Biological Monitoring: Heutige und künftige Möglichkeiten in der Arbeits- und Umweltmedizin (Rundgesprache Und Kolloquien) (German Edition)

Deutsche Forschungsgemeinschaft Biological Monitoring Heutige und künftige Möglichkeiten in der Arbeits- und Umweltmedizin

Deutsche Forschungsgemeinschaft

Biological Monitoring Heutige und künftige Möglichkeiten in der Arbeits- und Umweltmedizin Rundgespräche und Kolloquien Herausgegeben von Jürgen Angerer Redaktionelle Bearbeitung von Tobias Weiß Autoren und Mitwirkende: Jürgen Angerer, Helmut Bartsch, Hermann M. Bolt, Hans Drexler, Erich Gebhart, Hansruedi Glatt, Klaus Golka, Helmut Greim, Ernst Hallier, Dietrich Henschler, Jürgen Lewalter, Werner K. Lutz, Martin G. Maisch, Michael Müller, Günter Obe, Wolfgang Pfau, Albert W. Rettenmeier, Gabriele Sabbioni, Günter Speit, Bertold Spiegelhalder, Kurt Straif, Ricarda Thier, Kurt Ulm, Michael Wilhelm

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Die Deutsche Bibliothek – CIP-Einheitsaufnahme Ein Titeldatensatz für diese Publikation ist bei Die Deutsche Bibliothek erhältlich ISBN 3-527-27410-3

c WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69469 Weinheim (Federal Republic of Germany). 2001 Gedruckt auf säurefreiem Papier. Alle Rechte, insbesondere die der Übersetzung in andere Sprachen, vorbehalten. Kein Teil dieses Buches darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form – durch Photokopie, Mikroverfilmung oder irgendein anderes Verfahren – reproduziert oder in eine von Maschinen, insbesondere von Datenverarbeitungsmaschinen, verwendbare Sprache übertragen oder übersetzt werden. Die Wiedergabe von Warenbezeichnungen, Handelsnamen oder sonstigen Kennzeichen in diesem Buch berechtigt nicht zu der Annahme, daß diese von jedermann frei benutzt werden dürfen. Vielmehr kann es sich auch dann um eingetragene Warenzeichen oder sonstige gesetzlich geschützte Kennzeichen handeln, wenn sie nicht eigens als solche markiert sind. All rights reserved (including those of translation into other languages). No part of this book may be reproduced in any form – by photoprinting, microfilm, or any other means – nor transmitted or translated into a machine language without written permission from the publishers. Registered names, trademarks, etc. used in this book, even when not specifically marked as such, are not to be considered unprotected by law. Umschlaggestaltung und Typographie: Dieter Hüsken. Satz: Hagedorn Kommunikation, D-68519 Viernheim. Druck: betz-druck gmbh, D-64291 Darmstadt. Bindung: Wilhelm Osswald & Co, D-67433 Neustadt. Printed in the Federal Republic of Germany.

Inhalt

Vorwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1

Bedeutung des Biological Monitoring Entwicklung und Bedeutung des Biological Monitoring in der DFG und MAK-Kommission

IX

.

1

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte Das Biological Monitoring in der Arbeits- und Umweltmedizin – derzeitiger Stand und künftige Entwicklungen . . . . . . . . . . . . . . .

5

Dietrich Henschler

2 2.1

Jürgen Angerer

2.2

Metabolic Profiling – ein Weg zur besseren Beurteilung von Belastung und Beanspruchung durch organische Arbeitsstoffe . . . . . . . .

16

Albert W. Rettenmeier

2.3

Biological Monitoring of Arylamines and Nitroarenes . . . . . . . . . . . . . . .

24

Gabriele Sabbioni

V

Inhalt

3 3.1

DNA Adducts Genetic Cancer Susceptibility and DNA Adducts: Studies in Smokers and Coke Oven Workers . .

35

Margarita Rojas, Kroum Alexandrov, Helmut Bartsch, and Bertold Spiegelhalder

3.2

Nachweis von DNA-Addukten für ein Biological Monitoring . . . . . . . . . . . .

46

Werner K. Lutz und Martin G. Maisch

3.3

32

P-Postlabelling HPLC-Analyse von DNA-Addukten im Brustgewebe . . . . . . .

58

Wolfgang Pfau

3.4

Untersuchungen zum 8-Hydroxy-2lDeoxyguanosin – ein Biomarker für eine oxidative DNA-Schädigung in-vivo? . . . . . .

70

Boleslaw Marczynski, Jürgen Hölzer und Michael Wilhelm

4 4.1

Suszeptibilität Verfeinerte Phänotypisierungsmethoden und Effektmonitoring zur Erfassung des individuellen Risikos am Beispiel der GSTT1 . .

80

Ernst Hallier

4.2

Genetische Polymorphismen von Sulfotransferasen als Suszeptibilitätsparameter

.

86

Genotypisierung und Phänotypisierung am Beispiel der NAT2 . . . . . . . . . . . .

98

Hansruedi Glatt

4.3

Klaus Golka und Meinolf Blaszkewicz

4.4

Neue High-Throughput-Technologie des diagnostischen Screenings von Suszeptibilitätsfaktoren . . . . . . . . . . Ricarda Thier, Thomas Brüning und Yon Ko

VI

105

Inhalt

5 5.1

Zytogenetische Parameter Biological Monitoring mit zytogenetischen Methoden . . . . . . . . . .

113

Günter Obe, Helga Fender und Gisela Wolf

5.2

Anwendungsbeispiele einer Dreifarb-Chromosomen-Painting-Technik im zytogenetischen Biomonitoring . . . . . . .

124

Erich Gebhart, Irmgard Verdorfer und Susann Neubauer

5.3

Der Comet-Assay als Test im Biomonitoring . . .

133

Günter Speit, Oliver Merk und Andreas Rothfuß

6 6.1

Immunologie Immunglobuline als Marker chronischer Exposition gegenüber allergenen Arbeitsstoffen .

144

Hans Drexler

6.2

Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme . . . . . . . . .

150

Jürgen Lewalter

7 7.1

Epidemiologie Erfassung der Exposition in epidemiologischen Studien . . . . . . . . .

174

Kurt Ulm

7.2

Möglichkeiten und Grenzen einer molekularen Epidemiologie von Arbeitsstoffen . . . . . . .

180

Kurt Straif

8

Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . .

197

Jürgen Angerer und Helmut Greim

9

Adressen der Mitwirkenden am Rundgespräch

.

205

VII

Vorwort

Am 09. und 10. März 2000 fand in Bonn auf Einladung der Deutschen Forschungsgemeinschaft ein Rundgespräch über die Möglichkeiten des Biomonitoring in Arbeits- und Umweltmedizin statt, bei dem auch die Frage der Zusammenarbeit der verschiedenen Fachdisziplinen auf nationaler Ebene zur Diskussion stand. Anlass zu diesem Gespräch waren unter anderem folgende Erwägungen: Nicht zuletzt dank der Aktivitäten der Deutschen Forschungsgemeinschaft hat das Biomonitoring in den letzten dreißig Jahren in Deutschland ein hohes Niveau erreicht. Begünstigt wurde dies dadurch, dass die deutsche Arbeitsschutzgesetzgebung die Arbeitsergebnisse der Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe unmittelbar in geltendes Recht umgesetzt hat. Dies hatte zur Folge, dass sich in Deutschland die Wirksamkeit dieser Maßnahme der Individualprävention in der Praxis erweisen konnte, was wiederum stimulierende Effekte auf die Forschung auf diesem Gebiet ausübte. Auf dieser Grundlage von Forschung und Praxis kann Deutschland deshalb durchaus eine führende Rolle auf dem Gebiet des Biomonitoring für sich in Anspruch nehmen. Neue Möglichkeiten des Biomonitoring in Form von biochemischen und biologischen Effektmarkern wie z. B. Protein- und DNA-Schadstoffaddukte oder von zytogenetischen Parametern könnten es ermöglichen, die Prävention schadstoffbedingter Erkrankungen weiter zu verbessern. Allerdings ist über die diagnostische Aussagekraft dieser Parameter bisher wenig bekannt. Dies gibt Anlass, die Expertise verschiedener Fachdisziplinen, vor allem der Toxikologie, Arbeitsmedizin, Immunologie, Humangenetik, Analytik, Epidemiologie zusammenzuführen und zu klären, welche Bedeutung diesen Parametern künftig im Rahmen der Prävention zukommen kann. In diesem Zusammenhang ist auch zu eruieren, was getan werden muss, um auf diesem wichtigen und dynamisch sich entwickelnden Forschungsgebiet die führende Rolle Deutschlands zu halten beziehungsweise wiederzugewinnen. Dieser erste Gedankenaustausch, den das Rundgespräch ermöglicht hat, soll nach dem Willen der Teilnehmer den Nukleus darstellen, aus dem sich künftige Forschung entwickeln soll. IX

Vorwort Der Deutschen Forschungsgemeinschaft, die sich für unser Fachgebiet in Frau Dr. Konze-Thomas in vorbildlicher Weise verkörpert, danke ich dafür, dass sie dieses Rundgespräch ermöglicht hat. Diesen Dank abzustatten ist mir umso mehr ein Bedürfnis, als er all das einschließt, was die Deutsche Forschungsgemeinschaft in den vergangenen 45 Jahren für die Forschung auf dem Gebiet der arbeitsmedizinischen Toxikologie und damit für den arbeitenden Menschen getan hat. Jürgen Angerer

X

1 Bedeutung des Biological Monitoring 1.1 Entwicklung und Bedeutung des Biological Monitoring in der DFG und MAK-Kommission Dietrich Henschler*

1.1.1 Vorläufer Die Methode des Biological Monitoring ist weit älter als ihre Bezeichnung. Erstmals ist Biomonitoring wohl schon vor 130 Jahren angewendet worden, und zwar mit der Bestimmung von Salizylursäure im Harn zur Steuerung der Therapie des Rheumatismus mit heroischen Dosen Salizylsäure. Die Bezeichnung Biological Monitoring kommt aus dem angelsächsischen Sprachraum, wo sie seit ca. 50 Jahren gängig ist; ein deutsches Pendant hat sich nicht gefunden. Biological Monitoring ist an chemisch-analytische Bestimmungsmethoden gebunden. Fortschritt im Biological Monitoring setzt daher stets auch Fortschritt auf dem Gebiet der analytischen Chemie voraus. Treibende Kraft ist das praktische Bedürfnis, Stoffkonzentrationen im Organismus zum Zwecke der Risikoprävention zu kennen. Hier hat der Arbeitsschutz eine Pionierrolle übernommen. Schon seit ca. 1890 werden in Betrieben mit Bleiexposition Blut- und Harnbleibestimmungen durchgeführt, um gefährdete Arbeiter rechtzeitig vor dem Auftreten von Bleikrisen zu schützen. Dementsprechend stellte man grenzwertige, oberste Verträglichkeitsschwellen von Blei in Blut und Harn auf. Einen Meilenstein in der Entwicklung in diesem Felde stellen die systematischen Untersuchungen von Robert Kehoe (1933) zur Resorption, Verteilung, Speicherung und Exkretion kleiner Bleidosen dar, die den Einsatz von Bleitetraethyl als Zusatz in Hochleistungsbenzin absichern sollten. Als ein weiteres herausragendes, frühes Beispiel erfolgreichen Biomonitorings sind die seit 1953 in Schweden durchgeführten Untersuchungen an Trichlorethen exponierten Beschäftigten zu nennen. Die Bestimmung des Hauptmetaboliten Trichloressigsäure (TCA) im Harn wurde vom Hersteller des Lösungsmittels und der Entfettungsanlagen quasi mitgeliefert und systematisch bei allen Exponierten regelmäßig durchgeführt. Die robuste und

* Institut für Toxikologie, Universität Würzburg, Versbacher Str. 9, 97078 Würzburg

1

1

Bedeutung des Biological Monitoring

frühzeitig validierte Fujiwara-Methode für TCA bestätigte mit jahrzehntelanger Erfahrung den in diesem Land schon sehr früh eingeführten MAK-Wert von 30 mL/m3. Ein drittes Beispiel sei als Ausweis der Nützlichkeit eines Effektparameters angeführt. Der Einsatz von Organophosphatverbindungen (OP) als Insektizide in der Landwirtschaft und in der Malariabekämpfung hatte in den 40er und 50er Jahren zu zahlreichen, z. T. tödlichen akuten Vergiftungen geführt. 1951 veröffentlichte Wilson seine Theorie des molekularen Mechanismus der Vergiftung: die irreversible Bindung des Phosphatesterrestes an das Serin im katalytischen Zentrum der Acetylcholinesterase (AchE). Man entwickelte rasch praktikable Methoden zur Bestimmung der AchE-Aktivität im Blut, die eine Aufnahme gefährdender Mengen von OPVerbindungen verlässlich anzeigen. Seit ihrer Gründung 1955 hat die Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der Deutschen Forschungsgemeinschaft (MAK-Kommission) die Möglichkeiten des Biologischen Monitorings erkannt und sich in ihren Verhandlungen an den genannten Beispielen ausgerichtet. Schon in der ersten MAK-Werte-Liste sind in den Vorbemerkungen die Möglichkeit, die Bedeutung und der Wert des Verfahrens erwähnt.

1.1.2 Organisatorische Ansätze Von Anfang an hat in der MAK-Kommission eine Arbeitsgruppe Luftanalysen bestanden. 1975 wurde eine neue Arbeitsgruppe Analysen in biologischem Material gegründet. Leiter wurde Herr Angerer, Erlangen. Beide Gruppen veröffentlichten die von ihnen erarbeiteten Methoden in fortgesetzten Ringbuchsammlungen. Die Sammlung für die Analysen in biologischem Material wuchs sehr viel rascher an, was das besondere Interesse der Analytiker an den an biologische Fragen heranführenden Methoden ausweist. Nach intensiven, vorbereitenden Beratungen wurde 1979 eine neue Arbeitsgruppe Aufstellung von Grenzwerten in biologischem Material unter der Leitung von Herrn Lehnert, Erlangen, gegründet. Sie führte mehrere Pilotstudien an geeigneten Arbeitsstoffen durch mit dem Ziel, Grenzwerte in biologischem Material zu definieren. Parallel liefen vergleichbare Bestrebungen der Europäischen Gemeinschaft und des TLV-Committee in den USA. Von vornherein war – in Analogie zu den MAK-Werten – als verpflichtend festgelegt, für aufzustellende Grenzwerte ausführliche wissenschaftliche Begründungen zu erarbeiten. Die ersten Muster für biologische Grenzwerte erstellte Herr Bolt. Als Bezeichnung der neuen Werte-Kategorie wurde Biologische Arbeitsstoff-Toleranz (BAT-Werte) gewählt. Die ersten BAT-Werte hat die Kommission – mit einer ausführlichen, erläuternden Einführung – 1982 in die MAK-Werte-Liste eingeführt; sie nennt sich seither Maximale Arbeitsplatzkonzentrationen und Biologische Arbeitsstoff-Tole2

1.1

Entwicklung und Bedeutung des Biological Monitoring

ranzwerte, ab 1992 abgekürzt MAK- und BAT-Werte-Liste. Seit 1983 erscheinen in unregelmäßiger Folge, jedoch in zeitlichem Zusammenhang mit der Einführung neuer BAT-Werte in der Liste, ausführliche wissenschaftliche Begründungen (Wiley-VCH Verlag, Weinheim). Wenige Jahre nach ihrer Einführung durch die MAK-Kommission sind BAT-Werte in das offizielle Regelwerk des Ausschusses für Gefahrstoffe (AGS) beim BMA aufgenommen worden in Form der Technischen Regel TRGS 903; sie verpflichtet zur Vornahme von Analysen in biologischem Material unter bestimmten Voraussetzungen.

1.1.3 Forschungsaktivitäten der MAK-Kommission Die Kommission hat mit mehreren ihrer Mitglieder wesentliche experimentelle Beiträge zur Fortentwicklung des Systems geleistet. Von 1980–89 sind von der DFG über ein besonderes Förderprogramm eine Reihe von Forschungsvorhaben mit dem Schwerpunkt krebserzeugende Arbeitsstoffe bezuschusst worden. Sie haben der Forschung über Biologisches Monitoring in Deutschland eine anerkannte Vorreiterrolle gebracht.

1.1.4 Kriterien BAT-Werte unterscheiden sich von MAK-Werten durch eine Reihe von Kriterien: x BAT-Werte dienen der Individualprävention, MAK-Werte zielen dagegen, da Luftproben nur in der Umgebungsluft genommen werden können, auf Kollektive ab. x BAT-Werte sind absolute Spitzenwerte, während MAK-Werte als zeitintegrierte Durchschnittswerte genommen werden können. x Bei Einhaltung von BAT-Werten sollen keine (biologischen) Veränderungen von Krankheitswert resultieren. x Bei Einhaltung eines BAT-Werts für einen Stoff sollen keine Verstärkungen der Wirkung anderer Stoffe entstehen. x BAT-Werte sollen, über die toxikologischen Gesetzmäßigkeiten ermittelt, mit den entsprechenden MAK-Werten korrelieren.

3

1

Bedeutung des Biological Monitoring

x Die im Bereich von BAT-Werten beobachteten Effekte sollen voll reversibel sein. Daher werden für krebserzeugende Arbeitsstoffe keine BATWerte aufgestellt. Stattdessen werden für vorgegebene Konzentrationen/ Dosen dieser Stoffklasse „Expositionsäquivalente“ für krebserzeugende Arbeitsstoffe (EKA) aufgestellt.

1.1.5 Randbedingungen BAT-Werte erfassen die „innere Belastung“. Gemessen werden, je nach Fragestellung und Datenlage, der Arbeitsstoff selbst, seine Metaboliten, Reaktionsprodukte von Stoff und/oder Metaboliten mit körpereigenen Strukturen (z. B. Addukte an DNA oder Hämoglobin) oder Funktionsänderungen. Als biologische Matrices sind bisher Blut, Harn, Kot, Haut, Haar, Gewebe und Ausatmungsluft erfasst. Während MAK-Werte weitgehend unabhängig vom Zustand des Schutzobjekts, des am Arbeitsplatz Tätigen, gelten, berücksichtigen BATWerte eine Reihe von besonderen Einflussgrößen: die physische Belastung, die sich in wechselndem Atemvolumen und damit in unterschiedlichen StoffAufnahmeraten mit der Atmung manifestiert; die persönliche Sorgfalt des einzelnen Arbeitenden, die persönliche Hygiene an und außerhalb des Arbeitsplatzes, Vorkrankheiten, Alter und Geschlecht, Art und Ausmaß von Abweichungen im Fremdstoff-Metabolismus (Polymorphismus) und Änderungen im toxikokinetischen Verhalten, v. a. die Exkretion von Arbeitsstoffen und ihren Metaboliten betreffend.

1.1.6 Bilanz Seit ihrer Einführung sind in die deutsche MAK- und BAT-Werte-Liste 44 BAT-Werte und 13 EKA-Werte für krebserzeugende Arbeitsstoffe aufgenommen worden. Ihre Zahl wird absehbar weit unter der von MAK-Werten (ca. 750 insgesamt bewertete Stoffe) bleiben. Die wesentlichen Gründe dafür sind: Nur für eine beschränkte Zahl von Arbeitsstoffen sind die erforderlichen toxikokinetischen Daten erarbeitet und geeignete analytische Methoden ausgearbeitet worden. Dennoch ist mit dem Biologischen Monitoring und den BAT-Werten ein wichtiges Instrument des Arbeitsschutzes geschaffen. Das ihm zugrundeliegende Prinzip des Individualschutzes setzt eine Maxime des Grundgesetzes (Artikel 2) um, die den Individualschutz dem Kollektivschutz gleich setzt. Die Arbeitsstoffkommission hat auf diesem wichtigen Sektor des Arbeitsschutzes maßgebliche, auch international anerkannte Pionierarbeit geleistet. 4

2 Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte 2.1 Das Biological Monitoring in der Arbeits- und Umweltmedizin – derzeitiger Stand und künftige Entwicklungen Jürgen Angerer*

Im Bereich der arbeits- und umweltmedizinischen Toxikologie stellt das Biological Monitoring eine Maßnahme der Individualprävention dar, bei der das Ausmaß der Schadstoffbelastung des Menschen und der daraus resultierenden gesundheitlichen Beanspruchung abgeschätzt wird (Zielhuis 1980, Angerer und Gündel 1996, Kommission Human-Biomonitoring des Umweltbundesamtes 1996, Schaller und Angerer 1998). Beim Biological Monitoring unterscheidet man heute zwischen dem Dosismonitoring, dem biochemischen Effektmonitoring und dem biologischen Effektmonitoring. Als Dosismonitoring bezeichnet man die Bestimmung der Schadstoffe bzw. ihrer Metabolite in Körperflüssigkeiten. Als biochemisches Effektmonitoring bezeichnen wir die Quantifizierung von Reaktionsprodukten mutagener Substanzen mit der Erbsubstanz. Als Surrogat für die DNA betrachten wir Proteine bzw. deren Addukte mit mutagenen Substanzen. Von einem biologischen Effektmonitoring sprechen wir, wenn erste Reaktionen des Körpers auf die Schadstoffbelastung messbar sind, z. B. die Veränderung von Enzymaktivitäten oder auch von genetischen Parametern. Dabei steigt die prädiktive Bedeutung im Hinblick auf die gesundheitlichen Auswirkungen vom Dosismonitoring über das biochemische Effektmonitoring zum biologischen Effektmonitoring an (Abb. 1). Das Biological Monitoring ergänzt die Schadstoffmessung in der Luft des Arbeitsplatzes bzw. in den unterschiedlichsten Umweltmedien und weist darüber hinaus eine Reihe zusätzlicher Vorteile auf. Stark vereinfacht könnte man sagen, dass der wesentliche Vorteil des Biological Monitoring darin besteht, dass es eine Aussage darüber zulässt, ob und in welchem Ausmaß der Mensch Schadstoffe aus seiner Umgebung aufnimmt. Dies ist insbesondere im Bereich der Umweltmedizin von größter Bedeutung, da man landauf, landab Chemikalien in allen nur denkbaren Materialien wie Holz, Baustoffe, Staubsaugerbeutel etc. bestimmt, ohne dass bisher ein Bezug zwischen dem Schadstoffgehalt dieser Medien und der vom Menschen aufgenommenen Dosis hergestellt wurde. * Institut für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin, Universität Erlangen-Nürnberg, Schillerstr. 25/29, 91054 Erlangen

5

2

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

Abbildung 1: Monitoring von Schadstoffen.

Die Vorteile, die das Biological Monitoring bietet, wurden in Deutschland frühzeitig erkannt und seit Ende der 60er Jahre kontinuierlich fortentwickelt. Daran hat sicher den weitaus größten Anteil die Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der DFG, die die analytischen Arbeiten wesentlich vorangetrieben hat (Analysen in biologischem Material 1976–1999). 1980 war es die Arbeitsstoffkommission, die weltweit als Erste Grenzwerte für die innere Schadstoffbelastung evaluiert hat, die so genannten Biologischen Arbeitsstoff-Toleranzwerte (BAT; BAT-Begründungen). Heute wird diese Arbeit ergänzt durch die Kommission Human-Biomonitoring des Umweltbundesamtes, die Grenzwerte und Referenzwerte für die Schadstoffbelastung der Allgemeinbevölkerung evaluiert (Kommission Human-Biomonitoring des Umweltbundesamtes 1996). Dabei stützt sich diese Kommission ausdrücklich auf die analytischen Grundlagenarbeit, die die DFG geleistet hat. Zu nennen ist auch noch die Deutsche Gesellschaft für Arbeitsmedizin und Umweltmedizin, die 1982 damit begonnen hat, eine externe Qualitätssicherung in Form von Ringversuchen für arbeits- und umweltmedizinischtoxikologische Analysen durchzuführen (Schaller et al. 1984). Wichtig erscheint an dieser Stelle, dass sich die Europäische Gemeinschaft aus diesem Prozess um die Ausarbeitung und Anwendung des Biological Monitoring am Arbeitsplatz Anfang der 80er Jahre ausgeklinkt hat. Vor diesem Zeitpunkt enthielten alle Richtlinien und Beschlüsse der Europäischen Gemeinschaft, die sich mit dem Schutz vor den Wirkungen gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe befasst haben, Ausführungen zum Biological 6

2.1

Das Biological Monitoring in der Arbeits- und Umweltmedizin

Monitoring (Angerer und Schaller 1990). Danach findet sich in den entsprechenden Richtlinien der Europäischen Gemeinschaft kein Hinweis mehr auf die Durchführung des Biological Monitoring im Rahmen der Individualprävention. Erst heute erfolgt ein Wiedereinstieg in diese Art des vorbeugenden Gesundheitsschutzes (EG-Richtlinie 98/24). Das heißt: Während unsere europäischen Partner mehr oder weniger stehen geblieben sind auf dem Niveau der EG-Richtlinie Blei (EG-Richtlinie 82/605), die ein Biological Monitoring im Falle einer Bleivergiftung vorsieht, wurde in Deutschland das Biological Monitoring weiterentwickelt, so dass wir heute sicherlich eine führende Position auf diesem Gebiet einnehmen oder zumindest einnehmen könnten. Letzteres ist die Frage, die zu diesem Rundgespräch „Biomarker“ geführt hat: Wie können wir in Deutschland unsere führende Position bei der Entwicklung des Biological Monitoring halten bzw. weiter ausbauen und letztendlich international deutlich machen? Voraussetzung für das Biological Monitoring sind empfindliche spezifische analytische Verfahren, mit denen sich die verschiedenen Parameter in Körperflüssigkeiten bestimmen lassen. Es ist deshalb kein Zufall, dass die Einführung neuer Methoden der instrumentellen Analytik immer auch einen Innovationsschub beim Biological Monitoring als Folge hatte. War es in den 60er Jahren die Atomabsorptionsspektrometrie, die eine Metallanalytik im fraglichen Konzentrationsbereich erst ermöglicht hat, waren es ab Mitte der 70er Jahre die immer preiswerteren GC/MS-Kombinationen, mit denen es möglich war, organische Substanzen bis in den pg/l-Bereich zu bestimmen. Diese analytischen Entwicklungen und Fortschritte finden ihren Niederschlag in der Methodensammlung Analytische Methoden zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe. Band 2: Analysen in biologischem Material der Arbeitsstoffkommission der DFG (Analysen in biologischem Material 1976–1999). Diese Methodensammlung repräsentiert den analytischen Stand der Kunst im Bereich der Arbeits- und Umweltmedizin. Diese Methoden ermöglichen es für viele Substanzen, ein Dosismonitoring durchführen. In zunehmendem Maße werden auch Methoden des biochemischen Effektmonitoring in die Sammlung aufgenommen. Natürlich finden sich in dieser Methodensammlung auch die klassischen Methoden des biologischen Effektmonitorings wie beispielsweise die Bestimmung der d-Aminolaevulinsäure im Harn im Falle einer Bleiexposition. Nicht enthalten sind derzeit Methoden zur Bestimmung von DNA-Addukten. Auch nicht enthalten sind derzeit noch Suszeptibilitätsmarker. Letztere werden aber nach den Beschlüssen der Arbeitsstoffkommission der DFG künftig in die Methodensammlung aufgenommen. Auch zytogenetische Parameter oder immunologische Parameter finden sich nicht in dieser Methodensammlung. Betrachten wir das Dosismonitoring, so können wir heute praktisch alle relevanten Metalle in den Körperflüssigkeiten bestimmen (Tab. 1). Über diesen bloßen Metallnachweis hinaus arbeitet man heute daran, die Metalle in ihren unterschiedlichen Bindungszuständen zu analysieren. Mit der so genannten Spezies-Analytik gelingt es z. B., krebserzeugende 7

2

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

Tabelle 1: Biological Monitoring von Metallen. Blut

Harn

Metalle Aluminium Antimon Arsen Barium Beryllium Blei Cadmium Chrom Cobalt Molybdän Nickel Palladium Platin Quecksilber Selen Silber Thallium Vanadium

þ – – – þ þ þ þ þ – þ – þ þ þ – – –

þ þ þ þ þ þ þ þ þ þ þ þ þ þ þ þ þ þ

Andere CO-Hb Fluorid ALA (Blei)

þ – –

– þ þ

anorganische Arsenverbindungen von weniger toxischen organischen Arsenverbindungen abzutrennen und im Harn nachzuweisen. Hier stehen wir am Anfang einer Entwicklung. Bei den organischen Substanzen können Lösungsmittel, aber auch wichtige Stoffgruppen wie aromatische Amine, aromatische Nitroverbindungen sowie PAH erfasst werden (Tab. 2). Tabelle 3 zeigt die Palette von Lösungsmittel-Metaboliten an, die heute routinemäßig im Harn bestimmt werden können. Von eher umweltmedizinischer Bedeutung sind persistente Chlororganika, die in sehr niedrigen Konzentrationen im Blut und Harn bestimmt werden können (Tab. 4). Bei den nicht persistenten Pestiziden stehen wir am Anfang der Methodenentwicklung für ein Biomonitoring. Gleichwohl möchte ich die Leitungsfähigkeit des Dosismonitoring an einem umweltmedizinischen Beispiel zeigen. Bisher sind die Lebensmittelchemiker, die Landesuntersuchungsämter und auch die Bundesoberbehörden davon ausgegangen, dass über Lebensmittel Pflanzenschutzmittel praktisch nicht aufgenommen werden. In einem vom BMBF geförderten Verbundprojekt haben wir unter anderem eine sehr empfindliche Methode zur Bestimmung von Organophosphat-Metaboliten im Harn erarbeitet. Mit dieser Methode haben wir zwischenzeitlich über 1000 Personen der Allgemeinbevölkerung untersucht, darunter etwa 8

2.1

Das Biological Monitoring in der Arbeits- und Umweltmedizin

Tabelle 2: Biologisches Monitoring von organischen Substanzen. Lösungsmittel

Blut

Harn

Aliphatische Kohlenwasserstoffe Aromatische Kohlenwasserstoffe Halogenierte Kohlenwasserstoffe Alkohole, Ketone PAH Aromatische Amine Aromatische Nitroverbindungen

þ þ þ – – (þ) (þ)

– – – þ þ þ þ

Tabelle 3: Biologisches Monitoring von Lösungsmitteln. Arbeitsstoff Aromaten Benzol Toluol Xylole Ethylbenzol, Styrol

Untersuchungsparameter S-Phenylmerkaptursäure t,t-Muconsäure o-Kresol Methylhippursäure Mandelsäure, Phenylglyoxylsäure

Chlorbenzole

Chlorphenole

Aliphaten n-Hexan

Hexandion

Halogenierte KW Trichlorethen

Trichloressigsäure

Glycolether 2-Methoxyethanol 2-Ethoxyethanol 2-Butoxyethanol

2-Metoxyessigsäure 2-Ethoxyessigsäure 2-Butoxyessigsäure

Schwefelkohlenstoff

TTCA

Vinylchlorid

Thiodiglycolsäure

Tabelle 4: Biological Monitoring von persistenten Chlororganika.

DDT, DDE Hexachlorcyclohexan Polychlorierte Biphenyl (PCB) Hexachlorbenzol Pentachlorphenol Chlorphenole (CP) Chlorbenzole (CB)

Blut

Harn

þ þ þ þ þ – –

– þ – – þ þ þ

9

2

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

500 Erwachsene (Abb. 2). Danach konnten bei etwa 80 % der Allgemeinbevölkerung Dimethylphosphat und Dimethylthiophosphat im Harn nachgewiesen werden. Betrachten wir uns die 95. Perzentile, die um 100 mg/g Kreatinin liegen, so handelt es sich durchaus um Werte, die von der Konzentration her imponieren (Hardt und Angerer 2000). Im Vergleich dazu liegt der Referenzwert für die PCP-Ausscheidung im Harn der Allgemeinbevölkerung bei 8 mg/l. Der entsprechende Referenzwert für die Bleikonzentration des Blutes liegt bei 80 mg/l Blut. Wir kommen also zur Erkenntnis, dass die Allgemeinbevölkerung relativ homogen mit Organophosphaten belastet ist. Ähnliches gilt übrigens auch für die Pyrethroide, nur sind die hier nachweisbaren Konzentrationen um rund zwei Größenordnungen niedriger (Hardt et al. 1999). Unsere Arbeitshypothese ist derzeit, dass sowohl die Organophosphate wie auch die Pyrethroide im wesentlichen über die Nahrung aufgenommen werden. Dies bereitet den zuständigen Behörden derzeit nicht unerhebliches Kopfzerbrechen. Trotzdem muss hier bemerkt werden, dass wir bei der überwiegenden Mehrzahl der nicht persistierenden Pflanzenschutzmittel derzeit noch über keine geeigneten Methoden für das Biological Monitoring verfügen. Zumeist ist nicht einmal der Metabolismus der Pflanzenschutzmittel beim Menschen bekannt. Zusammenfassend komme ich zu dem Schluss, dass wir im Bereich des Dosismonitoring heute in der Lage sind, Schadstoffbelastungen bis in den umweltmedizinischen Bereich zu erfassen. Das Parameterspektrum ist bereits heute als durchaus imponierend zu bezeichnen, muss aber laufend erweitert werden. Bei bestimmten Stoffgruppen, wie etwa den Pflanzenschutzmitteln, bleiben erhebliche Lücken zu schließen. Fortschritte haben wir auch beim biochemischen Effektmonitoring erzielt. In den letzten Jahren ist viel auf diesem Gebiet der Protein-Addukte, insbesondere der Hämoglobin-Addukte, gearbeitet worden. Wenn man heute die ungezählten Arbeiten zusammenfasst, ergibt sich folgendes vereinfachtes Bild, wobei ich hier nur von Untersuchungen spreche, die beim Menschen wirklich durchgeführt worden sind: Mit dem so genannten Edman-Abbau spaltet man die an das so genannte N-terminale Valin gebundenen

Abbildung 2: Belastung der erwachsenen Allgemeinbevölkerung mit Organophosphaten: Dimethylphosphat (DMP), Dimethylthiophosphat (DMTP), Dimethyldithiophosphat (DMDTP), Diethylphosphat (DEP), Diethylthiophosphat (DETP) und Diethyldithiophosphat (DEDTP).

10

2.1

Das Biological Monitoring in der Arbeits- und Umweltmedizin

Schadstoffaddukte ab. Mit dieser Methode lassen sich vor allem die alkylierenden Substanzen wie Ethylenoxid, Styrol, Butadien, Acrylnitril erfassen. Die Addukte aromatischer Amine und die Addukte von PAH werden hydrolytisch aus ihren Bindungen an Cystein abgespalten. Natürlich lassen sich auch die Addukte aromatischer Nitroverbindungen in Form ihrer Reduktionsprodukte bestimmen (Tab. 5). (siehe u. a. Angerer et al. 1998, Bergmann et al. 1997, Bergmark 1997, Bolt 1996, Boogaard et al. 1999, Ehrenberg et al. 1996, Farmer et al. 1996, Farmer 1995, Müller et al. 1998, Neumann et al. 1995, Pastorelli et al 1999, Sabbioni et al. 1996, Schütze et al. 1995, Sepai et al. 1995, Severi et al. 1994, Skipper et al. 1990, Tannenbaum 1991, Thier et al. 1999, Van Welie et al. 1992, Waidyanatha et al. 1998). Hämoglbin-Addukte können heute in den führenden Laboratorien routinemäßig und sehr empfindlich bestimmt werden. So gelingt es z. B. im Blut von Rauchern Hydroxyethylvalin und Cyanoethylvalin zu bestimmen. Dies ist beim Nichtraucher nicht der Fall. Raucher wie Nichtraucher weisen zudem nicht unerhebliche Mengen an Methylvalin im Blut auf, das infolge endogener Methylierungen gebildet wird (Bader et al. 1995). Wir erzielen mit der Erfassung von Hämoglobin-Addukten auch erkenntnistheoretische Fortschritte in Bezug auf den Metabolismus von Substanzen. Dimethylformamid (DMF) ist ein wichtiges organisches Lösungsmittel, das schwere Leberschädigungen verursachen kann. Ob es auch mutagene bzw. krebserzeugende Eigenschaften besitzt, ist heute noch nicht restlos geklärt. Unter beruflicher DMF-Belastung haben wir festgestellt, dass beim Menschen ein unvergleichlich größerer Anteil an Mercaptursäuren dieses Lösungsmittels im Harn ausgeschieden wird als im Tierversuch. Das bedeutet unter anderem, dass beim Menschen aus DMF intermediär ein Methylisocyanat entstehen könnte, das nicht nur an Glutathion, sondern auch an Hämoglobin oder DNA binden könnte (Abb. 3). Um diese Hypothese zu prüfen, haben wir deshalb nicht wie üblicherweise beim Edman-Abbau das Globin mit Isothiocyanat versetzt, um eine Tabelle 5: Biochemisches Effektmonitoring mittels Protein-Addukten beim Menschen. Alkylierende Substanzen z. B. Ethylenoxid Butadien Acrylnitril Acrylamid Propylenoxid Styrol Aromatische Amine Aromatische Nitroverbindungen PAH Sonstige z. B. Dimethylformamid Benzochinon

11

2

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

Abbildung 3: Postulierter, vereinfachter Metabolismus von DMF.

Ringbildungsreaktion zu erreichen. Wir haben das potenziell entstandene Hämoglobin-Addukt lediglich in saurem Milieu erhitzt, in der Annahme, dass das Isocyanat, falls es tatsächlich gebildet wird, ebenfalls einen Ring schließt und sich so von Hämoglobin abspalten lässt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt. Bei zehn DMF-exponierten Personen konnten wir eine im Vergleich zur Hintergrundbelastung erheblich höhere Adduktkonzentration feststellen (Angerer et al. 1998). Mittlerweile haben wir diese Ergebnisse an einem großen Kollektiv beruflich DMF-Exponierten bestätigt. Dieses Ergebnis belegt einerseits, dass das DMF mutagen sein könnte, andererseits, dass die angenommene Bildung von Methylisocyanat tatsächlich wahrscheinlich ist. Unser nächstes Ziel muss es deshalb sein, zu versuchen, auch die DNA-Addukte als Folge einer DMF-Belastung zu erfassen. Was die Bestimmung von Hämoglobin-Addukten anbetrifft, ist zu folgern, dass hier Fortschritte erzielt worden sind und auch künftig Fortschritte erzielt werden können. Dies bezieht sich sowohl auf die reine Monitoringfunktion wie auch auf den Erkenntnisgewinn, der mit dem Nachweis von Addukten verbunden ist. Beim biochemischen Effektmonitoring muss es unser Ziel sein, auch DNA-Addukte mit den Mitteln der instrumentellen Analytik bestimmen zu können. Dies gilt für die DNA-Addukte in Blut wie für deren Abbauprodukte, die im Harn ausgeschieden werden. Im Gestalt des 8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin haben wir ein solches Nukleosid, das heute von vielen Arbeitsgruppen bestimmt wird. Aus verschiedenen Gründen muss heute der Nachweis chemisch veränderter Nukleoside als erfolgversprechend angesehen werden. Wie wir wissen, reagieren die vier DNA-Basen mit mutagenen Chemikalien unter Bildung definierter Verbindungen, die mittels eines Repair-Mechanismus aus dem DNA-Strang ausgeschnitten und im Harn ausgeschieden wer12

2.1

Das Biological Monitoring in der Arbeits- und Umweltmedizin

Abbildung 4: Addukte nach DMF-Exposition und Kontrollen.

den. Ihre Bestimmung im Harn müsste es erlauben, einen biochemischen Effekt streng Substanz-spezifisch zu quantifizieren. Neue Aufreinigungs- und spezifische Anreicherungstechniken lassen ein solches Ziel greifbar erscheinen. Insbesondere im Hinblick auf Ihre Kombination mit der LC/MS/MS. Diese schon seit Jahrzehnten angestrebte Kombination der HPLC und Massenspektrometrie erscheint heute als technisch weitgehend ausgereift und sollte speziell beim Biological Monitoring große Fortschritte ermöglichen. So ergibt sich zusammenfassend folgender Ausblick: 1. Neue analytische Methoden wie beispielsweise ICP/MS und LC/MS/MS werden dem Biological Monitoring neue Möglichkeiten eröffnen. 2. Fortschritte wird es insbesondere geben bei der Aufbereitung des biologischen Materials und der Anreicherung der Analyte z. B. auf maßgeschneiderten Säulen sowie unter Verwendung von Online-Techniken. 3. Im Bereich des Dosismonitoring werden wir die stofflichen Grenzen weiterhin ausdehnen. Zu denken ist beispielsweise an Methoden zur Bestimmung von Pflanzenschutzmitteln in biologischem Material. Wir werden aber auch weitere Erkenntnisse zum Metabolismus der unterschiedlichsten Schadstoffe am Menschen gewinnen. 4. Von zentraler Bedeutung für Arbeits- und Umweltmedizin ist es, das biochemische Effektmonitoring weiter auszubauen. Dies gilt für Hb-Addukte und insbesondere natürlich für DNA-Addukte mutagener Substanzen. Die biochemischen Effektmarker stehen dem ultimativen Schadprinzip näher als das reine Dosismonitoring. 13

2

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

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2.1

Das Biological Monitoring in der Arbeits- und Umweltmedizin

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2

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

2.2 Metabolic Profiling – ein Weg zur besseren Beurteilung von Belastung und Beanspruchung durch organische Arbeitsstoffe Albert W. Rettenmeier*

Die innere Dosis oder innere Belastung wird gegenwärtig bei den in der MAK- und BAT-Werte-Liste aufgeführten Stoffen, für die biologische Grenzwerte oder Expositionsäquivalente festgelegt sind, überwiegend anhand eines singulären Parameters bestimmt. Bei den organischen Arbeitsstoffen wird hierzu meist die Konzentration eines Metaboliten im Harn herangezogen. In einigen Fällen wird die innere Belastung auch aus der Konzentration der Muttersubstanz in Blut oder Harn abgeleitet. Bei den kanzerogenen Stoffen treten die Hämoglobin-Addukte als weitere Expositionsparameter hinzu. In den Fällen, in denen es gelingt, einen für den kritischen toxischen Effekt unmittelbar verantwortlichen Metaboliten zu erfassen, kann dieses Vorgehen zufrieden stellen. Ein Beispiel ist neben den Hb-Adduktbildnern das Lösungsmittel n-Hexan, dessen Metabolismus in Abbildung 1 dargestellt ist. n-Hexan wird über mehrere Stufen zu 2,5-Hexandion abgebaut. Dieser der Analyse zugängliche Metabolit ist nicht nur in quantitativer Hinsicht von vorrangiger Bedeutung. Er ist auch das Abbauprodukt, welches die kritische toxische Wirkung – in diesem Fall die periphere Polyneuropathie – unmittelbar verursacht. Seine Konzentration im Harn ist ein Maß für das expositionsbedingte Gesundheitsrisiko. Bei vielen Gefahrstoffen wird der kritische toxische Effekt jedoch nicht von einem Metaboliten des dominierenden Abbauwegs hervorgerufen, sondern von quantitativ eher unbedeutenden Abbauprodukten. Häufig sind auch mehrere Endpunkte toxischer Wirkungen vorhanden, die bei der Belastungs- bzw. Beanspruchungskontrolle zu berücksichtigen sind und die auf der Wirkung von Metaboliten aus verschiedenen Abbauwegen beruhen. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die verschiedenen metabolischen Pfade x x x

beim Stoffabbau miteinander konkurrieren, bei entsprechendem Stoffangebot sättigbar sein können, intra- und interindividuellen Schwankungen unterliegen und

* Institut für Hygiene und Arbeitsmedizin, Universität GH Essen, Hufelandstr. 55, 45147 Essen

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2.2

Metabolic Profiling – ein Weg zur besseren Beurteilung

Abbildung 1: Metabolisches Profil von n-Hexan.

x durch vorausgehende oder begleitende Expositionen begünstigt oder gehemmt werden können.

Hieraus ergibt sich, dass sich ein wesentlich zutreffenderes Bild der inneren Belastung und der von ihr ausgehenden Risiken gewinnen lässt, wenn nicht nur ein Metabolit, sondern Metaboliten aus verschiedenen Stoffwechselwegen zum Biomonitoring herangezogen werden, d. h. wenn das metabolische Profil aufgezeichnet wird. Unter Metabolic Profiling versteht man die quantitative Bestimmung von metabolischen Produkten aus verschiedenen Abbauwegen endogener oder exogener Stoffe mit dem Ziel, x die quantitative Bedeutung der einzelnen metabolischen Pfade und damit die Belastung und ggf. die Beanspruchung umfassend zu ermitteln;

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2

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

x Abweichungen von „normalen“ Ausscheidungsmustern aufzudecken um dadurch aus Expositionen resultierende individuelle Risiken frühzeitig zu erkennen.

Das metabolische Profil wird wesentlich durch den Funktionszustand der in den Stoffabbau einbezogenen Zellen bestimmt. Folglich spiegelt das metabolische Profil den aktuellen Funktionszustand dieser Zellen wider. Das Metabolic Profiling wurde zuerst zum Nachweis angeborener Stoffwechselstörungen eingesetzt. Aus der Aufzeichnung abnormer Profile der im Harn ausgeschiedenen organischen Säuren lässt sich auf das Vorliegen von Stoffwechseldefekten schließen (Rashed et al. 1997). Darüber hinaus wird das Metabolic Profiling vor allem zur Aufklärung der Wirkungsmechanismen von Arzneimitteln und der Abschätzung der von ihnen ausgehenden Nebenwirkungsrisiken angewandt. Letzteres sei an einem Beispiel demonstriert. In Abbildung 2 ist der komplexe metabolische Abbau des Antiepileptikums Valproinsäure (VPA) dargestellt (Rettenmeier et al. 1989). In den 70er und 80er Jahren kam es unter der Therapie mit VPA bei einem kleinen Teil der Patienten zu schweren Leberintoxikationen, die in mehr als 100 Fällen einen letalen Ausgang nahmen. Epidemiologische Erhebungen ergaben, dass insbesondere Säuglinge und Kleinkinder betroffen waren, die gleichzeitig mit anderen, insbesondere mit Cytochrom-P450 induzierenden Antiepileptika therapiert worden waren. Als Ursache der Leberschädigung wurde einerseits die verstärkte Bildung hepatotoxischer VPA-Metaboliten, wie der terminal ungesättigten Metaboliten 4-En-VPA (1) und 2,4-Dien-VPA (7), angenommen. Andererseits schienen auch defekte oder dekompensierende Stoffwechselwege eine ursächliche Rolle zu spielen. Dies trifft insbesondere auf die b-Oxidation zu, welche gewöhnlich den quantitativ bedeutendsten Phase-I-Stoffwechselweg der VPA darstellt und zur 3-Oxo-VPA (12) führt. Entscheidend für das Verständnis der hepatotoxischen Wirkung der VPA war die Entdeckung, dass es sich bei der terminalen Desaturierung um eine Cytochrom-P450-abhängige Reaktion handelt, die durch eine antikonvulsive Komedikation mit Phenobarbital oder Phenytoin induzierbar ist (Rettie et al.1987). Nachdem ein adäquates Analysenverfahren für das Metabolic Profiling bei VPA-Gabe entwickelt worden war (Rettenmeier 1989), wurde untersucht, ob sich potenzielle Risikopatienten einer VPA-Therapie anhand des Profils der Metaboliten im Harn nach einer einmaligen oralen Belastung mit VPA identifizieren lassen (Rettenmeier et al. 1990). Der größere Teil der an der Studie beteiligten 22 pädiatrischen Patienten stand während der VPA-Gabe unter einer antikonvulsiven Therapie mit Phenobarbital. Auf den in Abbildung 3 dargestellten Diagrammen sind die relativen Ausscheidungsmengen des hepatotoxischen Metaboliten (1) und des Oxidationsprodukts (12) für die einzelnen Patienten wiedergegeben. Die Konzen18

2.2

Metabolic Profiling – ein Weg zur besseren Beurteilung

Abbildung 2: Metabolischer Abbau der Valproinsäure. Abbildung 3 (siehe nächste Seite): Relative Wiederfindungsmengen der 4-En-VPA (a) und 3-Oxo-VPA; (b) im Urin nach einmaliger oraler VPA-Belastung (in % der renal eliminierten Valproinsäureprodukte); (c) Verhältnis der terminalen und subterminalen Oxidationsprodukte der VPA (Cytochrom-P450-abhängige Produkte) zu den Produkten der mitochondrialen b-Oxidation.

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a)

b)

c)

2.2

Metabolic Profiling – ein Weg zur besseren Beurteilung

tration des hepatotoxischen Metaboliten betrug im Mittel ca. 1–2 % der Konzentration des oxidativen Metaboliten. Es zeigte sich, dass die Ausscheidung des hepatotoxischen 4-En-VPAMetaboliten bei den meisten Patienten, die unter einer Therapie mit Phenobarbital standen (dunkle Balken), höher war als bei den anderen Patienten. Bei zwei der 22 Patienten wurde vergleichsweise wenig 3-Oxo-VPA gebildet. Bei diesen beiden Patienten war das Verhältnis von Cytochrom-P450-abhängigen terminalen und subterminalen Oxidationsprodukten zu b-Oxidationsprodukten deutlich zugunsten der ersteren verschoben. Dies deutete auf eine Beeinträchtigung der mitochondrialen b-Oxidation hin. Eine Erklärung fand dieser Befund in den niedrigen Carnitinspiegeln bei diesen Patienten. Carnitin ist für den Transport von Fettsäuren, zu der auch die VPA zählt, in die Mitochondrien erforderlich. Durch die Aufzeichnung des metabolischen Profils war es bei diesem relativ kleinen Kollektiv von 22 Patienten somit möglich, sowohl den induzierenden Effekt einer Medikation wie auch eine metabolische Störung nachzuweisen. Beide Faktoren erhöhen das Hepatotoxizitätsrisiko. Bemerkenswert war hierbei, dass die metabolische Störung nicht an der erhöhten, sondern an der erniedrigten Bildung eines Metaboliten erkennbar war. Das Metabolic Profiling erwies sich demnach als geeignetes Verfahren, um frühzeitig Patienten zu identifizieren, welche durch eine VPA-Therapie gefährdet sind. Obwohl sich das Metabolic Profiling in analoger Weise auch zum Nachweis der von Arbeitsstoff-Expositionen ausgehenden individuellen Risiken eignen sollte, liegen bisher nur vereinzelte Studien mit dieser Zielsetzung vor. Als Beispiel seien Untersuchungen zum Metabolismus von Trichlorethen (Abb. 4) genannt (Bernauer et al. 1996).

Abbildung 4: Vereinfachter Metabolismus von Trichlorethen (Dekant et al. 1984).

21

2

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

Bei Trichlorethen konkurrieren oxidative und reduktive Stoffwechselwege miteinander, wobei dem oxidativen Abbauweg eine 1000–10000-fach höhere Kapazität zugeschrieben wird. Beide Abbauwege führen zu unterschiedlichen toxischen Endpunkten. Während die Produkte des oxidativen Stoffwechsels zentralnervöse und hepatotoxische Effekte hervorrufen, sind für die nephrotoxischen bzw. nephrokanzerogenen Wirkungen Produkte des reduktiven, glutathionabhängigen Abbauwegs verantwortlich. Wird der oxidative Stoffwechselweg bei hoher Exposition gesättigt, gewinnt der reduktive Abbauweg an Bedeutung, wodurch das Risiko der Nierenschädigung steigt. Zwar können die über die b-Lyase-Reaktion gebildeten ultimalen Kanzerogene nicht bestimmt werden. Jedoch wurden andere Metaboliten des reduktiven Stoffwechselpfads, wie das 1,2- und 2,2-Dichlorvinylcystein und auch die 1,2-Dichlorvinylmerkaptursäure, im Tierversuch aber auch im Harn exponierter Personen nachgewiesen und sind damit prinzipiell der Analyse zugänglich. Zur Expositionskontrolle wird derzeit empfohlen, die oxidativen Metaboliten Trichlorethanol und Trichloressigsäure heranzuziehen. Mit der Analyse der Produkte aus dem oxidativen und dem reduktiven Metabolismus wäre – über die Beurteilung der von Trichlorethen selbst und den oxidativen Metaboliten ausgehenden Gefährdungen hinaus – auch eine bessere Einschätzung des nephrotoxischen bzw. nephrokanzerogenen Risikos möglich. Allerdings erfordert die Bestimmung der Metaboliten des oxidativen und reduktiven Metabolismus separate Analysenverfahren. Als weiteres Beispiel für eine sinnvolle Anwendung des Metabolic Profiling sei die arbeitsmedizinische Überwachung von Butoxyethanol-Exponierten genannt. Butoxyethanol wird im Wesentlichen in zwei Stufen über den entsprechenden Aldehyd zu Butoxyessigsäure oxidiert, welche die hämolytische Wirkung dieses Glykolethers verursacht. Butoxyethanol hat eine wesentlich kürzere Halbwertszeit als seine kürzerkettigen Homologen Methoxy- und Ethoxyethanol, vermutlich wegen der Bildung eines ungewöhnlichen Glutamin-Konjugats der Butoxyessigsäure, das als gut wasserlösliches Produkt rasch eliminiert wird (Rettenmeier et al. 1993). Es gibt Anhaltspunkte dafür, dass dieses Glutamin-Konjugat, das üblicherweise mit bis zu 70 % an der Ausscheidung der Butoxyessigsäure beteiligt ist, bei einzelnen Personen nicht oder nur in geringem Umfang gebildet wird. Als mögliche Konsequenz resultiert ein bei gleicher Exposition erhöhtes Risiko, eine Hämolyse zu entwickeln. Die Expositionskontrolle über die Bestimmung der Butoxyessigsäure, auch nach vorheriger Hydrolyse des Konjugats, ist ungeeignet, diese Risikopersonen zu identifizieren. Inzwischen liegt eine Methode vor, die es erlaubt, zusammen mit den übrigen Metaboliten die freie Butoxyessigsäure und das Glutamin-Konjugat simultan zu bestimmen und so ein komplettes metabolisches Profil in einem Analysengang zu erstellen (Müller und Rettenmeier 1999). Anhand dieser wenigen Beispiele werden bereits die Vorteile deutlich, die sich aus dem Metabolic Profiling für die Belastungs- und Beanspruchungskontrolle gewinnen lassen. Metabolic Profiling ist jedoch analytisch 22

2.2

Metabolic Profiling – ein Weg zur besseren Beurteilung

aufwendig und setzt eine detaillierte Kenntnis des Metabolismus der Arbeitsstoffe voraus. Weiterer Forschungsbedarf besteht insbesondere hinsichtlich 1. der weiteren Aufklärung des metabolischen Abbaus, der bei vielen Arbeitsstoffen nur unvollständig bekannt ist. Da die meisten Metaboliten kommerziell nicht verfügbar sind, ist ihre gezielte, häufig sehr schwierige Synthese erforderlich. 2. der Entwicklung von Analysenmethoden zur Aufzeichnung der metabolischen Profile. Im Allgemeinen werden nur GC/MS- bzw. LC/MS-Methoden in Frage kommen, da sich viele der teilweise in nur sehr geringer Konzentration vorkommenden Arbeitsstoff-Metaboliten nur mit Hilfe spezieller massenspektrometrischer Methoden bestimmen lassen. 3. der Entwicklung von Rechenprogrammen, mit denen sich die Profildaten verarbeiten und ggf. abnorme Profile identifizieren lassen. Referenzbereiche und Cutoff-Werte für die kritischen Metaboliten müssen über Feld- und Laborstudien sowie aus Tierversuchsdaten ermittelt werden. Literatur Bernauer, U., Birner, G., Dekant, W., Henschler, D.: Biotransformation of trichloroethene: dose-dependent excretion of 2,2,2-trichloro-metabolites and mercapturic acids in rats and humans after inhalation, Arch. Toxicol., 70, 338–346 (1996). Dekant, W., Metzler, M., Henschler, D: Novel metabolites of trichloroethylene through dechlorination reactions in rats, mice and humans, Biochem. Pharmacol., 33, 2021–2027 (1984). Müller, G., Rettenmeier, A. W.: Simultaneous GC/MS determination of butoxyacetic acid and its glutamine conjugate in urine of workers exposed to 2-butoxyethanol, 6th European Meeting on Mass Spectrometry in Occupational and Environmental Health, Stockholm, September 1–3 (1999). Rashed, M. S., Bucknall, M. P., Little, D., Awad, A., Jacob, M., Alamoudi, M., Alwattar, M., Ozand, P. T.: Screening blood spots for inborn errors of metabolism by electrospray tandem mass spectrometry with a microplate batch process and a computer algorithm for automated flagging of abnormal profiles, Clin. Chem., 43, 1129–41 (1997). Rettenmeier, A. W., Hennigs, R., Wodarz, R.: Determination of butoxyacetic acid and N-butoxyacetylglutamine in urine of lacquerers exposed to 2-butoxyethanol, Int. Arch. Occup. Environ. Health, 65, 151–153 (1993). Rettenmeier, A. W., Howald, W. N., Levy, R. H., Witek, D. J., Gordon, W. P., Porubek, D. J., Baillie, T. A.: Quantitative metabolic profiling of valproic acid in humans using automated GC/MS techniques, Biomed. Environ. Mass Spectrom., 18, 192–199 (1989). Rettenmeier, A. W., Lebherz, J., Wodarz, R. et al.: Bestimmung der Valproinsäuremetaboliten nach einmaliger oraler Belastung: Ein Weg zur Früherkennung potenzieller Risikopatienten? in: Epilepsie 89, Wolf, P. (Hrsg.), S. 421–425, Einhorn-Presse Verlag, Reinbek (1990). Rettie, A. E., Rettenmeier, A. W., Howald, W. N., Baillie, T. A.: Cytochrome P450-catalyzed formation of Ä4-VPA, a toxic metabolite of valproic acid, Science, 235, 890–893 (1987).

