Genes IX

BENJAMIN LEWIN

Cuando se publicó la primera edición de GENES, Benjamín Lewin establecíó el estándar de la enseñanza de la biología y genética moleculares con un abordaje unificado. La novena edición de este libro clásico continúa con dicha tradición. presenta la estructura y función de los genes en organismos eucariotos y procariotos. El Dr. Lewin mantiene el compromiso de proporcionar a los estudiantes, investigadores y educadores los conceptos actuales en este campo que cambia en forma constante. La novena edición de GENES incluye contenido actualizado y una cobertura más amplia de temas fundamentales con una nueva organi zación que le permite al estudiante enfocarse con mayor precisión en los genes y en su expresión. GENES /X también ostenta un diseño moderno, nuevo y un programa contemporáneo. Características nuevas y principales de GENES IX • Mayor cobertura en numerosas áreas, que incluye: - Replicación del DNA - Recombinación y reparación - El replicón

- Regulación de la cromatina y regulación génica -Evolución de los genes - El cromosoma Y

• Reorganización para permitir a los instructores construir conceptos críticos a lo largo del curso. • Nuevo diseño contemporáneo y un impactante programa de arte de cuatro colores. • Nuevas actualizaciones de principio a fin, que incluyen información actua l referente a la organización del genoma, replicación del DNA. regu lación génica y mucho más .

•

Educación ISBN·13; 978·970·10-8685·0 ISBN-10; 970·10·6685-5

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Editado por

Benjamin Lewin, PhD Geneticist Cambridge University Novena edición Traducción:

Héc:tor Barrera Villa Zevallos Félix García Roig

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Editor sponsor: C<~milo Her<~s Manfnez Corrección. de fSiilo: Guillermina Cuev<~s Meza y Elia Olvera ,Manínez Supe,.visióll de edició11: Leonora Vélíz Sala zar Supervisión de producción: José Luis González lluerta Composici611 y formacióll: By Color Soludones Gráficas

NOTA

La medicina es una ciencia en constante des.arrollo. Conlorme suqan nuevos conocimientos, se req uerirán cambios de la terapéutica. El (los) autor(es) y los edi tores se han esforzado para que los cuadros de dosificación medicamentosa sean precisos y acordes con lo establecido en la techa de publicación. Sin embargo, ante los posibles errores humanos y cambios en la medicina, ni los editores ni cualquier otra persona que haya participado en la preparación de la obra garantizan que la información contenida en ella sea precisa o completa, tampoco son responsables de errores u omls;iones, ni de los resultados que con dicha información se obtengan. Convendrla recurrir a otras fuentes de dalas, por ejemplo, y de manera part¡cular, habrá que consultar la hoja informativa que se adjunta con cada medicamento, para tener certeza de que la información de esta, obra es precisa y no se han in\roducido cambios en la dosis recomendada o en las contraindicaciones para su admin¡stradón. Esto es de particular importancia con respecto a fármacos nuevos o de uso no frecuente . También deberá consultarse a los laboratorios para recabar información sobre los valores normales

GENES IX

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oc

ISBN 10: 970-10-6685-5 ISBN 13: 978-970-1 0-6685-0

Translated from the n1nth English editío11 oJ: Ganes IX Edilcd by Benjamín Lewin Copyright© 2008 by Jones & Banletl I'ublíshers. Tnc., 40 Taii.Pine Drive. Sudblli'\', MA 01776 All Rights Rt$ei'Ved ISBN lO: 076371!0632 lSBN l3: 9780763740634

1234567890 Impreso en México

0976543ll0S Printed in Mexico

Impreso en México en Abril del 2008 Impreso por Editori al Impresora A polo

Printed in Mexico in April 2008 Prin ted by Ed itorial Impresora Apolo

Contenido abreviado

Contenid o vi Prefacio xvi

e

e

Los genes son DNA

1

Los genes codifican proteínas

23

O El gen interrumpido 37 O ELcontenido del genoma 55 O Secuencias genómicas y números de genes

e

Agrupamientos y repeticiones

O El RNA mensajero 127 O Síntesis proteínica 151 O Utilización del código genético

e e e e

e e e

Localización de Las proteínas Transcripción El operón

98

189 218

256

300

El replicón

con el ciclo celular 408

G)

Recombinación homóloga y específica

La replicación bacteriana está conectada

Replicación del DNA 428

de sitio

457

G) Sistemas de reparación

76

e e e e

e e e e e

Transposones

499

521

Retrovirus y retroposones Diversidad inmunitaria

550

570

Promotores y potenciadores Activación de la transcripción

609 640

Corte, empalme y procesamiento del RNA RNA catalítico

349

376

Replicones extracromosómicos 392

e

667

706

Cromosomas 729 Nucleosomas

757

G) Control de La estructura de La cromatina

RNA regulador 331 Estrategias de los fagos

e e

796

Los efectos epigenéticos son heredados 818

Glosario 845 Índice alfabético 867

V

Contenido

Prefacio xvi

1 Los genes son DNA

1

Introducción 2 El DNA es el material genético de las bacterias 3 El DNA es el material genético de los virus 4 E: DNA es el material genético de las células animales 5 Los polinucleótidos tienen bases nitrogenadas ligadas a un esqueleto de azúcar-fosfato 6 El DNA es una hélice dúplex 6 La duplicación del DNA es semiconservadora 8 Las cadenas de DNA se separan en la horquilla de duplicación 9 La información genética puede ser proporcionada por el DNA o por el RNA 10 Los ácidos nucleicos se hibridan por apareamiento de bases 12 Las mutaciones cambian la secuencia del DNA 14 Las mutaciones pueden afectar a pares de bases individuales o a secuencias más largas 15 Los efectos de las mutaciones pueden ser revertidos 16 Las mutaciones se concentran en puntos calientes 17 Numerosos puntos calientes son resultado de bases modificadas 18 Algunos agentes hereditarios son extremadamente pequeños 19 Resumen 20

2 los genes codifican proteínas

23

Introducción 24 Un gen codifica a un solo polipéptido 24 Las mutaciones que se presentan en el mismo gen no se pueden complementar 25 Las mutaciones pueden provocar pérdida o ganancia de función 26

vi

Un locus puede tener numerosos aletos mutantes diferentes 27 Un locus puede tener más de un alelo de tipo silvestre 28 La recombinación ocurre por al intercambio físico de DNA 28 El código genético se lee en tripletes 30 Cada secuencia tiene tres marcos de lectura posibles 31 Los genes procarióticos son colineales con sus proteínas 32 Numerosos procesos son necesarios para expresar el producto proteínico de un gen 33 Las proteínas actúan en trans, pero los sitios del DNA, en cis 35 Resumen 36

3 El gen interrumpido 37 Introducción 38 Un gen interrumpido está formado por intrones y exones 38 Las endonucleasas de restricción son una herramienta esencial en el mapeo del DNA 39 La organización de los genes interrumpidos puede conservarse 40 Las secuencias de los exones se conservan, pero las de los intrones vañan 42 La distribución de tamaños de los genes es amplia 43 Algunas secuencias de DNA codifican a más de una proteína 45 ¿Cómo evolucionaron los genes interrumpidos? 47 Algunos exones pueden equipararse con funciones proteínicas 49 Los miembros de una familia de genes tienen una organización común 51 ¿Se encuentra toda la info rmación genética contenida en el DNA? 53 Resumen 53

4

El contenido del genoma 55 Introducción 56 Pueden trazarse mapas de tos genomas por ligamiento, por restricción, por división o por secuencia de DNA 56 los genomas individuales son muy variables 57 los RFlP y los SNP pueden ser utilizados para el mapeo genético 58 ¿Por qué los genomas son tan grandes? 60 Los genomas eucarióticos contienen secuencias de DNA repetitivas y no repetitivas 61 Los genes pueden ser aislados por la conservación de los exones 63 La conservación de la organización del genoma ayuda a identificar genes 65 Los organelos contienen DNA 67 Los genomas de los organelos son moléculas circulares de DNA que codifican proteínas de los organelos 69 La organización del DNA mitocondrial es variable 70 El genoma de los cloroplastos codifica a numerosas proteínas y moléculas de RNA 71 Las mitocondrias evolucionaron por endosimbiosis 72 Resumen 73

5 Secuencias gen ómicas y números de genes 76 &D

Introducción 77 El número de genes bacterianos abarca un rango superior de un orden de magnitud 77 En numerosas eucariotas se conoce el número total de genes 79 ¿Cuántos tipos diferentes de genes hay? 81 El genoma humano tiene menos genes que los esperados 83 ¿Cómo se distribuyen los genes y otras secuencias en el genoma? 85 El cromosoma Ytiene varios genes específicos de la masculinidad 86 Las especies más complejas evolucionan agregando nuevas funciones génicas 87 ¿Cuántos genes son esenciales? 89 Los genes se expresan en niveles muy diferentes 92 ¿Cuántos genes se expresan? 93 El número de genes expresados puede medirse en masa 93 Resumen 94

6 Agrupamientos y repeticio nes 98

011

mi

Introducción 99 La duplicación de los genes es una fuerza importante en la evolución 100 Los agrupamientos de las globinas son formados por duplicación y por divergencia 101 La divergencia secuencial es la base del reloj evolutivo 104 La velocidad de sustitución neutral puede ser medida a partir de la divergencia de secuencias repetidas 107 Los seudogenes son callejones sin salida de la evolución 108 Mediante entrecruzamiento desigual se reestruct uran los agrupamientos de genes 109 Los genes del RNAr forman repeticiones en tándem 112 Los genes repetidos de RNAr mantienen una secuencia constante 114 La fijación entrecruzada podría mantener repeticiones idénticas 115 Los DNA satélite a menudo se encuentran en la heterocromatina 117 Los satélites de los artrópodos tienen repeticiones idénticas muy cortas 119 Los satélites de los mamíferos consisten de repeticiones jerárquicas 120 Los minisatélites facilitan el mapeo genético 123 Resumen 125

7 El RNA mensajero

.a

DfJI

127

Introducción 128 El RNAm se produce por transcripción y se traduce 129 El RNA de transferencia fo rma una hoja de trébol 130 El tallo aceptar y el anticodón se encuentran en los extremos de la estructura terciaria 131 El RNA mensajero es traducido por los ribosomas 132 A una molécula de RNAm se unen numerosos ribosomas 133 El ciclo vital del RNA mensajero de las bacterias 135 El RNAm eucariótico es modificado durante su transcripción o después de ésta 13 7 El extremo 5' del RNAm eucariótico posee un casquete 138 El extremo 3' está poliadenilado 139 La degradación del RNAm bacteriano involucra a múltiples enzimas 140 La estabilidad del RNAm depende de su estructura y de su secuencia 141 Contenido

vii

La degradación del RNAm involucra a múltiples actividades 143 Las mutaciones sin sentido activan un sistema de vigilancia 144 Las moléculas de RNA eucariótico se transportan 145 El RNAm puede localizarse específicamente 146 Resumen 147

8 Síntesis proteínica

Introducción 151 La síntesis proteínica ocurre por iniciación, elongación y terminación 153 La precisión de la síntesis proteínica es controlada por mecanismos especiales 156 La iniciación en las bacterias requiere de subunidades 305 y de factores accesorios 157 Un RNAt iniciador especial comienza la cadena polipeptldica 158 El uso del fMet-RNAt, está controlado por el IF-2 y por el ribosoma 160 La iniciación implica el apareamiento de bases entre el RNAm y el RNAr 161 Las subunidades pequeñas buscan sitios de iniciación en el RNAm eucariótico 162 Las eucariotas utilizan un complejo formado por numerosos factores de iniciación 164 El factor de elongación Tu carga al aminoacil-RNAt en el sitio A 167 La cadena polipeptídica se transfiere al aminoacil-RNAt 168 La translocación mueve al ribosoma 169 Los factores de elongación se unen alternativamente al ribosoma 170 La síntesis proteínica termina con tres codones 172 Los codones de terminación son reconocidos por factores proteínicos 173 El RNA ribosómico se extiende en ambas subunidades ribosómicas 17 5 Los ribosomas tienen numerosos centros activos 177 El RNAr 165 desempeña un papel activo en la síntesis proteínica 179 El RNAr 235 tiene actividad peptidil transferasa 182 Las estructuras ribosómicas cambian cuando se unen las subunidades 183 Resumen 183

.. 9

Utilización del código genético Introducción 190

viii

151

Contenido

189

•

1

UD

Los codones relacionados representan a aminoácidos relacionados 190 El reconocimiento codón-anticodón involucra balanceo 192 Los RNAt son procesados a partir de precursores más largos 194 El RNAt contiene bases modificadas 194 Las bases modificadas afectan el apareamiento codónanticodón 196 El código universal tiene alteraciones esporádicas 197 En ciertos codones de terminación pueden insertarse aminoácidos nuevos 199 Los RNAt son cargados con aminoácidos por medio de sintetasas 200 Las ami noacil-RNAt si ntetasas se clasifican en dos grupos 201 Las sintetasas utilizan mecanismos de corrección para incrementar la precisión 203 Los RNAt supresores tienen anticodones mutados que leen a codones nuevos 206 Hay supresores de mutaciones sin sentido para cada codón de terminación 207 Los supresores pueden competir con la lectura de tipo silvestre del código 208 El ribosoma influye en la precisión de la traducción 209 La modificación de la codificación cambia el significado de los codones 211 Los cambios del marco de lectura ocurren en las secuencias resbaladizas 213 La evasión implica el movimiento del ribosoma 214 Resumen 215

10 Localización de las proteínas

218

Introducción 220 El desplazamiento a través de una membrana requiere de un mecanismo especial 220 La translocación de las proteínas puede ser posterior a la traducción o durante ésta 221 Los chaperones pueden ser necesarios para el plegamiento de las proteínas 223 Las proteínas desnaturalizadas y las recién sintetizadas necesitan chaperones 224 La familia Hsp70 es ubicua 226 Las secuencias de señal inician la translocación 227 La secuencia de señal interactúa con la SRP 228 La SRP interactúa con et receptor de 5RP 229 El traslocón forma un poro 231

II!IIft

iiiiD IIiiili IJi:ll1)

1m)

La translocación requiere de inserción en el traslocón y (en ocasiones) de un trinquete en el ER 233 La translocación inversa envía proteínas al citosol para que sean degradadas 234 Las proteínas residen en las membranas por medio de regiones hidrófobas 235 Las secuencias de anclaje determinan La orientación de las proteínas 236 ¿Cómo se insertan las proteínas en las membranas? 238 La inserción en la membrana después de la traducción depende de las secuencias líder 240 Una jerarquía de secuencias determina la localización dentro de los organelos 241 Las membranas mitocondriales interna y externa tienen traslocones distintos 243 Los peroxisomas emplean otro tipo de sistema de translocación 245 Las bacterias utilizan tanto translocación cotraduccional como translocación postraduccional 246 El sistema Sec transporta proteínas al interior de la membrana interna y a través de ella 247 Sistemas de translocación independientes de Sec en f. coli 249 Resumen 250

11 Transcripción

...

0111 La eficiencia de los promotores puede incrementar o

DE ,....

12 El operón -

256

Introducción 258 La transcripción ocurre por medio de apareamiento de bases en una "burbuja" de DNA no apareado 259 La reacción de la transcripción consiste en tres etapas 260 La polimerasa de RNA del fago T7 es un sistema de modelos útil 261 La estructura cristalina sugiere un modelo de desplazamiento enzimático 262 La polimerasa de RNA bacteriana está formada por múltiples subunidades 265 La polimerasa de RNA está formada por la enzima central y por un factor a 267 La asociación con el factor a cambia en la iniciación 267 Una polimerasa de RNA varada puede reiniciar la transcripción 269 ¿Cómo encuentra una polimerasa de RNA las secuencias promotoras? 270 El factor cr controla la unión al DNA 271 El reconocimiento del promotor depende de las secuencias de consenso 272

disminuir por medio de mutaciones 274 La polimerasa de RNA se une a una cara del ONA 275 El superenrollamiento es una característica importante de la transcripción 277 La sustitución de los factores a puede controlar la iniciación 278 Los factores a entran en contacto de manera directa con el DNA 280 Los factores cr pueden organizarse en cascadas 282 La esporulación es controlada por factores a 283 La polimerasa de RNA bacteriana termina en sitios discretos 286 Hay dos tipos de terminadores en E. co/i 287 ¿Cómo funciona el factor p? 288 La antiterminación es un episodio regulador 291 La antiterminación requiere sitios que son independientes de los terminadores 292 Los factores de terminación y de antiterminación interactúan con la polimerasa de RNA 293 Resumen 295

l6lfJ

1fD IDiM

300

.Introducción 302 La regulación puede ser positiva o negativa 303 Los agrupamientos de genes estructurales son controlados de manera coordinada 304 Los genes loe son controlados por un represor 305 EL operón loe puede ser inducido 305 EL represor es controlado por una pequeña molécula inductora 307 Las mutaciones constitutivas de actuación en cis identifican al operador 308 Las mutaciones de actuación en trans identifican al gen regulador 309 Las proteínas multiméricas tienen propiedades genéticas especiales 309 El monómero represor tiene numerosos dominios 310 Un represor es un tetrámero formado por dos dímeros 311 La unión al DNA es regulada por una cambio alostérico en la conformación 312 Los fenotipos mutantes se correlacionan con la estructura del dominio 312 La proteína represora se une al operador 313 La unión del inductor libera al represor del operador 314 El represor se une a tres operadores e interactúa con la polimerasa de RNA 315 El represor siempre está unido al DNA 316 Contenido

ix

~

lf.ZE

El operador compite con los sitios de baja afinidad para unirse al represor 317 la represión puede suceden en múltiples Loci 319 El AMP cíclico es un efector que activa al factor CRP para que actúe en múltiples operones 320 El factor CRP funciona de formas diferentes en operones diana distintos 321 la traducción puede ser regulada 323 La síntesis de las proteínas r es controlada por medio de regulación autógena 325 la p32 del fago T4 es controlada por un circuito autógeno 326 la regulación autógena se utiliza frecuentemente para controlar la síntesis de ensambles macromoleculares 327 Resumen 328

13 RNA reg ulador

IIIB

331

Introducción 332 las estructuras secundarias alternativas controlan la atenuación 333 la terminación de los genes trp de Bocillus subtilis es controlada por el triptófano y por el RNAtr'P 333 El operón triptófano de Escherichia coli es controlado por medio de atenuación 335 La atenuación puede ser controlada por la traducción 336 El RNA antisentido puede ser utilizado para desactivar la expresión génica 338 las moléculas pequeñas de RNA son capaces de regular la traducción 339 las bacterias contiene RNA reguladores 341 los microRNA son reguladores en numerosas eucariotas 342 la interferencia de RNA está relacionada con el silenciamiento de los genes 343 Resumen 345

14 Estrategias de los fago s

111111

1B11

x

349

Introducción 350 El desarrollo lítico se divide en dos periodos 352 El desarrollo lítico es controlado por una cascada 353 la cascada lltica es controlada por dos tipos de sucesos reguladores 354 los genomas de los fagos T4 y T7 presentan agrupación funcional 355 Los genes A. tempranos inmediatos y tempranos retrasados son indispensables para la lisogenia y para el ciclo lítico 356 Contenido

lmiil

DI'B

El ciclo lítico depende de la antiterminación 357 la lisogenia la mantiene una proteína represora 359 El represor y sus operadores definen la región de inmunidad 360 la forma de unión al DNA del represor es un dímero 361 El represor utiliza un elemento hélice-giro-hélice para unirse al DNA 362 La hélice de reconocimiento determina la especificidad por el DNA 363 Los dímeros represores se unen en colaboración al operador 364 El represor en OR2 interactúa con la polimerasa de RNA en el PR,.. 365 El represor mantiene un circuito autógeno 366 Las interacciones en colaboración incrementan la sensibilidad de la regulación 367 Los genes cii y ciii son necesarios para establecer la lisogenia 368 Un mal promotor requiere proteína cii 369 La lisogenia requiere numerosos sucesos 369 El represor Cro es necesario para la infección lítica 371 ¿Qué determina el balance entre la lisogenia y el ciclo lTtico? 373 Resumen 374

15 El re plicón 1111

~

111iZJ

376

Introducción 377 Los replicones pueden ser lineales o circulares 378 Es posible elaborar el mapa de los orígenes con autorradiografía y electroforesis 379 ¿Regula la metilación del origen La iniciación? 380 Los orígenes pueden ser secuestrados después de la replicación 381 Cada cromosoma eucariótico contiene numerosos replicones 383 En las levaduras pueden aislarse los orígenes de replicación 384 El factor de competencia controla a la replicación eucari6tica 385 El factor de competencia está formado por proteínas MCM 386 los lazos Omantienen a los orígenes mitocondriales 388 Resumen 389

16 Replicones extracromosómicos Introducción

393

392

Los extremos del DNA lineal representan un problema para la replicación 393 las proteínas terminales permiten la iniciación en los extremos de los DNA víricos 394 los círculos rodantes producen multimeros de un replicón 396 Los clrculos rodantes se utilizan para replicar los genomas de los fagos 397 El plásmido F es transferido por conjugación entre bacterias 398 La conjugación transfiere DNA de cadena individual 400 El plásmido bacteriano Ti provoca la enfermedad de agalla de Crown en las plantas 401 El T-ONA porta los genes necesarios para la infección 402 La transferencia del T-ONA es semejante a la conjugación bacteriana 405 Resumen 407

17 La replicación bacteriana está

conectada con el ciclo celular 408

1Jm1

1JJ1D

Introducción 409 La replicación está conectada con el ciclo celular 410 EL septo divide a una bacteria en bacterias hijas que contienen cada una un cromosoma 411 Las mutaciones de la división o la segregación alteran la forma de la célula 412 El producto FtsZ es necesario para la formación del septo 413 Los genes min regulan la localización del septo 415 La segregación cromosómica puede requerir de recombinación específica de sitio 415 La partición implica a la separación de los cromosomas 417 Los plásmidos de una sola copia tienen un sistema de partición 419 La incompatibilidad de los plásmidos depende del replicón 421 El sistema de compatibilidad ColE1 es controlado por un regulador de RNA 422 ¿Cómo se replican y segregan las mitocondrias? 424 Resumen 425

18 Replicación del DNA liD

428

Introducción 429 las polimerasas de DNA son enzimas que sintetizan DNA 430

Las polimerasas de DNA tienen varias actividades de nucleasa 431 Las polimerasas de ONA controlan la fidelidad de la replicación 432 Las polimerasas de DNA tienen una estructura común 433 La síntesis de DNA es semidiscontinua 434 El modelo cpX muestra cómo se genera el ONA de cadena individual para la replicación 435 La actividad cebadora es necesaria para iniciar la síntesis de DNA 437 la holoenzima polimerasa de ONA tiene tres subcomplejos 439 La pinza controla la asociación de la enzima central con el DNA 440 Coordinación de la síntesis de la cadena líder y de la cadena retrasada 442 Los fragmentos de Okazaki están unidos por la ligasa 443 Polimerasas de ONA eucarióticas independientes realizan la iniciación y la elongación 444 El fago T4 proporciona su propio mecanismo de replicación 44 S Creación de las horquillas de replicación en el origen 448 Sucesos comunes en el cebamiento de La replicación en el origen 450 El primosoma es necesario para reiniciar la replicación 451 Resumen 453

19 Recombinación homó loga y específica de sitio 45 7 Introducción 459 Ocurre recombinación homóloga entre cromosomas en sinapsis 460 Rotura y reunión afectan el DNA heterodúplex 462 Las roturas de la doble cadena inician la recombinación 464 los cromosomas en recombinación se conectan por el complejo sinaptonémico 465 El complejo sinaptonémico se forma después de roturas de la doble cadena 467 El apareamiento y la formación del complejo sinaptonémico son independientes 469 las secuencias chi estimulan el sistema RecBCD bacteriano 470 Las proteínas de transferencia de cadena catalizan la asimilación de una sola cadena 471 Contenido

xi

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n:fE mil 1m"

El sistema Ruv resuelve las uniones Holliday 473 la conversión génica contribuye a la recombinación interalélica 475 El superenroltamiento afecta la estructura del DNA 476 las topoisomerasas relajan o introducen superhélices en el DNA 478 Las topoisomerasa rompen y resellan cadenas 480 la girasa funciona por la inversión de hélice 481 la recombinación especializada involucra sitios específicos 482 la recombinación específica de sitio comprende rotura y re unión 484 La recombinación específica de sitio simula la actividad de la topoisomerasa 484 l a recombinación f.. ocurre en un intasoma ·486 Las levaduras pueden cambiar loci silentes y activos por el tipo de apareamiento 488 Ellocus MAT codifica proteínas reguladoras 490 Se reprimen los cartuchos silentes en HML y HMR 492 Ellocus MAT receptor inicia la transposición unidireccional 493 la regulación de la expresión de HO controla el cambio 494 Resumen 496

20 Sistemas de reparación I!UD

fi!D

fiiD 111111 llilfJ

xii

fJm.

499

Introducción 500 Los sistemas de reparación corrigen el daño del ONA 502 Sistemas de reparación por escisión en E. coH 503 Vlas de reparación por escisión en células de mamíferos 504 Las metilasas y las glucosilasas "lanzan" las bases 506 Reparación susceptible de error y fenotipos mutadores 507 Control de la dirección de la reparación de apareamientos erróneos 507 Sistemas de reparación por recombinación en f. coli 510 La recombinación es un mecanismo importante de recuperación ante errores de replicación 511 La proteína RecA desencadena el sistema SOS 513 las células eucarióticas tienen sistemas de reparación conservados 515 Un sistema común repara roturas de la doble cadena 516 Resumen 518 Contenido

21 Transposones

521

Introducción 522 las secuencias de inserción son simples módulos de transposición sencillos 524 los transposones compuestos tienen módulos IS 525 la transposición ocurre por mecanismos replicativos y no re plicativos 527 Los transposones causan reestructuración del DNA 528 Intermediarios comunes para la transposición 530 La transposición replicativa avanza a través de un cointegrado 531 La transposición no replicativa avanza por rotura y reunión 533 La transposición de TnA requiere transposasa y resolvasa 534 La transposición de TnlO tiene múltiples controles 534 los elementos de control en el maíz causan roturas y reestructuraciones 538 Los elementos de control forman familias de transposones 540 los elementos Spm influyen en la expresión génica 542 Intervención de los elementos susceptibles de transposición en la disgenesia híbrida 544 los elementos P se activan en la línea germinal 545 Resumen 546

22 Retrovirus y retroposones

f1D

550

Introducción 551 El ciclo vital de los retrovirus comprende sucesos similares a la transposición 551 los genes retroviricos codifican poliproteínas 552 El DNA vírico se genera por transcripción inversa 554 El DNA vírico se integra al cromosoma 556 Los retrovirus pueden hacer transducción de secuencias celulares 558 Los elementos Ty de las levaduras se asemejan a los retrovirus 559 Muchos elementos susceptibles de transposición residen en la Drosophi/o melanogaster 561 los retroposones son de tres clases 562 La familia Alu tiene muchos miembros muy dispersos 564 los seudogenes procesados se originaron como sustratos para la transposición 565 las UNES utilizan una endonucleasa para generar un extremo con actividad cebadora 566 Resumen 567

23 Diversidad inmunitaria fiD

filE)

fi!I!]

570

Introducción 572 La selección clona! amplifica linfocitos que responden a antígenos individuales 574 Los genes de [as inmunoglobulinas se ensamblan en los linfocitos a partir de sus constituyentes 575 Las cadenas ligeras se ensamblan por recombinación simple 577 Las cadenas pesadas se ensamblan mediante dos recombinaciones 579 La recombinación genera una gran diversidad 580 La recombinación inmunitaria utiliza dos tipos de secuencias de consenso 581 La recombinación genera deleciones o inversiones 582 La exclusión alélica es desencadenada por rearreglo productivo 582 Las proteínas RAG catalizan la rotura y la nueva unión 584 la expresión temprana de las cadenas pesadas puede cambiar por procesamiento del RNA 586 El cambio de clase es producto de la recombinación del DNA 587 El cambio se debe a una nueva reacción de recombinación 589 La mutación somática genera otras diferencias entre el ratón y el ser humano 590 La desaminasa de citidina y la glucosilasa de uracilo inducen la mutación somática 591 Las inmunoglobulinas aviarias se ensamblan a partir de seudogenes 593 La célula B de memoria permite una respuesta secundaria rápida 594 Los receptores de las células T tienen relación con las inmunoglobulinas 595 El receptor de la célula T actúa en unión con el MHC 597 Ellocus de histocompatibilidad mayor codifica muchos genes del sistema inmunitario 599 la inmunidad innata hace uso de vías de señal conservadas 602 Resumen 604

24 Promotores y potenciadores

609

Introducción 610 las polimerasas de RNA eucarióticas constan de muchas subunidades 612 Los elementos del promotor se definen por mutaciones y vestigios 613 la polimerasa de RNA 1 tiene un promotor bipartido 614

61J1

La polimerasa de RNA lli utiliza promotores en flujo ascendente y descendente 615 TFmB es el factor de encargo de los promotores de Po! III

mil

616

El punto de inicio de la polimerasa de RNA TI 618 La TBP es un factor universal 619 La TBP se une al DNA de forma inusual 620 El aparato basal se ensambla en el promotor 621 El inicio va seguido de la depuración del promotor 623 Una conexión entre transcripción y re paración 625 Los elementos de secuencia corta se unen a activadores 627 La estructura del promotor es flexible, pero el contexto puede ser importante 628 Los potenciadores contienen elementos bidireccionales que facilitan el inicio 629 Los potenciadores contienen los mismos elementos encontrados en los promotores 630 los potenciadores actúan aumentando la concentración de activadores cerca del promotor 631 la expresión genética se vincula con la desmetilación 632 Los islotes CpG son dianas reguladoras 634 Resumen 635

25 Activació n de la transcripción

640

Introducción 641 Hay varios tipos de factores de transcripción 642 Dominios independientes se unen con el DNA y activan la transcripción 643 El análisis de dos híbridos detecta interacciones proteína-proteína 645 Los activadores interactúan con el aparato basal 646 Algunas proteínas de unión con promotor corresponden a represores 648 Los elementos de respuesta son reconocidos por los activadores 649 Hay muchos tipos de dominios de unión con DNA 651 El segmento de dedo de zinc es un dominio de unión con DNA 652 los receptores de esteroides son activadores 653 los receptores de esteroides tienen dedos de zinc 655 la unión con el elemento de respuesta se activa por unión con un ligando 656 los receptores de esteroides reconocen a los elementos de respuesta por un código combinatorio 657 Los homeodominos se unen con dianas relacionadas en el DNA 658 Contenido

xiH

Las proteínas hélice-asa-hélice interactúan por vínculo combinatorio 658 Las cremalleras de Levana participan en la formación de dímeros 658 Resumen 658

26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

f.ZBJ xiv

Contenido

~

GIIi]

flD

fl:ID

~

....

flB

667

Introducción 669 Las uniones de corte y empalme nuclear son secuencias cortas 670 Las uniones de corte y empalme se leen por pares 671 El corte y empalme del pre-RNAm procede a través de un lazo 673 Se requieren RNAsn para el corte y empalme 674 La RNPsn U1 inicia el corte y empalme 676 El complejo E puede formarse por definición de intrón o exón 678 Cinco RNPsn forman el empalmosoma 679 Un aparato alternativo de corte y empalme utiliza diferentes RNPsn 681 El corte y empalme está relacionado con la exportación del RNAm 682 Los intrones del grupo II se cortan y empalman a si mismos por la formación de un lazo 683 El proceso de corte y empalme alternativo implica el uso diferencial de uniones de corte y empalme 865 Las reacciones de corte y empalme en configuración trans utilizan RNA pequeños 688 El corte y empalme del RNAt de las Levaduras implica escisión y reunión 690 La endonucleasa de corte y empalme reconoce al RNAt 691 La escisión y ligadura del RNAt son reacciones separadas 692 La respuesta de la proteína no plegada tiene relación con el corte y empalme del RNAt 693 Los extremos 3' de los productos de transcripción pol I y pol m se generan por terminación 694 Los extremos 3' del RNAm se generan por escisión y poliadenilación 695 la escisión del extremo 3' del RNAm de histonas puede requerir de un RNA pequeño 697 la producción de RNAr requiere de sucesos de escisión 697 Se requieren RNA pequeños para el procesamiento del RNAr 699 Resumen 700

~

27 RNA catalítico

fl.ll

28 Cromosomas

fZD

60

fl;JE

~

706

Introducción 707 los intrones del grupo 1 realizan el autocorte y empalme por transesterificación 707 los intrones del grupo 1 forman una estructura secundaria característica 709 Las ribozimas tienen varias actividades catalíticas 711 Algunos intrones del grupo I codifican a endonucleasas que fomentan la movilidad 715 Los intrones del grupo II pueden codificar proteínas multifuncionales 716 Algunos intrones de autocorte y empalme requieren de madurasas 717 la actividad catalítica de la ribonucleasa P se debe al RNA 718 los viroides tienen actividad catalítica 718 La edición del RNA ocurre en bases individuales 720 La edición del RNA puede ser dirigida por RNA guias 721 El corte y empalme de las proteínas son autocatalíticos 724 Resumen 725

729

Introducción 730 Los genomas víricos están empaquetados en sus cubiertas 731 El genoma bacteriano es un nucteoide 734 El genoma bacteriano está superenrollado 735 El DNA eucariótico tiene asas y dominios unidos a un bastidor 736 Secuencias especificas unen el DNA a una matriz de interfase 737 La cromatina se divide en eucromatina y heterocromatina 738 Los cromosomas tienen patrones de bandas 740 Los cromosomas en escobillón se extienden 741 Los cromosomas politénicos forman bandas 742 los cromosomas politénicos se expanden en sitios de expresión génica 743 El cromosoma eucariótico es un dispositivo de segregación 744 Los centrómeros pueden contener DNA repetitivo 746 Las secuencias de DNA de Los centrómeros de S. cerevisiae son cortas 747 El centrómero se une a un complejo proteínico 748 los telómeros tienen secuencias de repetición sencillas 748 Los telómeros sellan los extremos de los cromosomas 749

ff!El ~

~

Los telómeros se sintetizan mediante una enzima ribonucleoproteinica 750 Los telómeros son esenciales para la supervivencia 752 Resumen 753

29 Nucleosomas

611

• •

BU

liD

757

Introducción 758 El nucleosoma es la subunidad de La cromatina 759 El DNA está enrollado en la estructura de los nucleosomas 761 Los nucleosomas tienen una estructura común 762 La estructura del DNA varía en La superficie del nucleosoma 763 La periodicidad del DNA cambia en el nucleosoma 766 Organización del octámero de histonas 767 la vía de los nucleosomas en la fibra de cromatina 769 La replicación de La cromatina implica el ensamblaje de los nucleosomas 771 ¿Los nucleosomas yacen en posiciones específicas? 774 ¿los genes transcritos se organizan en nucleosomas? 777 los octámeros de histonas son desplazados por \a transcripción 779 El desplazamiento del nucleosoma y su reensamblado requieren factores especiales 781 Los aislantes impiden la acción de los potenciadores y de la heterocromatina 781 Los aislantes pueden definir un dominio 783 los aislantes pueden actuar en una dirección 784 los aislantes puede variar en potencia 785 Los sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa reflejan cambios en la estructura de la cromatina 786 Los do mi ni os definen regiones que contienen genes activos 788 Una LCR puede controlar a un dominio 789 ¿Qué constituye un dominio regulador? 790 Resumen 791

30 Control de la estructura de la cromatina 796 Introducción 797 La cromatina puede tener estados alternativos 797 El remodelado de la cromatina es un proceso activo 798 La organización de los nucleosomas puede cambiar en el promotor 801

l1!llJ

1ffim

iiiiD

31

La modificación de las histonas es un episodio clave 802 Ocurre acetilación de histonas en dos circunstancias 805 Las acetilasas se relacionan con activadores 806 Las desacetilasas se relacionan con los represores 808 Las metilaciones de histonas y de DNA están relacionadas 808 Los estados de la cromatina se interconvierten por modificación 809 La activación del promotor comprende una serie ordenada de episodios 809 La fosforílación de las histonas afecta la estructura de la cromatina 810 Se encuentran algunos segmentos comunes en las proteínas que modifican a la cromatina 811 Resumen 812

Los efectos epigenéticos son heredados 818 Introducción 819 La heterocromatina se propaga a partir de un episodio de nucleación 820 La heterocromatina depende de interacciones con las histonas 822 Polycomb y Trithorax son represores y activadores antagonistas 824 Los cromosomas X experimentan cambios globales 826 Las condensi nas producen La condensación de los cromosomas 828 Una metilasa de mantenimiento perpetúa la metilación del DNA 830 La metilación del DNA se encarga de la impresión 832 Un solo centro puede controlar Los genes con impresión opuesta 834 Los efectos epigenéticos pueden heredarse 835 Los priones de levaduras muestran herencia desusada 836 Los priones causan enfermedades en los mamíferos 839 Resumen 840

Glosario 845 Índice alfabético

867

Contenido

xv

Prefacio

La ciencia es una aventura extraordinariamente dífídl. En cada revisíón de esta obra hay nuevos e interesantes acontecimientos de qué reportar, de modo que ésta inclu ye mucho material actualizado que da cuenta de nuevos hallazgos de la investigación molecular. La organización general del material de esta edición ha sido revisada según los criterios de Genes esenciales para facilitar e l uso conjunto de las dos obras. Como el aumento de tamaño representaba un problema, el contenido se ha enfocado con mayor precisión en los genes y su expresión, de modo que se eliminaron los capítulos que tratan de las consecuencias de la expresión génica en la biología celular. La primera parte del libro incluye cambios sobresalientes relacionados con el genoma derivados de exüosos proyecros de secuenciación genómica; resalta la importancia del RNA como regulador, y ahora es evidente que cubre todos los niveles de e~presión génica, tamo en procariotas como en eucarioLas. Algo así como un "eslabón perdido", anoja más luz sobre la forma en que el mecanismo actual de la expresión génica debió haber evolucionado desde el mundo primitivo regido por el RNA. En esta obra me he propuesto citar artículos de revisión y de investigación, que creo que serán de fácil acceso para los lectores; preferí aquellos que después de seis meses no representan ningún costo, y cuando no fue posible, Ja publicación debería ser de amplia difusión. Agradezco a las siguientes personas el haber leído las pruebas y el haberme asesorado en esta revisión: Elliott Goldstein Jocelyn Krebs Kathleen Matthews

University of Arizona, Tempe University of Alaska, Anchorage Rice Dniversity, Houston Benjamín Lewín Enero de 2007

xvi

Organización La nueva organización de GENES IX permite a instructores y estudiantes enfocarse con mayor especificidad en los genes y su expresión, con énfasis en los temas principales. El número de capítulos y el orden de los temas permanecen igual; sin embargo, numerosos capítulos se convírtieron en dos o más. Los cambios son los siguientes: El capítulo 1 de GENES VIII. Los genes son DNA, se convirtió en dos capítulos en GENES IX. La información básica de la estructura del DNA, la replicación y las mutaciones permanecen en el capítulo l, mientras que la descripción de la función de los genes corno unidad de la herencia constituyen el nue\To capítulo 2, Los genes codifican proteínas. El capítu lo 3 de GENES VllL El contenido del genoma, se divide en dos capítulos en GENES IX. El capírulo 4, El contenido del genoma, incluye información sobre secuencias de DNA, mapeo genómico y DNA de organelos. El capítulo 5, Secuencias genómicas y números de genes, ahora contiene información sobre las dimenstones y la expresión de los genomas de gran número de organismos, así como material nuevo sobre los genes del cromosoma Y. El nuevo capítulo 12, El operón, incluye el capítulo 1O de GENES Vlll, así como información sobre la regulación de la transcripción y de la traducción del capítulo l l de GENES VIII, Circuitos reguladores. El material que corresponde a l RNA regulador se encuentra ahora en el capítulo 13. El ma1.crial del capítulo 13 de GENES VllJ, El replicón, en GENES IX se encuentra en tres capírulos. El capítulo 15, El replicón, abarca la estructura y la función del replicón, así como los orígenes de la replicación. El capítulo 16, Replicones extracromosómicos, con tiene material sobre las proteínas terminales, el círculo de re-

plicación, los plásmidos y el T-ONA. La informadón sobre la forma en que la replicación bacteriana se vincula con el ciclo celular se encuentra en el capítulo 17. Recombinación y reparación, capítulo 15 de GENES Vlll, son dos capítulos de GENES IX. El capítulo 19 cubre la recombinación homóloga y específica de sitio, y el 20, Sistemas de reparación. incluye información novedosa sobre las rutas de reparación por es.cisión en las células de mamíferos. El capítulo 23, Control de la estructura de la cromatina, de GENES VIII ahora es el capítulo 30, en el cual

se analiza la relación entre la estructura de la cromatina y la expresión génica. El capítulo 31 . Los efectos epigenéticos son heredados, detalla las causas y los mecanismos de la herencia epigenética.

Programa de arte y diseño GENES IX luce ahora más moderno. El diseño y la parte artística de esta edición se actualizaron y revisaron para facilitar el aprendizaje de los estudiantes.

Prefacio

xvii

Los genes son DNA ESQUEMA DEL CAPÍTULO InLroducción El ácido desoxirribonucleico (DNA,

deoxyn'bonucleic add) es el material genético de Las bacterias La t.ran~formacibn bacteriana pruuorc1onó la primera prueba d(' aue •1 ONA PS el mateñalgen~tico de las bacterias. Las propred.::de~ genéticas pueden ~er tra11sfeñdas de una cepa bar.eria11a a otra e~
El ONA es el material genético de los virus l.a Jnfi!CCIOn po· fagos demostró que el ONA es el

matena genético de los v1rus. Cuando el ONA y lO$ los bacteriófago> son narcados con isótopos radioactivos diferentes, só.o el ONA e~ tr,Jn~mitrdu ¡¡ la progen'e de fagos prodocida por las banerills Infecciosas. componenlt~ protl'llliro~ de

El DNA es el material genético de las células animales fl ONA puedt spr utilizado para introducir nuevas caractcr!slicas genéticas en celulas animales o en animales completos. En ~ lgu nos v1rus, el mdterialgenéticn e~ el RNA.

Los polinucleótidos tienen bases nitrogenadas Ligadas a un esqueleto de azúcar-fosfato Un 11uLle6sido esta formado por una base pótica o ptrim•dica ligada a Ut'a pent0$<1 (azucar de cinco <arbunos) en l.a pu$flión 1. La~ posic1onPs en el anillo de ribosa se oescriben con el ~imbolo !lldtt!m~ tiro de pnmo ('), oaril distinguirlas. La diferencia entre el DNA y el RNA raaica e" el grupo localiz¡¡du en la po~~~~~~ 2' del azucar. El DNA tiene un azucar dt>SOltlfriboso (2'·11}: el RNA tiene un mear ñboso (2'-OH}. • Un nucleótido con\iste en un 11ucleosido ligado a un qr.Jpo fosfato en la pos1c1ón S o 3' de la (desoxi)ribosi!. • tos residoos suct!SÍIIO\ CP (desoxi)ri:I0$4 de una cadena de potinucleot ·dos estan unidos por un grupo 'osfato entre la posicíor 3' de un azuCllr y la 5' del siguiente. • Un l'lttr~'rnO ~ la cadena (convencionaliTiente el izqurerdo) ticnr: una pu'lt.a S' ;b•e y. en el otro. la punca libre es 3'. El DNA contiene las cuatro bases, adenina. gua:1ina, ntosina y timma: el RNA posee uracilo en vez de ti mina.

El O A es una hélice dúplex La form11 B del DNA es una hélice dúplex fomada por dos c~dena~ l)olinucleothrcas que torren de forma antiparalela.

• Las bases nit•ogenaoas de cada cadena son anillos ¡>lanas de putina o de pirimidina orientados hacia el interior que ~P ~p11rean uno a otro a través de puentes de hidrógeno para forma1 unicamentl! pare$ de A· T o G·l. El di3metro de la holice dúplex 1!$ de 10 A. ademas de una vuelta rompleta cada 34 A, con diez pares de bases por vuelta. • La hchce dQplex forma un surco profundo (anrho) y ur> surco supertiml(angosto).

La duplicación del DNA es semiconservadora En et experir•rcn:u de Mese<.son·Stahlse wtilizó marcaje de der~idad par~ df!mostrar Qlle la cadena polinudeobdica individu,l! r~ la umdad dPI DNA q~e se co'ISe'Va durante la dup rcac10n. • Cada cade"la de un Dt.A oupleJt aaúa como molde para ~•nteti1ar d una cadena hija. • Las sccucncl.n de la~ cadenas. h ías estin determinadas por ap;¡ream1e1to CCimp ementaro de bases con las caden~ progemtoras separadas.

Las caoeras de ONA se separan el' la horquilla de

duplicación l~ dupllcac10n de DNA es emprencída por un complejo d<• en11mas que separan a las cadenas progenitoras y que SllltC1 izan a la~ cadenas hijas. 1d horqllill'l dl' duplicación es el punto en el cual las cadena~ progenitora~ se separan. l ~ eMim~ s que sintetizan DNA se denominan DNA I)Uiimerasas; lJ~ enzimas que sintetizan RNA son conocidas tnmo RNA pol1metasas. lu$ nutlea\as son ~nzima$ que degradan a los ácidos nuclekos; Pntre otras. ONAsas y RNAs~ que pueden lllvidlrsP en eodonutleasas y en e~om.deasas.

La in formación genética puede ser proporcionada por el ONA o el RNA • lu\ gPnP\ celutMes son ONI\, pe-o .os vnus y tos víroides poedefl tener genomas de RNA. • U D~A s~ convierte en ~NA por tnn;crípdón. y el RNA ouedr conv~rt·r.e e:~ D~A oor b"'<nsc:rípóon inversa. • Llt traduccibn d.. R~A a i)toteina~ es u,idueccional

Los ácidos nucleicos se hibndan por apareamiento de bases f ca t!lltomi.,nto provoca q~e .as dos ca~nas de un ONA dupl<'x se separen. • La r. . tS t:l i)Untn Mi!OlO de. ra ngo di' a;moeratura para la d~naturaUzacíOn.

Las cadt'na~ com(ll!'mentaras U"ícas pueden renatu rallzarSI! cuando se reduce ta temperatura.

Continua en la siguiente pagina

1

• la desnaturalización y la ren¿¡turalización/hibridación pueden ocurrir con combir1aciones de DNA-ONA, de DNA-RNA o de RNA-RNA y pueden ser intermolecula res o intr¡¡moleculares. la capacidad de dos pre par¡¡r1ones de ácidos nude icos de Ur1a sola cadena para hibridarse es indicio de su complementariedad.

Las mutaciones cambian la secuencia del DNA • Todas las mutaciones con~isten en cambios ~e ta secuencia del DNA. Las mutaciones pu~den ser espontáneas o inducidas por mlitágenos.

Las mutaciones pueden afectar a pares de bases individuales o a secuencias más largas Urta mutación puntual cambia a un solo par de bases.

~

1as nru~adones puntuales pueden ser provocadas por la conversión química de una base en otra o por errores durante la duplicación. Una transrción remplaza a un par c;le bases G-C flOr un ¡¡ar ue bases A-To VICeversa. Una transversión remplat~ a una purina por una piñmidina, por ejemplo, cambiando A-TaT-A. las inserciones son ellipo más comú11 de mutación, y son resultado del movimiento de elementos transponib les.

Los efectos de las mutaciones pueden

las insertiones ~uedert reven-irse por deleción del material insertado, pero las deleciones no pl.leden revertirse. • 1a supresión ocurr-e cuando una mutación de un segundo gen an ula el efecto ele la mutación del primer gen. t

1m Las mutacione~ se concenttan en puntos calientes • La

lrecu~ncia

de la mutación en cual4uier par de bases

en p
e>Ccepto en los puntos calientes, en los cuales la frecuencia se increnrerrta cuando menos e(1 un orden de magnitutJ.

Numerosos puntos calientes son resultado de bases modificadas • Una <:ausa con¡ón de los puntos caliente> es la base modificada 5-metilcitosina, la cual expen'nll!nta desaminatión espontánea y se convielte en tirnina.

ilml Algunos agentes hereditarios son extremadamente pequeños •

Alguno~ agentes hereditarios 111uy pequeños no codifican proteínas, sino que constan de RNA o proteínas que poseen propiedades hereditarias.

Resumen

ser revertidos Las

mutacione!> primarias desactivan a un gen,

mientias que las inversas (o retromutaciones) tevierten

stts efectos.