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2

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

2.3 Biological Monitoring of Arylamines and Nitroarenes Gabriele Sabbioni*

2.4.1 Introduction Arylamines and nitroarenes are important intermediates in the production of plastics and polyurethanes. Employees in many factories are subjected to low level chronic exposure to a wide variety, often a mixture, of arylamines, nitroarenes, and arylisocyanates (Fig. 1). We have developed methods to measure hemoglobin (Hb) adducts of over 50 arylamines and nitroarenes (Sabbioni 1992, 1994a, 1994b, Sabbioni and Sepai 1999, Sabbioni and Beyerbach 1995, Schütze et al. 1995, Sepai et al. 1995a, 1995b, Sabbioni et al. 1996). Using these methods, we can assess exposure to low levels of these chemicals. Since, in most cases the air-monitoring values were below the detection limit, we have used the protein adduct levels to estimate the daily dose, which was then compared to the TD50, i. e. the daily dose which yields tumors in 50 % of rodents. Biological samples were collected from groups of workers. With each study we endeavored to collect control samples from unexposed clerical or medical staff. Blood samples were worked up using methods reported recently (Sabbioni and Beyerbach 1995, Schütze et al. 1995, Sepai et al. 1995a). The Hb, plasma, and urine samples were stored at 20 hC. Acid or base hydrolyzed samples were extracted at basic pH into organic solvents, derivatized with perfluorinated acid anhydride and analyzed by GC/MS, in the negative chemical ionization (NCI) mode. For each compound a calibration line was established at five concentrations covering the expected levels of adducts or metabolites in the samples.

* Walther-Straub-Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Ludwig-MaximiliansUniversität München, Nussbaumstr. 26, 80336 München

24

2.3

Biological Monitoring of Arylamines and Nitroarenes

Figure 1: DNA adducts and protein adducts of arylamines, nitroarenes, and arylisocyanates.

2.3.2 Biomonitoring of Protein Adducts 2.3.2.1

Workers Exposed to 2-Methylaniline and Aniline

A high incidence of bladder cancer was reported in employees from a factory producing rubber. Blood samples were available from 73 workers of this factory. The Hb adducts of 2-methylaniline (2MA), aniline (A), and 4-aminobiphenyl (4ABP) were investigated. Extremely high amounts of 2MA (0.1–200 ng/g Hb) and of A (0.1–35 ng/g Hb) were found (Ward et al. 1996). The levels of 4ABP were equivalent to the controls. The use of environmental air-monitoring as a means of dose estimation has several drawbacks: (i) often it is not sensitive enough, (ii) it does not show the effective dose but indicats the inhaled dose, and (iii) it does not indicate the metabolism of the compound in question. Hb adduct levels are dosimeters for the bioavailability of reactive xenobiotics or their metabolites and possibly also a dosimeter for the DNA adducts at the site of tumor formation. Furthermore, with the knowledge from animal data it is possible to estimate the daily dose from the measured Hb-adduct levels. However, it is necessary to make the following assumptions: 25

2

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

x the adduct levels result from steady-state exposures (Ac), Ac ¼ 0.5 x A x Ter, where A is the average daily increment per total Hb and Ter is the lifetime of an erythrocyte. Thus, to calculate the single dose the adduct level has to be divided by 60 (Tannenbaum et al. 1986), x modified Hb has the same lifespan as unmodified Hb and the adducts are stable to repair mechanisms, x the pharmacokinetics of the xenobiotic compound are comparable in rats and humans.

Taking 2MA as an example, the amount of adduct associated with Hb can be divided by 0.00059, which is the proportion of an administered dose found associated with the Hb in rats (Sabbioni 1992, Birner and Neumann 1988). Thus, for a 70 kg individual with 200 ng 2MA/g Hb, the dose is 68 mg 2MA/kg/day. In the absence of epidemiological data, it is necessary to characterize the human-health risk from animal experiments. The daily dose given to rodents that causes a fifty percent greater likelihood of the development of a tumor is termed the TD50. The human exposure dose expressed as a percentage of the rodent potency dose (TD50) has been termed the HERP index (Ames et al. 1987, Goodman and Wilson 1991, Crabtree et al. 1991, Gold et al. 1992, Talaska et al. 1994). The HERP index is very useful, as long as the many assumptions that are required are not ignored. Using the HERP index, it was possible to rank the risk or hazard potential for the workers exposed to the levels of amines for which we have established an internal-exposure dose from the adduct levels. The daily dose of 2MA for the workers with the highest adduct levels in this study was 1/300 of the TD50 value determined for rats (Gold et al. 1993).

2.3.2.2

Workers Exposed to 4,4l-Methylenedianiline (MDA) or 4,4l-Methylenediphenyl Diisocyanate (MDI)

Other groups of workers investigated were exposed to 4,4l-methylenedimethylenedianiline (MDA) or 4,4l-methylenediphenyl diisocyanate (MDI) (Schütze et al. 1995). The air levels of MDA and MDI were below detection limits. However, adduct and metabolite levels were detected in a high percentage of the samples. Hb adducts of MDA were found in 97 % and N-acetyl-MDA (AcMDA) in 65 % of the MDA-exposed workers. Hb adducts of MDA were found in 38 % of the MDI-exposed workers. In MDI exposed workers, the N-acetylated compound (AcMDA) was found only in one worker (Sepai et al. 1995a). Only the adducts of the primary amine from the hydrolysis of MDI were analyzed in this study. The presence of MDI adducts or other isocyanate metabolites was not investigated. Urine, collected at the same time as the blood samples from these MDA and MDI-exposed workers, was extracted at alkaline pH with and without 26

2.3

Biological Monitoring of Arylamines and Nitroarenes

preceding acid treatment. MDA and AcMDA were found in the urine of 84 % MDA-exposed workers and 78 % MDI-exposed workers. To release MDA and AcMDA from possible conjugates, urine was treated under strong acidic conditions. By this procedure the levels of MDA were found to be higher than the sums of MDA and AcMDA levels after base extraction alone. Urinary metabolites are indicators of recent exposure and it is not advisable to estimate an average daily dose from these values because there is a likelihood of over or under estimation (Cocker et al. 1994) that is a HERP of 0.3 %. In rats 0.044 % of MDA dose was found as Hb adducts (Sabbioni and Schütze 1998). Assuming that the pharmacokinetics of MDA are similar in rats and humans, the daily MDA dose of these workers is at least 10000 times below the TD50 (Gold et al. 1993) found for rats, i. e. a HERP of 0.01 %.

2.3.2.3

Workers Exposed to 2,4,6-Trinitrotoluene

Another study involved biomonitoring of workers employed in a Chinese 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) factory (Sabbioni et al. 1996, Liu et al. 1995). The factory controls were fire fighters, white-collar workers, security guards and the director. The blood was collected by the medical department of the factory. Hb of the workers was hydrolyzed with sodium hydroxide, extracted with methylene chloride and analyzed by GC/MS with negative chemical ionization. The 4-amino-2,6-dinitrotoluene (4ADNT) levels of the workers were up to 522 ng/g Hb. The highest levels were found in the screening and loading group. For 2-amino-4,6-dinitrotoluene (2ADNT) the highest level was 14.7 ng/g Hb. Hb adducts of TNT were found in all factory controls. This demonstrates that there is a general contamination of the factory, since the Hb of our German laboratory workers was free of 2ADNT and 4ADNT. The Hb adducts determined in the present study were compared with the air levels and skin levels. The air and skin concentrations were measured in the same workplace, but at a different time point than the blood collection. The adduct levels in exposed workers are more related to skin contamination than to air concentration, indicating that skin contamination is the main source of internal dose. Cataracts are sometimes the first and only sign of adverse health effects in TNT-exposed workers. Health records show that 29 out of 126 exposed workers from this factory have developed cataracts (Liu et al. 1995). The prevalence of cataracts correlates with the increase of TNT-Hb adducts. No cataracts were found when the TNT-Hb level was below 30 ng/g Hb (determined by ELISA), even for individuals who had been employed for up to 20 years in this factory. The three subjects with the highest level of adducts i300 ng/g Hb were all diagnosed with cataracts. Possibly similar protein adducts of TNT occur with lens proteins of exposed workers. This is subject of a future study. 27

28

Scheme 2.

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

Scheme 1.

2

2.3 2.3.2.4

Biological Monitoring of Arylamines and Nitroarenes

Females with Polyurethane Coated Breast Implants Exposed to 2,4-Toluenediamine (24TDA)

Another topic of concern is the non-occupational exposure to aromatic amines released from medical devices made of polyurethane (PU). We demonstrated the presence of degradation products of PU – namely monomeric toluenediamines: 2,4-toluenediamine (24TDA) a suspected human carcinogen and 2,6-toluenediamine (26TDA) – in the blood and urine up to two years after operation from patients with PU-covered breast implants (Sepai et al. 1995b). From our results we can estimate a potential risk from these implants. After a lag period of approximately 20 days, where no TDA above background levels were detected in the plasma, the levels of both 24TDA and 26TDA rose, reached a maximum of 4.4 (2.1) ng/ml plasma for 24TDA (26TDA), and remained at those levels for over 180 days. Most TDA was covalently bound to the plasma proteins, especially albumin. An adduct level of 4.4 ng TDA/ml plasma corresponds to a daily dose of 70400 ng for a 60 kg person. This was calculated by comparison to the adduct level found associated with plasma in rats dosed with radioactive TDA (Grantham et al 1978) and a steady-state to single dose conversion factor for albumin adducts of about 29 (Sabbioni et al. 1987). This value is about 300 times larger than the daily dose estimation from two implants reported by the Expert Panel of the Canadian Medical Association (1991). The Expert Panel ascribes five additional breast cancers in 10 million patients with two implants. But our risk estimation is about 1500 additional breast cancer cases in 10 million women. This additional risk is, of course, minuscule when 1 in 10 women is likely to be inflicted with breast cancer in the normal western population. However, the risk of 24TDA was only related to breast cancer. We should keep in mind that the primary site of action of this suspected carcinogen is the liver or the kidney. This infers that the risk of liver cancer may be of more concern. Our calculated dose level is about 1200 times lower than the TD50 in rats (Gold et al. 1993), that is a HERP of 0.08 %.

2.3.2.5

Summary

In several cases ambient monitoring is a poor exposure measure for humans. The internal dose takes into account different modes of exposure, metabolism, and individual susceptibilities. The presence of Hb adducts indicates the bioavailability of N-hydroxy-arylamines, which is the key intermediate for the subsequent biochemical effects. We found hemoglobin adducts in different groups of workers, although sometimes the air levels were below detection limit. From the measured Hb-adduct levels, we estimated the daily dose which was then compared to rodent carcinogenic potency data. The HERP indexes for the arylamines we have studied were 0.3 % for 29

2

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

2MA, 0.01 % for MDA, and 0.08 % for 24TDA. The genotoxic risk resulting from these chemicals, without taking into account synergistic effects, is possibly comparable to the hazard from formaldehyde in conventional home air (HERP index of 0.6 %) (Ames et al. 1987).

2.3.3 Biomonitoring of DNA Adducts Using HPLC/MS/MS The measurements in tissues from animals and humans of DNA adducts derived from environmental and endogenous carcinogens are essential for relating exposure with DNA damage (Poirier and Beland 1997). The levels of DNA adduction are typically 1 in 106–109 normal nucleotides. Therefore, highly sensitive techniques are required for the analysis of the small amounts of DNA (1–300 mg) available in human studies. The 32P postlabeling assay is the method most widely used for the analysis of DNA adducts (Talaska et al. 1992, Beach and Gupta 1992, Izzotti 1998, Phillips and Castagnaro 1999). This assay uses g-32P-labeled adenosine triphosphate to incorporate a highly radioactive reporter group into nucleotides After enzymatic hydrolysis of DNA, and the postlabeling procedure, the nucleotides are separated from normal nucleotides by TLC or HPLC, and visualized by radioautography or in-line scintillation counting, respectively. These procedures can yield very sensitive detection of adducted nucleotides. The major drawbacks are (Phillips and Castagnaro 1999): the inability to characterize unknown adducts, its susceptibility to false positives or false negatives, x poor reproducibility, x difficult interpretation of the spots on the 2-dimensional and 4-dimensional TLC plates, x extensive method validation is required for reliable quantitative performance. x x

In recent years, HPLC/MS/MS has gained an important role in bioanalytical chemistry for structure characterization, trace level detection, and quantification. The major advantages of HPLC/MS/MS are: analyses using isotopically labeled internal standards, exceptional selectivity and specificity, x additional evidence from characteristic retention times, x the potential for quantitative analyses without chemical derivatization reactions, x no need to work with radioisotopes. x x

30

2.3

Biological Monitoring of Arylamines and Nitroarenes

In view of these features, several laboratories, have been interested in replacing the 32P postlabeling methods with the new HPLC/MS/MS technique (Andrews et al. 1999, Beland et al 1999, Doerge et al. 1999, Gangl et al. 1999). In general, the following principles were adopted to develop a method for the characterization and quantification of DNA adducts: synthesis of standards, use of the synthesized standards to optimize chromatographic and detection conditions, x evaluation of detection limits in vitro, x application of the methodology to an in vivo system. x x

Recently, HPLC/MS analyses were successfully conducted on the dG-C8 adduct of 4-aminobiphenyl in rodents. Doerge et al. (1999) developed a quantitative isotope dilution method for analysis of N-(deoxyguanosine-8-yl)4-aminobiphenyl (dG-C8-4-ABP), which is the principal nucleoside adduct of 4-aminobiphenyl (4-ABP) modified DNA. Column switching valves were used to perform on-line sample concentration and cleanup. This permitted direct analysis of enzymatic DNA hydrolysates using narrow bore liquid chromatography. ESI/MS was performed by monitoring [MþH]þ (m/z ¼ 435) and two fragment ions (m/z ¼ 319, 195) characteristic for dG-C8-4-ABP, along with [MþH]þ (m/z ¼ 444) and a fragment ion (m/z ¼ 328) for the deuterated internal standard. The detection limit for dG-C8-4-ABP in DNA-hydrolyzates was ~10pg on-column. For a sample containing 100 mg DNA, this corresponds to 0.7 dG-C8-4-ABP adducts in 107 normal nucleotides. Doerge et al. (1999) analyzed calf thymus DNA modified in vitro and hepatic DNA isolated from mice treated in vivo with two dose levels (0.1 or 1.0 mg/kg body weight) of 4-ABP. The adduct level for these mice was 5 and 30 dG-C8-4-ABP adducts in 107 normal nucleotides. The relative standard deviation of intraassay precision varied from 9.7–17.7 %. In another recent study Gangl et al (1999) applied capillary liquid chromatography/microelectrospray mass spectrometry to the detection of deoxyribonucleoside adducts of the food-derived mutagen 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline (IQ) from in vitro and in vivo sources. Selective reaction monitoring techniques with a triple-quadrupole mass spectrometer enabled sensitive and specific detection of IQ adducts in vitro and in animals. The detection limit was 1 adduct in 107 unmodified bases using 300 mg of DNA. The DNA adducts N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline and 5-(deoxyguanosin-N 2 -yl)-2-amino-3-methyl-imidazo[4,5-f]quinoline were found in kidney tissues of chronically treated cynomolgus monkeys.

31

2

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

2.3.4 Conclusions Mass spectrometric ionization and detection methods are in a very dynamic state of growth. It is reasonable to expect further improvements in HPLC/MS instrumentation technology. Possibly, the HPLC/MS techniques will achieve the sensitivity of current radio-chemical detection methods. Sensitive HPLC/MS assays will enable a parallel use of the different adduct detection techniques. Mass spectrometry will be the essential tool for confirmation of adduct structures and recognition of new adducts in animal and possibly also in human experiments. The levels of detection in HPLC/MS/MS studies could be further improved by optimizing the HPLC side of the analytical system, i. e., the coupling of micro HPLC with microspray. In addition, there is still room for improvements in the handling (enzymatic digestion, extraction) of the DNA to increase the yields and the reproducibility of DNA-adduct recovery. Thus, in the future, it may be possible to detect adducts in the range of 1 adduct in 108–109 normal bases. This detection limit is necessary to match the sensitivity of the postlabeling assay which has been used in biomonitoring studies of populations exposed to carcinogens. References Ames, B. N., Magaw, R., Gold, L. S.: Ranking possible carcinogenic hazards, Science, 236, 271–280 (1987). Andrews, C. L., Vouros, P., Harsch, A.: Analysis of DNA adducts using high-performance separation techniques coupled to electrospray ionization mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 856, 515–526 (1999). Beach, A. C., Gupta, R. C.: Human biomonitoring and the 32P-postlabeling assay, Carcinogenesis, 13, 1053–1074 (1992). Beland, F. A., Doerge, D. R., Churchwell, M. I., Poirier, M. C., Schoket, B., Marques, M.: Synthesis, characterization, and quantitation of a 4-aminobiphenyl DNA adduct standard, Chem. Res. Toxicol., 12, 68–77 (1999). Birner, G., Neumann, H.-G.: Biomonitoring of aromatic amines. II: Hemoglobin binding of some monocyclic aromatic amines, Arch. Toxicol., 62, 110–115 (1988). Cocker, J., Nutley, B. P., Wilson, H. K.: A biological monitoring assessment of exposure to methylene dianiline in manufacturers and users, Occup. Environ. Med., 51, 519–522 (1994). Crabtree, H. C., Hart, D., Thomas, M. C., Witham, B. H., McKensie, I. G., Smith, C. P.: Carcinogenic ranking of aromatic amines and nitro compounds, Mutat. Res., 264, 155–162 (1991). Doerge, D. R., Churchwell, M. I., Marques, M. M., Beland, F. A.: Quantitative analysis of 4-aminobiphenyl-C8-deoxyguanosyl DNA adducts produced in vitro and in vivo using HPLC-ES-MS, Carcinogenesis, 20, 1055–1061 (1999). Expert panel of the Canadian Medical Association: Safety of polyurethane-covered, breast implants, Can. Med. Assoc. J., 145, 1125–1128 (1991). Gangl, E. T., Turesky, R. J., Vouros, P.: Determination of in vitro and in vivo-formed DNA adducts of 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline by capillary liquid chromatography/microelectrospray mass spectrometry, Chem. Res. Toxicol., 12, 1019–1027 (1999).

32

2.3

Biological Monitoring of Arylamines and Nitroarenes

Gold, L. S., Manley, N. B., Slone, T. H., Garfinkel, G. B., Rohrbach, L., Ames, B. N.: The fifth plot of the carcinogenic potency database: results of animal bioassays published in the general literature through 1988 and by the National Toxicology Program through 1989, Environ. Health Perspect., 100, 65–135 (1993). Gold, L. S., Slone, T. H., Stern, B. R., Manley, N. B., Ames, B. N.: Rodent carcinogens: setting priorities, Science, 258, 261–265 (1992). Goodman, G., Wilson, R.: Quantitative prediction of human cancer risk from rodent carcinogenic potencies: a closer look at the epidemiological evidence for some chemicals not definitively carcinogenic in humans, Regul. Toxicol. Pharmacol., 14, 118–146 (1991). Grantham, P. H., Mohan, L., Benjamin, T., Roller, P. P., Miller, J. R., Weisburger, E. K.: Comparison of the metabolism of 2,4-toluenediamine in rats and mice, J. Environ. Pathol. Toxicol., 3, 149–166 (1978). Izzotti, A.: Detection of modified DNA nucleotides by postlabeling procedures, Toxicol. Methods, 8, 175–205 (1998). Liu, Y.-Y., Yao, M., Fang, J.-L., Wang, Y.-W.: Monitoring human risk and exposure to trinitrotoluene (TNT) using haemoglobin adducts as biomarkers, Toxicol. Lett., 77, 281–287 (1995). Phillips, D. H., Castagnaro, M.: on behalf of the trial partcipants. Carcinogenesis, 14, 301–315 (1999). Poirier, M. C., Beland, F. A.: Aromatic amine DNA adduct formation in chronically-exposed mice: considerations for human comparison, Mutat. Res., 376, 177–184 (1997). Sabbioni, G., Beyerbach, A.: Biomonitoring of arylamines: haemoglobin adducts of aniline derivatives, J. Chromatog. B., 667, 75–83 (1995). Sabbioni, G., Schütze, D.: Hemoglobin binding of bicyclic aromatic amines, Chem. Res. Toxicol. 11, 471–483 (1998). Sabbioni, G., Sepai, O.: Comparison of hemoglobin binding, mutagenicity and carcinogenicity of arylamines and nitroarenes, Chimia, 49, 374-380 (1995), and 53, 456 (1999). Sabbioni, G., Hemoglobin binding of nitroarenes and quantitative structure-activity relationships. Chem. Res. Toxicol., 7, 267–274 (1994a). Sabbioni, G., Hemoglobin binding of arylamines and nitroarenes: molecular dosimetry and quantitative structure activity relationships, Environ. Health Perspect., 102 (Suppl 6), 61–67 (1994b). Sabbioni, G. Quantitative structure activity relationship of the N-oxidation of aromatic amines Chem.-Biol. Interact., 81, 91–117 (1992). Sabbioni, G., Skipper, P. L., Büchi, G., Tannenbaum, S. R: Isolation and characterization of the major serum albumin adduct formed by aflatoxin B1 in vivo in rats, Carcinogenesis, 8, 819–824 (1987). Sabbioni, G., Wei, J., Liu, Y.-Y.: Determination of hemoglobin adducts in workers exposed to 2,4,6-trinitrotoluene, J. Chromatogr. B., 682, 243–248 (1996). Schütze, D., Sepai, O., Lewalter, J., Miksche, L., Henschler, D., Sabbioni, G: Biomonitoring of workers exposed to 4,4l-methylenedianiline or 4,4l-methylenediphenyl diisocyanate, Carcinogenesis, 16, 573–582 (1995). Sepai, O., Czech, S., Eckert, P., Henschler, D., Sabbioni, G.: Exposure to toluene diamines from polyurethane-coated breast implants, Toxicology Lett., 77, 371–378 (1995a). Sepai, O., Henschler, D., Sabbioni, G.: Albumin adducts, hemoglobin adducts and urinary metabolites in workers exposed to 4,4l-methylenediphenyl diisocyanate, Carcinogenesis, 16, 2583–2587 (1995b).

33

2

Innere Belastung und Hämoglobin-Addukte

Talaska, G., Roh, J. H., Getek, T. J.: 32P-Postlabelling and mass spectrometric methods for analysis of bulky, polyaromatic carcinogen-DNA adducts in humans, Chromatogr., 580, 293–323 (1992). Talaska, G., Schamer, M., Casetta, G., Tizzani, A., Vineis, P.: Carcinogen-DNA adducts in bladder biopsies and urothelial cells: a risk assessment exercise, Cancer Lett., 84, 93–97 (1994). Tannenbaum, S. R. Bryant, M. S., Skipper, P. L., Maclure, M.: Hemoglobin adducts of tobacco-related aromatic amines: application to molecular epidemiology, Banbury Rep., 26, 63–75 (1986). Ward, E. M., Sabbioni, G., DeBord, D. G., Teass, A. W., Brown, K., Talaska, G., Roberts, D., Ruder, A., Streicher, R. P.: Biological monitoring of aromatic amine exposures at a chemical plant with a known bladder excess, J. Nat. Cancer Inst., 88, 1040–1052 (1996).

34

3 DNA Adducts 3.1 Genetic Cancer Susceptibility and DNA Adducts: Studies in Smokers and Coke Oven Workers Margarita Rojas*, Kroum Alexandrov*, Helmut Bartsch*, and Bertold Spiegelhalder*

Preventive strategies require the identification of cancer-susceptible individuals, resulting from combinations of carcinogen exposure, cancer-predisposing genes, and lack of protective factors. To this aim, related to tobacco smoking, we measured PAH-DNA adducts as exposure and susceptibility markers and the genetic polymorphism in drug-metabolizing enzymes related to CYP1A1, GSTM1, and GSTT1 genes in case-control studies. (þ)-anti-benzo(a)pyrene diol-epoxide (BPDE)-DNA adduct levels were quantified in white blood cells (WBC) and lung tissue DNA. CYP1A1 polymorphism and GSTM1 or GSTT1 gene deletion was analyzed in genomic DNA from lung parenchyma and WBC. Results from lung cancer patients and PAH-exposed coke oven workers allowed to correlate CYP1A1-GSTM1 genotype combinations with BPDE-DNA adduct levels. Smokers with homozygous CYP1A1 variant and GSTM1 null had highest adduct levels and were, as shown in Japanese smokers, most susceptible to lung cancer. Based on this short review we conclude that BPDE-DNA adduct levels resulting from at risk genotype combinations may serve as markers to identify most susceptible individuals.

3.1.1 Introduction The characterization of genetic determinants for cancer susceptibility is important for understanding the disease pathogenesis and for preventive measures. There is growing evidence that a group of predisposing polymorphic genes exists, as those involved in carcinogen metabolism and repair, which may increase cancer in certain environmentally exposed subjects, even when exposed only to low levels of carcinogens (Caporaso and Gold-

* Abt. für Toxikologie und Krebsrisikofaktoren, Deutsches Krebsforschungszentrum, Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg

35

3

DNA Adducts

stein 1995, Vineis et al. 1994, Vineis 1997). Within preventive strategies, it is therefore necessary to identify these vulnerable members in our society, particularly those suffering from an unfavourable combination of high carcinogen exposure, cancer-predisposing genes, and lack of protective (dietary) factors. Thus, molecular epidemiology faces the difficult task to analyze carcinogen-exposed individuals for a combination of at risk genotypes associated with higher cancer susceptibility. Instead of taking cancer as an endpoint, combinations of cancer-predisposing genes can then be explored by using DNA adducts as intermediate risk markers. With this approach it should become feasible to better define gene-environment interactions and provide knowledge for the identification of high-risk subjects within carcinogen-exposed populations. Some of the authors‘ current case-control studies on environmentally induced lung cancer related to cigarette smoking or PAH exposure of coke oven are briefly summarized. The literature cited is not exhaustive and the reader is referred to articles published earlier (Bartsch and Hietanen 1996, Bartsch 1996, Bartsch et al. 1995, Kriek et al. 1998).

3.1.2 Material and Methods DNA was isolated from normal lung tissue, obtained from untreated lung cancer patients undergoing surgery. Blood samples from male coke oven workers were obtained from a plant in France in 1995. Occupational exposure in the year of blood sampling ranged from I 0.15 to i 4 mg/m3 of benzo(a)pyrene (BP). All samples were coded and WBC were prepared on Ficoll and frozen before DNA extraction. DNA was extracted from non-tumorous lung tissue using proteinase K/RNase digestion and a modified phenol extraction procedure (Alexandrov et al. 1992). The DNA from WBC (either lymphocytes or lymphocyte and monocyte fraction, LMF) was isolated as described (Rojas et al. 1995). 0.2–1 mg DNA was used for analysis of BP tetrols by HPLC/FD (Alexandrov et al. 1992, Rojas et al. 1994), allowing quantification of (þ)-anti-BP diol-epoxide (BPDE)-DNA adducts (detection limit 0.2 BPDE-DNA adducts per 108 nt). In the lung cancer studies, PCR/RFLP based analysis of CYP1A1 gene polymorphisms and GSTM1 gene deletion was carried out as described. (Cascorbi et al. 1996, Brockmöller et al. 1993, Volkenandt et al. 1993, Arand et al. 1996). An allele carrying only a T to C transition 1194 bp downstream of exon 7 in the 3l-flanking region, leading to a Mspl-restriction site (m1), was termed *2A. An allele with m1 plus a mutation in exon 7 leading to an lle/Val-exchange at codon 462 (m2) due to an A to G transition at nt 4889 was termed *2B. The following nomenclature for the polymorphisms in GSTM1 and GSTT1 genes is used (Garte and Crosti 1998): GSTM1*1 active genotype comprises the functional allele configurations GSTM1*1A/*1A, GSTM*1B/*1B, 36

3.1

Genetic Cancer Susceptibility and DNA Adducts

GSTM1*1A/*2, and GSTM1*1B/*2. The non-functional null or deleted allele is GSTM1*2 and the corresponding deficient phenotype was termed GSTM1 null phenotype. Similarly, GSTT1*1 represents the active genotype, while the non-functional genotype null or deleted allele was denoted as GSTT1*2.

3.1.3 Results and Discussion 3.1.3.1

Bulky DNA Adducts in Human Lung Carcinogenesis and Disease Susceptibility

Cigarette smoking is the strongest risk factor for lung cancer, but drug-metabolizing enzymes, which often display genetic polymorphism and convert lung carcinogens from occupational environment or tobacco into DNA-binding metabolites in target cells, can modulate intermediate effect markers, e. g. DNA adducts, and ultimately the cancer risk. Substantial evidence that bulky, mostly PAH-derived DNA adducts have a significance for the onset of lung carcinogenesis in smokers and PAH-exposed workers has been summarized (Kriek et al. 1998). Having developed a sensitive and specific HPLC/FD for BPDE-DNA adduct detection in human lung tissue and LMF (Rojas et al. 1994), the aims of our ongoing studies are (i) to identify specific genotype combinations that lead to high BPDE-DNA adduct levels in smokers and PAH-exposed workers and (ii) to use the characterized markers for early detection of individuals susceptible to lung cancer. Within the complex DNA adduct pattern found in smokers‘ lungs we concentrated on the polycyclic aromatic hydrocarbon BP, because it is an important carcinogenic constituent in tobacco smoke, polluted air, and in the occupational environment. The mechanism by which BP interacts with DNA, activates oncogenes,

Figure 1: Principal metabolic pathways of BP in human lung, leading to the formation of the ultimate carcinogenic metabolite BPDE which reacts with DNA, if not detoxified by glutathione S-transferases (GST). The resulting DNA adducts lead to the initiation of lung carcinogenesis.

37

3

DNA Adducts

and initiates carcinogenic processes involves the formation of one of the enantiomeric BP diol-epoxides (BPDE). The biologically most active enantiomer is the (þ)-anti-BPDE, a major ultimate carcinogen which can now be quantified by our HPLC/FD technique. In human lung, cytochrome P4501A1-related catalytic activity is one of the enzymes that convert polycyclic PAH into DNA-binding metabolites as shown for BP (Fig. 1). For CYP1A1-related enzyme activity in human lung, BP-3-hydroxylase (AHH) is a marker. Glutathione S-transferases (GST) including GSTM1 in the liver and GSTM3 in the lung detoxify reactive diol-epoxide intermediates (Fig. 1). Our previous studies revealed a dramatic impact of tobacco smoke on carcinogen-metabolizing enzymes in the human lung (Bartsch 1996).

3.1.3.2

Smoking Enhances BPDE-DNA Adduct Levels in White Blood Cells of PAH-Exposed Coke Oven Workers

Because of the precision of the HPLC/FD method, the level of BPDE-DNA adducts could be determined in WBC from PAH-exposed coke oven workers. The aim was to see whether (i) smoking enhances the binding of PAH to DNA and (ii) whether CYP1A1-GSTM1 genotype combinations can act as modifiers of DNA adduct levels. Groups of coke oven workers exposed to PAH and non-exposed controls, each containing smokers and non-smokers, were investigated (Rojas et al. 1995). The BPDE-DNA levels in WBC of workers were 15 times higher than those from non-exposed controls. However, the most important finding was that smoking increased the adduct levels in PAH-exposed workers, leading to a 200-fold interindividual variation in smoking workers and only to a 6-fold variation in non-smoking workers. The enhancing effect of smoking on DNA adduct levels in WBC from PAH-exposed workers was confirmed recently (Van Schooten et al. 1995). These increased levels and high variability of BPDE-DNA adducts in smoking workers suggest genetic variations in PAH metabolism and DNA-adduct formation. This is now supported by our observation on BPDE-DNA adduct dependence from specific CYP1A1-GSTM1 genotype combinations (see below). As the same synergetic effects may occur in the lung, this would provide an explanation for the enhancing effect of smoking in PAH-associated occupational lung cancer risk. Recent studies showed that DNA adduct levels in WBC of smokers are correlated with adduct levels in lung tissue of lung cancer patients (Tang et al. 1995, Wiencke et al. 1995). The regulation of CYP1A1 expression is complex and also involves transcriptional control elements regulating the enzyme induction, which have not fully been characterized at the molecular level. Therefore, a genotype/phenotype approach was applied to examine the BPDE-DNA adduct levels in lung cancer tissue from patients with high CYP1A1 inducibility (Bartsch 1996). This phenotype was measured by immunohistochemical staining with a monoclonal antibody, while the GSTM1 inactive was determined by PCR. As compared to the 38

3.1

Genetic Cancer Susceptibility and DNA Adducts

respective wild type, smokers with similar cigarette consumption had 100-fold higher BPDE-DNA adduct levels in bronchial tissue (Bartsch 1996), if they were both GSTM1 null and highly inducible for CYP1A1. This large difference was not seen in lung parenchymal tissue. Although GSTM1 is not expressed in human lung, GSTM3 related activity is found in this tissue which seems to be co-regulated with the GSTM1 form (Nakajima et al. 1995). Thus, individuals with nulled GSTM1 genotype suffer from impaired detoxification of tobacco carcinogens qualitatively because of the absence of GSTM1 in the body and low expression of GSTM3 in the lung as well as quantitatively because of the overall lower GST activity. This effect of GSTM1 null on lung PAH adduct levels was also seen in a Finnish cohort of lung cancer patients (Bartsch and Hietanen 1996). In current smokers, the GSTM1 gene deletion resulted in a 10 % increase in total bulky DNA adduct levels in lung, whereas in ex-smokers it was even 2.5-fold. This increase in DNA adduct levels is compatible with results from a meta-analysis of lung cancer patients with GSTM1 deficiency according to which in smokers the relative risk increases to 1.4 for lung cancer of all major histological subtypes. This increased risk would account for 17 % of all new lung cancers being caused in smokers annually, because of the high relevance of the GSTM1 null genotype that occurs in about 50 % of Caucasians (McWilliams et al. 1995). A study in human cell lines revealed that GSTM1 deletion is associated with high inducibility by TCDD of the CYP1A1 gene transcription (Vaury et al. 1995). Although the underlying mechanism is not fully understood, this observation in vitro and our data on genotype dependence of PAH adduct levels in humans further underline the major importance of GYP1A1/GSTM1 as risk modifiers of tobacco-associated DNA damage and lung cancer. The latter is supported by case-control studies in Japanese and by our recent genotyping results (see below). Results from our earlier work suggested that PAH present in tobacco smoke induce pulmonary CYP1A1 gene expression only in certain individuals. As a consequence, the generation of DNA-reactive metabolites from tobacco carcinogens in lung target cells should be affected by polymorphic genes whose products are involved in the activation and detoxifying reactions of PAH. Therefore, we subsequently examined whether a correlation exists between the CYP1A1-related catalytic activity in the lung of smokers and the level of PAH-DNA adducts that are thought to be critical for the onset of lung carcinogenesis. Initially, we used the sensitive method of 32P postlabelling for detecting tobacco smoke-associated DNA adducts. Then, because of the low specificity of this method, an improved analytical procedure by HPLC/FD was developed to quantify BPDE after its binding to cellular DNA in humans (Alexandrov et al. 1992). Both methods were then applied to lung parenchyma of smokers to determine the level of DNA adducts. In the same lung samples the microsomal CYP1A1-related enzyme (AHH) activity was measured. A positive, highly significant correlation (0.91 P I 0.001) was found between the pulmonary enzyme activity and the level of BPDE-DNA adducts. The level of total bulky PAH-DNA adducts 39

3

DNA Adducts

(by 32P postlabelling) was also correlated with AHH, but less strongly. Surprisingly, in this study on Italian smokers, the BPDE-DNA adducts alone accounted for about 20 % of the total bulky adducts in smokers‘ lungs. These correlations explain why variation in inducibility or genetic polymorphism of CYP1A1-related enzyme activity acts as a modifier of lung cancer risk in smokers. They also implicate CYP1A1 in the formation and binding of BPDE to lung DNA in smokers.

3.1.3.3

CYP1A1/GSTM1 Genotype Dependence of BPDE-DNA Adduct Levels and Risk for Smoking-related Lung Cancer

In Japanese populations, a significant correlation between susceptibility to lung cancer and homozygosity for the CYP1A1 Mspl allele (*2A/*2A) was reported (Kawajiri et al. 1990, Nakachi et al. 1991, 1993). Hayashi et al. (1992) found exon-7 mutation (*2B) to be associated with squamous cell and small cell lung cancer. Case-control studies revealed that Japanese individuals with the susceptible CYP1A1 (*2A/*2A or *2B/*2B) genotype combined with GSTM1 null were at remarkably higher risk particularly for Kreyberg I type and squamous-cell carcinoma of the lung at a low-dose level of cigarette smoking (Kihara and Noda 1995). Individuals having homozygous CYP1A1 (*2A/*2A) were found to be relatively resistant to tobacco-related lung cancers when combined with GSTM1 active, but were highly susceptible when combined with GSTM1 null, leading to a 7–8-fold increased risk (Kihara and Noda 1995). In addition, lung cancer patients with the at risk CYP1A1 (*2A/*2A or *2B/*2B) combined with a GSTM1 null genotype had remarkably shortened survivals as compared with patients with the wild-type allele combination (Goto et al. 1996), confirming earlier results based on phenotyping (Bartsch et al. 1990). These studies suggested a genetic basis for the association of high CYP1A1 metabolic activity and GSTM1 null genotypes with increased lung cancer incidence, but the underlying molecular mechanisms regulating this effect are still not well understood (discussed in Rojas et al. 1998). For these reasons, the levels of BPDE-DNA adducts were analyzed by HPLC/FD in non-tumorous lung tissues from 20 lung cancer patients and in WBC from 20 PAH-exposed coke oven workers, all current tobacco smokers. CYP1A1 mutations and GSTM1 deletion polymorphisms in each subject were analyzed in genomic DNA by PCR/RFLP (Cascorbi 1996). Our results showed, for the first time, a clear effect of the combination of CYP1A1 and GSTM1 genotypes on the formation of BPDE-DNA adducts in human lung and WBC (Tab. 1). (i) Subjects with GSTM1 active genotype did not show any detectable BPDE-DNA adducts (I 0.2 per 108 nt). (ii) Those with CYP1A1*1/*1 or heterozygous for GYP1A1*2A or *2B and with GSTM1 null combination showed low but significantly increased (P I 0.00005) levels of BPDE-DNA adduct formation. (iii) Those with CYP1A1*2A/*2A mutant allele from the GSTM1 null group showed the 40

3.1

Genetic Cancer Susceptibility and DNA Adducts

Table 1: Classification of CYP1A1-GSTM1 genotype combinations into groups with low, intermediate and high levels of BPDE-DNA adducts. The data were compiled for lung parenchymal DNA from 20 smoking lung cancer patients and for WBC-DNA from 20 PAH-exposed (asymptomatic) coke oven workers (Rojas et al. 1998). Smokers with the combination of mutated homozygous CYP1A1 and GSTM1 null had highest PAH-DNA adduct levels and were shown earlier to be at high risk for squamous cell carcinoma (SCC) of the lung in Japanese populations, even at a low dose of cigarette smoking (Nakachi and Imai 1996). For details see text. Genotype combination

CYP1A1 *1/*1-GSTM1 active CYP1A1 *1/*2A-GSTM1 active CYP1A1 *1/*1-GSTM1 *0/*0 CYP1A1 *1/*2A or *2B-GSTM1 *0/*0 CYP1A1 *2A/*2A-GSTM1 *0/*0 CYP1A1 *2A/*2B-GSTM1 *0/*0 CYP1A1 *2B/*2B-GSTM1 *0/*0

BPDE Adducts per 108 nt (median)

Odds ratios for genetic susceptibility of Japanese smokers for SCC Low High cigarette cigarette dose dose

Lung DNA from lung cancer patients (n ¼ 20)

WBC DNA from coke oven workers (n ¼ 20)

I 0.2

I 0.2

1.0

I 0.2

I 0.2

(Z0.5)

a)

13.0

0.7

0.7

(Z3.0)

a)

11.8

0.6

(Z3.0)

a)

16.3

6.4

44.0

16.0

20.0

1.9

n. d.

n. d.

n. d.

n. d.

n. d.

41.0

n. d.

n. d.

b)

9.0

a) approximate values extracted from Nakachi and Imai 1996. b) not determined.

highest BPDE-DNA adduct levels. A graphical representation of these data is shown in Figure 2. These consistent results in the two pilot study groups demonstrated that the combination of homozygous mutated CYP1A1 and GSTM1 null led at a similar or even lower smoking dose to a stronger increase of BPDE-DNA adduct levels than found in subjects with CYP1A1 and GSTM1 wild type. In accordance to our observation, Soni et al. (1998) reported higher bulky DNA adduct levels in lymphocytes of smokers who had a deficient GSTM1 enzyme activity. Our data also provide, for the first time, a mechanistic understanding of previous epidemiological studies that correlated these at risk genotypes in Japanese with increased smoking-related lung cancers particularly at lower level of cigarette consumption (Nakachi and Imai 1996) as well as shortened survival of lung cancer patients (Goto et al. 1996). Although homozygous carriers of the Mspl mutation of CYP1A1 are very rare among 41

3

DNA Adducts

Figure 2: Genotype dependence of BPDE-DNA adduct levels in lung (smokers) and WBC (coke oven workers); mutated (M), deleted (0).

Caucasians (I1 %) (Cascorbi et al. 1996), a Scandinavian study found the combined CYP1A1 (Mspl) and GSTM1 null genotype significantly overrepresented in patients with squamous-cell carcinoma of the lung (Alexandrie et al. 1994). Taken together, our findings are also consistent with the prevalence of G:C p T:A transversion mutations found in the p53 tumor suppressor gene of tobacco-associated lung tumors, suggesting PAH-related mutational damage that occurs more frequently in persons who are GSTM1 null (Ryberg et al. 1994). Furthermore, the coincidence of mutational hotspots in p53 and BPDE-related adduct hotspots suggests that BPDE and structurally related PAH diol-epoxides are involved in the transformation of human lung tissue in smokers (Denissenko et al. 1996). In conclusion, the examination of BPDEDNA adducts resulting from the GSTM1 and the CYP1A1 polymorphisms and their interaction with other susceptibility markers like mutagen sensitivity and impaired DNA-repair capacity (Hsu 1987) will help to identify high-risk subjects among smokers and subjects occupationally and/or environmentally exposed to PAH. There is growing evidence that predisposing polymorphic genes involved in carcinogen metabolism and repair increase cancer risk in certain subjects (Caporaso and Goldstein 1995), even when exposed only to low levels of carcinogens (Vineis et al. 1994, Vineis 1997). It would therefore be necessary within preventive strategies to identify these vulnerable members in our society, particularly those suffering from very unfavorable combinations of carcinogen exposure, predisposing genes, and lack of protective factors.

42

3.1 3.1.3.4

Genetic Cancer Susceptibility and DNA Adducts

Acknowledgements

We acknowledge the collaboration and contributions during various phases of our studies on lung cancer patients and coke oven workers by G. Auburtin and L. Mayer (Institut National de L’Environment Industriel et des Risques, Verneuil en Hallate, France), I. Cascorbi, J. Brockmöller, and I. Roots (University Clinic Charite´, Humboldt University, Berlin, Germany), and H. Vainio, S. Anttila, and K. Husgafvel-Pursiainen (Institute of Occupational Health, Helsinki, Finland). References Alexandrie, A. K., Sundberg, M. I., Seidegard, J. et al.: Genetic susceptibility to lung cancer with special emphasis on CYP1A and GSTM1: a study on host factors in relation to age at onset, gender and histological cancer types, Carcinogenesis, 15, 1785–1790 (1994). Alexandrov, K., Rojas, M., Geneste, O. et al.: An improved fluorometric assay for dosimetry of benzo(a)pyrene diol-epoxide-DNA adducts in smoker’s lung: comparison with total bulky adducts and aryl hydrocarbon hydroxylase activity, Cancer Res., 52, 6248–6253 (1992). Arand, M., Muhlbauer, R., Hengstler, J. et al.: Multiplex polymerase chain reaction protocol for the simultaneous analysis of the glutathione S-transferase GSTM1 and GSTT1 Polymorphisms, Anal. Biochem. 236, 184–186 (1996). Bartsch, H., Hietanen, E., Petruzzelli, S. et al.: Possible prognostic value of pulmonary Ah-locus-linked enzymes in patients with tobacco-related lung cancer, Int. J. Cancer, 46, 185–188 (1990). Bartsch, H., Hietanen, E.: The role of individual susceptibility in cancer burden related to environmental exposure, Environ. Hlth. Perspect, 104 (S3), 569–577 (1996). Bartsch, H., Rojas, M., Alexandrov, K. et al.: Metabolic polymorphism effecting DNA binding and excretion of carcinogens in humans, Pharmacogenetics, 5, 84–90 (1995). Bartsch, H.: DNA adducts in human carcinogenesis: etiological relevance and structure-activity relationship, Mutat. Res., 340, 67–79 (1996). Brockmöller, J., Kerb, R., Drakoulis, N. et al.: Genotype and phenotype of glutathione S-transferase class m isoenzymes in lung cancer patients and controls, Cancer Res., 53, 1004–1011 (1993). Caporaso, N., Goldstein, A.: Cancer genes – single and susceptibility – exposing the difference, Pharmacogenetics, 5, 59–63 (1995). Cascorbi, I., Brockmöller, J., Roots, I.: A C4887A polymorphism in exon 7 of human CYP1A1: population frequency, mutation linkages, and impact on lung cancer susceptibility, Cancer Res. 56, 4965–4969 (1996). Denissenko, M. F., Pao, A., Tang, M. S. et al.: Preferential formation of benzo(a)pyrene adducts at lung cancer mutational hotspots in p53, Science, 274, 430–432 (1996). Garte, S. A., Crosti, F. A.: Nomenclature system for metabolic gene polymorphisms, in: Vineis, P., Lang, M., Caporaso, N., et al. (eds.): Metabolic Polymorphism and Cancer, IARC Sci. Publ., Lyon, IARC (1998). Goto, M., Yoneda, S., Yamamoto, M. et al.: Prognostic significance of germ line polymorphisms of the GYP1A1 and glutathione S-transferase genes in patients with nonsmall cell lung cancer, Cancer Res., 56, 3725–3730 (1996). Hayashi, S.-I., Watanabe, J., Kawajiri, K.: High susceptibility to lung cancer analyzed in terms of combined genotypes of P4501A1 and Mu-class glutathione S-transferase genes, Jpn. J. Cancer Res., 83, 866–870 (1992).

43

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DNA Adducts

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44

3.1

Genetic Cancer Susceptibility and DNA Adducts

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45

3

DNA Adducts

3.2 Nachweis von DNA-Addukten für ein Biological Monitoring Werner K. Lutz* und Martin G. Maisch*

3.2.1 Einleitung DNA-Addukte entstehen durch kovalente Bindung von chemisch reaktiven Substanzen bzw. deren reaktiver metabolischer Zwischenprodukte an DNA. Als Folge von DNA-Addukten können Mutationen entstehen, so dass die DNA-Adduktbildung als frühes Ereignis im Prozess der chemischen Mutagenese und Kanzerogenese bezeichnet werden kann. In Bezug auf ein Biological Monitoring werden DNA-Addukte deshalb nicht nur als Expositionsmarker, sondern auch als biochemische Beanspruchungsmarker diskutiert. Als DNA-Quelle kommen für ein Expositionsbiomonitoring weiße Blutzellen wohl am ehesten in Betracht. Weitere Quellen wie abgeschilferte Zellen des Urothels aus dem Urin oder Abstriche der Mundschleimhaut geben wegen der begrenzten DNA-Menge meist nicht die geforderte Nachweisempfindlichkeit. Biopsie- und chirurgisches Resektionsmaterial kann nur in Ausnahmefällen gewonnen werden. Die wichtigsten Methoden zum Nachweis von DNA-Addukten sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die erste Publikation der Analyse einer menschlichen DNA-Probe basierte auf einem gegen Benzpyren-DNA-Addukte gerichteten Antiserum (Perera et al. 1982). Weitere immunologische Analysen sind für DNA-Addukte von 2-Acetylaminofluoren, Aflatoxin, Cisplatin, 8-Methoxypsoralen, methylierenden Agentien und von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) erwähnt. Wegen Kreuzreaktionen und der damit verbundenen Probleme bei der Quantifizierung wurden Antikörper in den letzten Jahren weniger häufig zur direkten Bestimmung einer Adduktkonzentration, vermehrt hingegen zur Anreicherung von Addukten mittels Affinitätschromatographie eingesetzt. Parallel zu den immunologischen Nachweismethoden erfolgte die Entwicklung der 32P-Postlabelling-Methode (Randerath et al. 1981). Später

* Institut für Toxikologie, Universität Würzburg, Versbacher Str. 9, 97078 Würzburg

46

3.2

Nachweis von DNA-Addukten für ein Biological Monitoring

Tabelle 1: Methoden zur Messung von DNA-Addukten und deren Nachweisgrenzen (Garner 1998, modifiziert und ergänzt). Methode

Relative Nachweisgrenze Addukte / bezogen auf die Nukleotide DNA-Probenmenge (mg)

Immunassay (nicht mehr eingesetzt für eine direkte Quantifizierung) 1 Slot-blot assay 3 / 105 USERIA 1 / 107 25 ELISA kompetitiv 3 / 107 50 ELISA nicht-kompetitiv 1 / 107 1 32

P-Postlabelling (gewisse Einschränkungen bezüglich struktureller Anforderungen) Standardmethode 1 / 107 10 Nach Anreicherung der Addukte (Nuklease P1; Extraktion; Chromatographie) 1 / 109 10 Fluoreszenzspektroskopie (große Einschränkungen bezüglich Anforderungen) Bei Niedrigtemperatur 3 / 107 Synchronfluoreszenz 3 / 107 Linien-Verengungsanalyse 1 / 108

struktureller 1000 100 1000

Elektrochemische Detektion (große Einschränkungen bezüglich struktureller Anforderungen) 1 / 107 50 Massenspektrometrie (geringe Einschränkungen bezüglich struktureller Anforderungen) GC/MS des Kanzerogens 3 / 109 100 (nach Abspaltung von der DNA) GC/MS von alkylierten Basen 3 / 108 100 LC/MS von Nukleosid-Addukten 1 / 107 100

kamen elektrochemische (Floyd et al. 1986), fluoreszenzspektroskopische (Weston et al. 1989, Alexandrov et al. 1992) und massenspektrometrische Methoden dazu. Mehrere Kongressbände (Bartsch et al. 1988, Gledhill und Mauro 1991, Bartsch et al. 1993, Hemminki et al. 1994) und Übersichtsarbeiten (Perera 1988, Schut und Shiverick 1992, Hemminki 1995, Schell et al. 1995, Talaska et al. 1996, Poirier 1997, Wild und Pisani 1997, Garner 1998) beschreiben Möglichkeiten und Grenzen der DNA-Adduktanalytik. Die mit den verschiedenen Methoden erreichbaren Nachweisgrenzen bezüglich Adduktkonzentration in der DNA und die dazu notwendigen DNA-Mengen sind ebenfalls in Tabelle 1 zusammengestellt. Zur Beurteilung der Anwendungsmöglichkeiten für ein Human-Biomonitoring möge dienen, dass die Grundbelastung von Menschen mit PAK über Nahrung und Luft zu Adduktkonzentrationen im Bereich von 1–10 auf 108 Nukleotide führt (Schoket 1999) und dass aus den Leukozyten im Allgemeinen etwa 10 mg 47

3

DNA Adducts

DNA pro Milliliter Humanblut isoliert werden können. Aus diesen Gründen erscheint die 32P-Postlabelling-Methode für ein Human-Biomonitoring einer Umweltbelastung als besonders gut geeignet. Zur Beurteilung der verschiedenen Methoden sind allerdings nicht nur quantitative, sondern auch qualitative Aspekte von Bedeutung, insbesondere die Frage nach dem strukturellen Informationsgehalt der Analyse. Die Postlabelling-Methode ist zwar sehr empfindlich, gibt aber keine direkte strukturelle Information. Am besten wäre in dieser Hinsicht die Massenspektrometrie (MS) geeignet. Beide Methoden sollen im folgenden näher vorgestellt werden.

3.2.2 Methoden 3.2.2.1

Die

32

P-Postlabelling-Methode

a) Nachweisprinzip DNA wird enzymatisch zu den Desoxynukleosid-3l-phosphaten (im folgenden 3l-Nukleotide genannt) abgebaut. Die 3l-Nukleotid-Addukte werden gegenüber den normalen 3l-Nukleotiden angereichert (siehe unten) und mit 32P-Phosphat aus [g-32P]ATP enzymatisch in 5l-Stellung phosphoryliert. Bei der dünnschichtchromatographischen Analyse unterscheiden sich die Nukleotid-Kanzerogen-Addukte chromatographisch von den normalen Nukleotiden und können nach zweidimensionaler Chromatographie auf der Dünnschichtplatte als radioaktive Flecken (spots) erfasst und mittels Radioaktivitätsmessung (am einfachsten durch elektronische Autoradiographie) quantifiziert werden. Eine ausführliche Methodenbeschreibung findet sich in (Gupta 1996). b) Anreicherung der Addukte Bei der am häufigsten verwendeten Anreicherung werden die nach der DNA-Hydrolyse erhaltenen 3l-Nukleotide (normale Nukleotide plus entsprechende Addukte) mit Nuklease P1 behandelt (Reddy und Randerath 1986). Dieses Enzym entfernt die Phosphatgruppe in 3l-Stellung. Die entstandenen Nukleoside sind keine Substrate mehr für eine enzymatische Phosphorylierung in 5l-Stellung und werden somit nicht mehr radioaktiv markiert. Viele Addukte sind schlechte Substrate für die Nuklease P1, behalten die 3l-Phos-Phosphatgruppe und können in 5l-Stellung 32P-phosphoryliert und damit erfasst werden. Leider sind bei weitem nicht alle Addukte Nuklease P1-resistent. Gut eignen sich die Addukte von PAK. Die meisten Adduktbestimmungen in humanen Proben sind deshalb an dieser Stoffklasse durchgeführt worden. Auch verschiedene Addukte von a,b-ungesättigten Aldehyden als Folgeprodukte von oxidativem Stress können auf diese Weise bearbeitet werden. Falls 48

3.2

Nachweis von DNA-Addukten für ein Biological Monitoring

dies nicht möglich ist, muss die Anreicherung mittels Extraktion (Gupta 1985) oder chromatographischer Verfahren erfolgen. c) Anwendungen Der erste Nachweis von Addukten in der DNA aus der Mundschleimhaut eines Rauchers und eines Nichtrauchers wurde auf einem Kongress Ende 1983 präsentiert (Randerath et al. 1984). Im Jahre 1986 folgte der Nachweis von DNA-Addukten in Plazentagewebe (Everson et al. 1986). Parallel dazu erfolgten die ersten Publikationen des Nachweises von DNA-Addukten in peripheren Lymphozyten von Koksofen-Arbeitern (Haugen et al. 1986). Die meisten Publikationen betreffen Expositionen gegenüber PAK durch Rauchen am Arbeitsplatz und durch allgemeine Luftverschmutzung. Diese Fokussierung auf PAK ist darauf zurückzuführen, dass sich die gebildeten Addukte gut mittels Nuklease P1 anreichern lassen und eine hohe Phosphorylierungsausbeute zeigen. Bei anderen Addukten sind die Voraussetzungen meistens nicht so gut. In solchen Fällen wird nicht immer der notwendige Aufwand zur methodischen Optimierung getrieben, so dass viele publizierte Daten nur qualitativ interpretiert werden können, z. B. für aromatische Amine, Styrol, einzelne Arzneimittel (Übersicht in Lutz 2000).

3.2.2.2

Massenspektrometrie

Die massenspektrometrische Analyse gibt im Vergleich zum 32P-Postlabelling auch eine strukturelle Information. Nachteilig sind die niedrigere Empfindlichkeit und die mangelnde Flüchtigkeit. Letzteres stellt insbesondere für die Analyse von Nukleosid-Addukten ein großes Problem dar. Die seit Jahrzehnten erfolgreich genutzte GC/MS Kopplung wird deshalb nur zur Untersuchung von (kleinen) Basen-Addukten oder nach Abspaltung der adduktbildenden Substanz eingesetzt. Das aromatische Amin 4-Aminobiphenyl (Lin et al. 1994, Culp et al. 1997) oder das heterozyklische Amin PhIP (Friesen et al. 1994) seien hier als Beispiele genannt. Der Nachweis von Basen-Addukten in Humanproben gelang z. B. durch Identifizierung von methyliertem (Shuker und Bartsch 1994) und 2-hydroxyethyliertem Guanin (Ranasinghe et al. 1998, Wu et al. 1999), sowie von Malonaldehydmodifiziertem Guanin (Rouzer et al. 1997). In den letzten Jahren wurde die LC/MS-Kopplung intensiv weiter entwickelt und die Analyse von Nukleosid-Addukten nach Elektrospray-Ionisierung (ESI) und Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) vorangetrieben. Beispiele sind die Desoxyguanosin-Modifikationen durch die heterozyklischen Amine PhIP und IQ (Rindgen et al. 1995, Gangl et al. 1999), 4-Aminobiphenyl (Doerge et al. 1999), Malonaldehyd (Chaudhary et al. 1996), sowie die Analyse von 1,N6-Etheno-desoxyadenosin (edAdo) (Chen et al. 1999). Letztere Arbeit beschreibt die bislang einzige uns bekannte Analyse von Nukleosid-Addukten in DNA aus einer Humanprobe (Plazenta) und weist eine Adduktkonzentration im Bereich von 2,5 edAdo pro Million dAdo aus. 49

3

DNA Adducts

3.2.3 Methodischer Forschungsbedarf 3.2.3.1

Situation in Deutschland

Die Postlabelling-Methode wird in etwa einem Dutzend Labors in Deutschland verwendet, und ein reger Erfahrungsaustausch ist dank regelmäßiger Treffen gewährleistet. Im Vordergrund stehen allerdings DNA-Proben aus invitro Inkubationen oder Tierversuchen im Zusammenhang mit der Frage nach gentoxischem Potenzial von bekannten oder potenziellen Mutagenen und Kanzerogenen. Publikationen von Originaldaten zum Human-Biomonitoring von DNA-Addukten sind rar und stammen fast ausschließlich aus der Gruppe von Prof. Bartsch am Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg. Die massenspektrometrische Analyse von DNA-Addukten aus Humanproben steht weltweit erst am Beginn. In Bezug auf die methodische Entwicklung ist in Deutschland ein Rückstand von etwa 5 Jahren gegenüber den USA festzustellen. Dies liegt nicht zuletzt auch am Preis leistungsfähiger Geräte (ab 0,5 Millionen DM) und dem damit verbundenen Problem einer Finanzierung ohne ausweisbare Vorleistungen. Die Großgeräteinitiative der DFG im Sommer 1999 konzentrierte sich (leider) auf Fourier-Transformund Time-of-Flight-Geräte, welche zur Analyse von Nukleosid-Addukten weniger geeignet sind. Der Einsatz der Massenspektrometrie zur Analyse von DNA-Addukten war bisher auf die strukturelle Verifikation von Basen-Addukten beschränkt (Beispiel: Pfau et al. 1997) oder stammte aus einem eher spektrochemisch orientierten Labor (Schrader und Linscheid 1997, Siethoff et al. 1999). Letzteres sollte vermehrt in molekular-epidemiologische Fragestellungen eingebunden werden. Unserer Ansicht nach sollten sowohl das Postlabelling (PL) als auch die MS für ein Human-Biomonitoring von DNA-Addukten weiter entwickelt werden, da sich die beiden Methoden bezüglich Empfindlichkeit und struktureller Information hervorragend ergänzen. Eine vermehrte Zusammenarbeit zwischen den entsprechenden Arbeitsgruppen ist anzustreben, sowohl in Bezug auf den Austausch von Proben als auch von synthetisierten Adduktstandards. Die Entwicklung weiterer Anreicherungs- und Analysenmethoden sollte ebenfalls gefördert werden.

3.2.3.2

32

P-Postlabelling-Methode

Diese Methode zeichnet sich dank der sehr hohen spezifischen Aktivität von P (7000 Ci/mmol) durch eine enorme Empfindlichkeit aus. Einige wenige Mikrogramm DNA können zum Nachweis einer Adduktkonzentration im Bereich von 1 auf 109 Nukleotide genügen. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass keine teuren Geräte benötigt werden und dass durch Verwendung von Einwegmaterial die Gefahr von Kontaminationen relativ gering ist. 32

50

3.2

Nachweis von DNA-Addukten für ein Biological Monitoring

Dringender Nachholbedarf besteht bezüglich Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Bestimmung einer Adduktkonzentration. Ringversuche in 15 Labors zur Analyse definierter Proben mit relativ hohen Adduktkonzentrationen ergaben nach Ausschluss von Ausreißern Variationskoeffizienten bis 100 % (Phillips und Castegnaro 1993, Phillips et al. 1999). Auch innerhalb eines Labors kann die gemessene Addukt-Konzentration von Versuchsansatz zu Versuchsansatz, insbesondere im Bereich der Nachweisgrenze, stark schwanken. Für eine detaillierte Diskussion der einzelnen Fehlerquellen sei auf einen entsprechenden Übersichtsartikel verwiesen (Lutz 2000). Für eine korrekte Quantifizierung muss deshalb gefordert werden, dass verschiedene positive und negative Kontrollen (inklusive interne und additive Standards) mitgeführt werden. Die wenigsten der bisher publizierten Daten würden bezüglich Quantifizierung einer Überprüfung nach Guter Analytischer Praxis (GLP) standhalten. Wenn diese Qualitätskriterien erfüllt sind, wird das Postlabelling dank seiner hohen Nachweisempfindlichkeit und dem niedrigen Probenbedarf seinen Platz sicher halten können, und die Erarbeitung von Addukt-Standards sowie die Optimierung von Reproduzierbarkeit und Nachweisgrenze werden sich lohnen.

3.2.3.3

Massenspektrometrie

Die methodische Entwicklung zur massenspektrometrischen Analyse von DNA-Addukten für ein biologisches Monitoring wird sich wohl auf Desoxynukleosid-Addukte fokussieren, besteht doch bei den Basen-Addukten das Problem einer Kontamination durch RNA-Basen sowie die Frage nach der Ausbeute bei der Basenabspaltung. Problembereiche bei der Nukleosid-Adduktanalytik sind einerseits die Anreicherung der Addukte in kleinen Volumina, andererseits die dann erreichbaren Nachweisgrenzen. Anwendungen der Massenspektrometrie für ein Human-Biomonitoring werden sich vorerst wohl auf hohe Expositionen bzw. hohe Adduktkonzentrationen (z. B. bei Zytostatikabehandlungen) und/oder große verfügbare DNA-Mengen (z. B. bei chirurgischen Eingriffen) beschränken. Die dabei gemachten Erfahrungen werden zusammen mit der erwarteten Geräteentwicklung helfen, später auch ein DNA-Adduktbiomonitoring einer Umweltbelastung durch Analyse von Leukozyten-DNA aus wenigen Millilitern Blut durchführen zu können.

51

3

DNA Adducts

3.2.4 Thematischer Forschungsbedarf 3.2.4.1

Hintergrund-DNA-Addukte

Endogene Agentien und Prozesse (Lutz 1990) können zur Bildung von DNAModifikationen führen, die durch Postlabelling erfassbar sind. Ein Teil dieser DNA-Modifikationen wird als I-compounds (indigenous ¼ endogen) bezeichnet. Dies sind große, strukturell nicht identifizierte Nukleotid-Modifikationen, deren Vorkommen – auch in unbehandelten Tieren – von vielen Faktoren, wie Alter, Geschlecht, Organ, Ernährung und oxidativen Prozessen abhängig ist (Randerath et al. 1992, Randerath et al. 1999). Neben endogenen DNA-Modifikationen führen auch Belastungen durch unvermeidliche exogene Kanzerogene zu erfassbaren DNA-Addukten. Als Beispiel seien PAK in der Nahrung und in der allgemeinen verschmutzten Luft genannt. Der gesamte Hintergrundschaden liegt im Bereich von etwa 1 geschädigtem Nukleotid auf 105 Nukleotide (Gupta und Lutz 1999). Die Möglichkeit, mittels Postlabelling einen Teil dieses Hintergrundes zu erfassen, ist keineswegs nur störend oder nachteilig. Vielmehr ergibt dies einen möglichen Bezugswert, auf dessen Basis eine zusätzliche Belastung z. B. am Arbeitsplatz als inkrementelles (Krebs-)Risiko bewertet werden kann. Diese Frage ist besonders auch im Zusammenhang mit der Ableitung eines MAK-Wertes für chemische Kanzerogene der Gruppe 5 von Bedeutung, ist hier doch zu entscheiden, bei welcher Exposition ein inkrementelles Risiko im Vergleich zur Hintergrundbelastung als nicht mehr nennenswert gilt. Die Zunahme von Hintergrund-Addukten nach Behandlung von Tieren mit Prüfsubstanzen könnte als Adduktbildung durch die Substanz (fehl)interpretiert werden. Auch aus diesem Grunde wäre eine strukturelle Aufklärung solcher DNA-Modifikationen von großem Interesse.

3.2.4.2

Interindividuelle Unterschiede

Wie eingangs erwähnt, müssen die meisten adduktbildenden Substanzen metabolisch zu chemisch reaktiven Zwischenprodukten aktiviert werden. Die Konzentration dieser so genannten ultimalen Kanzerogene ist deshalb abhängig von der Aktivität der beteiligten aktivierenden und detoxifizierenden Enzyme. Die Reparatur der gebildeten Addukte ist ebenfalls zum großen Teil enzymkatalysiert. Die Aktivität all dieser Enzyme ist individuell unterschiedlich, abhängig von genetisch determinierten Faktoren sowie von exogenen Einflüssen, z. B. Enzyminduktion durch Rauchen oder Arzneimittel. Eine bestimmte Expositionsdosis kann deshalb bei verschiedenen Menschen ganz unterschiedliche Adduktkonzentration bewirken. Die Untersuchung von Lungengewebe von Rauchern und Nichtrauchern auf DNA-Addukte durch PAK ergab beispielsweise, dass die Gruppe der Raucher zwar im Mit52

3.2

Nachweis von DNA-Addukten für ein Biological Monitoring

tel etwa 3fach höhere Adduktkonzentrationen zeigten, dass die Überlappung der Wertebereiche aber so groß war, dass einige Raucher niedrigere Werte aufwiesen als viele Nichtraucher. Die Suche nach den maßgeblich an dieser Variabilität beteiligten Enzyme ist gegenwärtig hochaktuell und viele molekular-epidemiologische Studien untersuchen die Assoziationen zwischen Enzympolymorphismen und Krebsinzidenz. DNA-Addukte als biochemische Effektmarker sind für diese Fragestellungen bestens geeignet. Daneben sind auch Untersuchungen zur Chemoprävention der Kanzerogenese oder zur individuellen Optimierung einer Medikation, insbesondere in der Chemotherapie von Tumoren, lohnende Ziele.

3.2.4.3

Zeitlicher Verlauf der DNA-Adduktkonzentration nach Exposition

Die in einer DNA-Probe gemessene Adduktkonzentration ist das Resultat von Adduktbildung, Adduktreparatur und Adduktverdünnung durch DNAReplikation (der neu synthetisierte Strang trägt bei der Bildung noch keine Addukte). Eine Adduktkonzentration ist deshalb das Resultat eines Fließgleichgewichtes, das auch von der Zellteilungsrate und damit von der Lebensdauer der Zellen maßgeblich mitbestimmt wird. Je länger die Zelle lebt, desto länger der Zeitraum, in dem eine Exposition Spuren im Sinne von DNA-Addukten hinterlässt. In einer Probe peripherer Leukozyten ist die Lebensdauer vom Zelltyp abhängig. Subpopulationen von Lymphozyten können eine Lebensdauer von mehreren Jahren haben, während periphere Granulozyten höchstens einige Tage überleben. Unterschiede zwischen Lymphozyten und Gesamtleukozyten sind in diesem Sinne verständlich. Auch ist es einleuchtend, dass Verschiebungen zwischen unterschiedlichen Zellpopulationen eine Veränderung der genotoxischen Belastung vortäuschen können. Zur Untersuchung solcher Fragestellungen könnten auch Analysen der entsprechenden Hämoglobin-Addukte beitragen. Hb-Addukte werden nicht repariert, und die Lebensdauer von Erythrozyten ist klar definiert. Die Kinetik der HbAddukte ist deshalb einfacher zu interpretieren als die der DNA-Addukte.

3.2.4.4

DNA-Addukte als Expositions-, Beanspruchungs- oder Risikomarker?

Bei der DNA-Replikation können DNA-Addukte zum Einbau einer falschen Base im Tochterstrang führen. Die Fehlpaarung kann nach einer weiteren Replikation als Basenpaarsubstitution fixiert werden. Für ein Proto-Onkogen oder Tumorsuppressorgen könnte diese Mutation einen Schritt im mehrstufigen Prozess der Kanzerogenese bedeuten. Eine Korrelation zwischen Adduktkonzentration und Krebsrisiko könnte deshalb postuliert werden. 53

3

DNA Adducts

Der Weg von DNA-Addukten zu einem Tumor ist lang und die Wahrscheinlichkeit der stufenweisen malignen Transformation einer Zelle von vielen weiteren, individuell determinierten Gegebenheiten abhängig. Eine Korrelation zwischen dem primären DNA-Schaden und der Wahrscheinlichkeit einer Krebserkrankung ist deshalb für ein großes Kollektiv, nicht hingegen für ein Individuum anzunehmen. Überraschend zeigten unsere Arbeiten zu PAK-DNA-Addukten in der normalen Schleimhaut und in peripheren Lymphozyten von Pharynx- und Larynxtumorpatienten eine Korrelation des Zigarettenkonsums mit der Adduktkonzentration in der Schleimhaut, nicht hingegen in den peripheren Lymphozyten (Maisch et al. 2000). Dieses Beispiel zeigt, dass es noch einiger Anstrengung bedarf, bis DNA-Addukt-Daten als Biomarker sinnvoll interpretiert werden können. Literatur Alexandrov, K., Rojas, M., Geneste, O., Castegnaro, M., Camus, A. M., Petruzzelli, S., Giuntini, C., Bartsch, H.: An improved fluorometric assay for dosimetry of benzo(a)pyrene diol-epoxide-DNA adducts in smokers‘ lung – comparisons with total bulky adducts and aryl hydrocarbon hydroxylase activity, Cancer Res., 52, 6248–6253 (1992). Bartsch, H., Hemminki, K., O’Neill, I. K., (eds.): Methods for detecting DNA damaging agents in humans: applications in cancer epidemiology and prevention, IARC Sci. Publ., vol. 89, pp. 219 (1988). Bartsch, H., Kadlubar, F., O’Neill, I., (eds.).: Biomarkers in Human Cancer – Part II. Exposure Monitoring and Molecular Dosimetry, Environ. Health Perspect, 99, pp. 312 (1993). Chaudhary, A. K., Reddy, G. R., Blair, I. A., Marnett, L. J.: Characterization of an N6-oxopropenyl-2l-deoxyadenosine adduct in malondialdehyde-modified DNA using liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry, Carcinogenesis, 17, 1167–1170 (1996). Chen, H.-J. C., Chiang, L.-C., Tseng, M.-C., Zhang, L. L., Ni, J., Chung, F.-L.: Detection and quantification of 1,N6-ethenoadenine in human placental DNA by mass spectrometry, Chem. Res. Toxicol., 12, 1119–1126 (1999). Culp, S. J., Roberts, D. W., Talaska, G., Lang, N. P., Fu, P. P., Lay, J. O. Jr., Teitel, C. H., Snawder, J. E., Von Tungeln, L. S., Kadlubar, F. F.: Immunochemical, 32P-postlabeling and GC/MS detection of 4-aminobiphenyl-DNA adducts in human peripheral lung in relation to metabolic activation pathways involving pulmonary N-oxidation, conjugation, and peroxidation, Mutat. Res., 378, 97–112 (1997). Doerge, D. R., Churchwell, M. I., Marques, M. M., Beland, F. A.: Quantitative analysis of 4-aminobiphenyl-C8-deoxyguanosyl DNA adducts produced in vitro and in vivo using HPLC-ES-MS, Carcinogenesis, 20, 1055–1061 (1999). Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avitts, T. A., Randerath, K.: Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta, Science, 231, 54–57 (1986). Floyd, R. A., Watson, J. J., Harris, J., West, M., Wong, P. K.: Formation of 8-hydroxydeoxyguanosine, hydroxyl free radical adduct of DNA in granulocytes exposed to the tumor promoter, tetradecanoylphorbolacetate, Biochem. Biophys. Res. Commun., 137, 841–846 (1986).

54

3.2

Nachweis von DNA-Addukten für ein Biological Monitoring

Friesen, M. D., Kaderlik, K., Lin, D., Garren, L., Bartsch, H., Lang, N. P., Kadlubar, F. F.: Analysis of DNA adducts of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5- b]pyridine in rat and human tissues by alkaline hydrolysis and gas chromatography/electron capture mass spectrometry: validation by comparison with 32P-postlabeling, Chem. Res. Toxicol., 7, 733–739 (1994). Gangl, E. T., Turesky, R. J., Vouros, P.: Determination of in vitro- and in vivo-formed DNA adducts of 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline by capillary liquid chromatography/microelectrospray mass spectrometry, Chem. Res. Toxicol., 12, 1019–1027 (1999). Garner, R. C.: The role of DNA adducts in chemical carcinogenesis, Mutat. Res., 402, 67–75 (1998). Gledhill, B. L., Mauro, F.: New Horizons in Biological Dosimetry. New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore, Wiley-Liss (1991). Gupta, R. C.: 32P-Postlabeling for detection of DNA adducts, in: Pfeifer, G. P. (ed): Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, New York, Plenum Press, pp 45–61 (1996). Gupta, R. C., Lutz, W. K.: Background DNA damage from endogenous and unavoidable exogenous carcinogens: a basis for spontaneous cancer incidence? Mutat. Res., 424, 1–8 (1999). Gupta, R. C.: Enhanced sensitivity of phosphorus-32 postlabeling analysis of aromatic carcinogen:DNA adducts, Cancer Res., 45, 5656–5662 (1985). Haugen, A., Becher, G., Benestad, C., Vahakangas, K., Trivers, G. E., Newman, M. J., Harris, C. C.: Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in the urine, benzo(a)pyrene diol epoxide-DNA adducts in lymphocyte DNA, and antibodies to the adducts in sera from coke oven workers exposed to measured amounts of polycyclic aromatic hydrocarbons in the work atmosphere, Cancer Res., 46, 4178–4183 (1986). Hemminki, K., Dipple, A., Shuker, D. E. G., Kadlubar, F. F., Segerbaeck, D., Bartsch, H.: DNA Adducts: Identification and Biological Significance, IARC Sci. Publ., 125, pp. 478 (1994). Hemminki, K.: DNA adducts in biomonitoring, J. Occup. Environ. Med., 37, 44–49 (1995). Lin, D., Lay, J. O., Jr. Bryant, M. S., Malaveille, C., Friesen, M., Bartsch, H., Lang, N. P., Kadlubar, F. F.: Analysis of 4-aminobiphenyl-DNA adducts in human urinary bladder and lung by alkaline hydrolysis and negative ion gas chromatography-mass spectrometry, Environ. Health Perspect, 102 Suppl 6, 11–16 (1994). Lutz, W. K.: DNA-Addukte als Genotoxizitätsmarker für ein biologisches Monitoring, Arbeitsmed. Sozialmed. Umweltmed., 35, im Druck (2000). Lutz, W. K.: Endogenous genotoxic agents and processes as a basis of spontaneous carcinogenesis, Mutat. Res., 238, 287–295 (1990). Maisch, M., Vock, E. H., Preisler, V., Hoppe, F., Vamvakas, S., Helms, J., Lutz, W. K.: Biomonitoring of DNA adducts in lymphocytes and normal mucosa of pharynx and larynx in cancer patients as potential indicators of smoking dose, duration, or age at tumor manifestation, Naunyn-Schmied Arch. Pharmacol., 361 Suppl, R170 (2000). Perera, F. P., Poirier, M. C., Yuspa, S. H., Nakayama, J., Jaretzki, A., Curnen, M. M., Knowles, D. M., Weinstein, I. B.: A pilot project in molecular cancer epidemiology: determination of benzo(a)pyrene-DNA adducts in animal and human tissues by immunoassays, Carcinogenesis, 3, 1405–1410 (1982). Perera, F. P.: The significance of DNA and protein adducts in human biomonitoring studies, Mutat. Res., 205, 255–269 (1988). Pfau, W., Schulze, C., Shirai, T., Hasegawa, R., Brockstedt, U.: Identification of the major hepatic DNA adduct formed from the food mutagen 2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole (A alpha C), Chem. Res. Toxicol., 10, 1192–1197 (1997).

55

3

DNA Adducts

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56

3.2

Nachweis von DNA-Addukten für ein Biological Monitoring

Talaska, G., Cudnik, J., Jaeger, M., Rothman, N., Hayes, R., Bhatnagar, V. J., Kayshup, S. J.: Development and application of non-invasive biomarkers for carcinogen-DNA adduct analysis in occupationally exposed populations, Toxicology, 111, 207–212 (1996). Weston, A., Manchester, D. K., Poirier, M. C., Choi, J. S., Trivers, G. E., Mann, D. L., Harris, C. C.: Derivative fluorescence spectral analysis of polycyclic aromatic hydrocarbon-DNA adducts in human placenta, Chemical Research In Toxicology, 2, 104–108 (1989). Wild, C. P., Pisani, P.: Carcinogen-DNA and carcinogen-protein adducts in molecular epidemiology, IARC Sci. Publ., 142, 143–158 (1997). Wu, K.-Y., Scheller, N., Ranasinghe, A., Yen, T.-Y., Sangaiah, R., Giese, R., Swenberg, J. A.: A gas chromatography/electron capture/negative chemical ionization highresolution mass spectrometry method for analysis of endogenous and exogenous N7-(2-hydroxyethyl)guanine in rodents and its potential for human biological monitoring, Chem. Res. Toxicol., 12, 722–729 (1999).

57

3

3.3

DNA Adducts

32

P-Postlabelling HPLC-Analyse von DNA-Addukten im Brustgewebe

Wolfgang Pfau*

Die Mehrzahl der krebserregenden Substanzen entfaltet ihre biologische Wirkung erst nach enzymatischer Verstoffwechselung im Körper, der so genannten metabolischen Aktivierung. Die gebildeten reaktiven Metabolite sind, z. B. im Falle der polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAH), Dihydrodiol-Epoxide. Bei aromatischen Aminoverbindungen entstehen intermediär Hydroxylamine. Diese Metabolite stellen die Vorstufen von Elektrophilen dar. Sie reagieren unter anderem mit den nukleophilen Zentren der DNA (Abb. 1). Dabei werden durch kovalente Verknüpfung so genannte DNA-Addukte gebildet. Diese DNA-Addukte können dann zu Mutationen oder Strangbrüchen führen, wenn sie nicht repariert werden. Wenn diese Schäden in den entsprechenden Genen – Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen – gesetzt werden, kann auf diese Weise ein Tumor initiiert oder ein Wachstumsstimulus ausgelöst werden (Hemminki et al. 1994). DNA-Addukte haben also sicherlich eine entscheidende Bedeutung in der chemischen Kanzerogenese. Die qualitative und quantitative Analyse von DNA-Addukten stellt daher ein relevantes Problem dar. Da man von der Annahme ausgeht, dass die Bildung von DNA-Addukten in Leukozyten über dieselben elektrophilen Metabolite erfolgt wie die Bindung der krebserregenden Substanzen an die DNA im Zielorgan der kanzerogenen Wirkung, wird die so bestimmte Kenngröße auch target dosis genannt (Neumann 1994, Hemminki et al. 1995). Bei diesen Messungen werden neben der tatsächlich aufgenommenen Menge, der internen Dosis, auch weitere individuelle Parameter, wie Enzym-Aktivitäten und Toxikokinetik mitberücksichtigt. Der Einfluss der individuellen metabolischen Kapazität und zwar sowohl hinsichtlich der enzymatischen Aktivierung als auch der Detoxifizierung spielt dabei eine erhebliche Rolle (Vineis et al. 1999). Die Bestimmung des Phänotyps oder Genotyps polymorpher Enzyme stellt daher eine wichtige Ergänzung des Biomonitoring dar. Hier wird beispielhaft eine Pilot-

* Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Vogt-Kölln-Str. 30, 22527 Hamburg

58

3.3

32

P-Postlabelling HPLC-Analyse von DNA-Addukten im Brustgewebe

Abbildung 1: Nukleophile Angriffspunkte an den DNA-Basen und bevorzugte Bindungsstellen der PAH, der aromatischen Amine (AA) und der alkylierenden Karzinogene (A).

studie zur Assoziation der DNA-Adduktlevel in der Brustdrüse mit dem N-Acetyltransferase-Genotyp beschrieben. Als Quellen für Untersuchungsmaterial, also DNA, für das Biomonitoring sind insbesondere nicht-invasiv zugängliche Zellen wie Leukozyten, abgeschilferte Epithelzellen (Harnblase, Mund, Darm) geeignet. Zahlreiche Studien zum Biomonitoring mittels DNA-Adduktanalyse bei einer Exposition am Arbeitsplatz durch Umwelt oder Ernährung sind erschienen (Schoket et al. 1999, Lutz 2000). Eine höhere Präzision der Messung wird erzielt durch Messung von DNA-Adduktlevels in Biopsie-Proben aus dem (vermuteten) Zielorgan der kanzerogenen Wirkung, etwa PAH-Addukte im Bronchial-Epithel von Rauchern (Phillips et al. 1988) oder aromatische Amin-Addukte im HarnblasenEpithel (Vineis et al 1994, Rothman et al. 1996). DNA-Adduktlevel sind generell sehr niedrig, so dass für derartige Analysen hochempfindliche Methoden erforderlich sind.

3.3.1 DNA-Addukt-Analyse In-vitro oder in tierexperimentellen Untersuchungen können die DNA-Adduktlevel etwa bis zu 0,01 % (ein Addukt unter 104 Nukleotiden) erreichen. In humanen Gewebeproben werden dagegen Adduktlevel von 0,1–100 Addukten pro Zelle (ein Addukt unter 107–1010 Nukleotiden) gemessen (Phillips 1997). Es handelt sich dort meist um DNA-Addukte mit unbekannter chemischer Struktur und zudem ist der Mensch immer komplexen Gemischen von krebserregenden Substanzen ausgesetzt, so dass eine große Anzahl verschiedener DNA-Addukte beobachtet wird. Nur sehr wenige ana59

3

DNA Adducts

Tabelle 1: Methoden der DNA-Addukt Analyse. Methode

Empfindlichkeit1)

Kommentar

Literatur

3

10 100

markierte Substanzen müssen synthetisiert werden; nicht im Biomonitoring anwendbar nur fluoreszierende Verbindungen, hoher apparativer Aufwand nur fluoreszierende Verbindungen Derivatisierung ist erforderlich, Abspaltung vom Addukt Addukt Struktur muss bekannt sein Antikörper müssen gewonnen werden am besten geeignet für große aromatische Moleküle

Phillips 1990, Lin et al. 1992

H-label/HPLC C-label/HPLC

14

FLNS2)

HPLC/Fluoreszenz

100

GC/MS

10

Immunoassay

1

32

0.1

P-Postlabelling

1) 2)

Jankowiak und Small 1989 Vineis et al. 1994 Giese 1997, Friesen et al. 1994 Poirier 1993

Randerath et al. 1981, Phillips 1997

ungefähre Nachweisgrenze für Addukte pro 108 Nukleotide. Fluorescence Line Narrowing Spectroscopy.

lytische Methoden haben die erforderliche Empfindlichkeit und Spezifität für diesen Konzentrationsbereich (Tabelle 1). Viele Kanzerogene, also oft auch die DNA-Addukte (oder deren Hydrolysate), haben mehr oder minder starke Fluoreszenz-Eigenschaften, die es erlauben, diese Substanzen sehr empfindlich zu detektieren. Alle Fluoreszenztechniken sind jedoch in ihrer Anwendbarkeit auf die fluoreszierenden Moleküle, d. h. auf polyzyklische aromatische DNA-Adduktbildner beschränkt (Jankowiak und Small 1989, Alexandrov et al. 1992). Immunochemische Methoden erreichen ebenfalls sehr hohe Empfindlichkeiten und wurden auch bereits in einer Reihe von molekular-epidemiologischen Studien zur Messung von DNA-Addukten eingesetzt (Santella 1999). Ein Vorteil ist hier, dass sich durch die Wahl des Antikörpers auch Aussagen über die chemische Struktur der DNA-Addukte machen lassen. Nahm man zunächst an, dass man mittels monoklonaler Antikörper gegen Benzo[a]pyren-modifizierte DNA selektiv nur die DNA-Addukte des BaP detektieren würde, zeigte sich aber sehr bald, dass diese Antikörper auch die sehr ähnlichen DNA-Addukte anderer PAH binden (Poirier 1993). Die mit diesen Antikörpern bestimmten DNA-Adduktlevel werden heute als Summenparameter für PAH-induzierte DNA-Schäden angesehen (Perera 1996). Ein Nachteil ist, dass zunächst ein entsprechender Antikörper gewonnen werden muss, d. h. die Struktur des zu suchenden DNA-Addukts muss bekannt und auch in ausreichenden Mengen vorhanden sein. Die technische Entwicklung hat in den letzten Jahre die Empfindlichkeit der massenspektrometrischen Analytik sehr stark verbessert. In der che60

3.3

32

P-Postlabelling HPLC-Analyse von DNA-Addukten im Brustgewebe

mischen Analytik und der Strukturaufklärung experimentell gewonnener DNA-Addukt-Standards wurden GC/MS und FAB/MS regelhaft eingesetzt (Giese 1997). Die Empfindlichkeit erlaubt den Nachweis von Hydrolyse-Produkten von DNA-Addukten. So konnten mittels GC/MS nach alkalischer Hydrolyse und Derivatisierung PhIP-DNA-Addukte in humanen Gewebeproben nachgewiesen werden (Friesen et al. 1994). Elektro-Spray-LC/MS wurde erfolgreich zum Nachweis von Malondialdehyd-Addukten eingesetzt. Der Vorteil dieser Methoden liegt in der Strukturinformation, die man aus der Molmasse des Addukts oder sogar dem Fragmentierungsmuster erhält. Die 32P-Postlabelling-Methode (Randerath et al. 1981) ist die zur Zeit empfindlichste Analysenmethode zum Nachweis von DNA-Addukten. Diese Methode umfasst folgende Schritte: 1) Isolierung der DNA, 2) enzymatische Hydrolyse der DNA zu 3l-Phospho-Nukleotiden, 3) Anreicherung der modifizierten Nukleotide (Nuklease P1-Verdau oder Butanol-Extraktion), 4) 5l-Phosphorylierung mit T4-Polynukleotidkinase und [g-32P]-ATP, 5) Chromatographische Auftrennung der markierten Bisphospho-NukleotidAddukte, 6) Detektion mittels Autoradiographie, 7) Quantifizierung durch Messung der Cerenkov-Strahlung. Die Vorteile dieser Methode sind: die extrem hohe Empfindlichkeit (ein Addukt/109 normale Nukleotide), x die geringe Menge benötigter DNA (1–10 mg), x die Spezifität für DNA-Addukte durch zwei bis drei diskriminierende enzymatische Schritte, x die breite Anwendbarkeit auch auf DNA-Addukte unbekannter Struktur, x der geringe apparative Aufwand. x

Allerdings führt diese Methode (wie jede analytische Methode) immer nur zu relativen quantitativen Ergebnissen, solange keine Kalibrierung mit Standard-Addukten erfolgt. Ein Nachteil dieser Methode war die geringe Auflösung der chromatographischen Auftrennung. Wir konnten durch Einführung einer HPLC-Analysemethode dieses Manko beseitigen (Pfau und Phillips 1991).

61

3

3.3.2 HPLC-Analyse von

DNA Adducts

32

P-markierten DNA-Addukten

Bei der Exposition mit exogenen Substanzen ist der Mensch fast immer komplexen Gemischen genotoxischer Verbindungen ausgesetzt. Es handelt sich hierbei z. B. um komplexe Gemische polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (Autoabgase, Emmisionen aus Industrieanlagen wie Kokereien oder Hochöfen, Kohlefeuer, Kohlenteer), polyzyklischer aromatischer Amine oder Nitroverbindungen (Dieselabgase) oder heterozyklischer aromatischer Amine (gebratene oder gegrillte Lebensmittel) oder hoch komplexe Gemische verschiedener kanzerogener Stoffklassen (Tabakrauch). Zur Analyse der durch die Gemische gebildeten Addukte im Körper des Menschen sind also nicht nur hochempfindliche Methoden von Nöten, sondern es ist auch eine hohe Auflösung der chromatographischen Methode erforderlich, um die DNA-Addukte von einander zu trennen und so die biologisch relevanten Komponenten dieser Gemische zu identifizieren (Autrup 1991, Dale und Garner 1996). Daher wurde eine HPLC-Methode entwickelt, um die herkömmliche, nur mangelhaft auflösende DC-Technik zu ergänzen. Es gelang mit hoher Auflösung (Basislinien-Trennung) die Analyse von 32P-markierten DNA-Addukten der zehn Diol-Epoxide strukturell sehr ähnlicher PAH (Abbildung 2A, Pfau und Phillips 1992). Tatsächlich ergab die chromatographische Auftrennung mittels Ionenaustauscher-DC dieses Gemisches der 32P-markierten Addukte eine diagonale Zone an Radioaktivität, wie sie ähnlich auch bei der 32P-Postlabelling-Analyse von DNA aus humanen Gewebeproben, z. B. aus der Lunge von starken Zigarettenrauchern, nachzuweisen ist. Dies steht im Einklang mit der Vermutung, dass es sich bei diesen diagonalen Zonen um nicht aufgelöste komplexe Mischungen sehr ähnlicher DNA-Addukte handelt. Diese neue HPLC-Methode wurde in diversen Studien zur DNAAddukt-Charakterisierung angewandt. Etwa zur Analyse von PAH-induzierten DNA-Addukten (Dibenz[a,h]anthracen (Lecoq et al. 1992), Benzo[b]fluoranthen (Pfau et al. 1992, Weyand et al. 1993), Chrysen (Pfau et al. 1996)) Benzo[g]chrysen (Giles et al. 1996), Dibenz[a,j]anthracen (Baer-Dubowska et al. 1995) oder Benzo[c]phenanthren (Giles et al. 1995). Mittlerweile wurde diese Methode auch für die Auftrennung von Adduktgemischen eingesetzt, die durch diverse komplexe PAH-haltige Gemische gebildet wurden, wie künstliche PAH-Gemische (Hughes et al. 1993, Zhan et al. 1995), Kohlenteer (Hughes et al. 1993, Culp und Beland 1994), Dieselabgase (King et al. 1994, Savela et al. 1995), gebrauchtes Motorenöl (Carmichael et al. 1991) oder Kokerei-Rückstände (Weyand und Wu 1995). Durch die Kombination von Dünnschicht- und HPLC-Analyse wurden einzelne PAH-Addukte in diesen Gemischen identifiziert, d. h. die biologisch aktiven Komponenten dieser Gemische charakterisiert. Unter Verwendung der 32P-Postlabelling/HPLC-Analytik konnten Savela et al. (1995) beispielsweise zeigen, dass Chrysen zu den biologisch relevanten Komponenten des Dieselabgas zählt. 62

3.3

32

P-Postlabelling HPLC-Analyse von DNA-Addukten im Brustgewebe

Abbildung 2: Auftrennung 32P-markierter DNA-Addukte mittels reversed-phase HPLC (a) am Beispiel zehn strukturell sehr ähnlicher Addukte, die durch Bindung von zehn anti-Dihydrodiol-Epoxiden von PAH gebildet wurden (Pfau und Phillips 1991) und (b) der DNA-Addukte, die durch sechs heterozyklische aromatische Amine gebildet wurden (Brockstedt und Pfau 1999).

63

3

DNA Adducts

Die Anwendbarkeit der 32P-Postlabelling/HPLC Analyse auf DNA-Addukte, die durch andere Stoffklassen krebserregender Substanzen gebildet werden, konnte ebenfalls gezeigt werden, z. B. polyzyklische aromatische Nitroverbindungen (King et al. 1994, Zhan et al. 1995), heterozyklische Amine (Pfau und Brockstedt 1999, Abbildung 2B), Gallenflüssigkeit (Scates et al. 1993), DNA-Addukte durch Pharmazeutika (Aristolochiasäure, Tamoxifen), chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffe oder reaktive Sauerstoffspezies (Carmichael et al. 1992). Parallel und auch in der Folge wurden andere HPLC-Trennungsmethoden beschrieben, die sich ebenfalls als geeignet erwiesen, 32P-markierte DNA-Addukte mit hoher Auflösung und Empfindlichkeit zu trennen (Lau und Baird 1991, Möller et al. 1993, Otteneder et al. 1999). Diese Methoden haben bislang jedoch weniger breite Anwendung gefunden. Allerdings zeigte sich, dass die HPLC-Methoden stets weniger empfindlich sind als die DC-Methoden. Dies ist in der Detektionstechnik begründet. Während die autoradiographischen Methoden lange Expositionszeiten ermöglichen, ist die Detektionszeit im Durchflussradioaktivitätsmonitor auf einige Sekunden beschränkt.

3.3.3 DNA-Addukte im Brustgewebe Untersuchungen von Li et al. (1996) zeigten, dass bei Brustkrebs-Patientinnen höhere DNA-Adduktlevel im gesunden, den Tumor umgebenden Brustgewebe feststellbar sind als im Brustgewebe von ReduktionsmammoplastiePatientinnen als Kontrollgruppe. Wir haben die DNA-Adduktlevel ebenfalls in der Brustdrüse analysiert und dabei einen Zusammenhang mit dem N-Actyltransferase-Status festgestellt (Pfau et al. 1998). Die enzymatische N-Acetylierung stellt für aromatische Amine eine Entgiftungsreaktion dar. Personen mit einer hohen Enzymaktivität der N-Acetyltransferase (NAT), so genannte schnelle Acetylierer, können sich also z. B. besser schützen gegenüber der toxischen Wirkung aromatischer Amine. Die Aktivität der NAT2 ist genetisch bestimmt. Etwa 60 % der Kaukasier weisen eine geringere Enzymaktivität auf (langsame Acetylierer). Molekularbiologisch lässt sich dies anhand einer DNA-Probe nachweisen: Schnelle Acetylierer weisen wenigstens ein Wildtyp-Allel auf. Personen mit zwei mutierten Allelen des NAT2-Gens gelten als langsame Acetylierer. Dies kann mittels RFLP-Analyse untersucht werden. Durch Mutation fehlt im NAT2-Gen eine Restriktions-Schnittstelle. Man kann also durch PCR-Amplifikation, Restriktionsverdau und Gelelektrophorese mutierte und Wildtyp-Allele aufspüren und so homozygote WT, heterozygot und homozygot Mutierte, d. h. langsame Acetylierer, identifizieren.

64

3.3

32

P-Postlabelling HPLC-Analyse von DNA-Addukten im Brustgewebe

Während dieser Polymorphismus für das NAT2-Enzym lange bekannt ist wurde erst kürzlich ein genetischer Polymorphismus für die NAT1 beschrieben (Badawi et al. 1995). Entsprechend haben wir auch für dieses Enzym die Patientinnen hinsichtlich der häufigsten Mutationen in diesem Gen untersucht. Brustgewebeproben von Brustkrebs-Patientinnen und Reduktionsmammoplastie-Patientinnen wurden in Kooperation mit dem Institute of Cancer Research in England untersucht (Tabelle 2, Pfau et al. 1998). Höhere DNAAdduktlevel finden sich bei langsamen Acetylierern (NAT2). Für die NAT1 ergab sich keine signifikante Korrelation. In Abbildung 3 ist ein Zusammenhang dargestellt, der in der untersuchten Population (n ¼ 42) zwischen DNAAdduktlevel und der Häufigkeit der (NAT-) Allele festzustellen war. Für die NAT2 wurde das Wildtyp-Allel (NAT2*4) am häufigsten in der Quartile mit den niedrigsten Adduktleveln nachgewiesen und – mit abnehmender Tendenz – trat dieses Allel bei den Patientinnen mit den höchsten Adduktleveln in der Brustgewebe-DNA gar nicht mehr auf. Für die NAT1 war umgekehrt das Wildtyp-Allel am häufigsten bei Patientinnen mit hohem Adduktlevel. Die Mutanten-Allele wiesen einen Trend auf mit zunehmender Häufigkeit bei geringerem Adduktlevel. Ein ähnlicher Zusammenhang ist beschrieben für DNA-Addukte im Epithel der Harnblase und NAT-Polymorphismen (Rothman et al. 1996, Badawi et al. 1995). Bei Blasenkrebs konnte auch ein erhöhtes Risiko für langsame N-Acetylierer nachgewiesen werden (Perera 1996, Vineis et al. 1999). Es wurden einige Studien publiziert hinsichtlich eines möglichen Zusammenhangs zwischen Brustkrebs-Risiko und NAT-Aktivität. Dabei ergab sich, dass der Acetyliererstatus allein das Brustkrebs-Risiko nicht beeinflusst (Vineis et al. 1999).

Abbildung 3: Allelhäufigkeit des Wildtyp-Allels der NAT2- (NAT2*4) und der NAT1-Allele NAT1*4, NAT1*10 und NAT1*14 in Abhängigkeit vom DNA-Adduktlevel (1.–4. Quartil) im Brustgewebe in der untersuchten Population.

65

3

DNA Adducts

Tabelle 2: Assoziation von DNA-Adduktlevel und N-Acetyliererpolymorphismus. NAT2

n

NAT2 langsam Adduktlevel 2)

Alle Patientinnen

42

ReduktionsmammoplastiePatientinnen Nichtraucherinnen

31

83,0 (9,0–414,6) 121,0 (9,0–414,6) 120,0 (36,0–414,6)

19

1)

NAT2 schnell 1) Adduktlevel 2)

p

3)

39,7 (0–91,0) 51,0 (0–91,0) 36,5 (0–91,0)

0,0053 0,0052 0,015

1)

N-Acetylierertyp (NAT2) abgeleitet vom Genotyp. Mittlere Adduktlevel pro 109 Nucleotiden, Bereich in Klammern. 3) p-Werte wurden bestimmt mittels zweiseitiger Mann-Whitney Analyse der Adduktlevel. 2)

Ein erhöhtes Risiko für Raucherinnen, nach der Menopause an Brustkrebs zu erkranken, besteht nach Ambrosone et al. (1996) insbesondere dann, wenn diese dem langsamen N-Acetylierertyp angehören. Dieses Ergebnis konnte in einer kürzlich veröffentlichten Studie jedoch nicht bestätigt werden. Bei den von uns untersuchten Patientinnen scheint das Rauchen keine Rolle hinsichtlich der DNA-Adduktbildung zu spielen. Aus den Krankenakten ergibt sich, dass über 80 % der Patientinnen Nichtraucherinnen waren. Der signifikante Zusammenhang zwischen DNA-Adduktlevel und NAT-Status bleibt auch nach Stratifizierung hinsichtlich des Rauchverhaltens bestehen (Tab. 2). Einige Studien untersuchten den Zusammenhang zwischen dem Brustkrebs-Risiko und dem Konsum von gebratenem oder gegrilltem Fleisch unter Berücksichtigung des N-Acetyliererstatus der Patientinnen. Während in zwei Studien ein erhöhtes relatives Risiko beobachtet wurde für Frauen, die einerseits häufig stark durchgebratenes Fleisch konsumierten und vom langsamen Acetyliererstatus (NAT2) waren, konnte dies in anderen Studien nicht bestätigt werden. Eine Vielzahl von Ergebnissen deutet daraufhin, dass auch genotoxische Komponenten in der Kanzerogenese der Brustdrüse eine Rolle spielen. Weiterhin ist zu vermuten, dass es sich dabei auch um äußere Faktoren handelt, also umwelt- oder ernährungsbedingte Einflüsse. Dabei spielen sicherlich auch Polymorphismen der Fremdstoff-metabolisierenden Enzyme eine Rolle, die das Risiko beeinflussen, an Brustkrebs zu erkranken (Agundez et al. 1995).

66

3.3

32

P-Postlabelling HPLC-Analyse von DNA-Addukten im Brustgewebe

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67

3

DNA Adducts

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68

3.3

32

P-Postlabelling HPLC-Analyse von DNA-Addukten im Brustgewebe

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69

3

DNA Adducts

3.4 Untersuchungen zum 8-Hydroxy-2lDeoxyguanosin – ein Biomarker für eine oxidative DNA-Schädigung in-vivo? Boreslaw Marczynski*, Jürgen Hölzer** und Michael Wilhelm*,**

3.4.1 Hintergrund Die meisten gentoxischen Substanzen verursachen genomische Schädigungen durch die Bildung kovalenter Addukte und das Auslösen von Strangbrüchen in der DNA. Findet vor der Replikation keine Reparatur statt, können solche Läsionen zu Mutationen führen. Bisherige Untersuchungen im zellfreien System, in Zellkulturen und in Tierexperimenten deuten darauf hin, dass die Krebsentstehung wesentlich durch die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (RSS) in Anwesenheit verschiedener Noxen beeinflusst wird (Loft und Paulsen 1996, Jaurand 1997, Beckman und Ames 1998). Zu den reaktiven Sauerstoffspezies gehören das Superoxidanion, Wasserstoffperoxid und das Hydroxylradikal. Auch Singulettsauerstoff, Ozon und NO werden in diesem Zusammenhang diskutiert. Dabei werden Hydroxylradikale als die reaktivsten Sauerstoffradikale angesehen. Sie können eine direkte oxidative DNA-Schädigung verursachen (Floyd 1990, Collins 1999). Es gibt zahlreiche physiologische (z. B. die Zellatmung) und pathophysiologische Prozesse (z. B. Entzündungen), bei denen RSS auftreten.

* Berufsgenossenschaftliches Forschungsinstitut für Arbeitsmedizin (BGFA), RuhrUniversität Bochum, Bürkle-de-la-Camp-Platz 1, 44789 Bochum ** Abteilung für Hygiene, Sozial- und Umweltmedizin, Ruhr-Universität Bochum, Universitätsstr. 50, 44801 Bochum

70

3.4

Untersuchungen zum 8-Hydroxy-2l-Deoxyguanosin

3.4.2 Oxidative DNA-Schädigung 3.4.2.1

Endogene Ursachen

Die RSS können physiologisch zum Großteil durch entsprechende Oxidoreduktionsprozesse kompensiert werden. Ein gewisser endogen bedingter Anteil oxidativer DNA-Schädigung ist aber stets vorhanden (Ames und Gold 1991). Dieser Anteil nimmt zu, wenn RSS durch Mangel an reduzierenden Enzymen und Antioxidantien (Halliwell 1998) sowie durch pathophysiologische Vorgänge wie Entzündung (Loft und Poulsen 1996, Jaurand 1997) vermehrt auftreten.

3.4.2.2

Exogene Ursachen

Ionisierende Strahlen, viele anorganische und organische Chemikalien oder ihre Metaboliten lösen Oxidoreduktionsprozesse aus, die dann infolge eines Ungleichgewichts zwischen Oxidantien und Antioxidantien zu oxidativem Stress führen (Halliwell 1998). In der DNA können so Einzel- und/oder Doppelstrangbrüche und oxidative Addukte erzeugt werden (Anderson et al. 1998, Halliwell 1998).

Abbildung 1: Oxidative Addukte von Pyrimidin-Basen.

71

3

DNA Adducts

Abbildung 2: Oxidative Addukte von Purin-Basen.

Von den DNA-Nukleosiden, den Pyrimidinderivaten (Cytidin und Thymidin, Abbildung 1) und den Purinderivaten (Adenosin und Guanosin, Abb. 2) ist Guanin die reaktionsfreudigste und damit als Hauptangriffspunkt für Hydroxylradikale prädestiniert.

3.4.3 8-Hydroxy-2l-Deoxyguanosin, eine promutagene Base In Anwesenheit von Hydroxylradikalen wird bevorzugt das Kohlenstoffatom in der Position 8 des Guanins hydroxyliert. Das Produkt ist 8-Hydroxy-2l-de-

72

3.4

Untersuchungen zum 8-Hydroxy-2l-Deoxyguanosin

Abbildung 3: Oxidative DNA-Schädigung im steady-state.

73

3

DNA Adducts

Tabelle 1: 8-OH-dG-Addukte in Lymphozyten von Kontrollpersonen aus verschiedenen europäischen Ländern. 1–5: Nach Collins 1999 (n J 9 pro Land). 6: Eigene Angaben (n ¼ 61), in weißen Blutzellen. Land 1 2 3 3 5 6

Frankreich Irland Spanien Niederlande Großbritannien Deutschland

* Median

74

8-OH-dG/105dG (Mittelwerte) Gesamt Männer

Frauen

0,45 0,76 0,33 0,59 0,62 0,55

0,47 0,37 0,33 0,46 0,43 0,53 (0,51)*

0,43 1,14 0,33 0,72 0,81 0,58 (0,61)*

3.4

Untersuchungen zum 8-Hydroxy-2l-Deoxyguanosin

75

3

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DNA Adducts

3.4

Untersuchungen zum 8-Hydroxy-2l-Deoxyguanosin

77

3

78

DNA Adducts

3.4

Untersuchungen zum 8-Hydroxy-2l-Deoxyguanosin

79

4 Suszeptibilität 4.1 Verfeinerte Phänotypisierungsmethoden und Effektmonitoring zur Erfassung des individuellen Risikos am Beispiel der GSTT1 Ernst Hallier*

Fremdstoffe werden im menschlichen Organismus in mehreren sukzessive oder parallel ablaufenden enzymabhängigen Schritten verstoffwechselt. In den meisten Fällen führt dies zu einer Entgiftung, d. h. das Stoffwechselprodukt ist weniger toxisch als die Ausgangssubstanz. Es gibt jedoch auch Beispiele für eine Giftung, d. h. die Umwandlung einer Chemikalie zu einem toxischen Zwischenprodukt. In jüngster Zeit sind genetische Faktoren einer unterschiedlichen individuellen Disposition, insbesondere Enzympolymorphismen, verstärkt in die arbeitsmedizinische und umweltmedizinische Diskussion geraten. Ein in der Erbinformation verankerter hereditärer Genotyp führt dabei zu einer unterschiedlichen Expression eines Enzyms. Die dadurch bedingte starke oder schwache, u. U. auch fehlende Aktivität des Enzyms stellt dabei den Phänotyp dar. Der individuelle Genotyp lässt sich heute mit molekularbiologischen Methoden (PCR) bestimmen, während der Phänotyp anhand der Umsatzgeschwindigkeit bestimmter Testsubstrate ermittelt wird. Enzympolymorphismen sind in der Pharmakologie seit langem bekannt. Ihre Erforschung hat sich dort zu einem eigenen Wissenschaftszweig, der Pharmakogenetik, entwickelt. Das bekannteste Beispiel eines Enzympolymorphismus ist der Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-Mangel, der zu hämolytischen Anämien bei Verabfolgung von Antimalariamitteln und Sulfonamiden führen kann. Andere Polymorphismen führen zu einer verminderten therapeutischen Wirksamkeit oder zu einer erhöhten Gefahr unerwünschter Wirkungen durch Medikamente (Nebert 1997). In der Arbeitsmedizin und der Toxikologie sind inzwischen ebenfalls einige Beispiele einer individuell unterschiedlichen Gefährdung durch Chemikalien auf Grund von Enzympolymorphismen bekannt. Hierzu gehört insbesondere der Polymorphismus der N-Acetyltransferase 2. Personen mit geringer Enzymaktivität (langsame Acetylierer) tragen bei Exposition

* Abteilung für Arbeits- und Sozialmedizin, Georg-August-Universität Göttingen, Waldweg 37, 37073 Göttingen

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4.1

Verfeinerte Phänotypisierungsmethoden und Effektmonitoring

gegen aromatische Amine ein erhöhtes Risiko, eine Methämoglobinämie zu erleiden, und haben bei langjähriger Belastung mit diesen Stoffen ein höheres Harnblasen-Krebsrisiko als schnelle Acetylierer (Cartwright et al. 1982, Lewalter und Miksche 1991). Wichtige Enzyme des Phase-II-Stoffwechsels sind die GlutathionS-Transferasen (GST) (Hayes und Pulford 1995). Die GST konjugieren elektrophile Verbindungen oder Metaboliten mit Glutathion, ein Stoffwechselschritt, der in fast allen Fällen detoxifizierend wirkt, wobei auch hier toxikologisch relevante Ausnahmen existieren. Vor diesem Hintergrund werden Polymorphismen dieser Enzyme, welche die Entgiftungskapazität des betroffenen Individuums reduzieren können, verstärkt untersucht. Zur Zeit sind Polymorphismen von drei GST bekannt. Es handelt sich um die GSTM1 (Seidegard et al. 1988), die GSTT1 (Hallier et al. 1990, Pemble et al. 1994) und die GSTP1 (Henderson et al. 1998). Der Polymorphismus der GSTM1 beruht auf einer Gendeletion, die einen Verlust der enzymatischen Aktivität zur Folge hat (Seidegard et al. 1988). GSTM1 konjugiert unter anderem Epoxide der polyzyklischen Aromaten mit Glutathion. Es hat daher große Bedeutung als entgiftendes Enzym (Hayes und Pulford 1995). In der europäischen Bevölkerung sind etwa 50 % defizient für die GSTM1 (Daly et al. 1993). Es gibt jedoch klare ethnische Unterschiede. Mehr als 90 % der polynesischen Bevölkerung sind GSTM1-negativ, während es in Deutschland nur 50 % (Hayes und Pulford 1995, Schulz et al. 1999a) sind. In zahlreichen Studien wurde gezeigt, dass ein Zusammenhang zwischen der Defizienz für GSTM1 und dem Auftreten von Lungenkrebs, Blasenkrebs und Kolonkrebs besteht (Seidegard et al. 1990, Bell et al. 1993, Daly et al. 1993, Zhong et al. 1993). Die GSTT1 produziert, wie die anderen GST auch, überwiegend inaktive Metabolite. Das Enzym kann aber auch Substanzen wie Dichlormethan zu gentoxischen Intermediaten metabolisieren (Thier et al. 1996). Die Untersuchungen zur GSTT1 begannen mit dem Nachweis von polymorph exprimierten Glutathion-abhängigen Konjugierungsreaktionen in Erythrozyten (Peter et al. 1989, Hallier et al. 1990). Als Substrate wurden neben Methylchlorid und Methylbromid auch Ethylenoxid und Dichlormethan untersucht (Föst et al. 1991, Hallier et al. 1994). GSTT1 wird sowohl in der Leber als auch in den Erythrozyten exprimiert (Schröder et al. 1992). In-vitro-Experimente mit Lymphozyten zeigten einen protektiven Effekt der GSTT1, wenn Lymphozyten mit Methylbromid, Ethylenoxid oder Dichlormethan inkubiert und auf Schwesterchromatidaustausch (SCE) untersucht wurden (Hallier et al 1993). Nach Sequenzierung der cDNA der GSTT1 wurde eine PCR-Methode etabliert, die mit Phänotypisierungen in den Erythrozyten validiert wurde (Pemble et al 1994). Molekular-epidemiologisch sind bislang nur wenige Zusammenhänge zwischen malignen Erkrankungen und dem GSTT1-Polymorphismus hergestellt worden. Eine signifikante Erhöhung der Odds-Ratio für die Entwicklung eines myelodysplastischen Syndrom (MDS) wurde für GSTT1-negative Patienten beschrieben (Chen et al. 1996). Diesem Befund folgten weitere Stu81

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Suszeptibilität

dien anderer Arbeitsgruppen, die diesen Zusammenhang nicht finden konnten (Atoyebi et al. 1997, Basu et al. 1997, Schulz et al. 1999a). In neueren Untersuchungen zeichnet sich ab, dass mehrere Polymorphismen verschiedener Enzyme im Zusammenhang betrachtet werden müssen. In einer Untersuchung über therapieinduzierte Leukämien fielen Patientinnen mit Mamma-Karzinom auf. 50 % der untersuchten Fälle wiesen eine Deletion sowohl der GSTT1 als auch der GSTM1 auf (Schulz et al. 1999b). Auch in Bezug auf die Sensibilisierung gegen das wichtige Konservierungsmittel Thiomersal scheint diese Doppeldeletion der GSTT1 und GSTM1 einen Risikofaktor darzustellen (Westphal et al. 2000). Welche Bedeutung haben nun diese wissenschaftlich außerordentlich reizvollen Polymorphismen für die praxisorientierte Arbeitsmedizin? Den durchschnittlichen Arbeitnehmer gibt es nicht. Diese Binsenweisheit bestätigt sich auch für den Fremdstoff-Metabolismus mit all seinen Facetten. Für die weitergehenden Betrachtungen müssen allerdings noch einige grundlegende Fakten diskutiert werden. Es muss deutlich unterschieden werden zwischen der Betrachtung des individuellen und des kollektiven Risikos. Dies lässt sich z. B. anhand der GST veranschaulichen. Hier liegen viele Untersuchungen zu Zusammenhängen zwischen dem GSTM1-Polymorphismus und malignen Erkrankungen vor. Eine Reihe von Untersuchungen zeigte eine Häufung der Individuen mit GSTM1-negativem Genotyp bei Patienten mit bestimmten malignen Erkrankungen. Allerdings lag die Erhöhung des individuellen Risikos bei Vorliegen des GSTM1-negativen Genotypes in der Regel bei einem Faktor von zwei, in wenigen Fällen auch einmal bei drei (Rebbeck 1997). Im Vergleich zu Änderungen in bestimmten Tumorsupressorgenen, die vielfache Steigerungen des individuellen Krebs-Risikos zur Folge haben, stellt das eine geringe Erhöhung dar. Bei Betrachtung der Auswirkungen auf große Kollektive muss wiederum berücksichtigt werden, dass die GSTM1-Defizienz in Europa etwa 50 % der Bevölkerung betrifft und die GSTT1-Defizienz zwischen 10 und 30 % liegt, während die Veränderungen der Tumorsupressorgene selten sind. Damit haben die Polymorphismen der GST Bedeutung für die Beurteilung eines Risikos für die Gesamtheit der Population. Als Instrument für eine individuelle Risikoabschätzung in der betrieblichen Praxis ist eine Bestimmung der verschiedenen Polymorphismen bislang nicht geeignet. Zu vielfältig ist die Expositionslage auf der einen Seite und zu unvollständig ist unser Wissen über die konkrete Auswirkung der Polymorphismen auf der anderen Seite. Dennoch kann eine arbeitsmedizinisch-toxikologische Relevanz des GSTT1-Polymorphismus auch für die individuelle Risikoabschätzung durch eine Kasuistik verdeutlicht werden. Zwei Arbeiter, die sich akzidentell mit Methylbromid vergifteten, zeigten – bei gleicher Exposition – eine sehr unterschiedliche Symptomatik. Der Patient mit negativem GSTT1-Genotyp litt lediglich unter vorübergehenden Symptomen wie Übelkeit, während der Patient mit positivem GSTT1-Genotyp schwere dauernde neurotoxische Manifestationen zeigte und daher seit dem Vorfall einen Rollstuhl benutzen 82

4.1

Verfeinerte Phänotypisierungsmethoden und Effektmonitoring

muss. Hierfür wird eine GSTT1-abhängige Metabolisierung des Methylbromids zu einem neurotoxischen Metaboliten verantwortlich gemacht (Garnier et al. 1996). Für eine individuelle Prognose zur Suszeptibilität in Bezug auf die akuten neurotoxischen Wirkungen von Methylbromid wäre es erforderlich festzustellen, in welchem Maße die einzelne Person Methylbromid zum toxischen Metaboliten umsetzt. Die Genotypisierung mittels PCR liefert nur eine grobe Einteilung der Population in zwei Gruppen, nämlich Gen vorhanden und Gen deletiert. Die tatsächliche Enzymaktivität, also der Phänotyp, weist aber innerhalb einer Population sowohl für die GSTT1 (Schröder et al. 1996) als auch für die GSTM1 (Bell et al. 1992) eine breite Streuung auf. Mittels Genotypisierung durch PCR ist bislang noch nicht einmal eine grobe Einteilung in homozygote und heterozygote Träger des Merkmals möglich. Für die individuelle Risikobeurteilung ist daher eine Entwicklung praktikabler Phänotypisierungsmethoden, die als Verfahren des Biomonitoring in arbeitsmedizinischen und umweltmedizinischen Kollektiven einsetzbar sind, unabdingbar. Diese Methodenentwicklung ist, da sie chemisch-analytische und biochemische Verfahren beinhaltet, jedoch zeitaufwendig und kostspielig. Dennoch zeichnen sich erste Erfolge auf diesem Gebiet ab. Die bisher praktizierte grobe Phänotypisierung der GSTT1 durch Bestimmung des Substratumsatzes in Blutproben (Hallier et al. 1993) kann durch ein neues und exakteres Verfahren der Produktbestimmung abgelöst werden. Zusammenfassung und Forschungsbedarf Die Genotypisierung ist auf Grund ihrer methodischen Einfachheit als Screening-Methode für größere Kollektive, z. B. in der molekularen Epidemiologie, geeignet. Für die individuelle Risikobeurteilung ist jedoch eine Phänotypisierung zur Erfassung der tatsächlichen Ausprägung des Merkmals Enzymaktivität unverzichtbar. Es besteht noch erheblicher Forschungsbedarf im Hinblick auf x Faktoren, die den genetisch determinierten Enzymstatus modulieren (Induktion, Hemmung, intraindividuelle Variabilität); x Die Entwicklung praktikabler und standardisierter Biomonitoring-Verfahren zur Erfassung der individuellen Enzymaktivität bzw. -kinetik.