Introducción La naturaleza hen·dita ria de tOdo organismo viviente

es definida por su

genoma, el cuC~l consiste en una secuen.cia Larga de ácido oucleico que proporciona la Í11{om1acion necesaria para construir el o rgan,ismo. Se utiliza el térrnln.o "informadóo " debido a que e l genoma por sí mismo no desempeña ninguna fundóu acliva. en la ro¡1srrocción del organismo, n1ás bkn es la secuencia de las subunidades Lnd.ivtduales (bases) del ácido nucleico la que determina las caracreristicas hereditarias. Por una compleja serie de

imeracciones, eo;;ta secuencia se utiliza para producir tu<.las las proteína~ del ol'ganismo en el momemo y el lugar apropiados . Las proteínas .forman pane de la esuucrura Llel organismo o tienen. la capacidad tle const.ruit estructura:; t) llevar a cabo 1as rea.:ciones metabólicas necesarias para la vicia. El genoroa corlliene el conjunto completo de ifl fmmación.lleredita ria para cualquier organismo. Físic:ameme, eJ genoma puede ser dlvid iclo en varias moléculas diferentes de áddo rmcleico y lw1cionalmeme. en genes. Cada gen es una secuencia que dentro del áddo nudeko representa a UJ1a sota proteína. Cada una de las moléculas de ácjdo IHJdeico que romponen t'l genonta puede co ntener

2

CAPITULO 1 Los genes son DNA

gran número <.Je genes. Los genomas de los orga nism os vivos pueden cooteoc.r io.cluso <500 genes (como un mic:oplasma, que es un tipo de baCLeria) o >25 000 en el ser humano. En es re capítulo se analizan las propiedades del gen en cuanto a su consnucción molecular básica. En la se res u rnen las etapas de transjdóu del concepto histórico del gen a la defi nkión moderna del genoma. Un genoma coosiste en eJ conj unto completo de cromosomas de· cualquier organismo espeófico, de modo que comprende una serie de moléculas de ácido desoxirribonudeico (DNi\, deoxyribonu.cleic add} (una para cada cromosoma), cada una de las cuales comi.ene n LLmerosos genes. La principal definicjón de un genoma es detenninar la secuencia ckl DNA de

cada cromosoma . La primera definición del gen r,urno unidad funciot~al se detiv6 del descubrimiento de que cada gen es responsahle d.e la producción de proteínas específicas. La diferencia en las caracu.:1istkas químicas

del DNA del gen y su pro<.lucro proteínico condujo al concepto de que un gen codifica a una proteína. A su Vt:Z, esto lkvó al descubrimiento det aparato complejo que permite que la secuencia de DNA de un gen genere la secuencia de amh1oácidm de una. ptoteína.

1111 gen

1865 Los genes son factores particulados 1871 Descubrimiento de los acídos nucleicos

1903 Los cromosomas son las unidades hereditarias 1910 Los genes residen en los cromosomas 1913 Los cromosomas son secuencias lineales de genes 1927 Las mutaciones son cambios físicos en los genes i 931 La recombmacton ocurre por entrecruzamiento 1944 El DNA es el material genético 1945 Un gen codifica a una protefna 1951 La pnmera secuencia proterntca 1953 El DNA es una llétice dúplex

es una sentencia de DNA que codifica a u11 RNA; m los genes codific;adores de proteínas. el RNA a su vez codifica a una proteína. A partir de la demostración de que un gen consisLe en DNA. y de que un cromosoma consisre en un tramo largo de DNA que representa a numerosos genes, se llega a la organ.izadón glob<ü del genoma en 1unción de su secuenda de DN A. ~n el Capímlo 3, El gen interrumpido, se reroma en más detalle la organización del gen y su representación en proteínas. En el Capítulo 4, El conlenido dt:l genoma, se analiza e l n úrnero total de genes, y en el Capítu lo 6, Agrupamientos y repeticiones. se describen otros n)J]tponenres del genoma y el manrenimiento de su organización .

1958 El DNA se repllca de forma semlconsetvadora 1961 El códiga genético está determinado por trlpletes

1977 Los genes de las eucariolas son Interrumpidos 1977 Posible secuenciacíón deJ DNA 1995 Secuenciación de los genomas bacterianos

2001 Secuenciación del genoma humano

Breve historia de la genética.

. Gen DNA

~

.

Naturaleza qulmlca Secuencia de nucleótidos

l RNA

Proteina ~

Secuencia de nucleótidos

Secuencia de aminoácidos

Un gen codifica una molécula de RNA. la cual codifica una proteína.

Entendiendo el pToceso por medio del cual un gen se expresa, permite una definición más rigurosa de su naturaleza. En la se ilusrra el t ema básico de esta obJ-a. Un gen es tma secuenciu de DNA ~1ue produce mro ácido nucleico. el ácido ribonucleico (RNA. rihonudeic acid), que c.:u<:nta con dos cadenas de á<;idn oudeico. rnit>nn·as que el R.'iA riene una sola. La secuencia del RNA es determinada por la secuencia del DNA. (De hecho, e<; idéntica a una de las cadenas de DNA.) En muchos casos, pero no en todos, el Rl'o!A se utiliza a su vez para dir(gir la producdón de una proteína. Pot lo tanto.

1!1

El DNA es el material genético de las bacterias

Concepto principal • La tran~formación bacteriana proporcionó la primera prueba de que el DNA es el material genetico de las bacterias. Las propiedades genéticas pueden ser Lransferidas de una cepa bacteriana a otra extrayendo el DNA de la primera cepa y sumándolo a la segunda.

La idea de que el material genérico es lruya a. la barrería . Cuando por medio de tratamientO calórico se matan bactenas Jlsas, pierden la capacidad de dañar al animal, sin emba,rgo, la combinad6t~ de bacreria5 S desaaivadas con calor y la variante ineficaz R produce tm efecto considerablemente diferente del de Lada bacteria poi separado. En la se mue-su-a que cuando se inyectan conjuntameme en un anünal, el rarón muere corno resultado ele uua in[ección por Pneumococcus. Las bacterias S '7irulentas pueden !>er recuperadas del ratón muerto. 1.2 El DNA es el material genético de las bacterias

3

Tipos de Pneumoooccus

Baeterl~ s

Con capsula,

formame, se demostró que éste es ácido desoxüribonucleico (DNA, deoxyribot1udeic acid).

Inyección de células

Resultado

VIva

Muefe) _ - -

de aspecto liso (S) \

/ Sin cápsula, de aspecto

Bac;lería S muerte

VNe

Bacleña A villa

VIva

. ~ Baclerla S rnuerta ~k 'y bacteóa R viva

Múefe

rugoso (A)

Ni las bacterias tipo S asesinadas con calor ni las bacterias tipo Rvivas pueden matar a los ratones, pero la inyección simultánea de ambos Lipos de bacterias pueoe matar a los ratones de forma tan efectiva como la oacteria tipo S viva.

Ratón inyectado con bacterias S muertas

y R vlvas

/~ Bacterias S vivas recuperadas del ratón muerto \

Sé extrae el DNA

\YJ ;./

~~

>..., •

Bacteria R Tr~:~nsformaclón

Bacteria S

El DNA de la bacteria de tipo S puede transformar a la bacteria de tipo R en el mismo tipo S.

En este experimento. las bacterias S muertas fueron de ripo lil y las R vivas, de tipo ll. La cubierta de las bacterias virulenta!. recuperadas <.le la infección mixta era ltsa, de tipo Ht por lo tanto, alguna propiedad de las bacterias S tipo Ul. muertas, puede transformar a las bacre1ias R, induciendo la fo rmacl6n del polisacá,rido capsular rlpo III, que las torna virulentas. En la se mue51ra la idemilkadón del componente de las bacterias muertas responsable de la transformación, el cual se denominó principio transformante, que se pw·ificó desarrollando tm sistema libre de células, en donde los extractos de las bacterias S muertas podían agregarse a las hacrerias R vivas antes de ser inyectadas al animal. En 1994, mediante la purificac_i6n del pTincipio uans4

CAPÍTULO 1 Los genes son DNA

El DNA es el material genético de los virus Concepto principal La infección por fagos demostró que el DNA es el material genético de tos virus. Cuando el DNA y tos component.es proteínicos de los bacteriófagos so11 marcados con diferentes isótopos radioactivos, solo el DNA es transmitido a la progenie de fagos producida por las bacterias infecciosas.

Una vez que se compmbó que el ON A es e! material genélicu de las bacterias. el siguieme paso fue demosn-ar que el DNA prop0rciona el material genétko en un sistema bastame diferente. El fago T2 es un virus que infena a la bacteria Bscherfchia coli. Cuando las panícu.Jas del fago (virus) se agregan a las bacterias, éstas se adsorben en la superficie exterior, pane del material enrra en la bacteria y, al cabo de -20 m.in, cada bacteria explota (se lisa) para liberar una 11umerosa progenie de fagos. En la se ilu stran los resul tados de un experimento realizado en 1952 en el cual se infecLa rou bactelias con fagos T2, los cuales habían sido marcados radioacrivamente en su componente de DNA (con 32P) o en su componerm: proteínico (con ns) . Las bacterias inrectadas se mezdaron en una licuadora y dos fracciones se separaron por centrifugación. Una de éstas comenía Las cubiertas de fagos vacías liberadas de la superficial de la bacteria, en lanro que la otra estaba Jormada poJ las bacterias infectadas.~

Grao parte del marcador 32P se enconn·ó eu las bacterias irúectadas. Las partículas de la progenie de fagos producidas por la infección contenían -30% del marcador np original. La progenie recibió una cantidad muy peqtJeña, menos del 1 %, de la protefna contenida en la poblaclón origtnal de Iagos. Las cubiertas de fago estaban formadas por proteínas, y por lo tanto portaban eJ marcador radioactiva J)S. Así pues, con este experimento se demostró direclameme que sólo el DNA de los fagos progenitores entra en las bacterias y que después formará parte de los fagos ele la progenie. exacrameme el pau·ón de hcreucia que se espera del mate1ial genético.

párrafo implica que los Virus fueron marcarlos en un compoaeme o en OtrO (pero no en los dos), rnienuas que la descripción tk los resultados sugiere que tantu un componente como eJ otro fueron marcados.

' N del T· esre

Se Infecta a la bacteria con lagos marcados ' rr~

Las células que carecen del gen TK no pueden producir tímtdlna clnasa y mueren sin timidina

Se separan las cubtertas de los lagos de la bactena infectada

~

,A

{\! '\

f Las cub1ertas de los lagos contienen 80% del marcador So aislan las partlculas ns de la progenie de lagos

~

Los fagos de la progenie llenen 30% del

-

marcador"'P y <1% del

T

\

marcador "S

El material genético del fago T2 es el DNA.

Un fago se reproduce ordenando a la maquinaria de una célu la hospedadora infectada que produzca más copias de sí misma. El fago posee material gené tico cuyo comportamiento es análogo al de los genomas celulares: ~us rasgos son fielmente reproducidos y están sujeros a las mismas reglas que gobiernan la herencia. El caso de los Tl refuerza la conclusión general de que el material genético es el DNA, ya sea que forme pane del genoma de una célula o de un virus.

111

Adición de DNA TK

Las bacterias Infectadas conlienen 70%del marcador.x>P

El DNA es el material genético de las células a ni males

Conceptos principales • El DNA puede ser utilizado para introducir nuevas caracteñsticas genéticas en células animales o en animales completos. • En algunos virus, el material genético es RNA. Cuando se agrega DXA a poblaciones de células encariaras individuales en cultivo, el ácido nucleico entra a las células, lo cual, en algunas, resulta en la producción de proteínas nuevas. Cuando se utiliza DNA purificado. su incorporación da lugar a la producción de una protefna en particular. En la se represenra uno de los sistemas estándar.

Colonia de células

Células muertas Células

vivas

TI<•

Algunas c;élulas Incorporan al gen TK; los descendientes de una célula sometida a transfeoctón se agrupan en una colonia

Las células eucariotas pueden adquirir un fenotipo nuevo como resultado de la transfección por adición de DNA.

Aunque por razone!> hbtóricas estos experi mentos se describen como tran sfección cuando son realizados con células eucarioras, consctruyen uoa conLrapanc directa de la transformación bacteriana. bl DNA introducido en la célula receptora se incorpora a su material genético y es lleredado en la misma forma que cuak1uicr Olra parte. S\J expresión confiere un nuevo rasgo a las célu las (síntesis de timidina-cinasa en el ejemplo de la Figura 1.6). En un principio, esws experimentos sólo tuvieron éxito con células individuales adaptadas para crecer en un medio de cultivo, pero desde en to nces, el DNA h a sido inrroducido en óvulos de ratón por rnicroinyección, y puede llegar a ser una pane estable del material genético del animal. Dichos experimemos muestran directamente no sólo que el DNA es el material genérico de las eucariotas, sino también, que puede ser transferido

entre especies d1[ereme~ y seguir siendo funciollal. El material genético de tOdos los organismos conocidos y de numerosos virus es el D'I\A. No obslante, algunos virus usan un tipo alternativo de áddo nucleico, el ribonucleico (RNA, ribonucleic add), como material genético. El principio general de la naturaleza uel material genético, por lo ranto, e~ que siempre es ácido nucleico; de hecho, es DNA. excepto en los virus de RNA. l .t.

El DNA es el material genético de las células animales

5

Los polinucleótidos tienen bases nitrogenadas ligadas a un esqueleto de azúcar-fosfato Conceptos principales • Un nucleósido está formado por una base púrica o piril'llídica ligada a un azúcar pentosa en la posición 1. • Las posiciones en el anillo de ribosa se describe11 con el simbolo (') para distinguirlas. • La diferencia entre el DNA y el RNA radica en el ~rupo localizado en la posición 2' del azúcar. El DNA tiene un azúcar desoxirribosa (2'-H) y el RNA, ~tn azúcar' tibosa (2'-0H).

• Un nucleótido consta de un nucleósido ligado a un grupo fosfato en la posición 5' o 3' de la (desoxi)ribosa. Los residuos sucesivos de (desoxi)ribosa de un polinudeótido están unidos por .un grupo fosfato entre la posición 3' de un azúcar y la posición 5' de la siguiente. • Un extrerno de la cadena (convencionalmente el izquierdo) tiene una punta 5' libre y en el otro, una punta 3' libre. El DNA contiene las cuatro bases, adenina. guanina. citosina y timina¡ el RNA posee uracilo en vez de ti mina.

.El componenLe básico de lus áddos nucleicos es el

rlUdeóticlo. que tiene ues comronenres: • Ul)a base nilrogenada, •

unazúcar y

• un fosrato. la base nitrogenada es Lln anillo dt:· purina o cte pirimidina . La base está ligada a la posición l en una pemosa por medio de un enlace glucosídico de1 N 1 de las pirimidinas o el N0 de la pudnas ..Pm·a evitar ambigü edades entre los sisteruas de numeración de los aníllos hereroáclicos y del azúcar, a las posiciones de la pentosa se agrega un símbolo ('J.

Los ácidos nucleicos son no111br;:~dos según el lipa de azúcar que to nrienen; eJ DNA posee 2'-desoxinibosa, mientras que el RNA tiene ribosa. la direrencia radka en que el azúcar del RNA tiene un grupo OH en la posición 2' del anillo de pcntosa. El azúcar puede ligarse en la s posiciones S' o 3' a un grupn IosEato_ Un ácid o nu cleico consiste en una cadena larga de nucleótidos. En la se rnuestra que el esq~1clew de la cad~na polinucleorídita consta de series alternas de residuos c;le fosfato y de pentosa (azúcar) a través tlt· la unión de la posición 5' ele un anUlo de pen rosa con la posición 3' del siguiente anillu de pentosa mediante un gt1Jpo fosraw. Por 6

CAPÍTULO 1 Los genes son DNA

eso se dice que el esqueleto de azúcar-1ostato con!'iste en enlaces 5'- 3' [osl'odiéster. Las bases nitrogenadas "sobresalen" del esqueleto. Cada ácido nuckico contiene cuaLro tipo::> debases . Las mismas dos purinas. adenina y guanina, csrAn presentes ta nLO en el DNA como en t>l RNA. las dos pirimidiJ.1as del DNA son citosina y timina; en el RNA se en.nrentra uracilo, en ve2 de úmina. La única diferencia enLre el uraciJo y la timi:na es un grupo metilo suplantador en la rosición e,. Las bases suden nombrarsepors~Jsü1..iciales. E DNA contiene A. G, C yT; eJ RNA comiene AG. e y U . El nttdeóüdo Lerrninal de Wl extremo de la cadena llene un grupo 5' llbre; e l11wdeórido tetmiual del orro exu-emo dcne LlD grupo 3• libre. Se ha con venido en esclibir las secuencias de ácido nurleit:o en dirección 5' a 3', es dec:ir, del ex.tremo 5' de la i~quierda al ext~emo 3' de la derecha.

El DNA es una hélice dúplex Conceptos principales • la forma B del DNA es ur1a hélice dúplex formada por dos cadenas polinucleotídicas ant1paralel¡¡s. Las bases nitrogenadas de cada una son anillos planos de puriM o pirimidh1a orientados hacia el interior y que se aparean mediante puentes de hidrógeno para formar únicamente pares lle A-T y G-C. • El diámetro de la hélice dú plex es de 20 Á, y cada 34 Á hay una vuelta completa, con diez pares de bases por vuelta. • La hélice dúplex forma un surco principal profundo (ancho) y uno menor (angosto). T.a observaclón de que las camidades de bases pre-

sentes en los DNA varía ::.cgún la espede, condujo al concepw de que la seau!11cia de bases es la forma en que se po71CIIrt informaci6n gen.élica . Hacia la década de 19'50, d concepto de inrormación genética era común: el par de problen1.as que planteaba era determioa.r la estructura del ácido nudeico y explicar cómo una secuencia de bases del DNA podía tepresentar la secuencia de aminoácidos de una protdua. Tres nociones convergieron en la com1 rut:dón de un modelo de hélice dúplex del DNA, desarrollado por Watson y Crick en 1953: • Los datos de la difracción de los rayos X demostraron que el DNA tiene la forma de tma hé lice regular que da un gil:o completo cada 34 Á (3.4 nm) , con un diáriletro de -20 Á (2 nm). Como la distancia entre nucleóridos adyacentes es de 3.4 Á, debe haber t O uuclcól idos por vuelta.

• Lil cJemidild del D'\A l.ugiere que la héJice ucbt• ronlcrtt•r du .. t'atlcna~ de polinucleótido!.. Fl diáu•ctru Lonstante Je la hélice puede l"iaúo angosra). • lmkpcndicntemc.•ntl' de la!) canridades absoluta'> de edd,, Ui!SC la proporóon de G es siempre igual ., la rlt• C: rn el DNA. y la proporción de A c;iempre es la misma _que la de T, de manera que la composidón de cual<.¡uier DN A puede describirse por la proporción dl' ""~ bil!>I?S, es tkcir, G + C, que fluctua entn: 16 y 74% en tli tercntes especies. Wat~o n y Crlck propusiemn q ue las dos cade n as polinllclcOiídicas de la hélice dúplex se relacionan n1ediant e p11CIIICS de hidrógeno wtre las bases nirro_qenadas. La G pued~ fmmar puentes de hidrógeno específicnmcnrc )ólo con 1<~ C, y la A. sólo con la T.

'Estac; rcacdllfll'' )C.' ucscriben como apareamiento de ha~es, y ..e dh<' qtt<' Ja., base~ apareadas (G con e o A C(lll T) \Oil compleme n tarlas. El modelo proponía que la'> dos cadenas polinu cleoudicas corren en direcciones opuestas (antiparale la ), como 't' ilttstra en la . Observando a lo largo dt la hdilc. una ratlena va en direcáón 5' a 3 ', micrura'> qut• !>ti pareja l"Orre de 3 · a S . El esqueleto de aLikar-foslato está en la pane exterior y pona cargas negativas en los grupos fosfato. en soluciónml'lrro, las cargas del DNA se neurrali'lan por la umón de Iones metalicos, úpicamenre Na· En la c:61ula, la1. proteína:. con carga positiva propordona11 panc de la lltl:'tta neutralizame. Estas prNeína:-. dc~empt•fi¡¡ n ltnd fl1ncióll importante en la determ inación de la organización del DNA en la

olo\l(

--NucJeotJdo

H2~ ' o o-P.o

Esque eto

Base pirimtdica

de~ q

.,..,.,.foSiato- H,

Base purica

Enlaces fosfodléster 5'·3'

o-p~O

O

'""' j

Urtd tddena polinucleotldica está formada por una serie de en!aces c11uca•-fosfato 5'-3' que forman u.n esqueleto con las bases pro lirenes.

DNA ¡ Los loslat
célula. Las bascs se encuenrran en el imerior; son estructura!> pli.1nas. en pares perpendiculares al eje de la hélrce. Cortsitl~resc la hélice duplex como una escalt~ra ,•,piral: Jo~ pare~ de bases forman los esCdlones, como se ilmtra l'~<]tH'máticameote en la . Al 11 avanzando por la hélice. las bases están una sobre otra. como una pila de plaws. Catla par de bases gira -36° en tOmo al eje de la hélice, rc~prcto drl s1guicnte par de bases, de modo que - 1O pare' de base' forman una vuelta completa de 360°. La torsión de lac; cadenas c;obre sí mismas forma una hélice dúplex con un surco m enor ( -12 A de ancho) y un s urco may or ¡-22 A de ancho). c.omu put>de observarse en el modelo a escala de la . La hélice d(tpkx es dextrógira, es decir, c¡uc gi ra rn la dirección de la!> manecillas del

La hélice duplex mantiene un grosor constante porque las purinas siempre enfrentan a la pírimidinas en los pares de bases com· plementarios A-T y G-C. La secueneta Que se ilustra en la figura es T-A, C·G, A-T, G-C.

l.b El DNA es una hélice dúplex

7

reloj observada a lo largo del eje helicoidal. Estas características representan el modelo aceptado para lo que se conoce como forma B del DN A. Es importante percatarse de que la fonna B representa un promedio, no ttna estructura especificada con toda precisión, pues la estructura del DNA puede cambiar localme nle. Si tiene más pares de bases por vuella se dice que está sobregirada, de lo comrario, será laxa. La torción local puede ser afectada por la conformación global de la héüce dúpleJ< del DNA en el espado o por la unión de proteínas en si tios específicos.

B Azúcar

Base

Fosfato

Los pares de bases planos yacen perpendicularmente al esqueleto de azúcar-fosfato.

Las dos cadenas del ONA forman una hélice dúplex. Fotograña t::. Photodisc.

8

CAPÍTULO

1

Los genes son ONA

La duplicación deL DNA es semiconservadora

Conceptos principales

• En el experimento de Meselson~Stahl se utilizó marcaje de densidad para demostrar que la cadena polinucleotídica individual es la unidad del DNA. que se conserva durante la duplicación. Cada cadena de un DNA dúplex (o DNA duplohelicoidal, DNA de doble cadena o DNA de doble banda) hace las veces de molde para sintetizar una cadena hija. • Las secuencias de las cadenas hijas dependen del apareamiento complementario de las bases con las cadenas progenitoras separadas, Es crucia l que el material genético se reproduzca con exactitud. Las dos cadenas polinucleotídicas están unidas sólo por puentes de hidrógeno, de modo que pueden separarse sin necesidad de mmper enlaces covaJemes. La especificidad del apareamiento de bases sugiere que cada una de las cadenas progenitora s separadas puede hacer las veces de cadena molde para la sínlesis de una cadena l1ija complementaria. En la se representa el principio de que una nueva cadena hij a es ensam blada en cada cadena progenitora . La secuelJCia de la cadena hija es dictada por la cadena progenitora; una A en la cadena progenitora ocasiona la coloca dónde una Ten la cadena blja, en tanto que una G progenitora provoca la incorporación de una e hija. y así sucesivamente. En 1a parre superior de la Figura l.ll se muestra un dúplex progenitor (no replicado) formado por las dos cadenasprogenhoras originales. La parte Lnferior muestra las dos dúplex hijas que están siendo produddas por el apareamiento complementario de bases. Cada w1a de las dúplex hijas es idé,nlica en secuencia original y wn c.iene una cadena progenitora y una cadena recientemente sintetizada. La

~

DNA progemtor Duphcactón en medto de densidad

Generación 1

Generación 2 Yl~RU

JI~ --< HÍBRIDO .

~~"~ HIBRIDO

rv;v

~ " PESADO

LIGERO

~\)(í\;{f--<

Vl\1\.l

HiBAiDO

HfBRIDO

Analisis de denstdad •• • Ligero •• • • Hfbndo

.-

f~ ::
LIGERO M~

• • • • Ligero ll IIU< · - • Pesado

·-

Ligero Hib(Jdc •• • ·Pesado

La duplicación del DNA es scmlconservadora. Cadena hija /

\

Cadena hija

El apareamiento de bases proporcíona el meca-r-no necesario para la dupl.icación del DNA.

-·-uctura dtl DNA porta /u m[cm11adó11 necesaria para • -:oetuar su seaumcut Las consecuencias de este modo de duplicación J usrran en la .. .El dúplex progenitor ·cplic.-. par.-. formar do~ dúplex hijos. cada uno de tuales esta formado por una cadena progenitora .... na cadena hija (de sintc'iis reciente) . La urridad s? cvmerva de una gmerclCIÓII ala sigmente es una de - ','S mdtntl.~ individuales que forman el dúplex proge:-r. .éste comportamiento se conoce como duplilAdón scm icoo scrvad ora . En Ja Jligura 1. 12 se Uusua una predicción de e mode lo. Si el l>NI\ w·ogenitor porra un mare de dcmidnd ·' pesada'' porque el organismo ha , cuh ivado en un nwdío que contiene un isótopo ccuado (romn 1'N) (N del T: en otras bibliogra:: apa1clc rumo N1\ el re~to de los marcadores ;1donados en este capítulo también aparecen con :.ímero después de la letra p. ej . , plz y 5 15 ). sus cnas pueden ser ttisunguidas de las sintetizadas Jo el organismo es transf~rido a un medio que · ~ nga •sótopo!. '"ligeros· normales El J)'1A progl'nltor <.On'ibtt· en un dtíp!eJi: de dos _e-nas pesadas (rojas) . Después de una generación .::redmiento en medio ligero, el DNA dúplex es "'"ldo" en cuanto densidad. o sea que está forma' r una cadena progenitora pesada {roja) y por .:adena hija Ugera (azul). Despué!. de la segunda _raci6n, la~ dos eadenas de cada dúplex híbrido .m \Cparatlo. CadJ una Mil¡uiere a una pareja :: de tal forma qul' la mitad de los DNA ditplex

siguen siemlo h(bridos y la otra mitad es completamente ligera (a::. cadc t1as son azules). La~ cade111H indiv1dualt!s de esrns dúple>. son complelmnnue pe1adai " complecameute ligans. Este patrón se confirmó experimentalmente en la prueba de Meselson·S[ahl en J958, que siguió a la duplicación semiconservadora del O"\ A a través de ues generadones de cretimienw de E coll. Cuando el D~A fue extraído de la!> baut•ria) y su densidad se midió por centrHugadón <'1 0"\¡\ formo bandas correspondiente., a '>11 dcnc;iclad. pesada en las progenitoras. híbnda en la pnmera generación, y mitad h1brida y mirad Jgera en la segunda generadóu .

Las cadenas del DNA se separan en la horquilla de duplicación Conceptos principales

• La duplicación del DNA es llevada a cabo por un complejo de enzimas que separan las cadenas progenitoras y sintetizan las cadenas hijas. • La horquilla de duplicación es el punto en que se separan las cadenas progenitoras. • !..as erzlmas que sintetizan el ONA se llaman DNA polimerasas; las enllmas que smtetizan el RNA se conocen como RNA polimerasas. Las nucleasas son enzimas Que degradan a los ácidos nucleicos; 1ntluyen DNAsas y RNAsas. y pueden dividirse en endonucleasas y en exonucleasas.

La duplicact6n exige la separación de las dos cadenas de un dúplex progenHor: sin embargo, el rompimíento de la t'S[ructlll'a ~s rransitorio. y se reviene conforme se forma el tlúpl~x hijo. En algún mo1.8 Las cadenas del DNA se separan en la horquilla de duplicación

9

1

1 .J J DNA progenitor Moléculas de DNA replicadas Horquilla de duplicación

La horquilla de duplicación es la región del DNA

en la cual hay una transición del dúplex progenitor desenrollado a los dúplex hijos recientemente replicados.

Enlace roto

~ Una endonucleasa divide a un enlace en un ácido nudeico. En este ejemplo se mueslra una enzima que ataca a una cadena de un DNA dúplex.

V Una exonucleasa elimina bases, una a la vez. dividiendo el último enlace de una cadena polinudeotidica.

do sintetizada. .Las enzimas se nombran según el tipo de cadena que sintetizan: las D NA polimerasas sintetizan DNA. las RNA polimer asas, RN.A. La degradación ele los ácidos nudcicos también requiere de enzimas específicas: tas d cso x irribo n u deasas (DNAsas) degradan alDNA y las ribonuclea sas (RNAsas) degradan al RNA. Las nucleasas se incluyen en las clases generales de cxonu cleasas y e ndonucleasas: • Las endonucleasas con¡:m enlaces individuales en el incerior de las moléculas de DNA y de Rl\lA y generan ú·agmenros discretos. Algunas DNAsas dividen ambas cadenas de un DNA dúplex en el sirio diana , mienn·as que otras dividen sólo una de cUas. Las endonucleasas participan en reacciones de corte, como se observa en la • Las exooucleasas eliminan los residuos, uno a u no. a partir d el extremo de la molécu la, y generan mononucleólidos. Siempre actúan en una soJa cadena de ácido nucleico, y cada exonuclcasa avanza en una dir<.>cdón especifica, es decir, empieza e n m1 exuemo 5' o 3' para dir igirse hacia el ouo. Esráu involucradas e n reacciones J e ajuste, como se muestra en la

La información genética puede ser proporcionada por el DNA o el RNA Conceptos principales

memo, sólo un tramo pequeño del DNA dúplex se separa en cadenas individuales . La esn·uctura helicoidal ele una molécula de DNA dedicada a la duplicación se ilustra en la . La región no replicada es el dúplex progenitor que se abre hachl la región replicada, donde se han formado los dos dúplex b ijas. La esrructuru helicoidal doble se rompe en la urúón entre las dos regiones, llamada h o rqui lla de duplicaci ón . ta dupl icación irHplica el movimiento de la horqu~­ lla de duplicación a lo largo del DN'A progenitor, de modo que hay un desenrollarniemo continuo de las cadenas progenitoras y un enrollamiento de los dúplex hijos. l..a síntesis de áddos nucleicos e~ catalizada por enzimas específicas, las cuales reconocen el molde y emprenden la Larea de caLalizar la adición de subunidades a la cadena poJinude01fdica que eStá sien-

10

CAPÍTULO 1 Los genes son DNA

• Los genes celulares son DNA, pero los virus y los viroides pueden tener genomas de RNA. • El DNA se convierte en RNA por transcripción, y e( RNA puede convertirse en DNA por transcripció11 inversa. • La traducción del RNA a proteína es unidireccional.

El dogm a cen tr aJ define el paradigm a de la biología molecular. Los genes se perpetúan como secuencias de ácido nudeko, si bien ac1:úan al ser expresados en forma de proteinas. La duplicación es responsable de la hercn.cia de la información genética. La transcri pción y la traducción son responsabJes de la conversión de uua forma a otra. Eo la r se Uustran las fu nciones de la duplicación, la transcripción y la traducción desde la perspectiva del dogma central: • La perpehJadón del ácido nucleico suele implicar al DNA o el RNA corno el material gmético. Las células utilizan únicamente DNA, en tanto que algunos virus usan RNA, y la duplica-

Molde de doble

-, DNA ....C:• • • • • • • • ••

... Cadena antigua

Duplicación

~

Duplicación

Transcnpcion tnversa

ANA

...........

""'~"~"

(T

YAY,w--< \7'\9

C
La duplicación genera dos dúplex nljos. cada uno de los

cuales coohene una cadena progenitora y una cadena fabricada recientemente Molde de cadena lndhndual

)

VV\--... YjOOW

Protelna

'!Vv -+ VV\ El dogma central manifiesta que la informa:'!ón del ácido nucleico puede ser perpetuada o transferida , s1n embMgo la transferencia de la infotmación a protcinas es reversible.

La cadena complemenrana es Uhllzada para sintetizar una copia de la cadena progenitora

Los ácidos nucleicos. tanto los de doble cadena cadena individual, se replican por la síntesis de cadenas complementarias regida por las reglas del apareamiento de ba~es. como los de

caón del RNA vímo oclllre en la celula iofecaada. • ro !:\presión dt In 111ft)r11'/tiL1Ófl t]em!llca celular wl!le ser unidirecáOIIlll La trans< ripción del DNt\ gcnl'r
fuente de informadón genérica. L1 traducci6n del R'\A a proteína siempre es irreverSible. Estos meca111~mo' son igliJimeme efecti,·os 3ra la informacion gem;l ka celular de procarioas o curariotas y para la informacwn transportada 'Ir los virU!>. Los geno mas de 1odo.; lo!> o rganismos

_vos están formados por DNA dup ll'x. Los virus 1seen gcJIOIIIa!> de DNA o RNA. y rlc· c;HJa tipo hay cmplos de doble cadena (ds. t/t)uúle .~trcmded) o de .iJena única (e;,, sin,qlt• suandrd). Los detalles del ·canismo de replicación del ácido nucleico ' 'a rían ..tre los dtferemec; c;¡~lcmas víricos. pero el prindJc duplicacion por 'itfllc.,is de cadenas comple.emilna!> si~ue stendo el mi<.nto. segun se ilustra

" la Los genomas celulares reproducen el DNA por "llt:lanismo de duplicación <.emiconservadora Los :-cnonta!> vú·icos de doble catl,.:nJ. ~ean de DNA o ~~A. la t nbi~n se replican utilitando como molde -~cadena!>

La cadena progenitora lndiYiduaf es utilizada para sintetizar una cadena complemontarla

indJviduales del dl'tplc:\ para sintetizar las cadt>nt1., LOmplememarias. Los viruc; con genomas de una '>Ola cadena la izan como moldl' para ~imerízat un¡¡ radeoa - '"'lplementaria, la cual. él su vez. es urilizada para

sintetizar a su compk·memo que por )upuesw. es idéntico a la cadena origina l inicial. La duplicación puede implicar la formadCln de ime11nedictrios eslallles de doble cadena o utili7ar .1cido nucleico de dnb e ladena sólo como UIM fal>t' 1ransnoria. la rc'itricción de la ttan,lrrcnciJ unidireccional de DNA a RNA no es absoluta, he:~ '>idus lpcrada por los retrovirus. cuyos gt'nomas están formados por molew las de Rl\A de una ..,ola cadena Durame el

ciclo infeccioso, el RNA -,e wnvit:rte en una cadena úntcct dr DNA por el prort:!>O dt: Lran cripción .inversa; dilha cadena. a su vc1. c~ convenida en un DNA dC' douk l>e~nda. Esre DNA duplex se convierte en parte del genoma de la ct~l ula y es heredado como cualq1 tier orro gen. rle numem qw: In rranscripcióllmversa pemute que una ~t·mwdtl de RN!J ua recu-

v 111ilizada '01111) ínjormachíll gen~uca . L,1 existencia tk la duplicación del RNA y de la Lranscripcion inversa e<.tableu! el princtpio geueral d(' qut' la mfi.,, m~ltlllll m walqwer ripc1 de ucunrcw dE acido 11t~d~ico plll!dt' .:onv~mm m el orrcl r1po. Sin embargo, <'ll l'l cur~o normal de lo!> hechos, la célula depende de lo'i protC'>o~ de duplicac ion, rranscription y rrc1ducdon del DNA_ No obc;tame, alguna ve¡ Id inlormaCión de un RNA celular se cortvtene en DNA r se insena en C'1 genoma (evemo posiblemenlf' mediado por un viru'> RNA). Aunque la

paadrl

rranscnpciou mwrsa no parti<:.ipa en las operaciones regulares de la rélula. llega a c;er un mecanismo potencialmeme irnponantt: "uando c;e analizo la evolución del gennma.

1.9 La información genetica puede ser proporcionada por el DNA o el RNA

11

/

./

1

Moléculas de DNA replicadas 1

DNA progenitor

Horquilla de duplicación

La horquilla de ouplicación es la región del DNA en la cual hay una transición del dúplex progenitor desenrollado a los dúplex hijos recientemente replicados.

Enlace roto 1

Una endonucleasa divide a un enlace en un ácido nucleico. En este ejemplo se muestra una enzima que ataca a una cadena de un DNA düplex.

do sintetizada. Las enzimas se nombran según el tipo de cadena que simetiz;an: las DNA polimerasas sintetizan DNA. las RNA polimerasas, RNA. La degradadón de los ácidos nucleicos tambiénrequiere de enzimas específicas: las d esoxirribonucleasas (DNAsas) degradan al DNAylas l'ibonuclea sas (RNAsa s) degradan al RNA . Las nudtasas se incluyen en las clases generales de exonuclea-

sas y endonuclcasas: • las endonudeasas cortan enlaces individuales en el interior de las moléculas de DNA y de RNA y generan fragmentos discretos. Algunas DNAsas dividen ambas cadenas de un DNA dúplex en el silla diana, mientJas que otras dividen sólo una de ellas. las endonucleasas participan en xeacdones de corte, como se observa en la • Las ex'Unudeasas eliminan los residuos, uno a uno, a partir del extremo de la molécuJa, y generan mononudeótidos. Siempre aCLÚan en una sola cadena de ácido nudeico, y cada exonucleasa avanza en un a direcdón especifica, es decir, empieza en lln exnemo 5' o 3' para dirigirse hada el otro. Están involucJadas en reacdones de ajuste, como se muesrra en la

111 Una exonucleasa eli 1r1ina bases, una a la vez, divldiendo el último enlace de una cadena polinucleotídic:a.

La información genética puede ser proporcionada por el DNA o el RNA

Concepto!> principales • Los genes celulares son DNA, pero los virus y los viroides pueden tener genornas de RNA.

mento. sólo un tramo peque.ü o del DNA dúplex se separa en cadenas individuales. La estrunura helicoidal de una molécu la de DNA dedicada. a la duplicacíón se Uustra en la . La región no replicada es el dúplex progt> 11itor que se abre hacia la t·cgión replicada, donde se han formado los dos dliple.x hijos. la estructura helicoidal doble se rompe en la unión en u-e las dos regiones. llamada horquilla de duplicación. La duplicación implica el movimiento de la horqui· Lla de duplicación a lo largo del DNA progenitor, de modo que hay tm desenrollamiemo conli11uo de Las cadenas proge11itoras y un enrollamiento de tos dúplex hijos. La síntesis de áddos nucleicos es calalizada por enzhnas específicas, las cuales reconocen el molde y emprenden la tarea de catalizar la adiciÓJ1 de subunidades a la cadena polinucleoúdica que está s ien10

CAPÍTULO 1 Los genes son DNA

• EL DNA se convierte en RNA por transcripción, y el RNA puede convertirse en DNA por transcripción inversa. • La traducción del RNA a proteína es unidireccional.

El dogma central define el paradigma de la biología molecular. los genes se perpetúan como secuencias de ácido nucleico, si bien actúan a l ser expresados en forma de proteínas. la duplicación es responsable de la herencia de la infon nación genélica. La transcripción y la traducción son responsables de la conversión de una forma a otra. En la se ilustran las funciones de la uuplicación, la rranscript.ión y la rraducción desde la perspectiva del dogma central: • La perpetuación del ácido nucleico suele implicar al DNAo el RNA corno el material genético. Las células utilizan únicamente DNA. en tanro que algunos virus u san RNA, y La duplica-

@

\ l f N U DNA

~·

Duplicación

Molde de doble _J cadena

• • •.. 1. ••

Transcripción Inversa

ANA

...........

~~

~ Cadena antcgua }

~~~

Cadenas ntcevas Cadenaantigua

La duplicación genera dos dúplex hijos, cada uno de los cuales contiene una cadena progenitora y una cadena fabricada recientemente

Duplicación

Molde de cadena individual

N!;¡

V\1\-,~ /VV ...... V\1\

Protefn a

El dogma central manifiesta que la informa:-tn del ácido nucleico puede ser perpetuada o transferida , !'1 embargo la transferencia de la información a proteínas es ~versi ble.

La cadena progenitora individual es Utlli.zada para sintetizar una cadena complementaria

La cadena complementaria·es

utilizada para sintetizar una copia de la cadena progenitora

Los ácidos nucleicos, tanto los de doble cadena como los de cadena individual, se replkan por la síntesis de cadenas complementarias regida por las reglas del apareamiento de bases.

ción del RNA vírico ocurre en la célula in fecladi'l .

• La expresión de la información ge1·1ética celular suele ser unidireccional. La transcripción del DNA genera moléculas de RNA que única menre pueden ser utilizadas o tra vez para generar secuencias de proreínas; en general no pueden recuperarse para usarlas como fuente de infmmadón genética. la traducción del RNA a proteína siempre es irreversible. Estos mecanismos son igualmente efecLivos 3:-a la información genética cel11lnr de procario.:s o eucariótas y para la información transportada "'!los virus. Los genomas de todos los organismos \OS están formados por DNA dúplex. Los virus .:rseen genomas de DNA o RNA, y de cada tipo hay :~emplos de doble cadena (ds, double srranded) o de .aJena única (ss, single srranded). los detalles del -:.ecanismo de replicación del ácido nucleico varían nrre los diferen tes sist emas víricos, pero el prind de duplicación por sínresis de rauenas compleemarias sigue siendo el mismo, según se ilustra

e la Los genomas celulares reproducen el DNA por

: mecanismo
sintetizar a su complemento, que, por supuestO, es idénrico a la cadena original inicial. La duplicación puede implicar la formación de in[ennediarios estables de doblr cadena o tt Lilizar ácido nudeico de doble cadena só lo como una fase transitoria. La restricción de la transferencia unidirecdona l de DNA a RNA no es absoluta, ha sido superada por Jos retrovi.rus, cuyos genomas están formados por moléculas de RNA rle una sola cadena. Durante el ddo infeccioso, el RNA se conviene en una cadena única de DNA por el proceso de transcripción inversa: dicha cadena, a su vez, es convertida en un D A de doble banda . Este DNA dúplex se convierte en parte del genoma de la célula y es heredado como cualquier o tro gen, de manera que la Jranscripcióll inversa permite q¡te una secuencia de RNA sea recu perada y uLi/[zadn como informución genética . La existencia de la duplicación del RNA y de la transcriJKión inversa establece el priodpio genernl de que la información en cu11/quier lipa de secuencia de ácido mtcleico puede conl'ertme en el o/ro tipo. Sin embargo, en el curso norma l de los hechos, la célula depende de los procesos de duplicación, Lranscripdón y traduccióJJ dd DNA. No obstanre. alguna vez la información de un RNA celular se convierte en DNA y se insena en el genoma (evento posiblememe mediado por un virus RNA). Aunque la transoipción inversa no panidpa en las operaciones reg ulares de la célula, llega a ser un mecanismo poLendalmente importante cuando se analiza la evolución del genoma.

1. 9 La información genética puede ser proporcionada por el DNA o el RNA

11

Genoma Orgamsmos Plantas Mam!reros Gusanos Moscas Hongos Bactenas

Mlcoplasma Vtrus DNAds Vaccinia Papova (SV40) FagoT4

Número de genes

Pares de bases

<50 000 30 000 14000 12 000 6 000 2-4 000 500

<1011 109 -108 1.6 x 10a 1.3 X 107 <107
<300 -200

VIrus DNAss Parvovuus Fago fX174

5 11

5 000 5 387

Virus RNAds Reovlrus

22

23000

7

12 4

20 000 13500 6400

4 1

3569

o

359

1 300

La cantidad de ácido nucle1co del genoma vaña en un rango enorme. ds, doble cadena; ss, cadena única.

Los mismo~ principios se aplican a la perpetuación de la iniormacion genética tamo en los genomas en •.~rmes de plantas o anfibios como en los genomas diminuros del mkoplasma y en la in formadón genética aún más pequeña de los virus de DNA o Rl~A. En la se resumen algunos ejemplos de la gama de tipos y tamaños de los genomas. En toda la gama de organismos, cuyo contenido total de genomas varía en un rango superim a las 100 000 vece o;. 11revalece un principio común: el TJNA L·odiftm a todas las proteínas que la(s) célula(.1) del orRanismo debe(11) .~illtetizar, y ltt.l proteínas, n Sil vez (directa o lndirecramrmre), proporcimum las ftmciones mcesarias pal'a la superv/VI!ncitl. Mediante un prjnclpio similar se describe la función rJe la infmmadón genética de los virus, ya sea
adicional a las proporcionadas por la célula hospedadota necesaria para la reproducdón c:iel virus durww: su cidtJ infeccioso. (El virus más pequeño, el virus satélite de la necrosic; del rabaco [STNV, satellite tobacco necrosis vims], no puede replicarse de forma independientt:, requiere deJa presencia simultánea de un virus "cooperador", el virus de la 11ecrosis del tabaco [TNV to/7acco necrosis virus], que por sí mismCl es uo virus notma1menre i11feccio:.o.)

12

Conc~ptos

principales

El calentamiento provoca que las dos c11denas de un DNA dúplex se separe~t.

• La T., es el punto medio del ra11go de temperatura de 187 000 5226 165 000

Vlroides PSTV RNA

Los ácidos nudeicos se hi brida n por apareamiento de bases

X

-6

VIrus RNAss Corona virus Influenza TMV Fago MS2 STNV

E

CAPÍTULO 1 Los gen~s son DNA

desnaturalización. las cadenas complementarias ünicas pueden renaturalizarse cuando se reduce la temperatura. • Puede haber desnaturalización y renaturalización/ hibridación con combinaciones tle DNA-DNA, DNARNA o RNA-RNA, y pueden serintermoleculares o i ntra moleculares.

la capacidad de dos preparaciones de ácido nucleico de una sola cadena para hibridarse demuestra su complementariedad. Una propiedad clave de la hélice dúplex es su capaddad para separar las dos cadenas sin afectar los enlaces covalentes; esru hace posible dicha separación, y que se reformen en coodidones fisiológicas a la velocidad necesaria (muy rápida) para mamener las funciones genéticas. La especificidad del proceso depenue rtel apareamiento complementario de las bases.

El concepto de apareamiento de las bases es fimdamental para lodos los p,.ocesos relaciOJwdns con/os ácidos nuclerC05. ~a separación de los pares de bases es un aspecco crud4/ dt? la junció11 de una molécula de doble carlma mientm$ t¡/le la capacidad para formar pares de bases lo es parn la actividad de un ácido nucleico de cadma única. En la se mues1ra que el apareamiento de bases

permite que los ácidos nucleicos complementarios de cadena única rormen una esrrucmra dúplex. • Una región dúplex intramolecular nuede forma rse por apareamiento de las bases entre dos secuencias complementarias que lunnan parte de ul'J.a molécula de cadena

única. • Una molécula de cadena única puede aparcane a rravés de las bases con Lma molécula (le cadena única. mmplementalia e inúependienre. para formar un dupkx intermolecular. La formación de dominios dúplex a partir de áddos nucleitos de cadena única es más importante para el RNA, pero también existe un DNA de cadena única (en forma de genomas víricos). "El apareamiento de las bases enrre cadenas complementarias únicas e independientes no está restringido a combinaciones DNA-DNA o RNA-RNA. rambién puede ocurrir entre una molécula de DNA y una de RNA.

~,

DNA de doble

DNA

!(

cadena

Oesna!urahzac¡on)

VV \IV / V \JIV

RNA RNAfargo

~ ::areamtento

ermolecular entre

cOtécutas oortas largas de ANA

VV

ONA de cadena

indiVIdual

~lf~

ANAcorto

~ \ RenaturahzaCión

[1 apaream•ento de bases ocurre en los DNA , · e intluso en las intcraCCIOI"es intermoleculares e intra,... -e:Jlares del RNA (o del DNA) de cadena individual. Lil t:il rC'ndn d<.: Clllctces covalenres entre cadenas .plcmcmarias permite m.111iplll,u al DNA in vitro.

uctns no covalente~ que estabilizan a la hélice "' ex se imerr11mpen por C'dlcmamiento o e>.-posia concemracione' bajas de sales. L~ dos cadeJe la hl'Un· tlupkx 'e ..eparan completamente ::ndo c;e wmp~n todo., lo~ pueme~ de hidrogeno "' la\ unrn El proct:loO Je ~l·paraciñn de cadenas se llama ~na t uraJización o (coloquialmeme) [ttSi:ín (EJ -uno "dl''>naturalizanon· también loe un,iza para ribir la pérdJda de la Clotrurtura auténtica de una :eina; é'> un término ueneral que tmpltca que la wrmación natural de una macromolécuJa se ha ~ '1>furmr1UO.) La dcsnaturall7ación dd D~A <>e presema en un ¡go limitado cie temperatura y dn lugar a cambios rprendemec; ~?n mutila~ l.k ~us propiedades físicas. : "1lH1ll1 mcdi(} del rango de temperatura en que la~ ~ ienas u·l DNA '>l' !it'pMan se conoce como tempe·•¡tm d~ fu,fióu (7~11, 1//l!l titlf} rempantrm;), la cuaJ de· ~ndc· dl' 111 proporci(m de pctrcs de bases G-C. Como ::la uno de esto~ pvn ·~ tkn~ tres puentes de hidró_.._no. es mas ec;table que un pat dt' bnses formado r A- T, t.>llual ~tllo nll'ntd con do'> de dichos puenf:~. Entre mas pate~o de<.,-<.. wutenga c:l DNA. mayor ·á la cantidad oc: cnt-rg1a necesaria para separar !as -denas rn soludon y lll condlnones fisiológicas. ., 01\A con I0°o de puentee; G-C valor npico de: Jos ~ 'lOma~ d(•lo., manuferoc;, "e desnaturaliza a una r ... ToxJmada de ~~"e tk rnodo c1uc el D~A dúplex ~ e'table a la temperatura de la lelula. I~ t.IC!IIlaturahtaCton del D);A es re\'e~ble en ediciones aprop1aúa!.. l a \_apatidad de las dos .:adena<; complementarias '>eparadas paia volver a rmar una héliu dupk>. '>t' llama rcn at u raliza.:ión . la cual depende del .1pareamit!ntu ~pecífko e l.:¡, bases t'nlrt:' las lcldenas cumplememarias. En h se ~~b~t'rva q11P IJ reacdou tiene lugar

J

DNA

renaturalizado L;~s cadenas mdividuales de DNA desnaturalizadas pueden mnaturalizarse para formar una estructura dúplex.

l'l1 do~

<'lapas. l'nmcro. las cadenas individuales de DNA qul· t'!>tan t'll Ir~ ,,,Jucion 'ie encuenrran por casualidad· SI 'il!S ~ecuencias son complememarias, aparearan 'li'i hase'> para g~nerar una región cona de héüce duplt:x. Po~tl'tlormente Jtcha región se e\tiendr .1 In largo de la molecu1a como una cremallera pr1ra lnrntM una moleculc1 dúplex larga. La renaturaliz.loon de la hélice dupkx restaura lac; proptedadt•., originales perdidas con la desnaturaJizaoón de ONA. La renaturalizacion describe la reacdón entre dos ... rwC'ncia'> Ctlmplementanao; x. A este proceso 51: ll,' llJmJ asoc iación. -;i bien la reacdón se describe de form.:t más gt>I1L'r<11 ronto hJbridación cuando pa t tl cipa tl <ícici ¡J~ nucleicos de diferentes orígenes, como suct•t.le cua11do una preparación es DNA y la orra, RNA. La mpac'ldtld dt' dos preparaciones de ácido~ mtdeicn.1 11arn hibrulm u dmwestra nm pruisión su rompi~IIIWtrmtdnd put•s ~ólo las uc11wczas complementarias ¡mcdm fonnm 1111a t'W uerro a dríplcx El prinCipiO Ut' la rt.'anion de la hibridactón es pon~1 frente a (rente dos preparadones de áódos nude cm de cadena mdiVtdual y después calcular la cantidad dt.> matt'rii1 cll' doble cadena que se forma. En la se ilustra un proceilirnienw por cllual ,t. lk~naturaliLa una prepataaon de D~A y se adsorbt>n en un filtro la!~ lat.lena!> umrana~. Postniormt'ntt: se añ.1de una segunda preparadon de DNA (o lk R"\ \) Jc~natura i.rado. El fihrn es tratado de t.lf forma l]llt' lc1 '>e~uuda preparación se adsorba solo o;1 puede format pares de- bru.e:. con el DNA adsorbido l'n un pnndpio. L~uo~lrnemc la segunda LlO Los acldos nucleicos se hibl'idan por apareamiento de bases

13

Se desnaturaliza el DNA y se adsorbe en un ffltro

~ (:P /

Se sumerge el filtro en la solución

l --..

~ Se determina el DNA unido al nllro

~

La hibridaclón en ñ tro establece si la solución de DNA (o RNII) desnatu1alizado contiene secuencias complementarias a las cadenas inmovilizadas en el filtro . preparación se marca radioactivameme. de manera que se pueda medir la reacción como la cantidad de marcador radioactiva reLenido por el tUtro. La extensión de la hibridación entre dos ácidos nude1cos de cadena individual depende de su complemenrariedad. No es necesario que dos secuencias sean perfectamente complementarias para hibridarse . Si es tán esuechameore relacionadas, pc:w no son idénticas, se forma un dúplex irnpedecLo en e l cual el apaream iento de ba~es se interrumpe en las posiciones en que las cadenas individuales no corTesponden .

1111

Las mutaciones cambian la secuencia del DNA

Conceptos principales • Todas las mutaciones consisten en cambios en la. secuencia del DNA. Las mutaciones pueden ser espontáneas o inducidas por mutágenos.

Las m uracione!> proporcionan evidencias detenn.inantcs de que el DNA es el marerial genético. Cuando un cambio en la secuencia del DN A provoca u na mut.Jificación en la secuencia ele una pTOteína, se puede concluir que el DNA cod ifica a did1a proteína. Ade14

CAPÍTULO 1 Los genes son DNA

más, un cambio en el fenotipo del organismo puede permitir que se identifique la función de la proteína. La existencia de n umerosas mutacion es en u n gen pennite que se comparen nu 1nerosas varLantes de u11a proLeína, y mcdianre un aná lisis detallado se identificarán las regiones de la proteína responsables de una función enzimática o de otras fu nciones. Todos los o rganism os experimentan cierro n úm~ro de mu1aciones como resultado de las operaciones celulares normales o de Las interacciones aleatol'ias con el ambiente a las cuales se les llama m u tacion es es pon táne a s; la velocidad a la que se producen es característica del org<mismo específico, y en ocasio 11es se le llama nivel de fond o . Las m uraciones son c:venros raros y, por supuesto, las que daiia~l a un gen son descartadas con la evoluciótl., de modo que es dilícil obtener grandes cantidades de mmantes espontáneos pa ra estudiarlos en las po blaciones natural.e!.. La incidencia de las mutaciones suele incrementa rse rnewanre Lratarnienros con ciertos compuestos; se les llama mutágeuos. y los cambios que pmvo · can se con ocen com o m utaciones inducidas. Lc:1 mayoría ele lt)s mutágenos actúan directamente en virtud de su capaddad para modificar una base específica del DNA o para inco rporarse e.n el ácido nucleico. La e[ecl ividad de un mutágeno se juzga por 1a medlda en que incremenLa la tasa de mutaciones respeno del nivel de fondo. Utilizando mutágenos se pueden inducir numerosos cambios en un gen. Las rnutaciot'les eo;pontáneas que de sactivan el funcionamiento de uo gen 1ienen lugar en Jos bacteriófagos y en las bacterias a una tasa relativamente constante de 3 a 4 x lO ~ por genoma, por gene ración . Dada la gran variación en el tamai1.o de los genomas emre bacteri6fagos y bacterias, esra t asa corresponde a amplias diferencias en el ritmo de las mfltadones po r par de bases, lo cual sugiere que la Lasa global de mu1adón ha estado s ujeta a fuerzas selectivas, que han equilibrado los efectos lJ Ocivos de la mayoría de las mutaciones respecto dr los favorab les de a lgunas mutaciones. Bsta con clusión se re(uerza por la o bservació n ele qlle una arqueobacreria que vive en condiciones adverséls de a ltas remperaluras y acidez (que supuestamente dañan el DNA) no muesua 1ma tasa eleva da ck mutaciones, de l1echn la rasa de mutación global apenas es menor al rango promedio. Eo la se m uestra que e n las bacterias, la tasa de muradones corresponde a -1 o-<> eventos por locus por generación , o a una tasa promedio de cambio por pa r de bases de 1o-9 a lQ- IO por generación . La rasa en pares de bases individuales varía considerablemen1e, en un rango de 1O000 veces. No hay 11n cálculo preciso de la tasa de mutadones en

CualqUJer par de bases, 1 en 10'-1 0'G generaciOnes

H CITOSINA ~ ~ ' H

e

Tasa de mutación

\

,/ry~ )

A~:

nitro~

URACLLO O

a

~

, NyN,

Cualquier gen

-

1 en 1 o-- 1()1

11

o

H

generaciOnes

u

El genoma,

e

1 en 300

generaciones

'~IRIRIR/1 m....,. 1)

1;

1

silvestre

G

Un par de ba)es mula a una tasa de 10"9 a 10-to ;ene ración, un gen de 1 000 pares de bases mula a una lasa _-:o~ por generación, en tanto que un genoma bacteríar¡o :a a una tasa de 3 x 10·' por generación. _·anotas. au nque e n gene1al se piensa que has1a '"10 pun to e<, 'iimiJ¡u a la de la~ baat'rias calcuJada ocm y por gt·rwraCion .

Las mutaciones pueden afectar a pares de bases individuales o a secuencias más largas ' (ooceptos pnncipall's Una mutación puntual modiñca a un solo par de bases. Las mutaciones puntuales pueden se1 provocadas por la conversión qulmica de una base en otra o por errores durante la duplicación. Una transición rempl¡na un par de bases G-C con un par de bases A-T, o viceversa. Una transversión remplaza una purina con una pirimidina, por ejemplo, A-Ta T-A. Las inserciones son el tipo más comun de mutación, son resultado del movimiento de elementos transponibles.

Las rnutac1011es pueden ser inducidas por modificació n quuníca de una ba!.e. Las mutaciones ptl mua les pueden ser de dos tipos, depenclíl ndo dt• 1.1 natUraleza dt'l cambio cuando una base es c;usmuida por nt.d: • La d.1se mas común es IJ trans ición. que consi~Ll' l'll la '>U\lltllnón dt una pirimidina por 1.1 otra, o de ma pm 'ua por la orra en \."U} U \.,1'\n, un 1 M(,-( e·' rt' mplaz..ado por un

par A-T o \'iCe\ersa. • La dilc;t nt~•no• t·omun es la transversión. en la cual una purin.1 es remplazada por una ririmidtlld O Vlt C'Vl'T.,,1 , de taJ fom1a que un par A-T 'ie <.onviene en T-Ao en C-G . Lo!' dt>uo~ dl·l .ít ido n itro~o conslituyen u n eje mpl o clá$ico de trathiLi6n p nr la co n versión quím ica dC:' l l l1 <1 b
::· .1/qwa rar d( bdSt'S dd fiNA tllltdt• IIIU(llr. Un a m u t ación puntual G1mb1a solo un par de bases. y - ... ede c;er provocada por cinc: llpo-; de eventos: • La modjhcaCIOn qUJmica del DNA convien e d iT(·uanH'ntt' 1111.1 h.l!>t" t'n otra diferente. • Un m a l ruuuonami~:nto du rante la du plica ción del UNA provoca la inserdón d e tma hao;e t'<¡ IJÍvot
Las rranste1ones tamhteon "011 provocadas por apareamient o erróní'o rle base cuando pareJaS 1nusuale" se aparectn dc'>afiaudo la rc:·stncdón usual dt> los p.Ut>!> de Watson )' Cnck En general. el apareamienw t>rrónco de ba'l'' t·-. una aberración. rel.ultadu de la U'\Corporación en el D~A de una base

anormal que llt'nt' propicd.tdl') ,m,btgua!. de apareamienro. En lil SI? mut...;tra el ejemplo del bromo~~rad l o (BrdU)

tlH>it•cu la •.ma logJ a la timina

.Ll2 Las mutaciones pueden afectar a pares de bases Individuales o r1 ~ecue n cia s más largas

15

CH3

HC,.~O /

N'e(N'H

Azucar O Par A·T

H....N ... H ·r

t(G.....c-,~CH

HC'N"

1

El BrdU se aparea con lo A en la dupllcacion

Azúcar

t

Br

Hc-'....C'c.,o

/NyN-H ,

11

Azúcar O

El cambio ceto·enol permite que el BrtiU se aparee con la G

Br 1

Carnblo ceto-~mol

H ?c'c_..OH

9

,

/N'c.... ~

Azúcar

11

en gene!, individuales. pem ahora sabemos que las inserciones de frdgme11ros de material adicional ~r;n muy frecuenu:s. la fuenre del material insertado ya~e et1 los elementos t:ra nsponibles. que son secuencias de DNA susceptibles de cambiar de lugar (véJsc Capitulo 21 , Transposones, y GapíruJo 22, Retrovirus y retroposones). Normalmente, una imerción c;uprime la actividad de un gen, y donde han ocurrido dichas inserciones. después pueden producirse delecion e s de una pane o todo el mate· rial in:.enado, y basta de los dominios adyacentes. Urta diferencia significativa entre las mutacio· nes puntuales y las inserdones/deleciones es que la rret·uencia de ldS primeraS puede increruC!llarsc por los mutiigenos, mientras que la incidencia de los cambios provocados por elemenlos traosponibles ntl se ve a[ec!ada. Sin embargo. las inserciones y delecio nes también pueden ser prnducw de mecanismos. pur <'i<'mplo, los que implican errore!> come tidos durante La duplicación o la recombinación, aunque probab'lemcnte sean menos comunes. Por OlTa parte, una clase de muriigenos, las C1Cridinas, dan lugar a inserdones y deleciones (muy JH.'QUClias).

O

1

El BrdU se aparea ~ con la G en la duplicación

Los efectos de las mutaciones pueden ser revertidos Conceptos principales

Se pUeden inducir mutaciones al incorporar análogos de bases en el O'JA,

que t'Drllkne

éÍiotno de bromina en lugar del grupo metilo de la ti mina. El Bl'dU se incorpora al D /\ en lugar dt- la timina . No obs[an[e, sus propiedades de apareamienlu son ambignas porque el átúmu de hromina pt·rmitt> que se realice tm cambio en el cual !a base modjfica 'iu estructura. de una forma cero 11 11

(=0) a IJilrl fornta eno l (-OH) . Esta ulrima puede apJrearse con la guanina. Jo cual conduce a la sustitución del par original A·T por un par G-C. El apareamiemo erróneo puede ocurrir durante la incorporación original de la base o eu un dclo c;ubsiguientl' dt.• duplicación. La transición es inducida con ciena probabilidad en cada ciclo de duplicación, de moJo que la incorporación de BrdU tiene de< to~ ron Linuos en la secuencia del DNA. Durante mud1o tiempo se pensó que las mul~linnes punt11alcs er;;¡n !.1 vía prin.<:ipal de cambio

16

CAPÍTULO 1 Los genes son ONA

Las mutaciones directas desactivan a un gen, en tanto que inversas (o revettientes) revierten sus efectos. Las inserciones pueden revertir por deleción del material insertado, pero las deleciones no pueden revertirse. La supresión ocurre cuando una mutación de un segundo gen anula el efecto de la mutación del primero. En la se muestra que el aisJ.amiento de los r e vextie n tes es una c,uac1erística impo n ame que distingue las mutaciones punruales y las ioseJcione.; ele las dekriones: • Una mutación puorual puede revenirse al restaurar tcJ secuencia 01iginaJ o al adquiri1 una mu tadón compensadora en alguna otra pane del gen. • Una i11serción de material adicional puede ser reve11ida por deleción del material insertado. • Una deletión de uné! parte de un gen no puede revenirse. Las mutaciones que desactivan a UJ1 gen son llamadac;; mutacio nes d ire c tas, y sus efectos sou revenido) por mutaciones i n versas, las cuales son de dos lipos, reversión verdadera y reversión supresora i nrrogénica.

·~...____ _

_ _ _1

_~

ATCGGACTIACCGGTIA TAGCCTGAATGGCCAAT

Mutación puntual

1 t

ATCGGACOACCGGITA TAGCCTGALTGGCCAAT Reversión

l

ATCGGACnACCGGTIA TAGCCTGAATGGCCAAT ATCGGACTIACCGGTIA TAGCCTGAATGGCCAAT lnsercJón

ATCGGACTI x .11XACCGGTIA TAGCCTGAAYYYYYTGGCCAAT Reversión

por deleción

1 t

ATCGGACTIACCGGTIA TAGCCTGAATGGCCAAT ATCGGACTIACCGGTIA TAGCCTGAATGGCCAAT

ATCGG ACGGTIA TAGCCTGCCAAT Reversión Imposible

Las mutaciones puntuales y las insercione5 pueden ser revertidas, pero l3s deleciones son irrever5ibles. Una reversión exacta dt' la rnUiadón original

se llama revers ión verdad era. de tal manera que si u o par A-T ha c;ido rcmplazacJo por tm par G-C. ou-a ntiHarión que reSTituya e l por A-T regenerará exactamente la secuencia de ripo sil vestre. El '>cgundo tipo de mutación inversa. la r everc;ió n supresora inrragé nica, puede tener lugar en otro sitio del gen. y sus efe el t>s compensan a la primera mutación. Por ejemplo. un cambio de ami11oacido en una proteína jlut'de allolir la funlión del gen. pero una segundi;l alteración puede compensar por la primera y 1CSta11rar !a actividad tk la proteína. Una lllUL(lt:i ÓH dl.recta resu ha de cualquier cam bio que desactive un gen, mil'ntras que una mutati6n inversa debe restaurar la función de una pro teína dañada por una mu tación
Las mutaciones también pueden ocurrir en onos genec; para contrarrestar los efectos de una mutacit1n en el gen urigin.i!l. eteGo que -;e conoce como su presió n . Se llama ~upresor al locus en qut' una mutación suprime el dccro de l:na muta' itlll

en

lHl'O.

Las mutaciones se concentran en pu ntos calientes Concepto principal • la frecuencia de las mutaciones en cualquier par d~ bases en particular dependE' de una nuctuacion estadística, excepto en los pl 11to~ calientes, en los cuales la frecuencia se incrementa cuando menos en un orden de magnitud. Ha:,ta a hura s~ han descriro las mutariones en luncion tle los cambios individuales en la secuencia del DNA que inllu}'en en la ñcrividad de la w1idatl genétka en la cuaJ ocurrc:ll. Cuando se analizan la" mulaciones desde la perspt·nlva de la desactivaciun ckl gen. la mayoría de 1m g('nes de una especie muestran rasas más o merws 'iimilares de m\ttacióu respecto de su camaii.o, lo cual ~ugicre que d gen puede ser comider;:tuo como un objet1vo de la m u ración, y q'lle un da r'io c>n cua lqujera de sus partc·s pl lt'Úe abolir su función , por consiguiente, la susceptibilidad a la muración es aproximadamt>me proporcional al tamañr> del gen. Pero considerando los sirios de mutación de la l>ccuencia del DNA. ¿todos lo., pares de bases de un gen ~on ig<.1almeme susceprihles o algunos son más propen.;oo; que: orros a sufril mutaciones? ¿Qué sucede cuando ')e aísla un ntunero impun antt' de mutacion es ·ndcrwndienles del mismo ge11 ? s~ obtienen numero<;os m LlliH ttes, cad-a uno ele los cuales es resu ltado de un t"vcnw mutacional individual. Posteriormente se determina el sitio Je u1da mmadón . La mayona d~ . . ns mutadones radicarán en sirios diferente~. si bien algunas estarán en la mil.ma posición. Do<> mUiacíones aisladas de manera iud<:¡.>endieme en el mi$lllO sitio pueden constituir exactamenre el mismo cambio en el DNA (en cuyo caso el mismo evt'mo mutacional hd sucedicio l'll mas de una ocasion). o p11cuen constituir cambio:; di fcrcn Les (en cada par de bases son posibles tres mutaciones putttuales dlferentes) . En el histograma de td se muestra la frecuencia con la C1.li\l se enn1emran muracio ues en C'ada par de ba.se'i dd gt!n fac/ de E. coli. La probabilidad estadlSlica de que ocurra más de una mutación en ur. siliCI part.iculat se determiua por dnl:ti(a de impactOs alearorios (como se observa en

1.14 Las llllltaciones se concentran en puntos calientes

17

(/1

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5

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40

~ 30 l E

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20 10 ~

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!'JI.

100 150 200 250 300 bp Distancia a lo largo del gen

Las mutaciones espontáneas ocurren a lo largo del gen /acl de la bacteria E. co/i, pero están concentradas en un punto caliente. la distribución de Puisson) . Por lo tamo, algunos

sitios adquirirán UIJa, dos o Lres m utaciones,

mi~n­

Lras que orrosno obtendrán ninguna. Algun.os si rios adquieren muchas más mutaciones ele las esperadas en una disrribución aleatoria; puede u presemar 1 O e ínclmo 100 veces más mutadones que lds predicha~ por los impados a learorios. Estos sitios se llaman p untos calientes. En los punros calientes pueden oc unir muraciones esp011táneas, y m utágenos di[eremes pueden tener diferentes puntos calien res.

Numerosos puntos calientes son resultado de bases modificadas Concepto principal • Una causa comün de puntos calientes es la base modificada 5-metilcitosina, la cual sufre desaminación espontánea y se convierte en timina. Una causa imponante de mutación espománca resulrn de la presencia de Ul'la base inusual en el DN A. Además de 'las cua tro bases que s~: insertan en éste cuando es sintetizado, en ocasioQeS se pueden ob-

servar bases modificadas C11yo nombre refleja su origen; son producidas al modificarse quúui.camenre w1a de las cuatro bases ya presentes en el DNA. La base modificilda más común es la 5-metilcirosina, generada por una enzlma merUasa que agrega un grupo rncLilo a t icrws resiciuos de citosina en sitios específicos del DNA. Los sitíos que con1\enen 5- mclilcitosina proporcionan puntos ca l ienl.~ pr~ra que se desarrollenmu tadones puntuales espon Láncas en 6. coli. En cada caso, la mutación adquiere la forma de una transición de G-C a A-T. Las cepas de B. co/i incapaces de metilcu la citosina carecen de pumos calientes. La razón de la existencia de los puntos calientes es que las bases de cito~ina sufren desaminadón

18

CAPÍTULO 1 Los genes son ON¡\

La desaminación de la citosina pr·oduce uracilo1 y la de 5-metilcitosina, ti mina.

espománea con frccuenlia COJISiderable. En esta reacción, el grupo a mino es remplazado por un grupo cew. Recuérdese que la desaminación de la drosina genera uracilo (véase Figura l .2 3). En la se compara esta reacción con la clesaminadón de 5-metilcirosina, en donde la desaminación genera timinél. El decro en el DNA es la generación de p-ares de bases G-U y G-T, respectivamente. donde hay un apareamiento erróneo entre parejas. Todos los organismos cuentan con s istemas de reparación que corrigen pares de ba5e apareados erróneamente eliminando y remplazando una de las bases. La operación de estos sistemas determina si los pares apareados erróneamente, como G-U y G·T, resultan en muradon.es. En J.a se muesLra que las consecuencias de la desaminadón son diferentes para la 5-metildtosina y para la ciLosina . La desaminación (poco fTecueme) de la 5-metilcitosína provoca una mutación. en tamo que la desamlnadóu de la dLosina más cmuún no tiene este efecto porque los sistemas de reparación soo mucho más electivos para reconocer G-U que G-T. La B. coli contie n e una et1zima, urac:ilo-DNJ\glucosidasa, que elimina los residuos de uracilo del DNA (véase la sección 20.5, La inversión de bases es utilizada por la~ metilasas y las glucosilasas). Esta acción deja sü1 aparea1· un residuo de G, y posLeriormeme ''un sistema de reparación" inserta una base C para aparearlo. El resultado final de estas reacciones es la restaluación de la secuencia original del DNA. Dste sisrema protege al DNA de las consecuencias de la desaminación espontánea de la citosLna (pero no es lo sufi.cienteu1eme activo como para prevenir los efcdos del alto nivel de desaminación provocado por el ácido nitroso; véase la Figura 1.23). Nótese gue la desaminación de la 5-metikitosina ¡.noduce titnina, lo cual da lugat a un par de bases apareauas erróneamente, G-T. Si d apa rcamiento

eMt~

e ~ G G

¡

DesamtnaClÓn ox&dahva La T remplaza a la Me-e El U remplaza a la

e

VJ\fAv\DJY G

'T

G

l

Eliminación del uracilo

¡

lnserc~ón de citosina

~ G G T

G

'N.U\./NV G

Duplicación

e

l

e

T

Y

e

~ G G v~

A la T se aparea con le A Mutación

G

Stn mutac!On

La cl!samtnacton de la 5-me:iltitosma ;Jroduce timina {por transiciones de C-G <1 --A). en tanto q1.e la desamiración de la citosma ;>roduce uracilo (que suele ser elimi1ado y posteriormente remplazado por Cttosina).

erróneo no .,E' corrig(' out<.·s del ·tguientc deJo de duplicación. 1es u ha una nnnaCJon. En la siguiente dupltcacion. las haws ckl Jpar~amicmo erroneo entre G y T se separan y posteriormente 'ie aparean con nuevas parejas pJra producir Ltn pc~r G-C de ripo silvestre y un par A-T mutantc. Lil desaminoción dt> la 5-mtttllcito!;ina es la causa más comC111 ele la prmlucción de pares erróneos de G-T en el DNA. Los ~isternns de repAración que actúa n en dic.. hu~ pa de rmJtación (véase la sección 20. 7, Control Je la dirección de la reparación del aparram1en1o rrrnnc•u). 'Jo obc;lanre. estos shtema~ no 'on I.Jn decrivos como la remodón de U de lo-; pares ern1ncoo; G-l, de moon que la desaminadón de la 5-metilcitosina pro' oca mutaciones con mucha mayor rrccucnciJ que la desaminación de la dto~ina. la 5-mctilctto,ula t.Hnbién l rea punto~ calien tes en el .Dl\A de eucariotas. fenómeno común en dinudcóridoc; CpG lOtH'<.'n trado., en regrones denominadas isla~ Cp<... (vease la secdon 24.19. Los islotes \pG ~nn cllan,r., n•guladorns). Si bien la 5meLildtosina represema - J '~" de las bases del DNA humano. ln"i ~ilros qLtt: t'IJJllÍl:lren 1.1 ba~e mocütica-

da representdll - 30"{, de lr1s mutaciones puntuales; eslO hace del estJdo de la 1-merildtosina un factor determinante de mutadm lllU} importante en las células aninrako; Los dectos de l.t ehminación de .a enzima del raton NIDD4. ~lucosrlasa SJsceptlble de eúminar T (o l) JC' pare" l'trOIH'O'- ,·un G, subr.lyan a tmporIancia de los sistemas ae rep<~ración para reducir la ta~a de mut.1crones. td rt'sulrado es una rasa de mutadón tn.·~ Vl'lt''> nt,!\ r>r t'rt lo!> siUos CpG. (la razón dt' que el efcltu no c;e¿ mayor es que ld i\I\B04 consrin.l)'e sólo uno de lo-, numt:tosos sistemas que inciden en lo~ p.HL'S t•rr6nt."o~ <.-r-1, es dt! imaginar que la e!imin 1.1 li1.~u1 de muración.) la opne1uon ~k c~flt'> 'ii'.lt'Hld~ proye< ta una lU7 imeresame en el u~t~ de laTen el DNA respectO de la U 1:'11 el fU\ A qt1c· quizti St: rei,Kione con la necesidaú (k C'~t<~hilidt~ d rll• la "'' Ul'nc"i.l del ONA; el uso de T signiAl:a que cualquit-"r ucsamini\ci6n de e se detec1a de imnedt,1to debu.ln a que genera una base (U) que Slll'll- L'~tar a\"t'lllt' del D A. lo cual incremema en gran mechda la eOoc-n de teparación (comparados con la 'iruaoón t'll 4ue m~nen qut: detectar apareamiemm c:trollt'U'- <1-T. O'> tuak!> tambicn pueden ser producidoc por situaoones en que la eliminación de Id T nu ~erra IJ rt''-(lllt'\tJ apropiad.l)_ Asimismo e enlace foslodit::stcr del esq•.Jeleto es más lábil cuando li! base e~ U

111 Algunos agentes hereditarios son extremadamente pequeños Concepto ¡¡rinc.ipal

·

• Algunos agentes hereditarios 1nuy pequeños no codifican prutelnas, pero constan de RNII o de proteínas que tienen propiedades hereditarias.

Los viroides son a~entes infecciosos que producen t·n pi;Jnf,1!> :.uperiores; son molécu-

enferrnt·dack~

las circulares de RNA muy pequeña~. A diferenda de los virus. cn los cua e'i el agente infeccioso es un virió n, genom.t t•map~ulado en una cubierra de protetna, t'l R/I.A 1'/r,,tt/( t'S d agcntl· mjeaioso. El vuoidt' ~'>tá lurm.1do únic h1rman una barra caracteristica, como 1.1 Ilustrada en la . Las mutacuHli'.,I.Jllt' interHc:ren con la estructura de esta batTa reducen 'ili Lapaudad in(cu rosa. Un R'\IA vitoide consiste en una t'specic rnolec.ular inrlivíd11.11 que st. replica de tor01a aurónoma en células in!ect.lda'> y uJya ~etuenciJ se perperúa 1.16 Algunos agentes hereditarios son extremadarnente pequeños

19

El RNA del PSTV es una molécula circular que forma una estructura extensa de doble cadena interrumpida por numerosos lazos interiores. La forma leve dífiere de la grave en tres sitios.

fielnJeme en sus descendientes. l.o' viroides pueden clasificarse en numerosos grupos. Un viroide dado se identiflca con urJ grupo por la similirud de <;u secuencia con la de otros miembros del grupo. Por ejemplo, cuatro viroides relacionados con el del rubérculo ahusaélo de la papa (PSTV, pacalo .spindfp

ruber viroíd), muestran simlliiUdes de secuencia del 70 al 83 por ciemo. Los clil'erentes aislarnienros de una cepa de un viroide en particular pueden variar entre ellos, y el cambio puede afectar a1 fenotipo de células infectadas. Por ejemplo, las cepas leves y ~evera.s de PSTV difieren por u·es sustituciones de nucleótidos. Los víroides se asemejan a Jos virus en que !-Us geno.rnas de ácido nucleico son heredables porque cumplen con todos los requisitos de la inf01mación genética. aunque los viruides, llamados en ocasiones patógenos subvíricos, difieren de los virus en estrucrura y función . El RNA viroide no parece ser traducido a proLeínas, por lo tamo nn puede codificarpor sí mismo las funciones necesarias para su supervivencia, fenómeno que genera dos toterrogantes: ¿Cómo se replica et RNA viroide? ¿Cómo afecta a l fenotipo de la célula de la planta lnfecrada? La duplicación debe ser realizada por enzimas ele la célula hospedadora. subverlidas de su función 1101111al. La heredabilidad de la secuencia del yjroide ind ica que el RNA vi..roide proporciona el mulde . Presumiblememe. los viroides son patogén icos porqu.e interfieren con Jos procesos t:elulares normales, qui.zá de forma relativamente aleatOria, por ejemplo, secuest rando una enzima esencial para su propia duplicación o interfiriendo con la producción de moléculas necesarias de RNA celular, o bien, pueden comportarse como moléculas reguladoras anormales con efectos pan!cuíaces en la expresión de genes individuales. Un agente aún menos común es la cncefalopatía es pongiforme de ovejas y cabras (sera20

CAPÍTULO 1 Los genes son DNA

pie), enfermedadneuroJógica uegenerativa de ovejas y cabras que se relaciona con kuru y síndiorne de Creutzfeldt-Jakob, enfermedades buma.nas que afectan la fuuci6n cerebral.

El agente infeccioso del .~crapie no contiene ácida nucleico. ·Este agente extraordinario llamado prión (agente :ittfeccioso proteináceo) es una glicoproteína hidrófoba de 28 kD. o PrP, codificada por un gen celular (conservado eütre los mamíferos) que se expresa en el cerebro normaL La prmeína existe en dos formas, el producto que se encuen tra en el cerebro normal conocido como PrfX, que es completamen te degradado por proLeasas. La proteína encontrada en 1os cerebros infectados se conoce como PrP" y es extremadamente resistente a la degradación por ptoteasas. La PrP<se convierte en PrP" por una modificación o cambio con forma cional q tte confiere resisteocia aJas proteasas y que aún no ha sido descrita por completo. Como agente iníecdoso del scrapie, el PrP" debe modific¿¡r de alguna manera la sínlesis de su contraparte celular..nonnal, de tal fonn a que1 de ser inocuo se Lome en infeccioso (véase la sección 31.12, Los priunes provocan enfennedades en los mamíferos) . Los rarones que carecen del gen PrP no pueden ser infectados para que en ellos se desarrolle scrapie, lb cua1 demueslra que el PrP es esencial para el desarrollo de la enfermedad.

Resumen Med iante do!i experimentos clásicos se demostró qut: el DNA es el material genético. El DNA aislado de ulla cepa de la bacteriA Pneumococcus puede conrerir p ropiedades de dicha cepa a Otra. Además, e l DNA es el único compon ente heredado por la progenie de los fagos progenitores. El DNA puede u 1ilizarse para rranslerir nuevas propiedades a cé lulas ew.."a rio1as.

El ONA es ulia 11elice duplex lorrnada por cadela~ t uaks lo' nuclcótidos es1án "Udos por enlaces tosfodiéster 5'a -3·. El esqueleto 'llla la pé!rll nlt>nor; lél!. ha'>t.'!. de purina y de pirim.J.ina estan ap1laclas en l'l interior Io:mando pares. 6 lo~ cuales la A c., cornpkrncntana de la T.} laG. !:" la C. Las cadenas se separan y recurren al apa..::tmlcrs tu totllplc·rnt·IH,mo dt· bases para ensamblar 3Jenas hijas siguiendo un patrón de duplicación ~~ucomervadora. Fl .1parcamiento compleroemade base' tam\.Jí¿n se 11til1za para transaibir un ~~A que rcprescnt.1 una :.ola tadena de un DNA uplex. Un iragmento <.ie DNA puede codificar a una <""~ teína. El uitligo gcnúico ckscribt: la relación en..t' la secuencia cle l DNA y 1,1 secuencia de la proteí~~. Sólo U ll cl de la~ do~ cadenas ckl DNA codiGca a aa pro teína. Un codón l'!ILÁ [ormaclo por tres n u.cótidoc; qttc re¡m:s('11l un cambio en la secuenda de · pares de bases. A-T y G-C d~l DNA que. en una :::uencia codilic.:~dora ., puede cambiar Ja seruenda ~ aminoacido) de la protema corre~pondkme. Una J tadón por despl.:~zamiento del marco de lectura - .>difica el marco de lccwra sub:.1gutente insenando c:immando una bac;e de modo que se produce una ... ~t· compklanleme nut'VJ de aminoáddos a partir ::.sitio de la mutac1ón. Una mtuac1on punrual cam.:;¡ sólo r1l ammoaddo rt>prtsentado por el condón en nml sucede la mutación. Las mutadones punruan pueden ser revenida!. ¡.>or mut.adórt inversa d~ la .:.uradón origmal. La-. inserciones pueden revenirse r la pérdidil del ll1JU?rin l in~ertado, pero las cle"""iones son lm~versibl es. Las mmadones también .eclcn ser su primid:t~ de man ~ra 1ntli recta cuando a mmac!ón dr un gen dilenmte antagoniza al de· .:r;o original. La incidenua nalural de la-. mutaciones se in-~me t11a por medio de mutágenos. Las murado::s pueden conet·ntrar:o,e en puntos caJirntcs. Una ~,..,edad de punto calientt> responsable de algunas '!:11tacionc·c; puntu.lll''i eo; prm ocada por la desaml· : .:ión de la base modificada 5-metilmosina. Las mutaciones dircCLa'> ocurren a una tasa de -le-~ por locus por generacion· las retromutaciones -nutaciones inversas) son menos comunes. ~o a~ lac; mutadtmc!l inliden en ~::1 fenotipo. Aunque toda lcl mformac10n genetica de las cé_..as r11 1ransportacla por el DN A. los viru::. lienen - "lomas de doble cauena o de una 50ia cadena de :. "A o de RNA.los viroid~s son pmógenos subvíri-

a' amiparalc:lac; l'n

cos fo1mados unicameme por moléculas circulares pequeña-; de R:\A, s1n Lubiena protenora. El RNA no cod1fica proteína); ~L desconoce su forma de perpt>tualiun y dl' palllgl'rH'"i~. El stwpit es un ageme proteínico mfeccioso

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El DNA es el matenal genético de los virus

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IIJ

El DNA es el material genelíco de las células animales

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111

El DNA es una hélire dúplex

riP invest tgacion J O . ~nd Cncl\. f 11 C. (195}¡ A 5trunure lor 0:-JA Nmurr 171, i~7-H8 Wutson, 1 D. <Jnd Cnd<, F li ( 1?S}) Genc:nc lmplicalions ollhc: Slructure ol Ol\jt\ .v.m:rt 171 964-967 W•l<m~ "'l . f H.. Stnk~\ 1\ R. aud WU~oll H. R.. 11 953¡ Mo!etular s1ruuur< of DN~ Sa/111{ 171 738-740 Arnculo~

'\\'~tsnn,

ID

La

duplicación del DNA es semiconservadora

Revisione~

Holmc:s f 1.wo 11 .'.lt u/.(rt/J 'itn/11 .mJ t/t( Rt•pllamon of DNA JI flrlt.•rv oj r/t( Mort Bl'llllfl(lll Exp.-rbllt!nL 111 Bwlvgy. Yak U111Vt!t5h~ Prt'~'· Nrw Havc·n. C1.

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llfJ

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CAPÍTULO 1 Los genes son DNA

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Algunos agentes hereditarios son extremadamente pequeños

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Los genes codifican proteinas

-

I DI

ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción Un gen codifica a un solo polipéptido la hipOtesis de un gen : una enLrma resume las bases de la genética mode1 na: quP un gen es un fragmento de DNA que rudific11 a una sola cadena pollpepttdica. L3 mayorla de t.b mutariones deterioran la función del gen en el cual se producen.

Las mutaciones que se presentan en el mismo gen no se pueden complementar Un.1 mutación en un gen arecu sOlo a la proteína codificada por la copl
(producir un fenot100 srlvestre cuando se presentan c:n configuración uons en un heterocignto) significa que h>rman parte dl!l ml\mO gen.

Las mutaciones pueden provocar pérdida o ganancia de función • Lu mutaciones rPresivas son p1ovocadas por pérdida de función del p•oducto proteínico. • La~ mulatinnes dominantes son resultado de una ganancia de función. • La evnlu~ciOn dP la esenci~lidad de un g~n requiere de unil mutación nula (qu~ eli111ine por com pleto su función). • L,is muloclooe~ ~ilendosas no tienen ningún efecto porque Pl cambio de base no allera 1¡¡ secuencia ni la cantidad de prot~lna , o porquf' el cambio de la secuencia de la proteína no tiene nfngun efecto. Las mutacione!. ft!Zumante~ (o h1pomorfas) inciden en la funciOn del producto del ger., pem no se observan en el fenotipo debido a qu~> prt'valece la act'vidao suficie1te.

Un locus puede tener numerosos aletos mutantes diferentes la existenc1.1 de vario~ dlelo\ permite ocurrencia de cualQUlel combinación en pares de alelas.

l!~!temcigotos con

Un locus puede tener más de un alelo de tipo silvestre Un locu~ puedl! tener una diso1buc•on polimórfica de alelos sm un alelo md'v•dual qJP pueda sr:1 considerado como el urnco de 11po silvestre.

La recombinación ocurre por el intercambio ñsico de DNA La recornbinacion es "eSUltado del entrecruzamiento que ocurr@ ~n los quiasmils e involucra a dos de las cuatro

uomálida\.

La r~cnmbinacil'ln se debe a un rompimiento y una reunión qut' tle11en lugar a través de un intermediario de DNA híbrido.

El código genético se lee en tripletes El c6rllgo genl-tfco ~e lee en tripletes de nudeótídos denom u1ados codores. Lo\ l ipletes no e~tAn superpuestos y se leen a partir de un :~untn fijo de lmCJo. • Li!\ tn~~t.ac ones que 1nsertan o eliminan oase5 •noividuales provocan un cambio el\ lo~ gruoos de tripletes des<~ués del siuo de fa mutaCIOn. • 1as COII'·bfrwcionel de mutaciones Q!Je insertan o eUminan tres ba~Ps (o múltiplos de tres), insertan o el•mioan a~r.looaddo\, oero no cambian la tecwra de tos tripletes mu JIU! del ultimo s1tto di' mutación.

Cada secuencia tiene tres marcos de lectura posibles •

u~ualmen·e solo un f'l3flO de lecu.r.~ es traducido y los otros oos son bloqueatlos :~or señales rrecuentes de term nat1011

Los genes procarióticos son colineales con !.US proteínas Un gen prorari6tico es un fragmenlo constante de JN nucll'Otido' ¡¡ue tudifio..a a N dmfnoacidos. • El gen, el RNAm y la proteína son Lodos rolineales.

mi Numerosos procesos son necesarios para expresar el producto proteínico de un gen • Un yl!n pro1.ariotico se expresa poo tr<~nscripci6n en RNAm y poueriormentc po1 traducción oel RNAm en una proLeirra. En las euc~dolas, un ge, puede contener reqiones internas no tl'prl'Sl'nt~óas en ld pro tel'la. • La• regiones •nternas son elimi'ladas del transcrito de RNA por e corte y ~:>mpalme tle i!~te oara dar or'gen a un RNAm colineal rP\Ilecto del producto proteínico. • CadA R:-41\m esW fo'lllcldo por una región líder 5' no :raduc•da una región Cod1Rcadora y una región posterior 3' no traducida.

Las prote1nas actúan en trans, pero los sitios del DNA, en cis Todo\ los ;¡rodoc;os de los ge~es (R~A o proteínas) actúan en trans; pueden actua· e:- rualquie· copia de un gen en la c~l.~ta.

• Las onut<JCIOO"> ~~~ llCt.lación en C1! iden:iikan a las ~~~cu~ncias dt ON/1 que son el objPtivo de reconocimiento ce los producto~ de actuación en trons. No se eJtprt!5i!n wMo RNA m como protclna~. y afectan só!o al fragmento contiguo

d~t

DNA.

011 Resumen 23

ID Introducción El gen es la unidad funcional de la herencia que constiluye una secuencia del genoma cuya función es dar origen a un producto discreto (ya sea una proteína o un RNA) : su comportamieoro bás ico fue definido pm Mendel hace más de un siglo. Res u mido en sus dos leyes, el gen fue reconocido como un "factor de panículas" que se transmite sin cambios del progenjwr a su progenie. Un gen pt1ede existir en formas a lternas que se conocen como aletos. En los organismos cUploides, los cuales tienen dos conjumos de cromosomas, ·una copia de cada uno de eUos se hereda de cada progenitor, mismo comportamiento exhibido por los genes. Una de la!> dos copias de cada gen es el alelo paLemo (heredado del padre), el orro es el materno (heredado de lamadre) . la equivalencia condujo al descubrlmienro de que, de hecho, los cro mosomas portan a los genes. Cada cromosoma consiste en u na csrrucmra lineal de genes. Cada gen reside en una localiz.ació tl particular del cromosoma. la localización se conoce de manera más fom1al como locus . Los a leJos de un

El cromosoma contiene numerosos genes

gen son las diferentes formas que se encuen tran tn su locus. La clave para comprender la o rganización de los genes en los cromosomas fue el descubrimiento del ligamjemo genético, o tendencia de los genes de un mismo cromosoma a mantenerse juntos en la progenie, en lugar de ordenarse de manera independiente, como "Pronostkan las leyes de Mendel. U na vez que se introdujo la unidad de recombinación (reordenamiento) como medida de vinculación, fne posible consrruir mapas genélicos. La resolución deJ mapa de recombinadón de una eucariota superior está rest ringida por [o reducido de la progenie que puede obtenerse de cada cruza. La rccombinación es tan po<.:o frecuente entre puntos cercanos, que se observa rara vez entre mutaciones diferentes del mismo gen. Por ello, en los mapas de ligamiento clásico de las eucariotas se puede colocar a los genes en orden, pero no es posible dete1minar las reladones en m1 gen. Al cambiar a un sistema mkrobiano en el cual se puede obtener una progenie muy numerosa de cada cntza genética, los investigadores pudieron demostrar que la recombinadón ocurre dentro de los genes y que sigue las m ismas reglas que se dedujeron previame11te para La recombinación entre genes. En un gen, las rn utaciones p11eden estar organizadas de forma Uneal, con lo cual se demuesu-a que el gen mismo posee la misma construcción lineal que el ordenamiento de genes en un cromosoma, de modo que el mapa genético es Lineal en los loci y enn·e éstos: está formado "POT una secuencia continua dentro de la cual resjden los genes. Esta conclusión condujo naturalmente a la perspectiva moderna que se resume en la , en la cual se considera que el material genético de un cromosoma está formado por una molécula ininterrumpida de DNA que representa a numerosos genes.

111 Cada gen es parte de una secuencia continua de DNA

fow¡

ln1cio

del gen

Final del gen

CATATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCCJOACAATGC GTATATTCCAcrCCATCCTAGTCAAOOAGGAGTG ACG

Cada cromosoma tiene una sola molécula larga de DNA dentro de la cual su encuentran las secuencias de genes individuales.

24

CAPÍTULO 2 Los genes codifica n proteínas

Un gen codifica a un solo poli péptido

Conceptos principales • La hipótesis de un gen : una enzima resume las bases de la genética moderna: que un gen es un fragmento de DNA que codifica a una sola cadena polipeptídica. • l a mayoña de las mutaciones deterioran la función del gen en el cual se producen. Mediante el primer intento sistemático de relacionar a los genes con las enzimas se demosu·ó que cada e tapa de la ruta metabólica es caralizada por una sola enzima y que puede ser bloqueada por mutaciones en un gen diferente. Esto condujo a la hipótesis de un gen:

11nn mzima. Ccldil paso mctabñlico t'S catalilado por una crwima c p~·dlka cuyJ pro<.Jutdón es responsabilidad de Ull <;o} o gen. Una m utadon en el gen altera la

aaividaci de la pwt{ íua de la 1..t1al e> rt'sponsable.

Par;') incluir .1 la<. protema~ formadas por más de tma subunídad. ce; nt'(esarin modificar la hipótesis Si las subunidadcs son toda~ rgualt><>. la prmeína es un homomuJtímero. y est~1 repre~emada por un solo gen. Si las o;ubunidaucc; '-CIIl difcrrl\lrs. la pruteína es un h e te romuiLimcro. Lxpresada como una regla mas genera! aplicable a cualquier prmem.l homnmultimérica. la hipótl:S~ de un ~-:en . urhl eroima !.t' manifiesta con mayor ptecisión como Wt _qe11 una mdeua polipeptídica Identificar qué protdoa rcprt·~ema a m1 ~wn t•n paniculnr puedt: sn t11rd.1clo ¡La mutación que dio lugar o los chícharos Jugosos murantes de Mendel no se idenri lkó sinnllttsra 1990, como una altera· ci6n que III.K tiva o1l gen quC' codlft.ra a una enzima ram iflcaclora del .11 rnid6n l Es irnporta titt' rcrotd.Jr qu<' 11r1 gen no prbduce dirccl
componentes estructurales del aparato responsable de la síntc!>i' dt· prutdnJ!>. ') hitu re~ular la expresión genetiLa Ll plincipto básico consiste en que el gen es una pend.iente. El proceso

Homoctgoto de tipo silvestre

Heteroctgoto de Homoc1goto tipo sllvestre/mutante mutante

Ambos aletos producen proteínas Activas

Un alelo (domln~nte) prodl1ce una protema activa

Ninguno de los aletos produce proteínas

~

t

tipo stlvestre t po sllvestre

t

hpo sttvestre

mutante

mutante

mutame

Fenoltpo Silvestre

Fenollpo mutante

1

~ Fenohpo S•tvestre

Los yene!> codifican prote1nas; la dominancia se explica por las propiedades de las protetnas mutan tes. Un alelo retesivo no contribuye al fenotipo debido a que no produce ninguna protema (o produce una protetna que no es funcional).

Jt' la ('Xprt'slón d~ lu~ gene~ puede rerminar en un

producto que sera RNA n prmema. Una mut;u iónt•, un l·vcmo alea tono respecto de la estructura dd gt!n en el cual es muy probable que se dañe. n rnduso qur \('suprima, la fun<..ión deJ gen. Casi Ludas las mutnciones que afectan el funcionamiento de un gen S\"lll recc<.tvas represmcan ausn-~t-za d~ Jimtum pu~~ a/.¡l'llllllttmllt' ~t le Ita unpedrda produar

su prottína ruual Ln la se ilustra la relaaón entre alelo-; de Lipo reC\'\Ivo ~ alrlch de tipo silvesne. Cuandu un hCtt'rodgoto contiene un alelo de tipo silvestre y un alelo dt' tipn mutante. esLe último e!. susccptihlc tlt' re~ir la prmtucdón de lil enzima. y por lo tanto. t.>~ dornin,mte (Csto implica que el único alelo de tipo silvec;tn: produ' e twa cantidad aderuada tk proteína. Cuundn t>'>ltl e-o, IJiso, la menor canúdad procl ucidu por 1111 ,1k lo. compilrada con la de dos
Las mutaciones que se presentan en el mismo gen no se pueden complementar Conceptos principales Una mutación en un gen afecta sólo a la proteina codificada por la copia mutante del gen y no a las proteínas cod1ficadas por algún otro alelo. la incapacidad de dos mutaciones para complementarse (producir un fenotipo silvestre cuando se presentan en configuración trnns en un heterocígoto) significa que forman parte del mismo gen.

¿Cómo determinamos si dos mutaciones qLie provocan un fenolipo c;imllar ~e· encuentran en el mismo gen? Si Clll' l tnap,1 e~t.1nmuy cerca, pueden ser alelos. Pero tnmbién podrí.;~n reprec;c n t<~l mutacione~ de do\ gcncc; tltji•n•ntl!,\ ruyas proteínas están implicadtls en la 1ilÍ'>IIIil función. La prueba d e complem.ent ación pcrmill' dt'tt•rmindr -,¡dos mutaciones yacen en l'l misnru ~en o cm genes diferemes. La prueba ronsiste ~n h..w:r un heterncigoto para las dos mutadnne~ (apdH'andu a progcnuores homodgóticos para tada mutación) Si las mutacione~ se encuentran en el mismo gen. los gr-noupo~ progcnrtore' pueden represen tarse como m. "': m~m 1 •

El pnm~r prugcnllor proporrrona un alelo mutantc m, y d 'lt"gundo un alelo m~. por lo Lamo. el hereroctgoto tendrá la consriluc1ón:

~

ml

2 J Las mutaciones que se presentan en el mfsmo gen no se

pu~den

complementar

25

No se observa ningún gen de tipo si.Jvesue, por lo

ramo, el J.1.eterocigoro tiene tm fenolipo mulame. Si la mutación yace en gPnes ditere11tes, los genotipos progenitores pueden representarse como: m 1+ +m 1 m,+ Y +m 2

Cada cromosoma tiene una copia ripo silvestre de un gen (rcpresemada por el signo más) y una copia mutame del otro, de modo que la conStitución del heterocigoro será: m ,+ +rn2

en la cual los dos progenitores han proporcionado una copia de tipo silvestre de cada gen . El heterocigoto tiene el fenotipo silvesne, de modo que se dice que los dos genes se complementan. La prueba de la complememación se describe más ampliamente en la . La básica coru,isre en la comparación que se mueStra en la parte superior de la figura. Si dos mutaciones se encuentran en el mismo gen, se observa una diferencia en los fenotipos de la configuración rrans y de la configuradóncis. La configuraci6n h·ans es mutame. pues cada alelo tiene una mutació11 (diJerente). Sin embargo. la configuración cis es de tipo silvestre. debido a C)Ue un alelo liene dos mutaciones y el ou·o, ninguna. En ID parte inferior de la figura se muestra que si las dos mutaciones se encuentran en genes diferentes,

MUTACIONES EN EL MISMO GEN

cohfiguraeién cts

configuracfón trans mutante 1 Sin comptementación Fenotlpo mutan te

~ .j

t ,¡ J ,¡

¡ ,¡,¡ ¡ ~

mutante 2

t

,¡,¡ ¡J .j Un gen es de ,¡ ,¡ d ,¡ tipo silvestre ~

Fenotipo sltvestre

tipo silvestre~-0

tipo silvestre

~

liposilvestre

(configuración trans)

Com:::::~" ~ ~ gen es de

Upo.ll'""'

WWVVVV n..

~

1

~-..,.

mutante 2

El dstrón se define mediante la prueba de c.omplementación. Los genes están representados por espirales; los asteriscos rojos identifican a los sitios de mutación.

26

Conceptos ptincipales Las mutaciones recesivas son provocadas por pérdida de función del producto proteínico. Las mutaciones dominantes son resultado de una ganancia de función. • la evaluación de la esencialidad de un gen requiere de una mutación nula (que elimine por completo su función). • Las mutaciones silenciosas no tienen ningún efecto porque el cambio de base no altera la secuencia ni la cantidad de proteína. o porque el cambio de la secuencia de la proteína no tiene ningún efeclo. • Las mutadone~ rezumantes (o hipomorfas) afectan a la función del producto del gen, pero no se observan en el fenotipo porque queda actividad sufi.ciente.

Los diversos efectos pos ibl es de las mutaciones

~ ~

V\/vV .} •l V V

Las mutaciones pueden provocar pérdida o ganancia de función

~ mutantedobte

MUTACIONES EN GENES DIFERENTES

(fenotipo silvestre) Una copia de cada

siempre se observará un fenotipo silvestre. Siempre hay un alelo de tipo silvestre y un alelo mutame de cada gen, y la configmación no tiene lmportanda. La incapaddad para complementar significa que dos mutaciones son pane de la misma unidad genética . Se dice que las mutadones que o o se complernenLan forman parle del mismo grupo de complen1entación. Otro término uLilizado para describir a la unidad definida por la prueba de complementación es cistró n. que significa lo mismo que gen. Rásicamen<e estos tres términos describen a un fragmento de DNA gue funciona como una unidad que dará lugar a un RNA o u u producto proteínico. Las propiedades del gen respecto de la complerncmación se e--xplican por el hecho de que este producto es una molécula única que se comporta como una unidad fundonal.

CAPÍTULO 2 los genes codifican proteínas

en un gen se resumen en la Cuando un gen ba sido idenrjficado. en principio se puede llegar a conocer su fundón produciendo un organismo mutante que ca relea complet.amente de.l gen. Una mutac.ión que elimina por completo la función de un gen, normalmente porque el gen ha sido eliminado, se llama mutación nula, y si el geo es esencial. la mutación nula es letal. Para determjnar el efecto rlel gen en el fenotipo. es iundamemal caracterizar a unmutanre nUlo. Cuando unn mutación no afecta al fenotipo. siempre cabe la posibilidad de que se trate de una mutación rez umante, es dedr, se produce una cantidad suficiente de producto activo para que cumpla con su [unción, aunque la acLividad se reduce cuantitativamente o es cualitativamente di[erente del tipo silvestre. Sin embargo, si una n~u ta dón nula no afecta al Jenolipo, se puede concluir con toda seguridad que la función del gen no es necesaria.

Sí e;(' produce llllcl mut.lciOn rert')tva por cada cambio que impide la prntluc.ción de una prmdna activa en w gen debe habet gtan nnm<:n.1 de dichas muradones en cualquit'r gen. Numerosos remplazos de aminoácidos pueden cambtélr la e ... rrucrura de la proteína lo )UftCll'llle como para impedir SU fundan. L1s dt[ererHt') \'élriames del nusmo gen se llaman aleto multi plc . ~ o;u l'Xt)tC!DCicl permite la creación ele un hcteroci~oto entre ale'os mutantes. r a relaciOn entre e!llO~ ,1ll'lo~ multiples asume diver-;a) turma~. En el caso rna!> c,tn\:Ulo. un gen de tipo silvestre corlifica a tm pmducto proteínico tundonal. El alelo mutante. o lo~ alclos muLante~. todifka(n) proteínas que no son luncionalt•s. Sin embarg<J. wn frt'C\.tencia ~e prcseruan casos en que un,1 serie de .:~IC'ln~ tttlltan1es tiene fenotipos d i fetenlf'~. Pnr ejemplo. la tunci6n dc 1ipo sUvestre del lucus /.J/rtllt't' de Id nro!i0/'111/(IIIIt'lanogaster es nt.:cesaria para t:1 dl'~oJrrollll del colnr 1 ojo normal de los ojos- El locus recibe ~ll tt ombn: )egún el electo de mu tadon es (n .tia~} extremas, la~ C"thlll') provocan que la rnosca tenga njoc, blanro:, en bomoClgotos mutantes. Pant describir a In\ a lelos murantes y a Jos de tipo silvest rr, l'l )(t:noripo stlvestr<' t' mdlca mediante un supenndke •m,ls· t+l despues del nombre del locus (v ... ec. el alelo sllvesrre para lo~ ojos lroiosj de la D_ me/awgaster) En algunos casos se utiliza el símbolo - pdra de)ctibit el elido de tipo silvesue, } sólo los alelos mutarllc~ '>t' mdican con el nombre dellocus. Una fom1a compktdmentl" defenuosa del gen (o ausenaa de knotipo) !lllele indicarse median re un supcnnd.ice 'meno~ · (-l . Para poder distinguir entre una vanedad tk illllos mmantcs con eleaos diferentes, pueden U[ihzarsl' otrm supcríndices. como tv' o w•. El alelo 11' es dominante re)peao de cualquiera otro en lo~ h<:ll'rudgotos. Hay muchos alelos mutanIC'!I dikr~me~; una nwcstr(1 (p~quei'í.a) se il u siTa en la . Si bien algunos alcalo:, carecen de color de ojos. mucho~ ot rm producen alg\1 n color. de modo que cada uno estos aklm rnttlclllles represelltará una mutacinu difenmtt.> del gen. la cual no elimina por completo su íunc1011. sino que deja una actividad residual qut• produce un fenotipo c:aracrerísLico. En un homocigotcJ. ~'w' Jlclos son denominados por el color de los ojos. (La mayo na de los alelas w aieaan la lanudad dt· pt~memo tkl OJO Lo' ejemplos de la figura esran organizado:, [mas o menos] en orden descendente ele ri'Ht'idad de color. pero orros, como el w •. afc.>uan el patrón rn el tual es depositado.) Cuando !'\i\ten muchos aletos, un animal puede ser un heteroagotn 4Ul' pone dos ale1os mutanres dileremcs. y r,u tenoupo depcndera de la naturaleza de la actividad rl'\tdual dt: cada alelo. En principio. la relactÓJt l'l11te dos .:tlelo~ mu lan tes no difiere de la que se observa l'ntrt' los aletos ntutantes y los de

El gen de tipo silvestre cod1ffca a una protefna

VJ\hVJ\1'1

~

li

Una mutación silenciosa no afecta a la prote1na

VJViVOW/

l

~

Una mutación nula no

produce protelnas

WAYJVJV/

.J...

Una mutación puntual puede dañar la !unción

'WJVAIN/

¡

•

Una mutación puntual puede crear una nueva función

VJ\YJ\0\U

~

Las mutaciones que no afectan a La secuencia o a la funcion de la protema son silenciosas. en tanto que las mutaciones que eliminan toda la actividad de la proteina son nulas. Las mulac1ones puntuales que provocan pérdida de la función son reces1vas, a diferencia de las que provocan ganancia de la función, que son dominantes. la'> mut.1cíones nulas, u otras mutaciones que impiden la funCión dd gt:n (pero que no nccesariarnt>me 1,1 elimman por c.:ontpleto) se denoffilnan mutacione d ~ pé rdida d e función (o amorfas). Uua mutación de pt:•nlidc:1 de tuncion es recesiva (corno eu el ejemplo de la Figura 2.2). En ocasiones, una mut.Kión 1ic.·ne t!l decro opuesto y provoca que unn ¡uorema a
ue

Un Locus puede tener numerosos alelos mutantes diferentes Concepto princ1pal La existenda de aletos múltiples permite que los heterodgotos representen cualquier combinadon en pares de aletos.

2

5 Un locus 11uecle tener numerosos aletos mutantes diferentes

27

Alelo

Fenotipo del homocigoto GaiNAccx1

ojos rojos (fenotipo silvestre) sangre cereza gamuza miel albaricoque eostna marfil cáscara de limón (amarillo limón) moteado, el color varfa blanco (sin color)

J, ................... antígeno A aaiP 1 _R 2 ..... Fuc~T ... transferasa A

...

gen A

Gal~ 1 -R

2

Delación 4 cambios de aminoácidos

.l- antígeno O

Fuco:1

. Ellocus w tiene una serie extensa de aletos cuyos fenot1pos van del color de tipo silvestre (rojo) a la ausencia total de pigmento.

gen B

~/ transferasa B

Gala1

: • • • • .. • • • • • • • • •

tipo silvestre: un alelo puede ser dominan le, puede haber dominancia parcial, o codominancia.

1!1

Un locus puede tener más de un alelo de tipo silvestre

Concepto principal • Un locus puede tener una distribución polimórfica de ale los sin un alelo individual que pueda ser considerado como el único de tipo silvestre.

No necesariamente hay un solo tipo ele alelo silvestre en un locus específico, por ejemplo, el control del sistema del grupo sanguíneo. La falra de función es representada por el tipo nulo, o grupo O. No obstante, Jos alelos fundonales A y B proporcionan actividades codominantes entre sí y dominames respecto del grupo O. las bases de esta relación se ilustran en la El anúgeno O (o H) se genera en todos los inclividuos, y consiste de un grupo carbohidrato particular que se agrega a la~ proteínas. El locus AJJO codifica a una enzima galacrosil-uansferasa que agrega otro grupo de azúcar al anúgeno O. La espccillcidad de esta enzima determina el grupo sanguú1eo. El alelo A da lugar a una enzima c¡ue utiliza el cofactor UDP-Nacetilgalactosa y crea el antígeno A. El alelo B produce una enzin1a que utiliza el cofacror UDP-galactosa y crea el antígeno B. Las versiones A y B de l a proteína transferasa difieren en cuatro aminoáctdos que presumiblemente afectan su reconocimiemo deJ tipo de cofacror. El alelo O riene una mutación (deleción pequeña} que elimina la actividad, de modo que en el antígeno O no hay modificaciones. Esto explica porqué los alelas A y B son dominantes en los heterocigotos AO y BO: la actividad