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Suszeptibilität

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4.1

Verfeinerte Phänotypisierungsmethoden und Effektmonitoring

Nebert, D. W.: Polymorphisms in drug-metabolizing enzymes: What is their clinical relevance and why do they exist?, Am. J. Hum. Genet., 60, 265–271 (1997). Pemble, S. E., Schroeder, K. R., Spencer, S. R., Meyer, D. J., Hallier, E., Bolt, H. M., Ketterer, B., Taylor, J. B.: Human glutathione S-transferase Theta (GSTT1): cDNA cloning and the characterization of a genetic polymorphism, Biochem. J., 300, 271–275 (1994). Peter, H., Deutschmann, S., Reichel, C., Hallier, E.: Metabolism of methyl chloride by human erythrocytes, Arch. Toxicol., 63, 351–355 (1989). Rebbeck, T. R.: Molecular epidemiology of the human glutathione S-transferase genotypes GSTM1 and GSTT1 in cancer susceptibility, Canc. Epidem. Biomark. Prev., 6, 733–743 (1997). Schröder, K. R., Hallier, E., Meyer, D. J., Wiebel, F. A., Müller, A. M. F., Bolt, H. M.: Purification and characterization of a new glutathione S-transferase, class q, from human erythrocytes, Arch. Toxicol., 70, 559–566 (1996). Schröder, K. R., Hallier, E., Peter, H., Bolt, H. M.: Dissociation of a new glutathione S-transferase activitiy in human erythrocytes, Biochem. Pharmacol., 43, 1671–1674 (1992). Schulz, T. G., Haase, D., Wörmann, B., Schoch, C., Schnittger, S., Hiddemann, W., Bünger, J., Hallier, E.: Increased occurence of GSTM1-deficiency in patients with AML or MDS and complex caryotype abnormalities, Naunyn Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol., 359 Suppl, R 150 (1999a). Schulz, T. G., Haase, D., Schnittger, S., Bünger, J., Schoch, C., Fonatsch, C., Westphal, G. A., Griesinger, F., Wörmann, B., Hallier, E.: Glutathione S-transferase (GST)-deficiency in de novo and therapy-induced hematologic malignancies, Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem., 331 Suppl. 2, 43 (1999b). Seidegard, J., Pero, R. W., Markowitz, M. M., Roush, G., Miller, D. G., Beattie, E. J: Isoenzyme(s) of glutathion transerase (class m) as a marker for the susceptibility to lung cancer, a follow up study, Carcinogen., 11, 33–36 (1990). Seidegard, J., Vorachek, W. R., Pero, R. W., Pearson, W. R: Hereditary differences in the expression of the human glutathione transferase active on trans-stilbene oxide are due to a gene deletion, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7293–7297 (1988). Their, R., Pemble, S. E., Kramer, H., Taylor, J. B., Guengerich, F. P., Ketterer, B.: Human glutathione S-transferase T1-1 enhances mutagenicity of 1,2-dibromoethane, dibromoethane and 1,2,3,4-diepoxybutane in Salmonella typhimurium, Carcinogen., 17, 163–166 (1996). Westphal, G. A., Schnuch, A., Schulz, T. G., Reich, K., Aberer, W., Brasch, J., Koch, P., Wessbecher, R., Sliska, C. h., Bauer, A., Hallier, E.: Homozygous gene deletions of the glutathione S-transferases M1 and T1 are associated with thiomersal sensitization, Int. Arch. Occup. Health, in press (2000). Zhong, S., Wyllie, A. H., Barnes, D., Wolf, C. R., Spurr, N. K.: Relationship between the GSTM1 genetic polymorphism and susceptibility to bladder, breast and colon cancer, Carcinogen., 14, 1821–1824 (1993).

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Suszeptibilität

4.2 Genetische Polymorphismen von Sulfotransferasen als Suszeptibilitätsparameter Hansruedi Glatt*

Sulfotransferasen sind am Metabolismus vieler Fremdstoffe beteiligt. Sie bilden in der Regel gut wasserlösliche, leicht ausscheidbare Metaboliten und tragen so zu ihrer Detoxifizierung bei. Untersuchungen mit rekombinanten Testsystemen haben jedoch gezeigt, dass Sulfotransferasen relativ häufig auch reaktive, potenziell mutagene und kanzerogene Metaboliten bilden. Beim Menschen sind elf Fremdstoff-metabolisierende Sulfotransferasen bekannt. Für zwei Formen sind funktionell relevante genetische Polymorphismen gefunden worden. Die meisten anderen Formen sind diesbezüglich noch nicht untersucht worden. In Anbetracht ihrer Zweischneidigkeit – Toxifizierung oder Detoxifizierung je nach Substrat – ist jedoch die Existenz weiterer Polymorphismen bei Sulfotransferasen wahrscheinlich. Es gilt nun, (a) herauszufinden, welche Substanzen durch welche Sulfotransferasen detoxifiziert oder toxifiziert werden, (b) die noch nicht untersuchten Formen auf genetische Polymorphismen zu prüfen, (c) basierend auf diesen Erkenntnissen Zusammenhänge zwischen Sulfotransferase-Genotyp und gesundheitlicher Gefährdung bei entsprechend exponierten Individuen zu erfassen.

4.2.1 Überblick über die Sulfotransferase-Formen des Menschen Sulfotransferasen übertragen die Sulfonyl-Gruppe vom Cosubstrat 5l-Phos-Phosphoadenosyl-3l-phosphosulfat auf nukleophile Gruppen (–OH, –NH2, –SH, –NpO) ihrer Substrate (Falany 1997). Die Reaktion wird im Hinblick auf die übertragene Gruppe Sulfonierung genannt. Sie wird auch als Sulfatierung bezeichnet, da bei der (weitaus häufigsten) O-Sulfonierung ein Sulfatester gebildet wird. Die Sulfotransferasen können in zwei Gruppen eingeteilt werden. Die erste Gruppe sulfoniert Makromoleküle (Tyrosin-Reste von

* Deutsches Institut für Ernährungsforschung, Abteilung Ernährungstoxikologie, Arthur-Scheunert-Allee 114–116, 14558 Bergholz-Rehbrücke

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4.2

Genetische Polymorphismen von Sulfotransferasen

Proteinen, Lipide, Zucker-Reste). Die meisten dieser Sulfotransferasen sind in den Membranen des Golgi-Apparates lokalisiert; von diesen Enzymen sind keine Fremdstoff-metabolisierenden Leistungen bekannt. Die zweite Gruppe sulfoniert xenobiote und endogene niedermolekulare Substanzen und umfasst nur lösliche Enzyme (Falany 1997). Beim Menschen sind elf verschiedene Formen bekannt. Sie zeigen Homologien ihrer Aminosäure-Sequenzen und können deshalb als Enzym-Superfamilie (oder Produkte einer Gen-Superfamilie) angesehen werden (Weinshilboum et al. 1997, Yamazoe et al. 1994). Als Bezeichnung für die Superfamilie wurde beim 2nd Sulfation Workshop SULT festgelegt. Eine systematische Klassifizierung ist in Bearbeitung. Obwohl formal noch nicht verabschiedet, hat sie für die humanen Formen bereits weite Verbreitung gefunden. Die Nomenklatur der SULT folgt weitgehend den Kriterien, die für die Klassifizierung der Cytochrom-P450 verwendet werden. Gene werden in der Regel in kursiver Schrift dargestellt, Genprodukte (mRNA, Protein, cDNA) in Normalschrift. Basierend auf dem Grad der Homologie der aus der cDNA abgeleiteten Aminosäure-Sequenz findet eine Einteilung in Familien (z. B. SULT1, SULT2), Subfamilien (z. B. SULT1A, SULT1B) und einzelne Gene (z. B. SULT1A1, SULT1A2) statt. Werden aus einem Gen durch unterschiedliches mRNA-Splicing mehrere unterschiedliche Proteine gebildet, werden diese durch einen nachgestellten Kleinbuchstaben gekennzeichnet (z. B. SULT2B1a, SULT2B1b). Die SULT des Menschen (1A1, 1A2, 1A3, 1B1, 1C1, 1C2, 1E1, 2A1, 2B1a, 2B1b, 4A1) unterscheiden sich insbesondere in ihrer Substratspezifität und Gewebeverteilung sehr stark voneinander. Die Trivialnamen, die sich an Substraten orientieren, sind oft irreführend. So metabolisiert z. B. die klassische Phenol-Sulfotransferase (1A1) nicht nur Phenole, sondern auch aromatische Amine, aromatische Hydroxylamine, Alkohole, N-Oxide und Nitroalkane (als Nitronate). Umgekehrt wird 17b-Östradiol nicht nur durch die Östrogen-Sulfotransferase (1E1) metabolisiert, sondern unter anderem auch durch 1A1 und 2A1 (Falany 1997).

4.2.2 Genetische Polymorphismen von SULT SULT1A1 (alte Bezeichnung: thermostabile oder Phenol-sulfatierende Phenol-Sulfotransferase, P-PST) und 1A3 (alte Bezeichnung thermolabile oder Catecholamin-sulfatierende Phenol-Sulfotransferase, M-PST) werden unter anderem in Thrombozyten exprimiert. Ihre Aktivität lässt sich darin spezifisch mit den Substraten p-Nitrophenol beziehungsweise Dopamin bestimmen (Raftogianis et al. 1997). Damit stehen einfache Verfahren zur Phänotypisierung zur Verfügung. Sie wurden bereits lange vor der Identifizierung der betreffenden Gene eingesetzt. Dabei zeigte die 1A3 eine geringe, die 1A1 dagegen eine große (mehr als 50fache) interindividuelle Variabilität. Dafür wurde mittlerweile eine genetische Erklärung gefun87

4

Suszeptibilität

den. Alle bis jetzt isolierten 1A3-cDNA zeigten die identische Sequenz. Dagegen wurden verschiedene 1A1-Sequenzen entdeckt (Coughtrie et al. 1999, Engelke et al. 2000, Jones et al. 1995, Ozawa et al. 1998, Raftogianis et al. 1997). Von besonderer Bedeutung ist ein GpA-Austausch im Codon 213, der zu einem Aminosäure-Austausch (ArgpHis) führt (Raftogianis et al. 1997). Die Enzymvariante SULT1A1*His zeigt ungünstigere kinetische Eigenschaften und ist weniger stabil als die Enzymvariante 1A1*Arg. In der Potsdamer Bevölkerung fanden wir Allelhäufigkeiten von 63 % für 1A1*Arg und 37 % für 1A1*His (Engelke et al. 2000). Ähnliche Allelhäufigkeiten wurden in den USA (Ozawa et al. 1998, Raftogianis et al. 1997) und in Großbritannien (Coughtrie et al. 1999) beobachtet. Ein funktionell relevanter Polymorphismus ist auch für die SULT1A2 bekannt (Brix et al. 1998, Engelke et al. 2000, Raftogianis et al. 2000). Basenaustausche in den Codons 7 und 235 führen zu Aminosäure-Austauschen (IlepThr und AsnpThr). In der Regel treten beide Austausche gekoppelt auf. Für die Funktion ist primär der Austausch im Codon 235 bedeutsam. 1A2*Asn zeigt wesentlich günstigere kinetische Eigenschaften als 1A2*Thr (Brix et al. 1998, Raftogianis et al. 2000). In Potsdam fanden wir Allelhäufigkeiten von 62 % für 1A2*Asn und 38 % für 1A2*Thr (Engelke et al. 2000). Die Gene SULT1A1 und 1A2 liegen direkt benachbart (innerhalb von 40 kb) auf dem gleichen Chromosom. Zwischen ihren Polymorphismen besteht eine enge Assoziation (Engelke et al. 2000). Es ist bemerkenswert, dass nahezu immer die Allele der hoch aktiven Varianten (1A1*Arg und 1A2*Asn) oder jene der weniger aktiven Varianten (1A1*His und 1A2*Thr) auf einem Chromosom zusammen vorliegen. Über die Gewebeverteilung der Expression der 1A2 ist nur wenig bekannt. Die cDNA wurde aus der Leber isoliert, so dass die entsprechende mRNA vorhanden sein muss. Allerdings scheint die hepatische 1A2 mRNA-Expression etwa 100 mal niedriger als jene der 1A1 zu sein. Von den anderen SULT wurden nur 2A1 und, in geringem Umfang, 1E1 auf interindividuelle Unterschiede untersucht. Für 2A1 wurde eine bimodale Aktivitätsverteilung in der Leber beobachtet. Sie kann nicht auf Unterschiede im kodierenden Bereich zurückgeführt werden (Wood et al. 1996). SULT1B1 zeigt ihre höchste Expression auf Protein-Ebene im Colon. Wir beobachteten dabei beträchtliche Unterschiede in Gewebeproben von verschiedenen Probanden. Doch sind die Gründe dafür noch unbekannt. Die übrigen SULT (1C1, 1C2, 2B1a, 2B1b, 4A1) wurden in den Jahren 1998–2000 zum ersten Mal beschrieben. Sie sind praktisch nur auf Nukleinsäure-Ebene bekannt. Über ihre Expression auf Protein- und Enzymaktivitäts-Ebene im menschlichen Organismus liegen keine Daten vor. Auch über ihre physiologische Funktion, interindividuelle Variabilität und mögliche genetische Polymorphismen ist noch nichts bekannt.

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4.2

Genetische Polymorphismen von Sulfotransferasen

4.2.3 Toxifizierung und Detoxifizierung durch SULT, Unterschiede zwischen allelischen Varianten Sehr viele Fremdstoffe werden als Glucuronide und Sulfonat-Konjugate (als Sulfate oder – seltener – als Sulfamate oder Thiosulfate) ausgeschieden. Aus diesem Grund werden die Konjugationsreaktionen üblicherweise eng mit metabolischer Detoxifizierung assoziiert. Diese Betrachtungsweise erweist sich zunehmend als zu einfach. Mittlerweile ist klar, dass zumindest die Sulfatierung (O-Sulfonierung) ein erhebliches Toxifizierungspotenzial aufweist. Dafür gibt es chemische Gründe. Die Sulfat-Gruppe ist stark Elektronen ziehend und bildet deshalb in geeigneten Positionen (bei Stabilisierung des resultierenden Kations durch Mesomerie oder induktive Effekte) eine gute Abgangsgruppe. Bei dieser Heterolyse entsteht ein stark elektrophiles Kation, das sich kovalent an zelluläre Makromoleküle binden kann. Bei Bindung an die DNA können Mutationen induziert und Tumore initiiert werden. Bereits in den 60er Jahren hatten die Millers gezeigt, dass die Aktivierung des Hepatokanzerogens 2-Acetylaminofluoren in der Ratte über eine Sulfatierung (N-Hydroxylierung gefolgt von O-Sulfonierung) verläuft (DeBaun et al. 1968). In den folgenden Jahrzehnten blieb dieser Aktivierungsmechanismus jedoch weitgehend unbeachtet. Ein wesentlicher Grund dafür dürfte sein, dass in dieser Zeit In-vitro-Tests mit externen Aktivierungssystemen (z. B. Ames-Test) eine zentrale Stellung bei der Erfassung von Mutagenen und bei der Charakterisierung ihrer Aktivierungswege erlangt hatten. Mit externen metabolischen Systemen lässt sich aber eine Aktivierung via Sulfatierung nicht zuverlässig erfassen, da reaktive Sulfatester wegen ihrer Ladung schlecht membrangängig sind, besonders wenn sie kurzlebig sind, und damit nicht in die Zielzellen eindringen (Glatt 1997). Die Detektierbarkeit einer SULT-vermittelten Aktivierung hat sich in den letzten Jahren grundlegend verbessert, da es nun möglich ist, durch gentechnische Verfahren SULT direkt in Zielzellen von etablierten Mutagenitäts-Testsystemen (z. B. Salmonella-Stämme von Ames, V79-Zellen aus dem Chinesischen Hamster) zu exprimieren (Glatt 1997, Glatt et al. 1998, 2000, Jones et al. 1995, Kreis et al. 2000). Allein in unserer Arbeitsgruppe – in welcher der größte Teil der Studien durchgeführt wurde – konnte für über 100 Substanzen eine SULT-abhängige Aktivierung zu Mutagenen nachgewiesen werden. Auffällig ist dabei das Charakteristikum, dass häufig nur eine oder wenige SULT zur Aktivierung einer Substanz führen, während viele andere Formen gegenüber der gleichen Substanz inaktiv sind (aber dafür andere Substanzen aktivieren). Das gilt beim Vergleich zwischen verschiedenen SULT-Formen aus einer Spezies (Glatt et al. 1998, 2000), zwischen orthologen Formen aus unterschiedlichen Spezies (Glatt et al. 1998, 2000) und auch zwischen allelischen Varianten (Alloenzymen) der gleichen Form aus einer Spezies. Hier soll nur auf den dritten Aspekt eingegangen werden, der mit Beispielen illustriert wird. 2-Nitropropan (Abb. 1) und 2,4-Dinitrobenzylalkohol (Abb. 2) werden durch die SULT1A1*Arg um Größenordnungen 89

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Suszeptibilität

Abbildung 1: Mutagenität von 2-Nitropropan in aus V79 abgeleiteten Zelllinien, in denen heterologe SULT stabil exprimiert wurden. Untersucht wurde die Häufigkeit von Mutationen im hprt-Locus. Angegeben sind Mittelwerte und Standardfehler von zwei Kulturen.

Abbildung 2: Mutagenität von 2,4-Dinitrobenzylalcohol in Salmonella typhimurium TA1538 und davon abgeleiteten Stämmen, in denen allelische Varianten der humanen SULT1A1 stabil exprimiert wurden. Untersucht wurde die Reversion zu Histidin-Prototrophie. Angegeben sind Mittelwerte und Standardfehler von drei Platten.

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4.2

Genetische Polymorphismen von Sulfotransferasen

Abbildung 3: Mutagenität von N-Hydroxy-2-acetylaminofluoren in Salmonella typhimurium TA1538 und davon abgeleiteten Stämmen, in denen allelische Varianten der humanen SULT1A2 stabil exprimiert wurden. Angegeben sind Mittelwerte und Standardfehler von drei Platten.

Abbildung 4: Mutagenität von N-Hydroxy-2-acetylamino-5-phenylpyridin in Salmonella typhimurium TA1538 und davon abgeleiteten Stämmen, in denen allelische Varianten der humanen SULT1A2 stabil exprimiert wurden. Angegeben sind Mittelwerte und Standardfehler von drei Platten.

91

4

Suszeptibilität

effizienter aktiviert als durch ihre allelische Variante 1A1*His. Ebenso werden N-Hydroxy-2-acetylaminofluoren (Abb. 3) und N-Hydroxy-2-acetylamino-5-phenylpyridin (Abb. 4) stärker durch 1A2*Asn als durch ihre allelische Variante 1A2*Thr aktiviert. N-Hydroxy-2-amino-1-methyl6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin, ein Metabolit des heterozyklischen Amins 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin (PhIP), das beim Erhitzen von Nahrungsmitteln aus Aminosäuren und Creatin entsteht, wird durch beide SULT, 1A1 und 1A2, sehr effizient aktiviert, wobei die Alloenzyme 1A1*Arg und 1A2*Asn wesentlich aktiver sind als 1A1*His und 1A2*Thr.

4.2.4 Assoziation zwischen SULT-Genotyp und Erkrankungsrisiken Die Beobachtung, dass ein Alloenzyme eine bestimmte Substanz substanziell effizienter toxifiziert als ein anderes, legt die Vermutung nahe, dass Individuen, die das hoch aktive Alloenzym homozygot kodieren, durch die betreffende Substanz stärker gefährdet sind als solche, die es nicht oder nur in einfacher Kopie kodieren. Diese Vermutung bedarf jedoch der Überprüfung im Menschen in-vivo, da das gleiche Enzym unter Umständen in multipler – toxifizierender und detoxifizierender – Weise in die Biotransformation der Substanz eingreifen kann, und da es in Konkurrenz zu anderen Enzymen steht, die je nach dem gebildeten Produkt und der Lokalisation des Enzyms zu einer stärkeren oder geringeren Gefährdung führen können. Ebenso ist hervorzuheben, dass ein bestimmter Genotyp für ein Fremdstoff-metabolisierendes Enzym nicht an sich ein Risikofaktor darstellt, sondern erst in Kombination mit der Exposition gegenüber bestimmten Fremdsubstanzen. Abhängig von der Art der Substanzbelastung könnte sich der gleiche Genotyp sowohl günstig als auch ungünstig auswirken. Die oben vorgestellten Daten lassen vermuten, dass das Vorhandensein des Alloenzyms SULT1A1*Arg die Gefährdung durch einige aromatische Amine und durch 2-Nitropropan erhöht. Dagegen würde man etwa beim Benzol eher eine Risikoverminderung erwarten, da Phenol, Catechol und Hydrochinon – die als proximale Mutagene/Kanzerogene des Benzols anzusehen sind – durch SULT1A1 in gut ausscheidbare Konjugate umgesetzt werden. Unser besonderes Interesse gilt der Ernährungstoxikologie. Einige, aber nicht alle, epidemiologische Studien zeigen positive Assoziationen zwischen der Inzidenz von Mamma- und Colon-Karzinomen und einem hohen Verzehr an Fleisch, insbesondere wenn stark gebratenes Fleisch bevorzugt wird. Dies legt den Verdacht nahe, dass heterozyklische Amine ätiologisch bedeutsam sein könnten. Da SULT1A1 an der Aktivierung von heterozyklischen Aminen beteiligt ist (siehe oben), in der Colonmucosa und der Mamma exprimiert wird und genetisch polymorph ist, bietet es sich an, entsprechende epidemiologische Studien durchzuführen. Wir beabsichtigen, solche Untersuchen im 92

4.2

Genetische Polymorphismen von Sulfotransferasen

Rahmen der European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC) durchzuführen. In der EPIC werden von mehreren hunderttausend Probanden Erhebungen zu Ernährungsgewohnheiten, Lebensstil und Gesundheit durchgeführt, verschiedene physiologische Parameter bestimmt und Blutproben entnommen (Riboli 1992). Da es sich um eine prospektive Studie handelt, die erst vor Kurzem begonnen wurde, liegen noch keine ausreichenden Daten zur Krebsinzidenz vor. Beim Etablieren der Genotypisierung der SULT1A1 und 1A2 wurden deshalb im Rahmen von EPIC Vergleiche zwischen Gruppen durchgeführt, die sich in solchen gesundheitsrelevanten physiologischen Parametern unterscheiden, welche sich bereits jetzt erfassen lassen, wie Blutdruck und Körpergewicht. Eine solche Untersuchung ist deshalb interessant, weil SULT nicht nur Fremdstoffe metabolisieren, sondern auch eine bedeutende Rolle bei der Regulation zahlreicher Hormone (Thyroxine, Catecholamine, einige Peptide, Sexual-, Mineral- und Corticosteroide, Melatonin, Eicosanoide) einnehmen; auch Cholesterol und Cholsäuren gehören zu ihren Substraten (Falany 1997, Kester et al. 1999). Es wurde keine Assoziation zwischen Bluthochdruck und den SULT1A1und 1A2-Genotypen beobachtet. Dagegen waren bei Adipösen die Allele 1A1*His und 1A2*Thr übervertreten (Tab. 1). Es ist noch nicht bekannt, ob die Ursache dieser Assoziation auf einer SULT-Funktion beruht oder auf einen gekoppelten Polymorphismus in einem benachbarten Gen zurückzuführen ist. Parallel zu unserer Arbeitsgruppe etablierten Coughtrie et al. (1999) die Genotypisierung von SULT1A1. Sie beobachteten dabei eine Zunahme der Häufigkeit des 1A1*Arg-Allels mit zunehmendem Alter (Tab. 2a). Eine Untersuchung unserer Probanden mit den identischen Kriterien zeigte den gleichen Trend (Tab. 2b). Da es sich um exploratorische Auswertungen handelt, ist die Aussage erst als vorläufig einzustufen. Immerhin könnten die Assoziation zwischen SULT1A-Genotyp und Adipositas einerseits (siehe oben) und die bekannte Assoziation zwischen Adipositas und verminderter Lebenserwartung andererseits für diese Möglichkeit sprechen. Sollte sich

Tabelle 1: SULT1A1- und 1A2-Genotyp in normalgewichtigen und adipösen Männern (n ¼ 692) aus der Potsdamer Gegend. Genotyp SULT1A1*Arg/*Arg *Arg/*His *His/*His SULT1A2*Asn/*Asn *Asn/*Thr *Thr/*Thr

Odds-Ratiob

Zahl der Individuen normalgewichtiga

adipösa

152 149 45 145 156 45

121 178 47 116 176 54

1,000 1,501 1,244 1,000 1,253 1,343

(Bezugswert) (1,086–2,075) (0,817–2,110) (Bezugswert) (1,019–1,955) (0,943–2,395)

a

Als Kriterium für Normalgewicht oder Adipositas wurde ein body mass index (BMI) von 20–25 beziehungsweise i 30 eingesetzt. b Adipöse im Vergleich zu Normalgewichtigen. In Klammern ist das Konfidenzintervall angegeben.

93

4

Suszeptibilität

Tabelle 2: Altersabhängigkeit der Häufigkeit verschiedener SULT1A1-Genotypen. a) Coughtrie et al. (1999): Britische Probanden (Männer und Frauen, n ¼ 293). Armitrage Trend-Test p ¼ 0.017. Altersklasse

Genotyp-Häufigkeit *Arg/*Arg *Arg/*His

*His/*His

Allel-Häufigkeit *Arg *His

(Jahre)

n

%

n

%

n

%

%

%

12–39 40–49 50–59 60–69 70–99

32 21 19 25 40

39,0 38,9 47,5 51,0 58,8

41 25 16 20 22

50,0 46,3 40,0 40,8 32,4

9 8 5 4 6

11,0 14,8 12,5 8,2 8,8

64,0 62,0 67,5 71,4 75,0

36,0 38,0 32,5 28,6 25,0

b) Männer aus der Potsdamer Gegend (n ¼ 692). Altersklassifizierung wie bei Coughtrie et al. (1999). Altersklasse (Jahre) 12–39 40–49 50–59 60–691 70–99 1

Genotyp-Häufigkeit *Arg/*Arg *Arg/*His

*His/*His

Allel-Häufigkeit *Arg *His

n

%

n

%

n

%

%

%

0 70 120 83 0

– 36,6 38,6 43,7 –

0 96 146 85 0

– 50,3 46,9 44,7 –

0 25 45 22 0

– 13,1 14,5 11,6 –

– 61,8 62,1 66,1 –

– 38,2 37,9 33,9 –

Ältester Proband 64-jährig.

der Zusammenhang von SULT1A-Genotyp und Lebensalter bestätigen, würde dies bedeuten, dass ein Polymorphismus der SULT1A1, der SULT1A2 oder eines benachbarten Gens die Lebenserwartung beeinflusst. Es wäre dann interessant herauszufinden, ob Unterschiede in den Häufigkeiten bestimmter Todesursachen zwischen den SULT1A-Genotypen bestehen und ob SULT1A1-Substrate ätiologisch bedeutsam sind. Abgesehen von diesen ersten Studien liegen noch keine Untersuchungen vor über die Häufigkeit von SULT1A-Genotypen in Abhängigkeit von Erkrankungsinzidenzen oder anderen gesundheitsbezogenen Parametern. Nachdem nun die Methoden zur Genotypisierung entwickelt sind, ist aber zu erwarten, dass in Kürze viele derartige Daten verfügbar werden. Wir erachten solche Daten aus toxikologischer Sicht dann als besonders interessant, wenn gleichzeitig ein Bezug zu Belastungen mit Substanzen erstellt wird, die durch SULT1A1 oder 1A2 toxifiziert oder detoxifiziert werden.

94

4.2

Genetische Polymorphismen von Sulfotransferasen

4.2.5 Folgerungen und Ausblick Durch heterologe Expression können exakte definierte Fremdstoff-metabolisierende Enzyme des Menschen für metabolische und toxikologische Untersuchungen verfügbar gemacht werden. Sie können daraufhin untersucht werden, ob sie eine vorgegebene Substanz metabolisieren. Werden die Enzyme direkt in Zielzellen von toxikologischen Testsystemen exprimiert, kann zudem unmittelbar geprüft werden, ob diese Metabolisierung eine Aktivierung zu zytotoxischen oder mutagenen Produkten darstellt. Dies ist schon deshalb von Bedeutung, weil viele toxikologisch aktiven Metabolite so reaktiv und kurzlebig sind, dass sie mit chemisch-analytischen Methoden nur schwer erfassbar sind. So reagieren reaktive Sulfat-Konjugate häufig mit Wasser, wobei die Ausgangsverbindung regeneriert wird (Glatt 1997, Landsiedel et al. 1998). Wird ein Enzym gefunden, das die betreffende Substanz metabolisiert (und dabei eventuell toxifiziert oder detoxifiziert) und sind davon genetische Polymorphismen bekannt, kann weiter untersucht werden, ob sich die allelischen Varianten bezüglich dieser metabolischen Leistung unterscheiden. Ist dies der Fall und sind Probanden verfügbar, die gegenüber dieser Substanz exponiert sind, z. B. durch Arzneimitteltherapie oder am Arbeitsplatz, bietet es sich an, Kinetik, Metabolitenprofile, pharmakologische und toxikologische Wirkungen separat bei den verschiedenen Genotypen zu untersuchen und zu vergleichen. Als toxikologische Endpunkte können dabei nicht nur die eigentlichen Schadwirkungen, sondern auch biologische und biochemische Biomarker wie DNA-Addukte eingesetzt werden. Vermittelt das betreffende Enzym eine Toxifizierung zu einem reaktiven Metaboliten, kann überdies aus seiner Gewebeverteilung auf mögliche Zielgewebe geschlossen werden, die eine besondere Beachtung bei toxikologischen und epidemiologischen Untersuchungen am Menschen verdienen. Auch die umgekehrte Blickrichtung (variable Wirkung/Kinetik p Polymorphismen) kann zu neuen Erkenntnissen führen. Falls man findet, dass bestimmte Enzymformen wesentlich in den Metabolismus einer Substanz eingreifen, und falls man in einzelnen exponierten Individuen Besonderheiten in der Kinetik oder den Wirkungen beobachtet, kann man dies als Anlass nehmen, die entsprechenden Loci in diesen Individuen genetisch zu untersuchen, um so neue, metabolisch/toxikologisch relevante Polymorphismen zu entdecken. Bei den vorgestellten Strategien werden mit Hilfe rekombinanter Invitro-Testsysteme Kandidatengene für Suszeptibilitätsfaktoren gegenüber bestimmten Substanzen identifiziert. Ob Polymorphismen in den entsprechenden Genen die Risiken in nennenswertem Umfang beeinträchtigen, muss dann jedoch im Menschen untersucht werden. Mittelfristig dürften als zusätzliche Untersuchungssysteme humanisierte Tiermodelle verfügbar werden, in denen das betreffende endogene Enzym durch die verschiedenen allelischen Varianten des orthologen humanen Enzyms ersetzt ist. Der Vorteil 95

4

Suszeptibilität

dieser Modelle wird darin liegen, dass umfangreiche experimental-toxikologische Untersuchungen in einem System möglich werden, in dem das polymorphe humane Gen in die Komplexität eines Gesamtorganismus eingebunden ist. Wenn einmal bekannt ist, wie die einzelnen genetischen Polymorphismen die Suszeptibilität gegenüber verschiedenen Einzelsubstanzen und Substanzklassen bestimmen, kann dieses Wissen auch genutzt werden, um jene Stoffe besser zu erfassen, die bei komplexen Expositionen, z. B. über Umwelt und Ernährung, für Schadwirkungen verantwortlich sind. Diese Verfahren lassen sich grundsätzlich auf verschiedene Komponenten des fremdstoffprozessierenden Systems (z. B. Biotransformation, Transport, Reparatur) anwenden. SULT dürften dabei von erheblichem Interesse sein, da sie in die Biotransformation sehr vieler Fremdstoffe eingreifen und dabei sowohl toxifizierend als auch detoxifizierend wirken können. Viele aromatische Amine, Nitroarene, sekundäre Nitroalkane und Substanzen, die zu benzylischen oder allylischen Alkoholen führen, können – direkt oder nach anderen Stoffwechselreaktionen – durch SULT toxifiziert werden. In diese Substanzklassen fallen viele Arbeitsstoffe und Umweltkontaminanten. Da alle bekannten humanen SULT-Formen einschließlich ihrer wichtigen allelischen Varianten bereits in rekombinanten Testsystemen verfügbar sind, kann auf relativ leichte Art untersucht werden, welche Formen in pharmako-toxikologischen Studien mit bestimmten Substanzen als Suszeptibilitätsfaktoren in Betracht kommen. Es ist zu erwarten, dass in den nächsten Jahren weitere humane SULT-Formen und weitere funktionell relevante SULT-Polymorphismen entdeckt werden. Entsprechende rekombinante Testsysteme können dann umgehend konstruiert werden. Parallel dazu sind leistungsfähige Verfahren zur Genotypisierung bezüglich funktionell relevanter Polymorphismen zu etablieren. Die Nutzung dieser Methodik im Rahmen der Arbeitsmedizin und der Umwelt- und Ernährungs-Toxikoepidemiologie erscheint uns viel versprechend. Literatur Brix, L. A., Nicoll, R., Zhu, X., McManus, M. E.: Structural and functional characterisation of human sulfotransferases, Chem.-Biol. Interact., 109, 123–127 (1998). Coughtrie, M. W. H., Gilissen, R. A. H. J., Shek, B., Strange, R. C., Fryer, A. A., Jones, P. W., Bamber, D. E.: Phenol sulfotransferase SULT1A1 polymorphism: molecular diagnosis and allele frequencies in Caucasian and African populations, Biochem. J., 337, 45–49 (1999). DeBaun, J. R., Rowley, J. Y., Miller, E. C., Miller, J.: Sulfotransferase activation of Nhydroxy-2-acetylaminofluorene in rodent livers susceptible and resistant to this carcinogen, Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 129, 268–273 (1968). Engelke, C. E. H., Meinl, W., Boeing, H., Glatt, H. R.: Association between functional genetic polymorphisms of human sulfotransferases 1A1 and 1A2, Pharmacogenetics, 10, 163–169 (2000). Falany, C. N.: Sulfation and sulfotransferases. 3. Enzymology of human cytosolic sulfotransferases, FASEB J, 11, 206–216 (1997).

96

4.2

Genetische Polymorphismen von Sulfotransferasen

Glatt, H. R., Davis, W., Meinl, W., Hermersdörfer, H., Venitt, S., Phillips, D. H.: Rat, but not human, sulfotransferase activates a tamoxifen metabolite to produce DNA adducts and gene mutations in bacteria and mammalian cells in culture, Carcinogenesis, 19, 1709–17137 (1998). Glatt, H. R., Engelke, C. E. H., Pabel, U., Teubner, W., Jones, A. L., Coughtrie, M. W. H., Andrae, U., Falany, C. N., Meinl, W.: Sulfotransferases: genetics and role in toxicology, Toxicol. Lett., 112–113, 341–348 (2000). Glatt, H. R.: Sulfation and sulfotransferases: 4. Bioactivation of mutagens via sulfation, FASEB J., 11, 314–321 (1997). Jones, A. L., Hagen, M., Coughtrie, M. W. H., Roberts, R. C., Glatt, H. R.: Human platelet phenolsulfotransferases: cDNA cloning, stable heterologous expression in V79 cells and identification of a novel allelic variant of the phenol-sulfating form, Biochem. Biophys. Res. Commun., 208, 855–862 (1995). Kester, M. H. A., Kaptein, E., Roest, T. J., van Dijk, C. H., Tibboel, D., Meinl, W., Glatt, H. R., Coughtrie, M. W. H., Visser, T. J.: Characterization of human iodothyronine sulfotransferases, J. Clin. Endocrinol. Metab., 84, 1357–1364 (1999). Kreis, P., Brandner, S., Coughtrie, M. W. H., Pabel, U., Meinl, W., Glatt, H. R., Andrae, U.: Human phenol sulfotransferases hP-PST and hM-PST activate propane 2-nitronate to a genotoxicant, Carcinogenesis, 21, 295–299 (2000). Landsiedel, R., Pabel, U., Engst, W., Ploschke, J., Seidel, A., Glatt, H. R.: Chiral inversion of 1-hydroxyethylpyrene enantiomers mediated by enantioselective sulfotransferases, Biochem. Biophys. Res. Commun., 247, 181–185 (1998). Ozawa, S., Tang, Y. M., Yamazoe, Y., Kato, R., Lang, N. P., Kadlubar, F. F.: Genetic polymorphisms in human liver phenol sulfotransferases involved in the bioactivation of N-hydroxy derivatives of carcinogenic arylamines and heterocyclic amines, Chem.-Biol. Interact., 109, 237–248 (1998). Raftogianis, R. B., Wood, T. C., Otterness, D. M., Van Loon, J. A., Weinshilboum, R. M.: Phenol sulfotransferase pharmacogenetics in humans: association of common SULT1A1 alleles with TS PST phenotype, Biochem. Biophys. Res. Commun., 239, 298–304 (1997). Raftogianis, R. B., Wood, T. C., Weinshilboum, R. M.: Human phenol sulfotransferases SULT1A2 and SULT1A1: genetic polymorphisms, allozyme properties, and human liver genotype-phenotype correlations, Biochem. Pharmacol., 58, 605–616 (2000). Riboli, E.: Nutrition and cancer: background and rationale of the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC), Ann. Oncol., 3, 783–791 (1992). Weinshilboum, R. M., Otterness, D. M., Aksoy, I. A., Wood, T. C., Her, C., Raftogianis, R.: Sulfation and sulfotransferases: 1. cDNAs and genes, FASEB J., 11, 3–14 (1997). Wood, T. C., Her, C., Aksoy, I., Otterness, D. M., Weinshilboum, R. M.: Human dehydroepiandrosterone sulfotransferase pharmacogenetics: quantitative western analysis and gene sequence polymorphisms, J. Steroid. Biochem. Mol. Biol., 59, 467–478 (1996). Yamazoe, Y., Nagata, K., Ozawa, S., Kato, R.: Structural similarity and diversity of sulfotransferases, Chem.-Biol. Interact., 92, 107–117 (1994).

97

4

Suszeptibilität

4.3 Genotypisierung und Phänotypisierung am Beispiel der NAT2 Klaus Golka* und Meinolf Blaszkewicz*

N-Acetyltransferasen (NAT) sind Fremdstoff-metabolisierende Enzyme der Phase 2. Gegenwärtig sind zwei NAT nachgewiesen, die sich sowohl in der Substratspezifität als auch in der Ausprägung in den verschiedenen Geweben unterscheiden. NAT1 ist im Cytosol lokalisiert und u. a. in Leber, Darm, Lunge, Niere und Leukozyten nachweisbar. Sie wurde bis vor einigen Jahren als monomorph angesehen. Ein typisches Substrat ist p-Aminobenzoesäure (PABA). Weitere Substrate sind p-Aminosalizylsäure (PAS), Anisidin und Sulfanilamid. Von größerer toxikologischer und klinischer Relevanz und besser erforscht ist die NAT2 (Übersichten bei Evans 1989, Thier et al. 1999, Autrup 2000). Typische Substrate sind u. a. das Antituberkulotikum Isoniazid (INH), verschiedene Sulfonamide, der Aromatasehemmer Aminoglutethimid, das gegen Lepra wirksame Dapson, das bei entzündlichen Darmerkrankungen eingesetzte Salazosulfapyridin, das Bluthochdruckmedikament Hydralazin, das Antiarrhythmikum Procainamid, Koffein sowie aromatische Amine. NAT2 ist ebenfalls im Cytosol lokalisiert und u. a. in Leberzellen, nicht jedoch in Leukozyten vorhanden. Die Halbwertszeit des Antituberkulotikums INH im Serum beträgt bei schnellen Acetylierern 1,5 Stunden, bei langsamen Acetylierern 3 Stunden. Bei langsamen Acetylierern, die mit INH behandelt wurden, wurde ein vermehrtes Auftreten einer peripheren Polyneuropathie beschrieben. Bei Hydralazin-Gabe fanden sich bei langsamen Acetylierern vermehrt antinukleäre Antikörper. Eine Therapiebeeinflussung durch den Acetyliererstatus ist vor allem dann zu erwarten, wenn der Serumspiegel des Arzneistoffes für die Wirkung verantwortlich ist, wie z. B. bei Hydralazin. Nachdem erkannt worden war, dass Sulfonamide ebenfalls acetyliert werden, wurde vor allem Sulfamethazin, welches in Deutschland nicht als Arzneimittel erhältlich ist, sowie Dapson, ein gegen Lepra wirksamer Arzneistoff, zur Bestimmung des Acetyliererstatus eingesetzt. Arzneistoffe sind jedoch aus ethischen Erwägungen in Studien zur Phänotypisierung nicht unproblematisch.

* Institut für Arbeitsphysiologie, Universität Dortmund, Ardeystr. 67, 44139 Dortmund

98

4.3

Genotypisierung und Phänotypisierung am Beispiel der NAT2

Das für Studien am besten geeignete Substrat für die Bestimmung des Acetyliererphänotyps ist Koffein. Diese Methode wurde zunächst von Grant et al. (1983) etabliert. Der entscheidende Vorteil dieser Methode für Feldstudien besteht darin, dass für eine Phänotypisierung das Trinken von 2 Tassen Bohnenkaffee sowie das Gewinnen einer Harnprobe nach ca. zwei Stunden, die auf pH 3,5 eingestellt wird und die dann bei -18 hC gelagert werden kann, für die Analytik ausreichend ist. Dennoch konnte sich diese elegante Methode zunächst nicht in der Praxis durchsetzten, da nur der nicht-acetylierte Koffein-Metabolit 1-Methylxanthin (1X), nicht jedoch der ebenfalls als Referenzstandard benötigte acetylierte Koffein-Metabolit 5-Acetylamino6-formylamino-3-methyluracil (AFMU) kommerziell verfügbar ist und seine Synthese (Röhrkasten et al. 1997), selbst wenn man auf Vorstufen in einem entsprechend ausgerüsteten Labor zurückgreifen kann, sehr aufwendig ist. Zum anderen kann die Ausschlussgrenze, die zwischen langsamen und schnellen Acetylierern trennt und die durch den Quotienten AFMU/1X definiert wird, nicht von einem Labor zum anderen Labor übertragen werden, da er, offensichtlich bedingt durch chromatographische Randbedingungen, in einem Bereich von ca. 0,5–1,0 variiert. Diese Unterschiede von Labor zu Labor bleiben auch dann bestehen, wenn eine Referenzsubstanz gleichen Ursprunges verwendet wird. Die Trennung der beiden aus dem Harn extrahierten Metabolite mittels HPLC ist mit einer Analysezeit von ca. 60 Minuten pro Probe zeitaufwendig und methodisch anspruchsvoll. Nach Einführung der Polymerase-Kettenreaktion ergab sich die Möglichkeit, auch den Genotyp hinsichtlich der NAT2 zu bestimmen. Bislang fanden sich 14 Allele, die für einen langsamen Acetylierer kodieren (Wormhoudt et al. 1999). Das schnelle Allel ist über ein langsames Allel dominant. Die Korrelation zwischen Acetylierer-Phänotyp und AcetyliererGenotyp beträgt mehr als 90 % (Abb. 1). Bei Betrachtung der bei einer

Abbildung 1: Bestimmung des Acetyliererphänotyps und des Acetylierergenotyps bei 54 Patienten mit Harnblasentumoren (bei 18 Patienten wurde der Acetyliererphänotyp nach 2 und nach 4 Stunden bestimmt).

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4

Suszeptibilität

bestimmten Allelkonstellation bestimmten Quotienten des molaren Verhältnisses der im Harn ausgeschiedenen Koffein-Metaboliten AFMU und 1X fällt auf, dass bei den einzelnen Allelen jeweils eine erhebliche Streuung vorliegt. Dies weist darauf hin, dass auch andere Faktoren die Verstoffwechslung der beiden Metaboliten beeinflussen können. Dies steht im Einklang mit neueren Forschungsergebnissen verschiedener Arbeitsgruppen, die zeigen konnten, dass z. B. bei der Verstoffwechslung von Benzidin auch andere Enzyme, wie z. B. die Prostaglandinsynthase H (Degen et al. 1998) sowie, entgegen bisheriger Annahmen, auch die NAT1 beteiligt sind (Zenser et al. 1996). Die Verteilung der beiden Acetylierertypen weist deutliche ethnische Unterschiede auf. 5 % der Eskimos, 15–22 % der Chinesen, 83 % der Ägypter

Abbildung 2: Aromatische Amine: Stoffwechselwege und angenommener Mechanismus der Kanzerogenese urothelialer Tumore (modifiziert nach Lang und Kadlubar 1991).

100

4.3

Genotypisierung und Phänotypisierung am Beispiel der NAT2

und 90 % der Marokkaner sind langsame Acetylierer. In Mitteleuropa sind ca. 50–65 % der Normalbevölkerung langsame Acetylierer. 1979 beobachteten erstmals Lower et al., dass Kollektive von Harnblasentumor-Patienten einen höheren Anteil an langsamen Acetylierern aufweisen als die Normalbevölkerung. Später konnte von Cartwright et al. (1982) gezeigt werden, dass der Anteil der langsamen Acetylierer unter denjenigen Harnblasentumor-Patienten besonders hoch war, die beruflich gegen aromatische Amine exponiert waren (Abb. 3). So waren 22 der 23 von Cartwright et al. untersuchten, ehemals beruflich in einer Farbstoffabrik aromatischen Aminen (insbesondere Benzidin) ausgesetzten Harnblasentumor-Patienten langsame Acetylierer. Von Lewalter und Miksche (1991) wurde berichtet, dass 92 der 331 in einer 1969 geschlossenen Benzidinanlage tätig gewesenen Personen an einem Harnblasentumor erkrankt waren. Der Anteil der langsamen Acetylierer unter den an einem Harnblasentumor erkrankten Beschäftigten betrug 81,5 %. Der Anteil der langsamen Acetylierer an den 331 jemals in der Benzidinanlage beschäftigten Mitarbeiter betrug 48 %. Die Grundzüge der Metabolisierung von aromatischen Aminen sind in Abbildung 2 dargestellt. Langsame Acetylierer acetylieren pro Zeiteinheit weniger Fremdstoff (z. B. aromatische Amine) als schnelle Acetylierer. Daher werden bei langsamen Acetylierern alternativ oxidative Stoffwechselwege vermehrt beschritten. Endprodukt des oxidativen Stoffwechsels von aromatischen Aminen sind Arylnitreniumionen, die sehr reaktiv sind und mit der DNA von Harnblasenurothelzellen reagieren. In älteren Studien wiesen Harnblasentumor-Patienten einen höheren Anteil an langsamen Acetylierern auf als die Kontrollen. Mitte der 90er Jahre konnte erstmals an zwei großen Kollektiven in Deutschland gezeigt werden, dass der Anteil der langsamen Acetylierer unter den Harnblasentumor-Patienten im Vergleich zur Normalbevölkerung nicht mehr signifikant erhöht ist (Golka et al. 1996). Als Ursache hierfür wird die Einstellung der Produktion krebserzeugender aromatischer Amine wie z. B. Benzidin (1971) in Deutschland und die damit verbundene Reduzierung der Hintergrundbelastung in der Allgemeinbevölkerung durch entsprechend gefärbte Konsumgegenstände diskutiert. Dieser Annahme liegt die arbeitsmedizinische Erfahrung zu Grunde, dass durch aromatische Amine ausgelöste urotheliale Harnblasentumoren sehr lange Latenzzeiten – im Einzelfall bis zu 40 Jahre und länger! – aufweisen können. Der langsame Acetylierer ist, bei beruflicher Exposition gegen aromatische Amine, mittlerweile als Prädispositionsfaktor für Harnblasentumore anerkannt. Allerdings ist bislang unklar, ob zwischen einzelnen aromatischen Aminen (z. B. einkernige, mehrkernige) Unterschiede bezüglich der Prädisposition für einen Harnblasentumor durch den Acetyliererstatus bestehen. Der bedeutendste Risikofaktor für Harnblasentumore ist das Rauchen. Da verschiedene aromatische Amine auch im Zigarettenrauch enthalten sind, wäre zu erwarten, dass bei den an einem Harnblasentumor erkrankten Rauchern der Status des langsamen Acetylierers überwiegt. Eine Überreprä101

4

Suszeptibilität

Abbildung 3: Prozentuale und absolute Häufigkeit des langsamen Acetyliererphänotyps bei Patienten mit urothelialen Tumoren und erwiesener beruflicher Exposition gegen aromatische Amine (y) sowie Patienten mit urothelialen Tumoren ohne bekannte berufliche Exposition (y) und Gesunden (Y) (Schöps et al. 1997). Bei der Studie von Lewalter und Miksche entspricht das Kontrollkollektiv dem Gesamtkollektiv von Arbeitern in einer Benzidinsyntheseanlage, die zwischen 1951 und 1967 dort eingesetzt waren (160 langsame und 171 schnelle Acetylierer).

sentation des langsamen Acetyliererstatus wird jedoch nicht in allen Studien beobachtet. Man kann in Personengruppen, für die ein erhöhtes HarnblasentumorRisiko bekannt ist, untersuchen, ob Verschiebungen in Richtung langsamer Acetylierer zu beobachten sind. Eine solche Verschiebung würde für eine Auslösung des Harnblasentumors durch aromatische Amine sprechen. Bei einigen an einem Harnblasentumor erkrankten Malern fand sich eine deutliche Zunahme der langsamen Acetylierer. 14 von 16 untersuchten Malern mit einem Harnblasentumor waren langsame Acetylierer (Golka et al. 1997a). Dies stützt die These, dass Harnblasentumore bei Malern, die in früheren Jahren (bis ca. 1960) gegen Azofarbstoffe exponiert waren, durch aromatische Amine ausgelöst wurden. Es ist belegt, dass aus bioverfügbaren (löslichen) Azofarbstoffen auf Benzidinbasis im menschlichen Körper das 102

4.3

Genotypisierung und Phänotypisierung am Beispiel der NAT2

ursprünglich als Kupplungskomponente bei der Produktion verwendete Benzidin freigesetzt werden kann. Das freigesetzte krebserzeugende aromatische Amin wird als ursächlich für das erhöhte Harnblasentumor-Risiko der Berufsgruppe der Maler und Lackierer angesehen. Bei der Untersuchung von Bergleuten, einer weiteren Berufsgruppe mit erhöhtem Harnblasentumor-Risiko, fand sich hingegen keine Verschiebung hinsichtlich des langsamen Acetylierers bei den an einem Harnblasentumor erkrankten Bergleuten (Golka et al. 1997b). Dies spricht gegen aromatische Amine als Auslöser des erhöhten Harnblasentumor-Risikos bei Bergleuten. Der Acetyliererstatus wird mit einer Reihe anderer Erkrankungen, u. a. Tumorerkrankungen des Darmes, in Verbindung gebracht. Bei DarmtumorPatienten überwiegt in den meisten Studien der schnelle Acetyliererstatus. Dies trifft jedoch auf ein Patientenkollektiv aus dem Großraum Dortmund, einer Industrieregion mit erhöhter Mortalität für das Dickdarm-Karzinom, nicht zu (Roemer et al. 1999). Es wird auch ein Zusammenhang zwischen dem Acetyliererstatus und verschiedenen Autoimmunerkrankungen diskutiert. Die Ergebnisse waren jedoch, nicht zuletzt auf Grund der kleinen Fallzahlen, bislang widersprüchlich. In einer neueren Studie an einer größeren Anzahl von Patienten mit Lupus erythematodes konnte ein vermehrtes Auftreten des langsamen Acetyliererphänotyps bei den Erkrankten gezeigt werden (v. Schmiedeberg 1999). Weiterhin ist ein vermehrtes Auftreten des einer toxischen epidermalen Nekrolyse nach Gabe von Sulfonamiden bei langsamen Acetylierern beschrieben (Wolkenstein et al. 1995). Der Anteil der langsamen Acetylierer in der Normalbevölkerung ist hinsichtlich des Lebensalters unauffällig verteilt. Eine wichtige Frage ist, ob Personen, die an einem Harnblasentumor erkrankt sind, als langsame Acetylierer eine andere Prognose als schnelle Acetylierer haben. In einer Untersuchung von 196 Harnblasentumor-Patienten zeigte sich jedoch, dass zumindest bei Harnblasentumoren der Klassifikation T1 und T2 kein klinisch relevanter Zusammenhang des Acetyliererstatus mit der Tumorklassifikation (TNM), dem Grading (G) und der Prognose besteht (Schöps et al. 1997). Literatur Autrup, H.: Genetic polymorphisms in human xenobiotica metabolizing enzymes as susceptibility factors in toxic response, Mutat. Res., 464, 65–76 (2000). Cartwright, R. A., Rogers, H. J., Barkham-Hall, D., Glasham, R. W., Ahmad, R. A., Higgins, E., Kahn, M. A.: Role of acetyltransferase in bladder carcinogenesis: a pharmacogenetic epidemiological approach to bladder cancer, Lancet 2, 842–846 (1982). Degen, G. H., Schlattjan, J. H., Mähler, S., Föllmann, W., Bolt, H. M.: Metabolismus und Genotoxizität von Benzidin in Urothel- und Samenblasenzellkulturen, in: Hallier, E., Bünger, J., (Hrsg.): Gesundheitsgefahren durch biologische Arbeitsstoffe. Neuro-, Psycho- und Verhaltenstoxizität. Dokumentationsband über die 38. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Arbeitsmedizin und Umweltmedizin in Wiesbaden vom 11.–14. 05. 1998, S. 603–604, DGAUM, Lübeck (1998). Evans, D. A. : N-Acetyltransferase, Pharmacol. Ther. 42, 157–234 (1989). Evans, D. A., Eze, L. C., Whibley, E. J.: J. Med. Genetics, 22, 479–483 (1983).

103

4

Suszeptibilität

Golka, K., Prior, V., Blaszkewicz, M., Cascorbi, I., Schöps, W., Kierfeld, G., Roots, I., Bolt, H. M.: Occupational history and genetic N-acetyltransferase polymorphism in urothelial cancer patients of Leverkusen, Germany. Scand, J. Work Environ. Health, 22, 332–338 (1996). Golka, K., Kempkes, M., Flieger, A., Blaszkewicz, M., Bolt, H. M.: Overrepresentation of the slow acetylator phenotype in painters suffering from urinary bladder cancer, Med. Lav., 88, 425–426 (1997a). Golka, K., Reckwitz, T., Kempkes, M., Cascorbi, I., Blaszkewicz, M., Reich, S. E., Roots, I., Sökeland, J., Schulze, H., Bolt, H. M.: N-Acetyltransferase 2 (NAT2) and glutathione S-transferase m (GSTM1) in bladder cancer patients in a highly industrialized area, Int. J. Occup. Environ. Health, 3, 105–110 (1997b). Grant, D. M., Tang, B. K., Kalow, W.: Polymorphic N-acetylation of caffeine metabolite, Clin. Pharmacol. Ther., 33, 355–359 (1983). Hanke, J., Krajewska, B.: J. Occup. Med., 32, 917–918 (1990). Hanssen, H. P., Agarwal, D. P., Goedde, H. W., Bucher, H., Huland, H., Brachmann, W., Ovenbeck, R.: Eur. Urol., 11, 263–266 (1985). Ladero, J. M., Kwok, C. K., Jara, C., Fernandez, L, Silmi A. M., Tapia, D., Uson, A. C.: Ann. Clin. Res. 17, 96–99, (1985). Lang, N. P., Kadlubar, F. F.: Aromatic and heterocyclic amine metabolism and phenotyping in humans, Prog. Clin. Biol. Res., 372, 33–47 (1991). Lewalter, J., Miksche, L. W.: Empfehlungen zur arbeitsmedizinischen Prävention expositions- und dispositionsbedingter Arbeitsstoff-Beanspruchungen, Verh. Dt. Ges. Arbeitsmed., 31, 135–139 (1991). Lower, G. M., Nilsson, T., Nelson, C. E., Wolf, H., Gamsky, T. E., Bryan, G. T.: N-Acetyltransferase phenotype and risk in urinary bladder cancer. Approaches in molecular epidemiology, Environ. Health Perspect., 29, 71–79 (1979). Roemer, H. C., Roetzel, C., Thier, R., Zorn, U., Reckwitz, T., Golka, K., Loehlein, D.: The distribution of two polymorphic enzymes in colon cancer cases in a highly industrialized area. Proceedings of the 2nd International Congress on Gastrointestinal Carcinogenesis in Ulm/Germany, March 25–27th, 1999, pp 223–226. Monduzzi Editore, International Proceedings Division, Bologna (1999). Röhrkasten, R., Raatz, P., Kreher, R. P., Blaszkewicz, M.: Synthesis of the caffeine metabolites 5-acetylamino-6-formylamino-3-methyluracil (AFMU) and 5-acetylamino-6-amino3-methyluracil (AAMU) on a preparative scale, Z. Naturforsch., 52b, 1526–1532 (1997). Schöps, W., Prior, V., Golka, K., Blaszkewicz, M., Cascorbi, I., Roots, I., Bolt, H. M., und Kierfeld, G.: Untersuchung zur klinischen Relevanz der Acetyliererphänotypisierung bei 196 Urotheltumorpatienten, Urologe [A], 35, 64–67 (1997). Thier, R., Golka, K., Brüning, T., Bolt, H. M.: Genetische Suszeptibilität im Hinblick auf toxische Arbeitsplatz- und Umweltbelastungen. Bundesgesundheitsblatt – Gesundheitsforschung – Gesundheitsschutz, 42, 834–840 (1999). von Schmiedeberg, S., Fritsche, E., Rönnau, A. C., Specker, C., Golka, K., Richter-Hintz, D., Schuppe, H.-C., Lehmann, P., Ruzicka ,T., Esser, C., Abel, J., Gleichmann, E.: Polymorphisms of the xenobiotic-metabolizing enzymes CYP1A1 and NAT2 in systemic sclerosis and lupus erythematosus, Adv. Exp. Med. Biol., 455, 147–152 (1999). Weber, W. W., Hein, D. W., Litwin, A., Lower, G. M. Jr.: Fed. Proc. (United States), 42, 3086–3097, (1983). Wolkenstein, P., Carrie`re, V., Charue, D., Bastuji-Garin, S., Revuz, J., Roujeau, J.-C., Beaune, P., Bagot, M.: Pharmacogenetics 5, 255–258 (1995). Wormhoudt, L.W., Commandeur, J.N.M., Vermeulen, N.P.E.: Crit. Rev. Toxicol. 29, 59–124 (1999). Zenser, T.V., Lakshmi, V.M., Rustan, T.D., Doll, M.A., Deitz, A.C., Davis, B.B., Hein, D.W.: Cancer Res. 56, 3941–3947 (1996).