28

CAPÍTULO 2 Los genes codifican proteínas

t

VA:/JVJ\YI

~

antfgeno B

~

~aiP 1 -A i

Fuca1 Fenollpo

Genotípo

Actividad

o

00

A B

AOoAA BOo BB

AB

AB

Ninguna N-Ac-gal transferasa Gal transfe rasa GaiN-Ac-Gal-transferasa

Ellocus del grupo sanguíneo ABO codifica a la gatactosiltransferasa cuya especificidad determina el grupo sanguíneo.

transferasa correspondiente crea el antígeno A o el B. Los a le les A y B son codm,n inames en. los beterocigows AB debido a que ambas act..ividades transferasa e>stán expresadas. El homocigoro 00 es nulo y no tiene ninguna acrividad, por lo tanto, ca,rece de ambos alltígenos. Ni A ni B pueden ser considerados únicamente como ele tipo silvestre porque representan acüvidadcs altemativas, más que pérdida o ganancia de función. Una situación como ésta, en la que hay rnúlliples alelos funcionales en una pobladón, se describe como polimorfismo (véase la sección 4.3, tos genomas individuales muestran una variación extensa) .

111

La recombinación ocurre por intercambio ftsico de DNA

Conceptos principales • La recombinación es resultado del entrecruzamiento en los quiasmas e involucra a dos de las cuatro cromátidas. • la recombinación ocurre por rompimiento y reunión, que tienen lugar a través de un intermediario de DNA híbrido.

Moléculas de DNA progenrtor

~., bivalente ::ottene 4 cromátidas, 2 de cada progenitor

: qulasma <3:>

provocado por

~"'lrecruzamianto

entre clos

Recombrnacton tntermedia

:e las ctomáttdas Jos aomosomas Siguen saenc1o ~:JS progen¡IOfeS (AB yab) ...os cromosomas recomblnantes ~ ~~~~=:::g ':'Ontienen material de cada orogenttor y tienen nuevas : ::=~~~~= B comblnacrones genéticas (Ab y aS). b

la formación del qu iasrna :·educción

es

responsable de la

de recombinantes.

:a rccombir1.1non g<•nétka dcscrihe ia generadón Je combinaciones nlll..'vas de aJelos en cada gene:ación de organtsmos diplotdes Las dos copias de ..a d a cromosoma puedt·u lt'lll'r dilercmes alelos en 3lgunos loci. lnrercamblando las pane~ correspondit>ntc<; entre lo' crnrnoc;urnas, c;e pueden generar Jtlmo somas n:comhm.1ntt>' ult.a de un imercambi o fí)ico de material cromo~ómiw leno rncno visible en el entrecru zamie nto que ocurre duranre la meiosis •división e~pcdalizada por la que se producen las células gcmnina1cs hapluak':>}. La lltdosJs empieza con una célula que ha duplicado sus cromosomas, de ral formn que po:,ct• c.u..Hro wptas de cada uno. En las primeras etapas de lt11l1t.'io)i\, e~as cuatro cop1as están mdmame me rcladonadas (en !>inapsis) eu unaesuuclllra LlantrHin biva le nte . En c~ta etapa, cada unidad a·omosómica se denominA cromá tida . Los intercambios t>n pares dt- matetiJI ocutre11 e ntre cromátidas. El n.' 'ultado visible·(]{: un evento de emrecruzarnicnto se denomina quiasm a, y se ilustra amanera de djagrrunil rn la . Un quiasma es un <;itio en el que dos de las cromátidas de un bivaleme se han roto en lo-; puntos correspondientes. Los extremos roto~ :,e han rc·unido de fonna emrecruz.ada, generando ntte\ ac; noma ti das. Cada cromárida nueva esta formada por material provenleme de una cromátida de un ladn dt"l punto de un ion y por material proveniente d<:: la otra uomatida en el lado opuesto. las dos cromatidas recombmames poseen esrruauras redprotas. Fl eventO \t' ddine tomo rotura y re unió n . Su naturaleza explica porqué w1 solo evenro de rerombinac10n puede producir sólo el 50% d e recornbintHII<:s: cada evento dt' rerurnbmadón involucra sólo dos de lt~s cuarro cromátidas asociadas.

Recomblnanles

La recombinacion implica el apareamie1to entre las caderas COI"'plementarias de dos düplex de DNA progenitores.

La compkmt."ntant'tlad de las dos cadenas de DKA e<; csrnnal para el prc>Le\o de recombinadón .. Cada una de las cromandas que se muestran en la Fi~ura 2. 7 wmbtt- en un la rgul'>Ínto dúplex de DXA. Para que esta~ se rompan y reconenen sin pérdida de matenaJ, se requiert' de un mecanismo qur rcconul(,t cxattamcmc la<. posiciones correspondientes, lo cual sucede graCias al c1pareamiemo complemenrn rio de ba:,es. la rccornl..unadón nnplica un proreso en el cual las ca d ena~ Individua les de la región de entrecruzamiento Intercambian '¡Jarejas. En la se ITIUC!~ l ril qm· <.'!>Le cvt·nt u da lu gar a u11 fragmemo de DNA híb ri do. en el cual la cadena individual de un dúplex se ilparca con su complemenro provenit'nlC' rlrl otro dúpll'x Por !lupuesw. el mecanismo mvolucra atrae; etapils (la.-, Ladenas deben romperse y reselléllse) que se analizarán en detalle en el CapítUlo 20, Sim:mas dr reparación. pero la caracrerfsñca cruda! que hace postble ta recombmación exacta es la tompkml'ntarkd;u.l de las cad~nas úe DNA. La figura mue•nra 'ólo algunas etapas de la reacción, pero podemo!t obscn·ar que en la recombinadón intermedia !>t' forma un lr<~gm~nto de O 'A bibrido cuando una sola l.adcn.~ cru;::a de un dúplex a orro. Cada recombmame esta formado por un dúplex de DN;\ progt'flltor del lado iLqukrdo. el cual está conectado p01 un tragmento tle DNA híbrido al orro dupkx progt.•nitor del lado Llerecho. Cada dúplex de ? 1 l a rccomblnacfón ocurre por intercambio físico de DNA

29

DNA corresponde a una de las cron'J.átidns impUcadas en el proceso de recombinación de la Figura 2. 7. La formación del DNA 11n1rido exige que las secuencias de los dúplex recornbinames se encuenuen lo suficienle1neme cerca como para lograr el apareamiento entre la~ cadenas cumplernentalia~. Si no hay diferencias entre los dos genomas progenitores en cstñ r<"gión, la formación de DNA híbrido será perfecw. Sin embargo, la reaC'ción puede ser lolerada mm cuando haya diferencias diminutas, en cuyo caso, el DNA híbrido tiene puntos de apareamiento erróneo, en los cuales una base de una caclena confroma a una ba<;c cie la (ltra cadena e¡ u e no es complen1enta rir~ La com:cció11 de dichos enorf'S de apareamiento es otra caracterjstica <.leJa re combinación ge¡1ética (véa"e Carímlo 20, Sisremas de reparación).

El código genético se lee en tri pletes Conceptos principales • El código genético se lee en tripletes de nucleótidos de no min ados codones. • Los tripletes no están superpuestos y se leen a partir de un punto fijo de inído. • Las mutaciones que insertan o el.iminan bases individuales provocan un cambio en los grupos de tripletes despu~s del sitio de la mutación. Las combinaciones de mutaciones que insertan o eliminan a tres bases en conjunto (o en múltiplos de tres) insertan o eliminan aminoácidos, pero no cambian la leclura de los Lripletes más allá del último silio de mutación.

Cada gen representa una cadena proleioica específica. El concepto d~ que cada proteína está formada por una serie de aminoácidos en particular, dara de la caracterización de Sanger de la insulina, de In. década de 1950. El descubrimiento de que un gen esrá formado por DNA dio lugar a la intcnoganre de cómo una secuencia de nuclet'ítidl\s del DNA represenIn una secuencia de aminoácidos en las proteínas. Una caractensrica clave de la l'Siructura gener:aJ de! DNA es que e~ iwit>pmdieme de la secuencia particufat de los nuc/eótidos que la componen. La sctue~1da de nucleótidos del DNA es importame no por su esrruc-tura per se. si110 porque codifica a la secuenria de aminoácidos que constiLuye al polipéptido correspondiente. T.a relación entre una secuencia de DNI\. y la secuencia de la proteína coHcspoudieute se denomina código ge nético. La estruclura y la actividad enz:i.mátjca de lao;; proteínas se deben a su secHencia primaria de ami noácidos, que al ser determinada en cada una, el gen puede t.ramportar roda la información necesaria para especificar una cadena polipeprídica acti30

CAPÍTULO 2 Los genes codifican protelnas

V.'L Tk e~ta manna. un sólo tipo de eslmctura - eJ gen- es susceptible de re>presenrarse a sí mismo en innumerables formas de polipéptidos. En conjunto. los diversos productos proteínicos de una céh1la asumen las actividade!l cata líticas y esLructuraks respomablt!s de establecer su fenotipo. Obviam.ente, además de las secuencias que co difican a las proteína::., el DNA rambién contiene ciertas secuencias cuya función es ser reconocidas por moléculas reguladoras, usualruellle proteíuas. En este ca~o. la ·función del DNA es de[ernúnada tlirectamente por su secuencia, no a t ravés de Lm. código interm("diaJ·io. Ambos tipos de región, los genes expresados como proteú1as y las ~ecuendas reconocidas como tales, consrituycn Ja lnformación gené tica. DI código genético es descifrado pnr 1111 mecanismo complejo qul.' interptela las secuencias de los áddos nucleicos, el cual es esencial si la inlonnación transportada en el DNJ\ lienc que ten.eJ· algún significado. En Utla región dada, sólo una de las dos cadenas de DNA codifica a u na proteína, por lo tanto, el código gen él ic-o se represen ta como una secuen· da de bases (rnás que como pares de bases). El código genético ~e lee <.:n grupo!> de trt'S nudeóLidos. cada uno de los cuales represenra a un amtnoáddo; cada secuencia de [res nude6üdos se denomina codón . Un gen incluye w1a se1ie de co Jones que se lee de lorma secuencial cksde un punto de partida de UJl exlremo basta w1 pun10 final, en <.:'1 otro exrremo. Escrira en la dirección convendona15' a 3', la secuencia de nucleótidos de la cadena de DNA (.JLle codifica a l¡¡ proLeína corresponde a la seruenda de aminoácidos de la proteína esnita de terminal N hasta terminal C. El código geuéüco se lee en triple tes 110 superpuesros a partir de un punto fijo de inicia: • No su11erpuesros implica que cada codón está formado por tres nucleóLidos y que los codones sucesivos es¡ á n representados por trinucleótidos sucesivos. • El uso de un pu11ta fijo de i11iciaci6n significa que el ensamblaje de una proteína debe comenzar en un extremo y avanzar hacia d otro, ele 111anera que las cüferentes panes de la secuencia codificadora no puedan ser leídas de mam~ra independiente. la naruraleza del código pronostica que dos tipos de mutaciones tendJ"án efectos dll'erentes. Si una secuencia en 1-1ar1iru lar se lee de forma st•cut:ndal como: UUU AAA GGG CCC (et)cioncs) aa l aa2 aa3 aa4 (aminoácidos)

entonces una mmación puntual alectará sólo a un aminoácido. Por ejemplo, la sustirución de una A por cualquier o tra base (X) provoca que aa2 sea remplazad u por aa 5:

UUU AAX GGC. CC( aa 1 aa5 aa3 aa4 ~egundo codón ha sufrido cambios. Sin tmbm~qo, 111ltl t111JliiOÓil qm msura o elumn:-z una sola base camJJ/ara tllt'.~ grupos dt triple ces de roda la secumclt' subSitJUit'me Ln cambio de e!.te tipo !>e llama desplazam.icnto del marco de lectura. Una inc;erdón puccic ac;umir la stglllente forma: UUU AAX AGG CCC C

porque solo d

aa 1 aaS aa6 aa 7

Dt•hido a ']lll la rwe' a secuencia de rripletes es cumplt•t<JrHc:rale cltlerente a la antigua, la secuencia completa de clmino,1Cidos de la proteína se modifica a partir del sitio de la mutacion. de modo que es prnbabk IJIIl' IJ f1andón ck la prmcina ~e pi~rda por completo. Lo~ nauraeiurH.::. dt· rambio de l marco de lt:l'l urQ !illll inúuC'Itbs por IJll acddi nas, compuestos que se unen ni DNA y r¡ue d istorsionan la estructura de la doble h61i c:e. provocando la incorporación de base-. adirion,:~IC'c; n la omisión de ba:.es durante el proct~o d(! repllladútt . Cada eventO mu1agénico provocado por una acridina resulta en la adición o eliminación de un sulo par de ba.;es. Si e prodtll e un mut.antc de acridjn de dicha~

Tipo stlves1re 1 GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU GOU -

........._

./

Ala

Ara

Inserción

Ala

Ata Ala

Ala

Ala

Ala

A

.J GCU GCU AGC UOC UGC UGC UGC UGC'Lr Ala

Ala Sar Cys Cys Cys Cys Cys

De~dón G GCU GCU GCU GCU GCU CUG CUG CUG -

J

Al.a

Ata

Ala

Ala Ata

lau Leu Leu

Mutante dobla A

j

G GCU GCU AGC UGC UGC UCU GCU

mtnacíorws prnpoHiott.Jll t'Videncia~ reveladoras referentes a Id nalurJlezc~ del código genético. E:n 1,1 ~e iJustt an las propiedades de la~ mutaliont~ de tambio dd marco de lectura. Una inserción o una clcle\.totl camhad ltt !>t:cuencia compkta de la protema de!>"J)ttés del c;itio de la mutadón. pero la lOOlOina(i(ln de una imerdón \ tma deledón haa:- Qllt' el código 'e lea !> del st•gundo sino. En 1961 nwJranll' d ,m.ilr-.i'> gcnt>lico de las mutaoones por acriJina en la reg10n rl! del fago T6 se demu~rró qut' toda!> 1.1s mutclCIOoes podrían ser clasificadas en uno clt• dt~<; gtupo~ d\'-.Uitos como {+) u (-).Cada tipo de mutación provoca por r;í misma un célmbiu en el t11<1r con 1 b~nado n es dt· lnlHante<: dobles de los ripos (++)y (- - ) sigurnmostt'i.tt tdu ltt tl'tllnpunamienw ro u ~an­ te, pero las comhiiMclone~ de lo~ lipo!i (+ - ) o (- +) c;e ~uprimen una <1 lil otra. En t~le caso, la segunda mutación se dc~t rilll' wnw u p resora d el cambio en e l marco d e lectura de la primera mutación. (En l'l wntexto de t'!llt trnbJjo.la palabra Hsupresor" ~e uulil.a en un ..c:uttdc• iuu~ual porque la segunda muradón l'Sicl en el mtsmo gen que la primera.) E<.to., result.1do<; muesuan que d código genético debe o;er letdo como u n adiciones o las delecionc:s se wmpemJn mutu,,meme, mientras que las adtctones o la!) sitio~ u.: mutación hay una secuencia incorreCLa de aminoáddn~. rntl'lltt"
acurr-

Cada secuencia tiene tres marcos de lectura posibles

Aia Ata Ser Cys Cys Ser Ala Ala Mutante tnp1e A

1GCU OCA UGC Ala

A

A

UGC AUG CAU GCU GCU

Ala Cys Cys Met Hrs

Secuencta de ltpo srtvestre

Ata

Ala

Secuencta ml.llante

Las mutacíone~ de cambio del marco de lectura muestran que el código genético se lee en tripletes desde un punto fijo de inicio.

Concepto princip;¡\

En generaL sólo un marco M lectura ~ ttacucído. los otros dos son bloqueados por señales frecuent~ de terminación. 1 el ródi¡;o genetil:o ~e lee en uipleLes no ~uperpues­ ws, 'nn 1rc:s l.1~ fiJrm,h pn')iblc:s de traducir cualquier

l '

Cada secuencia tiene trP.s marcos de lectura posibles

31

secuencia de nucleóridos en prmeínas, dependiendo del pumo de iniciación; a dichas secuencias se les llama marcos de lectura. Para la secuencia

ACGACGACGACGACGACG los Lre<> marcos de lectura posibles son

ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG CGA CGA CGA CGA CGA CGA CGA GAC GAC GAC GAC GAC GAC GAC Un ntarco de lectw·a que consta exclusivamente de Lripleres que representan a aminoácidos. se llama marco de lecrura abierto u ORF (open readínyframe) . Una scctH•ncia que se traduce en una proteína tiene un marco de lectura que empieza con un codón de iniciación especial (AUG) y que posteriormente se extiende a través de una serie de triple tes que representan a amjnoácidos, hasta terminar en uno de los tre~ tipo<> dl" codones de terminación (véase el Capítulo 7, El RNA mensajero). Cuall(lo 11n marco de lectura no puede ser tra ducido en protdua porque con frecuencia se pres-ent.an codones de terminación, se dice que está bloqueado. Si Ltna secuencia está bloqueada en los tres marcos de lectura. no puede tener la función de codificar a Lma proteína. Cuando se obtiene la secuencia de w1a rcgi6n de DNA de función desconodda, se analiza cada marco de lectu ca posible para determinar si eslá abierto o bloqtJeado. Normalmente, no más de uno de \os rreo; marcos de lectura posibles está abierto en un solo fragmt.:n Lo de DNA. En la st" mucslfa el ejemplo de tma secuencia que puede leerse e11 soto un marco de lectura debido a que los marcos de lecttua a lternativos están bloqueados por codones de terminación frecuentes. Es poco Irt obable que por casuali dad ex is1a un marco de lectu ra largo y abierto; si no se tradujera en ttna proteína, no habría presión selectiva para evitar la acumulación de codones de terminación, de modo que la identificación de un marco de lectura largo y abierto se considera como evidencia en primera inSiancia de que la secuenda se traduce en proteína en dicho marco. Un ORF para e l cual no se ha identificado un productO pmteínico suele denominarse marco de leCLura no iclemilicado ( URf, unidc111ijied reading [mm e).

Un marco de lectura abierto empieza con AUG y continúa en triplete.s hasta un codón de terminación. Los marcos de lectura bloqueados pueden ser interrum pidos con frecuencia por codones de terminación.

32

CAPÍTULO 2 Los genes codifican oroteínas

Los genes procarióticos son coli neales con sus proteínas Conceptos principales • Un gen procariótico es un fragmento constante ele 3N nudeótidos que codifica a N aminoacidos.

• El gen, el RNAm y la proteína son todos colineales.

Comparando la secuencia de nucleótidos de un gen con la secue:::n.cia de aminoácidos de una proteína, podernos determinar directamente si el gen y la proteína son coUnea les; esto es. si la secuencta de nucleótidos del gen cotTesponde exactamente a la secuencia de aminoácidos de la proteína. En las boct.erias y sus virus hay una equ ivalencia exacta. cada gen contien~:: un fr¿¡grnento continuo d l: DNA ruya longitud es directamente proporcional al número de ami n oácidos de la proreína que representa. Es necesario un gen de 3N pares de bases (l>p, base pairs) para codificar una proteína tle N amirwáddos, de .Kuerdo con el código gt>nético. Laequivabtda del gen bacreriano y su producto signific:a que un mapa .físico de DNA corresponderá exactamente a un rnapa de aminoácidos de la proteÍila. ¿Qué t.an bien se acoplan esto'> mapas con el mapa de recombinadón? El paralelis.mo del gen y la proteína se investigó originalmente en el gen de la tdpLórano simetasa cie E. t:oli. La distancia genética se valoró a través del porcentaje de recombinación entre muLaciones, en ramo que la distancia de la proteína se midió por meilio del número de aminoácidos que separaban a los sitios de rempla7o. En la se comparan ambos mapas. El orden de siete sitjos de mutación es e l mismo que e l ordell de los sitios correspondientes a los remplazos de aminoácidos, y las distancias de recombinación son relativamente similares a las distancias reales de la prmeína. El mapa de recombinación amplía las distancias entre rtlgunas mutadones, pero por lo demás, la d istorsión del mapa ue recombinadón es escasa. respectO del ma¡Ja físico. El mapa de recombinadón hace ver dos punws generales acerca de la organización del gen. M titadones diferentes pueden provocar que un aminoáddo de t.ipo silvestre sea rempla?.ado por sust1tutos di[erentes. Si dos de eo;tas mutacione!> no pueden recombinar~e. deben involucrar mutaciones pun tuales diferentes en la mÍSillil posicíón del DNA. Si las mULaciones pueden separarse en el mapa gt>nédco. pero afectan al mismo aminoácido en el mapa superior (las lineas comunkantes convergen en la figura), deben implicar a mutaciones punruales e n posiciones diferentes que afectan al mismo aminoácido debido a que la unidad de re::combi:nadón ge-

a~

El DNA esté formado por dos cadenas apareadas por medio de bases cadena supenor 5' ATGCCGTTAGACCGTTAGCGGACCTGAC 3' TACGGCAATCTGGCAATCGCCTGGACTG cadena tnfenor Síntesis de ANA

Protelna de tipo silvestre

l

S'AUGCCGUUAGACCGUUAGCGGACCUGAC3 El ANA llene la m1sma secuenQa que la cadena superior de DNA, es comptamentana a la cadena infenor de DNA

- D.stancla entre mutactones -, ~

Mapa de recombln

Proteína mutante

1

Mutaciones diferentes en la misma posición

El RNA se sinteti1a uti!izanco una cadena de DNA como molde para el apareamiento complementario oe las bases.

Ct•

Oho

Cts

meme, para sintetizar proteína (como se observa

1

en detalle en el C.1pítu lo 7, l:liRNA mensajero). Rl RNt\ rtll:majcro se \inlcl ii'J por el mismo r !Oceso de apareamJeruo cornplc m emario de bases utilindo pJra replicar el DNA. con la importante difercnn.1 ele· (jliC corn·sporttk ...oto a una cadena del

Las mutaciones pueden estar separadas, pero afectan a la misma posictón

El mapa de recombmacion del gen de la triptófano sintetasa corresponde a la secuencia de aminoacidos de la proteina.

n~t ira (('n realidad 1 hpl e., m.h pequeña que la unidad que codifica al aminoácido (en realidad 3 bpL

Numerosos procesos son necesarios para expresar el producto proteínico de un gen Conceptos principales Un gen rrocariótico se expresa por transcripción en RNAm y rosteriormente por traducción del RNAm en una proteína. • En las eucariotas. un gen puede contener regiones internas no representadas en la proteína. • las regiones internas son eliminadas del transcrito de RNA por el corte y empalme de éste para dar origen a un RNAm colineal respecto del producto proteínico. Cada RNAm está formado por una regt6n líder 5' no traducida. una región C{)dificadora y una región posterior 3' no traducida. Al comparar un gen y una proLdna se trata sólo con la secuencia de UNA ubic.1da cnrre lo~ puntos corrc<;pnndientco; a In'> \'XIremnc; de la prOLeína. Sin embargo. un gen no se rraduce directamente a una protcllla se expresa rlll'tliaml· 1,1 produccton de un RNA m e n sajero (RN Am, messwgt1 RNA), que es un addo nucleico intermedio tHilizado, efectiva 2.11

DNA de dohle hélice. En la se muestra que la ~ecut'ndcl del R.~Am e., complt:mentaria de la ~ewt'nl ia dl' UJ\él eadt na dl' n NA \ que es idéntica (excepto por el rempla.w de T por L) a la orra cadena de DNA. La forma convencionaJ de escribir las c;eC\.lenciac; del DN A Implica que la cadena de auiba vaya en dirección 5 _... 3', con la secuenda igual a(,, d1:l R'iA El proceso por el cual un gen da lugar a una protema se llama expresión genica. que en las haueria" rnmta dé do~ l'tapa'>. r a primera etapa es la transcripción. durante la cual ~e produce un.:~ wpia dt. R '\Am de u n<J cadena del D ' A. en tanto qul' la wgunda t.:l> la Lradm.dón del RNAm en u11a proteína. Mediante este proceso se lee en

1riplt:1 L'~ la '>Cl utncia de un R Am para originar la seri e de aminoácidos q t1t' en·<:~ al<~ pro teína corresrundience. Un RNt\111 Í i lcluyt· a und secuencia de nudeótidos que coLrespond~ a la 'lccucncia de aminoácidos dt- lil proreína; esta parte del .1cido nucleico se wnou· crmw reg ió n codificadora. Sin l"mbargo, el R'JAm indu) e -;ecuenuds aclil1onJicc; en ambo!l extremos las cuales no represema11 directamente tl llllcl ¡mHc111a. la rl·gtun '5 110 traducida ~e Uama líd e r . en tallln que a la regió11 3' rwtrdducida -;e lcconOlt' como ren 1.o lque. El yen indtrye la ~nu~ncta completa revresenLada en el R 'A mensdJero. Ocasiunalmeme. las mutacione~ que imptden la htnaon del gen se encucntr<~n en lac; reg_IOtlt'S ,Hhron;tlrs no codilicado ras, con lo cual se confirma la pero;pectiva de que didw~ reginnt'S coml)rentlen una parte leguima de la unidad gl•nclka.

Numerosos procesos son necesarios para expresar el prot.luc.lo ptole1nico de un gen

33

Reglón lfder

Remolque V 3 ' RNA

5' \J

L-------~--------~

La longitud del ANA define a la región del gen

l

N ~ C Proteína La proteina define a la región codificadora

El gen puede ser más largo que la secuencia que codifica a la proteína.

NÚCLEO

5'

S ~ INTRÓN

¡ .,

pre-RNAm

l iNTR~N " ~

5'~-

3'

(rc-o-rt_e_y_e_m_p_alm-e)

~ ""3'

Transcripción

5'

3' Ribosoma

DNA

( ( Traducción )

ANA

CITOPLASMA

Traducción

~

N6 Prote fna

L

El ribosoma lraduce al RNAm

En las bacterias, la t.ra nscripción y la traducción ocurren en el mismo compartimiento .

En la

se ilustra esta situación, err la

cual se considera que el ge o comprende un fragrnenl o cond.n uo de DNA n ecesario para procl u eir una proteína en particular; incluye la secuencia codificadora para dicha proteína, pero ¡ambién secuenCias a ambos lados de la regió n codificadora. Una bacteria está formada por un solo comparúmiento, de lTlodo que la transcripción y la traducción ocurren en el mismo lugar. como se ilustra en la . En las eucariotas, la transcripción tien<' lugar e n el núcleo, no obstante, el producto de RNA debe ser transp011ado al citoplasma para ser traducido. En los genes más simples de las eucariotás (igual que en las bacterias) , el RNA u-anscrito es de hecho el RNAm. Sin embargo, pa ra los genes más complejos, el cran scriro inme diato del ge n es el pre-RNAm , que requiere de cierto procesamiento para generar al RNAm m aduro. Las etapas básica ~ de la expresión gé nka de una e ucariota se bosquejan en la Este proceso resulla e n 34

CAPÍTULO 2 Los genes codifican proteínas

La expresión de un gen es un proceso que sucede en múltiples etapas. una separación espacial entre la lra nscri pción {en el núcleo) y la tTaducción {en el citoplasma). La etapa más importante deJ procesamiento es el corte y em palme del RNA . N u_merosos genes de las eucariotas (y casi todos los de las eucariotas superiores) contienen regiones .internas que no codifican proteínas. En el proceso de cone y empalme se eliminan estas regiones del pre-RNA.m para generar un RNA con un marco de lectu ra abierto y conúnuo (véase la Figura 3.1 ). Otros eventos procesadores que ocurren en esta etapa implican la modificación de los extremos 5' y 3' del pre-RNAm (véase la Figura 7.16). La u·aducción tiene lugar mediante un complejo mecanismo que incluye tamo proreínas como componentes de RNA. La ·'máquina" que se encarga dd proceso es el ribosoma, un gran complejo que incluye algunas m oléculas exrensas de RNA (RNA ri.bosómico, oRNAr) y numerosas proL cínas pequeñas. El proceso por el cual se reconoce qué aminoáddo corresponde a un triplete de nucleótidos en panicular implica un RNA de transferencia imerrnedio {o RNAl); hay cuando menos una especie de RNAt para cada aminoáddo. Numerosas proteínas accesorias están implicadas. La traducción se describe en cl Capítulo 7, El RNA

mensajero, pero comidérese por ahora que los ribosomas son las grandes estructuras que se mueven a lo largo delRNAm en la Figura 2.14. El puma importante de esta etapa es que el proceso deJa expresión gén.ica implica al RNA no sólo como sustrato esendal. ram.bién como proveedor de componemes para el mecanismo . Los componentes RNAr y RNAl son codificados por genes y generados por el proceso de rranscripción (como e l RNAm, excepto que no hay una etapa de traducdón subsiguiente).

EIB

Las proteínas actúan en trans, pero los sitios del DNA, en ds

Conceptos principales

• Todos los productos de los genes (RNA o proteínas) actúan en trans; pueden actuar en cualquier copia de un gen de la célula. • Las mutaciones de actuación en cis identifican a las secuencias de DNA que son el objetivo de reconocimiento de los productos de actuación en trans. No se expresan como RNA ni como proteínas, y afectan sólo al fragmento contiguo de DNA. Una etapa clave para la definición del gen [ue el descubrimiento de que todas sus partes deben estar presentes en un fragmemo contiguo de DNA. En la renninolog1a genética, se dice que la configuradón de Jos sitios localizados en el mismo DNA esrá en cis, mientras que de la configuradón de los localizados en dos moléculas diferentes de DNA se dice q~1e está en trans, de modo que dos mutaciones pueden presemarse en cis (en el mismo DNA) o en trans (en moléculas diferentes de DNA} . la prueba de complementación recurre a esre concepto para determinar si dos mutaciones están en el mismo gen (véase la Figura 2.3 de la Sección 2.3. Las mutaciones que se pl·esenran en el mismo gen no se pueden comple mentar), y ahora ·podemos ampliar el conceptO de la diferenda entre los efectos cis y lmns de la dellnición de la región codificadora de un gen a la descripción de la Lnt eracción entre Jos elemento~ reguladores y un gen. Supongamos que la capacidad de un gen para ser expresado depende de una proteína que se une al DNA cerca de la región codificadora . En el ejemplo representado en la , el RNAm puede ser sintetizado sólo cuando la proteína está unida al DNA, pero supóngase que en la secuencia del DNA en la cual se une esta proteínn ocuue 1ma mutación y la proteína ya no reconoce al DNA: el DNA ya no podría expresane.

Por lo tanto, un gen puede ser desadivado tanto por una mutación en un sitio de control, como por una mutación en una región codificadora. las mutaciones no pueden

Q \ '

"\.

La protefna se une al sitio de control

Si~t(ol

l

Reglón cadtfíoadora {fiNA

~

Dos tipos de secuencias de DNA

Et ANA se sintetiza

RNA

los sitos de control del DNA proporcionan sitios de unión para proteínas; las regiones codificadoras se expresan a través de la síntesis de RNA.

Ambos aleles sintetizan ANA en el Upo silvestre

La mutación en el silfo de control afecta sólo al DNA contiguo Mutación

~----.,. .,. --·"'~.........,.. __,.,..,._.,...., NO HAY S[NTESIS DE ANA MEDIADA POR EL ALELO 1

1

La síntesis de ANA continua a partir det aleto 2 ~

Un sitio de actuación en cis controla al DNA adyacente, pero no influye en el otro alelo. distinguirse genéticamente púrque ambos tienen la propiedad de actuar sólo en l<1 secuencia del DNA del a lelo individual en el cual ocurren, sus propiedades son idénricas en la prueba de complememación, de modo que una mutación en una región de comrol se define como parte integrante del gen, de la misma forma que una mutación en la región codificadora. l..a muestra que una deficiencia en el sitio de control afecta srílo a la región codificadora a

la cual escá conectada; no afecca la capacidad del otro alelo 2.12 Las proteínas actúan en trans, pero los sitios del DNA, en ás

35

l

t

úU

!

La protelna mulante no puede unirse a ninguno de Jos aleles

NO HAY SfNTESIS DE ANA A PARTIR DEL ALELO 1

éS:J--

Proteína mutante

NO HAY SfNTESIS DE ANA A PARTIR DEL ALELO 2

¡;-r,

"

Una mutación de actuación en trans de una proteína afecta a los dos aletos del gen que controla.

para expresarse. Una mutación que actúa exclusivamente afectando las propiedades de la secuencia contigua del DNA se denornLna de actuación en cis. El comportamiento de la mutación de actuación en ci.~ que se muesrra en la Figura 2.17 se puede comparar con el resulrado de una mutación en el gen que codifica a la proreína reguladora. En la se muestra que la ausencia ele proteína reguladora eviLará que ambos aletos se expresen; se dice que una mutación de esre tipo es de actUadón en trans. Revirüendo el argumento, se sabe que si una mutación es de actuación eo lrans, su efecto deberá ser ejercido a través de algún producto di fusible (típicnmente tma proteína) que actúe en múltiples dianas en una célula. Sín embargo. si unamutadón es de acLUación en cis, su fw1ción a(ectará cUrectarneme a las propiedades del DNA contiguo, lo cua l sign ifica que no se expresa en la forma de l
proteína.

Resumen Un cromosoma es un fragrneut'o ininterrumpido de DNA dúplex que contiene numerosos genes. Cada

36

CAPÍTU LO 2 los genes codifican proteínas

gen (o cistrón) se transcribe en un producto de RNA, el cual a su vez es traduddo en una secuencia polipeptídica si el gen codifica a una proteína. Se dice que un RNA o un producto pro1rínico de un gen son de actuación en trans. Un gen se define mediame la prueba de complementación como una unidad de un fragmento individual de DNA. Se dice que un sitio del DNA que regu la la actividad de un gen adyacente es de acruadón en cis. Cuando un gen codiúca a una proteína, la reladón entre la secuencia de DNA y la secuencio de Ja pro1eína depende del código genético. Sólo una de las dos cadenas de DNA codifica a una proteína. Un codón está formado por tres nudeótidos que represenran un solo aminoácido. Una secuencia codificadora de DNA consiste en una serie de codones. los cuales son leídos desde un punto ojo de inicio. En general, sólo uno de los tres marcos de lectura posibles puede ser traducido en proteínas. Un gen puede tener málúples alelos; los recesivos son provocados por mutaciones de pérctida de [unción que interfieren con la fundón de la proteína. Un alelo nulo tiene pérdida total de la función. Los alelos dominantes son provocados por mutaciones de ganancia de función que crean una nueva propiedad en la prorema.

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strucrure. Proc. Nall. Amd. Sci. USA,

El gen interrumpido ESQUEMA DEL CAPÍTULO

ll1fa

Afg unas secuencias de DNA codi fican a más
Introducción Un gen interrumpido está formado por intrones y exones • los intrones se eliminan mediante el proceso de corte y empalme de RNA, el cual ocurre sólo en configuración ds en una molécula individual de RNA. • Sólo las mutaciones que ocurren en los e:xones pueden influir en la secuencia de las proteínas; sin embargo, las mutaciones de los íntrones pueden afectar el procesamiento del RNA y, por lo tanto, evitar la producción de protelnas

.U Las endonucleasas de restricción son una herramienta esencial en el mapeo del DNA • las endonucleasas de restricción pueden utilizarse para dividir al DNA en fragmentos definidos. • Un mapa se genera utilizando las superposiciones de los fragmentos generados por diferentes enzimas de restricción.

liD La organización de los genes interrumpidos puede conservarse • Los intrones suelen detectarse por la presencia oe regiones adicionales al comparar los genes con sus productos de RNA mediante mapeo de restricción o por microscopia electrónica, sin embargo, la definición definitiva se basa en la comparación de secuencias. • Los intrones normalmente conseiVan su posición respecto de genes homólogos cuando se comparan organismos diferentes. las longitudes de los intrones correspondientes pueden variar mucho. Normalmente los intrones no codifican proteínas.

Las secuencias de los exones se mantienen, no así las de los intrones • la comparación entre genes re lacionados de diferentes especies muestra que las secuencias de los exones correspondientes usualmente se conse!Van, pero la relación entre secuencias de intrones no es tan buena. • los intrones evolucionan mucho más rápidamente que los exones debido a la falta de presión selectiva para producir una proteína con una secuencia útil.

La distribución de tamaños de los genes es amplia • La mayoña de los genes de las levaduras son continuos, no así los de las eucariotas superiores. • los exones suelen ser cortos y codificar menos de 100 aminoácidos. • Los intrones son cortos en las eucariotas inferiores, pero en las superiores pueden llegar a tener varias decenas de kb (kílobases) de longitud. • la longitud total de un gen se determina principalmente por sus intrones.

.a

• El uso de codones alternativos de iniciación o de terminación permite que se produzcan dos proteínas cuando una es equivalente a un fragmento de la otra. • Se pueden producir secuencias no homólogas de proteínas a partir de la misma secuencia de DNA cuando ésta es leída en marcos de lectura diferentes por dos genes (superpuestos). • Las protel nas homólogas que difieren por la presencia o ausencia de ciertas regiones se deben a un corte y empalme diferencial (alternativo) en el cual se incluyen o excluyen ciertos exones, ya sea por la inclusión o exclusión de exones especfficos o al optar por exones alternativos.

¿Cómo evolucionaron los genes interrumpidos? • la interrogante principal al respecto es si los genes se originaron como secuencias interrumpidas por intrones o si originalmente eran moléculas ininterrumpidas. • Probablemente la forma original de la mayoría de los genes codificadores de proteínas fue la interrumpida, si bien en un principio los genes interrumpidos que codifican al RNA pudieron haber sido moléculas ininterrumpidas. • Una clase especial de íntrones es móvil y puede insertarse en los genes.

Algunos exones pueden equipararse con funciones proteínicas • Lo que sugiere que los exones fueron las unidades básicas de la evolución y que los primeros ge nes fu eron interrumpidos en lo siguiente: • la estructura génica es igual entre genes de especies muy distantes. • Muchos e:xones pueden ser equiparados con secuencias codificadoras de proteínas que tienen Funcionés específicas. • En genes diferentes se encuentran exones relacionados.

Los miembros de una familia de genes tienen una organización común • Se supone que una característica común de una ag rupación de genes identifica una propiedad que antecede a la separación durante la evolución. la forma común de organización de todos los genes de globina, tres exones y dos intrones, sugiere que descienden de un solo gen ancestral.

¿Se encuentra toda la información genética contenida en el DNA? la definición del gen se ha invertido, de "un gen : una protelna" a "una prote!na : un gen". • La información sobre la posición también es importante en el desarrollo.

Resumen 37

ID

Introducción

La forma más sencilla de un gen es un fragmento de DNA colineal con su producto proteínico. Los genes bacterianos casi siempre son de este tipo, una secuencia codificadora continua de 3N pares debases representa una proteína de N aminoáddos. Sin embargo, en las eucaüotas, un gen puede incluir secuencias adicionales en la región codificadora, las cuales interrumpen a la secuencia que representa a la proteína. Esras secuencias se eliminan del producto de RNA durante la expresión del gen, con lo cual se genera un RNAm que incluye una secuencia de nudeótidos que corresponde exacLameme al producto proteínico, de acuerdo con las reglas del

código genético. Las secuencias de DNA que forman un gen interrumpido se dividen en las dos categorías desCJitas en la • Los ex ones son las secuencias representadas en el RNA maduro. Por definición, un gen comienza y termina con exones que corresponden a los extremos 5' y 3' del RNA. • Los intrones son secuencias interpuestas que se eliminan cuando el transcrito primario es procesado para dar lugar al RNA maduro. Las secuencias de exones siguen el mismo orden en el gen y el RNA, sin embargo, un gen interrumpido es más largo qu e su producto final de RNA debido a la presencia de los intrones.

La expresión de los genes interrumpidos requtere de un paso adicional que no es necesario en los continuos. El DNA de un gen interrumpido OJigina una copia de RNA (un t a'anscrito) que representa exactamente a la secuencia del genoma. Sin embargo, este RNA sólo es un precursor, no puede1.1tilizarse para producir proteínas; deben eliminarse primero los intrones del RNA para dar lugar a un RNA mensajero formado solameme por una serie de exones. Este proceso se conoce como cone y empalme (véase la sección 2.11, Para expresar el producto proteÚlico de un gen son necesarios numerosos procesos) e implica precisamente la deleción de un innón del lranscrito primario y el empalme de los extremos del RNA en ambos lados para formar una molécula con enlaces covalentes intactos (véase Capítulo 26, Corte, empalme y procesamiento del RNA). El gen comprende la región del genoma locali zada entre los pumos con:espondiemes a las bases terminales 5' y 3' del RNAm maduro. Se sabe que la transcripción se inicia en el extremo 5' del RNAm y que suele ir más allá del extJ·emo 3', formado por división del RNA (véase la sección 26.19, Los extremos 3' de los RNAm son formados por división y poliadenilación) . Se considera que el gen incluye las regiones reguladoras de ambos lados, las cuales son necesarias para iniciar y (en ocasiones) terminar la expresión génica.

1!1

Un gen interrumpido está formado por intrones y exones

C.onceptos principales EXÓN 3

DNA

~ Síntesis de ANA

pre-RNAm

~

IINTRÓN

4 /'\

Por corte y empalme se eliminan los in!rones

• los intrones son eliminados por el proceso de corte y empalme del RNA, el cual ocurre sólo en configuración ds en una molécula individual de RNA. • Sólo las mutaciones ocurridas en los exones pueden afectar La secuencia de las proteínas, pero las que se presentan en los intrones suelen incidir en el procesamiento del RNA y, por lo tanto, evitar la producción de proteínas.

RNAm

Proteína

-

~ Síntesis protelnica

La longitud del ANA precursor (no RNAm) detine la región del gen En el gen están separadas las regiones codificadoras individuales Los genes interrumpidos se expresan a través de un precursor del RNA. Los intrones se eliminan cuando se cortan y empalman los exones. El RNAm tiene sólo las secuencias de los exones.

38

CAPÍTULO 3 El gen interrumpido

¿Cómo cambia la existencia de los inlrones nuestra visión del gen? Después del corte y empalme, los exones siempre se unen en el orden que ocupan en el DNA, de modo de conservar la colinealidad del gen y la proteína entre cada exón y las partes correspondientes de la cadena proteínica_En la se muestra que, en el gen, el orden de las mutaciones sigue siendo el mismo que el de Jos remplazos de aminoácidos en la proteína. Sin embargo, las distancias en el gen no corresponden en abso luto a las distancias en la proteú1a. Como se observa en un mapa de recombinación, las distancias genéticas no

DNA genómico

Exón 1

lntrón 1

lntrón 2

Exón 3

e

A-B RNAm Exón 1

A-B

B-C

Exón 2

Exón 3

B-C

En el RNAm los exones permanecen en el mísmo orden que en el DNA. pero las distancias a lo largo del gen no corresponden a las distancias a lo largo del RNAm o de los productos proteínicos. La distancia de A a B en el gen es más corta que de 8 a C; sin embargo, la distancia de Aa B en el RNAm (y en la proteína) es mayor que de B a C.

tienen relación con las observadas enu·e los puntos co rrespond ientes de la proteína. La longitud del gen depende de la longitud del RNA irúcial (precursor) y no de la lon gitud del RNA mensajero (RNAm) . Todos los exones están representados en la rrusma molécu la de RNA. y su empalme ocurre sólo como reacción intramolccular. Usualmente los exones provenientes de moléculas diferentes de RNA no se unen, por lo tanto, el mecanismo excluye cual· quier empalme de secuencias que representen alelos diferentes. Las mutaciones localizadas en exones di[erentes de un gen no pueden complementarse, así, siguen siendo definidas como miembros del mismo grupo de complememación. Las mutaciones que afectan directamente a la secuencia de una proteína deben localizarse en los exones. ¿Cuáles son los efectos de las mutaciones en Jos intrones? Estos úlrimos no forman pane del RNA mensajero, por lo tanto, las mutaciones ocurridas en ellos no pueden afectar directamente a la estm ctura de la proteína, pero sí evitar la p roducción del RNA mensajero, por ejemplo, inhibiendo el con e y empalme de los exones. Una mutación de este tipo actúa sólo en el alelo que la porta, de modo qu e n o es suscepUblc de complementar cualquiera otra mutación en ese alelo y forma parte del mismo grupo de complcmentación que Jos exones. Las mutaciones que afectan al corte y empalme en general son nocivas; la mayoría sustituye a una sola base en la unión emre inrrone~ y exones, y pueden hacer que un exón sea eliminado del producto. que se induya a un imrón o que los eones y empalmes sucedan en sitios aherrames. El resultado más común es la inrroducción de un codón de terminación, el cual resulta en el truncamiento de la secuencia proteínica. Aproximadamente cll5% de lasroutadones puntuales que provocan enfermedades humanas son ocasionadas por interrupción del corte y empalme. Los genes de las eucariotas no necesariamente están interrumpidos, algunos corresponden de

manera directa al producto proteínico, igual qu e Jos gen es procarióticos. En las levadu ras. la mayoría de los genes son continuos, en tan to que en las eucaüotas superiores casi todos son interrumpidos, y los intrones suelen ser mucho más largos que los exones, lo cual da lugar a genes notablemente más largos que sus regiones cod.i.ficadoras.

Las endonucleasas de restricción son una herramienta esencial para el mapeo del DNA Conleptos principales • Las endonucleasas de restricción pueden utilizarse para dividir al DNA en fragmentos definidos. • Un mapa puede ser generado utilizando las superposiciones entre los fragmentos generados por diferentes enzimas de restricción.

La caracterización de los genes eucariólicos fue posibl e gradas al desarrollo de técnicas para mapear físicamente el DNA, técnicas que p ueden ap lica rse al RNA (de una sola cadena) badendo una copia de DNA (de doble cadena) del RNA. Se puede obtener un mapa físico de cualquier molécula de DNA rompiéndola en puntos definidos cuya distanda puede ser determinada con precisión. la capacidad de las endonucleasas de restricción de reconocer como objetivos de conc a secuencias cortas de DNA de doble cadena permite corte!> e pccíficos. Cada enzima de restricción tiene una diana específica en el dL!plex de DNA, usualmente una secuenda específica de cuatro o seis pares de bases. La enzima corta el DNA en cada punto en que se presenta su secuencia diana. Las diferentes enzimas de restricción tienen secuencias diana diferentes, y actualmente se dispone de un amplio rango de estas actividades (obtenidas de una amplia variedad de bacterias).

l.3 Las endonucleasas de restricción son una herramienta esencial para el mapeo del DNA

39

---A B Dividir con endonucleasa de restricción

1

Hacer etectroforesis y comparar con el DNA control

1 2100

2500 2000

1400 1000 500

Tamaños de tos El control oonsisle fragmentos comparados en fragmentos de con el control tamaño conocido Los fragmentos generados al dividir al ONA con una endonucleasa de restricción pueden ser separados en función del tamaño.

1 000 200

A 1900

600

8

A

800 500

Un mapa de restricción es una secuencia lineal de sitios separados por distancias definidas en el DNA. En el mapa se identifican los sitios divididos por las enzimas Ay B, según se definen los fragmentos individuales producidos por las digestiones dobles e individuales.

ginal tal como se muestra en la . En el mapa aparecen las posiciones en que las enzimas de restricción específicas cortan el DNA; las distancias entre los sitios de cone se miden en pares de bases, de modo que el DNA se divide en una serie de regiones de longitudes definidas que yacen entre sitios reconocidos por las enzimas de restricción. Una característica importante es que se puede obtener un mapa de restricción de cualquier secuencia de DNA, a pesar de que se hayal'/ idmtiftcado mutaciones en ella, o de hecho, que se conozca, o no, algo de su función.

La organización de los genes i nterrumpidos puede conservarse Conceptos principales

Un mapa de r estricció n representa una secuencia lineal de los sitios en los cuales enzimas de restricción especificas encuentran a sus secuencias diana. En dichos mapas, las distancias corras se miden directamente en pares d e bases (bp, base pairs), en tanto que las más largas se expresan en l
CAPÍTULO 3 El gen interrumpido

• Los intrones pueden ser detectados por la presencia de regiones adicionales cuando los genes son comparados con sus productos de RNA por mapeo de restricción o por microscopia electrónica, sin embargo, la última definición se basa en la comparación de secuencias. • Los intrones normalmente conservan su posición respecto de genes homólogos cuando se comparan organismos diferentes. Las longitudes de los intrones correspondientes pueden variar mucho. • Los intrones usualmente no codifican proteínas.

Cuando un gen es continuo, el mapa de restricción de su DNA corresponde exactamente al mapa de su RJ"l'Am. Cuando un gen posee un intrón, el mapa de cada extremo corresponde al mapa de cada extremo de la secuencia mensajera. Sin embargo, en el gen, los mapas difieren porque las regiones adicionales no están representadas en el mensaje. Cada una de dichas regiones corresponde a un intrón. En el ejemplo de la se comparan los mapas de restricción del gen de la ~-globina y del RNAm. Hay dos imrones, cada uno de los cua les contiene una serie de sitios de restricción que están ausentes en

DNA genómíco Exón 1

\

lntrón 1 Exón 2

Sitios divididos por las enzlmas de restncción lntrón 2 Exón 3

•

\.

DNAc El mapa de ONAc corresponde a exón1 + exón2 + exón3 del mapa genómico La comparación de los mapas de restricción del DNAc y del DNA genómico de la ~-globina del ratón muestra que el gen tiene dos intrones que no están en el DNAc. los exones pueden ser alineados exactamente entre el DNAc y el gen.

Exón

lntrón

Exón '

Bloqueado Bloqueado Secuencia del gen

1

1

Bloqueado

1

... TCOlTATTGTOCCGT

SeJ Leu Leu Ser Arg Asn Ser Trp C1s PIJe

Un intrón es una secuencia presente en el gen pero no en el RNAm (mostrado aquí de acuerdo con la secuencia del DNAc). El marco de Lectura está indicado por los bloques alternos, abiertos y sombreados; nótese que Los tres marcos de lectura posibles están bloqueados por codones de terminación en el intrón.

el DNAc. El patrón de los sitios de restricción de los exones es el mismo en el DNAc y en el gen. En ú ltima instancia, la comparación de las secuencias nudeorídicas de la secuencia genómica y la RNAm define precisamente a los intrones. Como se indica en la , en general Jos intrones carecen de un marco de leclura abierto. AJ eliminar los intrones, en la secuencia del RNAm se crea un marco de lectura intacto. Las estTUcturas de los genes eucarióticos muestran amplias variaciones. AJguoos genes son continuos, de tal manera que la secuencia genómica es colineaJ a la del RNAm. La mayoría de los genes eucariontes superiores soo interrumpidos, pero los inlrones varían enormemente tanto en número como en tamaño. Todas las clases de genes pueden ser interrumpidas, los genes nucleares que codiGcan proteínas. los nucleolares que codifican RNAr, y los que codifican RNAr. También en los genes mitocondriales se encuentran interrupciones, así como en las eucariotas inferiores y los genes de Jos cloroplastos. Los genes interrumpidos no parecen ser excluidos de

ninguna clase de eucariolas y se han encontrado en bacterias y en bacteriófagos, aunque son extremadamente raros en genomas procarióticos. Algunos genes interrumpidos cuentan sólo con un intrón, o con unos cuantos, de los cuales. los genes de la globina consti tuyen un ejemplo muy estudiado (véase la sección 3.1 O, La organización de los miembros de una familia de genes es común) . Los dos tipos generales de genes de globina, a y ~. comparten un tipo común de estructura, y la coherencia de su organización en Jos mamíferos es evidente a partir de la estructura del gen "genérico" de la globina. la cual se resume en la Las interrupciones ocurren en posiciones homólogas (respecto de la secuencia codificadora) en todos los genes de la globina activos, conocidos, incluidos los mamíferos, aves y ranas. El primer intrón siempre es bastante corto y el segundo suele ser más la rgo, pero la longitud en sí puede variar. La mayoría de las variaciones en cuanto a longitud total entre los dHerentcs genes de la globina resulta de la variación en el segundo inrrón. En el ratón. el segundo intrón del gen de la cx-globina tiene una longitud de sólo

3.4 La organización de los genes interrumpidos puede conservarse

41

Longitud de 116-130 los intrones Exón 1 lnttón 1 _ Ex _ ó_o_2._ Longitud 142-1 45 de los exones ~

573-904 lntrón 2

Exón3

222 ~

Contenido UTR 5' + codificadores

Aminoácidos

31- 104

1-30

216-255

~

Codificadores 105 - extremo + UTA 3'

Todos los genes funcionales de globina tienen una estructura interrumpida con tres exones. Las longitudes indicadas en la figu ra aplican a los genes de la globina-p de los mamíferos.

Las secuencias de los exones se mantienen, no así Las de los intrones Conceptos principales

o

6 Exones

4 5

2

5

10

15

20

25

30

kb Los genes de la DH FR de los mamíferos tienen

• La comparación de genes relacionados de diferentes especies muestra que las secuencias de los exones correspondientes usualmente se conservan, pero las secuencias de los intrones están mucho menos relacionadas. .. Los intrones evolucionan mucho mas rápidamente que los exones por la falta de presión selectiva para producir una proteína con una secuencia útil.

la misma organización relativa de exones más bien cortos e

intrones muy largos, pero varía ampliamente en las longitudes de los intrones.

150 bp, por lo tanto, la longitud total del gen es de 850 bp, respecto del gen mayor de la ~-globina, en el cual, los 585 bp del intrón resultan en un gen cuya longitud total es de 1382 bp. La variación en la

longitud de Jos genes es mucho mayor que e l rango de longitudes de los RNAm (el de la 0'.-globina tiene 585 bases y el de la ~-globina, 620 bases). El ejemplo de la DHFR, un gen un tanto más grande, se muesna en la . Dicho gen (dihidrofolato reducrasa) de los mamíferos está organizado en seis exones que corresponden al RNAm de 2 000 bases con una longitud mucho mayor de DN A debido a que los intrones son muy largos. En tres mamíferos, los exones son esencialmente iguales y las posiciones relativas de los intrones no cambian, a diferencia de la longitud de cada imrón; no obstante, el resultado de la variación en la longitud del gen es de 25 a 31 kb. Los genes de la globina y de la DHFR son ejemplos de un fenómeno general; los genes relacionados por evolución tienen organizaciones relacionadas con el manrenirnienco de la posición de los intrones (al menos de algunos de ellos). Las variaciones en la longitud de los genes son determinadas principalmente por la longitud de los intrones. 42

CAPÍTULO 3 El gen interrumpido

¿Un gen esrructural es único en su genoma? La respuesta puede ser ambigua. La longitud completa del gen es única, pero con frecuencia sus exones esrán relacionados con tos exones de otros genes. Como regla general, cuando dos genes están relacionados, la relación enrre sus exones es más cercana que la relación entre sus intrones. En un caso extremo, los exones de dos genes pueden codificar a ta misma secuencia proteínica, mientras que los intrones pue den seT diferentes, lo cua l implica que ambos genes fueron originados por una duplicación de algún gen ancestral común. Posteriormente, se acumularon diferencias entre una y otra copia, pero en los exones se vieron restringidas por la necesidad de codificar funciones proteínicas. Como se verá más adelante, al analizar la evolución del gen, los exones pueden ser considerados como las unidades básicas ensambladas en varias combinaciones. Un gen puede tener algunos exones reladonados con los exones de otro gen, pero otros pueden no tener relación. En general, Jos intrones no tienen ninguna relación en dichos casos, pueden surgir por duplicación y rranslocadón de exones individuales. La relación entre dos genes puede representarse como una comparación de mat1iz de puntos, como en la . Un punto indica la posición de la misma

Globína

5'

Exón

Exón

~mayor

Exón

3'

5'

Exón 1

g Exón ~ Q)

E <1!

e o

:0 (3

Los intrones evolucionan mucho más rápidamente que los exones. Cuando se compara un gen en dileremes especies, en ocasiones. los exones son homólogos, pero los intrones han cambiado tanto, que no se reconocen las secuencias correspondientes. Las mutaciones ocurren a la misma velocidad en exones e intrones, pero son eliminadas más eficientemente de los exones por selección adversa. Sin embargo, en ausencia de restricciones impuestas por una función codificadora, un inrrón es susceplible de acumular libremente sustitudones puntuales y otros cambios. los cuales implican que el intrón no tenga una función regida por una secuencia específica; aún no se sabe si su presenda es necesaria para la función del gen.

Exón ¡3

3'

---~------~--

las secuencias de los genes de la globina ~maro• y de la globina P""'''" del ratón están íntimamente relacionadas en las regiones codificadoras, pero difieren en Las regiones flanqueantes y en el intrón largo. Datos proporcionados por Philip Leder, Harvard Medica! School.

secuencia en cada gen. Si dos secuencias son idénticas, los puntos forman una línea en ángulo de 45°. La Línea es interrumpida por regiones no similares y se desplaza de forma lateral o vertical por deleciones o inserciones en una secuencia respecto de la otra. Cuando se comparan los dos genes de la globínap del ratón, dicha línea abarca los tres exones y el imrón pequeño para luego desvanecerse en las reglones flanqueanres y el intrón largo; es un patrón úpico en el cual las secuencias codificadoras están bien re lacionadas y la relación puede lr más allá de las fronteras de los exones; sin embargo, el patrón se pierde en los intrones más largos y en Las regiones de ambos lados del gen. El grado total de divergencia entre dos exones depende cte las diferencias entre las proteínas, pro" vacadas principalmente por sustituciones de bases. En las regiones traducidas, los exones se ven restringidos por la necesidad de codificar secuencias de aminoácidos, de modo que su potencial de cambio de secuencia es limitado. Muchos de los cambios no afectan el significado de los codones porque se cambia un codón por otro que represema al mismo aminoácido. Los cambios ocurren con mayor libertad en las regiones no traducidas (las cuales corresponden al líder 5' y al remolque 3' del RNAm). En los imrones corresponctientes, el patrón de divergencia impHca cambios tanto de raroaño (por deJ ecione~ e inserciones) como sustitllciones de bases.

m

La distribución de tamaños de los genes es amplia

Conceptos principales • la mayoría de los genes de las Levaduras son continuos, no así los de las eucariotas superiores. • los exones suelen ser cortos y codificar menos de 100 aminoácidos. • Los intrones son cortos en las eucariotas inferiores, pero en Las superiores pueden llegar a tener varias decenas de kb (kilobases) de longitud. • La longitud total de un gen se determina principalmente por sus intrones. En la se muestra la organización global de los genes en las levaduras, los insectos y los mamíferos. En Saccharomyces cerevisiae, la gran mayoría de los genes (>96%) son conrinuos, y los q ue tienen exones suelen mantenerse razonablem ente compactOs; vinua lmcnte ninguno de sus genes tie~ ne más de cuatro exones. En insectos y mamíferos sucede lo contrario, sólo a lgunos genes tienen secuencias coclificadoras ininterrumpidas (6% en los manúferos). Los genes de los insectOs tienden a presentar un número bastante reducido de exones, en general menos de 1O. Los genes de los mamíferos están diviclidos en más fracciones y algunas tienen varias decenas de exones. Aproximadamente el 50% de los genes de los mamíferos tienen > 1O intrones. Al examinar las consecuencias de este tipo de organización para el tamaño tOtal del gen, en la se observa que entre las levaduras y las eucarioras superiores hay una diferencia notable. La longitud del gen promedio de una levadura es de 1.4 kb, y en muy pocos es superior a los 5 kb. Sin embargo, la predominancia de genes interrumpidos

3.6 La distribución de tamaños de los genes es amplia

43

S. cerevisiae

D. melanogaster

Mamfferos

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

12

14

16

18

20 <40

>60

Número de exones

La mayoría de los genes de las levaduras son continuos, pero en las moscas y los mamíferos, casi todos son interrumpidos. (Los genes continuos tienen un solo exón y se suman en la columna de la extrema izquierda.)

en las eucariotas superiores significa que el gen puede ser mucho más largo que la unidad que codifica una proteína. Relativamente pocos genes de mosca o de mamífero presentan una longitud inferior a 2 kb, y en muchos casos es de entre 5 kb y 100 kb. El gen humano promedio tiene 27 kb de largo (véase la Figura 5.11). El cambio de genes en buena parte continuos a genes en gran medida interrumpidos ocurre en las euca riotas inferiores. En los hongos (excepto las levaduras), la mayoría de los genes son interrumpidos, pero tienen un número relativamente pequeño de exones ( <6) y son bastante cortos (<5 kb). El cambio a genes largos tiene Jugar en las eucarioras superiores, y los genes se hacen significativamente más largos en los insectos. Con este incremento en la longitud del gen, se pierde la relación entre el tamaño del genoma y la complejidad de los organ ismos (véase la Figura 4.5). Conforme se incrementa el tamaño del genoma, la tendencia es a intrones más largos, mientras que los exones siguen siendo bastame pequeí'í.os. En la se observa que los exones que codifican a los fragmentos de una proteína tienden a ser bastante pequeños, de modo que en las eucariotas superiores, el exón promedio codifica a -50 aminoácidos y la distribución general encaja bien

5 4

3 Q)

D.

N e so Q)

~

2

metanogaster

1 6

40

o 30 CL

20 10

(/)

5

Q)

Mamíferos

50

e 4 oX Q)

~

40

30 20 10

3

2

6 <0.5 <1 <2 <5 <10 <25 <50<100>100

Tamaño de los genes (kb) Los genes de las levaduras son cortos, pero los de las moscas y los mamíferos tiene una distribución dispersa que se extienden a longitudes muy amplias.

5 4

Humano

3

2 100

300

500

700

900

Longitud de los exones en nucleótidos Los exones que codifican proteínas usualmente son cortos. 44

CAPÍTULO 3 El gen interrumpido

con Ja idea de que Jos genes han evolucionado por la adición lema de unidades que coctifican a dominios pequeños e individuales de proteínas (véase la sección 3.8, ¿Cómo evolucionaron los genes interrumpidos?) . No hay una diferencia significativa en el ta maño de los exones de tipos ctiferentes de eucariotas superiores, aunque la ctistribución es más compacta en los verrebrados en que hay pocos exones cuya longitud rebase los 200 bp. En las levaduras, hay algunos exones más largos que representan a genes continuos en los cuales la secuencia codificadora está imacta. Los exones que codifican a regiones 5' y 3' no traducidas tienden a ser más largos que los que codifican proteínas. La muestra que el tamaño de los intrones varía ampliamente. En los gusanos y las moscas, el intrón promedio no es mucho más largo que los exones. En el primer caso no h ay intrones muy largos, sin embargo las moscas contienen una proporción significativa de ellos. En los vertebrados, la distribución de tamaño es mucho más amplia, desde aproximadamente la misma longitud que los exones (<200 bp) hasta longitudes medidas en decenas de kb, incluso 50 a 60 kb en casos extremos. Los genes muy largos son resultado de imrones muy largos, no de c;ecuencías codificadoras de productos de gran longitud. No hay una correlación

(/)

Q)

e:

e e

15 1

o:.!!

10

Mosca

5

20 15 10

S

10

15

20

25

30

Longitud de los intrones en kb Los intrones varían de muy cortos a muy largos.

entre el tamaño del gen y el tamaño del RNAm en las eucariotas superiores, tampoco una buena correlación enue el tamaño del gen y el número de exones, de modo que el tamaño de un gen depende principalmente de las longitudes de cada uno de sus intrones. En los mamíferos, los insectos y las aves, la longitud del gen "promedio" es de aproximadamente cinco veces la de su RNAm.

Algunas secuencias de DNA codifican a más de una proteí na Conceptos principales • El uso de codones alternativos de iniciación o de terminación permite que se produzcan dos proteínas cuando una es equivalente a un fragmento de la otra. • Se pueden producir secuencias no homólogas de proteínas a partir de la misma secuencia de DNA cuando ~sta es leída en marcos de lectura diferentes por dos genes (superpuestos). • l as proteínas homólogas que difieren por la presencia o ausencia de ciertas regiones se deben a un corte y empalme diferencial (alternativo) en el cual se incluyen o excluyen ciertos exones, ya sea por la inclusión o exclusión de exones específicos o al optar por exones alternativos.

La mayoría de los genes consra de una secuencia de DNA dedicada únicamente a codificar a una proteína (aunque el gen puede incluir regiones no codificadoras en cualqu ier extremo e intrones en la región codificado ra), aunqu e en algunos casos una sola secuencia de DNA codifica a más de una proteína . Los genes superpuescos se presentan en una situ ación rclarivamenre sencilla en la cual un gen es parte del otro. La primera mitad de un gen (o la segunda) es urilizada de manera indepenctienle para especificar una proteína que representa a la primera mitad (o a la segunda) de la proteína espedficada por el gen completo. Esta relación se ilustra en la . El resultado final es muy similar a una división parcial del producto proteínico para generar formas tanto de tamaño pardal como de tamaño total. Dos genes pueden superponerse de manera más sutil cuando la misma secuencia de DNA es compartida por dos proreínas no homólogas. situación que se presenta cuando la misma secuenda de DNA se traduce en más de un marco de lectura. En los genes celulares, una secuencia de DNA suele leerse sólo en uno de los tres marcos de lectura potendales. Sin embargo, en algunos genes víricos y mitocondriaJes hay superposición entre dos genes adyacentes que 3. 7 Algunas secuencias de DNA codiñcan a más de una proteína

45

X a

W

Exones W

t

X

Z Un RNAm tiene el axón a

z

ex

Proteína de tamaño patcial

1

Un RNAm tiene

el exón p W

~~~J,~mm~~~m~mmmmmmmmmmmmrummmmT~~~~~c~~~ porlripletes

X

~ ~

Z

El corte y empalme alternativo genera las variantes a y Pde la troponina T.

INICIO alterno

A partir de un sólo gen se pueden formar dos proteínas que inician (o terminan) su expresión en puntos diferentes.

Bases u

a • ur~ • ota • og • oa •o a • oo •o c • n ¡;; •o a • oa • o e •

lU UJiliQJ _

1

INICIO

_ _.....,..

Codones utilizados para la proteína 2

Dos genes pueden compartir la misma secuencia leyendo el DNA en diferentes marcos de Lectura.

se leen en marcos de lectura diferentes, situación ilustrada en la . La distancia de la superposición es por lo general relativamente corta, de tal forma que la mayor parte de la secuencia que representa a la proteína conserva una función codificadora única. En algunos genes, los patrones a!Lemativos de la expresión génica crean cambios en la ruta utilizada para conectar los exones. Un sólo gen puede generar diversos productos de RNAm diferentes en cuanto a contenido de exones, y la diferencia puede ser que cienos exones son opcionales, es decir, pueden ser incluidos o desempalmados. Asim ismo, puede haber exones que se excluyan mutuamente, se incluye uno u otro, pero no ambos. Las formas alternas producen proteínas en las cuales una parte es común y la otra es diferente. En algunos casos, los medios alternos de expresión no afectan a la secuencia de la proteína, por ejemplo, los que inciden en ellider S' no traduci46

CAPÍTU LO 3 El gen interrumpido

do o en el remolque 3' no traducido pueden tener consecuencias reguladoras, pero se crea la misma proteína. En otros casos, un exón es sustituido por otro, como se indica en la En este ejemplo, las proteínas producidas por los dos R.J.'!Am contienen secuencias que se superponen extensamente pero que son diferentes en la región alterna de corte y empalme. La mitad 3' del gen de la troponina T del músculo de la rata contiene cinco exones, pero sólo cuatro se utilizan para constituir un RNAm individual y tres, WXZ, son los mismos en ambos patrones de expresión. No obstante, en uno de éstos, el exón o: es empalmado entre X y Z y en el ou·o se utiliza el exón ~~ de modo que las formas o: y Pde la troponina T difieren en la secuencia de am inoácidos presente entre las secuencias w y Z, dependiendo del exón alterno utilizado, o: o p¡ cualquiera de ellos puede usarse para formar un RNAm individual, pero ambos no pueden estar en el mismo. En la es un ejemplo en el cual el empalme alternativo provoca la inclusión de un exón en algunos RNAm, miemras que lo deja fuera de otros. A panir del gen se forma un solo tipo de transcrito, pero éste puede ser empalmado en cualquiera de las dos formas. En la primera ruta, se desempalman dos intrones y los tres exones se unen entre sí, en tanto que en la segunda, el segundo exón no es reconocido, de tal forma que un solo intrón largo es desempalmado. Este intrón está formado por el intrón 1 +el exón 2 +el intrón 2. En efecto, el exón 2 ha sido tratado en esta ruta como parte del intrón individual. Estas rutas producen dos proteínas iguales en los extremos, pero una tiene una secuencia adicional en la mitad, por lo tanto, la región del DNA codifica a más de una proteína. (Otros tipos de combinaciones producidas por empalme alternativo se analizan en la sección 26 .12,

Exón 3

~

J

r.

r

Síntesis de ANA

Sólo los intrones son desempalmados

3'

3' RNAm

5'·

e N

Los tres exones están en la proteína larga Los intrones + exón 2 son desempalmados

5'

3'

5'

3' RNAm

e N En la proteína corta sólo están exón 1 + exón 3

El corte y empalme alternativo utiliza el mismo pre-RNAm para generar moléculas de RNA con combinaciones diferentes de exones.

El empalme alternaLivo involucra el uso diferencial de uniones de empalme.) En ocasiones dos ruras operan simultáneamente, en cuyo caso, ciena porción de RNA es empalmada en cada ruta, y en otras, las rutas son alternativas expresadas en condiciones diferentes, una en un tipo de célula y otra en otro. Así pues, el empalme alternativo o (diferencial) puede generar proteínas con secuencias superpuestas de un solo fragmentO de DNA. Es curioso que el genoma eucariótico superior sea extremadamente espacioso y tenga genes grandes que con frecuencia están muy dispersos y que al mismo tiempo forme múltiples productos a partir de un locus individual. El empalme alternativo expande el número de proteínas relativo al número de genes por -15% en las moscas y en los gusanos, pero tiene efectos mucho mayores en el hombre, en el cual, -60% de Jos genes puede tener formas alternas de expresión (véase la Sección 5.5, El genoma humano tiene menos genes que los esperados). Aproximadamente el 80% de los eventos de empalme alternativo resultan en cambios de la secuencia proteínica.

¿Cómo evolucionaron los genes interrumpidos? Conceptos principales • La interrogante principal al respecto es si los genes se originaron como secuencias interrumpidas por intrones o si originalmente eran moléculas ininterrumpidas. • Probablemente la forma original de la mayoría de los genes codificadores de protelnas fue la interrumpida, si bien en un principio los genes interrumpidos que codifican al RNA pudieron haber sido moléculas i ni nterrum pidas. • Una clase especial de intrones es móvil y puede insertarse en los genes. La esu-ucrura ampliamente imerrumpida de los ge-

nes de las eucariotas sugiere una imagen similar a un mar de intrones (casi todos únicos en secuencia, pero no exclusivamente), en el que las islas de exones (en ocasiones muy conos) están esparddas en archipiélagos individuales que representan a los genes. ¿Cuál era la forma original de los genes que actualmente están interrumpidos? 3.8 ¿Cómo evolucionaron los genes interrumpidos?

47

• En el modelo de los "intrones ancestrales'' se propone que los intrones siempre han for mado parte del gen . Los genes se originaron como estructuras interrumpidas, y los qu e carecen de imrones los han perdido en el curso de la evolución. • En el modelo de los "imrones adquiridos" se propone que las unidades ancestrales codificadoras de proteínas estaban formadas por secuencias continuas de DNA y que los imrones fueron insertados pt>Steriormente, Para poner a prueba los modelos se debe preguntar si la diferencia entre los genes eucarlóticos y Jos procalióticos puede ser e xplicada por la adqu isición de intrones en el primer caso o por la pérdida de Jos mismos en el segundo. El modelo de los "imrones ancestrales" sugiere que la estructura de mosaico de los genes es un remanente del antiguo enfoque de la reconstrucción de éstos para crear nuevas proteínas. Supóngase que una célu la ancestral tenfa cierto número de secuencias codificadoras de proteínas separadas: es probable que un aspecto de su evolución haya sido la reorganización y yuxtaposición de unidades polipeptídicas diferentes para crear nuevas proteínas. Si la unidad codiÍicadora de proteínas debe ser una serie continua de codones, cada reconstrucción requerirá de una recombinación precisa de DN A para colocar ambas unidades codificadoras de proteínas en registro, extremo con extremo, en el 1nismo marco de lectura. Además, si esta combinación no es exito-

sa, la célula ha sufrido algún daño por la pérdida de las unidades originales codificadoras de proteínas. Si en una recombinación aproximada del DNA se pudiera colocar a las dos unidades codificadoras de proreínas en la misma unidad de transcripción, se podrían probar patrones de corte y empalme en el 11ivel del RNA para combinar las dos proteínas en una sola cadena pollpeptídica. Si estas combinaciones no tienen éxito, las unidades originales de codificadón de proteínas siguen disponibles para pruebas posteriores. Dicho enfoque permite esendalmente que la célula intente delecioncs controladas en el RNA sin sufrir la posible inestabLlidad dañina de aplicar el procedimiento al DNA. Este argumento se apoya en el hecho de que podemos encontrar exones relacionados en genes diferentes, como si el gen hu biera sido ensamblado mezclando y apareando exones (véase la sección 3.9, Algunos exones pueden equ iparars<" con funciones proteínicas). En la se ilustra lo que sucede cuando en el genoma una secuencia alearoria que induye a exón es translocada a una nueva posición. Los exones son muy pequeños respecto de los intrones, de modo que es probable encontrar el exón dentro de un intrón. Para el corte y empalm.e sólo se necesitan las secuencias de las uniones entre exón e imr6n, de modo que es probable que el exón sea flanqueado por zonas de unión 3' y 5' funcio nales, respectivamente. Las zonas de unión son reconocidas en pares, por lo tanto, es probable que la zona de unión 5' del íntrón original interactúe con la

Los intrones son mucho más largos que los exones Zona de unión 3'

Zona de unión 5' . 1

1

exQn L- ~

~o

'--¡-!

intrón

intrón

intrón

ANA La secuencia que Incluye a un exón se transloca a un sitio diana aleatorio intrón

intrón

l mtrón

intrón

ANA

~

l

intrón

Un exón rodeado de secuencias f(anqueantes, translocado en el i nterior de un intrón, puede ser empalmado en el producto de RNA.

48

CAPÍTULO 3 El gen interrumpido

zona de unión 3' introducida por el exón nuevo. y no con su compañero original. De forma similar, la zona de unión 5' del nuevo cxón interactuará con la zona de unión 3' del imrón origi nal. El resultado es la inserción del nuevo exón en el producw de RNA entre los dos exoncs originales. Siempre y cuando el nuevo exón se encuentre ~n el mismo marco. de lectura que los exones originales, se producirá una nueva secuenda proteínica. Este tipo de evenro pudo haber generado nuevas combinaciones de exones durante la evolución. Nótese que su principio es imitado por la t¿mica dt! captura de exones que se uriliza para idenLificar a los exones funcionales (véase la Figura 4.11 ). En ocasiones ~e encuentran fom1as alternas de genes de .RNAr y RNAt, con y sin in trones. En el caso de los HNAt, en los cuales todas las moleculas están ·conformadas por la misma estructura general, parece poco probable que la evolución haya reunido a las dos regiones del gen, de::.pués de todo, ias diferentes regiones participan en el apareamiento de bases que da importancia a la estructura, de modo que, en este caso, los imrones debieron haber sido insertados en genes continuos. Los gcnoma:. de los organelos proporcionan algunas conexiones notables entre el mundo de las procariOlas y el de las eucariotas . Hay muchas similitudes generales entre las mitocondrias o los cloroplasros y las bacterias, por etlo, parece probable que los organelos se originaron en una endosimbiosis en la cual un prototipo bacteriano ancestral fue insenado en el citoplasma eucariótico. Sin embargo, a diferencia de las similitudes con la bacteria, por ejemplo, cómo se conserva en la síntesis proteíni ca o del RNA, algunos genes de organelos poseen i.otrones y por lo tanto se asemejan a los genes nucleares e uca rióticos. En muchos genes de los cloroplastos se encuentran 1ntroncs, incluidos algunos homólogos de los genes de la E. coli, lo cua l sugiere que el evento endosimbiótico ocurrió ames de que la línea pro cariótica perdiera los imrones. Si se encuentra un gen adecuado, sería posible rastrear el linaje génico hasta 31 periodo en que ocurrió la endosimhiosis. El gcnoma rnirocondrial es un caso panicularmente sorprendente. Los genes de las mirocondrias de las levaduras y de Jos mamíferos codifican proteínas mitocondriales virtualmente idénticas. pese a una diferencia considerable en la mganización génica. Los genomas mitocondriales de los vertebrados son muy pequeños. con una organización de genes ·continuo!. extremadameme compacta, mientras que los genomas rnitocondriales de las levaduras son más grandes y tienen algunos genes complejos interrumpidos ¿Cuál es la forma ancestral? Los in-

trones mitocondriales de las levaduras (y algunos otros introncs) pueden tener como propiedad la movilidad, ~on secuencias autónomas que pueden desempalmarse del RNA e insertar copias de DNA en cualquier otra parte, lo cual sugiere que podrían haber surgido por inserciones en el genoma (véase la sección 27.5, Algunos intrones del grupo I codi fican a endonucleasas que promueven la movilidad y la 27 .6, Los imrones del grupo lJ pueden codificar prmeína~ mulntuncionales).

111

Algunos exones pueden equipararse con fu nciones proteínicas

Cúuceptos principales

.

• Lo que sugiere que los exones fueron las unidades básicas de la evolución y que los primeros genes fueron interrumpidos en lo siguiente: • La estructura génica es igual entre genes de especies muy distantes. • Muchos exones pueden ser equiparados con secuencias codificadoras de proteínas que tienen funciones especificas. • En genes diferentes se encuentran exones relacionados.

Si las proteínas aclUales evolucionaron al combinar proteínas ancestrales que originalmente fueron independientes, es probable que la acreción de unidades haya OC\Jrrido de manera secuencial en algún periodo, agregándose un exóo a la vez ¿Es posible ver las diferentes funciones por las que estos genes fueron incrustados en sus estructuras presentes? En otras palabras, ¿podemos equiparar funciones específicas de proteínas actuales con dererminados exones? En algunos casos hay una clara relación entre las estructuras del gen y de la proteína; el ejemplo por excelettcia es el de las proteínas inmunoglobulinas, las cuales son codificadas por genes en los cuales cada exón corresponde exactamente a un dominio funcional conocido de la pwteína. Eo la se compara la estructura de una ínmu noglobulina con su gen. Una inmunoglobulina es un tetrámero formado por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas unidas para formar una proteína con numerosos dominios distintos. Las cadenas ligeras y las pesadas difieren en cuanto a estructura, y hay numerosos tipos de cadenas pesadas, y c.1da tipo es expresado desde un gen cuya serie de exones corresponde a los dominios estructurales de la proteína. 19 Algunos exones pueden equiparse con funciones proteínicas

49

exón L

exón V-J

1.7\:..PF.-

exón C ~

.... :-11".__.._

Cadena ligera Líder

Variable

Constante Bisagra Constante 2 Constante 3

Dominios proteínicos

Cadena pesada

_.__....,.

. rv~ ~ exón L exón V-D-J exón C1

exón bisagra

exón C2

exón C3

Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas de la inmunoglobulina son codificadas por genes cuyas estructuras (en sus formas expresadas) corresponden a los distintos dominios de la proteína. Cada dominio proteínico corresponde a un exón; los intrones van numerados del 1 al 5.

En muchos casos, algunos de los exones de un gen pueden identificarse con funciones específicas. En proteínas secretoras, el primer exón, que coctifi.ca a la región terminal N del polipéptido, con frecuencia específica a la secuencia señal implicada en la secreción membranosa, por ejemplo en la insulina. La perspectiva de que los exones son las unidades básicas funcionales de los genes está respaldada por casos en que dos genes pueden tener exones relacionados entre sí, mientras que otros se encuentran sólo en uno de los genes. En la se resume la relación entre el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDL, plasma low density lipoprotein) y otras proteínas. En el centro del gen receptor de la LDL se encuentra una serie de exones relacionados con los exones del gen para el precursor del factor de crecimiento epidérmico (EGF, epidermalgrowth .factor). En la región terminal N de la proteína, una serie de exones codifica a una secuencia relacionada con la proteína sanguínea del factor del complemento C9, de modo que el gen del receptor de la LDL se creó ensamblando módulos para sus diversas funciones. Estos módulos también son utilizados en combinaciones ctiferentes en otras proteínas. Los exones tienden a ser bastante pequeños (véase la Figura 4.11 ), aproximadamente del tamaño del polipéptido más pequeño susceptible de asumir una estructura plegada estable (-20 a 40 residuos). Quizá las proteínas fueron ensambladas originalmente a partir de módulos más bien pequeños. Cada módulo no necesariamente debe corresponder a una función actual, varios podrían haberse combinado para generar una fu nción. El número de exones de 50

CAPÍTULO 3 El gen i nterrumpido

Receptor de LDL Homología del precursor del EGF

Precursor del EGF El gen del receptor de la LDL está formado por 18 exones, algunos de los cuales están relacionados con los exones del precursor del EGF y otros con el gen del complemento sanguíneo (9. Los triángulos marcan las posiciones de los intrones.

un gen tiende a incrementarse con la longitud de su proteína, lo cual concuerda con la perspectiva de que las proteínas adquieren múltiples funciones agregando sucesivamente los módulos apropiados. Esta idea explicaría orra característica de la estructura de las proteínas. Aparentemente Jos sitios representados en las fronteras exón-intrón con fre cuencia se localizan en la supérficie de una proteína. Conforme se agregan módulos a una proteína, las conexiones, cuando menos las de los módulos agregados más reciememente, suelen tener la tendencia a localizarse en la superficie.

11m

Los miembros de una familia de genes tienen una organización común

Dominio de unión al grupo hemo

_ ~-j_

Globi~

1

1

Conceptos principales • Se supone que una caracteñstica común de una agrupación de genes identifica una propiedad que antecede a la separación durante la evolución. • la forma común de organización de todos los genes de globina, tres exones y dos intrones, sugiere que descienden de un solo gen ancestral.