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4.4

Neue High-Throughput-Technologie des diagnostischen Screenings

4.4 Neue High-Throughput-Technologie des diagnostischen Screenings von Suszeptibilitätsfaktoren Ricarda Thier*, Thomas Brüning* und Yon Ko**

Eine wichtige Ursache individuell unterschiedlicher Sensibilität gegenüber Fremdstoffen liegt in der Variabilität der Gene, die für fremdstoffmetabolisierende Enzyme (FME) kodieren. Für die Arbeits- und Umweltmedizin sind sowohl Polymorphismen verschiedener Isoformen der Phase 1 als auch die Phase 2 Enzyme wichtig geworden. Die Evaluierung dieser Unterschiede kann auf der genetischen Ebene durchgeführt werden. Die Light-Cycler gestützte Technologie erlaubt die schnelle und gleichzeitige Analyse mehrerer Polymorphismen fremdstoffmetabolisierender Enzyme (PFME) und weiterer Suszeptibilitätsfaktoren durch die Online-Detektion und Quantifizierung spezifischer Genamplifikate mittels fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonden. Bei dem weiter zu erwartendem Fortschritt der Erkenntnisse auf diesem Gebiet werden solche High-Throughput-Methoden erheblich an Bedeutung gewinnen.

4.4.1 Einleitung Zunehmend tritt die individuelle Suszeptibilität des Menschen gegenüber chemischen Stoffen, insbesondere Schadstoffen am Arbeitsplatz und in der Umwelt, bei der Entstehung chronischer Erkrankungen in den Vordergrund des toxikologischen Interesses (Zbinden 1992). Aufgenommene Fremdstoffe unterliegen einer schrittweisen Biotransformation, in deren Verlauf Metabolite entstehen können, die ein größeres oder geringeres toxisches oder kanzerogenes Potenzial als die Ausgangssubstanz haben. Die biologisch aktive Dosis dieser Metabolite ist abhängig von der Dosis exogen aufgenommener Fremdstoffe und von der Stoffwechselleistung fremdstoffmetabolisierender

* Institut für Arbeitsphysiologie, Universität Dortmund, Ardeystr. 67, 44139 Dortmund ** Medizinische Universitäts-Poliklinik Bonn, Wilhelmstr. 35–37, 53111 Bonn

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Suszeptibilität

Enzyme. Eine Ursache der individuell unterschiedlichen Stoffwechselleistungen besteht in der Variabilität der Gene, die diese FME kodieren. Mutationen, die mit einer Häufigkeit von mindestens 1 % in der Bevölkerung in einem Gen für ein FME auftreten, werden als Polymorphismen bezeichnet (Bolt 1994). In der Arbeits- und Umweltmedizin erscheinen in diesem Zusammenhang in erster Linie von den PFME der Phase 1 verschiedenen Isoformen des Cytochrom-P450 (CYP), von den Enzymen der Phase 2 insbesondere N-Acetyltransferasen (NAT) und Glutathiontransferasen (GST) wichtig (Bolt 1994). Aus arbeitsmedizinischer Sicht erscheinen die Isoenzyme der GSTT1 und GSTM1 wichtig im Metabolismus von organischen Lösemitteln, Kunststoff-Monomeren und Intermediaten polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe. Der Einfluss der N-Acetyltransferase 2 (NAT2) bei der Auslösung von Urothel-Karzinomen bei Exposition gegen aromatische Amine hat als erwiesen zu gelten. Die N-Oxidation aromatischer Amine, die zu deren Giftung führt, wird bei langsamen Acetylierern vermehrt beschritten. Es ist insgesamt evident, dass PFME die Wirkungen toxischer Stoffe entscheidend modulieren. Für den Beitrag der PFME auf die Entstehung chronischer Erkrankungen in der Bevölkerung sind das relative Risiko, das mit dem Vorliegen einer Interaktion von Fremdstoffbelastung und genetischem Polymorphismus assoziiert ist, und die Häufigkeit dieser Kombination in der Bevölkerung ausschlaggebend. Bei komplexen Erkrankungen, die durch exogene Risikofaktoren mitverursacht werden, sind Risikoeingrenzungen über eine Senkung der Fremdstoffbelastung in suszeptiblen Personengruppen möglich. Damit wird deutlich, dass kasuistische und epidemiologische Untersuchungen zu der Genese chronischer Erkrankungen durch chemische Schadstoffe erheblich an Aussagekraft gewinnen können, wenn genetisch bestimmte Merkmale von PMFE in die Untersuchungen einbezogen werden. Bisher haben jedoch nur wenige Studien die Wechselwirkung von Genotyp und Exposition (gene-environment interaction) genauer untersucht. PFME können anhand des vorliegenden Genotyps bestimmt werden. Diese Untersuchungen werden unmittelbar auf der DNA-Ebene vorgenommen. Es gibt mehrere Verfahren, die das so genannte High-Throughput von Proben ermöglichen. Einige sind in ihrer Anwendbarkeit bis jetzt nicht vollständig ausgereift und stehen für die Bestimmung von PFME noch nicht zur Verfügung. Hier soll deswegen lediglich auf die Light-Cyclergestützte Real-Time-Polymerasekettenreaktion (PCR), mit der die Autoren eigene Erfahrungen in der Etablierung von Methoden zur PFME-Bestimmung gemacht haben, eingegangen werden (Brüning et al. 1999, Harth et al. 2000, Ko et al. 2000). Der Hauptvorteil der Methode liegt in der Schnelligkeit des Verfahrens. Üblicherweise wird eine Mutationsanalyse mittels PCR und sich anschließendem Restriktionsverdau (RFLP) durchgeführt. Hierfür muss ein Zeitaufwand von mindestens einem Arbeitstag eingeplant werden. In einem Durchgang können dabei bis zu 96 Proben, einschließlich der notwendigen Kontrollen, bearbeitet werden (Abb. 1). Mit der Real-Time-PCR entfällt die Notwendig106

4.4

Neue High-Throughput-Technologie des diagnostischen Screenings

Abbildung 1: Vergleich des Zeitbedarfs für die Mutationsanalyse mittels PCR-RFLP und mittels Light-Cycler-gestützter Technologie.

keit, einen Restriktionsverdau und eine Gelelekrophorese (GE) durchzuführen. Die PCR kann mit dem Light-Cycler in weniger als 2 Stunden erfolgreich abgeschlossen werden. Allerdings ist das Gerät zur Zeit nur für 32 Proben ausgelegt. Neben der Schnelligkeit liegt ein weiterer Vorteil dieser Methode in der Möglichkeit der spezifischen Online-Quantifizierung des amplifizierten Genfragmentes.

4.4.2 Prinzip der Technologie Zusätzlich zu den Genfragment-spezifischen Primern werden jeweils zwei Sequenz-spezifische Hybridisierungssonden verwendet, von denen die erste an ihrem 3l-Ende mit Fluorescein (Detektionssonde) und die zweite (Ankersonde) an ihrem 5l-Ende mit einem anderen fluoreszierendem Farbstoff, Light-Cycler-Red 640 (LC-640) oder 705 (LC-705), markiert sind (Abb. 2). Diese beide Sonden werden so ausgewählt, dass sie innerhalb

Abbildung 2: Prinzip der Light-Cycler-gestützten Mutationsanalyse.

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4

Suszeptibilität

des amplifizierten Genfragments maximal 1–5 Basenpaare voneinander entfernt hybridisieren. Die Emissionsdiode des Light-Cyclers (470 nm) regt das Fluorescein in der Detektionssonde zur Fluoreszenz an. Das dadurch emittierte grüne Licht regt die Fluorphore LC-640 bzw. LC-705 in der Ankersonde zur Emission von rotem Licht (640 bzw. 705 nm) an. Dieser Vorgang wird als Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) bezeichnet. FRET kann nur stattfinden, wenn sich die beiden Sonden in unmittelbarer Nähe zueinander befinden. Daher wird die Messung am Ende der AnnealingPhase eines jeden PCR-Zyklus durchgeführt. Die Emission roten Lichtes ist proportional zur Menge des amplifizierten DNA-Fragmentes und wird jeweils in dem entsprechenden Kanal des Light-Cyclers gemessen. Im Anschluss an den Messvorgang werden die beiden Hybridisierungssonden von der Taq-Polymerase verdrängt (Extensionsphase des PCR-Zyklus).

4.4.3 Anwendung bei Gendeletionspolymorphismen der GSTM1 bzw. GSTT1 Eine Anwendung dieser Technologie stellt die Untersuchung der Polymorphismen der Glutathiontransferasen GSTT1 und GSTM1 dar. Beide GST zeigen einen Gendeletionspolymorphismus, der sich durch den teilweisen (heterozygote) oder kompletten (homozygote Träger des jeweiligen Nullallels) Verlust des funktionalen Genproduktes äußert (Wiebel et al. 1999). Liegt

Abbildung 3: Untersuchung des GSTM1-Gendeletionspolymorphismus.

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4.4

Neue High-Throughput-Technologie des diagnostischen Screenings

mindestens ein Allel vor, zeigt sich in der Real-Time-PCR ein Anstieg der Fluoreszenzemission (LC-640). Handelt es sich um eine DNA-Probe eines homozygoten Null-Genotyps (GSTM1*0/0 oder GSTT1*0/0), können die Sonden nicht hybridisieren und deshalb wird auch keine Fluoreszenz emittiert. Heterozygote (GSTM1*1/0 bzw. GSTT1*1/0) können mit dieser Methode nicht von homozygoten Trägern des funktionalen Gens (GSTT1*1/1 bzw. GSTM1*1/1) unterschieden werden. Um falsch negative Ergebnisse auszuschließen, wird parallel in jeder Probe unter Verwendung eines anderen Fluorophors (LC-705), das in einem weiteren Kanal des Gerätes detektiert wird, ein Housekeeping-Gen – hier die Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase (GAPDH) – amplifiziert (Abb. 3; Ko et al. 2000).

4.4.4 Anwendung bei Punktmutationen von GSTP1 Der Polymorphismus der GSTP1 beruht auf zwei Punktmutationen. Im Codon 104 führt ein Basenpaaraustausch (A1404G) zum Austausch der Aminosäure Isoleucin durch Valin. Mehrere Publikationen zeigen eine Erniedrigung des Genproduktes des mutierten Allels (Zimniak et al. 1994, Ali-Osman et al. 1997). Wie im ersten genannten Beispiel werden zusätzlich zu den beiden Primern, mit denen ein Teil des GSTP1-Gens amplifiziert wird, zwei Sonden gewählt. Die Detektionssonde hybridisiert direkt im Bereich der zu untersuchenden Punktmutation von GSTP1. Die Ankersonde befindet sich in unmittelbarer Nähe. Nach Abschluss der PCR wird eine Schmelztemperaturkurve der Amplifikate erstellt. Die Schmelztemperatur, das ist die Temperatur bei der sich die Hybridisierung zwischen den Sonden und dem Amplifikat auflöst, wird von der Länge und Sequenz der Sonden sowie der Homologie zum Amplifikat bestimmt. Ist die Sequenz einer Sonde nicht absolut komplementär zu der des Amplifikats, dann löst sich die Hybridisierung schon bei niedrigeren Temperaturen. Dies ist bei einer Punktmutation der Fall. Die Schmelztemperatur für das zur Sonde völlig komplementäre Allel (a) beträgt 65,5 hC, die für das mutierte Allel (b) beträgt 62 hC. Daraus ergibt sich ein einzelnes Maximum in den ersten Ableitungen für die Schmelzkurven von homozygoten DNA-Proben, während die Ableitungen heterozygoter DNA-Proben zwei Maxima zeigen (Abb. 4). Weitere Anwendungen dieser Art für Punktmutationen wurden bereits für die Enzyme Cytochrom-P450 1B1 und NAD(P)H-Chinonoxidoreduktase (NQO1) etabliert (Harth et al. 2000, Brüning et al. 1999).

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4

Suszeptibilität

Abbildung 4: Untersuchung des GSTP1-Polymorphismus (A1404G) mittels der Schmelzkurvenbestimmung.

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4.4

Neue High-Throughput-Technologie des diagnostischen Screenings

4.4.5 Ausblick In vielen Fällen müssen für die Untersuchung eines Gens mehrere Mutationsanalysen durchgeführt werden. Es ist möglich bis zu zwei Mutationen in einer Probe gleichzeitig zu untersuchen, da mit dem Light-Cycler mehrere Kanäle zur Messung unterschiedlicher Emissionen zur Verfügung stehen. Theoretisch können auch zwei sehr eng benachbarte Mutationen mit einer Detektionssonde erfasst werden. Daraus ergeben sich weitere Schmelzpunkte zur Unterscheidung der Allele, die für eine eindeutige Unterscheidung allerdings weit genug auseinander liegen müssen. Mit der Light-Cycler-unterstützen Real-Time-PCR ist es theoretisch möglich, über 30 verschiedene Mutationsstellen in mehreren Genen parallel zu untersuchen. Dies ist besonders für die klinische Anwendung interessant, wenn sehr schnell möglichst viele Untersuchungen durchgeführt werden müssen. Allerdings ist für eine parallele Durchführung erforderlich, dass sowohl die Annealingtemperaturen aller Primer, als auch diejenigen aller Sonden möglichst gleich sind, sonst kann weder eine spezifische Amplifizierung noch eine spezifische Detektion bzw. Quantifizierung der Amplifikate erfolgen. Diese Technologie ist nicht auf die Untersuchung von PFME beschränkt, sondern auch für Polymorphismen anderer Gene in gleicher Weise anwendbar. Dadurch ergibt sich die Möglichkeit, parallel die Bestimmung von PFME sowie die Polymorphismen anderer genetisch determinierter Suszeptibilitätsfaktoren für bestimmte Erkrankungen zu erfassen. Darunter fallen die Polymorphismen, die zu Defekten in der DNA-Reparatur führen (z. B. bei Xeroderma Pigmentosum), und andere Gendefekte, wie sie z. B. für Brustkrebs oder andere Erkrankungen erkannt wurden. Bei dem weiter zu erwartendem raschen Fortschritt der Entwicklungen auf diesem Gebiet werden High-Throughput-Methoden zur genotypischen Erfassung von Polymorphismen immer wichtiger werden.

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4

Suszeptibilität

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112

5 Zytogenetische Parameter 5.1 Biological Monitoring mit zytogenetischen Methoden Günter Obe*, Helga Fender** und Gisela Wolf***

5.1.1 Einleitung Chromosomenaberrationen (CA) sind strukturelle Veränderungen von Chromosomen, die im Lichtmikroskop analysiert werden können. Voraussetzung für die Entstehung von CA sind Schädigungen der chromosomalen DNS. Eine signifikante Erhöhung von CA-Frequenzen weist somit darauf hin, dass ein verursachendes Agens mutagen ist. Besonders deutlich wird dies nach Exposition mit ionisierender Strahlung (IAEA 1986). Auch nach Einwirkung diverser chemischer Substanzen wurden vermehrt CA in exponierten Personengruppen nachgewiesen (Ashby und Richardson 1985, Natarajan und Obe 1980, Obe 1993, Obe und Beek 1982, Obe und Müller 1999, Obe und Natarajan 1993, 1996). CA sind Effekte einer Exposition, man spricht deshalb auch von Effektmonitoring (Wolf et al. 1997). Eine spezifische Exposition ist aus der Art der CA nur begrenzt ableitbar. Alle bei exponierten Personen gefundenen CA-Typen kommen auch spontan vor. Erhöhte Frequenzen von CA in menschlichen Lymphozyten korrelieren mit einem erhöhten Krebsrisiko (Bonassi et al. 1995, Hagmar et al. 1998a, 1998b). Menschliche Neoplasien weisen oft typische CA auf, die offenbar zu ihrer Entstehung geführt haben (Mitelman et al. 1997). Diese enge Korrelation zwischen CA und Krebs weist der CA-Analyse beim Menschen eine besondere Bedeutung zu. Weitere chromosomale Veränderungen, die im Effektmonitoring eingesetzt werden, sind Mikrokerne (MN) und Schwesterchromatidenaustausche (SCE). MN entstehen, wenn Bruchstücke von Chromosomen oder seltener ganze Chromosomen während der Mitose nicht in die Tochterkerne gelangen und sich mit einer eigenen Kernmembran umgeben. Eine Erhöhung

* Fachbereich 9, Genetik, Universität-GH Essen, Universitätsstr. 5, 45117 Essen ** Robert Koch Institut; Nordufer 20, 13353 Berlin *** Berufsgenossenschaftliche Klinik für Berufskrankheiten Falkenstein/Vogtland, Postfach 11 53, 08219 Falkenstein

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5

Zytogenetische Parameter

der MN-Frequenzen weist somit darauf hin, dass eine Exposition zu CA und/ oder zu Spindelstörungen führt (Fenech 1998, Müller und Streffer 1994). SCE sind homologe Austausche zwischen Schwesterchromatiden, deren Frequenzen von mutagenen Agenzien erhöht werden (Morris 1991, Sandberg 1982, Schubert 1990, Tice und Hollaender 1984, Tucker et al. 1993, Wolff 1982, Bruckmann et al. 1999 a, b).

5.1.2 Methodische Aspekte Die Analyse von CA in peripheren Lymphozyten ist eine weltweit verwendete Methodik des zytogenetischen Populationsmonitorings am Menschen, Human Population Monitoring (HPM). Weit über 90 % der Lymphozyten befinden sich in einer präsynthetischen Ruhephase des Zellzyklus (G0). Die Zellen werden in-vitro mit einem Mitogen, meist Phytohämagglutinin, stimuliert, treten in den Zellzyklus (G1-, S-, G2-Phase) ein und teilen sich mitotisch (Natarajan und Obe 1982, Obe und Beek 1982). Der mitotische Ablauf wird mit dem Spindelgift Colchizin (meist das Derivat Colcemid) in einem metaphaseartigen Zustand blockiert (C-Metaphasen, im Folgenden Metaphasen genannt), der nach einer entsprechenden Präparation erlaubt, alle Chromosomen im Lichtmikroskop einwandfrei zu erkennen. Verschiedene CA-Typen und MN können nach entsprechender Färbung der Präparate, etwa mit Giemsa-Farbe, analysiert werden. CA, die beide Chromatiden eines Metaphasechromosoms an homologen Stellen betreffen, werden als CA vom Chromosomentyp bezeichnet. Hierher gehören dizentrische Chromosomen, Ringchromosomen und reziproke Translokationen. Ist nur eine Chromatide von der Aberration betroffen, handelt es sich um CA vom Chromatidentyp, wie Chromatideninterchange bzw. -austausche und Chromatidenbrüche. Azentrische Fragmente können sowohl Chromosomenbrüche (CA vom Chromosomentyp) als auch Isochromatidenbrüche (CA vom Chromatidentyp) darstellen. SCE können nur sichtbar gemacht werden, wenn die DNS in den Chromatiden differentiell, etwa mit 5-Bromdeoxyuridin, substituiert wurde (Bruckmann et al. 1999 a, b, Morris 1991). Translokationen werden nach Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) sichtbar gemacht, bei der mit Fluorochromen markierte DNS-Sonden für einzelne Chromosomen mit diesen hybridisiert werden. Spezielle FISH-Methoden erlauben eine unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung aller Chromosomenpaare (mFISH) oder eine Bänderung einzelner Chromosomen (mBAND) (Johannes et al. 1999, Marshall und Obe 1998). FISH-Methoden sind aufwendig und teuer und finden nur langsam Eingang in das zytogenetische Populationsmonitoring (Littlefield et al. 1998, Straume und Bender 1997). Die Frequenzen von CA geben nur dann ein realistisches Bild von dem In-vivo-Zustand, wenn sie ausschließlich an ersten In-vitro-Mitosen erhoben 114

5.1

Biological Monitoring mit zytogenetischen Methoden

werden. Zellteilungen in-vitro führen zu einer Selektion aberranter Mitosen und damit zu einer Verminderung der CA-Frequenzen. Erste Mitosen invitro können dadurch nachgewiesen werden, dass die Zellen in Gegenwart des Basenanalogons Bromdesoxyuridin (B) kultiviert werden, das, wenn im Überschuss vorhanden, statt Thymin (T) in die replizierende DNS eingebaut wird. Nach der ersten S-Phase in-vitro in Gegenwart von B sind beide Chromatiden eines Chromosoms in jeweils einem DNS-Strang mit B substituiert (TB-TB) und färben sich mit Giemsa-Farbe uniform dunkel. Nach zwei S-Phasen in Gegenwart von B hat eine Chromatide die Konstitution TB und erscheint nach Giemsa-Färbung dunkel. Die andere Chromatide hat die Konstitution BB und erscheint hell. Metaphasen mit differentiell gefärbten Chromosomen werden nicht nach CA ausgewertet, denn sie haben bereits zwei S-Phasen in-vitro durchlaufen, allerdings können in diesen Zellen SCE analysiert werden. Chromosomen in differentiell gefärbten Präparaten sind oft nicht so gut auswertbar wie normal mit Giemsa-Farbe gefärbte Präparate. Um den Vorteil der besseren Auswertbarkeit mit einem Hinweis auf die Zellzyklusprogression zu verbinden, kann eine zusätzliche Kultur mit B inkubiert werden, an der dann bestimmt wird, wie viele zweite In-

Abbildung 1: Einfluss der pro Person analysierten Metaphasen (Stichprobengröße) auf die Varianz der Ergebnisse. Es wurden konsekutiv 250, 250 þ 250 ¼ 500, 500 þ 500 ¼ 1000 Metaphasen ausgewertet. Angegeben ist der Prozentsatz von Personen (Prozent Probanden) mit 0,0–8,0 % aberranten Metaphasen (Prozent aberrante Zellen). Die Daten beruhen auf zytogenetischen Analysen der Lymphozyten von 85 Männern (Durchschnittsalter 68,3 4,5 Jahre). Die gefundenen Aberrrationsfrequenzen (Säulen) wurden mit den theoretisch erwarteten Normalverteilungen (durchgezogene Linien) verglichen. Es wurden ausschließlich erste In-vitro-Metaphasen ausgewertet.

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5

Zytogenetische Parameter

vitro-Mitosen vorliegen. Nach einer Kulturdauer von 48 Stunden finden sich meist weniger als 5 % zweite Mitosen, was die Ergebnisse einer Aberrationsanalyse kaum beeinflusst. Die Güte der erhobenen Daten hängt besonders von der Anzahl der ausgewerteten Metaphasen ab. Der Einfluss der Stichprobengröße wird aus Abbildung 1 ersichtlich. Die Varianz der Daten nimmt mit Stichprobengrößen von 1000 über 500 zu 250 ausgewerteten Metaphasen zu. Weiterhin ist die intraindividuelle Variabilität der Häufigkeit von CA ein nicht zu vernachlässigender Faktor. Abbildung 2 zeigt die Schwankungsbreiten der Frequenzen von dizentrischen Chromosomen und zentrischen Ringen nach Analyse von 4–6 Stichproben von jeweils 1000 Metaphasen aus Lymphozytenkulturen von 4 Personen. Tabelle 1 zeigt, dass nicht nur die Frequenzen von dizentrischen Chromosomen und zentrischen Ringen mit der Zahl der ausgewerteten Metaphasen schwanken, sondern auch die anderer CA-Typen. Es können sogar signifikante Unterschiede, wie in Tabelle 1 beim prozentualen Anteil aberranter Zellen, auftreten. Tabelle 2 zeigt CA-Frequenzen in Lymphozyten von Perchlorethylen-exponierten Frauen, die in chemischen Reinigungen (Fender 1993) arbeiten, und von Arbeitern auf Mülldeponien (Fender und Wolf 1998) mit den jeweiligen Gruppen von Kontroll-Personen. Bei beiden Expositionen kommt es zu signifikanten Erhöhungen der CA-Frequenzen.

Abbildung 2: Intraindividuelle Variabilität der Anzahl dizentrischer Chromosomen (DIZ) und zentrischer Ringchromosomen (Ringe) in 4–6 Stichproben von jeweils 1000 Metaphasen aus Lymphozyten von vier Kontroll-Personen. Der höchste Wert von Person 1 enthält ein Ringchromosom, der höchste Wert von Person 2 enthält eine RogueZelle mit zwei trizentrischen Chromosomen, die als vier dizentrische Chromosomen gewertet wurden. Es wurden ausschließlich erste In-vitro-Metaphasen ausgewertet.

116

5.1

Biological Monitoring mit zytogenetischen Methoden

Tabelle 1: Häufigkeit von Chromosomenaberrationen in zwei Gruppen Kontroll-Personen nach Analyse von 1000 oder 500 Metaphasen pro Person (Stichprobengröße). Die Werte sind mit ihren Standardfehlern (e SE) angegeben. Es wurden ausschließlich erste In-vitro-Metaphasen ausgewertet. Die Prozentwerte der aberranten Metaphasen unterscheiden sich signifikant (p J 0,05 zweiseitig, U-Test nach Mann und Whitney). Stichprobengröße 1000 Zellen

Stichprobengröße 500 Zellen

Anzahl untersuchter Personen

99

83

Alter

39,6 e 9,8 (17–58)

36,6 e 8,6 (20–56)

Gesamtzahl analysierter Metaphasen

99000

41500

Anzahl Aberrationen/ Person (Mittelwert e SE)

Anzahl Aberrationen/ Person (Mittelwert e SE) (Mittelwert pro 1000 Zellen)

Chromatidbrüche

642 6,5 e 0,5

244 3,0 e 0,4 (5,9)

Chromatidaustausche

58 0,6 e 0,1

5 0,06 e 0,02 (0,1)

Dizentrische Chromosomen und zentrische Ringe

119 1,2 e 0,1 (5 Ringe)

23 0,3 e 0,1 (0,6) (1 Ring)

Zusätzliche azentrische Fragmente

207 2,1 e 0,3

98 1,2 e 0,2 (2,4)

Multiaberrante Metaphasen (Zellen mit i 2 dizentrischen Chromosomen)

5 0,05 e 0,03

3 0,04 e 0,02 (0,07)

Metaphasen mit CA vom Chromatidentyp

665 6,7 e 0,5

233 2,8 e 0,4 (5,6)

Metaphasen mit CA vom Chromosomentyp

391 4,0 e 0,3

126 1,5 e 0,2 (3,0)

% aberrante Metaphasen

1,1 e 0,1

0,9 e 0,1

117

5

Zytogenetische Parameter

Tabelle 2: Zytogenetisches Populationsmonitoring bei chemischer Exposition. Die Werte sind mit ihren Standardfehlern (e SE) angegeben. Es wurden ausschließlich erste In-vitro-Metaphasen (M) ausgewertet. Die Werte in den schattierten Feldern sind signifikant gegenüber der jeweiligen Kontrollgruppe erhöht (p J 0,05 zweiseitig, U-Test nach Mann und Whitney). Daten von Fender (1993) und Fender und Wolf (1998). Exposition Gruppe

Geschlecht/ Anzahl

Alter in Jahren

Dauer in Jahren

Aktuelle Konzentrationa [mg/m3]

Mittlere Gesamtkonzentrationb [mg/m3]

Beschäftigte in chemischen Reinigungen (Perchlorethylen)

w/ 9

47,9 e 5,5 (40–56)

16,4 e 3,9 (8,6–20,5)

257 e 62,8 (144–348)

4842 e 2282 (1909–8277)

Kontrollen

w/ 9

40,0 e 16,5 (21–56)

–

–

–

Mülldeponiearbeiter

m / 75 w/7

36,6 e 10,1 18–59

5,1 e 3,5 0,5–13

Kontrollen

m / 65 w/6

39,6 e 9,1 21–59

–

a

b c d e f g h

Geometrischer Mittelwert aus etwa 10 personengebundenen Schichtdurchschnittskonzentrationen am Arbeitsplatz. Schätzung der gesamten beruflichen Exposition. Mit einer Ausnahme wurden 1500 Metaphasen pro Person ausgewertet. Mit einer Ausnahme wurden 1000 Metaphasen pro Person ausgewertet. Mit zwei Ausnahmen wurden 1000 Metaphasen pro Person ausgewertet. Einschließlich Rogue Zellen. Ausschließlich Rogue Zellen. CA vom Chromatidentyp.

118

5.1

Biological Monitoring mit zytogenetischen Methoden

Chromosomenanalyse Zahl analysierter Metaphasen

Dizentrische Chromosomen und zentrische Ringe

Zusätzliche azentrische Fragmente

Multiaberrante Metaphasen (RogueZellen)

Metaphasen mit Aberrationen vom Chromatidentyp

Chromosomentyp

13100c

34 3,8 e 0,7 pro Person 2,6 pro 1000 M

60 6,7 e 1,2 pro Person 4,6 pro 1000 M

0

97 10,8 e 1,2

101 11,2 e 1,7

7,4 pro 1000 M

7,7 pro 1000 M

3 0,3 e 0,1 0,2 pro 1000 M

18 2,0 e 0,8 1,4 pro 1000 M

0

66 7,3 e 0,9 4,9 pro 1000 M

22 2,4 e 1,0 1,6 pro 1000 M

338f (3 Ringe) 4,1 e 0.2 174g 2,1 e 0,2

573f 6,9 e 1,0

603 7,3 e 0,5

517 6,2 e 0,5

1,4 e 0,7

302g 3,6 e 0,4

31 (4 Ringe) 0,4e 0,1 davon 7M nur mit ctbh

106f 1,5 e 0,2 103 g 1,5 e 0,2

235f 3,3 e 0,6 210 g 2,9 e 0,5

11 0,2 e 0,1 davon 8M nur mit ctbh

355 5,0 e 0,4

308 4,3 e 0,4

0,9 e 0,6

13500c

81830d

70420e

% Aberrante Metaphasen

1,5 e 0,2

0,7 e 0,1

119

5

Zytogenetische Parameter

Bei den Mülldeponiearbeitern und den entsprechenden Kontroll-Personen fanden sich multiaberrante Zellen, die jeweils mehr als zwei dizentrische Chromosomen oder mehrere CA vom Chromatidentyp enthielten. Solche multiaberranten Zellen (Rogue-Zellen) werden immer wieder gefunden. Ihre Entstehungsweise ist unklar (Ahuja und Obe 1994, Wolf et al. 1999). Rogue-Zellen sollten gesondert aufgeführt werden, anderenfalls kann es zu hohen Aberrationswerten kommen (siehe auch Person 2 in Abb. 2), die möglicherweise nicht auf der zu untersuchenden Exposition beruhen. Tabelle 3 zeigt ein Beispiel für SCE-Frequenzen bei Mülldeponiearbeitern und Kontrollen. Obwohl bei Mülldeponiearbeitern signifikante Erhöhungen der CA-Frequenzen beobachtet wurden (Tab. 2), sind die SCE-Frequenzen nicht erhöht. Allerdings zeigt sich bei den Kontrollen ein signifikanter Einfluss des Rauchens auf die SCE-Häufigkeit. Rauchen und Alkoholkonsum führen nachweislich zu chromosomalen Schäden und gelten als Einflussfaktoren beim zytogenetischen Populationsmonitoring (Obe et al. 1982, Obe und Anderson 1987). Ein weiterer Endpunkt, der im zytogenetischen Populationsmonitoring eingesetzt wird, sind MN, die infolge von CA oder Spindelstörungen nach Einwirkung von Mutagenen auftreten. MN entstehen, wenn während der mitotischen Anaphase Bruchstücke oder ganze Chromosomen nicht auf die Zellpole verteilt werden und sich mit einer eigenen Kernmembran umgeben. Analysiert werden MN meist in zweikernigen Zellen, die in Gegenwart von Cytochalasin B dadurch entstehen, dass die Zellteilung, nicht aber die Kernteilung blockiert wird (Fenech 1998, Müller und Streffer 1994). Tabelle 3: SCE pro Metaphase in Lymphozyten von Mülldeponiearbeitern und Kontroll-Personen sowie der Einfluss des Zigarettenrauchens. Die Werte für Raucher und Nichtraucher sind bei den Kontrollen, nicht aber bei Mülldeponiearbeitern signifikant verschieden (p I 0,01, t-Test). Es wurden 50, bei zwei Kontroll-Personen 40 Metaphasen ausgewertet. Die Werte sind mit ihren Standardabweichungen (e SD) angegeben (Fender und Wolf, 1998). Mülldeponiearbeiter

Kontrollen

Alle Personen

Raucher

Nichtraucher

Alle Personen

Raucher

Nichtraucher

Anzahl untersuchter Personen

54

31

23

50

26

24

Zahl analysierter Metaphasen

2700

1550

1150

2480

1290

1190

SCE/Zelle (Mittelwert e SD)

6,1 e 1,4

6,2 e 1,5

6,0 e 1,2

6,2 e 1,4

6,7 e 1,5

5,7 e 0,9

120

5.1

Biological Monitoring mit zytogenetischen Methoden

5.1.3 Standardisierung und Qualitätssicherung Eine Standardisierung des HPM konnte trotz langjähriger Bemühungen nationaler und internationaler Gremien bisher nicht in ausreichendem Maße erreicht werden. Sie ist jedoch Voraussetzung für vergleichbare Ergebnisse. Eine Standardisierung darf sich dabei nicht nur auf Probenaufarbeitung und -auswertung erstrecken, sondern muss das gesamte Studiendesign umfassen (Hook 1982, IAEA 1986, Carrano und Natarajan 1988, Speit et al. 1994). Zytogenetische HPM-Studien sollten nach epidemiologischen Vorgaben geplant und unter Beachtung bestimmter Qualitätskriterien durchgeführt werden. Wesentliche Einflussfaktoren für die mitotische Aktivität von Lymphozyten in der Blutkultur sind die Zusammensetzung des Kulturmediums und das verwendete Mitogen (meist Phytohämagglutinin). Eine wichtige Voraussetzung für verlässliche Daten ist die Analyse von ersten in-vitro-Mitosen (M1) auf CA, von zweiten In-vitro-Mitosen (M2) auf SCE und von zweikernigen Zellen auf MN. Die statistische Bezugsgröße sollte die untersuchte Person, nicht die untersuchte Zelle sein. Die Zahl der analysierten Zellen sollte 1000 M1-Zellen für CA, 50 M2-Zellen für SCE und 1000 zweikernige Zellen für MN betragen. Unverzichtbar ist die gleichzeitige Analyse von KontrollPersonen, die – abgesehen von der Exposition – mit der exponierten Personengruppe so weitgehend wie möglich übereinstimmen sollten. Historische Kontrollen sind nicht geeignet (Wolf 1993, Wolf et al. 1996, 1997, 1999). Wolf et al. (1997) geben eine ausführliche Darstellung zu Standardisierung und Qualitätsmanagement im zytogenetischen Populationsmonitoring. Literatur Ahuja, Y. R., Obe, G.: Are rogue cells an indicator of cancer risk due to the action of bacterial restriction endonucleases? Mutation Res., 310, 103–112 (1994). Ashby, J., Richardson, C. R.: Tabulation and assessment of 113 human surveillance cytogenetic studies conducted between 1965 and 1984, Mutation Res., 154, 111–133 (1985). Bonassi, S., Abbondandolo, A., Camurri, L., Dal, L., Pra, A. M., Ferrari, D. e, Degrassi, F., Forni, A., Lamberti, L., Lando, C., Padovani, P., Sbrana, I., Veccio, D., Putoni, R.: Are chromosome aberrations in circulating lymphocytes predictive for a future cancer onset in humans? Preliminary results of an Italian cohort study, Cancer Genet. Cytogenet., 79, 133–135 (1995). Bruckmann, E, Wojcik, A, Obe, G.: Sister chromatid differentiation with biotin-dUTP, Chromosome Res. 7, 185–189 (1999a). Bruckmann, E., Wojcik, A., Obe, G.: X-irradiation of G1 CHO cells induces SCE which are both true and false in BrdU-substituted cells but only false in biotin-dUTP-substituted cells, Chrom. Res., 7, 277–288 (1999b). Carrano, A. V., Natarajan, A. T.: Considerations for population monitoring using cytogenetic techniques (ICPEMC Publication Nr. 14), Mutation Res. 204, 379–406 (1988). Fender, H.: Chromosomenanalystiche Untersuchungen bei Textilreinigern: Vergleich von Literaturdaten und eigenen Untersuchungen unter besonderer Berücksichtigung methodischer Aspekte, bga-Schriften 3/1993, 71–76 (1993).

121

5

Zytogenetische Parameter

Fender, H., Wolf, G.: Cytogenetic investigations in employees from waste disposal sites, Toxicology Letters 96,97, 149–154 (1998). Fenech, M.: Important variables that influence base-line micronucleus frequency in cytokinesis-blocked lymphocytes – a biomarker for DNA damage in human populations, Mutation Res., 404, 155–165 (1998). Hagmar, L., Bonassi, S., Strömberg, U., Brøgger, A., Knudsen, L. E., Norppa, H., Reuterwall, C.: Chromosomal aberrations in lymphocytes predict human cancer: a report from the European Study Group on Cytogenetic Biomarkers and Health (ESCH), Cancer Res., 58, 4117–4121 (1998a). Hagmar, L., Bonassi, S., Strömberg, U., Mikoczy, Z., Lando, C., Hansteen, I.-L., Huici Montagud, A., Knudsen, L., Norppa, H., Reuterwall, C., Tinnerberg, H., Brøgger, A., Forni, A., Högstedt, B., Lambert, B., Mitelman, F., Nordenson, I., Salmaa, S., Skerfving S.: Cancer predictive value of cytogenetic markers used in occupational health surveillance programs: A report from an ongoing study by the European Study Group on Cytogenetic Biomarkers and Health (ESCH), Mutation Res., 405, 171–178 (1998b). Hook, E. B.: Perspectives in mutation epidemiology 2. Epidemiologic and design aspects of studies of chromosome breakage and sister-chromatid exchange (ICPEMC Working Paper 5/2), Mutation Res., 99, 373–382 (1982). IAEA (International Atomic Energy Agency) Technical Reports Series No. 260 Biological Dosimetry: Chromosomal Aberration Analysis for Dose Assessment. International Atomic Energy Agency, Vienna (1986). Johannes, C., Chudoba, I., Obe, G.: Analysis of X-ray induced aberrations in human chromosome 5 using high-resolution multicolour banding FISH (mBAND), Chromosome Res., 7, 625–633 (1999). Littlefield, L. G., McFee, A. F., Salomaa, S. I., Tucker, J. D., Inskip, P. D., Sayer, A. M., Lindholm, C., Makinen, S., Mustonen, R., Sorensen, K., Tekkel, M., Veidebaum, T., Auvinen, A., Boice, J. D. Jr.: Do recorded doses overestimate true doses received by Chernobyl cleanup workers? Results of cytogenetic analyses of Estonian workers by fluorescence in situ hybridization, Radiation Res., 150, 237–249 (1998). Marshall, R., Obe, G.: Application of chromosome painting to clastogenicity testing in vitro, Env. Molec. Mutagen., 32, 212–222 (1998). Mitelman, F., Mertens, F., Johannson, B.: A break point map of recurrent chromosomal rearrangements in human neoplasia, Nature Genet., 15, 417–474 (1997). Morris, S. M.: The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells, Mutation Res., 258, 161–188 (1991). Müller, W.-U., Streffer, C.: Micronucleus Assays, in: Obe, G. (ed.): Advances in Mutagenesis Research, Vol. 5, Springer-Verlag, Berlin, pp 4–134 (1994). Natarajan, A. T., Obe, G.: Screening of human populations for mutations induced by environmental pollutants: Use of the human lymphocyte system, Ecotox., Env. Safety, 4, 468–481 (1980). Natarajan, A. T., Obe, G.: Mutagenicity testing with cultured mammalian cells: Cytogenetic assays. In: J. A., Heddle (ed.) Mutagenicity: New Horizons in Genetic Toxicology, Academic Press, New York, pp.171–213 (1982). Obe, G.: Chromosomenaberrationen in menschlichen peripheren Lymphozyten und ihre Bedeutung für das zytogenetische Populationsmonitoring, in: Arndt, D., Obe G. (Hrsg): Zytogenetische Methoden. BGA Schriften, 3/39, MMV Medizin Verlag, München (1993). Obe, G., Anderson, D.: Genetic effects of ethanol, Mutation Res., 186, 177–200 (1987). Obe, G., Beek, B.: The human leukocyte test system, in: de Serres, F. J., Hollaender, A. (eds.): Chemical Mutagens, Principles and Methods for Their Detection, Vol 7, Plenum Press, New York, pp. 337–400 (1982).

122

5.1

Biological Monitoring mit zytogenetischen Methoden

Obe, G., Müller, W.-U.: Zytogenetik in der genetischen Toxikologie und Strahlenbiologie, Medizinische Gen., 3, 373–377 (1999). Obe, G., Natarajan, A. T.: Mutagenicity tests with cultured mammalian cells: Cytogenetic assays, in: Corn, M. (ed.): Handbook of Hazardous Materials, Academic Press, New York, pp. 453–461 (1993). Obe, G., Natarajan, A. T.: Zytogenetische Methoden, in: Wichmann, H. E., Schlipköter, H.-W., Fülgraff, G. (Hrsg.): Handbuch der Umweltmedizin 4/96, Ecomed, pp. 1–15 (1996). Obe, G., Vogt, H.-J., Madle, S., Fahning, A., Heller, W.-D.: Double-blind study on the effect of cigarette smoking on the chromosomes of human peripheral blood lymphocytes in vivo, Mutation Res., 92, 309–319 (1982). Sandberg, A. A.: Sister Chromatid Exchange, Alan R. Liss, Inc., New York (1982). Schubert, I.: Sister chromatid exchanges and chromatid aberrations: a comparison, Biol. Zentbl., 109, 7–18 (1990). Speit, G., Bauchinger, M., Schmidt, E., Gebhard, E., Hüttner, E., Obe, G.: Zytogenetische Analysen an menschlichen Populationen (Human Population Monitoring: HPM), Bundesgesundheitsblatt, 3, 118–119 (1994). Straume, T., Bender, M. A.: Issues in cytogenetic biological dosimetry: emphasis on radiation environments in space, Radiation Res., 148, 60–70 (1997). Tice, R. R., Hollaender, A (eds.): Sister Chromatid Exchanges. 25 Years of Experimental Research. Part A, The Nature of SCEs. Part B, Genetic Toxicology and Human Studies, Plenum Press, New York (1984). Tucker, J. D., Aulette, A., Cimino, M. C., Dearfield, K. L., Jacobson-Kram, D., Tice, R. R., Carrano, A. V.: Sister-chromatid exchange: second report of the gene-tox program, Mutation Res 297 101–180 (1993). Wolf, G.: Chromosomenanalytische Untersuchungen nach chemischer Exposition: Methodische Aspekte: Eine kritische Bewertung von Literaturdaten, in: Arndt, D., Obe, G. (Hrsg.): Zytogenetische Methoden. BGA-Schriften 3/93, MMV Medizin Verlag München, S. 58–64 (1993). Wolf, G., Fender, H., Obe, G.: Standardisierung und Validierung zytogenetischer HPM-Studien, in: Arndt, D., Obe, G. (Hrsg): Methodische Fragen beim Human Population Monitoring in der Zytogenetik, RKI-Schriften 1/96, MMV Medizin Verlag, München, S. 8–11 (1996). Wolf, G., Obe, G., Fender, H.: Standardisierung und Qualitätsmanagement im zytogenetischen Populationsmonitoring, in: Arndt, D., Obe, G. (Hrsg): Qualitätssicherung in der Zyto- und Molekulargenetik, RKI-Schriften, MMV Medizin Verlag München, pp 19–24 (1997). Wolf,G., Pieper, R., Obe, G.: Chromosomal alterations in peripheral lymphocytes of female cabin attendants, Int. J. Radiat. Biol., 75, 829–836 (1999). Wolff, S. (ed.): Sister Chromatid Exchange, John Wiley and Sons, New York (1982).

123

5

Zytogenetische Parameter

5.2 Anwendungsbeispiele einer Dreifarb-Chromosomen-Painting-Technik im zytogenetischen Biomonitoring Erich Gebhart*, Irmgard Verdorfer* und Susann Neubauer**

5.2.1 Einleitung Bis vor wenigen Jahren stand für die Erfassung von Chromosomenaberrationen in Mutagen-exponierten Bevölkerungsgruppen ausschließlich das klassische zytogenetische Population Monitoring zur Verfügung. Grundregeln für die Schadenserfassung und -interpretation waren erarbeitet und erprobt worden (Speit et al. 1994). Ein ganz entscheidender Nachteil dieser klassischen Techniken lag jedoch in der unzuverlässigen Erfassung jener Aberrationstypen, die wegen ihrer Langlebigkeit und ihrer praktisch-klinischen Bedeutung beim Menschen von besonders hohem Interesse sind, nämlich der reziproken Translokationen. In der Strahlenzytogenetik hatte man sich daher z. B. auf die selektive Auswertung der gut erfassbaren dizentrischen Chromosomen und Ringchromosomen festgelegt. Mit der Einführung der Chromosomen-in-Situ-Suppressions-Hybridisierung (CISS- Hybridisierung) (Lichter et al 1988, Cremer et al 1990), heute in der internationalen Literatur auch als Chromosome Painting bezeichnet, wurde ein entscheidender Fortschritt erzielt. Mit Hilfe dieser Technik gelingt es nicht nur, gerade chromosomale Rearrangements zuverlässig zu erfassen (Lucas et al. 1992, Tucker et al. 1993) und ihre Langlebigkeit zu dokumentieren (Gebhart et al. 1996, Matsumoto et al. 1998), sondern auch die bis dahin kaum nachweisbaren und in unerwartet hohem Maße auftretenden komplexen Rearrangements (Neubauer et al. 1997) können damit erkannt werden. Wegen der einfachen und raschen Auswertung erwies sich die selektive Hybridisierung ausgewählter Chromosomen als besonders praktikabel. Jedoch gelingt heute auch die komplette Analyse des gesamten Chromosomensatzes mit Hilfe der Multicolor-FISH (Speicher et al. 1996) oder des Spectral Kryotyping (Schröck et al 1996). Beide Techniken erfordern allerdings einen erheblich größeren zeitlichen und materiellen Aufwand als die hier vorgestellte Dreifarb-Painting-Technik.

* Institut für Humangenetik, Universität Erlangen-Nürnberg, Schwabachanlage 10, 91054 Erlangen ** Klinik für Strahlentherapie, Universität Erlangen-Nürnberg

124

5.2

Anwendungsbeispiele einer Dreifarb-Chromosomen-Painting-Technik

5.2.2 Methodik Metaphasen aus 48h-Kulturen transformierter Lymphozyten aus dem peripheren Blut der Testpersonen werden nach den üblichen Standardtechniken präpariert. Die Metaphasechromosomen werden dann mittels der CISS-Technik (Lichter et al. 1988) mit Fluoreszenz-markierten Chromosomen-spezifischen DNA-Bibliotheken hybridisiert. In unseren Händen hat sich der Einsatz von Libraries der Chromosomen 1, 2 und 4 und einer Dreifarb-Technik bestens bewährt (Gebhart et al. 1996). Jedes der drei markierten Chromosomenpaare erscheint dann im Fluoreszenzmikroskop (mit geeigneten Filterkombinationen) in einer eigenen Farbe (rot, grün gelb), wodurch eine rasche und zuverlässige mikroskopische Erfassung von Stückaustauschen zwischen den Chromosomen ermöglicht wird. Eine zusätzliche Gegenfärbung aller Chromosomen mit DAPI erlaubt – nach Filterwechsel – die zuverlässige Erkennung der Zentromerregionen (z. B. in komplexen Rearrangements) und auch die Bestätigung dizentrischer Chromosomen. Je nach Zielgruppe und Untersuchungsziel werden pro Proband 1000–3000 Mitosen mit eindeutiger Chromosomenmarkierung mikroskopisch analysiert und die jeweils beobachteten Aberrationen einzeln dokumentiert. Dabei werden alle erkennbaren Aberrationstypen registriert, z. B. auch Fragmente, die nicht in einem erkennbaren Zusammenhang mit Rearrangements stehen. Die Anzahl der Bruchereignisse pro 1000 Mitosen eignet sich nach unserer Erfahrung gut zum Gruppenvergleich. Sie wird als Minimalzahl der für die Entstehung der beobachteten Aberrationen notwendigen Bruchereignisse bestimmt. Die in der Literatur gelegentlich vorgeschlagenen Korrekturfaktoren zur Anhebung der ermittelten Aberrationsrate auf ein gesamtgenomisches Niveau wurden von uns nicht angewandt. Man darf mit aller Vorsicht davon ausgehen, dass die in unseren Studien angewandte Technik etwas über ein Drittel der insgesamt im jeweiligen Genom auftretenden Aberrationen erfasst. Genaue Vergleichsdaten aus Multicolor-PaintingAnalysen stehen noch aus. Erst sie werden eine zuverlässige Vergleichsbasis liefern. Im folgenden werden exemplarische Painting-Analysen an verschiedenen Personengruppen dargestellt. Die bislang von uns untersuchten vier Personengruppen sind in Tab. 1 zusammengefasst. Zusätzlich werden als Positiv-Kontrollen Daten aus Studien an 15 Patienten mit Chromosomeninstabilitätssyndromen (12 Ataxia teleangiectasia und 3 Nijmegen-BreakageSyndrom) sowie an 17 heterozygoten Trägern dieser Mutationen zum Vergleich herangezogen. Diese Daten sind insofern heterogen, als sie z. T. aus lymphoblastoiden Zelllinien erhoben wurden.

125

5

Zytogenetische Parameter

Tabelle 1: Zusammensetzung der untersuchten vier Probandengruppen. Gruppe

Zahl der Probanden

Zahl der analysierten Metaphasen

Geschlechtsverteilung

Alter (Jahre) Bereich/ Durchschn.

Anmerkungen

Kontrollen

32

71000

7m / 25w

24–57

38

Studenten, Büro- und Laborpersonal

Tumorpatienten

51

75000

11m / 40w

33–74

58

37 Mamma-Ca. 10 HNO-Tu. 4 sonstige Ca.

Personal in der medizinischen Strahlenanwendung

42

91000

19m / 23w

25–61

38

30 Radiologie, 8 Nuklearmed. 4 Str.-Physik

TNT-Arbeiter

19

19000

11m / 8w

32–57

52

–

5.2.3 Eigene Ergebnisse Der Vergleich der in Abbildung 1 zusammengefassten Einzelergebnisse dokumentiert eine hohe interindividuelle Variabilität der beobachteten Bruchraten in jeder der untersuchten Personengruppen. Diese Beobachtung deckt sich mit früheren, sowohl bei konventioneller zytogenetischer Analyse (Gebhart et al 1980) als auch bei Painting-Analysen strahlenbelasteter Tumorpatienten (Gebhart et al. 1996). In der Kontrollgruppe überstieg die ermittelte Gesamtzahl der Bruchereignisse pro 1000 Mitosen in einigen Fällen (Gruppe 1 in Abb. 1) die Obergrenze der Standardabweichung. Für zwei dieser Probanden konnte durch intensive Nachbefragung eine erhöhte Strahlenbelastung (vielfache Röntgendiagnosen in der Zeit vor der Untersuchung), bei einer weiteren Probandin eine erhöhte Chromosomeninstabilität als Ursache wahrscheinlich gemacht werden. Rund zwei Drittel der erfassten Bruchereignisse gehen in dieser Gruppe auf stabile Translokationen (Abb. 2) zurück. Im Schnitt deutlich höhere Bruchinzidenzen finden sich in einer Gruppe von Tumorpatienten, wobei die spontane Aberrationsrate in den Lymphozyten nicht vom Tumortyp abhängig war (Gruppe 2 in Abb. 1). Der relativ hohe Anteil von Bruchereignissen, die stabile Rearrangements verursachten (über 80 %, Abb. 2) lässt darauf schließen, dass die auslösenden Faktoren überwiegend vor längerer Zeit wirksam waren. Bemerkenswert ist die hohe Variabilität der Ergebnisse in dieser Gruppe, die offensichtlich die Vielfalt aberrationsverursachender Mechanismen bei diesen Patienten widerspiegelt. Immerhin zeigten zehn von ihnen Gesamtbruchraten, welche die Obergrenze der Standardabweichung dieser Gruppe überstiegen. 126

5.2

Anwendungsbeispiele einer Dreifarb-Chromosomen-Painting-Technik

Abbildung 1: Gesamtzahl der Bruchereignisse pro 1000 Metaphasen in den untersuchten Personengruppen (Jeder Kreis entspricht der Bruchrate einer Person). 1: Kontrollgruppe; 2: Tumorpatienten mit Mamma-Karzinom (gefüllte Symbole), mit HNO-Tumoren und sonstige Karzinomen (offene Symbole); 3: Personal in der medizinischen Strahlenanwendung; 4: Nitroaromaten-Exponierte; 5: 12 AT- und 3 NBS-Patienten zum Vergleich; (M weisen auf Daten aus lymphoblastoiden Zelllinien hin); 6: 11-ATHeterozygote und 6 NBS-Heterozygote zum Vergleich. * Die Gruppen 5 und 6 sind wegen ihrer heterogenen Zusammensetzung (verschiedene Syndrome, unterschiedliche Zielzellen) nicht als Gruppe im Sinne der Gruppen 1–4 zu betrachten. Neben den Einzelwerten der jeweiligen Gruppe sind Mittelwerte (k) und Standardabweichungen (I) der jeweiligen Gruppe angegeben.

127

5

Zytogenetische Parameter

Abbildung 2: Zahl der an Translokationen beteiligten Brüche pro 1000 Metaphasen in den untersuchten Personengruppen (Erläuterungen siehe Abb. 1).

Die Gruppe des in der medizinischen Strahlenanwendung beschäftigten Personals (Gruppe 3 in Abb. 1) erbrachte mit der Kontrollgruppe nahezu identische Ergebnisse. Lediglich ein individueller Wert war deutlich erhöht. Er stammte von einem 61-jährigen Strahlenphysiker mit hoher Lebenszeitdosis. Drei weitere Werte lagen nur geringfügig über der Obergrenze der Standardabweichung. 75 % der Bruchereignisse waren ursächlich an der Entstehung stabiler Rearrangements beteiligt (Gruppe 3 in Abb. 2).

128

5.2

Anwendungsbeispiele einer Dreifarb-Chromosomen-Painting-Technik

Aus einer arbeitsmedizinischen Studie an Personen, die im Rahmen der Vernichtung militärischen Abfalls in erhöhtem Ausmaß Nitroaromaten exponiert waren (Letzel et al. 2000) stammen die Daten der Gruppe 4. Neben dem gegenüber der Kontrollgruppe erhöhten Durchschnittswert der Zahl der Bruchereignisse pro 1000 Mitosen fiel hier insbesondere der hohe Anteil der auf akute Exposition hinweisenden instabilen Aberrationen auf. Wie der Vergleich der Werte (Abb. 1 und Abb. 2) ergibt, waren in dieser Gruppe nur etwa 57 % der Brüche an stabilen Rearrangements beteiligt. Dies ist der niedrigste Prozentsatz aller vier Gruppen. Die ergänzend dargestellten Daten für Patienten mit hereditärer Chromosomeninstabilität (Gruppe 5 in den beiden Abbildungen) und für heterozygote Träger der entsprechenden Mutationen (Gruppe 6) sind angesichts der relativ kleinen Individuenzahl und der Heterogenität des untersuchten Materials (hoher Anteil von Daten aus lymphoblystoiden Zelllinien) lediglich zum orientierenden Vergleich eingeführt worden. Einerseits wird daraus die sehr hohe spontane Aberrationsrate – insbesondere in den peripheren Lymphozyten – der Patienten deutlich, zum anderen belegt der relativ niedrige Prozentsatz der an stabilen Rearrangements beteiligten Brüche (58 %), dass bei diesen Patienten die angeborene Chromosomeninstabilität zur ständigen Entstehung neuer – auch kurzlebiger – instabiler Aberrationen führt. Die heterozygoten Träger der Mutation weisen im Schnitt eine über der Kontrollrate liegende Bruchhäufigkeit auf. Jedoch lässt die große interindividuelle Variation der Beobachtungswerte eine eindeutige Abgrenzung gegen die Personen der Durchschnittsbevölkerung nicht zu. Wir haben auch besonderes Augenmerk auf die komplexen Rearrangements gelegt, das sind Aberrationen, zu deren Entstehen mindestens drei oder mehr Bruchstellen in mindestens zwei oder mehr Chromosomen führen. Solche komplexen Aberrationen finden sich auch in Lymphozyten von Kontrollpersonen. Nur die Personen dieser Gruppe überschritten den von uns als Mittelwert plus zweifacher Standardabweichung festgelegten oberen Grenzwert, für die eine Mutagen-Belastung ermittelt werden konnte. In der Gruppe der medizinischen Strahlenanwender zeigten 12 %, in der Gruppe der Tumorpatienten 19 % und in der Gruppe der Nitroaromat-Exponierten 31,5 % der untersuchten Personen über dem Grenzwert liegende Bruchraten aus komplexen Aberrationen. Auch dieser Aberrationstyp konnte daher nicht zu einer eindeutigen Diskriminierung der untersuchten Gruppen beitragen. Zuletzt sei darauf hingewiesen, dass unsere ersten vergleichenden Studien mittels der Multicolor- (24-Farb-)Technik zwar die grundsätzliche Möglichkeit des Einsatzes dieser Methodik auch für das Population Monitoring belegen. Der zeitliche und materielle Aufwand, den diese Technik erfordert, ließ sie als Screening-Methode des Biomonitoring der vorgestellten Dreifarb-Painting-Methode nicht eindeutig überlegen erscheinen, wie dies gelegentlich propagiert wird. Für die tatsächlich untersuchbaren Mitosen liefert sie jedoch zuverlässigere Ergebnisse.