Muchos de Jos genes ele u n genoma eucariótico su -

lntrón extra

Leghemogloblna

1

El dominio esta dividido La estructura de los exones de los genes de globína corresponde a la función proteínica, pero la leghemoglobina tiene un intrón extra en el dominio central.

perior estár1 relacionados con oLros del mismo genoma. Una fa milia d e genes puede definirse como un grupo de genes que codilkan a proteínas idénti ~ caso relaci onadas; la fam ilia se origina al duplicarse un gen . Inicialmente. las dos copias son idénticas, pero después divergen, conforme se acu mulan mutaciones en el las. las duplicaciones posteriores y la divergencia hacen aún más exte nsa la familia. Los genes de la globina son un ejemplo de una familia que puede dividirse en dos subfamilias (globina a y globina p), aunque todos sus miembros úenen la misma estructura básica y la misma función . El concepto puede ampliarse más cuando se encuentran genes relacionados de forma más distanre pero cuyo ancestro común aún puede reconocerse; en est e caso, se considera que un grupo de familias de genes forma una s upe rfa mHia. Las globinas a y ~~ y otras dos pro teínas rela cionadas con ell as. constituyen un caso fascina nte de conservación evo luUva. la mioglobina es una proteína monomérica que se liga al oxígeno, está presente en los anima les y su secuencia de aminoácidos sugiere uo origen común (a u nque antigtlo) con las s ubunidadcs de la globina. Las leghemoglobinas son proteínas que se unen al oxígeno y que se encuentran en las legumbres; igual gue la m ioglobina, son monoméricas. Además, también comparten un origen común con las otras proteínas de unión al grupo hemo. Jumas. las globinas, la mioglobina y la leghemoglobina constituyen la superfamilia de la globina, grupo de familias de genes descendientes de algún ancestro (distame) común. Los genes de la globina a y de la globina ~ tienen tres exoncs (véase la Figura 3.7). Los dos intrones están en posiciones constantes respecto de la secuencia codificadora. El exón central representa al dominio de unión al grupo hemo de la cadena de globina. En el genoma humano, la mioglobina está representada por un solo gen cuya estructura es esencialmente la misma que la de los genes de la globina, de modo que la estru ctura de tres exon es antecede

a la evolución de las funciones separadas de la rnioglobina y de la globi.na. Los genes de la leghemoglobina comienen tres introncs, de los cuales, el primero y el último se presentan en puntos de la secuencia cod ificadora homólogos a las localizaciones de los dos intrones de los genes de globina . Esta notable sim ilitud sugiere un origen extremadamente antiguo de las proteínas de unión a! grupo hemo en forma de un gen dividido, como se ilustra en la El imrón central de la leghemoglobina separa dos exones que juntos codifican a la secuenda correspondiente al exón central individual de la globina ¿Pudo el exón central del gen de la globina haber sido derivado de una fusión de dos cxones centrales del gen ancestral? ¿O es el exón individual central la forma ancestraL en este caso, un intrón que debió haber sido insertado en él al inicio de la evolución de la planta? Los casos en que la estructura de genes homólogos difiere, podrían proporcionar información acerca de su evoludón, por ejemplo, la íosuUna . Los m amíferos y las aves tienen sólo un gen para codificar insulina, exceptO los roedores, que tienen dos. En la se ilustran las estructuras de estos genes. El principio que se utiliza para comparar la organización de genes relacionados en especies diferentes consiste en que una característica común identifica

a una estructura que precedió a la separación evolutiva de las dos especies. En lo~ pollos, el gen único de la insulina tiene dos intrones; uno de los dos genes de la rata tiene la misma estructura. La estructura común implica que el gen ancestral de la insulina tenía dos intrones, sin embargo, el segundo gen de las ratas tiene sólo uno, de modo que debe haber cvoludonado por una duplicacióngénica en los roedores seguida de la eliminación precisa de un intrón de una de las copias. La organización de algunos genes muestra discrepancias considerables entre especies, en cuyo

3. LO los miembros de una famili a de genes tienen una organización común

51

caso, la eliminación o inserción de intrones durante la evolución debió haber sido intensa. Un caso bien caracterizado son los genes de la actioa. El típico gen de la actina tiene un líder no traduddo de
Gen común de la insulina (pollos y ratas) Exón Exón Hder lntrón codificador lntrón

Exón líder lntrón

1

Exón codificador

• • • .,...Deleción del intron

Exón codificador

Segundo gen de insulina de la rata El gen de la insulina de la rata, el cual cuenta con un intrón, evolucionó por la pérdida de un intrón de un ancestro con dos intrones.

y que todos los genes de la actina están relaciona dos con él por pérdida de intrones, en cada rama evoluriva se han perdido intrones diferentes. Probablememe algunos se han perdido por completo, de modo que el gen primordial pudo bien haber tenido 20 o más. La alternativa es suponer que un proceso de inserción de intrones continuó de manera independiente en las diferentes líneas de evolución. En última instancia, la relación entre las localizaciones de los intrones en diferentes especies puede utilizarse para consrruir un árbol de la evolución del gen. La relación entre los exones y los dominios de proteínas es un ramo errática; en ciertos casos es claramente de J: 1 y, en otros, no es posible discernir un patrón. Una posibilidad es que por la eliminación de intrones se han fusionado los exones adyacentes, lo cua l significa que el inrrón debió haber sido eliminado de .forma precisa, sin modificación de la integridad de la región codificadora. Una alternativa es que algunos inLrones surgieron por inserción en un dominio coherente. Además de las variaciones observadas en la colocación de los exones en casos como el de Jos genes de la acrina, esto sugiere que las posiciones de los imrones pueden ser ajustadas en el curso de la evolución. La ecuación de cuando menos algunos exones con los dominios de proteínas y la aparidón de exones relacionados en proteínas diferentes, no deja duda de que la duplicación y la yuxtaposidón de exones ha desempeñado un papel importante en la evolución. Es posible que el número de exones ancestrales, de los cuales se han derivado rodas las proteínas por duplicación, variación y recombinación, sea relativamente pequeño (algunos miles o decenas de miles). Considerando al exón como unidad fundamental de la evolución, desde esta perspectiva se acepta implí-

S.pombe S. cerevíslae Acanthamoeba Thermomyces C. elegans D. melanogaster A6 A1

A4 A2 Erizo de mar C J Músculo de pollo Músculo de rata Citoplasma de rata Músculo liso humano Músculo cardiaco humano FrUol de soya

los genes de la actina varían ampliamente en cuanto a organización. Los sitios de los intrones se indican en tono más oscuro.

52

CAPÍTULO 3 El gen interrumpido

dtamente el modelo de los imrones ancestrales como origen de los genes que codifican proteínas.

¿Se encuentra toda la información genética contenida en el DNA? Conceptos principales • La definición del gen se ha invertido, de "un gen : una proteína" a "una proteína : un gen". • La información sobre la posición también es importante en el desarrollo.

El concepto del gen ha evolu cionado significati-

vamente en los últimos años . La interrogante respecto de qué h ay en un nombre es especialmente apropiada para el gen. Ya no podemos aseverar qu e éste sea una secuencia de ONA que codifica continua y únicamente a una proteína en particular. En situaciones en las que un fragme nto de DNA es responsable de la prod ucción de un a proteína específica, hoy día se considera que la secuencia entera de DNA -desde el primer punto representado en el RNA mensajero hasta el último correspondiente a su extremo- comprende al •gen", los exones, los intrones y todo lo demás. Cuando las secuencias que representan a proteínas se superponen o tienen formas alternas de expresión, es pol>ible revenir la descripción común del gen, y en vez de deci1 "un gen-un polipéptido". podemos describir a la relación como '' un po1ipéptido- un gen", de modo que se considera ~_la secuencia responsable de hecho de la p rodu coon del polipéptido (incluido~ intrones y exones) como productora del gen, al mismo tiempo que se acepta que desde la perspectiva de otra proteína, parte de esta misma secuencia también pertenece a su gen. Esto permite el uso de descripciones como genes "superpuestos" o baJternativos". Ahora podernos ver qué tan lejos se ha llegado desde la hipótesis origjnal de un gen:una enzima. Hasta ese momento. la pregunta fundamenta l se relacionaba con la naturale?.a del gen. pero una ve7. que se descubrió que los genes representan a proteínas, eJ paradigma se estableció como el concepto de que cada unidad genética funciona a través de la síntesis de una proteína específica. Este punto de vista sigue siendo el paradigma central de la biología molecular: una secuencia de DNA funciona codificando directamente a una proteína en particular o porque es necesaria para el uso de un segmento adyacente que codifica realmente a la proteína ¿Qué tan lejos nos ll eva este paradigma

aparre de explicar la relación básica entre los genes y las proteínas? El desarrollo de organismos multicelulares se sustenta en el uso de gene~ diferentes para generar los diversos fenotipos celulares de cada tejido. La expresión de los genes depende de una red reguladora que asume la forma de una cascada. La expresión del primer conjunto de genes al principio del desarrollo embrionario conduce a la expresión de los genes implicados en la siguieme etapa de desarrollo, y así sucesivamente, hasta que todos los tejidos del adulto son funcíonales. La naturaleza molecular de esta red reguladora es en gran medida desconocida. pero suponemos que consiste en genes que codifican a productos (probablemente protefnas, quizá en ocasiones RNA) que actúan sobre otros genes. Si bien es casi seguro que dicha serie de interacciones es el m edio por el cual se ejecuta el programa de desarrollo, es posible preguntarse sí es suficíente. Una pregu nta específica concierne a la naturaleza y la función de la informa ción pos icional. Sabemos que no todas las partes de un óvulo fertilizado son iguales; una de las caracterísricas responsables deJ desarrollo de diferentes panes de tejidos de distintas re!liones del óvulo es la localización de la informa ctÓn (presumiblememe macromoléculas específicas) dentro de la célula. Desconocemos cómo se forman esas regiones paniculares, pero se puede especular que la ex..i,stencia de la información posicional en el óvulo conduce a la expresión düerenciaJ de los genes en las cél ulas formadas después en estas regiones. Esto conduce al desarrollo del organismo aduho, lo cual a su vez da lugar al desarrollo de un óvulo con la información posicional apropiada . Esta posibilidad incita a preguntar si inJormadón necesaria para el desarrollo de organismos está contenida en una forma que no pueda ser atribuida directamente a una secuencia de DNA (aunque la expresión de secuencias parúculares puede ser ne cesaria para perpetuar la intormación posicional). De una manera más general, es posible preguntar lo siguiente: cuanuo leemos la secuencia completa de DNA que comprende al genoma de algún organismo y la inrerpreLamos en función de proteínas y regiones reguladoras, ¿se podría, en principio, construir un organismo (o incluso una sola célula viviente) por medio de la expresión controlada de los genes adecuados?

EIB

Resumen

Todos los tipos de genomas eucarióticos contienen genes interrumpidos. La proporción de éstos es baja 3.12 Resumen

53

en las levaduras y se incrementa en las eucariotas inferiores; en las eucariOLas superiores son pocos los genes continuos. Los imrones se encuemran en todas las clases de genes eucarióticos. La estructura del gen interrumpido es la misma en todos los tejidos: en el RNA, los cxoncs se unen en el mismo orden en que están organizados en el DNA y los intrones usualmente carecen de función codificadora. Los imrones se eliminan del RNA por corre y empalme. Algunos gen~s ~e expresan mediante patrones alternos de corte y empalme, en los cuales una secuencia específica es eliminada como im rón en algunas situaciones, pero retenida como exón en otras. Las posiciones de los intrones suelen conservarse cuando se compara la organización de genes homólogos entre especies. Las secuencias de íntrones varían, incluso pueden no estar relacionadas, aunque las secuencias de exones se mantienen bien relacionadas. La conservación de 1o!> exones puede utilizarse para aislar genes relacionados en especies djierenres. El tamaño de un gen depende sobre todo de las longitudes de sus intrones, que en las eucariotas superiores se alargaron en las primeras etapas, cuando, por lo tanto, las dimensiones de los genes se incrememaron significativamente. La gama de dimensiones de los genes de los mamíferos suele fluctuar entre 1 y 100 kb, pero es posible que sean aún más largos: el caso conocido es el de la distrofina, que mide l. 000 kb. Algunos genes companen sólo algunos de sus exones con otros genes, lo cual sugiere que han sido ensamblados por adición de exones que representan a módu los individuales de la proteína_ Dichos módulos podrían haber sido incorporados en una gran variedad de proteín<Js diferentes. La idea de que los genes se han cnsa m blado por acreción de exones implica que en los genes de organismos primitivos hubo intrones. Algunas de las relaciones entre genes homólogos pueden explicarse por la pérdjda de intrones de los genes primordiales, con pérdida de intronec; diferentes en líneas de ascendencia diferentes.

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Nathan~.

.A.rticulos de investigación Danna. K. J.. Sack. G H.. and N¡¡thans. D . { 1973). Studies or SV40 })N;\ VIl A cleavage map of the SV40 zenome. J.

M1,/ Bicrl 78, 36;-376.

La organización de los genes interrumpidos puede ser conservada Artículos de investigación Be.:rgel. S. M.. Moore. C., and Sharp, P {1977). Spliced scgmc:nt~ .11 rhc 5' trrminus of adcnovirus 2 la re mRNA. Pror. Nat/.1\cad. Sci. USA 74, 3171-3 175. Chow, L. T., Gcliuas, R. E., Broker, T. R., and Robcrts. R. J. (1977 ). An amazing scqucncc arrangcmcnt at rbe 5' ende; of adenovirus 2 rnRNA. CP//12, 1-8. Glovcr, D. M. and llogncs). D. S. (1977 ). A novel arrangemem of the 8S and 28S scquenccs in a repeating un\t of D. mt iiJirogoster rDNA. Ce/110, 167-176. JeHreys. A. J. and Flavell. R. A. (1977). The rabbit p-g1obin gene contaln~ a large insen iu the coding scquence. Ce//

ll, 1097- 11 08 Wenskmk, J>. et al. ( 1974). A system for mapping DNA sequencc~ in rh<' chromosomes o! D melanogascu. Ce/13, 315- 325.

IIJ

Algunos exones pueden ser equiparados con funciones proteínicas

Revisiones Blakc, C. C. ( 1985). Exons anct Lhc evo1urion of proteins. 1111. Rev.G'ytol 93, 149-185.

El contenido del genoma ESQUEMA DEL CAPÍ TULO

-

Introducción Pueden trazarse mapas de los genomas por ligamiento, restricción, división o secuencia de DNA Los genomas individuales son muy variables • El polimorfismo puede ser detectado en el nivel fenotípico cuando una secuencia afecta a la función génica, en el de los fragmentos de restricción cuando afecta a un sitio diana de una enzima de restricción y en el secuencial por análisis directo del DNA. • los aletos de un gen muestran un amplio polimorfismo en el nivel secuencial, pero muchos cambios de secuencia no inciden en la función.

Los RFLP y los SNP pueden ser utilizados para el mapeo genético • los RFlP y los SNP pueden constituir la base de los mapas de ligamiento; permiten establecer relaciones entre progenitores y su progenie.

B'll ¿Por qué los genomas son tan grandes? • No hay una buena correlación entre el tamaño del genoma

y la complejidad genética. • Hay un incremento en el tamaño mfnimo del genoma necesario para formar organismos de mayor complejidad. • En numerosos filos, las dimensiones de los genomas de íos organismos vanan ampliamente.

Los genomas eucarióticos con tienen secuencias de DNA repetitivas y no repetitivas • La cinetica de la reasociación del DNA después de que un genoma ha sido desnaturalizado distingue a las secuencias por la frecuencia con se repiten en el genoma. • En el DNA no repetitivo, los genes generalmente son codificados por secuencias localizadas. • los genomas más grandes de un filo no contienen más genes, pero tienen cantidades mayores de DNA repetitivo. • Gran parte del DNA repetitivo puede estar formada por transposones.

-

Los genes pueden ser aislados por la conservación de los exones • la conservación de los exones puede ser utilizada como base para localizar regiones codificadoras al identificar fragmentos cuyas secuencias están presentes en mültiples organismos.

La conservación de la organización del genoma ayuda a identificar genes Los algoritmos para identificar genes no son perfectos, de modo que son necesarias numerosas correcciones al conjunto inic.ial de datos. Los seudogenes deben distinguirse de los genes activos. Hay amplias relaciones sinténicas entre los genomas del ratón y los del humano, y la mayoría de los genes activos se encuentran en una región sinténica.

Los organelos contienen DNA • Las mitocondrias y los cloroplastos tienen genomas cuya herencia es no mendeliana; típicamente son heredados de la madre. los genomas de los organelos pueden ser sometidos a segregación somática en las plantas. • las comparaciones del DNA mitocondrial sugieren que los humanos descienden de una sola hembra, la cual vivió hace 200 000 años en África.

Los genomas de los organelos son moléculas circulares de DNA que codifican proteínas de los organelos • los genomas de los organelos suelen ser moléculas circulares de DNA (pero no siempre). • Los genomas de los organelos codifican algunas de las proteínas que se encuentran en el organelo, pero no a todas.

La organización del DNA mitocondrial es variable • El DNA mitocondrial de las células animales es extremadamente compacto y suele codificar a 13 proteínas, dos moléculas de RNAr y 22 de RNAt. • El DNA mitocondrial de las levaduras es cinco veces más largo que el ONAmt de las células animales por la presencia de intrones largos.

El genoma de los cloroplastos codifica a numerosas proteínas y moléculas de RNA • Los genomas de los cloroplastos vañan en cuanto a tamaño, pero son lo suficientemente grandes como para codificar de SO a 100 proteínas, así como a los RNAr y a los RNAt.

Las mitocondrias evolucionaron por endosimbiosis Resumen

55

Introducción La pregunta crucial sobre el genoma es cuántOs genes contiene. Se puede pensar acerca del número rotal de genes en cuatro niveles, los cuales corresponden a etapas sucesivas de la expresión génica: • El genoma es el conjunto completo de Los genes de un organismo. En última instancia se define por la secuencia completa de DNA, aunque por una cuestión práctica podría no ser posible identificar cada gen inequívocamente sólo con base en la secuencia. • El transcriptoma es el conjunto completo de Jos genes expresados en determinadas condiciones. Se define en función del

conjunto de mo léculas de RNA presenre y puede referirse a un so lo tipo de célula, a cualquier ensamble de células más complejo o a l organismo completo. Debido a que a lgunos genes generan múltiples moléculas de RNAm, es probable que el transcriptoma sea mayor que el número de genes definidos di rectamente en el genoma. El transcriproma incluye a las moléculas de RNA no codificadoras, así como a las moléculas de RNA.m. • El proteoma es el conjunto completo de proteínas. Debe corresponder a las moléculas de RNAm del transoíptoma, aunque puede haber diferencias de detalle que reflejen cambios de la abundancia relativa o la estabilidad de las moléculas de RNAm y de las proteínas. Puede ser utilizado para referirse al conjunw de proteínas codificadas po r todo el gcnoma o producidas en cualquier célu la o tejido específicos. • Las proteínas pueden funcionar de manera independiente o como parte de ensambles de mültiples proteínas. Si fuera posible identificar todas las interacciones eoue proteína y proteína. se podría definir el número total de ensambles independientes de proteínas. El número de genes del genoma puede ser identificado direaamentc al definir marcos de lectura abiertos. El mapeo de esta naturaleza a gran escala es complicado porque los genes interrumpidos pueden estar formados por numerosos marcos de lectura abiertos separados. No necesariamente tenernos información acerca de las fondones de los produaos proteínicos, o de hecho, una prueba de que lleguen a expresarse, de modo que este abordaje se restringe a la definición del potencial del genoma. Sin embargo, se presume con relativa certeza que cualquier marco de lectura abieno conservado probablemente llegue a expresarse. Otro abordaje consiste en definir el número de genes directamente en función del transcriptoma (identificando directamente todas las moléculas de RNJ\n1) o del proreoma (identificando directamente 56

CAPÍTULO 4 El contenido del genoma

todas las proteínas). Esto propordona la seguridad de que se trata con genes a1uénticos que se e.>..1Hesan en circunstancias conocidas y permite investigar cuántos genes son expresados en un tipo de célula o un tejido panicular, qué variación existe en los niveles relativos de expresión y cuámos de los genes expresados en una célula particular son únicos de esa célula o también son expresados en alguna otra parte. RespeCto de los tipos de genes, podemos pregumar si alguno en particular es esencial: ¿qué le sucede a un mutante nulo? Si una mutación nula es letal, o el organismo presenta un defecto visible, podemos concluir que el gen es esencial o que al menos transfiere una ventaja scleCLiva, pero algunos genes pueden ser suprimidos sin un efecto

aparente en el fenotipo ¿Son estos genes realmente prescindibles, o resulta una desventaja selectiva por la ausencia del gen, quizás en OLras circunstancias. o en periodos más largos?

DI

Pueden trazarse mapas de los genomas por ligamiento, por restricción, por división ~ por secuencia de DNA

Definir esencialmente el contenido de un genoma significa Lrazar un mapa de genes y genomas en muchos niveles de resolución: • Mediante un mapa genético (o de ligamienw) se identifica la distancia entre muta dones en cuanto a frecuencias de recombinadón. Lo limita su dependencia en la ocurrencia de mutaciones que afectan al fenotipo. Debido a que las frecuencias de recombinación pueden distorsionarse respecto de la distancia física entre los sirios. no represen ta con precisión distancias físicas a lo largo del material genético. • Un mapa de ligamiento puede cons truirse midiendo la recombinación entre sirios en el DNA genómico. Estos sitios tienen variaciones secuencia les que generan diferencias en la susceptibilidad de división por ciertas enzimas (de restricción); como dichas variaciones son comunes. es posible hacer un mapa de ligamiento para cualquier organismo. a pesar de la ocurrencia de mmantes. Su desventaja es la misma para cualquier mapa de ligamiento, es decir, que las distancias relativas se basan en la recombinación. • Un mapa de restricción se construye dividendo el DNA en fragmentos con enzimas de rcsLricción y midiendo las distancias entre los sitios de división. Esre mapa representa distancias en cuanto a longitud del DNA, por lo tanto. proporciona un mapa físico del

material genético. Con un mapa de restricción no se identifican intrínsecameme los sitios de interés genético, para relacionarlo con el mapa genético. las mutaciones deben ser caracterizadas en función de sus efectos en los sitios de restricción. Pueden reconocerse grandes cambios en el genoma porque afectan a dimensiones o el número de fragmentos de restricción. Las mutaciones puntuales son más difíciles de detectar. • El último mapa permite determinar la secuencia del DNA. A partir de la secuencia se identifican los genes y las distancias entre ellos. Al analizar el pOLencíal de coctificación de proteínas de u na secuencia de DNA se

En la perspectiva mendeliana original del genoma, Jos alelos se clasificaban como silvestres o mutantes; posteriormente se aceptó la existencia de alelos múltiples, cada uno con un efecto diferente en el fenoti po. En algunos casos. incluso podría no ser apropiado definir algún alelo como de "tipo silvestre". La coexistencia de alelos múltiples en un locus se denomina polim orfismo genético. Por definición, cualquier sitio en el cual existen aleles múltiples como componentes estables de la población es polimórfico. Un alelo suele ser definido como polimórfico si su frecuencia en la población es de >1 por ciemo. ¿Cuál es la base del polimorfismo entre los alelos mutames? Poseen diJeren tes m u raciones que modifi-

puede deduclr si representa a una proteína,

can la función proteínica, produciendo cambios en el fen01 ipo. Si se comparan los mapas de restricción de

en cuyo caso, la conjetura básica es que la selección na tural impide la acumulación de mutaciones dañ.inas en las secuencias que codifican proteínas. Invirtiendo el argumento, se puede suponer que es probable que una secuencia codificadora intacta sea utilizada para formar proteína. Al comparar la secuencia de un DNA de tipo silvestre con la de un alelo mutante, es factíble determinar la naturaleza de una rnut.adón y el sitio exacto en que aparecerá. Esfo define la relación entre el mapa genético (el cual se basa completamente en los sitios de mutadón) y el mapa físico (basado en la secuencia del DNA, incluso puede estar formado por ésta). Técnicas similares son utilizadas para idemificar y secuenciar genes y para trazar mapas del genoma. aunque por supuesto hay una diferencia de escala. En cada caso, el principio consiste en obtener una serie de fragmentos superpuestas de DNA que puedan ser conectados en un mapa continuo. La caracrerística clave consiste en que cada segmento está relacionado con el siguiente segmento en el mapa caracterizando la superposición entre ellos. de tal forma que podemos estar seguros de que no faltan segmenros. Este principio es aplícado para ordenar grandes fragmentos en un mapa y para conectar las secuencias que constiwyen a los fragmentos.

•

Los geno mas individuales son muy variables

Conceptos principales

• El polimorfismo puede ser detectado en el nivel fenotípico cuando una secuencia afecta a la función génica, en el de los fragmentos de restricción cuando afecta a un sitio diana de una enzima de restricción y en el secuencial por análisis directo del DNA. " Los alelas de un gen muestran un amplio polimorfismo en el nivel secuencial. pero muchos cambios de secuencia no inciden en la función.

las secuencias de DN/\ de estos aletos. éstas también serán polimórflcos. en el sentido de que cada mapa o secuencia será diferente de los onos. Aunque no es evidente a partir del fenotipo, el tipo silvestre mismo puede ser polimórfico. Las versiones múltiples del alelo de tipo silvestre pueden distinguirse por di.ferendas secuenciales que no afectan a su función y que, por lo tanto, no pro ducen variantes fenotípicas. Una población puede tener gran polimorfismo en el nivel del genotipo. En un locus determinado pueden existir muchas variantes de secuencia diferentes; algunas son evidentes porque afectan al fenotipo, pero otras están ocultas porque su efecto no es visible. De manera que puede haber una sucesión de cambios en un locus. incluidos los que cambian la secuencia del DNA pero que no alteran la secuencia de la prOLeína, los que transforman la secuencia de la proteína sin afectar su función, los que crean proteínas con actividades clíferemes y los que producen proreínas rnutames no funcionales. Cuando se comparan los alelos. un cambio en un solo nucleótido se denomina polimorfismo de un solo n.u cleótido (SNP, Single nucleotide po· lymorphism). Uno de estos cambios se presenta cada - l 300 bases en el gcnoma humano. Definido por sus SNP, cada ser humano es único. Los SNP pueden ser detectados por diversos medios. desde comparaciones dire<.tas de secuencia hasta métodos bioquímicos o de espectroscopia de masas que producen diferencias basadas en variaciones de secuencia en una región definida. Un objetivo del mapeo genético es obtener un catálogo de variantes comunes. La frecuencia observaaa de SNP por genoma pronostica que, respecro de la población humana en general (considerando la suma de todos los genoma5 humanos de todos los individuos vivientes). debe haber >10 millones de SNP que ocurren a una Frecuencia de > l por ciento; ya se .ha identificado >1 míllón. 4..3 Los genomas individuales son muy variables

57

.

El DNA tiene 3 sitios diana en la región

La mutación elimina un sitio diana

~ ~ XC~OWJ\1 1 + {}\i '\.

La diVisión genera dos fragmentos internos

La división genera un fragmento interno

fragmento A fragmento B

! ~]

rt .1 1

f.JV.'

fragmento

r

e

~

Electroforesis

Arl B

1

+

Fragmentos A + B combinados :

C

e

Una mutación puntual que afecta a un sitio de restricción se detecta por una diferencia en los fragmentos de restricción.

B

Progenitores B

3 son heterocigotos 1 es homocigoto para

e

e

e e

F1 F2 hereda A o D de un progenitor, B o del otro progenitor

e

Alelo A

Alelo S Alelo

e

AlelaD .

Los polimorfismos de los sitios de restricción se heredan según las leyes de Mendel. Hay cuatro aletos para un marcador de restricción en todas las combinaciones de pares posibles; se segregan de forma independiente en cada generación . La fotografía es cortesía de Ray White, Ernest Gallo Clinic and Research Center, University oj California, San Francisco.

Algunos polimorfismos de l genoma pueden detectarse al comparar los mapas de restricción de individuos dlferentes. El criterio es un cambio en el patrón de fragmentos producidos por división con una enzima de restrícción. En la se mues tra que cuando en el genoma de un ind ividuo hay un sitio diana y en el de otro no, la división extra en el primer genoma generará dos fragme ntos que corresponden al fragmento individual del segundo genoma. El mapa de restricción es independ iente de la función génica, de modo que en este nivel, un po58

CAPÍTULO 4 El contenido del genoma

limorfismo puede ser detectado a pesar de que el cambio de secuencia afecte al fenotipo. Probablemente muy pocos de los polimorfismos de los sitios de restricción de un genoma realmente afecten al fenotipo, la mayoría impl ican cambios de secuencia que pueden no tener efec;LO en la producción de proteínas (por ejemplo, debido a que se encuentran entre genes). Una diferencia en los mapas de restricción de dos individuos es denominado polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, restrictlon fragment length polymorphism). Básicamente, un RFLP es un SNP localizado en el sitio diana de una enzima de restricción que puede utilizarse como marcador genético exactamente de la misma ma nera que cua lquiera otro marcador. En vez de examinar alguna característica del fenotipo, se evalúa directamente el genotipo, como lo revela el mapa de restricción. En la se observa la genealogía de un polimorfismo de restricción a través de tres generaciones; exhibe segregación mendeliana en los fragmentos de marcadores de DNA.

Los RFLP y los SNP pueden ser utilizados para el mapeo genético Cüncepto principal • Los RflP y los SNP pueden constituir la base de los mapas de ligamiento; permiten establecer relaciones entre progenitores y su progenie.

La frecuencia de recombinación puede medirse entre un marcador de restricción y un marcador feno, de tal típico visible, como se ilu:;l(a en la manera que un mapa genético puede incluir marcadores genotípicos y fenotípicos. Los marcadores de restricción no se limitan a los cambios del genoma que afectan al fenotipo, de modo que proporcionan las bases para una técnica extremadamente poderosa de identificacióp de loci genéticos en el ámbito molecular. Un problema típico concierne a una mutación con efectos conocidos en el fenotipo, en el cual elloc:us genético pertinente puede ser colocado en un mapa genético, pero de la cual se desconoce el gen o la proteína corre$pondiente. Muchas enfermedades humanas dañinas o fa tales pertenecen a esta categoría. Por ejemplo, la fib rosis quística muestra herencia mendeliana, pero se desconocía la naturaleza molecular de la función mutan te hasta que se pudo identificar como resultado de la caracterización del gen. Si los polimorfismos de restricción sonaleatOlios en el genoma, algunos deben ocurrir cerca de un gen diana específi co. Dichos marcadores de restricción se

Cruza genética

lnvesttgac1ón de los patrones de DNA de los pacientes con la enfermedad

35%

1

!

35%

Investigación de control de los patrones de DNA de las personas no afectadas

!

Tipos de progenitores ....J .....J -

La banda es la m1sma en el paciente

-

- •- -J L.

y en la persona sana

-J

-, L.

r

f-' _J---- El polimorfismo no ligado varra _Jil l en todas las muestras

u

¡

1

~

Recombinantes

;........¡

La banda es com(¡n a los pacientes La banda es comun a todas las personas no afectadas

15%

1

-e

Si un marcad::>r de restricción es asociado con una característica fenotípica, el sitio de restricción debe est ar localizado cerca del gen responsable del fenotipo. La mutación que cambia la banda común a las personas sanas en la banda común a los pac.ientes, está muy íntimamente relacionada con el gen de la enfermedad.

El marcador de restricción está a 30 unidades de mapeo del marcador de color de ojos Un polimorfismo de restricción puede ser utilizado como m¡¡rcador genético para medir la distancia de recombi nación a partir de un marcador fenotípico (como el color de los ojos). En la figura se simplifica la situación mostrando sólo las bandas de ONA que corresponden al alelo de un genoma en un diploide.

identifican gracias a su emecha vinculación con el fenotipo mutante. Si se compara el mapa de restricdón del DNA de pademes que padecen una enfermedad con el DNA de personas sanas, podría encontrarse que, en los pacientes, siempre hay un sitio de restricción en panicular (o siempre está ausente). En la ~e muestra un ejemplo hipotético que corresponde al descubrimiento de una vinculación de l 00% entre el marcador de restricdón y el fenotipo, lo cual implicaría que el marcador de resnicdón está tan cerca del gen mutante, que nunca se separa de él por recombinadón. La identificación de un marcador de tales caracrerísticas tiene dos consecuencias importantes: • Puede ofrecer un procedjmiemo diagnóstico para detectar la enfermedad. Algunas de las enfermedades humanas bien caracterizadas genéticamente pero mal definidas en función de las moléculas, no son fáciles de diagnosticar. Si un marcador de restricción está ligado con fiablemente al fenotipo, puede servir para diagnosticar la enfermedad. • Puede conducir al aislamiento del gen. El marcador de restricción debe encontrarse

relativamente cerca del gen en el mapa genético si ambo) loci rara vez se recombinan. o nunca. Lo que se considera ~ relarivamente cercaNen genética puede ser una distancia sustancial entre pares de bases de DNA; no obstante, el marcador de restricción proporciona un punto de inicio del cual partir en el DNA para localizar el gen. La frecuente presencia de SNP en el genoma humano los hace útiles para el mapeo genético. De los 1.5 x 106 SNP que hasta ahora han sido identificados. en promedio hay uno cada 1 a 2 kb, lo cual debe permitir la localiLación rápida de genes de enfermedades n uevas al ubicarlos en tre los SNP más cercanos. Según el mismo princ.:ipio, el rnapeo por RFLP ha sido utilizado durante alg(m tiempo. Una vez que se asigna uno de e llos a un grupo de ligamiento. puede colocarse en el mapa genético. En el hombre y en el rarón, esLc mapeo ha conducido a la construcción de mapas de ligamiento para ambos genomas. El ligamiento de un sitio desconocido se prueba con estos sitios y puede ser colocado rápidamenLe en el mapa. Hay menos RFLP que SNP, así que, en principio, la resolución del mapa de RFLP es más limirada. La frecuencia del polimorfismo significa que cada individuo tiene una constelación única de SNP o de RFLP. la combinación específica de los sitios encontrados en una región específica se denomina h aplotipo, un genotipo en miniatura. Si bien el concepto de haplotipo fue inLroducido originalmen-

4.4 Los RFLP y los SNP pueden ser utilizados para el mapeo genético

59

te para describir la constitución genética del locus mayor de histocompatibilidad, región que especifica proteínas considerablemente importantes del sistema inmunológico (véase Cap. 23, Diversidad inmun itaria), ahora se ha extendido a la descripción de combinadones particulares de a lelos o sitios de restricción (o cualquier otro marcador genético) de algún área definida del genoma. Mediante los SNP se creó un detallado mapa de haplo ripos del genoma humano que facilita el trazado de los mapas de los genes provocadores de enfermedades. La existencia de RFLP constituye la base de una técnica que permite establecer relaciones inequívocas entre los progenitores y su progenie. Cuando se duda de la paternidad, la comparación del mapa RFLP de una región cromosómic-d adecuada de los progenitores potenciales y del hijo permite asignar de manera absoluta el parentesco. El uso del anáUsis de restricción del DNA para la identificadón de individuos se ha denominado h uella digital del DNA. El análisis de secuencias "minisa télite" especialmente variables se utiliza en el mapeo del genoma humano (véase la sección 6.14, Los minisatélites facilitan el roa peo genético).

Plantas con flores Aves Mamíferos Reptiles Anflbios Peces óseos Peces cartilaginosos Equinodermos Crustáceos Insectos Moluscos Gusanos Mohos Algas Hongos Bacterias gram (+) Bacterias gram (-) 1 Micoplasma

11

1

••

11

106

107

108

108

101° 1011

El contenido de DNA del genoma haploi de se incrementa con la complejidad morfológica de las eucariotas i nferiores, pero varía ampliamente en algunos grupos de eucariotas superiores. El rango de los valores de DNA de cada grupo se indica mediante áreas sombreadas.

¿Por qué los geno mas so n tan grandes? Conceptos principales • No hay una buena correlación ent re el tamaño del genoma y la complejidad genética . • Hay un increment o en el tamaño mínimo del genoma necesario para formar organismos de mayor complejidad. • En numerosos filos, las dimensiones de los genomas de Los organismos varían ampliamente.

La cantidad rotal de DNA del genoma (haploide) es una característica de cada especie viviente conocida como su vaJOl· C. Hay una variación enorme en el rango de los valores C, desde <10 6 bp en un micoplasma hasta > l 0 1' bp en algunas plantas y algunos anfibios. En la se resume el rango de valores C encontrados en diferentes filos evolutivos. Con forme se incrementa la complejidad, aumenta el tamaño mínimo del genoma encontrado en cada grupo. Sin embargo, al incrementarse las cantidades absolutas de DNA en las eucariotas superiores, se observan amplias variaciones en las dimensiones de los genomas de algunos filos. En la , el diagrama de la cantidad mínima de DNA requerida por un miembro de cada 60

CAPÍTU LO 4 El cont enido del genoma

El gerioma mínimo encontrado en cada filo se incrementa de las procariotas a los mamíferos.

grupo sugiere que para for mar procarioras más complejas y eucarioras inferiores, es necesario que el genoma aumente de tamaño. Los Jnicoplasmas son las procariotas más pequeñas, y sus geno mas son sólo -3 veces el tamaño de un bacteriófago grande. El tamaño de las bacterias parte de -2 x 106 bp. Las eucariotas unicelulares (e u yos e >tilos de vida pueden parecerse a los de las

Filo Alga Micoplasma Bacteria Levadura Moho limoso Nematodo Insecto Ave Anfibio Mamffero

Especies

Genoma (bp)

Pyrenomas salma M. pneumoniae E. coli S. cerevtsiae D. discotdeum C. elegans D. melanogaster G. domesticus X. laevis H. sapíens

6.6X1Q5 1.0 )( 1()8 4.2 x tOS 1.3 X 107 5.4x107 8.0 X 107 1.4X10S 1.2 X 109 3.1 X 1()9 3.3 X 109

Dimensiones de los genomas de algunos organismos experimentales comunes.

procariotas) también subsisten con genomas pequeños, aunque son más grandes que los de las bacterias. El hecho de que un organismo sea euca riótico en sí, no impli ca un gran incremenLo en cuanto a l ramaüo del genoma; una levadura puede Lener un genof!la de -1.3 x 107 bp, el cual es apenas dos veces el tamaño de un genoma bacteriano promedio. Orro doble incremento en d tamaño del genom.a es adecuado para respaldar al moho limoso Dictyostelium discoideum, que puede vivír tanto en la modalidad unicelular como en la multicelular. Es necesario otro incremento en la complejidad para dar lugar a los primeros organismos completamente multicelulares; el nematodo Camorhabdilis elegans tiene un DNA de 8 x 101 bp. Asimismo, en el listado de la se observa el incrememo constante del Lamati.o del genoma de acuerdo con la complejidad de algunos de los organismos más comúnmente anaiLzados. Es n ecesario que aumente el tamaño del genoma para que se formen insectos, aves, anfibios y mamíferos. Sin embargo, después de este punto no hay una buena relación entre tas dimensiones del genoma y la complejidad morfológica del organismo. Se sabe que Jos genes son mucho más grandes que las seruendas necesarias para codificar proteínas porque los exones (regiones codificadoras) pueden incluir sólo una pequeña parte de la longitud total de un gen, lo cual explica la razón de que haya mucho más DNA del n ecesario para propordonar marcos de lectura para todas las proteínas del organismo, pues grandes segmentos de un gen interrumpido pueden no estar relacionados con la codificación de proteínas. Adicionalmente puede haber fragmentos significativos de DNA entre los genes, de modo que no es posible hacer deducciones respecto del número de genes a partir del tamaño tota l del genoma. La paradoj a del valor C se refiere a la falta de correlación entre el ramaño del genoma y la comple jidad genética. Hay algunas variaciones muy curiosas

respectO del tamaño del geno ma. En el sapo Xenop~tS y el hombre, los genomas son esencialmente del mismo tamaño, sin embargo. ¡se supone que el hombre es más complejo en cuanto a desarrollo genético! En algunos filos, las variaciones en contenido de DNA entre organismos que no difieren mucho en cuanto a complejidad extremadamente grandes (véase la Fig. 4.5). (Esto es especialmenre notable en insectos, anfibios y plantas, no así en aves. reptiles ni mamíferos. los cuales muestran pocas variaciones dentro del grupo, con un rango de dimensiones de genoma de -2 veces). Un grillo tiene un genoma 11 veces mayor que el de una mosca de la fruta. En los anfibios, Jos genoxnas más pequeños son de< l 09 bp, mientras que los más grandes son de- LO ' ' bp. Es poco probable que se .necesite una gran diferencia en el oúmero de genes para especificar a esws anfibios. No se sabe por qué la selección natural permite esta variación, ni si tiene consecu encias evolutivas.

Los genomas eucarióticos contienen secuencias de DNA repetitivas y no repetitivas Conceptos principales • La cinética de la reasociación del ONA después de que un genoma ha sido desnaturalizado distingue a las secuencias por La frecuencia con se repiten en el genoma. • En el DNA no repetitivo, los genes generalmente son codificados por secuencias localizadas. • Los genomas más grandes de un filo no contienen más genes, pero tienen cantidades mayores de DNA repetitivo. _. Gran parte del DNA repetitivo puede estar formada por transposones.

Las características generaks del genoma eucariótico pueden evaluarse por la cinética de reasociadón del DNA desnaturali7.ado, Lécnica ampliamente utilizada antes de que fuera posible la secuendación de1 DNA a gran escala. Con la cinética de reasociación se identifican dos tipos generales de secuencias genómicas: • El D NA no repetitivo consta de secuen cias únicas: sólo hay una copia en un genoma haploide. • El DNA repetitivo consta de secuencias presentes en más de una copia en cada genoma. El DNA repetitivo con frecuencia se divide en dos Lipes generales: • El DNA moderadamente repetitivo consiste en secuencias relativameme canas que se repiten Lípicamenre de 10-1000 veces en el genoma, dispersas a lo largo de éste; son

6 Los genomas eucarióticos contienen secuencias de DNA repetitivas y no repetitivas

61

1010 66% 58%

109

E o

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41%

25%

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No repetitivo

• Moderadamente • Muy repetitivo repetitivo

Las proporciones de los diferentes componentes secúenciales vañan en los genomas eucarióticos. El contenido absoluto de DNA no repetitivo se incrementa con el tamaño del genoma. pero alcanza una meseta a -2 x 109 bp.

responsables del alto grado de formación de la estructura secundaria en el pre-RNAm. cuando repeticiones (invertidas) en los intrones se aparean para formar regiones dúplex. • El DNA altamente repetiLivo está formado por secuencias muy cortas (típicamente < l 00 bp) presentes muchos miles de veces en el genoma. frecue ntemente organizadas en forma de repeticiones en tándem (véase la sección 6.11. los DNA saté lite frecuente mente se encuentran en la heterocromalina). Ninguna clase representa a proteínas. la proporción del genoma ocupado porDNA no repetitivo varía mucho. En la se resume la organiLación ge nómica de algunos organismos represemativos. Las procarioras contienen sólo DNA no repetitivo. En las e ucarioras inferiores, la mayor parte del DNA es no repetitivo; <20% forma parte de uno o más componemes moderadamente repetitivos. En las células animales. a menudo hasta la mitad del DNA es ocupado por componentes moderada y altamente repetitivos. En las plantas y en los anfibios. los componentes moderada y altamen· te repetitivos pueden representar hasta el 80% del genoma. de tal manera que el DNA no repetitivo se reduce a un componente minoritario. 62

CAPÍTULO 4 El contenido del genoma

Una parte significativa del DNA moderadamente repe titivo consiste en tran s pos ones. secuencias cortas de DNA (de - 1 kb) susceptibles de moverse a localizaciones nuevas en el genoma y de crear copias adicionales de sí mismos (véanse Cap. 21, Transposooes. y Cap. 22, Retrovirus y retroposones). En algunos genomas eucariócicos superiores pueden ocupar incluso más de la mitad del genoma (véase la sección 5.5, El genoma humano tiene menos genes de los esperados). En ocasiones se considera que los transposones se adaptan al concepto de DNA redundante, el cual se define como secuencias que se propagan por sí mismas en un genoma sin contribuir ar desarroiJo del organismo. Los transposones suelen fomentar las reestructuraciones genómicas. y éstas podrian conferir ventajas selectivas. Sin embargo. es justo decir que en rea lidad no se sabe porqué las fu e rzas selectivas no contrarrestan e l que los u·ansposones se conviertan en una proporción tan grande del genoma. Otro término que se utiliza para describir e l exceso aparente de DNA es "DNA basura". que define a secuencias gcnómicas sin una función aparente. Obviameme, es probable que en el ge· noma haya un equ ilibrio entre la generación de secuencias nuevas y la eliminación de secuendas indeseables. y que dena proporción del DNA que aparenremenre carece de [unción. esté en proceso de ser eliminada. La longitud del componente no repetitivo de DNA tiende a incrementarse con el tamaño total del genoma conforme se procede a un tamaño total del genoma de -3 x l 0 9 (característico de los mamíferos). Sin embargo. incrementos posteriores generalmente reflejan un aumento de la camidad y la proporción de componentes repetitivos, de tal forma que es raro que un organismo tenga un componcnre de DNA no repetitivo >2 x 109• Por lo tanto, el contenido de DNA no repetitivo de los genomas concuerda con nuestra percepción de la complejidad relativa del organismo. E. coli tiene 4.2 x 106 bp; C elegans se incrementa en un orden de magnitud, a 6.6 x L0 7 bp; D. rnelanogaster se incrementa aún más, a -108 bp. y en los mamíferos. el incrememo es de otro orden de magnilud. a -2 x l 0 9 bp. ¿Qué tipo de DNA corresponde a los genes codificadores de proteínas? La cinética de reasociación suele mostrar que eJ RNAm es derivado del DNA no repetitivo. de modo que La cantidad de éste es un mejor indicador del potencial codificador q1.se el DNA total. (No obstante, un análisis más detallado basado en las secuencias genómicas muestra que numerosos exones tienen secuencias relacionadas en otros exones l véase la sección 3. 5, las secuencias de los exones se conservan. pero las de los imrones varían]. Dichos exones evolucionan por duplicación

~ra formar copias que inicialmente son idénticas, ero que después difieren en secuencia durante la _ ·olución.) ~ Las

translocaciones cromosómicas identifican a la banda Xp21 como fuente de la DMD

Los genes pueden ser aislados por la conservación de los exones 1

Ccncepto principal

n

~

la conservación de los exones puede ser utilizada como base para localizar regiones codificadoras al identificar fragmentos cuyas secuencias están presentes en múltiples organismos.

-

-70kb

Mediante el DNA clonado de X humano se Identifican las delaciones en esta región Mapa de restncción construido mediante caminata cromosómica a partir de la sonda

~

o

..:...__~...,.,

!

+70kb

¡-__:]

\lgunas estrategias importantes para la identifi-

.::adón de genes se basan en el contraste entre la .:ooservación de los exones y la variación de los in.rones. En una región que contiene un gen cuya :~mción se ha conservado en un rango de especies, .a secuenda que representa a la proteína debe tener Jos propiedades distintivas: • Un marco de lectUra abierto, • y es probable que tenga una secuencia relacionada en otras especies. Estas características pueden utilizarse para aislar 5enes. Supóngase que por daros genéticos se sabe que un rasgo genético específico se localiza en determinada región cromosómica. Si se desconoce la naturaleza del producto del gen, ¿cómo se identifica al gen eo una región que puede ser. por ejemplo, >1 Mb? Una estrategia colosal cuya eficacia ha sido demostrada con algunos genes de importancia médica, consiste en detectar en fragmentos rela tivamente cortos de la región las dos propiedades esperadas de un gen conservado. Primero se intenta identificar fragmentos sometidos a hibridación cruzada con los genomas de otras especies y después se examinan dichos fragmentos para detectar marcos de lectura abienos. El primer criterio se aplica al realizar una zoo· transferencia, para lo cual se utilizan fragmentos conos de la región como sondas (radioactivas) para evaluar la presencia de DNA relacionado en una variedad de especies a través de la hibridación de Southern. Si se encuentran fragmentos de hibridación relacionados con el de la sonda en numerosas especies -la sonda suele ser humana-, ésta se conviene en candidato para un exón del gen. Los candidatos van en secuencia y, si contienen marcos de lectura abiertos. se utilizan para aislar a las regiones genómicas circundantes. Si parecen ser parte de un exón, posteriormente podrán sec utilizados para identificar al gen completo, aislar a l

Las moléculas de DNA de pacientes con DMD presentan delaciones en la reglón de la caminata

~ }

El DNA hacia la derecha se elimina

El DNA hacia lao { izquierda se elimina

o

y Delación interna El gen implicado en la distrofia muscular de Duchenne fue detectado mediante un mapeo cromosómico y "caminando'' hacía una región en la cual se pueden identificar deleciones cuando se presenta la enfermedad.

DNAc o al RNAm correspondiente y. por último, para identificar a la proteína.

Esta estrategia es particularmente importante <.:uando el gen diana está disperso porque posee numerosos imrones prominentes, como en eJ caso de la dist rofia muscular de Duchenne (DMD, Duclzenne muscular dystrophy), trastorno degenerativo de los músculos ligado al cromosoma X, presente en uno de cada 3 500 nacimientos de varones. Los pasos para identificar el gen se resumen en la Mediante el análisis del ligamiento se localizó el locus correspondiente en la banda cromosómica Xp21. Los afectados por la enfermedad con frecuen cia presentan reestructuraciones cromosómicas en dicha banda. Al comparar la capacidad de las sondas de DKA ligadas al cromosoma X para hibridarse con el DNA de pacientes con DNA normal. se obtuvieron fragmentos clonados correspondientes a la región reestructurada o eliminada del DNA de los pacientes.

4.7 los genes pueden ser aislados por la conservación de los exones

63

-~

-

-

-"'"'

50 clones de la región hibr1dada al DNA de otras especies; 2 clones se hibridan con tOdos los mamfferos La secuencia del fragmento proveniente del hombre y del ratón es 95% idéntica y tiene un marco de lectura abierto

Humano

.... GCCATAGAGCGAGAA ·..

Murina

.... GCCATAGCACGAGAA ...·

!

DNAc

Utilizar el fragmento para identificar RNAm de i4 kb; axones del mapa correspondientes al DNAc 10

8

12

kb

·~:\.~

"\-.;:,.. o

250 500

a be d 200 100 50 25

~-

750 1 000

1 soo Kb en el genomE.