129

5

Zytogenetische Parameter

5.2.4 Resümee Die hier dargestellten Anwendungsbeispiele des Chromsomen-Painting für das Population Monitoring zeigen die Möglichkeiten und Grenzen dieser Technik auf. Die Erfassbarkeit reziproker Translokationen ist eine der Hauptstärken solcher Untersuchungen, nicht nur, weil dieser Aberrationstyp als solcher von hoher praktischer Bedeutung, insbesondere in der Tumorgenetik, aber auch in der klinischen Genetik ist, sondern weil diese stabilen Aberrationen sich auch als sehr langlebige und damit informative Indikatoren zeitlich weiter zurückliegender Mutagenbelastung erwiesen haben (Lucas et al. 1992, Gebhart et al. 1996). Wie am Beispiel verschiedener Personengruppen gezeigt wurde, eignet sich die Technik auch sehr gut zur Entdeckung besonders markanter individueller Mutagenbelastung. Für eine systematische Anwendung im Biomonitoring muss allerdings noch eine breitere Erfahrungsbasis geschaffen werden, da wirklich vergleichbare Studien zum Biomonitoring mit drei unterschiedlich markierten Chromosomen weitgehend fehlen. Dennoch kann man auch aus den vorgelegten Daten bereits wichtige Erkenntnisse ableiten. Berücksichtigt man in der Kontrollgruppe die Personen mit bekannter Mutagenbelastung nicht, so ergibt sich eine durchschnittliche Bruchhäufigkeit von 0,011 þ 0,005. Setzt man als Obergrenze den Durchschnittswert plus doppelte Standardabweichung (also auf 0,021) für unbelastete Kontrollpersonen fest, so lassen sich für die anderen untersuchten Personengruppen folgende Feststellungen treffen: Die Bruchhäufigkeiten überschreiten diesen Grenzwert bei 23 der 51 Tumorpatienten (45 %), bei 4 der 42 in der medizinischen Strahlenanwendung Beschäftigten (9,5 %) und bei 13 der 19 mit Nitroaromaten-Exponierten (68 %). Die Bruchinzidenz aller Patienten mit hereditärer Chromosomeninstabilität, von denen Blut zur Untersuchung zur Verfügung stand, liegt weit über diesem Grenzwert. Bei den heterozygoten Trägern dieser Mutationen waren es fünf von 17 Werten. Welche praktischen Konsequenzen sich hinsichtlich der Abschätzung von Arbeitsplatzrisiken und für die Gesundheit des betroffenen Individuums ergeben, ist einerseits unter den früher erörterten Aspekten des Population Monitoring (Speit et al. 1994) zu diskutieren und muss andererseits einer grundlegenden Erweiterung des Erfahrungsschatzes mittels dieser neuen Techniken vorbehalten bleiben. In der Literatur fehlen wirklich vergleichbare Studien weitgehend. Eine tschechische Arbeitsgruppe konnte mit Hilfe einer Zweifarb-FISH-Technik mit Proben für die Chromosomen 2 und 4 eine Gruppe medizinischen Personals von Vergleichskontrollen differenzieren (Rubes et al. 1998). Die meisten vorliegenden Studien anderer Arbeitsgruppen, die ChromosomenPainting als Technik des Biomonitoring oder der Biodosimetrie einsetzten, beschäftigten sich mit Strahlen-Exponierten (Lucas et al. 1992, Lucas 1997) und/oder verwendeten nur eine Markierung für die ausgewählten Chromosomen (Tucker et al 1993, Finnon et al. 1995, Salassidis et al. 1995,1998, Scarpato et al. 1997). Wenn auch die überwiegende Zahl dieser Studien sich auf 130

5.2

Anwendungsbeispiele einer Dreifarb-Chromosomen-Painting-Technik

die mit unserer identischen Auswahl der Chromosomen 1, 2 und 4 stützt, gibt es doch eine Reihe von Untersuchungen mit anderen Chromosomenkombinationen (Natarajan et al. 1992, Johnson et al. 1998, Pressl und Stephan 1998). Dies bedeutet, dass eine größere Zahl gut vergleichbarer systematischer Population-Monitoring-Studien bislang noch nicht greifbar ist. Chromosomenaberrationen gelten seit langem als wertvolle Indikatoren für Mutagenbelastung beim Menschen im Sinne eines Population Monitoring und als Detektionsmethode potenziell bedenklicher Expositionen sowie ihrer biologischen Auswirkungen beim Menschen. Da ihre Variabilität die jedem Humangenetiker geläufige Individualität biologischer Reaktionen des Menschen in sehr realistischer Weise widerspiegelt, sind sie als Warnsystem zweifellos gut geeignet. Dies gilt selbstverständlich umso mehr, wenn ein möglichst relevantes Aberrationsspektrum erfasst wird, wie dies die Chromosomen-Painting-Techniken gestatten. Allerdings bedarf ihre Einbeziehung in ein umfassendes Screening exponierter Personengruppen noch eines erheblichen Erfahrungszuwachses, der nur über die Einbettung in kooperative Forschungsprogramme erreichbar scheint. Insbesondere sollte in diesem Zusammenhang auch die Validität und Praktikabilität der 24-Farb-PaintingTechniken eingehend studiert werden. Was alle zytogenetischen Methoden auf Grund der genannten systemimmanenten Variabilität nicht in gleicher Weise leisten können wie die biochemischen Techniken, ist ein Biomonitoring einer arbeitsmedizinisch relevanten Exposition im Sinne einer exakten Quantifizierung der einwirkenden Agensdosis. Literatur Cremer, T., Popp, S., Emmerich, P., Lichter, P., Cremer, C.: Rapid metaphase and interphase detection of radiation-induced chromosome aberrations in human lymphocytes by chromosomal suppression in situ hybridization, Cytometry, 11, 110–118 (1990). Finnon, P., Lloyd, D. C., Edwards, A. A.: Fluorescence in situ hybridization detection of chromosomal aberrations in human lymphocytes: applicability to biological dosimetry, Int. J. Radiat. Biol., 68, 429–435 (1995). Gebhart, E., Lösing, J., Wopfner, F.: Chromosome studies on lymphocytes of patients under cytostatic therapy. I. Conventional chromosome studies in cytostatic interval therapy, Hum. Genet., 55, 53–63 (1980). Gebhart, E., Neubauer, S., Schmitt, G., Birkenhake, S., Duns,t J.: Use of a three-colour chromosome-in-situ-suppression (CISS) technique for the cytogenetic detection of past radiation exposure, Radiat. Res. 145, 47–52 (1996). Johnson, K. L., Tucker, J. D., Nath, J.: Frequency, distribution and clonality of chromosome damage in huamn lymphocytes by multi-color FISH, Mutagenesis, 13, 217–227 (1998). Letzel, S., Göen, T., Neubauer, S., Gebhart, E., Bader, M., Kraus, T., Angerer, J.: Chromosomal changes in peripheral lymphocytes of workers exposed to nitroaromatics during the disposal of military waste, in press (2000). Lichter, P., Cremer, T., Borden, J., Manuelidis, L., Ward, D. C.: Delineation of individual chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries, Hum. Genet., 80, 224–234 (1988). Lucas, J. N.: Dose reconstruction for individuals exposed to ionizing radiation using chromosome painting, Radiat. Res., 148, S33–S38 (1997).

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5

Zytogenetische Parameter

Lucas, J. N., Awa, A., Straume, T., Poggensee, M., Kodama, Y., Nakano, M., Ohtaki, K., Weier, H. U., Pinkel, D., Gray, J., Littlefield, G.: Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation, Int. J. radiat. Biol., 62, 53–63 (1992). Matsumoto, K., Ramsey, M. J., Nelson, D. O., Tucker, J. D.: Persistence of radiationinduced translocations in huamn peripheral blood determined by chromosome painting, Radiat. Res., 149, 602–613 (1998). Natarajan, A. T., Vyas, R. C., Darroudi, F., Vermeulen, S.: Frequencies of X-ray-induced chromo-some translocations in human peripheral lymphocytes as detected by in situ hybridization using chromosome-specific DNA libraries, Int. J. Radiat. Res., 61, 199–203 (1992). Neubauer, S., Dunst, J., Gebhart, E.: The impact of complex chromosomal rearrangements on the detection of radiosensitivity in cancer patients, Radiother. Oncol., 43, 189–195 (1997). Pressl, S., Stephan, G.: Chromosome translocations detected by fluorescence in situ hybridization (FISH) – a useful tool in population monitoring? Toxicol. Lett., 96/97, 189–194 (1998). Rubes, J., Kucharova, S., Vozdova, M., Musilova, P., Zudova, Z.: Cytogenetic analysis of peripheral lymphocytes in medical personnel by means of FISH, Mutat. Res., 412, 293–298 (1998). Salassidis, K., Braselmann, H., Okladnikova, N. D., Pressl, S., Stephan, G., Snigiryova, G., Bauchinger, M.: Analysis of sammetrical translocations for retrospective biodosimetry in radiation workers of the Mayak nuclear-industrial complex (Southern Urals) using FISH-chromosome-painting, Int. J. Radiat. Biol., 74, 431–439 (1998). Salassidis, K., Georgiadou-Schumacher, V., Braselmann, H., Müller, P., Peter, R. U., Bauchinger, M.: Chromosome painting in highly irradiated Chernobyl victims: a follow-up study to evaluate the stability of symmetrical translocations and the influence of clonal aberrations for retrospective dose estimation, In. J. Radiat. Biol., 68, 257–262 (1995). Scarpato, R., Lori, A., Panasiul, G., Barale, R.: FISH analysis of translocations in lymphocytes of children exposed to Chernobyl fallout: preferential involvement of chromosome 10, Cytogenet. Cell Genet., 79, 153–156 (1997). Schröck, E., du Manoir, S., Veldman, T., Schoell, B., Wienberg, J., Ferguson-Smith, M. A., Ning, Y., Ledbetter, D. H., Bar-Am, I., Soenksen, D., Garini, Y., Ried, T.: Multicolor spectral kryotyping of human chromosomes, Science, 273, 494–497 (1996). Speicher, M. R., Ballard, S. G., Ward, D. E.: Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH, Nature Genet., 12, 368–375 (1996). Speit, G., Bauchinger, M., Schmid, E., Gebhart, E., Hüttner, E., Obe, G.: Zytogenetische Analysen an menschlichen Populationen (Human Population Monitoring: HPM), Bundesgesundheitsblatt, 3/94, 118–119 (1994). Tucker, J. D., Ramsay, M. J., Lee, D. A., Minkler, J. L.: Validation of chromosome painting as a biodosimeter in human peripheral lymphocytes following acute exposure to ionizing radiation in vitro, Int. J. Radiat. Biol. 64, 27–37 (1993).

132

5.3

Der Comet-Assay als Test im Biomonitoring

5.3 Der Comet-Assay als Test im Biomonitoring Günter Speit*, Oliver Merk* und Andreas Rothfuß*

Der Nachweis einer Exposition gegenüber genotoxischen/mutagenen Agenzien am Arbeitsplatz oder in epidemiologischen Studien ist nach wie vor von zentraler Bedeutung für das Biomonitoring. Für solche Untersuchungen stehen eine Vielzahl von Genotoxizitätstests zur Verfügung, wobei die meisten Erfahrungen für zytogenetische Tests vorliegen (Speit et al. 1994). Keine der bisher etablierten Methoden kann das gesamte Spektrum möglicher mutagener Expositionen sicher erfassen, da sich die Methoden hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit für bestimmte primäre DNA-Schäden unterscheiden. Aus diesem Grund werden in der Praxis im Allgemeinen verschiedene Methoden in einer sinnvollen Kombination eingesetzt. Darüber hinaus werden stets neue Methoden entwickelt und für den routinemäßigen Einsatz im menschlichen Biomonitoring erprobt (Perera und Whyatt 1994). Vor einigen Jahren wurde mit dem Comet-Assay (Einzelzell-Gelelektrophorese) ein neuer Genotoxizitätstest, der gegenüber den bisher verwendeten Tests einige entscheidende Vorteile bietet: x ein sehr einfacher, schneller und empfindlicher Test zur Quantifizierung von DNA-Schäden, x erfasst ein breites Spektrum verschiedener DNA-Schäden, x weist DNA-Schäden auf dem Einzelzellniveau nach, x ist mit praktisch jeder Zellpopulation durchzuführen, x erfordert nur sehr geringe Zellmengen, x kann mit proliferierenden und nicht-proliferierenden Zellen durchgeführt werden.

Für Biomonitoring-Studien ergibt sich der große praktische Vorteil, dass nicht nur peripheres Blut untersucht werden kann, sondern z. B. auch Zellen der Wangen- und Nasenschleimhaut. Letztere können als Ort der primären Exposition (z. B. bei Luftverschmutzungen) von besonderer Bedeutung sein (Valverde et al. 1997). * Universitätsklinikum Ulm, Abteilung Humangenetik, Albert-Einstein-Allee 11, 89070 Ulm

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5

Zytogenetische Parameter

Abbildung 1: Schematische Übersicht über den Ablauf des Comet-Assay.

Beim Comet-Assay handelt es sich um eine MikrogelelektrophoreseTechnik, für die eine Einzelzellsuspension, z. B. heparinisiertes peripheres Blut, benötigt wird. Der Versuchsablauf ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Genaue Angaben zu den experimentellen Details finden sich in den Übersichtsartikeln von Tice (1995) und Speit und Hartmann (1999). Die zu untersuchenden Zellen werden in Agarose aufgenommen und auf einem Objektträger verteilt, der zuvor mit Agarose beschichtet wurde. Die auf dem Objektträger fixierten Zellen werden unter alkalischen Bedingungen lysiert, um die Membranstrukturen der Zellen zu zerstören. Nach der Lyse werden die Objektträger in eine horizontale Elektrophoreseapparatur eingelegt und dem alkalischen Elektrophoresepuffer ausgesetzt (unwinding). Anschließend erfolgt eine kurze Elektrophorese, danach eine Neutralisierung und die Färbung mit Ethidiumbromid oder einem anderen DNA-bindenden Farbstoff. Die Präparate werden dann am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. DNA-Schäden führen zu einer Wanderung der chromosomalen DNA zur Anode, wobei sich im Mikroskop das Bild eines Kometen zeigt (Abb. 2). Die Länge und/oder Menge der DNA-Wanderung dient als Maß für den Grad der DNA-Schädigung. Die Auswertung erfolgt entweder direkt am Mikroskop oder mit Hilfe eines Bildanalysesystems. Nachfolgend sind die Parameter zur Quantifizierung von DNA-Schäden im Comet-Array aufgelistet, die in der Praxis häufig verwendet werden.

134

5.3

Der Comet-Assay als Test im Biomonitoring

Abbildung 2: Mikroskopisches Bild von Zellen nach Durchführung des Comet-Assay. (a): Kontrolle. (b): Zelle mit induzierten DNA-Schäden, die eine verstärkte DNAMigration (Kometen) zeigt.

Für Methode I ohne Bildanalyse sind dies: x x x

die Gesamtlänge (image length), der Prozentsatz der Zellen in verschiedenen Schadensklassen, der Prozentsatz der Zellen mit Schweif (geschädigte Zellen).

Für Methode II mit Bildanalyse sind dies: x x x x

die Gesamtlänge (image length), die Schweiflänge (tail length), der Prozentsatz der DNA im Schweif, das Tailmoment.

Die Anschaffung eines Bildanalysesystems ist zwar teuer, lohnt sich aber bei einem routinemäßigen Einsatz des Tests. Es stehen verschiede Systeme zur Verfügung, von denen sich einige in der Praxis schon außerordentlich gut bewährt haben. Der bei der Auswertung mittels Bildanalyse häufig verwendete Parameter Tailmoment hat den Vorteil, dass er sowohl die Länge als auch die Menge der DNA-Wanderung berücksichtigt. Es sei jedoch kritisch angemerkt, dass die Berechnung bisher nicht auf einer einheitlichen Formel beruht und dass diese Maßangabe sehr abstrakt ist und – insbesondere dem mit dem Test nicht Vertrauten – keinen direkten Eindruck vom Ausmaß der 135

5

Zytogenetische Parameter

DNA-Schädigung gibt. Die Verwendung eines Bildanalysesystems ist keineswegs zwingend erforderlich. Die direkte Auswertung kann als sensitiv und zuverlässig angesehen werden. Die Längenmessung am Mikroskop über eine Okularskala ist jedoch sehr aufwendig. Die Einteilung in verschiedene Schadensklassen und ein aus diesen Zahlen errechnetes Maß der DNA-Schädigung (Collins et al. 1995, 1997) ist direkt nachvollziehbar und lässt sich auch graphisch gut darstellen. Bei der Verwendung der Begriffe geschädigte und ungeschädigte Zelle sollte man bedenken, dass sich dies nur auf das mikroskopische Bild der Kontrolle bezieht. Selbstverständlich tragen auch die Zellen ohne Schweif eine große Zahl von (spontanen) DNA-Schäden. Es gibt viele Modifikationen des Comet-Assay, die von verschiedenen Gruppen eingesetzt werden. Ein wesentlicher Unterschied besteht im pHWert des Elektrophoresepuffers, der dazu führt, dass ein unterschiedliches Spektrum von DNA-Schäden detektiert wird. Im Biomonitoring sollte jedoch ausschließlich die alkalische Version mit einem pH-Wert über 13 verwendet werden, da sie sich als am empfindlichsten erwiesen hat. Unter diesen Bedingungen weist man im Comet-Assay DNA-Strangbrüche, alkalilabile Stellen und Reparatureinschnitte nach. Der Effekt im Comet-Assay wird einerseits durch Zahl und Art der DNA-Schäden einer Zelle bestimmt, andererseits können viele methodische Parameter einen Einfluss auf das Ergebnis haben, wie: die Konzentration der Low-Melting-Agarose, die Zusammensetzung der Lyse-Lösung, x die Bedingungen der Alkalibehandlung (pH, Dauer, Temperatur), x die Bedingungen der Elektrophorese (Spannung, Stromstärke, Dauer, Temperatur), x die Färbung und Auswertung (Farbstoff, Fluoreszenzanregung, Vergrößerung, Messparameter). x x

Abbildung 3 zeigt beispielhaft den Einfluss der Dauer von Alkalibehandlung und Elektrophorese auf das Tailmoment in peripheren menschlichen Leukozyten. Man sieht, dass eine Verlängerung der Zeiten zu eindeutigen DNAEffekten führt (Abb. 3a) und dass diese Effekte darauf beruhen, dass in der Mehrzahl der Zellen eine verstärkte DNA-Wanderung stattfindet (Abb. 3b). Dieses einfache Experiment zeigt auch, dass zu kurze Zeiten den Test insensitiv machen können. Gerade bei Untersuchungen im Biomonitoring, bei denen oft nur mit schwachen Effekten zu rechnen ist, ist die Überprüfung der Sensitivität des Tests vor der Studie wichtig, um falsch-negative Ergebnisse zu vermeiden. Die zweite wichtige Schlussfolgerung, die sich hier ableiten lässt, ist die Forderung nach extrem gut definierten und einwandfrei reproduzierbaren Testbedingungen. Andernfalls könnte eine Variabilität der Messungen auf Grund variabler Testbedingungen die Zuverlässigkeit der Ergebnisse deutlich einschränken. Dies ist ein besonderes Problem beim Einsatz im Biomonitoring, da man hier – im Unterschied zu experimentellen In-vitro- und 136

5.3

Der Comet-Assay als Test im Biomonitoring

Abbildung 3: Der Einfluss der Dauer von Alkalibehandlung (1. Zahl) und Elektrophorese (2. Zahl) auf die DNA-Migration (Tailmoment) in peripheren menschlichen Leukozyten.

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5

Zytogenetische Parameter

In-vivo-Tests – in den meisten Fällen weder die Expositionsbedingungen variieren kann noch die Möglichkeit zu unabhängigen Wiederholungsversuchen hat. Der Nachweis einer Dosis-Effekt-Beziehung, der einen starken Hinweis auf die biologische Relevanz des Testergebnisses geben kann, wird nur in Ausnahmefällen möglich sein. Um die Qualität und Stabilität des verwendeten Protokolls zu kontrollieren, kann es hilfreich sein, einen internen Standard mitzuführen. Es ist ohne großen Aufwand möglich, z. B. eine größere Zellprobe zu bestrahlen, sofort in Portionen tiefzufrieren und dann einzelne dieser Proben in den Tests mitlaufen zu lassen. Das Ergebnis für diese Probe kann wertvolle Informationen über die Qualität der Testbedingungen und/oder die Qualität der Auswertung liefern. Die Zuverlässigkeit der mit dem Comet-Assay erhaltenen Ergebnisse hängt ganz entscheidend von der Qualität der Testdurchführung ab. Die Qualitätssicherung sollte neben einer adäquaten Methodik noch weitere Aspekte berücksichtigen. Der erste Schritt sind sorgfältige Aufzeichnungen über Entnahme, Transport und Lagerung von Proben. Um Einflüsse sterbender oder toter Zellen auf das Ergebnis im Comet-Assay zu vermeiden, sollten parallel Bestimmungen der Lebensfähigkeit (Vitalfärbungen) der Zellen durchgeführt werden. Der Comet-Assay sollte ausschließlich an kodierten Präparaten durchgeführt werden. Doppelbestimmungen an zwei Parallelpräparaten werden empfohlen. Eine externe Qualitätskontrolle, z. B. durch das Austauschen von Präparaten zwischen zwei erfahrenen Labors, kann für die Bewertung sehr hilfreich sein. Für die Beurteilung von Ergebnissen ist weiterhin eine angemessene statistische Bearbeitung der Daten erforderlich. Es gibt bisher keine allgemeine Empfehlung für einen statistischen Test. Grundsätzlich gelten die gleichen Anforderungen, die auch an andere Genotoxizitätstests gestellt werden. Da nicht von einer Normalverteilung der Effekte ausgegangen werden kann, sind nicht-parametrische Tests, die auf dem Median basieren, vorzuziehen. Zu bedenken ist, dass die Einheit der Exposition nicht die Zelle, sondern das Individuum ist, und dass das Zusammenfassen von Daten mehrerer Individuen zum Verlust wichtiger Informationen zur Variabilität führen kann. Im Hinblick auf die Interpretation von Daten sollten Kriterien für ein positives Testergebnis vor der Durchführung der Studie festgelegt sein. Die biologische Bedeutung von Effekten im Comet-Assay ist nicht grundsätzlich geklärt und wahrscheinlich sehr komplex. Effekte im CometAssay reflektieren frühe Ereignisse (primäre DNA-Veränderungen), die nicht zwangsläufig zu Mutationen führen. Der Comet-Assay ist deshalb als Indikatortest anzusehen und die gefundenen Effekte sollten generell als Biomarker für eine Exposition (der zellulären DNA) betrachtet werden, woraus ein Gefährdungspotenzial abgeleitet werden kann (hazard identification), nicht jedoch ein Risiko. Dem Kometen selbst kann man grundsätzlich nicht ansehen, welche Arten von DNA-Veränderungen zur DNA-Wanderung geführt haben und ob er ein mutagenes/kanzerogenes Potenzial der Exposition reflektiert. Eine scharfe Grenze zwischen dem Nachweis einer Exposition und dem eines biologischen Effekts besteht dann nicht mehr, wenn 138

5.3

Der Comet-Assay als Test im Biomonitoring

Modifikationen des Tests (s. u.) spezifische DNA-Schäden nachweisen können, die im direkten Zusammenhang mit der Mutagenese und Kanzerogenese stehen. Für einen sinnvollen Einsatz des Comet-Assay im Biomonitoring sollte man bedenken, welche Arten von DNA-Schäden mit diesem Test erfasst werden, wie lange solche Schäden nach dem Ende einer Exposition in den untersuchten Zellen persistieren können und welche Störfaktoren (confounder) das Testergebnis beeinflussen können. Inzwischen weiß man aus vielen In-vitro- und In-vivo-Tests, dass der Comet-Assay ein breites Spektrum an DNA-Schäden detektiert (Tice 1995). Neben direkten DNAStrangbrüchen können praktisch alle bekannten DNA-Veränderungen, wie z. B. oxidative DNA-Schäden, Alkylierungen und große Addukte eine Induktion der DNA-Wanderung bewirken. Eine wichtige Ausnahme stellen Crosslinks (Quervernetzungen) – sowohl DNA-DNA als auch DNA-Protein Crosslinks – dar (Merk und Speit 1999). Crosslinks sind der einzige bekannte DNA-Schaden, der zu einer Hemmung der DNA-Wanderung führt. Mit dem Standardprotokoll des Comet-Assay erfasst man eine Exposition gegenüber Crosslinkern, die relevante Mutagene und Kanzerogene sein können, nicht. Es wurden zwar verschiedene Modifikationen des Comet-Assay zum spezifischen Nachweis von Crosslinkern etabliert, die aber für einen (zusätzlichen) Routinetest im Biomonitoring ungeeignet erscheinen. Enthält eine (Misch-) Exposition neben anderen genotoxischen Agenzien auch Crosslinker, so ist es möglich, dass ein potenzieller genotoxischer Effekt durch Crosslinks abgeschwächt wird. Im Hinblick auf die Persistenz der Effekte im Comet-Assay haben mehrere experimentelle Studien zeigen können, dass die meisten der DNA-Schäden, die zur DNA-Wanderung beitragen innerhalb weniger Stunden repariert bzw. eliminiert werden. Untersuchungen am Menschen haben nur in einzelnen Fällen eine Persistenz von Effekten über mehrere Tage zeigen können (Hartmann et al. 1995). Solange man also nicht über spezifische Informationen über eine langanhaltende Persistenz der relevanten Schäden verfügt, sollte man von einer schnellen Entfernung ausgehen. Für die Praxis bedeutet dies, dass der Comet-Assay während einer bestehenden Exposition durchgeführt werden sollte oder unmittelbar nach dem Ende einer akuten oder chronischen Exposition. Untersuchungen zu späteren Zeitpunkten sollten gut begründet sein, da eine höhere Wahrscheinlichkeit für falsch-negative Ergebnisse besteht. Als mögliche Störfaktoren, die das Testergebnis beeinflussen können, kommen zunächst alle bekannten Faktoren in Betracht, die auch für andere Genotoxizitätstests wichtig sind und üblicherweise über einen ausführlichen Fragebogen erfaßt werden (Speit et al. 1994). Ein Störfaktor, der bisher nur für den Comet-Assay beschrieben wurde, ist starke körperliche/sportliche Belastung (Hartmann et al.1994). Es sollte darauf geachtet werden, dass die Teilnehmer an einer Studie während der letzten Woche vor der Blutentnahme sich nicht bis zur Erschöpfung körperlich belastet haben. Einige Klassen von DNA-Schäden können im Comet-Assay hochspezifisch durch den Einsatz schadensspezifischer Endonukleasen nachgewiesen 139

5

Zytogenetische Parameter

werden. Für diesen Ansatz werden Präparate nach der Lyse bei 37 hC mit dem Enzym inkubiert. Die Enzyme schneiden die DNA an den für sie spezifischen Modifikationen ein und die daraus resultierende Zunahme an Einzelstrangbrüchen kann im Comet-Assay quantifiziert werden. Mit dieser Modifikation des Comet-Assay konnten in Kombination mit der Endonuklease III oder der Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase (FPG-Protein) oxidativ geschädigte Basen mit hoher Sensitivität nachgewiesen werden (Collins et al. 1993, 1997, Dennog et al. 1996). Ein zusätzlicher Einsatz dieses modifizierten Comet-Assay im Biomonitoring erscheint sinnvoll und erfolgversprechend, wenn Informationen über möglicherweise induzierte DNA-Schäden vorliegen und dieser Schadenstyp mittels spezifischer Endonukleasen nachweisbar ist. Mit diesem Ansatz erreicht man sowohl eine höhere Sensitivität als auch eine höhere Spezifität. Letzteres kann für die Beurteilung der biologischen Relevanz von Comet-Assay-Effekten von großer Bedeutung sein. Eine weitere Modifikation, die für das Biomonitoring hilfreich sein könnte, ist der Einsatz von DNA-Reparaturinhibitoren. Sofern Exzisionsreparatur induzierter Schäden stattfindet, führt die Anwesenheit von Reparaturinhibitoren wie Aphidicolin oder Cytosinarabinosid – allein oder in Kombination mit Hydroxyharnstoff – dazu, dass die Reparatursynthese gehemmt wird und Reparatureinschnitte akkumulieren. Diese Reparatureinschnitte stellen Einzelstrangbrüche dar, die im Comet-Assay eine (zusätzliche) DNAWanderung bewirken. In Zellkulturexperimenten konnte gezeigt werden, dass Reparaturinhibitoren zu einer Verstärkung der DNA-Wanderung nach Behandlung der Zellen mit UV-Strahlung oder verschiedenen chemischen Mutagenen/Kanzerogenen führte (Speit und Hartmann 1995, Martin et al. 1999). Beim Menschen konnten wir zeigen, dass oxidative DNA-Schäden im peripheren Blut nach hyperbarer Sauerstoffbehandlung induziert und im Comet-Assay nachgewiesen werden (Dennog et al. 1996). Diese Schäden werden in Leukozyten nach Ende der Exposition sehr schnell repariert. Setzt man den Blutproben jedoch sofort einen Reparaturinhibitor (Aphidicolin) zu, so findet man nach Inkubation für zwei Stunden bei 37 hC eine starke Zunahme des primären Effektes (Speit et al. 1998). Ob ein solcher Ansatz, der theoretisch in vielen Fällen zu einer Zunahme der Sensitivität führen sollte, sich in der Praxis des Biomonitoring bewährt, muss noch untersucht werden. In verschiedenen Untersuchungen am Menschen wurde der Comet-Assay nicht nur zum Nachweis (induzierter) DNA-Schäden eingesetzt, sondern auch zur Bestimmung der so genannten Reparaturkapazität (Plappert et al. 1997, Buschfort et al. 1997, Alapetite et al. 1999). Dazu wurden die Blutproben der Probanden mit ionisierender Strahlung oder einem chemischen Mutagen behandelt und der Effekt im Comet-Assay bestimmt. Die Blutproben wurden unter physiologischen Bedingungen inkubiert und zu verschiedenen Zeitpunkten nach Ende der Exposition im Comet-Assay analysiert, um die Abnahme des Effektes mit der Zeit als Maß für die Reparaturkapazität zu bestimmen. Dabei zeigte sich z. B. eine verminderte Reparaturkapazität von chronisch bestrahlten Personen aus der Region um Tschernobyl 140

5.3

Der Comet-Assay als Test im Biomonitoring

(Plappert et al. 1997). Es sei jedoch kritisch angemerkt, dass die Reproduzierbarkeit solcher Unterschiede bisher nicht hinreichend untersucht wurde und die biologische Bedeutung solcher Unterschiede nicht bekannt ist. Neue Untersuchungen aus unserer Arbeitsgruppe mit Blut von Brustkrebs-Patientinnen mit einer BRCA1-Mutation deuten darauf hin, dass man mit dem Comet-Assay hauptsächlich die Geschwindigkeit der Schadenseliminierung bestimmt, nicht jedoch die Genauigkeit der Reparatur. Das Blut der von uns untersuchten Patientinnen mit BRCA1-Mutation zeigte keine Unterschiede in der Reparaturkapazität im Comet-Assay nach Bestrahlung, aber deutlich erhöhte Raten an Chromosomenaberrationen im Vergleich zu Kontrollpersonen (Rothfuß et al. 2000). Weitere Untersuchungen zur Reparaturkapazität erscheinen erforderlich, bevor man den Einsatz dieser Modifikation im Biomonitoring empfehlen kann. Der Comet-Assay wurde bis jetzt nur in wenigen Biomonitoring Studien vergleichend mit anderen genetischen Endpunkten untersucht (Vodicka et al. 1995, Hartmann et al. 1998, Sram et al. 1998, Somorovska et al. 2000). Weitere systematische Untersuchungen sind erforderlich, bevor eine Aussage zur zukünftigen Bedeutung des Comet-Assay im Biomonitoring gemacht werden kann. Solche Studien sollten nach Möglichkeit den Einsatz schadensspezifischer Enzyme und Reparaturinhibitoren berücksichtigen. Besonderer Wert ist auf die Standardisierung der Versuchsbedingungen und strikte Qualitätskontrollen zu legen. In bisherigen Untersuchungen hat sich die große Variabilität der Messungen im Comet-Assay als problematisch erwiesen. Zellproben derselben Person, die zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht wurden, zeigten beträchtliche Unterschiede (Collins et al. 1997). Es muss noch untersucht werden, inwieweit diese Variabilität methodisch bedingt und vermeidbar ist. Insgesamt könnte der Comet-Assay auf Grund seiner vielen Vorteile in Zukunft eine wichtige Rolle im Biomonitoring spielen. Eine sorgfältige Planung und Durchführung der Studie vorausgesetzt, sollte es möglich sein, Unterschiede zwischen Personengruppen zuverlässig zu messen. Allgemeine Anerkennung kann der Comet-Assay nur finden, wenn solide Daten publiziert werden und die Ergebnisse nicht überinterpretiert werden. Danksagung Diese Arbeit wurde durch das Programm Umwelt und Gesundheit (PUG) des Forschungszentrums Karlsruhe gefördert.

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5

Zytogenetische Parameter

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142

5.3

Der Comet-Assay als Test im Biomonitoring

Speit, G., Hartmann, A.: The comet assay (single-cell gel test). In: Methods in Molecular Biology, Vol 113: DNA Repair protocols: Eukaryotic Systems, Humana Press, Totowa (1999). Speit, G., Bauchinger, M., Schmid, E., Gebhart, E., Hüttner, E., Obe, G.: Zytogenetische Analysen an menschlichen Populationen (Human Population Monitoring: HPM), Bundesgesundhbl., 3/94, 118–119 (1994). Speit, G., Dennog, C., Lampl, L.: Biological significance of DNA damage induced by hyperbaric oxygen, Mutagenesis, 13(1), 85–87 (1998). Sram, R. J., Rossner, P., Peltonen, K., Podrazilova, K., Mrackova, G., Demopoulos, N. A., Stephanou, G., Vlachodimitropoulos, D., Darroudi, F., Tates, A. D.: Chromosomal aberrations, sister-chromatid exchanges, cells with high frequency of SCE, micronuclei and comet asay paramaeters in 1,3 butadiene-exposed workers, Mutation Res., 419, 145–154 (1998). Tice, R.: The single cell gel / comet assay: a microgel electrophoretic technique for the detection of DNA damage and repair in individual cells, in: Phillips, D. H., Venitt, S. (eds.): Environmental Mutagenesis, S. 315–339, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford (1995). Valverde, M., Lopez, C. M., Lopez, I., Sanchez, I., Fortoul, T., Ostrosky-Wegman, P., Rojas, E.: DNA damage in leukocytes and buccal and nasal epithelial cells of individuals exposed to air pollution in Mexico City, Environ. Mol. Mutagen, 30, 147–152 (1997). Vodicka, P., Bastlova, T., Vodickova, L., Peterkova, K., Lambert, B., Hemminki, K.: Biomarkers of styrene exposure in lamination workers: levels of O6-guanine DNA adducts, DNA strand breaks and mutant frequencies in the hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase gene in T-lymphocytes, Carcinogenesis, 16, 1473–1481 (1995).

143

6 Immunologie 6.1 Immunglobuline als Marker chronischer Exposition gegenüber allergenen Arbeitsstoffen Hans Drexler*

Allergische Erkrankungen durch Arbeitsstoffe sind auch an modernen Arbeitsplätzen ein vielfach noch zu wenig beachtetes Problem. Beispielsweise wird geschätzt, dass bei einer Asthmaprävalenz von 5 % ca. 0,2–0,5 % der Bevölkerung an einem beruflich induzierten Asthma leiden (Blanc und Toren 1999, Kogevinas et al. 1999). Die Jahresinzidenz beruflicher Handekzeme wird in Abhängigkeit von der Tätigkeit mit 0,5–1,9 pro 1000 Vollzeitbeschäftigte angegeben (Diepgen und Coenraads 1999). Zumindest ein Teil dieser Erkrankungen hat eine immunologische Pathogenese. Gelang es in den vergangenen Jahrzehnten toxisch verursachte Berufskrankheiten durch die Überwachung der Exposition und die konsequente Anwendung von Grenzwerten zu reduzieren, so blieben am Arbeitsplatz vorkommende Allergene oftmals unberücksichtigt. Sowohl in der Definition des MAK-Werts, als auch in der Definition des BAT-Werts wird das allergene Potenzial von Arbeitsstoffen nicht für die Grenzwertfestsetzung herangezogen (Deutsche Forschungsgemeinschaft 1999). Obwohl kein Zweifel daran besteht, dass sowohl die Induktion einer allergischen Reaktion als auch deren Auslösung einer Dosis-Wirkungs-Beziehung gehorcht, ist es derzeit kaum möglich, Schwellenwerte für einen gefährdungsfreien Umgang mit Allergenen zu definieren (Drexler 1997). Solche sind derzeit u. a. deshalb nicht zu evaluieren, weil der Großteil der vorliegenden Erfahrungsberichte ohne eine geeignete Quantifizierung der Exposition erstellt wurde. In Studien, in denen die Exposition ermittelt wurde, konnte gezeigt werden, dass mit der Reduzierung der Allergenkonzentration die Zahl der Sensibilisierungen und die Zahl der Beschwerden zurückgeht (Grieshaber 1997, Drexler et al. 1999). Gleichwohl zeigte sich dabei auch, dass ein Gesundheitsschutz nicht in dem Maße gewährleistet ist, wie dies die toxikologisch begründeten MAK- und BAT-Werte in ihrer Definition vorsehen (Deutsche Forschungsgemeinschaft 1999). Bei allergischen Erkrankungen ist zwischen den humoral (IgE, IgG, IgM) und den zellulär vermittelten Pathomechanismen zu unterscheiden. Der mög* Institut für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin, Universität Erlangen-Nürnberg, Schillerstr. 25/29, 91054 Erlangen

144

6.1

Immunglobuline als Marker chronischer Exposition

liche Einsatz von Immunglobulinen dürfte sich in erster Linie auf die humoral vermittelten Allergien beschränken. Von arbeitsmedizinischem Interesse sind dabei die Allergie vom Soforttyp (Typ I Allergie) und die durch Immunkomplexe verursachte Typ III Allergie. Bei diesen Allergien induziert die allergenpräsentierende Zelle eine TH2-Antwort (T-Helferzelle vom Subtyp 2). Bei der häufig vorkommenden Typ I Allergie wird das Interleukin 4 als das entscheidende Zytokin betrachtet, welches für den so genannten Switch (von IgG auf IgE) der Antikörper-Produktion der B-Lymphozyten verantwortlich ist. Die dann produzierten IgE-Antikörper sind wesentlich mit an der durch Allergenkontakt initiierten Entzündungsreaktion beteiligt. Der Prozess der Induktion (Sensibilisierung) und der Provokation (Auslösung) wurde und wird noch immer vielfach rein qualitativ betrachtet und damit mehr den stofflichen Eigenschaften als der Menge der einwirkenden Allergene zugeschrieben. Nur vergleichsweise wenige allergologische Publikationen beschreiben auch exakt die Exposition. Die Ursachen dafür sind offensichtlich in den Schwierigkeiten einer exakten Quantifizierung von Allergenen begründet. Bei den Allergenen handelt es sich zum überwiegenden Teil um hochmolekulare Proteine natürlichen Ursprungs, deren Luftkonzentrationen in der Größenordnung von 1 ng/m3 liegen. Die daraus resultierenden Probleme der Analytik sind leicht nachvollziehbar. In diesem Konzentrationsbereich werden zeitliche und räumliche Inhomogenitäten zunehmend wichtig. Vieles scheint dafür zu sprechen, dass weniger die Allergendosen als vielmehr kurzzeitige Spitzenkonzentrationen für die Sensibilisierung relevant sind. Schließlich kommt individuellen Faktoren eine bedeutsame Rolle zu, beispielsweise wenn die natürlichen Haut- und Schleimhautbarrieren in ihrer Funktion geschädigt sind und Allergene dadurch erleichterten Zugang zu den immunkompetenten Zellen finden. Allergene lassen sich am einfachsten in Materialien und im Staub nachweisen. Doch es stellt sich in Anbetracht der aufgeführten Argumente die Frage nach der Relevanz derartiger Messwerte. Auch das Luftmonitoring ist problembehaftet, so dass Untersuchungen im biologischen Material sicher von großem Nutzen wären, wenn es gelänge, geeignete Parameter zu finden. In diesem Zusammenhang scheint die Differenzierung zwischen dem Belastungsmonitoring (Bestimmung der Konzentration im Körper oder im Zielorgan), dem Effektmonitoring (Bestimmung biochemischer oder biologischer Effekte) und dem Beanspruchungsmonitoring (Erfassen des adversen Effektes) besonders sinnvoll. Bei allergischen Erkrankungen können im klassischen Belastungsmonitoring die hochmolekularen Proteine biologischen Ursprungs bislang nicht erfasst werden. Der Nachweis gelingt aber für verschiedene niedermolekulare Haptene, also Verbindungen, die erst nach Bindung an ein körpereigenes Eiweiß eine allergische Reaktion auslösen können. Dabei handelt es sich praktisch ausschließlich um arbeitsplatzrelevante Expositionen (Diisocyanate, Dicarbonsäureanhydride, Platinsalze). Diese Verbindungen stellen daher wichtige Beispiele für das Verstehen der DosisWirkungs-Beziehung allergischer Erkrankungen dar. 145

6

Immunologie

Es gibt nur relativ wenige Gruppen von niedermolekularen Verbindungen, die auf Grund ihrer spezifischen Bindungsfähigkeit an körpereigene Makromoleküle eine allergene Potenz entfalten. Wenn diese Bindung passiv erfolgt, müssten die messbaren Hämoglobin- oder Albumin-Addukte noch als Belastungsmonitoring mit dem Kompartiment iProteineI bezeichnet werden. Bekanntermaßen induzieren allergene Stoffe nur bei einem Teil der Exponierten die Bildung spezifischer IgE-Antikörper. Diese und auch die Hauttestungen stellen bei bereits Sensibilisierten definitionsgemäß Beanspruchungsparameter dar, die mit dem adversen Effekt assoziiert sind. Antikörper vom IgG-Typ gegen immunogene Fremdstoffe scheinen aber bei entsprechender Konzentration und Einwirkdauer bei fast allen Exponierten nachweisbar zu sein und wären als Effektparameter im biologischen Monitoring zu bezeichnen. Um die Vorteile des biologischen Monitoring auch dann nützen zu können, wenn die Voraussetzung zur Ableitung von BAT-Werten oder von Expositionsäquivalenten für krebserzeugende Arbeitsstoffe nicht gegeben sind, wird derzeit von der Deutschen Forschungsgemeinschaft ein Konzept erarbeitet, mit dem es auch in diesen Fällen möglich sein wird, anhand der Biomonitoring-Ergebnisse arbeitsplatzhygienische Maßnahmen zu überwachen. Neben der Überwachung von Kanzerogenen dürfte dieses Konzept auch für allergene Arbeitsstoffe erfolgreich anwendbar sein. Zu den Allergenen, die für die Verifizierung dieses Konzeptes geeignet erscheinen, gehört die Substanzklasse der Dicarbonsäureanhydride. Dicarbonsäureanhydride stellen niedermolekulare Inhalationsallergene mit hoher Sensibilisierungspotenz dar (Venables 1989, Welinder et al. 1990, Nielsen et al. 1992, 1994, Drexler et al. 1994, Baur et al. 1995, van Tongeren et al. 1998). Verwendet werden diese Verbindungen vorwiegend als Epoxidharz- und als Pulverfarbenhärter, wobei meistens nicht ein einziges Kongener, sondern ein Gemisch verschiedener Derivate eingesetzt wird, z. B. Phthalsäureanhydrid (PA), Hexahydrophthalsäureanhydrid (HHPA), Methyltetrahydrophthalsäureanhydrid (MTHPA), Methylhexahydrophthalsäureanhydrid (MHHPA), Trimellitsäureanhydrid (TMA). Unter ungünstigen Expositionsverhältnissen sind Sensibilisierungsraten bis 50 % beschrieben worden. Auch unter relativ günstigen Expositionsbedingungen bewegt sich die Prävalenz von Soforttypsensibilisierungen in Querschnittstudien bei 20 %. Dicarbonsäureanhydride können sowohl durch Luftuntersuchungen am Arbeitsplatz als auch durch ein biologisches Belastungsmonitoring (Metabolite in Urin, Protein-Addukte) erfasst werden. Weiter lassen sich spezifische Immunglobuline vom IgG-Typ als biologische Effektparameter und bei sensibilisierten Personen Immunglobuline vom IgE-Typ als Beanspruchungsparameter nachweisen. Auch der Hautpricktest mit freien Dicarbonsäureanhydriden (Drexler et al. 1993) und deren Protein-Konjugaten (Nielsen et al 1992) verläuft nach eingetretener Sensibilisierung positiv und kann als Beanspruchungsparameter herangezogen werden. Im Rahmen von Felduntersuchungen zur Sensibilisierungspotenz verschiedener Dicarbonsäureanhydride wurde u. a. die Frage gestellt, ob ein 146

6.1

Immunglobuline als Marker chronischer Exposition

biologisches Monitoring eine risikorelevante Expositionserfassung von Allergenen ermöglicht und ob die Befunde des biologischen Monitorings insbesondere mit dem Risiko einer Sensibilisierung korrespondieren. Untersucht wurden insgesamt 219 Personen aus drei Industrieanlagen mit inhalativem Kontakt zu Dicarbonsäureanhydriden. Das Untersuchungsprogramm umfasste neben Luftanalysen eine körperliche Untersuchung, einen Hautpricktest mit Eiweiß-Konjugaten der Dicarbonsäureanhydride sowie eine Serum- und Urinanalyse. Im Serum erfolgte eine Bestimmung spezifischer Immunglobulin E- und Immunglobulin G-Antikörper (Welinder et al. 1990) gegen HHPA-Konjugate und MTHPA-Konjugate. In den Urinproben wurden die korrespondierenden Dicarbonsäuren der Allergene analysiert (Jönsson und Lindh 1996). In Übereinstimmung mit Literaturangaben fanden sich Sensibilisierungsraten von 21–35 % bei Luftkonzentrationen bis 58,5 mg/m3 MTHPA. Die Konzentration der Urin-Metabolite war bei den Arbeitnehmern in dem Betrieb mit der höchsten Sensibilisierungsrate am größten (Sensibilisierungsrate 35 %, Median 346 nmol/mmol Kreatinin) und bei Arbeitnehmern mit der geringsten Sensibilisierungsrate am niedrigsten (Senibilisierungsrate 21 %, Median 10,1 nmol/mmol Kreatinin). Die Spiegel des spezifischen Immunglobulin E gegen MTHPA im Serum der sensibilisierten Arbeitnehmer (spezifisches IgE i 0,3) zeigte das gleiche Muster wie die Konzentrationen der Urin-Metabolite. Die Dicarbonsäure-Ausscheidung im Urin von Sensibilisierten und Nicht-Sensibilisierten zeigte keinen Unterschied. Eine Korrelation zwischen den Dicarbonsäuren im Urin und dem spezifischen IgE ließ sich nicht nachweisen. Das spezifische IgG im Serum korrelierte sowohl mit den Metaboliten des MTHPA im Urin als auch mit dem spezifischen IgE. Im Gegensatz zum spezifischen IgE wird das spezifische IgG nicht als Beanspruchungsparameter, sondern als Parameter einer chronischen Exposition betrachtet (Kim et al. 1997, Park et al. 1999). Das spezifische Immunglobulin G könnte somit bei Exposition gegenüber allergenen Arbeitsstoffen ein geeigneter Parameter für ein biologisches Monitoring sein. Die statistisch signifikante Korrelation der spezifischen IgG-Spiegel der Exponierten mit der Metabolitenkonzentration im Urin scheint dies zu belegen. Wenn das spezifische IgG als Parameter für eine chronische Exposition herangezogen werden kann, dann spricht die Korrelation mit dem spezifischen IgE dafür, dass mit steigender chronischer Exposition auch die Intensität der Sensibilisierung, also die Beanspruchung, zunimmt. Abzuklären bleibt, ob diese Assoziation nicht eine Scheinkorrelation ist, unter Umständen dadurch verursacht, dass die Antikörperbildung durch die Sensibilisierung generell gefördert wird. Zwei Argumente sprechen aber gegen eine generelle Stimulierung der Antikörperbildung. Erstens ist es biologisch nicht plausibel, dass die Bildung beider Immunglobulin-Klassen gleichzeitig angeregt wird. Das Interleukin 4 (IL4) wird für den so genannten Switch der Plasmazellen mit konsekutiver Umstellung der Antikörperproduktion von IgG auf IgE verantwortlich gemacht. Eine gemeinsame Anregung der Antikörperproduktion durch einen Stimulus wäre demnach nicht zu 147

6

Immunologie

erwarten. Zweitens unterscheiden sich erwartungsgemäß die IgE-Antikörperspiegel zwischen Nicht-Atopikern und Atopikern. Die Atopie ist definitionsgemäß eine hereditäre Immundysregulation mit erleichterter IgEBildung. Beim spezifischen IgG fand sich dieser Unterschied aber nicht. Dies scheint auch nicht die Folge eines Selektionsbias gewesen zu sein (wenn z. B. Atopiker, die schneller sensibilisiert werden, den Arbeitsplatz als Folge der Sensibilisierung verlassen), da der IgG-Spiegel von Sensibilisierten und Nicht-Sensibilisierten keinen Unterschied zwischen Atopikern und Nicht-Atopikern erkennen ließ. Auch wenn über die mögliche pathogene Bedeutung der IgG-Antikörper z. T. noch kontrovers diskutiert wird, wurden diese erfolgreich als Expositonsmarker bei Kontakt mit Diisocyanaten, Enzymen, Hausstaubmilben, Getreidestaub und Pilzen herangezogen (Kim et al. 1997, Zentner et al. 1997, Smith et al. 1998, Johanning et al. 1999, Park et al 1999). Ausblick Trotz der sozialmedizinisch-epidemiologischen und der gesundheitsökonomischen Bedeutung allergischer Erkrankungen gibt es bislang wenig Anstrengungen, die Exposition valide zu erfassen. Die IgG-Antwort des Körpers bei chronischer Exposition gegenüber Allergenen könnte ein wertvoller Parameter dafür werden. Dazu ist es aber erforderlich, dass zunächst die Analytik standardisiert wird. Erst dann kann die Methode Allergen-spezifisch validiert werden. Dabei müssen die Fragen beantwortet werden, für welche Allergene der IgG-Spiegel mit der Exposition assoziiert ist und ob eine erhöhte chronische Exposition einen Risikofaktor für die Sensibilisierung darstellt. Niedermolekulare Allergene sind geeignete Modellsubstanzen, da der Nachweis dieser Arbeitsstoffe sicher und präzise sowohl in der Luft als auch im biologischen Material erfolgen kann. Kann genügend Datenmaterial gesammelt werden, ist es denkbar, neuartige Arbeitsschutzkonzepte abzuleiten. Die IgG-Konzentration würde sich zwar nicht wie ein BAT-Wert als individueller Höchstwert (Ceiling) eignen, aber vielleicht ließe sich die Arbeitsplatzhygiene mit einem Konzept, wie es die Anwendung der US-amerikanischen BEI-Werte vorsieht, besser beurteilen, als dies bei allergischen Erkrankungen bisher möglich ist. Literatur Baur, X., Czuppon, A. B., Rauluk, I., Zimmermann, F. B., Schmitt, B., Egen-Korthaus, M., Tenkhoff, N., Degens, P. O.: A clinical and immunological study on 92 workers occupationally exposed to anhydrides, Int. Arch. Occup. Environ. Health, 67, 395–403 (1995). Blanc, P. D., Toren, K.: How much adult asthma can be attributed to occupational factors? Amer. J. Med., 107, 580–587 (1999). DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft): MAK und BAT-Werte-Liste 1999, WileyVCH Verlag, Weinheim (1999). Diepgen, T. h., Coenraads, L. P. J.: The epidemiology of occupational contact dermatitis, Int. Arch. Occup. Environ. Health, 72: 8, 496–506 (1999).

148

6.1

Immunglobuline als Marker chronischer Exposition

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6

Immunologie

6.2 Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme Jürgen Lewalter*

6.2.1 Einleitung Das Immunsystem hat zur Erhaltung der Integrität unseres Körpers eine lebenswichtige Funktion. Neben der Abwehr von eindringenden Krankheitserregern und chemischen Noxen umfaßt dies die Reparatur geschädigter Gewebe und die Eliminierung veränderter Zellen (z. B. Tumor- und gealterte Zellen). Diese komplexe Aufgabenstellung erfordert ein fein reguliertes System. Grundpfeiler der Immunantwort ist die Induktion einer Entzündungsreaktion als Folge der Aktivierung von Immunzellen über ihre Erkennungsrezeptoren an ihrer Oberfläche. Die zellulären Träger des phylogenetisch älteren Immunsystems (Makrophagen, Granulozyten, Mastzellen, etc.) verfügen über ein Set von so genannten pattern recognition receptors mit relativ breiter Spezifität für ubiquitär vor allem von Mikroorganismen exprimierte chemische Strukturen (z. B. Endotoxin, Mannose, CG-reiche DNA, RNA, Phosphoserycholin), sowie den vielfältigen Arbeitsstoffen. Das Eindringen derartiger Verbindungen ins Gewebe führt zur Aktivierung aller in der Umgebung vorhandenen immunkompatenten Zellen (Abb. 1) (Baenkler 1992, Bauer 1991, Keller 1987, Lewalter 1994, Reinke et al. 1999, Schleicher 1997. Durch humorale Erkennungsvermittler – Komplement, C-reaktives Protein (CRP), etc. – wird dieses System noch effektiver gestaltet. Die Stimulierung dieser Zellen über ihre pattern recognition receptors führt weniger zur direkten Aktivierung (verstärkte Phagozytose und verbesserte Killingfunktion), sondern durch die freigesetzten Zytokine werden die umgebenden Zellen (z. B. Endothel) aktiviert und in die Entzündungsreaktion einbezogen (parakrine Funktion). Mögliche Einflussgrößen werden in Abbildung 2 skizziert (Neumann 1992, Schleicher 1997). Größere Mengen freigesetzter Zytokine haben eine generalisierte Wirkung (endokrine Funktion) und aktivieren systemische Entzündungssysteme

* Institut für Biologisches Monitoring, BAYER AG, 51368 Leverkusen

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6.2

Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme

Abbildung 1: Eigenschaften und Leistungen des Immunsystems (Playfair und Baron 1995).

Abbildung 2: Vereinfachtes Schema der Ausbildung von zellulärer und humoraler Immunität mit Angriffspunkten immunsuppressiver Stoffe (Neumann 1992).

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6

Immunologie

– Synthese von akuten Phaseproteinen, Umstellung auf eine katabole Stoffwechsellage, Induktion von Fieber und anderer neuroendokriner Reaktionen, induzierte Hämatopoese, etc. – bis hin zum systemic inflammatory response syndrome (SIRS). Um den vielfältigen Escape-Mechanismen der Mikroorganismen Paroli bieten zu können, hat sich im Laufe der Evolution zusätzlich das spezifische, adaptive Immunsystem entwickelt, dessen zelluläre Träger die Lymphozyten sind. Anstelle der multireaktiven pattern recognition receptors besitzen sie Milliarden verschiedener, klonal verteilter, hoch spezifischer Antigenrezeptoren, die praktisch die Erkennung aller in der Natur entstehenden chemischen Strukturen ermöglichen. Da naturgemäß nur wenige Zellen (Klone) einer Spezifität im Körper existieren, setzt eine effektive Effektorwirkung eine klonale Expansion der stimulierten Klone nach Kontakt mit dem mikrobiellen oder anderen allergenen Stimuli voraus. Daher reagiert dieses spezifische Immunsystem deutlich langsamer (Tage) als das unspezifische (Stunden). Auf der Effektorseite benutzt das spezifische Immunsystem jedoch viele der unspezifischen Entzündungsreaktionen. Die komplexen Zusammenhänge sind in der folgenden Übersicht (Abb. 3) kurz skizziert worden (Baenkler 1992, Schleicher 1997, Vorlaender 1980). Akute Entzündungsreaktionen dienen sowohl der verbesserten Erregerabwehr als auch der Wundheilung und Gewebereparatur. Allerdings bieten akute Entzündungsreaktionen immer die Gefahr der Selbstzerstörung, was eine komplexe Regulation erfordert. Neben der autoregulativen Selbstabschaltung der aktivierten Entzündungszellen (Apoptose, exhausting) wird die Entzündungsreaktion durch auto-, para- und endokrin wirkende regulatorische Zytokine (z. B. IL-10, TGF-ß) sowie durch das neuroendokrine System (Hypothalamus/Hypophysen/Nebennierenachse, Katecholamine, Endorphine) kontrolliert. Dieses über Jahrmillionen bewährte und weiterentwickelte System kann unter intensivmedizinischen, aber auch unter

Abbildung 3: Hypersensibilitätssyndrome (Schleicher 1997) Schädigung durch inadäquate Reaktion: Überschießende und unnötige Immunreaktion gegen harmlose Antigene: Hypersensitivität; Allergie – xenogen: gegen speziesfremde Antigene (klassische Allergie, infektinduzierte Prozesse) – allogen: gegen individualfremde Antigene (Transplantatabstoßung, Immunfetopathien, allogene Infertilität – autolog: gegen körpereigene Antigene (Autoaggression, Autoallergie) x Unzureichende oder fehlende Immunreaktion gegen pathogene Antigene: Immunmangel, Immundefekt – infolge Fehlanlage oder Auslöschung: „primäre“ Defizienzzustände – infolge Verlust oder Behinderung: „sekundäre“ Defizienzzustände x Ungezügelte monoklonale Proliferation: Maligne Immunproliferation. x

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n

6.2

Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme

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Immunologie

arbeitsmedizinisch orientierten Bedingungen, vorzugsweise nach Intoxikationen, außer Kontrolle geraten. In den vergangenen Jahren hat man sich vor allem auf die überschießende Reaktion des Entzündungssystems konzentriert und Immunfaktoren wie TNF-a und IL-1 eine wesentliche Rolle in der Pathogenese systemischer Entzündungsreaktionen (SIRS) und der Sepsis zugesprochen. Während zahlreiche Körperfunktionen (Leber, Niere, Blutgerinnung, Herz, Blutdruck) in der arbeitsmedizinischen Prophylaxe einem engmaschigen Monitoring unterzogen werden, wird kaum berücksichtigt, dass im Rahmen anaphylaktoider Ereignisse oder des Multiorganversagens auch das lebenswichtige Organ Immunsystem versagen kann. Im Allgemeinen wird dessen funktionelle Erfassung auf das mäßig aussagekräftige CRP beschränkt (Reinke et al. 1999, Vorlaender 1980). Im arbeits- und umweltmedizinischen Bereich werden folgende humorale und zelluläre Mechanismen immunologischer Kompetenzen unterschieden: x Immunstimulation: Verstärkung der Antigen-induzierten Immunabwehr; adverse Folgen: Sensibilisierung, etc. x Immuntoleranz: Dämpfung der Antigen-induzierten Immunabwehr; adverse Folgen: Persistierende Infektionen etc.

6.2.2 Auswahl immundiagnostischer Parameter Welche Immunparameter sollten in der arbeitsmedizinischen Vorsorge erfaßt werden? In der Literatur wurde eine Vielzahl von Parametern als diagnostisch/prognostisch hilfreich beschrieben. Die im folgenden aufgeführten Parameter gelten als sinnvoll und genügen vor allem modernen Ansprüchen der Standardisierung – leider noch ein Handicap vieler immunologischer Methoden. Natürlich wird aus Kostengründen immer nach dem Screeningparameter gefragt. Jedoch ist es illusorisch anzunehmen, die komplexe Funktion des Immunsystems mit einem einzigen Parameter erfassen zu können. Dies gelingt für andere Organfunktionen auch nicht. Bei der Auswahl des Parameters spielt vor allem die Fragestellung eine wesentliche Rolle (Vorlaender 1980). Die auf exogene und endogene Induktionen resultierende Immunantwort ist ein komplexer Vorgang. Wie aus Abbildung 4 ersichtlich, sind an der Immunantwort zahlreiche immunkompatente Zellen unter der Vermittlung multifunktioneller Mediatoren (Zytokine) beteiligt (Baenkler 1992, Dean und Murray 1991, Kirchner et al. 1993). Abbildung 4: Entwicklung, Interaktionen und Zellen des Immunsystems (Dean und Murray 1991).

154

n

6.2

Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme

155

6

Immunologie

Das Immunsystem wird in einen zellulären und humoralen Bereich unterteilt, die beide sowohl spezifisch als auch unspezifisch auf antigene Induktionen reagieren können. Die T- und B-Lymphozyten repräsentieren den spezifisch-zellulären, die Makrophagen und natürlichen Killerzellen den unspezifisch-zellulären Anteil des Immunsystems. Im Gegensatz zu den sensitiven, aber aufwendig zu bestimmenden Markern zellulärer Abwehr sind die Parameter der humoralen Abwehr im Plasma mit weitgehend standardisierten Methoden analysierbar (Bauer 1991, Dean und Murray 1991, Vorlaender 1980). Die humorale Immunantwort wird durch spezifische Serumproteine vermittelt. Der spezifische Teil wird durch die Antikörper der Immunglobulinklassen G, A, M und E (IgG, IgA, IgM, IgE), die unspezifischen Teile durch das Komplementsystem repräsentiert. Neben diesen Markern der humoralen Immunabwehr sind in der zellulären Abwehr die labilen Zytokine und stabilen löslichen Zytokinerezeptoren als frühe Indikatoren der Immunmodulation integriert. Sie sind an allen immunologischen Zell-Aktivierungs-, Inhibierungs-, Differenzierungs- und Reifungsprozessen beteiligt. Sie besitzen keine Enzymaktivität und erfordern wegen ihrer hohen, meist nur kurzzeitigen biologischen Wirksamkeit eine sensitive Regulation. Durch Inhibition der Expression ihrer spezifischen, meist langlebigen Rezeptoren kann diese zumindest teilweise auch über einen autokrinen Mechanismus induziert werden. Belastungen können durch sensibilisierende Arbeitsstoffe zu einer Modulation des Immunsystems führen, dessen gestörte Immuntoleranz über erhöhte antinukleare Antikörper-Titer nachzuweisen ist. Schließlich sind die Makrophagen in der unspezifischen, über Mediatoren, aber auch indirekt in der spezifischen Immunabwehr von Arbeitsstoffen beteiligt (Baenkler 1992, Vorlaender 1980).

6.2.3 Erfassung der immunologischen Kompetenz Nach der Erläuterung des molekularbiologischen Hintergrundes der Immunreaktionen sollen die zu obstruktiven Atemwegserkrankungen führenden immunologischen Vorgänge beispielhaft besprochen werden. Aus den BGBerichten ist bekannt, dass der Umgang mit allergisierenden und toxischirritativen Stoffen zu obstruktiven Atemwegserkrankungen führen kann (Tab. 1, Schleicher 1997). Trotz intensiver arbeitsmedizinischer Vorsorgeuntersuchungen gehören die obstruktiven Atemwegserkrankungen bis heute zu den häufigsten, beim Arbeitsstoffumgang erworbenen Berufserkrankungen. Inzwischen konnten die auslösenden Mechanismen der obstruktiven Atemwegserkrankungen weitgehend abgeklärt werden (Diller 1990, 1991, 1997). Folgende obstruktive Atemwegserkrankungen werden unterschieden: 156

1315 5101 1301 4302

Isocyanate – Atemwegsobstruktion, Alveolitis – Hauterkrankung

Aromatische Nitro- und Aminoverbindungen

Schweißrauche

Alle Untersuchungen: 4.638.128

4301 4302

Berufskrankheiten nach BK-Listen-Nr.: (Anlage 1, BKV)

Obstruktive Atemwegserkrankungen – allergisierende Stoffe – toxisch-irritative Stoffe

Berufsgenossenschaftlicher Grundsatz

44.037

17.546

23.833 ?

54.868

Anzahl der Untersuchungen in 1996

207

90

29 647

176 207

213

99

24 713

146 213

BK-Anzeigen 1995 1996

Tabelle 1: Berufsgenossenschaftliche Grundsätze für arbeitsmedizinische Vorsorgeuntersuchungen.

59 [28,5]

33 [36,7]

15 [51,7] 153 [23,6]

54 [30,7] 59 [28,5]

57 [26,8]

36 [36,4]

17 [70,8] 127 [17,8]

54 [37,0] 57 [26,8]

BK-Anerkennung [%] 1995 1996

6.2 Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme

157

6 x

Immunologie

Unspezifische bronchiale Hyperreagibilität (UBH);

x Positive spezifische bronchiale Überempfindlichkeit (G 23), allergisierende Stoffe (IgE-vermittelt; BKV A4301), toxisch-irritative Stoffe (BKV A4302); x Isocyanat-Überempfindlichkeit der Atemwege (Alveolitis, G27; BKV A1315), immunologisch-humorale Mechanismen (IgE, IgG), immunologischzelluläre Mechanismen (T-Lymphozyten).

In Felduntersuchungen (Tab. 2) wurde für den sensibilisierenden Arbeitsstoff eine Auslöseschwelle erkannt (Porter et al. 1975). Die Erfahrungen lassen sich für den Isocyanat-Umgang zu einer DosisWirkungs-Beziehung für die Induktion einer bronchialen Überempfindlichkeit (Berufsasthma) wie folgt zusammenfassen: x Sensibilisierungsschwellen werden für die toxisch-irritativen und auch für die allergischen Formen in der Induktionsphase, sowie für die Auslösephase beobachtet (Van den Plas et al. 1993); x Die immunologischen Sensibilisierungsschwellen betragen für wiederholte Isocyanat-Expositionen etwa 20 ppb (Diller 1990); x Grundsätzlich genügt eine massive Überexposition, eventuell auch über die Haut, zur Sensibilisierung bzw. zur Induktion einer spezifischen bronchialen Überempfindlichkeit.

Tabelle 2: Dosis-Wirkungs-Beziehung bei der Induktion pulmonaler Sensibilisierung durch TDI bei Beschäftigten eines chemischen Großbetriebes (Porter et al. 1975). Beobachtungszeitraum

Durchschnittliche TDI-Exposition (ppb)

Inzidenz Isocyanat-AsthmaFälle pro Jahr

1957 1958 1959 1960 1961 1962 1963 1964 1965 1966 1967 1968 1969 1970 1971 1972 1973 1974

60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 50 50 20 20 4

4 3 3 1 2 3 1 3 1 1 1 1 2 1 2 0 0 0

158

ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb

kontinuierliche Reduktion der Expositionsspitzen

b

6.2

Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme

Der Soforttyp (Typ 1) IgE-vermittelter Sensibilisierungen wird primär über Allergene bzw. Haptene, d. h. insbesondere durch Addukte der Arbeitsstoffe mit körpereigenen Proteinen, ausgelöst. Inzwischen konnte in molekularbiologisch begleiteten Kasuistiken und Felduntersuchungen belegt werden, dass der Umfang der Protein-Addukte von Arbeitsstoffen vorzugsweise von der Beteiligung defizienter Stoffwechselenzyme abhängig ist (Lewalter und Neumann 1996, 1998). Die arbeits- und umweltmedizinische Risikobewertung hat die genetischen Polymorphismen von Schlüsselenzymen des Fremdstoff-Stoffwechsels zu berücksichtigen, bei denen mindestens 2 Allele in Frequenzen von jeweils über 1 % vorliegen (WHO-Empfehlung 1993): Hydrolasen (Phase I, detoxifizierend) – Cholinesterasen (ChE, AChE): Organophosphat-Stoffwechsel – Carboxylesterasen (CE): Pyrethroid–Stoffwechsel Oxygenasen (Phase I, toxifizierend) – Cytochrom-P450-Monooxygenasen – CYP 1A1: Aliphaten-, Olefin- und Aromaten-Stoffwechsel – CYP 2E1: Lösemittel-Stoffwechsel Transferasen (Phase II, detoxifizierend) – N-Acetyltransferasen (NAT1; NAT2): Aminoaromaten-Stoffwechsel – Glutathion-S-Transferasen (GST a, m, p, y): Ethylenoxid-, Acrylnitril-, Styrol-/Styroloxid-, Alkylhalogenid-, Isocyanat-Stoffwechsel – Glucuronidasen (UDPG): Phenol-Stoffwechsel Im IgE-spezifischen Stoffwechsel typischer Arbeitsstoffe werden die relevanten Human-Serum-Albumine-Adduktbildungen (HSA-Adduktbildungen) u. a. von den in Abbildung 5 folgenden polymorphen Stoffwechselenzymen beeinflusst (Lewalter und Neumann 1996, 1998).

Abbildung 5: IgE-relevanter Stoffwechsel. 4-Aminophenyl (4-ADP), Toluylendiamin (TDA), N-Acetyltransferase (NAZ), Glutathio-S-transferase (GST), Methylendianilin (MDA), Methylendiisocyanat (MDI), Toluylendiisocyanat (TDI), Naphthylen-1,5-diamin (NDA), Naphthylendiisocyanat (NDI).

159

6

Immunologie

6.2.4 Ziel der Untersuchung Im Folgenden werden die ersten Erfahrungen mit dem molekularbiologischen Konzept zur Prävention obstruktiver Atemwegserkrankungen vorgestellt: a) Diagnostische Bedeutung der durch Addukt-Antigene induzierten IgEAntikörper bei der Abklärung von Befindlichkeitsstörungen bis zu obstruktiven Atemwegserkrankungen; b) Abhängigkeit der Sensibilisierungsschwellen toxisch-irritativ oder allergisch wirkender Fremdstoffbelastungen von den individuellen Polymorphismen essentieller Stoffwechselenzyme. Zu (a): Der unsachgemäße Isocyanat-Umgang kann zu obstruktiven Atemwegserkrankungen führen. Hierbei können die sensibilisierenden Allergene über die folgenden Reaktionskaskaden (Abb. 6) gebildet werden (Lewalter 1998). Die beim Isocyanat-Umgang beobachteten Gesundheitseffekte werden nicht ausschließlich von den Isocyanaten selbst ausgelöst, sondern können auch von den im Allgemeinen beteiligten Lösemitteln und Confounders verursacht werden (Lewalter 1998). Potenzielle Symptome adverser Gesundheitseffekte der Isocyanate und Confounders sind für:

Abbildung 6: Isocyanat-Haptene. Glutathion (GSH), Glutathion-Transferasen (GST), Isocyanat-Rest (R).

160

6.2

Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme

Isocyanate (aromatische Mono- und Diisocyanate): primäre Haut- und Schleimhaut-Reizung sowie Sensibilisierung; allergische Reaktion bei sensiblen Personen. (Thio-)Carbamate (Isocyanate und (Sulf)hydr(ox)yl-Gruppen): Kopfschmerz, visuelle Störungen, Erbrechen, Cyanosen, Zuckungen, Miosis, Krämpfe, Atemlähmung, etc.; rascherer Anstieg und Abfall der Cholinesterase-Hemmung als bei Organophosphaten; Einfluss auf Nierenfunktionen. Carbamide (Isocyanate und Amino-Gruppen): erhöhte MetHb-Werte, moderate Haut- und Schleimhaut-Reizung, Sensibilisierung sensibler Personen, Störung der Mobilität. Lösemittel: vermehrte Aktivität von Leberenzymen im Plasma, neurologische Dysfunktionen. Alkohol: vermehrte Aktivität von Leberenzymen im Plasma, neurologische Dysfunktionen. Die HSA-Erholungsraten (Tab. 3) belegen den signifikanten Einfluss spezifischer Vorbelastungen auf die individuelle Sensibilisierungsschwelle. In der folgenden Kasuistik wird deutlich, dass nicht nur der Umfang der akuten HSA-Adduktbildung, sondern insbesondere der Zeitraum ihrer Anwesenheit (Bioverfügbarkeit) im Plasma des Verunfallten für dessen spätere Sensibilisierung (Memory-Effekt; RAST-Werte i 2,0 RU) verantwortlich sein kann. Im Allgemeinen wird die natürliche biologische Halbwertszeit des HSA von 19 Tagen durch die Adduktbildung mit Arbeitsstoffen signifikant verkürzt, wie aus dem Verlauf der HSA-Addukt-Kurve (Abb. 7) ersichtlich ist (Lewalter und Neumann 1996, 1998): Zur Prävention Arbeitsstoff-bedingter Sensibilisierungen sollten in der Praxis folgende Hinweise beachtet werden: x HSA-Addukte mit Fremdstoffen haben signifikant kürzere biologische Halbwertszeiten als freies HSA, x die Regenerierung von weniger als 50 % an freiem HSA aus HSA-Addukten innerhalb von bis zu 16 Stunden ohne Arbeitsstoff-Umgang wird als individueller Suszeptibilitäts-Marker IgE-vermittelter Sensibilisierungen gewertet.

Durch Berücksichtigung der HSA-Erholungsrate in der arbeitsmedizinischen Vorsorge des Isocyanat-Umgangs nach G 27 konnten die beginnenden obstruktiven Atemwegserkrankungen von elf zunächst noch unauffälligen MDI-Exponierten frühzeitig erkannt (Erholungsraten ca. 20 %) und deren Ausmaß durch rechtzeitige Isocyanat-Karenz deutlich reduziert werden (Lewalter 1998) (Tab. 4). Seit 1996 wird der industrielle Isocyanat-Umgang nur noch bei Mitarbeitern mit HSA-Erholungsraten über 50 % toleriert. In der Folge wurden keine obstruktiven Atemwegserkrankungen mehr beobachtet.

161

162

normal normal normal normal erniedrigt

Vor Intoxikation Intoxikation 1 Tag danach 5 Monate später 1 Jahr später

119,5 117,3 136,6 128,1 135,8

1,5 1,4 1,4 1,9 2,1

IgE-Befunde Gesamt p-FPIPU spezifisch RU 310 100.000 900 I 100 280

HSA-Addukte Schichtende ng p-FPI/I Blut 230 40.000 570 I 100 210

vor folgender Schicht ng p-FPI/I Blut

Abbildung 7: Bewertung der akuten und kumulativen Anteile im Arbeitstoff-HB-Addukt.

Lungenfunktion

Untersuchungszeitpunkt

Tabelle 3: Risikobewertung einer p-Fluorphenylisocyanat-Intoxikation (p-FPI).

26 60 37 0 25

HSAErholungsrate [%]

6 Immunologie

eingeschränkt

normal

25 [11,8]

3 [1,4]

normal

11 [5,2]

normal

eingeschränkt

17 [8,1]

183 [86,7]

normal

Lungenfunktion

183 [86,7]

N [%]

Personen

186 (57–1840)

265 (48–2340)

71 (0,5–910)

201 (64–230)

183 (57–1980)

73 (0,5–1130)

PU

IgE-Spiegel Gesamt

4,5 (2,5–7,9)

3,8 (2,2–8,5)

1,1 (0,5–1,9)

2,8 (2,1–8,1)

3,1 (2,4–7,6)

1,2 (0,7–1,9)

RU

MDIspezifisch

870 (130–3100)

910 (150–4800)

390 (I10–890)

850 (90–3870)

780 (120–4300)

430 (I10–1320)

750 (110–2900)

790 (130–4100)

130 (I10–340)

680 (84–2950)

630 (95–3700)

170 (I10–620)

18

13

67

20

19

60

HSA-Addukte nach 3 Arbeitstagen HSA-ErhoZu Beginn der Ende der lungsrate* nächsten Schicht (Recovery Schicht rate) [%] ng MDA/l Blut ng MDA/l Blut

* Prozent freigesetztes HSA während der 16-stündigen Erholungszeit (expositionsfreie Zeit).

1996

1995

Jahre

4,1 (1,8–6,9)

4,7 (1,5–7,3)

1,5 (I1,0–2,3)

5,2 (1,5–8,3)

3,4 (1,7–5,9)

1,7 (I1,0–2,5)

ng/l Blut

4-ADP

Tabelle 4: Biomonitoring von Arbeitern mit MDI-Umgang in 1995 und 1996. Der durchschnittliche MAK-Wert betrug 1995 24 mg/m3 und 1996 17 mug/m3.

6.2 Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme

163

6

Immunologie

In der Isocyanatprävention sollten darüberhinaus folgende Beobachtungen berücksichtigt werden (Diller 1990, 1991, 1997): x die Allergen- (Asthmogen-) Konzentration muss stets unter der Sensibilisierungsschwelle liegen, x

zusätzlich ist auf guten Hautschutz zu achten,

x

Unterbindung adjuvanter Effekte in der Arbeitsplatzluft,

x Vermeidung Zigarettenrauch-bedingter IgE-Bildung pagne),

(Antirauch-Kam-

x Atopiker werden durch hochmolekulare Allgergene stärker gefährdet als Nicht-Atopiker, x in Abhängigkeit von der Atopie-Ausprägung und dem Ausmaß der Allergenexposition sind spezieller Atemschutz, d. h. engmaschige Überwachungsuntersuchungen oder Arbeitsstoff-Karenz, zu veranlassen (Diller 1997).

Dabei ist zu beachten, dass auch die Sensibilisierungsschwelle von zahlreichen Faktoren beeinflusst werden kann (Diller 1997): endogene Disposition (Atopiker) (Gubian und de Zotti 1994), Rauchergewohnheiten (Raucherasthma) (Newman-Taylor 1995), x Virusinfekte des Atemtraktes (Hemmung zellulärer Toleranzmechanismen) (Holt 1989), x Adjuvantien wie Lösemittel, Amine, inerte Stäube, Ozon, etc. (konzentrations-abhängig, mit signifikantem NOEL) (Goren und Hellmann 1988), x Vorbestehende Sensibilisierungen erhöhen Prävalenz aktueller Sensibilisierungen (Kersten und Wahl 1994). x x

6.2.5 Immunmodulationen durch Arbeitsstoffe Außer den Isocyanaten können weitere Arbeitsstoffe im Stoffwechsel ProteinAddukte bilden, deren Umfang vom Polymorphismus der beteiligten Enzyme geprägt ist (Tab. 5). Bei langsamen Acetylierern werden neben erhöhten Adduktmengen auch signifikant erhöhte IgE-RAST-Werte beobachtet (Lewalter 1994). Die molekularbiologische Erklärung zeigt Abbildung 8. Dabei wird der Aminoaromaten-Stoffwechsel nicht nur von dem Polymorphismus der NAT1 und NAT2, sondern auch von dem der G-6-PDH (Tab. 6) beeinflusst (Lewalter und Neumann 1996, 1998). Wie Tabelle 6 zeigt, führen defiziente G-6-PDH-Aktivitäten bei schnellen Acetylierern zu erhöhten Hintergrundbelastungen an Met-Hb-, 4-ADP164

I 1,0 I 1,0

HSA

I 0,1 I 0,1

10

20 1 4 70

I 0,1 I 0,1

4,3

15,8 9,5 8,3 37,5

mg 3,4-Dichloranilin/l Blut

Hämoglobin

schnell langsam

schnell

langsam schnell schnell langsam

25 47

130 28 44 480 (Symptome!) 31

AcetyliererIgE-PRIST Phenotyp 60 % schnell/ PU 40 % langsam

1,1 1,4

1,5

3,9 1,7 1,2 5,2*

RU

IgE-RAST

1

PRIST i 150 entspricht positiver Befund, 2 RAST I 2,0 RU entspricht negativer Befund, RAST 2,0–2,9 RU entspricht Grenzbereich, RAST i 3,0 RU entspricht negativer Befund, 3 im RAST-Hemmtest validiert.

I 1,0 I 1,0

40

510

5

Normalwerte 10 Personen 10 Personen

Freies Amin g Kreatinin

40 2,3 5,7 230

Gesamtes Amin mg 3,4-Dichloranilin

Harn

40 100 170 250

1 2 3 4

Personen

Tabelle 5: Korrelation zwischen der 3,4-Dichloranilien-Harnausscheidung und der Protein-Adduktbildung nach 3,4-Dichlorphenylisocyanat-Intoxikation von Anlagefahrern.

6.2 Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme

165

6

Immunologie

Abbildung 8: Carbamid-Addukte. N-Acetyltransferase (NAT), Cytochrom-P450 II E1 (CYP), Isocyanat-Rest (R). Tabelle 6: G-6-PDH-Abhängigkeit der Met-Hb- und 4-ADP-HSA-Addukt-Hintergrundbelastung bei 292 schnellen Acetylierern ohne industriellen AminoaromatenUmgang. Nichtraucher (%)

G-6-PDH U

Met-Hb (%)

HSAAddukte ng 4-ADP/l Blut

IgE-Gesamt PU

IgE-RAST RU

282 (97) 7 (2) 3 (1)

130 e 10 70 e 8 0

0,7 (0,1–1,1) 1,3 (0,9–2,7) 2,1 (1,4–4,3)

1,3 (0,5–2,1) 3,5 (2,4–5,1) 7,3 (5,5–9,8)

38 (1–72) 55 (8–97) 81 (34–112)

1,1 (0,9–1,2) 1,3 (1,1–1,7) 1,6 (1,4–1,9)

HSA-Addukt- und IgE-Werten. Auch die Cr(VI)-Belastungen können die immunologische Abwehr beanspruchen (Abb. 9). In Abhängigkeit vom individuellen Cr(VI)-Reduzierer-Status werden signifikante IgE-Induktionen beobachtet (Lewalter 1994, Lewalter und Neumann 1996, 1998). Der Cr(VI)-Reduzierer-Status inhibiert darüber hinaus über die Interleukin-2-Produktion die Proliferation und Differenzierung der B- und T-Lymphozyten (Tab. 7). Unter Chrom(VI)-Belastungen dürfte bei den schwachen Cr(VI)-Reduzierern die geringere Aktivität der zytotoxischen T-Lymphozyten zu einer verminderten Präsenz der Makrophagen und damit zu einer verzögerten bzw. gehemmten zellulären Abwehr führen (analog zu Kucharz und Sierakowski 1987). 166

Abbildung 9: Vergleich spezifischer Biomarker bei starken und schwachen Chrmo(VI)-Reduzierern unter Dichromat-Expositionen bis zum halben TRK-Wert sowie bei unbelasteten Kontrollen.

6.2 Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme

167

6

Immunologie

Tabelle 7: Hemmung der Proliferation der T-Lymphozyten sowie ihrer Interleukin2-Ausschüttung durch Natriumdichromat in Blutproben starker und schwacher Chrom(VI)-Reduzierer. PhytohaemagglutininStimulation Normal-Status – Mitogen-Stimulation þ þ þ þ

mM Cr (VI) pro Probe

% T Zell-Proliferation Cr(VI)-Reduzierer stark schwach

% IL-2 Produktion Cr(VI)-Reduzierer stark schwach

–

–

–

34

20

– 0,1 10 100

100 103 98 0,3

100 74 34 0

100 86 55 34

100 38 21 13

Tabelle 8: 8-Hydroxy-desoxy-Guanosin- (8-HO-dG) Ausscheidung nach Umgang mit Ozon-emittierenden Messgeräten (AM: bis 0,05 ppm). Personen

Harnproben

nMol 8-HO-dG/ g Creatinin

Gesamt-IgE kPU/l

IL-2 mg/L

81 Frauen 25 Männer Kontrollen 50 Frauen 50 Männer

324 101

17.9 (6.1–34.0) 25.3 (8.6–42.7)

95 (21–168) 72 (34–91)

163 (115–430) 151 (104–310)

50 50

7.9 (5.1–9.0) 9.2 (8.5–10.6)

I 23 (I 1–45) I 20 (I 1–38)

189 (125–640) 180 (135–450)

Abbildung 10: Die interindividuelle Variabilität im Alkohol-Stoffwechsel (CYP 2E1(MAOS ¼ microsomales Alkohol-oxidierendes System)

168

6.2

Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme

Tabelle 9: Konsequenzen der Alkohol-bedingten O6-MeGT-Hemmung auf den Umfang der HSA- und DNA-Methylierung sowie der IgE-Spiegel (Durchschnittswerte) Personen

Ethanol im Blut ‰

Human Serum Albumin N-MethylAsparaginsäure ng/l Blut

Lymphozyten O6-MethylGuanosin mMol/Mol Guanosin

IgE-RAST RU

Beschwerden (subjektiv)

Raucher (N ¼ 21) (u. a. Hydrazin – induzierte Methylierung)

0 0,8 (0,2–1,5)

87 112

0,7 2,5

1,2 (1,0–1,4) 1,9 (1,3–3,7)

keine unspezifische; gestörtes Allgemeinbefinden

Nichtraucher (N ¼ 27) (u. a. endogene Methylierung)

0 0,8 (0,3–1,4)

65 93

0,4 1,3

0,8 (0,5–1,0) 1,6 (1,1–2,3)

keine unspezifische; gestörtes Allgemeinbefinden

Ähnliche Effekte werden auch durch Ozon-Belastungen induziert, wobei die Interleukin-2-Produktion bei Männern offenbar deutlich stärker inhibiert wird als bei Frauen (Lewalter 1994, Lewalter und Neumann 1996, 1998). Die Tabelle 8 zeigt die Dämpfung der Vermehrung und Differenzierung aktivierter B- und T-Lymphozyten nach Ozon-Belastung (persistierende Infektionen?). Etwa 15 Prozent der Europäer leiden als Folge der polymorphen CYP2E1 unter einer durch die intermediäre Acetaldehyd-Kumulation ausgelösten Ethanolunverträg-lichkeit (Lewalter 1994, Lewalter und Neumann 1996, 1998). Der intermediär gebildete Acetaldehyd führt über eine Hemmung verschiedener methylierender Enzyme nicht nur zu einem Anstieg des gentoxischen O6-Methylguanosin in den Zellen, sondern über eine erhöhte HSAMethylierung auch zu einer signifikanten IgE-Induktion, deren Umfang über den spezifischen RAST-Test bewertet werden kann. Die Tabelle 9 zeigt die Ethanol-bedingte Stimulation der individuellen IgE-Spiegel im Plasma von Rauchern und Nichtrauchern.

169

6

Immunologie

Tabelle 10: Immundiagnostische Parameter. Parameter

Material

Funktion

Bio-Marker

IL-2

Plasma

Proliferation und Differenzierung von T-Zellen, B-Zellen und Thymozyten Freisetzung von Cytokinen aus T-Zellen (CD4-Zellen) Aktivierung von cytotoxischen T-Zellen Regulation der Lymphozytenfunktion

Indikator individueller Immunmodulationen

IL6

Plasma

Induktion der Differenzierung von B-Zellen in antikörperproduzierende Plasmazellen Förderung der Produktion der Antikörper IgM, IgG und IgA Steigerung der Phagozytosefähigkeit von Monocyten und Makrophagen Induktion der Akute-PhaseProteinen in Hepatocyten Zusammen mit IL-1 Wirkung auf die Proliferation und Cytokinproduktion von T-Helferzellen Zusammen mit IL-2 Wirkung auf die Teilung und Differenzierung von cytotoxischen T-Zellen Gemeinsam mit IL-3 Anregung der Stammzellen zur Proliferation

Induktion der antigenspezifischen Immunantwort durch Stimulation der B-Zellen Inflamatorische Reaktionen

TNFa (TumorNekroseFaktor)

Plasma

Steigerung der Phagozytose und Cytotoxizität bei Monozyten Steigerung der Expression von Endothelzellen und Granulozyten Verstärkung der Expression von MHC-Klasse-1-Molekülen auf Fibroblasten und Endothelzellen Zusammen mit IL-1 Unterstützung der Aktivierung antigen stimulierter T-Zellen und der Regulation der Antikörperproduktion Induktion der Bildung von Cytokinen Nekrosen in Tumoren

Essentiell für intakte Immunantwort erforderlich Hinweis auf inflammatorische und antikanzerogene Wirkung des Immunsystems Kontrolle der Funktionstüchtigkeit des Immunsystems

170

6.2

Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme

6.2.6 Erfassung der immunologischen Kompetenz Da das Immunsystem für die Eliminierung von eingedrungenen Erregern und Arbeitsstoffen von essentieller Bedeutung ist, kommt der Erfassung seiner Funktionsfähigkeit eine große prognostische Bedeutung zu. In jüngerer Zeit ist es möglich, derartige Funktionstests wie die IgE- und IgG-Bestimmung auch gut standardisiert und damit allgemein vergleichbar durchzuführen (Baenkler 1992, Bauer 1991, Dean et al. 1991, Lewalter 1994, Lewalter und Neumann 1996, 1998). Bei den spezifischen IgE-RAST-Tests scheitert die Validierung bisher an den nicht-kommerziell erhältlichen Allergenen. Dabei sollte jeder positive IgE-RAST-Test durch einen spezifischen Hemmtest abgesichert werden (Karol 1981, 1992, Lewalter 1994, Vorlaender 1980). Neben diesen im Allgemeinen bekannten immunologischen Biomarkern werden einige weitere wertvolle Parameter und ihre wichtigsten Indikationen in Tabelle 10 zusammengefasst (Baenkler 1992, Schleicher 1997, Vorlaender 1980): Wegen der zunehmenden diagnostischen Bedeutung dieser Immunparameter zur Überwachung der Funktionstüchtigkeit des Immunsystems ist dringend geboten, die zu ihrer Bestimmung eingesetzten Testverfahren nach den analytischen Kriterien der Deutschen Forschungsgemeinschaft zu validieren.

6.2.7 Zusammenfassung und Ausblick Reaktivstoff-spezifische IgE-Antikörper können im RAST erfaßt und quantifiziert werden. Im Allgemeinen werden Korrelationen zwischen der Menge und Halbwertszeit der HSA-Addukte dem Polymorphismus essentieller Stoffwechselenzyme, positiven RAST-Ergebnissen sowie den klinischen Symptomen beobachtet. Zur Prävention der immunologisch induzierten ReaktivstoffÜberempfindlichkeit des Bronchialsystems werden humorale (IgE, IgG) und zelluläre (T-Lymphozyten) Mechanismen mit Sensibilisierungsschwellen von etwa 20 ppb (Isocyanate) diskutiert. Signifikant erhöhte IgE-Befunde ohne gesicherten Fremdstoff-Umgang lassen sich häufig als Konsequenz defizienter Stoffwechselenzyme interpretieren. Die zur Bestimmung der Immunparameter eingesetzten Testverfahren sind nach den analytischen Kriterien der Deutschen Forschungsgemeinschaft zu validieren.

171

6

Immunologie

Literatur Baenkler, H.-W.: Checkliste Immunologie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1–243 (1992). Bauer, P. C.: Obstruktive Atemwegserkrankungen durch allergisierende Stoffe, in: Konietzko, J., Dupuis, H. (Hrsg.): Handbuch der Arbeitsmedizin, 4. Erg. Lfg. 3/91, Kap IV-5.4, Seiten 1–25 (1991). Dean, J. H., Murray, M. J.: Toxic responses of the immune system, in: Amdur, M. O., Doull, J., Klaasen, C. D. (eds.): Casarett und Doull’s Toxikologie: the basic science of poisons, 4. Edition, Pergamon Press, New York, 282–333 (1991). Diller, W. E.: Arbeitsmedizinische Gesichtspunkte bei der Begutachtung des „Isocyayanat-Asthmas“, Arbeitsmed. Sozialmed. Präventivmed., 26, 393–398 (1991). Diller, W. E.: Quantitative Noxenabhängigkeit beim Berufsasthma, Allergologie, 13, 140–144 (1990). Diller, W. E.: Umwelteinflüsse bei der Induktion des Berufsasthmas aus der Sicht des Arbeitsmediziners, Zbl. Arbeitsmed., 47, 206–209 (1997). Goren, S., Hellmann, W.: Prevalence of respiratory symptoms and diseases in schoolchildren living in polluted and in a low polluted area in Israel, Environ. Res., 45, 28–35 (1988). Gubian, F., De Zotti, R.: Smoking occupation, and allergic lung disease, Proc. Ann. Meeting Europ. Respir. Soc., Nizza, 82 (1994). Holt, P. G.: Environmental pollutants as co-factors in IgE production, Current Opinion in Immunology, 1, 643–646 (1989). Karol, M. H.: Occupational asthma and allergic reaction to inhaled compounds, in: Miller, K., Türk, J., Nicklin, S. (eds.): principles and practice of immunotoxicology, Blackwell Scientific Publication, London, 228–241 (1992). Karol, M. H.: Survey of industrial workers for antibodies to toluene diisocyanate, J. Occup. Med., 23, 741–747 (1981). Keller, R.: Immunologie und Immunpathologie: Eine Einführung, Gerorg Thieme Verlag, Stuttgart, 3. Auflg. 3–408 (1987). Kersten, W., van Wahl, P. G.: Allergische Atemwegserkrankungen in der holzverarbeitenden Industrie, Allergologie, 17, 55–60 (1994). Kirchner, H., Kruse, A., Neustock, P., Rink, L.: Cytokine und Interferone: Botenstoffe des Immunsystems, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 11–295 (1993). Kucharz, E. J., Sierakowski, S. J: Immunotoxicity of chromium compounds: effect of sodium dichromate on the T cell activation in vitro, Arhiv za higigenu rada i toksikol, 33, 239–243 (1987). Lewalter, J., Neumann, H.-G.: Biologisches Arbeitsstoff-Toleranzwerte (Biomonitoring) Teil VIII: Bewertung der Hintergrundbelastungen bei beruflich nicht-exponierten Personen, Arbeitsmed. Sozialmed. Umweltmed., 31, 418–432 (1996); Teil XII: Die Bedeutung der individuellen Empfindlichkeit beim Biomonitoring, Arbeitsmed. Sozialmed. Umweltmed., 33, 352–364 (1998); Teil XIII: Die Bedeutung von Referenzwerten für die Bewertung von Fremdstoffbelastungen, Arbeitsmed. Sozialmed. Umweltmed., 33, 388–393 (1998). Lewalter, J., Steinmann-Steiner-Haldenstätt, W.: Untersuchung der molekularbiologischen Konsequenzen des 4.4l-Methylenbiphenyldiisocyanat (MDI)-Umgangs, in: Kessel, R. (Hrsg.), Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft für Arbeitsmedizin und Umweltmedizin e. V.: 34. Jahrestagung, Wiesbaden, Gentner-Verlag, Stuttgart, 329–334 (1994). Lewalter, J.: Monitoring und immunologische Bedeutung von Schadstoffaddukten, Berichte der Österreichischen Gesellschaft für klinische Chemie (ÖGKC), 17, 9–18 (1994).

172

6.2

Immunologische Effekte polymorpher Schlüsselenzyme

Lewalter, J.: Immunologische Aspekte bei der Verarbeitung isocyanathaltiger Produkte im Bereich Tiefbau, in: Dokumentation der 4. Erfurter Tage, Monade-Verlag, Leipzig, 183–200 (1998). Neumann, H.-G. Immunsuppressiva, in: Forth, W., Henschler, D., Rummel, W., Starke K. (Hrsg.): Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie: Entstehung und Behandlung von Tumoren, BI Wissenschaftsverlag, Mannheim, 6. Auflg., 744–746 (1992). Newman-Taylor, A. J.: Environmental determinants of asthma, Lancet, 345, 296–299 (1995). Playfair, J. H. L., Baron, D.: Immunologie, Blachwell Wissenschafts-Verlag, Berlin (1995). Porter, C. V., Higgins, R. L., Scheel, L. D. A: Retrospective study of clinical, physiological and immunologic changes in workers exposed to toluene diisocyanates, Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 36, 159–165 (1975). Reinke, P., Döcke, W.-D., Kox, W., Zuckermann, H., Volk, H.-D.: Neue Entwicklungen in der Immundiagnostik intensivmedizinischer Patienten, Dtsch. Med. Wschr., 124, 1527–1529 (1999). Schleicher, P.: Grundzüge der Immundiagnostik und –therapie, Hippokrates Verlag, Stuttgart, 2. Auflg., 11–206 (1997) Van den Plas, O., Cartier, A., Gliezzo, H., Malo, J.-L.: Response to isocyanates, Am. Rev. Respir. Dis., 148, 226–235 (1993). Vorlaender, K. O., Diagnostik unter Verwendung immunologischer Methoden, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 169–310 (1980).

173

7 Epidemiologie 7.1 Erfassung der Exposition in epidemiologischen Studien Kurt Ulm*

Die Erfassung der Exposition ist nach wie vor eine der Schwachstellen epidemiologischer Studien. Im Bereich der Arbeitsmedizin liegen häufig keine Luftmesswerte vor. Daher wird die Exposition abgeschätzt. Eine Konsequenz dieser unpräzisen Erfassung der Exposition ist eine verringerte Korrelation zwischen Dosis und Wirkung. Ein weiteres Problem ist die adäquate Beschreibung der Exposition durch eine geeignete Maßzahl. Die Erfassung der äußeren Exposition mittels Biological Monitoring könnte – zumindest in einigen Situationen – eine Verbesserung darstellen. Aber auch hier sind die geeigneten Messzeitpunkte zu diskutieren sowie die Maßzahlen zur Beschreibung der Exposition zu definieren. Beispiele werden präsentiert.

7.1.1 Einleitung Das Ziel epidemiologischer Studien liegt in der Untersuchung von Assoziationen zwischen einem Faktor F und einer Krankheit K. In vielen Studien wird die Exposition gegenüber einem Faktor häufig nur in ja oder nein unterteilt. Dies gilt z. B. für den Faktor Rauchen, aber auch für Arbeitsstoffe. Damit stellt die Gruppe der Exponierten eine Mischung aus höchst unterschiedlichen Personen dar. Für die Exposition gegenüber einem Arbeitsstoff wird meist eine Mindestanforderung gestellt, z. B. Expositionsdauer über 1 Jahr. Das Ergebnis, häufig dargestellt in Form des relativen Risikos, ist dann von der Verteilung der Exposition abhängig. Ist die Mehrzahl der Arbeiter gering exponiert, so wird das relative Risiko um 1,0 liegen. In diesem Fall lässt sich nicht entscheiden, ob keine Assoziation vorliegt oder wegen der geringen Exposition kein Effekt nachweisbar ist. Ein Beispiel hierfür ist Trichlorethylen (TRI). Es liegen mehrere Kohortenstudien vor, in denen die Inzidenz

* Institut für Medizinische Statistik und Epidemiologie, Technische Universität München, Ismaninger Str. 22, 81675 München

174

7.1

Erfassung der Exposition in epidemiologischen Studien

bzw. die Mortalität von TRI-exponierten Arbeitern mit der in der Bevölkerung als Surrogat für Nicht-Exponierte verglichen wurde. Die Ergebnisse unterscheiden sich deutlich. Die relativen Risiken liegen zwischen 1,0 (Antilla et al. 1995, Axelson et al. 1994) und um bzw. über 8,0 (Henschler et al. 1995, Vamvakas et al. 1998). Eine Erklärung für diese Diskrepanz könnte in der Höhe der Exposition liegen. In den Studien ohne erhöhte Risiken lag die Exposition unter 20 ppm, während in den Studien mit deutlich höheren Risiken vermutlich Werte über 1000 ppm vorherrschten. Es lagen keine Messwerte vor. Daher kann die Exposition in diesen Studien nur geschätzt werden.

7.1.2 Festlegung der Exposition Die Abschätzung der Exposition ist eine der Schwachstellen der Epidemiologie. Auf Grund der langen Latenzzeiten bis zum Auftreten der chronischen Krankheiten ist die Exposition in den weiter zurückliegenden Jahren von entscheidender Bedeutung. Meist liegen für diesen Zeitraum jedoch keine zuverlässigen Messdaten vor. In diesen Fällen wird häufig eine so genannte Job-Exposure-Matrix aufgestellt (Checkoway et al. 1989). Hier werden den verschiedenen Tätigkeiten relative Expositionen, auch Scores oder Grades genannt, zugeordnet. Diese Scores werden meist nach der Kalenderzeit noch differenziert. Mit diesen Scores wird nun versucht, die Exposition pro Arbeiter zu beschreiben. Ein Ansatz ist die so genannte kumulative Exposition, in denen die Scores mit der entsprechenden Dauer der Tätigkeit multipliziert und dann aufaddiert werden. Für die Auswertung wird dann diese kumulative Exposition in verschiedene Intervalle unterteilt. Ein Beispiel ist die Analyse der TCDD-Exposition im Hinblick auf das Auftreten von korona-

Tabelle 1: Ergebnisse der Analyse der Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen TCDD und dem Auftreten von koronarer Herzerkrankung (ICD 9; 410-414) (nach Steenland et al. 1999), n ¼ 3538 Arbeiter. Kumulierte Exposition

Beobachtete Anzahl von Sterbefällen

Erwartete Anzahl von Sterbefällen

StandardMortalitätsrate (Beob./Erw.)

95 % Konfidenzintervall

I 19 19–I 139 139–I 581 581–I 1.650 1.650–I 5.740 5.740–I 20.200 i 20.200 Summe

29 39 45 42 48 44 43 290

31,18 39,00 42,86 43,30 43,64 36,67 33,59 270,24

0.91 1,00 1,05 0,97 1,10 1,20 1,28 1,07

0,62–1,34 0,71–1,37 0,77–1,40 0,70–1,31 0,81–1,46 0,87–1,61 0,93–1,72 0,95–1,20

175

7

Epidemiologie

ren Herzerkrankungen (Steenland et al. 1999). Die kumulative Exposition wurde in 7 Klassen unterteilt. In Tabelle 1 ist das Ergebnis der Analyse dargestellt. Es ist nur ein geringer Anstieg des Risikos mit zunehmender Exposition zu erkennen. Eine der wesentlichen Fragen bei dieser Analyse ist die Art der Quantifizierung der Exposition. Beschreibt die kumulative Erfassung die Exposition im richtigen Ausmaß? Als Beispiel dient hierfür die Analyse einer Studie, in der ein Zusammenhang zwischen Schwefelsäure und Larynx-Karzinom untersucht wurde (Soskolne et al. 1984). In dieser Fall-Kontrollstudie wurden 43 Patienten mit einem Larynxkarziom und 151 Kontrollen erfasst. Die Exposition der Schwefelsäure wurde qualitativ über drei Kriterien erfasst, die Konzentration, die Häufigkeit der Exposition und die Sicherheit der Erfassung (Soskolne et al. 1992). Alle drei Kriterien hatten jeweils vier Ausprägungen von 0–3. Anhand dieser drei Kriterien wurden fünf Maßzahlen berechnet die kumulative Exposition (CEI), die durchschnittliche Exposition (MG), die maximale Exposition (HG), der time-weighted average (TWA) und der Expositionsdauer (TTE). Die beiden Maßzahlen MG und TWA unterscheiden sich im Nenner. Bei MG wird die kumulative Exposition durch die Expositionsdauer, bei TWA durch die gesamte Beschäftigungsdauer dividiert. Alle fünf Maßzahlen wurden in drei Klassen unterteilt (no or low, moderate, high). Tabelle 2 zeigt das Ergebnis der Analyse dieser fünf Maßzahlen. Bei der Berechnung der Odds-Ratios (OR) wurden Alkoholkonsum, Rauchverhalten sowie einige Begleiterkrankungen berücksichtigt. Mit zwei der fünf Maßzahlen ist ein deutlich positiver Zusammenhang nachweisbar (MG und HG). Mit den übrigen drei Maßzahlen zeigt sich kein oder ein negativer Einfluss der Schwefelsäure. Hier drängt sich die Frage nach der richtigen Maßzahl auf. Die Wahl kann von Fall zu Fall durchaus variieren. Die Erklärung für die z. T. gravierenden Unterschiede ist durch die Auswahl der Kontrollen zu erklären. Die Beschäftigungsdauer war ein Kriterium. Daher sind alle Maßzahlen, in denen die Dauer direkt eingeht, für die Bewertung nicht zu verwenden. Die beiden Maßzahlen MG und HG sind daher für die Frage einer Assoziation zwischen Schwefelsäure und LarynxKarzinom besser geeignet. Es gibt auch andere Studien, in denen die Ergebnisse der Analyse der verschiedenen Maßzahlen zu ähnlichen Ergebnissen führen (Ulm et al. 1999). Es sind Situationen denkbar, in denen die maximale bzw. die durchschnittliche oder auch die kumulative Exposition geeignet sind. Nur derzeit sind keine Auswahlkriterien bekannt. Problematisch bei diesen Analysen, vor allem bei Verwendung der kumulativen Exposition, ist die Zuordnung der Arbeiter in die verschiedenen Klassen. Im Laufe seines Arbeitslebens durchwandert ein Arbeiter die verschiedenen Expositionsklassen. So verbringt z. B. ein Arbeiter der höchsten Expositionskategorie einen Teil seiner Zeit in jeder Kategorie. Ein Zuwachs kann nur dann erfolgen, wenn er gesund genug ist für eine weitere Tätigkeit. Die höheren Expositionskategorien stellen daher eine Selektion dar, was den Nachweis einer Dosis-Wirkungsbeziehung erschwert. Es gibt hierfür Aus176

7.1

Erfassung der Exposition in epidemiologischen Studien

Tabelle 2: Odds-Ratios (OR) und 95 % Konfidenzintervalle (95 % KI) für die verschiedenen Maßzahlen zur Untersuchung eines Zusammenhangs zwischen einer Exposition gegenüber Schwefelsäure und dem Auftreten von Tumoren des oberen Atemtrakts (Suarez-Almazor et al. 1992). Maßzahl CEI no or low moderate high MG no or low moderate high HG no or low moderate high TWA no or low moderate high TTE no or low moderate high a b

Fälle

Kontrollen

ORa

95 % KI

11 22 10

25 94 32

0,58 0,70

0,22–1,50 0,22–2,18

4 24 15

32 92 27

2,89 5,20b

0,74–11,27 1,23–22,09

3 37 3

27 113 11

4,69 b 2,40

1,03–21,33 0,29–20,15

10 24 9

26 92 33

0,67 0,59

0,27–1,67 0,19–1,80

9 27 7

27 89 35

1,15 0,55

0,43–3,10 0,17–1,74

Vergleich mit niedrigster Expositionkategorie. statistisch signifikant (p I 0,05).

wertungsansätze, die jedoch auf Grund ihrer Komplexität noch zu wenig Anwendung finden (Robins 1987). Eine erste Verbesserung der Beschreibung der Exposition bieten Messwerte. Hier handelt es sich meist um die Ergebnisse von stationären Messungen. Diese stationären Messungen gelten meist für einen Arbeitsbereich und beschreiben die Exposition eines bestimmten Arbeiters immer noch nicht präzise genug. Eine deutliche Verbesserung bieten die personenbezogenen Messungen. Damit lässt sich die äußere Belastung am besten erfassen. Je genauer die Belastung beschrieben werden kann, um so besser lässt sich eine Beziehung zur Wirkung nachweisen. Der Korrelationskoeffizient wird in Abhängigkeit vom Ausmaß der Ungenauigkeit immer kleiner. Diese personenbezogenen Messungen sind jedoch sehr aufwendig und werden nicht routinemäßig durchgeführt. Daher wurde dieses Verfahren zur Erfassung der Exposition bisher nur begrenzt eingesetzt. Beispiele sind z. B. Radon und elektromagnetische Felder. All die erwähnten Ansätze sind geeignet, die äußere Exposition zu beschreiben. Offen ist jedoch, ob damit auch wirklich die Belastung erfasst wird. In einigen Studien wurde daher der Versuch unternommen, die innere Belastung mit der Wirkung zu korrelieren. 177

7

Epidemiologie

7.1.3 Erfassung der Exposition mittels Biological Monitoring In einigen wenigen Situationen kann die innere Belastung als Maß für die Exposition verwendet werden. Ein Beispiel hierfür ist TRI. In den skandinavischen Ländern wird den Arbeitern von den Betrieben seit 1955 ein Biological Monitoring angeboten, die gegenüber TRI exponiert sind. Hier liegen also besonders günstige Umstände vor. Die Messwerte reichen weit zurück und beschreiben nicht nur die heutigen Verhältnisse. Aber auch hier treten die gleichen Probleme auf, wenn es darum geht, die Messwerte geeignet zusammenzufassen. So schreiben z. B. Axelson et al. (1994), dass sowohl die Anzahl der Messungen als auch deren Zeitpunkte erheblich variieren. Aus diesem Grund werden zwei Maßzahlen verwendet, die durchschnittliche und die maximale Konzentration. In einer ähnlichen Untersuchung aus Finnland (Antilla et al. 1995) wird die durchschnittliche Konzentration als Maßzahl verwendet. Diese Studie zeigt die hohe Variabilität zwischen den Messwerten, die z. T. Werte über 10000 mmol/l erreichen. Der Median liegt zwischen 80 und 90 mmol/l. Aber auch diese beiden Studien zeigen das Problem auf: Wie sollen all die vorliegenden Messwerte sinnvoll zusammengefasst werden?

7.1.4 Konsequenzen Ziel muss es sein, die Belastung so genau wie möglich zu erfassen. Unter Belastung ist sowohl die äußere als auch vor allem die innere Belastung zu verstehen. Je präziser die Belastung quantifiziert werden kann, um so deutlicher kann eine Assoziation zu einer Krankheit nachgewiesen werden. Mit einer genauen Erfassung der Belastung ist es hoffentlich auch möglich, präzisere Grenzwerte abzuleiten. Dies gilt vor allem für die innere Belastung. Bei all diesen Bemühungen ist zu bedenken, in welchen Abständen gemessen werden soll. Weiter muss man sich Gedanken machen über die geeignete Maßzahl zur Beschreibung der Exposition. Auf diesen Gebieten liegen in der Arbeitsmedizin schon umfangreiche Erfahrungen vor. Aber speziell auf dem Gebiet des Dosismonitoring ist noch genügend Forschungsbedarf vorhanden.

178

7.1

Erfassung der Exposition in epidemiologischen Studien

Literatur Antilla, A., Pukkala, E., Sallmen, M., Hernberg, S., Hemminki, K.: Cancer incidence among Finnish workers exposed to halogenated hydrocarbons, J. Occup. Med., 37, 797–806 (1995). Axelson, O., Selden, A., Andersson, K., Hogstedt, C.: Updated and expanded Swedish cohort study on trochlorethylene and cancer risk, J. Occup. Med., 36, 556–562 (1994). Checkoway, H., Pearce, Neil, E., Crawford-Brown, Douglas, J.: Research Methods in Occupational Epidemiology, Oxford Undiversity Press, Monographs in Epidemiology and Biostatistics, Volume 13, (1989). Henschler, D., Vamvakas, S., Lammert, M., Dekant, W., Kraus, B., Thomas, B., Ulm, K: Increased incidence of renal cell tumors in a cohort of cardboard workers exposed to trichlorethene, Arch. Toxicol., 69, 291–299 (1995). Robins, J.: A graphical approach to the identification and estimation of causal parameters in mortality studies with sustainded exposure periods, J. Chronic. Dis., 40 (suppl. 2), 139S–61S (1987). Soskolne, C. et al.: Occupational exposure to sulfuric acid associated with laryngeal cancer, southern Ontatio, Canada, Scand. J. Work. Environ, Health, 18: 225–232 (1992). Soskolne, D. L., Zeighami, E. A., Hanis, N. M., Kupper, L. L., Herrmann, N., Amsel, J., Mausner, J. S., Stellman, J. M.: Laryngeal cancer and occupational exposure to sulfuric acid, Am. J. Epid., 120, 358–369 (1984). Steenland et al.: Cancer, Heart Disease and Diabetes in Workers Exposed to 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin, JNCI, 91, 779–86 (1999). Suarez-Almazor, M. E., Soskolne, C. L., Fung, K., Jhangri, G. S.: Empirical assessment of the effect of different summary worklife exposure measures on the estimation of risk in case-referent studies of occupational cancer, Scand. J. Work Environ. Health, 18, 233–241 (1992). Ulm, K., Waschulzik, B., Ehnes, H., Guldner, K., Thomasson, B., Schwebig, A., Nuß, H.: Silica dust and lung cancer in the German stone, quarrying, and ceramics industries: results of a case-control study, Thorax, 54, 347–351 (1999). Vamvakas, S., Brüning, t., Thomasson, B., Lammert, M., Baumüller, A., Bolt, H. M., Dekant, W., Birner, G., Henschler, D., Ulm, K.: Renal cell cancer correlated with occupational exposure to trichlorethene, J. Cancer Res. Clin. Oncol., 124, 374–382 (1998).

179

7

Epidemiologie

7.2 Möglichkeiten und Grenzen einer molekularen Epidemiologie von Arbeitsstoffen Kurt Straif*

7.2.1 Einleitung Bereits zu Beginn unseres Jahrhunderts wurden Labortests im Rahmen von Surveys eingesetzt. Ein frühes Beispiel war die Verwendung des Wassermann-Tests zur Beschreibung der Häufigkeit von Syphilis in einer amerikanischen Großstadt (Williams 1920). Schon in der Frühphase dieser Seroprävalenz-Studien oder Seroepidemiologie zeigten sich neben den neuen Möglichkeiten auch neue Problemfelder, wie z. B. die gesellschaftliche Stigmatisierung und Diskriminierung von Personen mit (potenziell falsch) positiven Testergebnissen (Roy 1996). Seit Ende der 80er Jahre ist eine explosionsartig zunehmende Verwendung von Biomarkern in epidemiologischen Studien zu beobachten (Hulka et al. 1990a). Diese Entwicklung wurde gefördert durch aktuelle Entwicklungen in der Labortechnologie und durch die methodischen Grenzen der klassischen Epidemiologie bei geringen Risikoerhöhungen. Insbesondere die raschen Fortschritte der Labortechnologie ermöglichen inzwischen, dass zahlreiche Biomarker auch in größeren Studienkollektiven schnell und kostengünstig untersucht werden können. Die Bezeichnung molekulare Epidemiologie wurde geschaffen.

* Institut für Epidemiologie und Sozialmedizin, Universität Münster, Domagkstr. 3, 48129 Münster

180

7.2

Möglichkeiten und Grenzen einer molekularen Epidemiologie

7.2.2 Stärken und Schwächen der klassischen Epidemiologie Die Stärken der klassischen Epidemiologie lassen sich eindrucksvoll am Archetyp epidemiologischer Studien, der Untersuchung der Choleraepidemie in London durch John Snow im Jahre 1855, demonstrieren. Mitten im großen wissenschaftlichen Widerstreit zwischen Verfechtern der Miasmatheorie und Verfechtern der Kontagionstheorie konnte Snow mit epidemiologischen Methoden – ohne den damals noch unbekannten Erreger der Cholera zu identifizieren – die Ursache dieser Epidemie aufzeigen und durch Entfernung des Pumpschwengels von der kontaminierten Trinkwasserpumpe eine weitere Ausbreitung der Choleraepidemie verhindern (Snow Reprint 1936). In den Kriterien zur Evaluation von Kanzerogenen werden national und international humanepidemiologische Ergebnisse als entscheidend für eine Einstufung in Kategorie 1, d. h. für eine Einstufung als gesicherte Humankanzerogene, angesehen (IARC 1992, Deutsche Forschungsgemeinschaft 1999) – u. a. weil die mit Unsicherheiten behaftete Interspezies-Extrapolation von labor- oder tierexperimentellen Ergebnissen bei epidemiologischen Studien nicht erforderlich ist. Kritische Punkte bei der Bewertung der Validität epidemiologischer Studien stellen die verschiedenen Formen einer potenziellen Verzerrung von Studienergebnissen dar. Man unterscheidet: x Verzerrung durch Selektion, z. B. der Healthy-Worker-Effekt beim Vergleich der Mortalität in einer exponierten Kohorte mit der Mortalität in der Allgemeinbevölkerung, x Verzerrung durch nicht-systematische oder systematische Fehlklassifikation, z. B. durch Erfassung der Exposition über das Surrogat des Arbeitsbereiches oder durch Erhebung der Todesursache durch Todesbescheinigungen, x Verzerrung durch Confounding, z. B. durch unterschiedliche Rauchgewohnheiten in exponierten und nicht-exponierten Personen.

Exemplarisch zeigt Abbildung 1 die Auswirkungen einer nicht-systematischen Fehlklassifikation der Zielvariablen in einer geschlossenen Kohorte. Bereits eine auf 90 % reduzierte Sensitivität (SE) und Spezifität (SP) des diagnostischen Instruments bewirkt, dass anstelle eines wahren relativen Risikos von 6,0 in der Studie lediglich ein relatives Risiko von ca. 2,5 beobachtet werden kann. Neben der Validität spielt die Präzision der Effektschätzer eine wesentliche Rolle bei der Beurteilung epidemiologischer Studien. Insbesondere bei seltenen Krebserkrankungen in kleinen, hoch exponierten Kollektiven sind wahre Risikoerhöhungen eventuell nicht mit statistisch signifikanten Risikoschätzern zu belegen, weil die statistische Power dieser Studien oft nicht ausreichend ist. 181

7

Epidemiologie

Abbildung 1: Wahres und beobachtetes Risikoverhältnis in einer geschlossenen Kohorte in Abhängigkeit von Sensititvität und Spezifität des diagnostischen Tests.