Los anticuerpos contra la secuencia peptídica corta del DNAc Identifican a la proteína distrofina

La dislrofina tiene -500 k0; está presente en (a) músculo esquelético (b) músculo cardfaoo y está ausente en (e) otros tejidos (d) músculo ~on DMQ_

EL gen de la distrofia muscular de Duchenne se caracterizó por medio de hibridación inespecífica, hibri· dación de DNAc, hibridación genómica e identificación de la proteína.

Una vez que se ha obtenido un poco del DNA localizado en la vecindad general del gen diana, es posible "caminar" a lo largo del cromosoma l1asta llegar al gen. Mediante una caminata cromosómica se construyó un mapa de restricción de las regiones que flanquean a la sonda, el cual cubrió una región de >100 kb. Mediante el análisis del DNA de una serie de pac\cntcs. en esta región se identificaron deleciones extensas en ambas direcciones; la más contundente está totalmente dentro de 1a región porque delinea un segmen to importante para la función del gen e indica que éste, o cuando menos parte de él, yace en dicha región. Una vez en la región del gen, se deben identificar los cxones y los intrones. Mediante un análisis de hibridación inespecífica se identificaron fragmentos que presentan hibridación cruzada con el cromosoma X del ratón y con otras moléculas de DNA de 64

CAPÍTULO 4 fl contenido del genoma

mamífero. Como se resume en la , éstos se examinaron detalladamente para detectar marcos de lectura abiertos y las secuencias úpicas de las uniones exón-intrón. Los ira,gmentos que cumplían con estos criterios se utilizaron como sondas para identificar secuencias homólogas en una biblioteca de DN A.c preparada a partir de RNArn muscular. El DNAc correspondiente al gen identifica a un RNAm inusualmente largo, de aproximadamente 14 kb. La hibridadón revenida hacia el genoma muestra que el RNAm está representado en >60 exones esparcidos en -2 000 kb de DNA. lo cual hace del gen de la DMD el más largo identificado hasta ahora. El gen codifica a una proteína de -500 kD denominada dislrofina, que es uno de los componentes del müsculo, más bien escaso. Todos los afectados por la enfermedad presentan deledoncs en este locus y carecen de distrofina (o es deficiente). El músculo también se distingue por tener la proteína más grande conocida, la titina, formada por aproximadamente 27 000 aminoácidos. El gen correspondiente contiene el número mayor de exo· ncs ( 178) y el exón más largo del genoma humano (17 000 bp). Otra técnica que permite examinar rápidamente los rragmcnros genómicos para detectar los exones se denomina técnica de captura de ex ones. En la se muestra que empieza con un vector que contiene un promotor fuerte y un solo intrón localizado entre los dos exones. Cuando este vector es introducido a las células por transfccción, la transcripción del mismo genera grandes cantidades de RNA que contiene las secuencias de los dos exones. Dentro del intrón hay un sitio de restticción-clonación que se utili.za para insertar fragmentos genómicos de una región de interés. Si un frag mento no úene exón, no hay cambios en e l patrón de corte y empalme, y el RNA contendrá sólo Las mismas secuencias que el vector progenitor. No obstante, si el fragmento genómico comiene un exón flanqueado por dos secuencias int.rónicas parciales. se reconocen los sitios de corte y empalme a uno y otro lado de este ex:ón y su secuencia es insertada en el RNA, entre los dos exones del vector. No es difícil detectar este proceso mediante transcripción inversa del RNA citoplásmico a DNAc utilizando la reacción en cadena de po limerasa (PCR. polymerase chain reaction) para amplificar las secuencias locali zadas enrre los dos exones del vector. Por ello, la apaüción de secuencias del fragmento genómico en la población amplificada indica que un exón ha sido capmrado. Como en las células animales los intrones suelen ser grandes y los exones pequeños, hay muchas probabilidades de que un fragmento

El vector contiene dos exones empalmados en el transcrito Promotor Unión de empalme 5'

J

1

Unión de empalme 3' 1

axón- L - - -- - ----,- - - - - ---' exón intrón Transcripción y oorte 1 y empalme para t eliminar el intrón Fragmento genómico intrón Inserción del fragmento genómico en el intrón

!

intrón

-' exón ' - - - - - - , - -- ----'exón intrón lntrón Transcripción y corte y empalme 1 para eliminar el intrón t

axón

L._-.----

Para la captura de exones se utiliza un vector especial de corte y empalme. Si un exón está presente en el fragmento genómico, su secuencia será recuperada en el RNA citoplásmico, pero si el fragmento genómico está formado únicamente por secuencias de dentro de un intrón, no ocurre el corte y empalme y el RNAm no es exportado al citoplasma.

aleatorio de DNA genómico contenga la esLructura :-equerida de un exón rodeado de intrones pardales. De hecho, la captura de exones puede parecerse a los eventos ocurridos de forma narural durante la evolución de los genes (véase la sección 3.8, ¿Cómo evolucionaron los genes interrumpidos?)

La conservación de la orga nización del genoma ayuda a identificar genes Conceptos principales Los algoritmos para identificar genes no son perfectos, de modo que son necesarias numerosas correcciones al conjunto inicial de datos. • los seudogenes deben distinguirse de los genes activos. Hay amplias relaciones sinténicas entre los genomas del ratón y los del humano, y la mayoña de los genes activos se encuentran en una región sinténica.

-...:na vez ensamblada la secuenda de un genoma, :oda vía se tienen que identificar los genes que con-

tiene. Las secuencias codificadoras representan una fracción muy pequeña. Los exones pueden ser idemiricados como marcos de lectu ra abiertos e ininterrumpidos, flanqueados por secuencias apro piadas. ¿Cuáles son los criterios para identificar un gen activo en una serie tle exones? En la se muestra que un gen activo debe estar formado por una serie de exones en la cual el primero de ellos sigue inmediatamente a un promotor; lo~ exones internos son flanqueados por uniones apropiadas de corre y empalme, y el último va seguido de señales de procesamiento 3'; uniendo a los exones puede deducirse un solo marco de lectUra abierto que empieza con un codón de iniciación y termina con uno de terminación. Los exones internos pueden identificarse como marcos de lectura abiertos flanqu eados por uniones de cone y empalme. En los casos más sencillos, el primero y el último exón inician y terminan la región codificadora, respeaivameme (así como las regiones no traducidas 5' y 3') . En casos más complejos, dichos exones pueden tener sólo regiones no traducidas y, por lo ramo, ser más dHícilcs de identificar. los algoritmos utilizados para conectar los exones no son realmente efectivos cuando el genoma es

4.8 La conservación de la organización del genoma ayuda a identificar genes

65

Secuencia promotorá

Unión de ernpalme

GT

Unlón de empalme AG

UnTón de empalme

GT

Unión de empalme AG

Señales proc~doras

3'

Exones internos ORF

....- - AUG ..........................................WI - - - - . . Los exones rorman un marco de lectura abierto continuo Los exones de los genes codificadores de proteínas son identificados como secuencias codificadoras fla nqueadas por señales apropiadas (con regiones no traducidas en ambos extremos). La serie de exones debe generar un marco de lectura abierto con codones adecuados de inicio y final. ORF, marco de lectura abierto; UTR, regiones no traducidas; GT y AG se refieren a las bases nitrogenadas de las secuencias.

muy grande y los exones están muy separados. Por ejemplo, en el análisis inicial del genoma humano se mapearon 170 000 exones en 32 000 genes. No es difícil que estas cifras sean incorrectas porque resultan en un promedio de 5.3 exones por gen, mientras que la media de los genes caracterizados completamente es de J0.2, de modo que, o se han omitido muchos exones o deben conectarse de ror· ma difereme en un número más pequeño de genes en toda la secuencia genórnica. Aun cuando la organización de un gen sea identH'i.cada correcramcnre, surge el problema de distinguir entre genes activos y seudogenes. Muchos de estos últimos se reconocen por defectos obvios que dan lugar a mutaciones múltiples que resultan en una secuencia codificadora inactiva. Los seudogenes que han surgido más recientemente no acumulan tamas mutaciones, de modo que pueden ser más difíciles de reconocer. En un ejemplo extremo, el ratón tiene sólo un gen Gapdh activo (que codifica a la deshidrogenasa de gHceraldehído fosfato), pero - 400 seudogenes. Dé éstos, en un principio pareció que aproximadamente lOO eslaban activos en la secuencia del genoma del ratón y fue necesario examinarlos uno por uno para excluirlos de la lista de genes activos. La certeza de que un gen está activo se puede incrementar comparando regiones de los genomas de especies diferentes. Ha llabido una reorganización general muy amplia de las secuencias entre los genomas de ratón y de humano, como se observa en el simple hecho de que el genoma haploide del humano tiene 23 cromosomas y el del ratón, 20. No obstante, localmente, el orden de los genes suele ser 66

CAPÍTU LO 4 El contenido del genoma

el mismo: cuando se comparan pares de homólogos de humano y de ratón, los genes localizados a ambos lados también tienden a ser homólogos. A esta relación se le denomina sintenia. En la se muestra la relación entre el cromosoma 1 del ratón y el conjunto cromosómico humano; se observa que 2 l segmentos de este cromosoma de ratón tienen contrapartes sinténicas en los cromosomas humanos. La extensión de la reorganización ocurrida entre los genomas se demuestra porque los segmentos están esparcidos en seis cromosomasl1umanos diferentes. El mismo tipo de relación se ha detectado en todos los cromosomas del ratón, excepto en el X, sinténico sólo con el cromosoma humano X, lo cua l se explica por el hecho de que el cromosoma X constituye un caso especial, sujeto a compensadón de dosis para ajustar las diferencias entre machos (una copia} y hembras (dos copias) (véase la sección 31.5, Los cromosomas X expe1imentan cambios globales). Esto puede ejercer presión selectiva contra la translocación de genes desde y hacia el cromosoma X. La comparación de las secuencias de los genomas del ratón y del humano revela que >90% de cada genoma se encuentra en bloques sinténicos cuyo tamaño varía (de 300 kb a 65Mb). Hay un total de 342 segmentos sinténicos, con una longitud promedio de 7Mb (0.3% del genoma). El99% por ciento de los genes del ratón tiene un homólogo en el genoma humano~ para el96% de dichos genes, ese homólogo se encuentra en una región sinténica. La comparación de los genomas proporciona información interesante con respecto de la evolución de las especies. El número de familias de

111 10 20 30 40 50 60 70 80

Concepto~

Cromosoma i del ratón

2 14 5

2

Los organelos contienen DNA

1!!!11 ~!!!

6 8

Cromosomas humanos correspondientes

El cromosoma 1 del ratón tiene 21 segmentos de 1 a 25 Mb que son sinténicos con regiones que corresponden a partes de seis cromosomas humanos. :;enes de los genomas de l ratón y del humano es e mismo, y una diferencia importante entre las especies es la expansión diferencial de familias es"'ecíficas en uno de los gen o mas, lo cual es par:!cu larme nte no ta ble e n los genes qt¡e afectan a .:aracte rísticas fenotípicas únicas ele las especies. En ~l ra tón, de las 25 fami lia s en las cuales se ha ob5!'rvado aumento de tamaño, 14 contienen genes =')pecíficameme implicados en la reproducción de .os roedores y cinco, genes específicos del sistema ~'"lmunológico.

Una validación de la imporrancia de los bloques ; iménlcos proviene de comparaciones de pares de os genes comen idos en ellos. Al buscar seudogenes ~milares sobre la base de comparaciones de secuen.:ias, para un gen que no está en una localización ;1ménica (esto es, su contexto es diferente en las Jos especies) hay el doble de probabilidades de que :.::-a un seudogén. En otras palabras, la transloca.:ión lejos del Jocus original tiende a asociarse con la ;:read ón de seudogenes, por lo tamo, la falta de un _?en relacionado en una posición sinténica despierta ~vspecha s de que un supuesto gen puede realmen:e ser un seudogén. En total, >10% de los genes ..Jentificados inicialmente en el análisis del genoma -rrobablememe resulten seudogenes. Como regla genera L las comparaciones entre genomas incrementan significa llvamente la cerre:.a del pronóstico génico. Cua ndo se conservan ca::-aaerísticas de la secuencia que condu cen a genes ~ctivos, por ejemplo, emrc el hombre y el ratón, se ncrememan las probabilidades de que identifiquen :: homólogos activos. La identificación de genes que codifican RNA :5 más complicada porque no es posible utilizar el (Titerio del marco de lectura abierto. También es · erdad que con el análisis comparativo del genoma ~ incrementó el rigor del análisis. Por ejemplo, al .;'ializar el genoma del humano o del ratón se iden:"..fican -500 genes que codifican RNAt, pero la com-.aración de características sugiere que <3 50 de estos ;enes están realmente activos en cada genoma.

principales

• Las mitocondrias y los cloroplastos tienen genomas que muestran herencia no mendeliana. Típicamente son heredados de la madre. • Los genomas de los organelos pueden ser sometidos a segregación somática en las plantas. Las comparaciones del DNA mitocondrial sugieren que los humanos descienden de una sola hembra, la cual vivió hace 200000 años en África.

La prLmera evidencia de genes fuera del núcleo provino de la herencia no mendeliana detectada en plantas (en los primeros años del siglo xx, después del redescubrimiento de la herencia roendeliana). En ocasiones, dicha here ncia está relacionada con el fenómeno de la segregación somática, en ambos casos la causa es simila r: • La herencia no mendeliana se define como la incapacidad de la progenie de un a pareamiento de mostrar la segregación mendelia na de los caracteres de los progenitores. Esta Jirnitante rclleja que falta la asociación entre el carácter segregante y el huso meiótico. • La segregación somática describe un fenó meno en el cual los caracteres de los progenitores se segregan en las células somáticas, de modo que exhiben la heterogeneidad del organismo. Ésta es w1a característica notable del desarrollo de las plantas porque refleja la falta de asociación entre el ca rácter segregame y el huso mirólico.

Por lo tanto. se considera que la herencia no mendeliana y la segregación l'Onu1tica indican la presencia de genes que residen fuera del núcleo y que no rewrren a la segregación en el huso mitótico y ell'neiótico para distribuir réplicas a los gametos o a las células hijas, respectivamente. En la se muesLra que esto sucede cuando las miwcondrias heredadas de los progenitores macho y hembra tienen alelas diferentes, y por casualidad, una célula hija recibe una distribución desequilibrada de mitocond.rias que representa sólo a un progeniwr (véase la sección 17.12, ¿Cómo se replican y segregan las mitocondrias?). La forma extrema de la herencia no mendeliana es la herencia uniparental, cuando se hereda el genotipo de sólo uno de los progenitores y el del otro progenitor se pierde permanentemente. En ejemplos menos extremos, la progenie de un genotipo progenitor excede a la del otro genoripo; por lo general, es el genotipo de la madre el que se hereda preferentememc (o únicamente). Este efectO se define en ocasiones como h e r e ncia materna. 4.9 Los organelos contienen DNA

67

La célula tiene mltocondrjas de ambos progenitores Mitocondria patema

l:

'(/"

G - Núcleo

,6' ~

Mitocondria matema

Posibles

resultado~ de

1<1 segregación estocástica

Las células suelen tener ambos tipos de mitocondrias

La distribución asimétrica proporciona células de un sólo tipo

6"1.101'

Cuando los aletos mitocondriales paternos y maternos difiere n, una célula tiene dos conjuntos de DNA mitocondrial. La mitosis suele generar células hijas con ambos conjuntos. La variación somática resulta de una segregación desigual que genera células hijas con sólo un conjunto.

El punto importante es que predomina el genotipo proporcionado por el progenitor de determinado género, como se observa en los índices de segregación anormales cuando se rea liza una cruza entre un mutante y un tipo silvestre, lo cual contrasta con el comportamiento de la genética mendeliana, que se presenta cuando cruzas recíprocas muestran que las contribuciones de ambos padres son heredadas de forma equivalente. El sesgo en los genomas progenitores se establece al formarse un cigoto, o poco después, por varias causas posibles. La aportación de información paterna o materna a los organelos del cigoto puede ser desigua l; en el caso más extremo, sólo contribuye un progenitor. En otros casos, las aportaciones son equivalentes, pero la infom1ación provista por un progenitor no sobrevive. Es posible que se combinen ambos efectos, pero independientemente de la causa, la representación desigual de la información proveniente de los progeni tores contrasta con la información genética nuclear, que se deriva de manera equivalente de uno y otro progenito r. La herencia no mendeliana resulta de la presencia de genomas de DNA en mitocondrias y cloroplasws, heredados independientemente de los ge68

CAPÍTULO 4 El contenido del genoma

nes nucleares. En efecto, el genoma de los organelos es un fragmento de DN A físicamente secuestrado en una parte definida de la célula y sujeto a su propia ·forma de expresión y regulación. Un genoma de organero puede codificar algunas o todas las moléculas de RNA, pero só lo algunas de las proteínas necesarias para perpetuar al organelo. Las otras proteínas son codificadas en el núcleo, expresadas a través del mecanismo dtoplásmico de síntesis de proteínas e importadas al interior del organelo. Los genes que no residen dentro del núcleo generalmente se describen como genes extranucleares que se transcriben y traducen en el mismo compartimiento del organelo (mitocondria o cloroplasro) en el cual residen. Por el con trario, los genes nucleares son expresados a través de la síntesis citoplásmica de proteínas. (El término herencia citopJásrnica suele utilizarse para describir el comportamiento de los genes en los organelos, pero esta descripción no debe utilizarse porque es importanre poder distinguir entre lo que sucede en el dtosol general y lo que acontece en organelos específicos.) Los anima les superiores muestran herencia materna, que se explica si las mitocondrias provienen todas del óvulo y en absoluto del esperma. En la se muestra que el esperma contribuye sólo con una copia de DNA nuclear, de modo que los genes mirocondriales son derivados exclusivamente de la madre, y en los mad1os, son desechados en cada generación. Las condidones del organelo son diferen tes de las observadas en el núcleo, y por lo tanro, el DNA de los organelos evoluciona a su propia velocidad. Si la herencia es uniparemal, puede no haber recombinación entre los genomas progenitores. De hecho, la recombinación suele no presentarse cuando los genomas de los organelos son heredados de ambos progenitores. El DNA de los organelos tiene un sistema de replicación diferente al del núcleo, por lo que la tasa de error durante la replicación puede ser diferente. El DNA mitocondrial acumula mutaciones más rápidamente que el DNA nuclear en Jos mamíferos, sin embargo, en las plantas, la acumulación en la mitocondria es más lenta que en el núcleo (en el cloroplasto la velocidad es intermedia). Una consecuencia de la herencia materna es que la secuencia del DNA mitocondrial es más sensible a reducciones en el tamal"io de la población de reproducción que la del DNA nuclear. La compara· ción de las secuencias de DNA mitacondrial en un rango de poblaciones humanas permite construir un árbol evolutivo. La divergencia entre las moléculas de DNA mitocondrial humano cu bre el 0,57%. Es posible elaborar un árbol en el cual las variantes mitocondriales se derivaron de un ancestro (africano) común. La tasa a la cual el DNA rnitocond.rial

/~-, 1

,

~\ ~tocondrias

,

,, -Pronúcleo

El DNA del esperma entra al ovocito para formar el pronúcleo masculino en el óvulo fertilizado, sin embargo, todas las mitocondrias son proporcionadas por el ovocito.

de los mamíferos acumula mutaciones es de 2 a 4 % por cada millón de años, es decir, > 1O veces más rápida que la tasa de la globina . Dicha tasa generará la divergencia observada en un periodo evolutivo de 140000 a 280000 años, lo cual implica que la raza h umana desciende de una sola hembra que vivió en África hace -200 000 años.

Los genomas de los organelos son moléculas circulares de DNA que codifican proteínas de los organelos Conceptos principales • Los genomas de los organelos suelen ser moléculas circulares de ONA (pero no siempre). • Los genomas de los organelos codifican algunas de las proteínas que se encuentran en el organelo, pero no a todas. La mayoría de los genomas de los organelos asumen la forma de una sola molécula circular de DNA de secuencia única (ll amada DNAmt en la mitocondria y DNAct en el doroplasto). Hay pocas excep-

ciones en las que el DNA de la m.itocondria es una molécula lineal; estas estructuras generalmente se presentan en las eucariotas inferiores. En general. en un organelo hay numerosas copias del genoma, y en cada célula hay mú ltiples organelos, de modo que son numerosos Jos genoma~ de organelos por célula. Aunque el genoma de los organelos es único, constituye una secuencia repetitiva respecto de cualquier secuencia nuclear no repetitiva. Los genomas de los cloroplastos son relativamente grandes, casi siempre - 140 kb en las plantas superiores y <200 kb en las eucariotas inferiores, dimensiones comparables con las de un bacteriófago grande, el T4, por ejemplo, mide -165 kb. Son varias las copias del genoma por organelo, típicamente de 20 a 40 en una planta superior, y múltiples copias del organelo en cada célula, por lo general, de 20 a 40 . El tamaño total de los genomas mitocondriales varía en más de un orden de magnitud. Así, los genomas mitocondriales de las célu las animales son pequeños, aproximadamente de 16.5 kb en los mamíferos. Hay muchos cientos de miwcondrias por célula. y cada mitocondria tiene múltiples copias de DNA. La cantidad total de DNA mitocondrial respecto del DNA del núcleo es pequeña, se estima en <1 %. Por el contrario, en las Jevadnras, elgenomí=! mitocondrial es mucho más grande, por ejemplo, en Saccharomyces cerevisiae el tamaí1o exacto varía de una cepa a otra, pero en promedio es de - 80 kb . Hay -22 mitocondrias por célula, que corresponden a -4 genomas por organelo. En célu las de cultivo, la proporción de DNA mitocondrial puede llegar aJ 18 por dento. En las plantas, eJ. rango de dimensiones del DNA mitocondríal es extremadamente amplio, con un mínimo de -100 kb. Las d imensiones del ge noma hacen difícil aislarlo intacto, pero el mapeo de restricción de muchas plantas sugiere que el genoma m\tocondrial su ele ser una secuencia individual organizada en un círculo, dentro del cual hay secuencias homólogas cortas. La recombinación entre estos elementos genera moléculas circulares subgenómicas más pequeñas que coexisten con el genoma "maestro" completo, buen ejemp lo de la complej idad aparente de las moléculas de DNA mirocondrial de las plantas . Ahora que se cuenta con la secuenda de los genomas mitocondriales de numerosos organismos, es posible observar algunos patrones generales en la representación de las funciones del DNA mitocondrial. En la se resume la distribución de los genes de ese tipo de genomas. El número total de genes codificadores de proteínas es bastante pe queño y no se correlaciona con el tamaño del geno-

4.10 Los genomas de los organelos son moléculas circulares de ONA que codifican proteínas de los organelos

69

Especie

Hongos Protistas Plantas Animales

Tamaño (en kb)

19-1 00 6-100 186-366 16-17

Citb

Genes Genes codificadores codificadores de proteinas de RNA

8-14 3-62 27-34 13

10-28 2-29 21-30 4-24

Los genomas mitocondriales tiene genes (principalmente de los complejos 1-IV) que codifican proteínas, moléculas de RNAr y moléculas de RNAt.

/

NOS

~

-"J

1111 La organización del DNA mitocondrial es variable Conceptos principales • El DNA mitocondrial de las células animales es extremadamente compacto y suele codificar a 13 proteínas, dos moléculas de RNAr y 22 de RNAt . • El DNA mitocondrial de las levaduras es cinco veces más largo que el DNAmt de las células animales por la presencia de intrones la(gos.

El DNA rrútocondrial de los animales es exnem.adamente compacto. En diferentes filos animales se observan diferencias notables en la organización génica detallada, pero se conserva el principio general de un genoma pequeño que codifica a un número 70

CAPÍTULO 4 El contenido del genoma

#.

0 ("

RNAr 128 '

N06

RNAr 16S \

~

16.6 kb

N04 1

1 ND1

~

"\ N04L N03 \ .

ma. Las mitocondrias de los mamíferos utilizan sus genomas de 16 kb para codificar a 13 proteínas, en tanto que las m itocondrias de las levadu ras utilizan los de 60 a 80 kb para codificar a sólo ocho proteínas. Las plantas, cuyos genomas mitocondr.iales son mucho más grandes, codifican a más proteínas. En la mayoría de los genomas mítocondriales se encuentran imrones, aunque no en los genomas muy pequeños de mamífero. Los dos RNAr principales siempre son codificados por el genoma miLOcondrial. El número de moléculas de RNAr codificado por el genoma mitocondrial fluctúa entre ninguno y todo el complemento (25 a 26 en las mitocondrias), lo cual justifica la variación en la Figura 4.16. La parte principal de la activ idad codificadora de pro Leínas está dedicada a los componentes de los ensambles de múltiples subun.idades de los complejos de respiración I-IV. Muchas proteínas ribosórnicas son codificadas en los geno.mas prolist.as y mitocondriales de las plantas, sin embargo, muy pocas o ninguna se codifican en los genomas de hongos y animales. En m uchos gcnomas mitocondriales protistas hay genes que codifican proteínas y que están implicados en la importación.

Laz0

;.

C03 ' ¡. ATPasa6 ~...... _ ATPasa8 C02

~

1

N02

C01

Genes de RNAt Regiones codificadoras ~ I nd ica la dirección del gen, de 5' a 3' CO: citocromo oxidasa NO: NADH deshidrogenasa

El DNA mitocondrial humano tiene 22 genes de RNAt y 13 regiones codificadoras de proteínas. Catorce de las 15 regiones codificadoras de proteínas o codificadoras de RNA se transcriben en la misma dirección. Catorce de los genes de RNAt se expresan en la dirección de las manecillas del reloj y ocho en dirección contraria.

reslringido de fu nciones. En los genomas rnitocondriales de los mamíferos, la organización es extremadamente compacta, no hay íntrones, de hecho, algunos genes se superponen, y casi cada par debases puede ser asignado a un gen . Con excepdón del lazo D, región implicada en el inido de la replicación del DNA, no puede considerarse que más de 87 de los 16 569 bp del gen orna mitocondrtal humano se encuen tren en regiones interdstrón.icas. Las secuencias de nucleótidos completas de los genomas mitocondriales de las células animales muestran una homología extensa en cuanto a organización. El mapa del genoma mitocondrial humano se resume en la . Hay 13 regiones codHkadoras de proteínas; todas éstas forman parte del mecanismo implicado en la respiración, entre otras, el dtocromo b, las tres subuuidades de la citocromo oxidasa, una de las subunidades de la ATPasa y siete un.idades (o proteínas asociadas) de la NADH deshidrogenasa. La discrepancia en el tamaño de los genomas mitocondriales de S. cerevisiae (84 kb), cinco veces más grandes que los de los mamíferos ( 16 kb), alerta ante el hecho de que debe haber una gran diferencia en su organización genética, a pesar de su función común. El número de productos relacionados con las funciones enzimáricas mitocondriales y sinte tizados de forma endógena parece ser similar. ¿El

Genes

RNAr 21§..---'+

TipOS

Codificadores de ANA ANAr 16S ANAr 23S RNAr 4.5S ANAr 5S ANAl

30-32

Expresión génica Protefnas r ANA polimerasa Otras

20- 21 3 2

1 '1

1 1

Funciones del cloroplasto Aubisco y lilacoides 31-32 NADH deshidrogenasa 11 Total

C01

Exones

Productos

lntrones

105-113

El genoma de los cloroplastos de las planta> terrestres codifica a cuatro moléculas de RNAr. 30 molécula~ de RNAt y -60 proteína s.

=

oli } subunidades de ATPasa sensible a la aap ollgomicina oxi = subunidades del citocromo e

box = citocromo b par =funciones desconocidas var =subunidad proteínica ribosómica pequeña

El genoma mitocondrial de 5. cerevisioe contiene genes codificadores de proteínas, genes de RNAr y genes de ~NAt interrumpidos y continuos (no se indican las posiciones) . ..as flechas indican la di rección de la transcripción.

31.aterial genérico adicional de las levaduras miro: ondriales representa a otras proteínas, quizá rela.:ionadas con la regulación, o no se expresa? El mapa de la representa al RNA -·rindpal y los productos proteínicos de la mitoconiria de la levadura, en el cual la característica más !lOtable es la dispersión de los loci. Los dos más promi nentes son los genes inte:rumpidos box (que codifican al citocromo b) y oxi3 que codifica a la subunidad 1 de la citocromo oxiiasa), que juntos son ¡casi ran largos como el geno""'1a mitocondrial entero de los mamíferos! Muchos .!e los inrrones largos de estos genes tienen marcos de .ccrura abiertos en registro con el exón precedente ·:éase la sección 27.5, Algunos intrones del grupo codHican endonucleasas que promueven la moviJad), fenómeno que agrega numerosas proteínas, '"Idas sintetizadas en cantidades bajas, al comple:::nemo de la mitocondria de la levadura. Los genes restantes son ininterrumpidos y co-:-esponden a otras dos subunidades de la citocro-:o oxidasa codificadas por la mitocondria, a la(s) Jbunidad(es) de la ATPasa y (en el caso del gen - rJ) a una proteína ribosómica mirocondrial. Es co probable que el número total de genes mitondriaJes de las levaduras exceda de -25.

El genoma de los cloroplastos codifica a numerosas proteínas y moléculas de RNA Conr.epto principill • Los genomas de los cloroplastos varian en cuanto a tamaño, pero son lo suficientemente grandes como para codificar de 50 a 100 proteínas, asl como a los RNAr y los RNAt.

¿Qué genes ponan los cloroplasws? Las moléculas de DNA de los cloroplastos varían en longitud de 120 a 190 kb. Los genomas secuenciados de doroplastes (> 1O en total) tienen de 87 a 183 genes. En la se resumen las funciones codificadas por el genoma de los cloroplastos de las plantas te rrestres. Hay más variaciones en los geno mas de los cloroplastos de las algas. En general, la situación es similar a la de las mirocondrias, excepto que hay más genes implicados. El genoma del cloroplasto codifica a todas las especies de RNAr y de RNAt necesarias para la síntesis de proteínas. El ribosoma incluye dos moléculas de RNAr pequeñas, además de las especies principales_ El conjunto de RNAt puede incluir todos los genes necesarios. El genoma de los cloroplastos codifica a -50 proteinas. incluidas la RNA polimerasa y las proteínas ribosórnicas. También en este caso, la regla es que los genes de Jos organelos son transcritos y traducidos por el mecanismo del organelo. Cerca de la mitad de Jos genes de los cloroplastos codifican a proteínas implicadas en la síntesis de proteínas. El origen endosimbiótico de los cloroplastos resalta por las relaciones entre estos genes y sus

4. 12 EL genoma de los cloroplastos codi fica a numerosas proteínas y moléculas de RNA

71

contrapartes en las bacterias. La organizadón de Jos genes de RNAr en particular está íntimamente relacionada con la de una cianobacteria, la cual define con mayor precisión al último ancestro común de doroplasros y bacterias. Intrones y cloroplastos caben en dos clases generales; los que se encuentran en los genes de RNAt suelen estar en el lazo anticodón (aunque no inevitablemente), como los intrones localizados en los genes de RNAt nucleares de las levaduras (véase la sección 26.14, El corte y empalme del RNAt de las levaduras implica procedimientos de cotte y empalme). Los intrones localizados en los genes codificadores de proteínas se asemejan a los de los genes mitocondriales (véase Cap. 27, El RNA catalítico), por Jo que el evento endosimbiótico se ubica en un periodo de la evolución anterior a la separación de las procariotas con genes ininterrumpidos. La función de los doroplastos es la fotosíntesis. Muchos de sus genes codifican a proteú1as de Jos complejos localizados en las membranas de los rilacoides, cuya constitución muestra un balance diferente del de los complejos rnitocondriales. Si bien algunos de estos complejos son similares a los mitocondria les debido a que algunas subuni.dades son codificadas por el genoma de tos organelos y oLras por el nuclear, otros complejos de doroplastos son codificados completamente por un genoma.

Las mitocondrias evolucionaron por endosi mbiosis ¿Cómo evolucionó una situación en la cual un organelo contiene información genética para algunas de sus funciones, mientras que otras son codificadas en el núcleo? En la se ilustra e l modelo de ta endosimbiosis de la evolución de las mitocondrias, durante la cuaL células primitivas capnnaron a bacterias que proporcionaron las funciones y las es[ructuras que evolucionaron hacia mitocondrias y ctoroplastos, En ese momento. el proto-organelo debe haber contenido todos los genes necesarios para especificar sus funciones. Las homologías secuenciales sugic1;en que mitocondrias y cloroplastos evolucionaron separadamente a partir de linajes comunes a las eubacterias, pero las mitocond.rias comparten su origen con las bacterias púrpura a y los clorop lastos, con las cianobacterias. Entre las bacterias, el pariente de las mitocondrias más cercano que se conoce es Rickettsia (agente causal de tifus), parásito intracelular obligado gue probablemente desdende de bacterias de vida libre, hipótesis que refuerza la idea de que las mirocondrias se originaron en un evento endosim72

CAPÍTULO 4 El contenido del genoma

Bacteria

Célula primitiva

Endosimbíosis

La bacteria evoluciona y se transforma en una mitocondria, de modo que pierde genes necesarios para la vida independiente Los genes son transferidos de la rnitocondria al núcleo

Las mitocondrias se originaron por un evento endosimbiótico en el cual una bacteria fue capturada por una célula eucariótica.

biótico en que también estuvo lnvolucríldO unancestro común. Deben haber ocurrido dos cambios, conforme las bacterias se integraron en la célula recipiente y evolucionaron hacia mitocondrias (o cloroplastas). Los organelos tienen mucho menos genes que una bacteria independiente y han perdido muchas de las funciones _gén.icas necesarias para la vida independiente (como las rutas metabólicas) . La mayoría de los genes que codifican funciones de los organelos se localizan de hecho en el núcleo, por lo tanto, estos genes deben haber sido transferidos ahí desde el organelo. La Lransferencia de DNA entre organelo y núcleo ha ocurrido a lo largo de la evolución, y aún continúa. La velocidad de transferencia puede medirse directamente al inLroducir en un organelo un gen que sólo puede funcionar en el núcleo, porque, por ejemplo, contiene un intrón nuclear o la proteína debe funcionar en e l citosoL Respecto de la provisión del material necesario para la evolución, la veloddad de transferencia del organelo al núcleo equivale aproximadamente a la de una mutación génica única. El DNA introducido en las mitocondrias

es transferido al núcleo a una tasa de 2 x 10-> por generación. los experimentos para medir la transfe:-encia en dirección opuesta, del núcleo a la rrútoconjria, sugieren que la tasa es mucho más baja, . Obviamente, la transferencia de un gen de un "'rgan elo al núcleo requiere de movimiento físico ;el DNA, pero la expresión exitosa también implica .:ambios en la secuencia codificadora. Las proteínas je organelos codificadas por genes nucleares tienen ~ecuenci as especia les que les permiten ~e r importa:!as al interior de l organe\o después de ha ber sido ~:n t e tizadas en el citoplasma (véase la sección 10.16, :a inserción postransduccional de la membrana de~nde de secuencias líder). Estas secuencias no son -ecesarias para las proteínas sintetii'adas dentro del rganelo. Quizá el proceso de transferencia e[ec: va de genes tuvo lugar en un periodo en el cua 1 r.; compartimientos se definían de forma menos -!gida, de modo que era más fácil que se reubicara ::. DNA y que las proteínas se incorporaran en el •rganelo, independientemente del sitio en que se s.ntetizaran. Los mapas filogenéticos muestran que las trans~rendas de genes han sido mdepen
Resumen ..as secuencias de DNA que componen a un genoma -:Jcariótico pueden ser clasificadas en tres grupos: • secuencias no repetitivas únicas; • secuencias moderadamente repetitivas que se dispersan y repiten pocas veces respecto de copias no idénticas; • secuencias muy repeütivas, que son conas y suelen repetirse tn forma de secuencias en tándem. Las proporciones de los tipos de seruendas son ::.;racterísricas de cada genoma, aunque más exten-

sos tienden a tener una proporción menor de DNA no repetitivo. Aproximadamem~ el 50% del genoma humano consta de secu~ncias repetitivas, y la vasta mayoría corresponde a secuencias de transposones. La mayoría de lo!> genes estructurales se localiza en el DNA no repetitivo. La cantidad de DNA no repetitivo refleja rr.ucho mejor la complejidad del organismo que el tamaño total del genoma; la mayor cantidad de DNA no repelitivo en los geno mas es -2 x 109 bp. La herencia no mendeliana se explica por la presencia de DNA en organelos del citoplasma. Las mitocondrias y los cloroplastos son sistemas delimi · tados por membranas en los cuales algunas proteínas son sintetizadas en el organelo, mientras que orras son importadas. En genera l, el genoma de Los o rganelos es una molécula ci rcular de DNA que co· dífica a todas las moléculas de RNA y a algunas de las proteínas rcq ueridas por el organelo. Los genomas m itocondriales varían enorme· mente de tamaño, de 16 kb en e l genoma mini· roalista de Jos mamíferos, a 570 kb en el de plan · tas superiores. Los gcnomas más grandes pueden codificar funciones adicionales. Los genomas de los cloroplastos fluctúan entre 120 y 200 kb; en los secuenciados, la organización y las funciones codi· ficadoras son similares. En las mitocondrias y los cloroplasto!i, muchas :::le las proteínas principales conrienen algunas subunidades sintetizadas en el organelo y otras importadas del citosoL En la~ levaduras, las reestructuraciones son muy frecuentes en el DNA mllocondrial, y se ha encontrado recombinación entre los genomas mitecondriales o los genomas de los cloroplastos. Se han observado transferencias de DNA entre los genomas de los cloroplastOs o de las mítocondrias y los genomas nucleares.

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Los genes pueden ser aislados por la conservación de los exones

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llliJ

Los genomas de los organelos son moléculas circulares de DNA que codifican proteínas de los orgaoelos

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IIJ

Los genomas eucarióticos contienen secuencias de DNA repetitivas y no repetitfvas

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74

CAPÍTULO 4 El contenido del genoma

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•

El genoma de los cloroplastos codifica a numerosas protelnas y moléculas de RNA

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Referencias

75

Secuencias genómicas y números de genes ESQUEMA DEL CAPÍTULO

/

\

Introducción El número de genes bacterianos abarca un rango de un orden de magnitud Se conoce el número total de genes de numerosas eucariotas

se añaden genes adicionales para fo rmar eucariotas. organismos multlcelulares, animales y vertebrados. • La mayoría de los genes únicos de los vertebrados están relacionados con el sistema nervioso o el inmunológico.

U . ¿Cuántos genes son esenciales? • No todos los genes son esenciales. En las levaduras y las moscas, las deleciones de <50% de los genes tienen efectos detectables. Cuando dos o más genes son redundantes, una mutación en cualquiera de ellos puede no tener efectos detectables. • No se sabe porqué sobreviven los genes que aparentemente son prescindibles en el genoma.

• Hay 6 000 gene.s en una levadura; 18 500 en un gusano; 13 600 en una mosca; 25 000 en la pequeña planta Arabidopsis y, probablemente de 20 000 a 25 000 en el ratón y el hombre.

¿Cuántos tipos diferentes de genes hay? El genoma humano tiene menos genes de los esperados • Sólo 1"fo del genoma humano está formado por regiones codificadoras. • Los exones forman -5% de cada gen, por lo tanto, los genes (exones más intrones) constituyen -25% del genoma. • El genoma humano tiene de 20 000 a 25 000 genes. • -60% de los genes humanos son sometidos a corte y empalme alternativo. • Hasta el 80"/o de los cortes y empalmes alternativos cambian la secuencia protelnica, de manera que el proteoma tiene -so ooo a 60 ooo miembros.

¿Cómo se distribuyen los genes y otras secuencias en el genoma? • Las secuencias repetidas (presentes en más de una copia) representan >50% del genoma humano. • La mayor parte de las secuencias repetidas está formada por copias de transposones no funcionales. • Hay numerosas duplicaciones de extensas regiones cromosómicas.

-

El cromosoma Ytiene varios genes específicos de la masculinidad • El cromosoma Vtiene -60 genes que se expresan específicamente en los testículos. • Los genes espedficos de la masculinidad están en múltiples copias de segmentos cromosómicos repetidos. • La conversión génica entre copias múltiples permite el mantenimiento de los genes activos durante la evolución.

Las especies más complejas evolucionan agregando nuevas funciones génicas • la comparación de diferentes genomas muestra un incremento constante en el número de genes conforme

76

los genes se expresan en niveles muy diferentes • En una célula dada, la mayoría de los genes se expresa en niveles bajos. • Sólo un pequeño número de genes, cuyos productos son especializados para un tipo celular especifico. se expresan ampliamente.

¿Cuántos genes se expresan? • Los RNAm expresados en niveles bajos se superponen ampliamente en comparaciones de tipos de células. • las moléculas de RNAm abundantemente expresadas suelen ser especificas del tipo de célula. • - 10 000 genes expresados pueden ser comunes a la mayoña de los tipos celulares de una eucariota superior. ~

El número de genes expresados puede medirse en

masa • la tecnolog!a del chip permite tomar una instantánea de la expresión del genoma completo de una unidad celular de levadura. • -75% (-4 500 genes) del genoma de las levaduras se expresa en condiciones de cultivo normales. • La tecnología del chip permite comparar detalladamente células animales relacionadas para determinar (por ejemplo) las diferencias de expresión entre una célula normal y una cancerígena.

mi Resumen

1!1

Introducción

Desde que en 1995 se secuenciaron los primeros genomas, la velocidad y el rango de secuenciad óo han mejo rado exrraordinariamence. Los primeros genomas secuendados fueron genomas bacteria nos pequeños, de <2 Mb, hacia 2002, el genoma humano de 3 000 Mb había sido secuenciado. A la fecha se han secuenciado los genomas de una gran variedad de organismos, entre otros, las bacterias, las arqueobacterias, las levaduras, las eucariotas inferiores, las plantas y los animales, incluidos, en este último caso, gusanos, moscas. roedores y algunos mamíferos. Quizá la información más imporrante derivada de la secuencia de un geno m a sea el número de genes. Mycoplasma genitt1lium, bacteria intracelular obligada, tiene el gen oma más pequeño conocido de cualquier organismo, de sólo - 470 genes; elgenoma de las bacterias de vida libre osci la entre 1 700 y 7 500. Los genomas de las arqueobacterias abarcan un rango similar; los de las eucarioras unicelulares empiezan en aproximadamente 5 300 genes, en ran:o que los de gusanos y mostas tienen unos 18 500 ·.- 13 500 genes, respectivamente; sin embargo, ese número se incremema sólo a -25 000 en el ratón : el hombre. En la se resume el número mínimo je genes encontrado en seis grupos de organismos. ?ara formar una célula se necesitan -500 genes; -1 500 para una célula de vida libre; >5 000 para c~na célula con mkleo; > 10 000 para un organ.ismo :nulticelular y >1 3 000 para un organismo con sis:ema n ervioso, pero obviamente m ucbas especies "'uede n rener más del número mínimo necesario ")3ra su tipo, por lo que el número de gen es varía enormemente, aun entre especies íntimamente ree.cionadas. En las bacte ri as y las eucario tas inferiores, la -nayor ía ue los genes son ún icos, sin embargo, en os gcn omas de las eucariotas superiores, los genes "'Ueden dividirse en familias de miembros relaciona ::os. No hay duda de que a lgunos genes son únicos . ormalmeme La familia tiene un solo miembro). --ero muchos pertenecen a familias de diez o más ~iembros. El número de fami lias puede estar mejor : elacionatlo con la complej idad global del organis · :-10 que el n úmero de gene'>. Parte de la información más reveladora provie...e de la comparación de secuencias de genomas. :::on las secuencias del genoma humano y del geno~ a del chimpancé de que se dispone actualmente, ~posibl e empezar a abordar algunos de los aspecs de la interroga nte sobre qué bace (micos a los uman os.

500 genes Bacteria extracelular (parasitaria)

1500 genes Bacteria de vida libre

.,

5000 genes Eucariota unicelular

13 000 genes Eucarlota multlceluiar

25 000 genes Plantas superiores

25 000 genes Mamíferos

El número mínimo de genes requerido por cualquier tipo de organismo incrementa con su complejidad. Fotografía de bacteria extracelular cortesía de Gregory P. Henderson and Grant J . Jensen, California Institute of Technology. Fotografía de célula de vida libre cortesía de Karl O. Stetter, Universitat Regensburg. Fotografía de eucariota unicelular cortesía de Eishi Noguchi, Drexel University College of Medicine. Fotografía de eucariota multicelular cortesía de Carolyn B. Marks and David H. Hall, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY. Fotografía de planta superior cortesía de Keith Weller/USDA. Fotografía de mamífero o Photodisc.

El número de genes bacterianos abarca un rango de un orden de magnitud Los intensos estudios actuales han permitido la secuenciación de numerosos genomas, entre otros, los incluidos en la , en la cual se describe el tamaño de algunos de e llos, que va de 0.6 x 106 bp del micoplasma a 3.3 x 10 9 bp del genoma humano; se incluyen numerosos animales experimentales importantes, como la:. levaduras, la mosca de la fruta y un gusano nematodo.

5 2 El número de genes bacterianos abarca un rango de un orden de magnitud

77

:

Genomas

...... Loci letales

Especies

(Mb)

Genes

Mycop/asma genitalium

0.58

470

Rickettsia prowazekii

1. t t

834

Haemophilus influenzae

1.83

1 743

Methanoooccus ¡annaschii

1.66

1 738

B. subtilis

4.2

4 100

E. col/

4.6

4288

t 800

S. cerevlsiae

13.5

6 034

1 090

S.pombe

12 .5

4 929

A thaliana

119

25 498

O. saliva (arroz)

466

-30 000

D. melanogaster

165

13 601

C. e/egans

97

18 424

H. sapiens

3 300

-300

3 100

- 25 000

En numerosos organismos se conocen los tamaños de los genomas y los números de genes a partir de secuencias completas. Los loci letales se estiman a partir de bases de datos genéticos.

6 000 <1)


e:

~ 4000 2 000

/.

. 2

. 3

4

5

6

7

8

Tamaño del genoma (Mb) • Bacterias parasitarias obligadas Otras bacterias

• Archaea

El número de genes de los genomas de las bacterias y de las archaea es proporcional al tamaño del genoma.

Las secuencias de los genomas de las bacterias y de las arqueobacterias demuestran que virtualmente rodo el DNA (típicamente de\85 al 90%) codifica a moléculas de RNA o a proteínas. En la se observa que el rango de dimensiones de los genomas es aproximadamente de un orden de magnitud y que las del genoma son proporcionales al número de genes, que s uele tener una longitud aproximada de 1000 bp.

78

CAPÍTULO S Secuencias genómicas y números de genes

Todas las bacterias con genomas de me nos de 1.5Mb son parásitos inrracelu lares obligados, es decir, viven en un hospedador eucariótico que les proporciona moléculas pequeñas. Sus geno mas corresponden al número mínimo de funciones necesarias para construir una célula . El núm ero de todas las clases de genes es más reducido respecto de las bacterias con genomas más grandes, pero la reducción más significativa se observa en los loci que codifican a enzimas relacionadas con funciones metabólicas (que dependen principalmen te de la célula hospedadora ) y con la regulación de la expresión gén ica. Mycoplasma genitalium~ rienc el genoma más pequeño, formado por -470 genes. Las propiedades biológicas de las ard1aea están enn·e las de las procariotas y las de las eucadotas, no obstante, el tamaño de su genoma y el número de genes están en e l mismo rango que el de las bacterias. Dichas dimensiones fluctúan entre 1.5 y 3Mb, que corresponde a 1 500 a 2 700 genes . Methanococcus jannaschii es una especie productora de metano que vive en condiciones de alta p resión y alta temperatura, y el número total de genes que contiene es sim ilar al de Haemophilus ínjlue11Zae, aunque apenas unos cuantos pueden ser identificados comparándolos con genes conocidos de otros 01·ganismos. Sus mecanismos de expresión génica son más parecidos a los de las eucariotas que a los de las procarioLas, pero el mecanismo de división celular se asemeja más al de estas últimas. En las archaca y las bacterias de vida libre más pequeñas se identifica el número mínimo de genes necesarios para formar una célula susceptible de fundonar de manera independiente en el entorno; su genoma más pequeño tiene - 1 500 genes. La bacteria de vida libre con el genorna más pequeño conocido es el termófilo Aquifex aeolicus, que mide l. 5 Mb y tiene l 512 genes. Una bacteria gramnegativa "típica", R. injluenzae, tiene 1 743 genes, cada uno de -900 bp. Por ello, se puede concl uir que el número de genes necesarios para formar un organ ismo de vida libre es de - 1500. Las dimensiones de los geno mas bacterianos cubren más o menos un orden de magnitud, de 0.6 Mb a <8 Mb, y los más grandes comienen más genes. Las bacterias cuyos genomas son los más grandes, Sinorhizobiurn meliloti y Mesorl!izobium lotí, son bacLerias fijadoras de nitrógeno que viven en las raíces de las plantas. El tamaño de sus genomas (-7 Mb) y el número Lota! de genes (>7 500) son similares a los de las levaduras. El tamaño del gen oma de E coli es intermedio; la cepa común de laboratorio tiene 4288 genes y una longitud promedio de -950 bp; la separación promedio entre genes es de 118 bp. No obstante, puede haber diferencias muy significativas entre cepas: los

extremos conocidos van de 4.6 Mb y 4 249 genes de la cepa más pequeña, a 5.5 Mb y 5 361 genes de la más grande. Todavía se desconocen las funciones de todos los genes. En la mayoría de estos genomas, -60% de los genes pueden ser identificados con base en la homologación con genes conocidos de otras espedes, los cuales se disuibuyen más o menos de manera equ ivalente en clases cuyos productos se retadonan con el metabolismo, la estructura celular y el transpone de componentes, así como con la expresión génica y su regulación, si bien virtualmente a >25% de los genes es imposible atribuirle una función; muchos se encuentran en organismos relacionados, lo cual implica que se ha conservado la función. Por su importancia médica, se ha hecho énfasis en la secuen ciación de los genomas de las bacterias patógen as, y una perspectiva importante de la naturaleza de la patogenia proviene de la demostración de que las "islas de patogenicidad" son u n rasgo característico de sus genomas. Dichas "islas" son regiones extensas, de -1 O a 200 kb, presentes en :os genomas de especies patógenas, pero no en los genomas de las variantes no patógenas de la misma espede o de una especie relacionada. Su comeni do de G-C suele diferir del contenido del resto del 5enoma, y es probable que estas bases migren en:re bacterias merced a un proceso de transferencia ::torizomal. Por ejemplo, la bacteria que provoca el ~mrax (Bacillus anlhracis) tiene dos plásmidos (DNA extracromosómico) grandes, u no de los cuales tiene .ma isla de patogen icidad que incluye el gen codifi..:ador de la toxina del ántrax.