Nach der Prüfung der Validität und der Präzision einzelner epidemiologischer Studien werden zur Beurteilung der Frage, ob es sich bei einer beobachteten statistischen Assoziation um einen kausalen Zusammenhang handelt, weitere Kriterien herangezogen (Evans 1995). Ein wichtiges Kriterium ist die Frage nach der Konsistenz der Ergebnisse verschiedener epidemiologischer Studien mit unterschiedlichen Designs und in unterschiedlichen Populationen. Fänden beispielsweise epidemiologische Studien in kaukasischen Populationen einen Zusammenhang zwischen einer Exposition gegenüber aromatischen Aminen und Blasenkrebs, können epidemiologische Studien in asiatischen Populationen jedoch keinen entsprechenden Zusammenhang aufzeigen, so könnte dies als Hinweis auf eine Inkonsistenz der Ergebnisse und eine eingeschränkte Validität einzelner Studien betrachtet werden. Ausreichende Validität und Präzision der evaluierten Studien vorausgesetzt, kann die scheinbare Inkonsistenz der Ergebnisse jedoch auch durch eine Effektmodifikation, z. B. bedingt durch unterschiedliche Suszeptibilität verschiedener ethnischer Gruppen, erklärt werden.

182

7.2

Möglichkeiten und Grenzen einer molekularen Epidemiologie

7.2.3 Stärken und Schwächen der molekularen Epidemiologie Die paradiesische Zeit der Epidemiologie, in der Studienergebnisse mit großen relativen Risiken wie reife Früchte von den Bäumen gepflückt werden konnten, gehört der Vergangenheit an. Die in aktuellen und zukünftigen epidemiologischen Studien erwarteten relativen Risiken dürften meistens unter 2,0, wenn nicht sogar unter 1,5 liegen. Dies bedeutet nicht, dass entsprechende Risiken von geringer gesundheitlicher Bedeutung sind. Beispielsweise zeigt der Zusammenhang zwischen häuslicher Radonexposition und Lungenkrebs, dass auch geringe relative Risiken bei entsprechend hoher Prävalenz der Exposition ein hohes attributables Risiko bewirken können (BEIR 1999). Die multifaktorielle Genese vieler chronischer Krankheiten sowie häufig anzunehmende Gen-Umwelt-Interaktionen sind eine zusätzliche Herausforderung an die Epidemiologie. Um in diesem Kontext aussagekräftige Studienergebnisse zu erzielen, ist in ganz besonderem Maße die Minimierung der für die Validität kritischen Punkte gefordert. Die Öffnung der Black Box (Abb. 2) könnte hier einige potenziell erfolgversprechende Ansätze bieten: Das Kontinuum zwischen externer Exposition und klinischer Diagnose wird hier als Übergang zwischen verschiedenen Kategorien von Marken dargestellt. Prinzipiell ist denkbar, dass die jeweiligen Biomarker im Zielgewebe (bei der Zielvariablen Lungenkrebs also in Bronchialzellen) oder in Surrogatzellen (z. B. in peripheren Leukozyten) untersucht werden. Entscheidend ist hier die Abwägung zwischen Verfügbarkeit von Zielgewebe und Aussagekraft von Untersuchungen in Surrogatzellen, welche u. a. von der untersuchten Exposition, dem spezifischen Biomarker und der Halbwertszeit des Biomarkers im Surrogatgewebe abhängt. Die Berücksichtigung von Biomarkern zur internen Dosis, zur biologisch effektiven Dosis, zu frühen biologischen Effekten, zu funktionellen oder mor-

Abbildung 2: Schematische Darstellung des Übergangs von der klassischen zur molekularen Epidemiologie.

183

7

Epidemiologie

phologischen Veränderungen sowie zur Suszeptibilität könnten potenziell folgende Beiträge zur Epidemiologie leisten: x eine Reduktion der Fehlklassifikation der Exposition durch Erhebung der individuellen internen Dosis, x eine Reduktion der Fehlklassifikation der Zielvariablen durch molekularbiologische Definition verschiedener Subtypen von Krankheiten mit potenziell unterschiedlicher Ätiologie, x eine Identifikation früherer Krankheitsstadien und damit auch eine potenzielle Verkürzung der Studiendauer in Kohortenstudien, x

eine Aufdeckung von Pathomechanismen,

x eine bessere Einbeziehung von genetisch determinierter Suszeptibilität und Effektmodifikation. Insbesondere bei Erkrankungen mit niedriger Penetranz kann durch eine genetische Definition der Suszeptibilität eine Optimierung der Methoden der traditionellen Epidemiologie, wie z. B. die Differenzierung verschiedener ethnischer Gruppen oder die Erhebung der Familienanamnese als Surrogat für genetisch determinierte Suszeptibilität, erzielt werden.

Eine volle Ausschöpfung der Potenziale der molekularen Epidemiologie erfordert eine intensive interdisziplinäre Kooperation zwischen Epidemiologie und Toxikologie, damit sowohl wichtige methodische Standards der Toxikologie (z. B. Laborstandards) als auch der traditionellen Epidemiologie (Studiendesign, Vermeidung systematischer und nicht-systematischer Fehler, Beachtung statistischer Modellannahmen) adäquate Berücksichtigung finden. Eine unzureichende Kenntnis der spezifischen Methodik der jeweils anderen Wissenschaft kann sonst leicht zu falschen Ergebnissen oder verfrühter kausaler Interpretation statistischer Assoziationen führen. Als prominentes historisches Beispiel kann hier die an die Bestimmung des CEASpiegels im Serum geknüpfte Hoffnung der Früherkennung kolorektaler Tumoren genannt werden. (Ransohoff und Feinstein 1978). Wie in einer Publikation von Bogardus et al. (1999) dargelegt, weisen jedoch selbst aktuelle molekular-epidemiologische Arbeiten in hochrangigen Zeitschriften erhebliche methodische Schwächen auf. Im Jahrgang 1995 der Zeitschriften Lancet, British Medical Journal, New England Journal of Medicine und Journal of the American Medical Association identifizierten die Autoren insgesamt 40 molekular-epidemiologische Artikel, in denen mehr als zehn Patienten untersucht und analytische Schlussfolgerungen gezogen wurden. Diese Artikel wurden u. a. auf die folgenden sieben methodischen Aspekte überprüft: x Reliabilität und Validität des eingesetzten Tests (Wiederholung des Tests in einer Untergruppe oder Bestätigung der Testergebnisse mit einem anderen Verfahren),

184

7.2

Möglichkeiten und Grenzen einer molekularen Epidemiologie

Tabelle 1: Anzahl und Prozent gemäß sieben methodischer Standards positiv beurteilter Artikela. Methodischer Standard

Positive Artikel Anzahl (%)

Reliabilität des Tests Objektivität Falldefinition Adäquates Spektrum von Fällen Definition der Kontrollgruppe Adäquate Kontrollgruppe Quantitative Beschreibung der Ergebnisse

15 13 31 35 28 35 36

(37,5) (32,5) (77,5) (87,5) (70,0) (87,5) (90,0)

a

untersucht wurden 40 Artikel des Jahrgangs 1995 der Zeitschriften Lancet, New England Journal of Medicine, JAMA und BMU modifiziert nach Bogardus et al. (1999).

Objektivität (Untersucher in Unkenntnis des Patientenstatus), Falldefinition (Beschreibung demographischer Details der Fallgruppe sowie klare Kriterien für Zielvariablen), x adäquates Spektrum von Fällen, x Definition der Kontrollgruppe (Einschlusskriterien), x adäquate Kontrollgruppe, x quantitative Beschreibung der Ergebnisse (Konfidenzintervall oder p-Wert). x x

Die Ergebnisse ihrer Untersuchungen sind in Tabelle 1 dargestellt. Nur jeweils ca. ein Drittel der untersuchten Studien erfüllte die beiden ersten Kriterien, Reliabilität bzw. Validität des eingesetzten Tests und Objektivität des Untersuchers. In einem knappen Drittel der Studien fand sich nur eine unzureichende Beschreibung der Kontrollgruppe. Hätten die Autoren nicht primär weitere acht Artikel mit analytischem Anspruch direkt als rein deskriptiv eingestuft, weil in diesen Studien keine Kontrollgruppe untersucht wurde, wäre ihr Fazit noch kritischer ausgefallen.

7.2.4 Kurzübersicht zu Biomarkern nach verschiedenen Klassifikations-systemen Biomarker können gemäß Abb. 2 entsprechend ihrer Funktion im Kontinuum zwischen Exposition und Krankheit oder nach Krankheitsgruppen klassifiziert werden. Tabelle 2 gliedert verschiedene Biomarker entsprechend der erstgenannten Klassifikation und gibt Übersichtsartikel zu den jeweiligen Markern an. Tabelle 3 zeigt eine Klassifikation von Biomarkern nach Krankheitsgruppen und nennt Übersichtsarbeiten zu den jeweiligen Markern. 185

7

Epidemiologie

Tabelle 2: Klassifikation von Biomarkern nach deren Funktion: Beispiele und Übersichtsarbeiten. Marker für

Beispiele

Übersichtsarbeiten

Interne Dosis chemischer Stoffe, biologischer Agenzien

Blei im Blut Urinmutagenität Hepatitisserologie

Coggon and Friesen, 1997 Rynard, 1990 Munoz and Bosch, 1997

Biologisch effektive Dosis

Protein- und DNA-Produkte

Wild and Pisani, 1997, Goldring, G. W., 2000

Frühe biologische Effekte

Schwesterchromatidaustausch, Mikronuclei, Chromosomenaberrationen

Tucker et al., 1997, Wilcosky und Rynard 1990; Vine, 1990; Schwartz, 1990a

Veränderte Struktur oder Funktion

Mutationen in somatischen Zellen, Onkogene und Tumorsuppressorgane

Albertini und Hayes, 1997, Schwartz, 1990b

Krankheit

Tumormarker

Zhang et al. 1997

Suszeptibilität

Ah-Rezeptor-Gen Cytochrome P4501A1 Cytochrome P4501A2 Cytochrome P4502A Subfamilie Cytochrome P4502D6 Glutathion-S-Transferase N-Acetyltransferasen Weitere Cytochrome P450 und sonstige Polymorphismen DNA-Repair

Garte und Sogawa, 1999 Kawajiri, 1999 Landi et al., 1999 Raunio et al., 1999 Wolf und Smith, 1999 Strange und Fryer, 1999 Hirvonen, 1999 Stubbins und Wolf, 1999

Vineis und Malats, 1999 Vine und Mcfarland, 1990

Tabelle 3: Übersichtsarbeiten zu Biomarkern nach Krankheitsgruppen. Krankheitsgruppe

Referenz

Infektionskrankheiten Krebserkrankungen Krankheiten des Immunsystems Krankheiten des Nervensystems Krankheiten des Kreislaufsystems Krankheiten der Atmungsorgane Leberkrankheiten Krankheiten der Harn- und Geschlechtsorgane Krankheiten von Skelett/Muskeln/Bindegewebe Erbkrankheiten Reproduktionsstörungen

Harrison und Griffin, 1993 Perera und Santella, 1993 Vogt Jr. und Schulte, 1993 Griffith und Garry, 1993 Schulte et al. 1993a Tockman et al. 1993 Tamburro und Wong, 1993 Hemstreet III et al. 1993 Mastin et al. 1993 Khoury und Dorman, 1993 Lemasters und Schulte, 1993

186

7.2

Möglichkeiten und Grenzen einer molekularen Epidemiologie

In Abhängigkeit von spezifischen Fragestellungen und Studiendesigns kann ein bestimmter Biomarker epidemiologisch völlig unterschiedliche Bedeutungen (Expositionsvariable, Zielvariable, Störfaktor) annehmen. Beispielsweise können spezifische DNA-Addukte in einer Untersuchung zu Gesundheitsrisiken einer arbeitsbedingten Exposition gegenüber polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) als Expositionsvariable definiert werden, wenn Lungenkrebs die zu untersuchende Zielvariable darstellt. Im selben Kontext können diese DNA-Addukte jedoch auch als Zielvariable betrachtet werden, wenn der Zusammenhang zwischen PAK-Exposition und DNA-Adduktbildung untersucht werden soll. Ferner wäre denkbar, in einer Studie über den Zusammenhang zwischen Asbestexposition und Lungenkrebs PAK-spezifische DNA-Addukte als Indikator für Rauchgewohnheiten, also als Störfaktoren, zu betrachten. In jeder konkreten epidemiologischen Studie sollte man sich die exakte Funktion des verwendeten Biomarkers verdeutlichen. Im Beispiel der DNAAddukte als Expositionsvariable wäre zu fragen, ob die Addukte möglichst exakt die individuelle biologisch effektive Dosis abbilden sollen oder als Indikator der Arbeitsplatzexposition dienen. Im zweiten Fall wären Faktoren, die die individuelle Bildung von DNA-Addukten beeinflussen, z. B. genetisch determinierte Polymorphismen des PAK-Metabolismus oder individuell unterschiedliche DNA-Reparaturkapazitäten, als Störfaktoren anzusehen, wogegen im ersten Fall, zumindest theoretisch, die DNA-Addukte die individuelle, biologisch effektive Dosis mit geringerer Fehlklassifikation abbilden als Arbeitsplatzmessungen des Gefahrstoffs, weil hierbei individuell unterschiedliche Suszeptibilitäten als potenzielle Störfaktoren bereits berücksichtigt werden.

7.2.5 Aspekte der Planung und Durchführung molekular-epidemiologischer Studien 7.2.5.1

Laborstudien und transitionale Studien

Überlegungen zur Planung molekular-epidemiologischer Studien beginnen mit der Auswahl der im Hinblick auf die Fragestellung am besten geeigneten Marker (Schulte und Perera 1993, Wilcosky 1990, Hulka 1990b). In transitionalen Studien, die die Entwicklung, Charakterisierung und Evaluation von Biomarkern umfassen, stellt der zu untersuchende Biomarker meist die Zielvariable dar (Schulte und Perera 1993, Harris 1991). Neben der labortechnisch bedingten Variabilität (Vineis et al. 1993, Vineis 1997) und Etablierung geeigneter Qualitätskontrollen (Wild und Pisani 1997, Gompertz 1997) sind auch Aspekte der biologischen Variabilität, kurzzeitige oder langfristige intra- und interindividuelle Variabilität zu charakterisieren (Vineis 1997, Hulka 1990b). Eine Übersicht zu spezifischen Gesichtspunkten, die bei der 187

7

Epidemiologie

Anlage einer Materialbank berücksichtigt werden sollten, finden sich bei Winn und Gunter (1993). Im Rahmen einer epidemiologischen Studie sind Aspekte der Probenahme, der Weiterverarbeitung, der Stabilität und Lagerung des biologischen Materials, insbesondere auch versandtechnische Aspekte, sorgfältig zu prüfen und zu planen (Landi und Caporaso 1997). Eingebettete Reliabilitätsstudien können, abhängig von der Fragestellung und vom Studiendesign, singulär einzelne kritische Schritte, wie z. B. Verarbeitung oder Lagerung der Proben oder Laborvariabilität zwischen verschiedenen Untersuchern, verschiedenen Labors oder im zeitlichen Verlauf der Studie, thematisieren. Die Mitführung und Analyse standardisierter Proben kann Hinweise auf spezifische Problemfelder der Qualitätssicherung ermöglichen. Abhängig vom spezifischen Design der Reliabilitätsstudien können diese alternativ, quasi integrativ, die Gesamtvariabilität aller kritischen Schritte quantifizieren. Hinweise zur Auswirkung von Messfehlern von Biomarkern in molekular-epidemiologischen Studien finden sich bei White (1997) und Rothman et al. (1999).

7.2.5.2

Eignung bestimmter Biomarker für verschiedene Studiendesigns

Kriterien zur Eignung bestimmter Biomarker für verschiedene Studiendesigns finden sich in mehreren Übersichtsarbeiten (Schulte et al. 1993b, Boffetta und Pearce 1999, Brennan 1999, Hunter 1997, Rothman et al. 1995). Am Beispiel von Fall-Kontrollstudien lassen sich Design-spezifische Vor- bzw. Nachteile von molekular-epidemiologischen Studien aufzeigen. Bei klassischen epidemiologischen Fall-Kontrollstudien wird aus methodischen Überlegungen, insbesondere zur Reduzierung möglicher Selektionseffekte, oft eine bevölkerungsbezogene Fall-Kontrollstudie bevorzugt. Bei molekular-epidemiologischen Fall-Kontrollstudien wird andererseits häufig Krankenhaus-basierten FallKontrollstudien der Vorzug gegeben. Angesichts der in molekular-epidemiologischen Studien erforderlichen Abnahme von biologischem Material (Blutabnahme, Urinprobe) wird bei Krankenhaus-basierten Kontrollen eine höhere Teilnahmerate als bei bevölkerungsbezogen Kontrollen erwartet. Weiterhin kann die erforderliche Logistik, d. h. Probenahme, Verarbeitung und Lagerung der Probe, bei bevölkerungsbezogenen Kontrollen zum Teil unüberwindbare Probleme stellen, während sich bei Krankenhaus-basierten Kontrollen die erforderliche Gewinnung von biologischem Material oft elegant im Rahmen der üblichen Probenahmen integrieren lässt und eine möglichst rasche Verarbeitung der Proben ohne längere zwischengeschaltete Transportwege – meist auch mit relativ geringem Zusatzaufwand – zu gewährleistet ist. Für Krebserkrankungen und andere chronische Krankheiten mit längerer Latenzzeit ist die molekularbiologische Bestimmung der Exposition in Fall-Kontrollstudien oft problematisch, da die heute zur Verfügung stehenden Expositionsmarker häufig nur die aktuelle Exposition erfassen, aber keine Aussagen über die bei diesen Krankheiten relevante Exposition vor 188

7.2

Möglichkeiten und Grenzen einer molekularen Epidemiologie

zehn oder mehr Jahren liefern können. Expositionen, die sich im zeitlichen Verlauf ändern können, wie z. B. Rauchgewohnheiten, lassen sich, im Vergleich mit heute zur Verfügung stehenden molekularbiologischen Markern, exakter mit standardisierten Fragebögen erheben. Andererseits lässt sich eine Exposition gegenüber humanem Papilloma Virus (HPV) als Risikofaktor für Zervix-Karzinome auch in Fall-Kontrollstudien exakter über die Virusserologie als indirekt über standardisierte Fragebögen zur Häufigkeit von Geschlechtsverkehr, Wechsel des Intimpartners, etc. erfassen. Frühe morphologische oder funktionelle Veränderungen sind, solange es keine geeigneten Register gibt, nicht als Zielvariablen von Fall-Kontrollstudien geeignet. Andererseits können genetisch determinierte Marker der Suszeptibilität in Fall-Kontrollstudien valide und effizient eingesetzt werden. Methodische Überlegungen zur Verwendung von Biomarkern in Kohortenstudien finden sich in einer Übersichtsarbeit von Hunter (1997). Spezifische Besonderheiten nicht-traditioneller epidemiologischer Studiendesigns, wie z. B. Fall-Fallstudien zur Untersuchung von Gen-Umwelt-Interaktionen (Khoury und Flanders 1996, Andrieu und Goldstein 1998) oder familienbasierte Linkage-Studien können hier nicht berücksichtigt werden.

7.2.5.3

Statistische Analyse molekular-epidemiologischer Studien

Die Verwendung geeigneter statistischer Tests ist zu beachten. Häufig beobachtete Fehler bestehen darin, dass z. B. Tests, die eine Normalverteilung der Messwerte voraussetzen, auf nicht normal verteilte Daten angewendet werden oder dass statistische Tests, die eine Unabhängigkeit der einzelnen Beobachtungen voraussetzen, auf wiederholte Messungen von Biomarkern in einem Kollektiv, also auf seriell korrelierte, statistisch nicht unabhängige Daten, angesetzt werden (Stover Hertzberg und Russek-Cohen 1993). Die häufig in molekular-epidemiologischen Studien präsentierten Korrelationskoeffizienten sind kein geeigneter Ersatz für die in der Epidemiologie gebräuchlichen Effektschätzer, wie Odds-Ratio bzw. relatives Risiko (Greenland et al. 1991). Eine Standardisierung oder Adjustierung der Ergebnisse für klassische Risikofaktoren und potenzielle Störfaktoren wird mangels entsprechender Daten oder angesichts der geringen Probandenzahl oft vernachlässigt. Andererseits ist bei multivariater Analyse die potenzielle Multikollinearität verschiedener Variablen zu berücksichtigen. Die Tatsache, dass verschiedene Zwischenschritte auf dem Weg von der Exposition zur Krankheit untersucht werden, somit also Intermediärvariablen in die Analyse einfließen, kann zu der analytisch problematischen Situation führen, dass eine Variable gleichzeitig Intermediärvariable und Störfaktor ist (Robins et al. 1992). Die zunehmende Möglichkeit, schnell und kostengünstig zahlreiche Biomarker – gegebenenfalls ohne klare Forschungshypothese – in einer Studie zu untersuchen, wird die methodische Diskussion zur Frage der statistisch korrekten Behandlung multipler Vergleiche sowie das Problem des Publikationsbias verschärfen. 189

7 7.2.5.4

Epidemiologie

Schätzung der erforderlichen Studiengröße molekular-epidemiologischer Studien

Die teilweise enormen Kosten oder der hohe Personalaufwand labortechnischer Analysen von Biomarkern führt häufig zu Kompromissen bei der Studiengröße. Anderseits erfordert gerade die Untersuchung von Polymorphismen, die oft nur als Untersuchung von Gen-Umwelt-Interaktionen sinnvoll ist, oder die Untersuchung von Gen-Gen-Interaktionen, besonders große Kollektive zur Erzielung einer ausreichenden statistischen Aussagekraft (Hulka 1990b, Hwang et al. 1994, Cuzick 1999).

7.2.5.5

Interpretation und Kommunikation der Ergebnisse molekular-epidemiologischer Studien

Aspekte des Datenschutzes besitzen bei molekular-epidemiologischen Studien einen besonders hohen Stellenwert. Welche Untersuchungen dürfen an eingelagertem biologischen Material ohne zusätzliche schriftliche Einwilligung des Probanden durchgeführt werden? Wie ist, wenn im Rahmen einer Studie ein neuer Suszeptibilitätsmarker identifiziert wurde, das individuelle Testergebnis an den jeweiligen Probanden zu kommunizieren (Schulte 1993). Entsprechende, eventuell sogar noch vorläufige Ergebnisse können zu einer erheblichen Verunsicherung im Privat- und Familienleben, zur Diskriminierung beim Abschluss von Kranken- oder Lebensversicherungen und am Arbeitsplatz führen (Hainaut und Vahakangas 1999, Schulte et al. 1999).

7.2.6 Zusammenfassung Das vorliegende Referat gibt einen Überblick über spezifische Aspekte einer molekularen Epidemiologie. Zwei Gedanken ziehen sich wie ein roter Faden durch diese Übersicht: Die molekulare Epidemiologie besitzt das Potenzial, bedeutsame neue Erkenntnisse zu generieren. Spezifische, der molekularen Epidemiologie inhärente Probleme bedürfen jedoch der sorgfältigen Beachtung. Empfehlungen zu methodischen Standards: 1. Evaluation von Biomarkern in transitionalen Studien: x kurz- und langfristige, intra- und interindividuelle Variabilität, x Hintergrundniveau, x Erarbeitung spezifischer Dokumentationsblätter für einzelne Biomarker (Probenahme, Verarbeitung, Lagerung, Störfaktoren).

190

7.2

Möglichkeiten und Grenzen einer molekularen Epidemiologie

2. Beachtung „Guter epidemiologischer Praxis“: x Studiendesign, x Minimierung von Bias und Confounding, x adäquate statistische Modelle, x ausreichende statistische Power, x Qualitätskontrollen: Handling der Proben, Blinden des Untersuchers, Monitoring von experimentellem Drift, Reliabilitäts- und Validitätsstudien. 3. Lagerung von histologischen Schnitten und Tumorblöcken 4. „Natural History of Disease“: x Lagerung von gesundem Gewebe, benignen Läsionen, prämalignen Veränderungen, ggf. Material des kontralateralen Organs. 5. Gleichzeitige Untersuchung verschiedener Biomarker im Rahmen einzelner kollaborativer Studien mit Austausch von Standards und biologischen Proben: x chemikalienspezifische und allgemeine Marker x Marker aktueller und historischer Exposition x Marker für frühe klinische Effekte und Suszeptibilität Empfehlungen zum Forschungsgegenstand: 1. Auswahl von Biomarkern auf Basis biologischer Relevanz 2. Einrichtung von Probenbanken von klar definierten Kohorten 3. Validierung expositionsspezifischer Mutationsmuster 4. Untersuchung von Modellpopulationen (z. B. Krebspatienten mit Behandlung einer Hochdosis-Chemotherpaie und hohem Risiko für Sekundärtumoren) 5. parallele Studien am Menschen und in Tiermodellen unter Verwendung derselben biologischen Marker zu Optimierung der Interspezies-Extrapolation: Pathomechanismen, Expositionsantworten Eine intensive interdisziplinäre Zusammenarbeit zwischen Genetikern, Toxikologen und Epidemiologen ist eine wesentliche Voraussetzung zum Gelingen molekular-epidemiologischer Projekte. Lassen Sie mich in diesem Sinne mit den Worten von Geoffrey Rose schließen: „Just as epidemiologists need to look inside the black box, so the molecular biologists need to look outside it.“ (Rose 1990).

191

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Epidemiologie

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Epidemiologie

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8 Zusammenfassung Jürgen Angerer* und Helmut Greim**

Unter dem Begriff Biomonitoring versteht man die Bestimmung von Schadstoffen, ihrer Metaboliten, deren Addukte an Proteine und an die DNA oder anderer Parameter des Intermediärstoffwechsels in Körperflüssigkeiten. Das Biomonitoring stellt in der Arbeits- und Umweltmedizin eine wertvolle Möglichkeit dar, den einzelnen Menschen vor den Wirkungen gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe zu schützen (Individualprävention). Nach ersten Anfängen in den 30er Jahren setzt man das Biomonitoring seit Mitte der 60er Jahre in Arbeits- und Umweltmedizin auf ständig breiter werdender Basis ein. Dabei ist der Fortschritt des Biological Monitoring eng gekoppelt mit entsprechenden Fortschritten in den Analysentechniken. Deutschland hat das Biological Monitoring früher und in der Folgezeit konsequenter als andere Länder für die Prävention von Gesundheitsschäden durch chemische Substanzen genutzt. Die Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der Deutschen Forschungsgemeinschaft hat seit 1975 die Entwicklung geeigneter, valider und erprobter analytischer Methoden für das Biological Monitoring vorangetrieben. Es ist mittlerweile eine Sammlung analytischer Methoden entstanden, die weltweit ihresgleichen sucht. 1979 hat die Arbeitsstoffkommission als erste damit begonnen, gesundheitlich tolerable Grenzwerte für die Parameter des Biological Monitoring zu evaluieren in Form der biologischen Arbeitsstoff-Toleranzwerte (BAT) und der Expositionsäquivalente für krebserzeugende Arbeitsstoffe (EKA). Die USA sind dann diesem Beispiel gefolgt. 1984 hat dann die Deutsche Gesellschaft für Arbeitsmedizin und Umweltmedizin begonnen, die Qualität der Ergebnisse des Biological Monitoring durch Ringversuche zu sichern. Heute werden in Deutschland die umfangreichsten Ringversuche für arbeits- und umweltmedizinisch-toxikologische Untersuchungen organisiert.

* Institut und Poliklinik für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin, Universität Erlangen-Nürnberg, Schillerstr. 25, 91054 Erlangen ** GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH, Institut für Toxikologie, Ingolstädter Landstr. 1, 85764 Oberschleißheim

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Zusammenfassung

In Deutschland wurden nicht nur diese Grundlagen geschaffen. Anders als in anderen Ländern ist das Biological Monitoring Bestandteil der Arbeitsschutzgesetzgebung. Deshalb liegt hier auch die größte praktische Erfahrung beim Umgang mit dem Biological Monitoring in Arbeits- und Umweltmedizin vor. Ob Deutschland seine führende Rolle in diesem Gebiet behaupten kann, hängt nun davon ab, ob es gelingt, die neuen Möglichkeiten des Effektmonitoring zu nutzen und weiter auszubauen. Das Biological Monitoring hat sich lange Zeit zum überwiegenden Teil auf ein Dosismonitoring, d. h. den Nachweis der Schadstoffe und ihrer Stoffwechselprodukte in biologischem Material, beschränkt. Heute stehen weitere Möglichkeiten zur Verfügung. Das ist das biochemische Effektmonitoring, d. h. beispielsweise die Bestimmung der Reaktionsprodukte mutagener Substanzen mit Proteinen und mit der Erbsubstanz. Von einem biologischen Effektmonitoring spricht man, wenn die Schadstoffbelastung zu ersten messbaren Wirkungen im menschlichen Organismus führt. Solche biologischen Effekte können Veränderungen von Enzymaktivitäten unter einer Schadstoffbelastung, frühe Effekte an den Nieren, Lunge, Nervensystem, etc. oder auch der Chromosomenstruktur und Chromosomenzahl, Mikrokernen oder Schwesterchromatik-Austauschraten darstellen. Was die diagnostische Validität von Immunparametern im Zusammenhang mit Schadstoffexpositionen anbetrifft, steht man noch ganz am Anfang einer möglichen Entwicklung. Moduliert werden die messbaren Parameter des biologischen Monitoring (Dosis- und Effektmonitoring) durch die interindividuell unterschiedlichen Möglichkeiten, die Schadstoffe zu giften und zu entgiften. Enzympolymorphismen sind die Ursache für die Unterschiede in der Stoffwechselleistung Fremdstoff-metabolischer Enzyme. Die Stoffwechselleistung ist darüber hinaus abhängig von der Induktion oder auch Inhibition von Enzymen. Durch die Bestimmung von Schadstoffen und ihrer Stoffwechselprodukte in menschlichen Körperflüssigkeiten kann die vom Einzelnen aufgenommene Schadstoffdosis spezifisch und empfindlich erfasst werden (innere Belastung, Dosismonitoring). Dank der heute zur Verfügung stehenden Methoden der instrumentellen Analytik gelingt es, viele Schadstoffe bis in den Bereich umweltmedizinisch relevanter Konzentrationen zu erfassen. Das Parameterspektrum umfasst heute Metalle, organische Lösungsmittel, persistente und nicht-persistente Pflanzenschutzmittel (PSM), aromatische Amine und aromatische Nitroverbindungen, polykondensierte aromatische Kohlenwasserstoffe usw. Dennoch muss dieses Parameterspektrum laufend erweitert werden. So fehlen z. B. für viele Pflanzenschutzmittel geeignete Methoden für ein Dosismonitoring. In diesem Zusammenhang wird auch der Metabolismus vieler organischer Substanzen wie z. B. der PSM beim Menschen aufzuklären sein. Ziel ist es dabei, aus allen Stoffwechselprodukten diejenigen herauszufinden, die dem Gesundheits-Risiko möglichst nahe stehen. Mit Hilfe eines so genannten Metabolic Profiling sollten neben den ultimal toxischen Metaboliten auch interindividuell unterschiedliche Suszeptibilitäten zu erkennen sein. 198

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Zusammenfassung

Was das biochemische Effektmonitoring anbetrifft, so hat man gelernt, die Reaktionsprodukte verschiedener Gruppen mutagener Substanzen mit Hämoglobin (Hämoglobin-Addukte) zu bestimmen. Dazu gehören vor allem alkylierende Substanzen, aromatische Amine, aromatische Nitroverbindungen, PAH sowie eine Reihe von Einzelstoffen wie Dimethylformamid, Benzochinon, etc. Hämoglobin-Addukte werden heute aus toxikologischer Sicht als Surrogat für die Reaktionsprodukte mutagener Substanzen mit der Erbsubstanz angesehen. Bereits heute können erste quantitative Abschätzungen des Krebs-Risikos anhand der Hämoglobin-Adduktkonzentration im Blut durchgeführt werden. Dies gelingt auf der Basis von Gruppen, bei denen man analytisch aus dem an Hämoglobin gebundenen Anteil der aufgenommenen Dosis auf das Krebs-Risiko schließen kann, wie z. B. bei den aromatischen Aminen. Dabei liegt diejenige Adduktkonzentration zugrunde, die im Tierversuch zu einem 50 %igen Krebs-Risiko führt (TD50). Die Möglichkeiten, HämoglobinAddukte zu bestimmen, müssen über die oben aufgeführten Stoffgruppen hinaus ausgedehnt werden. In den Adduktleveln schlagen sich die interindividuell unterschiedlichen Enzympolymorphismen nieder, die ihrerseits das individuelle Krebs-Risiko wesentlich beeinflussen. Die Wirkung giftender und entgiftender Enzymsysteme wird im Adduktlevel global, aber quantitativ erfassbar. Geht man davon aus, dass die Bindung mutagener Substanzen an die DNA ein frühes Ereignis im Prozess der chemischen Mutagenese und Kanzerogenese darstellt, so kommt der Erfassung der DNA-Schadstoffaddukte größte arbeits- und umweltmedizinische Bedeutung zu. Dass erhöhte DNAAdduktspiegel nicht nur eine erhöhte Schadstoffbelastung, sondern auch das interindividuell unterschiedliche Krebs-Risiko anzeigen, konnte man am Beispiel beruflicher oder Tabakrauch-bedingter PAH-Belastung belegen. Die Bestimmung von DNA-Addukten krebserzeugender Substanzen stellt damit ein hervorragendes Instrument dar, Krebsrisiken zu erkennen und bezogen auf das Individuum zu minimieren. Von den bisher eingesetzten Methoden zur Bestimmung von DNA-Addukten stellt das so genannte 32 P-Postlabelling die empfindlichste dar. Allerdings weist dieses Verfahren die Einschränkung auf, dass es die gesuchten Substanzen nicht Substanzspezifisch zu erfassen gestattet. Dies ist nicht zuletzt auf die geringe chromatographische Auflösung der Dünnschichtchromatographie zurückzuführen. Hier ermöglicht die Kombination aus 32P-Postlabelling und HPLC eine gewisse Verbesserung, weil diese chromatographische Methode eine bessere Auflösung ermöglicht. Solche Verfahren wurden unter anderem zur Bestimmung von Addukten der PAH sowie von heterozyklischen Aminen erfolgreich eingesetzt. Allerdings reichen die mit dieser Methodik erzielbaren Nachweisgrenzen offenbar nicht aus, um sie zur Bestimmung von DNAAddukten in peripheren Lymphozyten einsetzen zu können. Bei der Untersuchung entsprechend belasteter Personengruppen muss dann geprüft werden, ob eine Assoziation zwischen der DNA-Adduktkon199

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Zusammenfassung

zentration und dem Auftreten von Tumoren besteht. Diese Kenntnis könnte zu einer gezielten Krebsprävention eingesetzt werden. Eine Sonderstellung bei den DNA-Addukten nehmen die durch den oxidativen Stress verursachten Nukleoside ein. Sie sind jedoch anders als die DNA-Schadstoffaddukte in Bezug auf das auslösende Agens unspezifisch. Sie könnten gleichwohl im Rahmen der Prävention eingesetzt werden, wenn daneben die Schadstoffexposition Stoff-spezifisch erfasst wird. Auf diese Weise müsste auch die diagnostische Aussagekraft oxidativ veränderter Nukleoside validiert werden. Unabdingbar für das Dosismonitoring wie für die Bestimmung von Protein- und DNA-Addukten sind Fortschritte auf dem Sektor der instrumentellen chemischen Analytik. Bei der Bestimmung von Metallen ist die ICP/MS unerlässlich. Diese Methode eignet sich unter anderem für die Bestimmung refraktärer Elemente wie beispielsweise Wolfram, das bei der Entstehung der Hartmetallfibrose eine große Rolle spielt. Neue Trenntechniken, gekoppelt an Atomabsorption oder ICP/MS, werden es ermöglichen, Metallspezies zu bestimmen, die wegen ihrer unterschiedlichen Toxizität von großer arbeits- und umweltmedizinischer Bedeutung sind. Die Möglichkeit der Kopplung LC/MS/MS stellt die Voraussetzung dar, um Protein-, vor allem aber DNA-Addukte spezifisch und empfindlich erfassen zu können. Um bei den DNA-Addukten in den Bereich der erforderlichen Nachweisgrenzen vorstoßen zu können, sind völlig neue Anreicherungsphasen, Säulenschaltungen, etc. unerlässlich. Die Verwendung von maßgeschneiderten chromatographischen Phasen, wie z. B. restricted access material (RAM) oder molecular imprinting (MIP), ist dafür notwendig. Interindividuell unterschiedliche Suszeptibilitäten führen bei gleicher Schadstoffbelastung zu unterschiedlichen Gesundheitsrisiken. Enzympolymorphismen haben deshalb bei der Prävention und Abschätzung von schadstoffbedingten Gesundheitsrisiken große Bedeutung. Beispielsweise tragen Personen mit einer geringen Aktivität an N-Acetyltransferase bei einer Exposition gegen aromatische Amine ein höheres Risiko, an Harnblasen-Karzinomen zu erkranken, als so genannte schnelle Acetylierer. Neben den Acetyltransferasen wurden vor allem die Cytochrom-P450-abhängigen Oxidasen, die Glutathiontransferasen sowie die Sulfatasen hinsichtlich ihrer Bedeutung in Arbeits- und Umweltmedizin untersucht. Während man den jeweiligen Genotyp heute mittels der so genannten PCR-Technik relativ einfach bestimmen kann, sind für die Bestimmung des Phänotyps wesentlich aufwendigere Methoden notwendig. Bei der Bestimmung des Genotyps werden immer leistungsfähigere Verfahren entwickelt. Die Bestimmung des Phänotyps ist aber zur Erfassung der tatsächlichen Ausprägung des Merkmals Enzymaktivität unverzichtbar. Forschungsbedarf besteht deshalb vor allem in Bezug auf die Faktoren, die den genetisch determinierten Enzymstatus modulieren (z. B. Induktion, Hemmung). Die Entwicklung praktikabler und standardisierter Biomonitoring-Verfahren zur Erfassung der individuellen Enzymaktivität ist daher von Nöten. Da verschiedene Enzymsysteme in Abhängigkeit vom Substrat toxifizierend oder detoxifizierend wirken kön200

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nen, muss z. B. bei den Sulfotransferasen herausgefunden werden, welche Substanzen durch welche Sulfotransferasen gegiftet oder entgiftet werden. Es ist darüber hinaus zu prüfen, welche weiteren Polymorphismen bestehen, und es müssen basierend auf diesen Erkenntnissen Zusammenhänge zwischen den Aktivitäten der Enzyme und der gesundheitlichen Gefährdung erforscht werden. Im Sinne der Prävention müssen Risikogruppen erkannt werden. Vor allem aber ist zu erforschen, welche Bedeutung der Enzympolymorphismus bei der Beurteilung des Einzelfalles hat. Zytogenetische Parameter wie Chromosomenaberrationen, zytogenetische Indikatoreffekte wie Schwesterchromatidaustausche und Mikrokerne beziehungsweise Verfahren zum Nachweis chromosomaler Rearrangements wie die Chromosomen-in-situ-Suppression-Hybridisierung (CISS) bzw. Chromosome Painting oder auch molekulargenetische Techniken, wie z. B. der Comet-Assay, bieten Möglichkeiten, die Wirkung mutagener Substanzen auf die Erbsubstanz zu quantifizieren. Neben den eingangs erwähnten klassischen zytogenetischen Parametern bietet das Chromosome Painting den Vorteil, langlebige reziproke Translokationen erfassen zu können, die im Hinblick auf die Prävention gesundheitlicher Wirkungen von großer Bedeutung sind. Der Comet-Assay weist den Vorteil auf, besonders praktikabel zu sein und das von allen Parametern breiteste Spektrum von DNA-Schäden unterschiedlichster Genese zu erfassen. Allerdings ist beim Comet-Assay zu bedenken, dass er nur die kurzfristig zurückliegende Exposition zu erfassen gestattet und im Allgemeinen als Dosisparameter zu bewerten ist. Anzumerken ist auch, dass der Comet-Assay von vielen Randbedingungen abhängt. Zu größerer diagnostischer Validität gelangt der Comet-Assay z. B. durch den Einsatz von bestimmten Endonukleasen, die den gesetzten Schaden spezifisch zu erfassen gestatten. Auch zur Bestimmung der Reparaturkapazität kann der Comet-Assay eingesetzt werden. Allen genetischen Parametern ist gemeinsam, dass sie bisher nicht systematisch in das Biomonitoring von Schadstoffbelastungen am Arbeitsplatz oder in der Umwelt eingebunden worden sind, so dass ihr diagnostisches Potenzial in diesem Bereich weder eingeordnet noch auch nur annähernd ausgeschöpft werden konnte. Dies ist im Hinblick auf die Prävention von Gesundheitsschäden außerordentlich beklagenswert. Auch Allergene gehorchen offensichtlich einer Dosiswirkungsbeziehung. Diese Erkenntnis konnte mangels Daten im Bereich der Arbeitsmedizin und des Arbeitsschutzes wie auch der Umweltmedizin bisher kaum genutzt werden. Auf der Basis einer Dosiswirkungsbeziehung könnten aber Schwellenwerte definiert werden, mit denen ein wirkungsvoller Gesundheitsschutz auch bei Belastungen durch allergene Substanzen betrieben werden könnte. Dass dies derzeit noch nicht möglich ist, ist darauf zurückzuführen, dass beim Auftreten sensibilisierender Wirkungen die äußere und innere Belastung durch das Allergen zumeist nicht quantitativ erfasst wurde. Derzeit ist dies bei einer Exposition durch hochmolekulare Substanzen aus rein analytischen Gründen nicht möglich. Möglich dagegen ist es, mit den derzeit vorhandenen Methoden niedermolekulare Haptene in der Luft und 201

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Zusammenfassung

in Körperflüssigkeiten zu erfassen. Beispiele hierfür sind Dicarbonsäureanhydride, Platinsalze, Isocyanate, etc. Bei der Sensibilisierung durch solche Substanzen sollten Antikörper vom IgG-Typ im Rahmen des Biological Monitoring als Marker einer Exposition bzw. eines Effektes zu verwenden sein. Um diese Frage zu beantworten, müsste untersucht werden, ob zwischen der Höhe der Allergenexposition und dem IgG-Spiegel eine Assoziation besteht. Zu klären ist vor allem, ob die Höhe der Exposition einen Risikofaktor für die Sensibilisierung darstellt. Auf der Grundlage solcher Untersuchungen müsste es gelingen, Schwellenwerte für Allergene herzuleiten, mit denen das Erkrankungs-Risiko gesenkt werden kann. Im Rahmen solcher Untersuchungen sollte auch geprüft werden, ob sich Stoff-spezifische IgEAntikörper als biologische Effektmarker eignen. IgE-Antikörper können heute analytisch z. B. mit RAST erfasst werden. Es ist unmittelbar einsichtig, dass biochemische und in noch stärkerem Maße biologische Effekte dem ultimalen Schadprinzip und damit der Wirkung der Noxe näher stehen als das Dosismonitoring. Das heißt, der prädiktive Wert der Untersuchungsparameter des Biological Monitoring steigt vom Dosismonitoring zum Effektmonitoring an. Problematisch ist allerdings, dass gleichzeitig die Substanzspezifität zum Effektmonitoring hin abnimmt. Vielen Effektparametern, wie z. B. Chromosomenaberrationen oder DNAStrangbruch, ist nicht mehr anzusehen, ob sie als Folge einer Exposition durch polyaromatische Kohlenwasserstoffe oder durch aromatische Amine, etc. entstanden sind. Umgekehrt verhält es sich beim Dosismonitoring. Hier erfasst man den Schadstoff spezifisch, ohne jedoch direkte Aussagen zur Wirkung machen zu können. Der Epidemiologie kommt die Aufgabe zu, Assoziationen zwischen einer Schadstoffbelastung, biochemischen und biologischen Effekten und dem Auftreten von Gesundheitsschäden zu untersuchen. Auch ist zu klären, welche Rolle der Empfindlichkeit der Beschäftigten bei der Entstehung von Krankheiten zukommt. Die Erfassung der Schadstoffbelastung ist bisher eine der Schwachstellen epidemiologischer Studien. Häufig liegen nicht einmal Messungen der chemischen Substanzen in der Luft der Arbeitsplätze oder in anderen umweltrelevanten Medien vor. Die Beschreibung der Belastungssituation nach dem Ja/Nein-Prinzip oder durch Scores hat sich in vielen Studien als ungeeignet erwiesen. Noch seltener sind epidemiologische Studien, bei denen die innere Belastung oder die daraus resultierende Beanspruchung erhoben wurde. Die Durchführung von Studien, bei denen Daten des Dosismonitoring, des Effektmonitoring und ggf. Daten gesundheitlicher Effekte mittels epidemiologischer Methoden miteinander verbunden werden können, erscheint daher dringend geboten. Durch eine solche Assoziation könnten die Vor- und Nachteile der einzelnen Parameter des Biological Monitoring im Hinblick auf ihre diagnostische Validität ausgenutzt bzw. ausgeglichen werden. Durch die Identifizierung der diagnostisch validesten Parameter sollte es gelingen, die Prävention von Gesundheitsschäden nicht nur zu verbessern, sondern gleichzeitig den Aufwand zu begrenzen. 202

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Zusammenfassung

Mittels der Bestimmung der aufgenommenen Schadstoffdosis bzw. der daraus resultierenden biochemischen und biologischen Effekte sind durch epidemiologische Studien präzisere Aussagen über die gesundheitlichen Auswirkungen bei den Exponierten möglich. Durch den Einsatz epidemiologischer Methoden im Bereich des Biological Monitoring sollte es gelingen, Pathomechanismen aufzuklären, Frühstadien von Krankheiten zu erkennen und auch die genetisch determinierte Suszeptibilität in die Risikoabschätzung einzubeziehen. Allerdings muss man beim Einsatz epidemiologischer Methoden im Bereich des Biological Monitoring häufig zu beobachtende methodische Mängel (Validität der Tests, Power der Studie, Selektion der Kontrollgruppe, etc.) ausschließen. Voraussetzung für eine erfolgreiche Forschung auf dem gesamten Gebiet des Biological Monitoring sind Analysenergebnisse, die miteinander, d. h. von Labor zu Labor, vergleichbar sind. Dies bedeutet, dass man Konditionen schafft, die zu einer Minimierung eventueller Einflüsse auf das Analysenergebnis führen. Im Bereich der so genannten präanalytischen Phase, die mit der Vorbereitung des Probanden beginnt und bei der Aufbereitung der biologischen Probe im Labor endet, müssen alle Bedingungen der Probennahme, Probenlagerung, des Probennahmezeitpunkts, etc. standardisiert werden. Die analytische Phase, die im Labor stattfindet, muss durch eine wirksame interne und externe Qualitätssicherung begleitet werden. Wichtige Voraussetzungen sind unter anderem Referenzsubstanzen und Kontrollmaterialien. Die Verfügbarkeit von Referenzsubstanzen stellt ein ständig wachsendes Problem des Biological Monitoring dar. Präparativ tätige Chemiker sind deshalb in die diesbezüglichen Forschung einzubeziehen. Detaillierte Beschreibungen der vollständigen Analysenverfahren (so genannten SOP) führen zu einer weiteren Reduzierung möglicher Einflüsse auf das Analysenergebnis. Was diesen gesamten Bereich der Qualitätssicherung der Analytik anbetrifft, so ist man beim so genannten Dosismonitoring am weitesten fortgeschritten. Bei den biochemischen Effektmarkern und bei den biologischen Effektmarkern steht man dagegen erst am Anfang einer solchen Entwicklung. Entsprechende Aktivitäten müssen deshalb in entsprechende Forschungsvorhaben einbezogen werden. Alle im Rahmen solcher Studien zur Anwendung kommenden analytischen Verfahren sind bezüglich ihrer Validität und Nachvollziehbarkeit zu prüfen, wie es den Kriterien der Arbeitsstoffkommission der Deutschen Forschungsgemeinschaft entspricht. Forschung auf dem Gebiet des biologischen Monitoring bedarf der Zusammenarbeit der verschiedensten Fachgebiete, insbesondere der Toxikologie, Arbeitsmedizin, Umweltmedizin, Allergologie, Humangenetik, analytischen und synthetischen Chemie, Epidemiologie, etc. Da aus diesen Fachgebieten nur ein kleiner, hochspezialisierter Teil der Wissenschaftler auf dem Gebiet der Schadstoffbelastung arbeitet, ist eine Zusammenarbeit auf nationaler Ebene notwendig, da sie innerhalb einer Universität nicht zu leisten ist. 203

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Zusammenfassung

Die heutigen und künftigen Möglichkeiten des Biological Monitoring dienen dazu, die Prävention Schadstoff-bedingter Erkrankungen zu verbessern und gleichzeitig grundlegende Erkenntnisfortschritte in den unterschiedlichen Fachgebieten wie insbesondere Toxikologie, Arbeits- und Umweltmedizin, Allergologie, Chemie und Epidemiologie zu erzielen. Dazu müssen Assoziationen zwischen den Parametern des Biological Monitoring und frühen Indikatoren einer Erkrankung hergestellt werden. Dazu bedarf es der Untersuchung Schadstoff-exponierter Personen und Gruppen der Allgemeinbevölkerung. In die Planung der Untersuchungen sowie bei der Auswertung der Ergebnisse ist epidemiologische Expertise heranzuziehen. Als Parameter des Biological Monitoring sind in diesem Zusammenhang zu sehen: x x x x x x x

die Schadstoff- und Metabolitenkonzentration in Körperflüssigkeiten, Produkte des Intermediärstoffwechsels, Protein- und DNA-Schadstoffaddukte, Geno- und Phänotypen, immunologische Parameter, zytogenetische Parameter, frühe toxische Effekte, z. B. an Nieren, Nervensystem, Lunge, etc.

Zu diesem Zwecke sind x analytische Verfahren zu erarbeiten und zu validieren, mit denen weitere Parameter des Biological Monitoring erschlossen werden können. Dies betrifft neben dem gesamten Bereich des Dosismonitoring vor allem das Effektmonitoring, immunologische und Suszeptibilitätsparameter; x Fortschritte bei der Aufbereitung des biologischen Materials und der Anreicherung zu erzielen; x neue Methoden der instrumentellen Analytik in das Biological Monitoring einzubeziehen. Dies betrifft vor allem die ICP/MS und LC/MS/MS, aber auch Techniken wie Kapillarelektrophorese/MS usw.

Bei allen Untersuchungen ist zu gewährleisten, dass die erhobenen Daten untereinander vergleichbar sind. Dies ist die Voraussetzung zur Ableitung von Schwellenwerten. Um dieses Ziel zu erreichen, sind x bereits vorhandene Verfahren des Biomonitoring, soweit dies nicht bereits durch die Arbeitsstoffkommission der Deutsche Forschungsgemeinschaft vorgenommen worden ist, zu validieren und auf ihre Nachvollziehbarkeit zu prüfen. Dies gilt insbesondere für neue Parameter des Biological Monitoring; x Standardisierungen im Bereich der präanalytischen Phase vorzunehmen. Dies betrifft die Vorbereitung des Probanden auf die Probenahme, die Probenahme, die Probenlagerung, etc.; x Referenzsubstanzen zu synthetisieren; x Maßnahmen der internen und externen Qualitätssicherung durchzuführen, die ihrerseits auf entsprechenden Kontroll- und Referenzmaterialien beruhen.

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9 Adressen der Mitwirkenden am Rundgespräch

Prof. Dr. J. Angerer Institut für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin Universität Erlangen-Nürnberg Schillerstraße 25/29 91054 Erlangen Tel.: 0 91 31/8 52-61 31 Fax: 0 91 31/8 52-61 31 [email protected]. uni-erlangen.de Prof. Dr. H. Bartsch Institut für Toxikologie und Chemotherapie Deutsches Krebsforschungszentrum Im Neuenheimer Feld 280 69120 Heidelberg Tel.: 0 62 21/42-33 01 Fax: 0 62 21/42 33 59 [email protected] Prof. Dr. Dr. H. M. Bolt Institut für Arbeitsphysiologie Abteilung Toxikologie und Arbeitsmedizin Universität Dortmund Ardeystraße 67 44139 Dortmund Tel.: 02 31/10 84-3 48 Fax: 02 31/10 84-3 08 [email protected]

Prof. Dr. H. Drexler Institut für Arbeitsmedizin Universitätsklinikum der RWTH Aachen Pauwelsstraße 30 52057 Aachen Tel.: 02 41/80 88 88-0 (Sek. -1) Fax: 02 41/88 88-477 [email protected] seit 01. 04. 2000: Institut für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin Universität Erlangen-Nürnberg Schillerstraße 25/29 91054 Erlangen Tel.: 0 91 31/8 52-23 12 Fax: 0 91 31/8 52-23 17 [email protected] Prof. Dr. E. Gebhart Institut für Humangenetik Schwabachanlage 10 91054 Erlangen Tel.: 0 91 31/8 52 23 51 Fax: 0 91 31/20 92 97 [email protected]

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Adressen der Mitwirkenden am Rundgespräch

Prof. Dr. H. R. Glatt Deutsches Institut für Ernährungsforschung Abteilung Ernährungstoxikologie Arthur-Scheunert-Allee 114–116 14558 Bergholz-Rehbrücke Tel.: 0 33/2 00-8 84 17 Fax: 0 33/2 00-8 84 26 [email protected] PD Dr. K. Golka Institut für Arbeitsphysiologie an der Universität Dortmund Ardeystraße 67 44139 Dortmund Tel.: 02 31/10 84-3 44 Fax: 02 31/10 84-3 08 [email protected] Prof. Dr. H. Greim Institut für Toxikologie GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, GmbH Ingolstädter Landstraße 1 85764 Oberschleißheim Tel.: 0 89/31 87-24 46 Fax: 0 89/31 87-34 49 [email protected] Prof. Dr. E. Hallier Abteilung Arbeits- und Sozialmedizin Georg-August-Universität Göttingen Waldweg 37 37073 Göttingen Tel.: 05 51/39-49 50 Fax: 05 51/39-61 84 [email protected]

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Prof. Dr. D. Henschler Institut für Toxikologie Universität Würzburg Versbacher Straße 9 97078 Würzburg Tel.: 09 31/2 01-39 84 Fax: 09 31/2 01-34 46 [email protected] Dr. Beate Konze-Thomas Deutsche Forschungsgemeinschaft Kennedyallee 40 53175 Bonn Tel.: 02 28-8 85-22 43 Fax: 02 28-8 85-27 28 [email protected] Dr. J. Lewalter BAYER AG WV-LE Ärztliche Abteilung Institut für Biologisches Monitoring Gebäude L 9 51368 Leverkusen Tel.: 02 14/30-6 56 79 Fax: 02 14/30-2 13 07 Zentr.: 02 14/3 00 [email protected] Prof. Dr. W. K. Lutz Institut für Toxikologie Universität Würzburg Versbacher Straße 9 97078 Würzburg Tel.: 09 31/2 01-54 02 Fax: 09 31/2 01-34 46 [email protected] Dipl.-Biol. M. Maisch Institut für Toxikologie Universität Würzburg Versbacher Straße 9 97078 Würzburg Tel.: 09 31/2 01-39 91 Fax: 09 31/2 01-34 46 [email protected]

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Adressen der Mitwirkenden am Rundgespräch

Dr. M. Müller Abteilung für Arbeits- und Sozialmedizin Georg-August-Universität Göttingen Waldweg 37 37073 Göttingen Tel.: 05 51/39-80 44 Fax: 05 51/39-61 84 + -49 50 [email protected] Prof. Dr. G. Obe Fachbereich 9 Genetik Universität GH Essen Universitätsstraße 5 45117 Essen Tel.: 02 01/1 83-33 88 Sek. 02 01/1 83-28 66 [email protected] PD Dr. W. Pfau Unviersitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Vogt-Kölln-Str. 30 22527 Hamburg Tel.: 0 40/4 28 83 21 27 [email protected]

Prof. Dr. G. Speit Abteilung Medizinische Genetik Universitätsklinikum Ulm Albert-Einstein-Allee 11 89081 Ulm Tel.: 07 31/5 02 34 29 Fax: 07 31/5 02 34 38 [email protected] Dr. B. Spiegelhalder Institut für Toxikologie und Chemotherapie Deutsches Krebsforschungszentrum Im Neuenheimer Feld 280 69120 Heidelberg Tel.: 0 62 21/42-33 05 Fax: 0 62 21/42-33 08 [email protected] PD Dr. K. Straif M. P. H. Institut für Epidemiologie und Sozialmedizin\UniversitätMünster Domagkstraße 3 48129 Münster Tel.: 02 51/83 55-3 98 Fax: 02 51/83 55-3 00 [email protected]

Prof. Dr. A. W. Rettenmeier Institut für Hygiene und Arbeitsmedizin Universitätsklinikum der GH Essen Hufelandstraße 55 45147 Essen Tel.: 02 01/7 23-45 74 + -45 75 Fax: 02 01/7 23-59 11 a. [email protected]

PD Dr. Ricarda Thier Institut für Arbeitsphysiologie Universität Dortmund Ardeystraße 67 44139 Dortmund Tel.: 02 31/10 84-3 48 Fax: 02 31/10 84-4 03 [email protected]

Prof. Dr. G. Sabbioni Walther-Straub-Institut für Pharmakologie und Toxikologie Ludwig-Maximilians-Universität Münschen Nussbaumstraße 26 80336 München Tel./Fax: 0 89/51 60 72 65 [email protected]

Prof. Dr. K. Ulm Institut für Medizinische Statistik und Epidemiologie TU München Ismaninger Straße 22 81675 München Tel.: 0 89/41 40-43 23 Fax: 0 89/41 40-43 20 [email protected] 207

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Adressen der Mitwirkenden am Rundgespräch

Prof. Dr. M. Wilhelm Institut für Hygiene, Sozial- und Umweltmedizin Ruhr-Universität Bochum Universitätsstraße 50 44801 Bochum Tel.: 02 34 /3 22-23 65 Fax: 02 34 /32 14-199 [email protected]

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