40 000

Arroz•

"' 30 000 Q) e

Q)

(!}

20 000

.. Ratón • Humano •

• Arabidopsis

• C. e/egans • D. melanogaster

10000 S. cerevisiae ' S. pombe 100

200

300

400

500

3000

Tamaño del genoma (Mb)

El número de genes de una eucariota varía de 6 000 a 40 000, pero no se correlaciona con el tamaño del genoma ni con la complejidad del organismo.

5% de los genes de S. cerewsiae tiene en promedio un intrón

1400 bp

t

Gen

200 bp

t

lntrones

~ 1 426 bp _

\

\ ..;;;_;..;;...;..;...;;._

43% de los genes de S. pombe tienen intrones El gen Interrumpido promedio tiene 2 introoes

El genoma de 5. cerevisiae, de 13.5 Mb, tiene 6 000 genes, casi todos interrumpidos. El genoma de 5. pambe, de 12.5Mb, tiene 5 000, de los cuales, casi la mitad tiene intrones. las dimensiones de los genes y el espaciamiento son bastante similares.

Schizosaccharomyces pombe. cuyas características más

En numerosas eucariotas se conoce el número total de genes ' Conceplo prindpal Hay 6 000 genes en una levadura; 18 500 en un gusano; 13 600 en una mosca; 25 000 en la pequeña planta Arabidopsis y, probablemente -25 000 en el ratón y el hombre.

7.;,n promo como se observan !os genomas euca..., "ricos, se pierde la relación entre su tamaño y el - jmero de genes. Los genomas de las eucariotas .:licelu lares están en el mismo rango de ramaño e los geno mas bacterianos más grandes. Las e u ca- ras superiores tienen más genes, pero el número se correlaciona con el tamaño del genoma, como ..:ede observarse en la La información más amplia sobre las eucario~ inferiores se relaciona con las secuencias de los -::-nomas de las levaduras Saccharomyces cerevi'siae y u

importantes se resumen en la . Los genomas de las levaduras de 12.5Mb y 13.5 Mb tienen -5 000 y -6 000 genes, respectivamente. El marco de lectura abierto (ORF, open readí11g frame) promedio mide - 1.4 kb, de manera que -70% del genoma lo ocupan regiones codificadoras. La diferencia principal entre estas cepas es que sólo el 5% de los genes de S. cerevisiae Liene ínrrones, respecto del 43% de los gene-s de S. pombe. La densidad de genes es alta, y la organización suele ser similar, aunque los espacjos entre los genes son un poco más conos en S. cerevisiae. Cerca de la mitad de los genes identificados por secuenciación ya se conocían o estaban relacionados con genes conocidos, los demás son nuevos, indicio del número de tipos nuevos que pueden ser descubiertos. La identificación de marcos de lectura extensos con base en la secuencia es muy precisa, pero los ORF que codifican a <1 00 aminoácidos no pueden ser identificados únicamente mediante secuencia ci6n por la elevada incidencia de falsos positivos. El -·~

En numerosas eucariotas se conoce el número total de genes

79

,

Manipulación del DNA

Transcripción ,-:¡ Estructura proteínica Ciclo y muerte celular "'! Citoesqueleto

Enzimas :: Transducción de señal • Adhesión celular ""1 Transportadores/ canales :::1 Desconocida

~20% de los genes de Drosophila codifican a proteínas implicadas en el mantenimiento o la expresíón de los genes; -20% codifican a enzimas y <10% a proteínas relacionadas con el ciclo celular o con la transducción de señal. La mitad de los genes de Drosophilo codifican a productos cuya función se desconoce.

análisis de la expresión génica sugiere que de -300 a 600 de dichos ORF en S. cerevisíae tienden a ser genes genuinos. Una forma eficaz de validar la estructura génica consiste en comparar secuencias de especies íntimamente relacionadas; si ungen está activo, es probable que se conserve. La comparación de las secuencias de cuatro especies de levaduras íntimamente relacionadas sugiere que 503 de los genes originalmente identificados en S. cerevisiae no tienen contraparte en las otras especies y, por lo tanto, deberían ser eliminadas del catálogo, con lo cual, el número total de genes para S. cerevisíae se reduce a 5 726. El genoma del DNA de Camorhabditis elegans varía entre regiones ricas en genes y otras en las cuales escasean. La secuencia tOlal contiene -18 500, pero sólo -42% tiene contrapartes putativas fuera de los nematodos. Aunque el genoma de la mosca es más grande que el del gusano, D. melanogaster tiene menos genes ( 13 600), y como resultado del corte y empalme aJternat:ivo, el número de transcritos diferentes es ligeramente mayor (14 100) . No se sabe porqué la mosca, que es un organismo mucho más complejo, tiene sólo el 70% de genes del gusano, lo cual subraya enfáticamente la falta de una relación exacta entre el número de genes y la complejidad del organismo. El tamaño del genoma de la planta Arabidopsis thaliana está entre el del gusano y el de la mosca, pero su número de genes es mayor (2 5 000), fenómeno que demuestra nuevamente que no hay una relación clara y subraya también la ca lidad especial de las plantas, que pueden tener más genes (debido a duplicaciones ancestrales) que las células animales. Gran parte del genoma de Ara,bidopsis se encuentra en segmentos duplicados, lo cual sugie 80

CAPÍTU LO 5 Secuencias genómicas y números de genes

re que bubo una duplicación ancestral del genoma (para dar lugar a un tetraploide); sólo el 3 5% de los genes de Arabidopsis son copias individuales. El genoma del arroz (Oryza sativa) es -4 veces más grande que el de Arabidopsis, pero el11úmero de sus genes es sólo - 50% mayor, probablemente -40 000. El DNA repetitivo ocupa del 42 al 45 1Vo del genoma. Más del 80% de los genes encontrados en Arabidopsis están representados en el arroz, y de estos genes comunes, -8 000 se encuentran en Arabidopsis y en el arroz, pero no en los genomas bacterianos o animales que han sido secuenciados. Éste es probablemente el conjunto de genes que codiJica funciones espedficas de las plantas, como la fowsíntesis. A parrir del genoma de la mosca es posible darse una idea de cuantos genes están dedicados a cada tipo de función. En la se dividen las funciones en categorías diferentes. Emre los genes identificados, se encuentran 2 500 enzimas, -750 factores de transcripción, -700 transportadores y canales de iones y -700 proteínas implicadas en la transducdón de señales. Poco más de la mi tad de los genes codifica a productos de función desconocida. Aproximadamente el 20% de las proteínas reside en las membranas. El tamaño de las proteínas se incremema de las procariotas y las archaea, a las eucariotas. El tamaño promedio de las proteínas de la archa ea M. ja¡maschii y la bacteria E. coli fluctúa entre 287 y 317 ami noácidos, respectivamente, mientras que S. cerevisiae y C. elegans lienen longitudes promedio de 484 y 442 aminoácidos. respectivamente. Las proteínas grandes (de 500 aminoácidos) son raras en las bacterias, pero constituyen un elemento importante (-1 /3) de las eucariotas. El incremento de longitud se debe a la agregación de dominios adicionales, cada uno de los cuales constiruye de 100 a 300 aminoáddos; no obstame, el mayor tamaño de las proteínas causa sólo una parte muy pequeña del incremento del tamaño del genoma. Otra perspectiva del n(Jmero de genes se obtiene al conrar el número de genes expresados. Basándose en las estimaciones del número de especies de RNAm que pueden contarse en una célula, se puede concluir que una célula promedio de un organismo vertebrado expresa de -lO 000 a 20 000 genes. Las significativas superposiciones entre poblaciones de mensajeros en diferemes tipos de células sugerirían que el número tota l de genes expresados en el organismo debería rebasar por poco esa cantidad. La estimación de 20 a 25 000 para el rotal del genoma humano (véase la secdón 5.5, El genoma humano tiene menos genes de los esperados) implicaría que una propordón significativa del nt'1mero total de genes de hecho se expresa en cua lquier célula dada.

Los genes eucarióticos se transcriben de manera individuaL y cada uno produce un mensajero monodsLrónico, y sólo hay una excepción general a esta !'egla: en el genoma de C. elegans, - 1 5% de los genes ~sLán organizados en unidades policisLrónicas (asodadas con el uso del empalme en trans para permitir la expresión de los genes en cascada en estas unidades; véase la secdón 26. 13, Las reacciones de empal;ne en trans utilizan molécu las pequeñas de RNA).

2S 000 ~ 20 000 e

:

e

totales Familias dislíntas

15 000 1

Q)

111

-~ 10 000

¿Cuántos tipos diferentes de genes hay?

Algunos genes son únicos, en tanto que otros pene:~ecen a familias cuyos miembros están relacionados pero usualmente no son idénticos). La proporción Je genes ún icos se reduce con el tamaño del ge~oma y la propordón de genes en fami lia se in~ementa. El número mínimo de familias de genes "lecesa rio para codificar a una bacteria es > 1 000, ..J na levadura, >4000 y una eucarioLa superior, de .l 000 a 14000. Algunos genes están presemes más de una vez se relacionan entre sí, de modo que el número :e tipos de genes es menor q1Je el número tOtal de ;enes. El número total de genes se puede dividir :., conjuntos cuyos miembros están relacionados, egú n se define al comparar sus exones. (Una fa-nilia de genes surge por la duplicación de un gen .=.:1cestral seguida de la acumulación de cambios de ecuencia entre copias. Es muy frecuente que los ""lliembros de una familia estén relacionados, pero o son idénticos.) El número de Lipos de genes se ..:alcula sumando el número de genes únicos (para 's cuales no hay otro gen relacionado) al número -e fami lias que tienen dos o más miembros. En la se compara el nC1mero toral de ~enes con el número de familias d istintas de cada "''O de seis genomas. En las bacterias. la mayoría de ~genes son únicos, así que el número de familias -stintas se acerca al número total de genes. La si .!adón es diferente incluso en la eucariota inferior - :erevisiae, en la cual hay una proporción significaa de genes repetidos. El cfccro más sobresaliente - que el número de genes se incrementa abrup.l.•nente en las eucariotas superiores, no así el de '..l!TliHas, que no cambia considerablemente. En la se demuestra que la proporción ..e genes únicos disminuye bruscamente con el ta.-año del genoma. Cuando los genes se presentan -oo: familias, el número de miembros de una familia · reducido en las bacterias y las eucarioras inierio-->.pero aumenta en las eucariotas superiores. Gran :.ne del tamaño adicional del genoma de Arnbidop· se debe a familias de >4 miembros.

z

sooo

Numerosos genes están duplicados, de modo que el número de familias es mucho menor que el número total de genes. En el histograma se compara el número total de genes con el número de familias de genes

Genes únicos

Familias Familias de 2-4 de>4 miembros miembros

H. influenzae

89%

10%

1%

S. cerevisiae

72%

19%

9%

D. melanogaster

72%

14%

14%

e e/egans

SS%

20%

26%

A. thal1ana

3S%

24%

41%

La proporción de los genes presentes en múltiples copias se incrementa con el tamaño del genoma en las eucariotas superiores.

Si todos los genes se expresan, el número total representada el número total de proteínas necesarias para constituir el organismo (proteoma), sin embrago, dos efeaos significan que el proreoma es diferente del número rotal de genes. Por una parte, los genes están duplicados, y como resultado, algunos codifican a la misma proteína (aunque puede expresarse en un tiempo o lugar diferente) y otros pueden codificar a prmeínas relacionadas que, nuevamente, tienen la misma función en difereiHes tiempos y lugares. El proteoma puede ser más grande que e l número de genes porque algunos pueden produdr más de una prOLeína mediante corte y empalme alternativo. ¿Qué es el proteoma fundamentaL el número básico de tipos diferentes de proLeínas del organismo? El número de familias de genes proporciona 5•.:. ¿Cuántos tipos diferentes de genes hay?

81

80%

60%

40%

20%

Comunes a todas las eucariotas

Adicional en Específicas eucariotas del género multícelulares

El genoma de la mosca puede dividirse en genes que podrían estar presentes en todas las eucariotas, en genes adicionales que probablemente están en todas las eucariotas multicelulares y en genes más específicos de subgrupos de especies incluidas las moscas.

un mínimo estimado, 1400 en las bacterias, >4 000 en las Jc:vaduras y 11000 a 14000 en la mosca y el gusano. ¿Cuál es la distribución de l proteoma entTe ti~ pos de proteínas? Las 6 000 proteínas del proteoma de las levaduras incluyen 5 000 proteínas solubles y 1 000 transmembrana; aproximadamenle la mitad son citoplásrnicas, un cuano se encuentran en el nucleolo y el resto se dividen entre las mitocondrias y el retículo endop!ásmico (ER, endoplasmic reticulum)laparato de Golgi. ¿Cuántos genes son comunes a todos los organismos (o a grupos como las bacterias o las eucariotas superiores) y cuántos son específicos de cada tipo de organismo? En la se resume la comparación entre levaduras, gusanos y moscas. Los genes que codiftcan a proieínas correspondientes en diferentes organismos se denominan ortólogos. Ftmcionalmente, suele considerarse que dos genes que se encuentran en organismos diferentes pueden realizar funciones corresponclientes si sus secuencias son similares en >80°/o de la longitud. Con base en este criterio, -20% de los genes de la mosca tienen onólogos en las levaduras y los gu sanos, genes que probablemente sean necesarios para todas las eucariotas. La proporción se incrementa a 30% cuando se compara a moscas y gusanos, lo cual probablemente represema la suma de las funciones génicas comunes a las eucariotas multicelulares. Esto aún deja m1a gran proporción de genes como codificadores de proteínas necesarias especlftcament.e para las moscas o los gusanos, respectivamente. El proteoma puede deducirse a partir del número y las estructuras de los genes, y también medir82

CAPÍTUlO 5 Secuencias genómicas y números de genes

se directamente al analizar el contenido proteínico r.otal de una célula o uo organismo. Medianr.e dichas metodologías se ha identificado a a lgunas proteínas no sospechadas con base en el análisis del geno01a, lo cual ha conducido a la identificación de genes nuevos. Para el análisis a gran escala de las proteínas se utilizan numerosos méLOdos. La espectrometría de masas permite separar e identificar proteínas en una mezcla obtenida directamente de células o tejidos. Las proteínas híbridas etiquetadas pueden obtenerse por expresión de moléculas de DNAc creadas al ligar las secuencias de los ORF con vectores de ~:xpresión apropiados que incorporan a las secuencias por etiquetas de afinidad, lo cual permite utilizar el análisis de matriz para evaluar los productos. Estos métodos también pueden ser efectivos para comparar proteínas provenientes de dos tejidos, por ejemplo, un tejido de uo individuo sano y el de un enfenno, para determinar con precisión las diferencias. Una Ve7. que se conoce el número total de proteínas, e.ntonces se puede preguntar cómo interactúan. Por definióón, las proteínas que se encuentran en ensambles estructurales de proteínas múltiples deben formar interacciones estables entre ellas, pero las proteínas de las rutas de señalización interactúan de man era transitoria. En ambos casos, clichas interacciones pueden detectarse en sistemas experimentales en que un sistema de lectu ra amplía esencialmente el efecto de la interacción. Un sistema popular es el de dos híbridos, a nalizado en la sección 25. 3, Los dominios independientes se unen al DNA y activan la transcripción. Dichos sistemas no detectan a todas las interacciones: por ejemplo, si en una ruta metabólica una enzima libera a un metabolito soluble que interactúa posteriormente con la siguiente enzima, las proteínas pueden no interactuar de forma directa. En términos práclícos, los análisis de interacciones en pares pueden indicar el número mínimo de esLrllcturas independientes o rutas. Un análisis de la capacidad de las 6 000 proteínas (pronosti cadas) de las levaduras para interactuar en pares muestra que - 1 000 pueden unirse cuando menos a oll'é~ proteína. Mediame análisis directos de forma ción de complejos se han identificado 1440 proteínas diferentes en 232 complejos multiproteínicos. Éste es el principio de un análisis que conducirá a la definición del número de ensambles funcionales o rutas. En un análisis comparable de 8 100 proteínas humanas se identificaron 2 800 interacciones, pero es más difícil de interpretar debido a las mayores dimensiones del proteoma. Además de los genes funciona les, hay copias de genes que se han tornado no fu ncionales (identificados como tales por interrupciones de sus secuencias

.:edificadoras de proteínas) y que se conocen como 5eudogenes (véase la sección 6.6, Los seudogenes 5on callejones sin salida de la evolución), cuyo número puede ser alto. En el genoma del ratón y el humano, el número de seudogenes es -10% del número de genes (potencialmente) activos (véase :a sección 4.8, La conservación de la organización del genoma ayuda a identificar genes). Además de la necesidad de conocer la densidad J e los genes para estimar el número total de éstos. ~e impone preguntar ¿cuál es su importancia?; ¿qué -estricciones estructurales hacen necesario que es: tn espaciados, y si esto contribuye al gran Lamaño .!e los genomas eucarióticos?

m

El genoma humano tiene menos genes de los esperados

Conceptos principales • Sólo 1% delgenoma humano está formado por regiones codificadoras. • Los exones forman -5% de cada gen, por lo tanto, los genes (exones más intrones) constituyen -25% del genoma. • El genoma humano tiene de 20 000 a 25 000 genes. • -60% de los genes humanos son sometidos a corte y empalme alternativo. Hasta el SO"'o de los cortes y empalmes alternativos cambian la secuencia proteínica. de manera que el proteoma tiene -so 000 a 60 000 miembros. !:. genoma humano Iue el primer genoma de los ~gan ismos vertebrados en ser secuenciado. Esta -·- 1rme tarea ha revelado información vali osa res· :-.:to de la composición genética de nuestra especie de la evolución del genoma en general, además . que los conocimientos se han profundizado por · .:apacidad de comparar la secuencia del genoma • •mano con el genorna del ratón. secuenciado más • .:ientemente. El genoma de los mamíferos y el de los roe - res generalmente se encuentran en un rango de n ensiones estrecho, -3 x 109 bp (véase la sección - 5 ¿Por qué los genomas son tan grandes?). El .:.oma del ratón es -l4% más pequeño que el hu· 3'10, probablemente porque ha tenido una tasa de ::.~ción más aha. Los genomas contienen familias ::: _5enes y genes similares, y de éstos, la mayoría ... ~e un ortólogo en el otro genoma. pero con dile. •das en el número de miembros de una familia. ~.:ialmente en los casos en que las funciones son .(íficas de cada especie (véase la sección 4.8, La -servadón de la organización del genoma ayuda -entificar genes). Ahora se cree que el genoma

Todos los genes 30000 [ 25 000

Codificadores de ANA

• Genes

Seudogenes

1000

20000

800

15 000

. 600

10 000

400

5000

200

El geno ma del ratón tiene -30 000 genes codificadores de proteínas, los cuales tienen -4 000 seudogenes. Hay -1600 genes codificadores de RNA. Los datos de los genes codificadores de RNA se esquematizan a la derecha. en una escala ampliada, para demostrar que hay -800 genes de RNAr, -450 genes de RNAt. -150 seudogenes y -350 genes misceláneos no codificadores de RNA, incluidos RNAsn y RNAmi.

del ratón. del cual originalmente se pensó que tenía -30 000 genes. tiene casi el mismo número de genes que el genoma humano. de 20 000 a 25 000, En la se representa la distribución de los genes del rarón. Los 30 000 genes codificadores de proteínas están acompai1ados por -4000 seudogenes. Hay -800 genes que representan a moléculas de RNA que no codifican proteínas, Jos cuales generalmenre son pequeños (excepto las mo léculas de R.NA ribosómico). Aproximadamente la m itad de estos genes codifican a RNA de transferencia, para los cuales también ha sido idt:ntHicado un número importante de scudogenes. El genoma humano (haploidc) contiene 22 autosomas más el cromosoma X y el Y. El tamaño de los cromosomas varía de 45 a 279Mb de DNA, que resulta en un contenido total del genoma de 3 286 Mb (- 3. 3 x 109 bp). Con base en la estructura cromosómica. el genoma total puede dividirse en regiones de eucromatina (que contienen potencialmente genes activos) y de heterocromatina (véase la sección 28.7, La cromatina se divide en eucroma üna y en heterocromatina). La eucromatina com prende la mayor parte del genoma, -2.9 x 109 bp. la secuencia identificada del genoma representa -90% de la eucromatina. Además de propordonar información sobre el contenido genético del genoroa, la secuencia también identifica caracterísl icas que pueden ser de importancia estructural (véase la sección 28.8, Los cromosomas tienen patrones de diStribución en bandas). 5. 5 EL genoma

humano tiene rnenos genes de los esperados

83

En la se muestra que una pequeña proporción (- l%) del genoma humano es representada por exones que, de hecho, codifican a proteínas. Los intrones que constiLUyen las secuendas restantes en los genes llevan el total del DNA implicado en la producción de proteínas a -25 por ciento. Como se observa en la . el gen humano promedio tiene una longitud de 27 kb, con nueve exones que incluyen una secuencia codificadora total de 1 340 bp. La secuencia codif1cadora promedio representa, por lo tanro, sólo el 5% de la longitud del gen. Dos esfuerzos independientes de secuenciar e l genoma humano resultaron en estimados de -30 000 y 40 000 genes, respectivamente. Una forma de determinar la predsión de los análisis consiste en averiguar si identifican a los mismos genes, y la sorprendente respuesta es que la superposidón entre uno y otro conjunto de genes es de sólo -50%, como se resume en la . En un análisis anterior del conjunto de genes humanos, basado en transcritos de RNA, se identificaron -1 1 000 genes,

de los cua les casi todos está n en los dos grandes conjuntos de genes humanos y representan la mayor parte de la superposición entre ellos. Así pues, no hay duda de la autenticidad de la mitad de cada conjunto de genes humanos, pero todavía se tiene qu e establecer la relación entre la mitad restante de cada uno de los conjuntos. ¡Las discrepancias ilustran los riesgos del aná lisis de secuencias a gran escala! Conforme se analiza la secuencia (Y conforme son secuenciados otros genomas con los que puede ser comparada), el número de genes válidos parece decUnar. de modo que ahora suele pensarse que son ~20 000 a 25 000. Sea como sea, el número total de genes humanos es mucho menor de lo esperado; la mayor pane de las estimaciones anteriores a la secuenciación del genoma fueron de - 100 000. El número co~al de genes muestra un incremento relativamente pequeño respectO de las moscas y los gusanos (13 600 y 18 500, respectivamente), s.in mencionar a la planra Arabidopsis (25 000) (véase la Fig. 5.2). Sin embargo, no debe sorprender la noción de que no se necesita un gran número de genes adicionales para formar un organismo más complejo. la diferencia de las secuencias de DNA del nombre y el chimpancé es extremadamente pequeña (la similitud es >99%), de modo que es obvio que las funciones y las interacciones entre un conjunto simi lar de genes pueden producir resultados muy d.i(erentes. Las fw1dones de grupos específicos de genes pueden ser especialmen· te imponantes, debido a que comparaciones detalladas de genes onólogos en el hombre y el chimpancé sugieren una evolución acelerada de dertas dases de genes, incluidas algunas implicadas en el desarrollo temprano, el olfato, la audición, todas [unciones relativamente específicas de las especies. El número de genes es menor que el número de proteínas potenciales debido al corte y empalme alternativo, cuya extensión es mayor en el hombre que en las moscas o los gusanos y puede afectar hasta el 60% de los genes, de manera que el incremen-

ONA repetitivo

Exones :

1%

lntrones = 24%

Otro DNA intergénico

Los genes ocupan el 25% del genoma humano, si bien las secuencias codificadoras de proteínas son sólo una pequeña parte de esta fracción .

7 exones internos de una longitud promedio de 145 bp

L

~

~

~

~

l

~

l

2

3

4

5

6

7

8

5' UTR "' 300 bp

lntrón promedio =3 365 bp

j

9

3' UTR = 770 bpj

El gen humano promedio tiene una longitud de 27 kb y nueve exones, de los cuales, dos suelen ser más largos y estar en cada extremo, y siete exones internos. Las UTR de los exones terminales son regiones no t raducidas (no codificadoras) localizadas en cada extremo del gen. (Estos datos se basan en el promedio. Algunos genes son extremadamente largos, de modo que la mediana de la longitud es de 14 kb, con siete exones.) 84

CAPÍTU LO 5 Secuencias genómicas y números de genes

Superpuestos Totales 39 114

15852

Genes ya

Transposooes =45%

Totales 29 691

Duplicaciones grandes = 5% Repelíciones simples =3%

COOOCidOS

Otro DNA intergénico =22% Los dos conjuntos de genes identificados en el genoma humano se superponen sólo parcialmente, como se muestra en los dos círculos grandes de la parte superior. no obstante, éstos incluyen casi todos los genes previamente conocidos, como lo demuestra la superposición con el circulo inferior más pequeño.

de tamaño del proteoma humano en relación con el de otras eucariotas puede ser mayor que el incremenlo en el número de genes. Una muestra de genes provenientes de dos cromosomas sugiere que la proporción de eones y empalmes alternativos, que de hecho resultan en cambios en las secuencias de las proteínas, puede ser hasta del 80 por ciento, !o cual puede incrementar el tamaño del proteoma a 50 000 a 60 000 miembros. Sin embargo, en cuamo a la diversidad del número de familias de genes. la discrepancia enue el hombre y otras eucariotas puede no ser tan grande. Yluchos de los genes humanos pertenecen a fami:ias: en un análisis de -25 000 genes se identificaron 3 500 únicos y lO 300 pares . Como puede observarse en la Figura 5.7, es1o se extrapola a un número de familias de genes sólo un poco mayor que en los gusanos o las moscas. lO

111

¿Cómo se distribuyen los genes y otras secuencias en el genoma?

Concept•>s principales • Las secuencias repetidas (presentes en más de una copia) representan >50% del genoma humano. • la mayor parte de las secuencias repetidas está formada por copias de transposones no funcionales. • Hay numerosas duplicaciones de extensas regiones cromosómicas.

.:Los genes se distribuyen uniformemente en el genoma? Algunos cromosomas cuentan con pocos

Exones-1%

lntrones = 24%

El componente más grande del genoma está formado por transposones. Otras secuencias repetitivas incluyen duplicaciones extensas y repeticiones sencillas.

genes y >25% de sus secuencias son "desiertos", o regiones de más de 500 kb en las que no hay genes. hasta> lO% de las secuendas de los cromosomas con más genes lo son. Así, en total, -20% del genoma humano consiste en desiertos carentes de genes. las secuencias repetitivas representan a >50% del genoma humano, como se observa en la . Las secuendas repetitivas se agrupan en cinco clases: • Los uansposones (activos o inactivos) constituyen la gran mayoría (45% del genoma); todos se encuentran en múltiples copias. • Los seudogenes procesados (-3000, constituyen -0. 1% del DNA total). (Son secuencias que surgen por inserción de una copia de u na secuencia de RNAm en el genom a; véase la secdón 6.6, Los seudogenes son los callejones sin sali da de la evolu ción.) • Repeticiones de secuencias simples (DNA muy repetitivo, como el (CA)n que representa -3%). • Las duplicaciones segmentarías (bloques de 1Oa 300 kb duplicados en una nueva región) representan a -5%. Sólo una minoría de esras duplicadones se encuentra en el mismo cromosoma; en los otros casos. las duplicadones están en cromosomas diferentes. • Las repeticiones en tándem forman bloques de un tipo de secuencia (especialmente en los centrómeros y los telómeros). La secuencia del genoma humano subraya la importancia de los transposones (que tienen la capacidad de replicarse a sí mismos e insertarse en una ubicación direrentc, además de que pueden funcio nar exclusivamente como elementos del DNA [véase

5 6 ¿Cómo se distribuyen los genes y otras secuencias en el genoma?

85

Cap. 21, Los tra nsposones] o tener u na forma activa RNA [véase Cap. 22, Retrovirus y retroposones]. Su distribución en el geooma humano se resume en la Fig. 22.18). la mayoría de los transposones que se encuentran en el genoma humano no son funcionales; muy pocos están realmente activos. sin embargo, la gran propordón del genoma ocupada por estos elementos indica que han partidpado activamente en el moldeo del genoma. Una característica importante es que algunos genes presentes se originaron como transposones y evolucionaron hasta llegar a su condición actual después de perder la capacidad de transponerse. Cerca de 50 genes pa recen haberse originado de esta manera. La duplicación de segmentos en su forma más sencilla implica la duplicación en tándem de alguna región de un cromosoma (habitualmente debido a un evento de rccombinación aberrante durante la meiosis; véase la sección 6. 7, El emrecruzamiento desigual reorganiza a los agrupamientos de genes). Sin embargo, en muchos casos, las regiones duplicadas se encuentran en cron1osomas diferentes, lo cual implica que originalmente hubo una duplicación en tándem seguida de la translocadón de una copia a un sitio nuevo. o que la duplicación se debió a mecanismos totalmente diferentes. El caso extremo de la duplicación de segmentos se observa cuando se duplica todo el gcooma, en cuyo caso, el genoma diploide inicialmente se conviene en terraploide. Conforme las copias duplicadas desarrollan diferendas, el genoma puede convenirse en diploide nuevamente de forma gradual y efecriva, no obstante que las homologías enrrc las copias divergentes dejan evidencias del evento, fenómeno particularmente común en los genom¡¡s de las plantas. El estado actual del análisis del genoma humano identifica numerosas regiones duplicadas, pero no indica si h ubo una duplicación completa del genoma en el linaje de los vertebrados. Una característica intrigante del genoma h u mano es la presencia de secuencias que parecen no tener funciones codificadoras, pero que muestran una conservación evo lutiva superior a la del nivel de fondo . Como se detectó mediante la comparación con orros genomas (inicialmenre con el del raLón), dichas secuencias represcman aproximadameme el 5% del genoma total. ¿Están coneCLadas funcionalmenee con las secuencias codificadoras de proteínas? Su densidad en el cromosoma 18 es la misma que en cualquier otra región del genoma, aunque el cromosoma 18 tiene una concentración de genes codificadores de proteínas significativamente menor. lo cual sugiere indirectamente que su función no está relacionada con la esnuctura ni con la expresión de los genes codificadores de proteínas.

86

CAPÍTULO 5 Secuencias genómicas y números de genes

ID

El cromosoma Ytiene varios genes específicos

de la masculinidad Conceptos principales • El cromosoma Ytiene ...(i0 genes que se expresan específicamente en los testículos. Los genes específicos de la masculinidad están en múltiples copias de segmentos cromosómicos repetidos. • La conversión g~nica entre copias múltiples permite el mantenimiento de los genes activos durante la evolución. La secuenciación del genoma humano ha amplia-

do significativamente los conocimientos sobre la función de los cromosomas sexuales. En general se piensa que los cromosomas X y Y desci.en den de un auwsoma común (muy antiguo). Su desarrollo ha implicado un proceso en el cual el cromosoma X ha retenido la mayor parte de los genes o riginales. mientras que el Y. ha perdido casi rodas. El cromosoma X se comporta como los autosomas en la medida en que las hembras tienen dos copias, y entre ellas puede tener lugar la recombínación. La densidad de genes localizados en el cromosoma X es comparable a la de otros cromosomas. El cromosoma Y es mucho más pequeño que el X y tiene muchos menos genes. Su única función resulta de que sólo los machos portan el cromosoma Y, del cual sólo hay una copia, por lo tanto, los loci ligados a este último son efectivamente haploides y· no diploides, como e l resto de los genes humanos. Durante muchos años se pensó que el cromosoma Y casi no portaba genes, excepto uno (o más) de los que determinan el sexo y definen la masculinidad. Gran parte del cromosoma Y (>95°1!, de su secuencia) no experimenta enl recruzamiento con e l cromosoma X, lo cual condujo a J.a perspectiva de que podía no contener genes activos porque no habría manera de evitar la acumu lación de mutadones deletéreas. Esta región está flanqueada por regiones seudoautosómícas cortas que se intercambian frecuentemente con el cromosoma X durante la meiosis masculina. Originalmente, a esta región se le llamó no recombinante, pero ahora se le conoce como región específica determinante de la masculinidad. La secuenciación detallada del cromosoma Y muestra que dicha región contiene tres tipos de regiones, como se ilustra en la • Las secue11cias X trallSpuestns están formadas por un toLal de 3.4 Mb que forman bloques grandes resultado de una transposición de la banda q21 en el cromosoma

Yp

Centrómero

PS

P7 P6

P5 P4

P3 P2

P1

Regtones ampltconicas

Palíndromos de las reglones amplicónicas

Genes de muchas copias

Regiones X transpuestas

Regiones seudoautosómicas

Genes de una sola copia

Reglones X degeneradas

Cenlrómero y heterocromatina

Yq

El cromosoma Y está formado por regiones Xtranspuestas, regiones Xdegeneradas y amplicones. Las regione~ Xtranspuestas y degeneradas tienen dos y 14 gene~ únicos, respectivamente. Los amplicones tienen ocho palíndromos extensos (P1 -P8), los cuales contienen a nueve Familias de genes. Cada familia contiene por lo menos dos copias.

X hace aproximadameme tres o cuatro millones de años, lo cual es específico del linaje humano. Estas secuencias no se recombinan con el cromosoma X y prácticamente se han desactivado. ahora contienen sólo dos genes activos. • Los segmentos X degenerados del cromosoma Y son secuencias que comparten un ori gen común con el cromosoma X (retorno al autosoma común del cual dcsdcnden los cromosomas X y Y) y contienen genes o seudogenes relacionados con el cromosoma X. Hay 14 genes acLivos y l3 seudogenes. En cierta forma, los activos han desafiado la tendencia a ser eliminados de las regiones cromosómicas que no pueden recombinarse durante la meiosis. • Los segmenlos amplicóy¡icos tienen una longitud total de 10.2 Mb y se repiten internamente en el cromosoma Y. Hay ocbo bloques palíndromos grandes que incluyen a nueve fam ilias de genes codificadores de proteínas; el número de copias por familia fluctúa enLre 2 y 35. "El nombre "ampticón" refleja el hecho de que las secuencias han sido amplificadas internamente en el cromosoma Y. Sumando los genes que se encuentran en estas =es regiones, el cromosoma Y comiene muchos más :~lo que se hubiera esperado, hay 156 unidades de :anscripción, de las cuales la mitad representa a ge- .:-s codificadores de proteínas y la müad representa · s:eudogenes. La presencia de los genes activos se explica por hecho de que la existencia de copias de genes _·imamente relacionados en los segmentos ampli !ücos permite que la conversión génica entre las ~.8

copias múltiples de un gen sea usada para regenerar copias activas. Las necesidades más comunes de las copias múltiples de un gen son cuantitativas (proporcionar más producto pro1eínico) o cualitativas (codificar proteínas con propiedades ligeramente distintas o expresadas en tiempos o lugares diferentes), aunque en este caso, la función esen cial es evolutiva. De hecho, la existencia de copias múltiples permite la rccombinación en elllÚsmo cromosoma Y para sustituir a la diversidad evolutiva que suele ser proporcionada por recombinación entre Jos cromosomas alélicos. La mayoría de los genes codificadores de proteínas en los segmentos amplicónicos se expresa específicamente en los testículos, y probablemente estén implicados en el desarrollo de la masculinidad . Si hay -60 de dichos genes en un conj unto total de -25 000 genes humanos, la diferencia genética cnrre varones y mujeres es de -0.2% .

111 Las especies más complejas evo lucionan al agregar nuevas funciones génicas Conceptos principales • la comparación de diferentes genomas muestra un incremento constante en el número de genes conforme se añaden genes adicionales para formar eucariotas, organismos multicelulares, animales y vertebrado~. • La mayor'ía de los genes únicos de los vertebrados están relacionados con el sistema nervioso o el inmunológico.

La comparadón de la secuencia del genoma humano con secuencias enconlradas en otras especies es reveladora respecto del proceso de evolución. En

las especies más complejas evolucionan al agregar nuevas funciones génicas

87

Incremento de la complejidad

mExtracelular

Todas las Sólo procariotas y vertebrados las eucariotas 22% 21% Sólo vertebrados y animales 24%

Sólo euoariotas

Compartimientos celulares

1 500

Mullicelularidad

32% 1 000

Los genes humanos pueden clasificarse según la amplitud de la distribución de sus homólogos en otras especies.

O Transcripción/ traducción • Plegamiento proteínico O Replicación o Transporte O Metabolismo

Las proteínas eucarióticas comunes están relacionadas con fu nciones celulares esenciales.

la se analizan los genomas humanos de acuerdo con la amplitud de su distribución en la naturaleza. Partiendo del más común (esquina superior derecha de la figura), el 2 l % de los genes es común a eucariotas y procariotas, y tienden a codificar proteínas esenciales para todas las formas vivas, tipicamente para el metabolismo básico, la replicación, la transcripción y la traducción . Avanzando en el sentido de las manecillas del reloj, se agrega otro 32% de los genes a las eucariotas en general, por ejemplo, pueden encontrarse en las levaduras. Estos genes tienden a codificar proteínas implicadas en funciones generales de las células eucarióticas, pero no de las bacterias; podrían relacionarse, por ejemplo, con la especificación de organelos o con los componentes del citoesqueleto. Otro 24% de los genes son necesarios para la especificación de los animales, entre otros, los genes para la multicelularidad y el desarrollo de diferentes tipos de tejidos. Veintidós por cienw de los genes son únicos de vertebrados, y codifican principalmente a proteínas del 88

1!1! Transmembrana '!Intracelular

CAPÍTULO 5 Secuencias genómicos y números de genes

5 00

El incremento de la complejidad de las eucariotas se acompaña de la acumulación de proteínas nuevas para desempeñar funciones transmembrana y extracelulares.

sistema inmunológico y del nervioso, pero a muy pocas enzimas, lo cual coincide con la idea de que el origen de las enzimas es muy antiguo y que las rutas metabólicas se originaron al principio de la evolución. Por lo tanto, se observa que el avance de las bacterias a los vertebrados implica agregar grupos de genes que representan a las nuevas func iones necesarias en cada etapa. Una manera de definir las proteínas comúnmente necesarias es identificar las que se encuentran en todos los proLeomas. Comparando detalladamente el proteoma humano con los proteomas de otros organismos, 46% del de las levaduras, 43% del de los gusanos y 61% del de las moscas están representados en el humano; un grupo clave de - 1 300 proteínas está presente en los cua tro proteomas. Las proteínas comunes son proteínas domésticas básicas necesarias para funciones esenciales que corresponden a los tipos resumidos en la . Las funciones principales están relacionadas con la transcripción y la traducción (35% ), el metabolismo (22%), el transporte (12%), la replicación y modificación del DNA ( 10%), el plegamiento y la degradación de proteínas (8%) y los procesos celulares (6%). Una de las sorprendentes características del proteoma humano es que tiene muchas proteínas nuevas respecto de otras eucariotas, pero relativamente pocos dominios protemicos nuevos. La mayoría de los dominios proteínicos parecen ser comunes al rei-

animal. Sin embargo. hay muchas arquitecturas reínicas recientes definidas como combinaciones t"vas de dominios. En la se muestra -:el mayor incremento tiene lugar en las proteítransmembrana y las extracclulares. En las le-Juras, la vasta mayoría de las arquitecturas tiene =ver con las proteínas intracel ulares. En las mos(0 los gusanos) hay aproximadamente el doble .arquitecturas intracelulares. pero hay un incre. nto sorprendente de proteínas transmembrana y •acelulares. como es de esperar de la adición de -:dones necesarias para las interacciones entre las _,las de un organjsmo multicclular. El incremen!n las arquitecturas inrracelulares necesario para ~ar un vertebrado (hombre) es relativamente :ueño, pero también en este caso se incrementan _?ran medida la arquitectura transmembrana y la ::acelular. Desde hace mucho tiempo se sabe que la diencía genética enrre el hombre y el chimpancé Jestro pariente más cercar1o) es muy pequeña, - 9% de los genomas son idénticos. Hoy día, la se~ncia del genoma del chimpancé permite investí_;· con más detalle ese 1% de difercndas y detectar ..as características responsables de Nlo humano_rden ser idemificadas. La comparación muestra " >e J 0 6 sustituciones de nucleótidos ( 1.2% de direnda globaJ en la secuencia), 5 X 106 deJeciones nsercioncs (dejando en -l. 5% de la secuencia _.:rmná tica, específica de cada especie) y muchas !Strucwraciones cromosómicas. las proteínas co.:spondicntes suelen ser muy similaie'i; 29% son -=micas y entre especies. en la mayoría de los casos • .- sólo una o dos diferencias en los ammoácidos ::: la proteína. De hecho. las sustituctones de nu• ~ridos son menos frecuentes en lo:. genes codifi.: !ores de proreínas que en los que tienden a estar olucrados en rasgos específicamente humanos, cual sugiere que la evolución de las proteínas es un efecto imponame en las diferencias entre '1 umano y el chimpancé. lo cual deja como po- iiidades principales a los cambios de estructura .• '1ica en gran escala y los de la regulación. El 25% -:as sustituciones de nudeótidos ocurre en los di... dcóridos CpG (entre los cuales hay muchos sitios -:-uladores potendales) .

¿Cuántos genes

son esenciales? 1

Cooceptu~ plincipal•~!.

'lo todos los genes son esenciales. En las levaduras y .as moscas, las deleciones de <50% de los genes tienen efectos detectables.

Cuando dos o más genes son redundantes, una mutación en cualquiera de ellos puede no tener efectos detectables. • No se sabe porqué sobreviven los genes que aparentemente son prescíndibles en elgenoma.

La selección natural es la fuerza que garantiza que los genes útiles sean retenidos en el genoma; las mutaciones son aleatorias y su efecto más común en un ORF sería dañar al producto proteínico. Un organismo con mutaciones nocivas estaría ~::o desvenraja en la evolución, y en última instancia, la mutadón sería eliminada por defidencias de competitivjdad de los organismos que la portan. La frecuencia de un alelo deficiente en la población se equilibra entre la generación de mutaciones nuevas y la eliminación de mutaciones antiguas. Invirtiendo este argumento, siempre que se ve un ORF intacto en el genoma, se supone que su producto desempeña una función útil en el organismo. La selecdón natural debe haber impedido la acumulación de muradones en el gen. El destino final de ungen que deja de ser útil es acumular muraciones hasta que deja de ser reconocible . El mantenimiento de un gen implica que confiere una ventaja selectiva al organismo. Sin embargo. en el curso de la evolución, i_nduso una ventaja relativa pequeña puede ser objeto de la selección natural y un defecto fenotípico no ser r1ecesariameme detectable de inmediato como resultado de una mutadón. No obstante, sería importante saber cuántos genes son realmente esendales, Jo cual significa que su ausencia es letal para el organismo. lo cual, en el caso de los organismos diploides, significa por supuesto que la rrnuación nula homodgótica es letal. Se puede suponer que la proporción de gene~ esenciales declinará con el incremento de tamaño del genoma porque los genomas más grandes pue· den tener múltiples copias reladonadas con funciones génicas particul ares, pero hasta ahora esta expectativa no ha sido confirmada por los dato~ (véase la Fig. 5.2) . Una forma de abordar el tema del número de genes es determinar-mediame análisis mutacional e: número de los que son esenciales. Si saturamos una región específica del cromosoma con mutadones letales, las mutaciones debenmapearse en un número de grupos de complemenración que corresponda a! número de loci letales en dicha región. AJ extrapolar este método al genoma como unidad global, se po· d.rá calcular el número toral de gene~ esenciales. En el organismo que tiene el genoma más pequeño conoddo (M.genitalium), las inserciones aleatorias tienen efectos detectables sólo en aproxima· damente dos tercios de los genes; asimismo. menos S.9 ¿Cuántos genes son esenciales?

89

de la mitad de los genes de la bacteria E. coli parecen ser esenciales. La proporción es incluso más baja en la levadura S. cerevisiae. Cuando las insercíones se introdujeron aleatoriamente en el genoma en un

r

20

Genoma total Crecimiento lento /1

15
E o e Q)

O>

a; -o

~ o

10

Los genes esenciales de las levaduras se encuentran en todas las clases. Las barras azules muestran la proporción t otal de cada clase de genes, en tanto que las rojas muestran a los esenciales.

O 90% efectos no detectables 13 70% no viables

O 1.6% fenotipos posembrionarios

O 1.6% defectos del desarrollo

En un análisis sistemático de pérdida de función que se realizó en 86% de los genes del gusano se demostró que sólo el 10% tiene efectos detectables en el fenotipo. 90

CAPÍTULO 5 Secuencias genómicas y números de genes

análisis previo, sólo 12% fueron letales y otro 14° impedía el crecimiento. La mayor parle de las inserciones (70%) no tuvo ningún efecto. En un sonde( más sistemático, basado en la deledón completa dL cada uno de los 5 916 genes (>96% de los identi· ficados), se muestra que sólo el 18.7% es esencia. para el crecimiento en un medio de cultivo rico er nutrientes. En la se observa que las levaduras incluyen genes en todas las categorías. La única concentración notable de defectos está en lo~ que codifican a productos implicados en la símesi~ proteínica, en cuyo caso, ~ 50% son esenciales. Obviamente, en este método se subestima el númerc de genes esenciales para que la levadma viva en su hábitat natural, cuando no está tan bien provista de nutrientes. En la se resumen los resultados de un análisis sistemático de los efectos de la pérdida de función génica en el gusano C. elegans. Las secuencias de genes individuales fueron pronosticadas a partir de la secuencia del genoma, y al dirigir un RNA inhibidor contra estas secuencias (véase la sección 13.1 O, La interferencia de RNA está reladonada con el silenciamiento de genes), se creó un conjunto grande de gusanos en el cual se impidió el funcionamiento de un gen (pronosticado) en cada gusano. Los efectos detectables en el fenotipo se observaron sólo en l 0% de estos organismos con genes desactivados, lo cual sugiere que la mayoría de los genes no tiene funciones esenciales. La proporción de genes esenciales es mayor (21%) entre los genes de gusanos que tienen conLrapartes en otras eucariotas, lo cual sugiere que los genes ampliamente conservados tienden a desempeñar funciones más básicas. También se incrementa la proporción de genes esenciales entre los que se presentan individualmente en cada genoma haploide, respecto de los genomas que tienen muchas copias de genes relacionados o idénticos, lo cual sugiere que muchos de los genes múltiples pueden ser duplicaciones relativamente recientes que pueden sustiLu ir mutuamente sus funciones·. En Drosophila se han realizado análisis extensos del número de genes esenciales e n una eucariota superior mediante intentos de correlacionar los aspectos visibles de la estructura cromosómica con el número de unidades genéticas funci onales. La idea de que esto pueda ser posible provino originalmente de la presencia de bandas en los cromosomas politénicos de D. melanogaster. (Estos cromosomas se encuentran en deLerminadas etapas del desarrollo y representan una forma física in usualmente amplia, en la cua l son evidentes una serie de bandas [denominadas más formalmente cromómeros]; véase la sección 28. 1O, tos cromosomas politénicos forman bandas.) A partir del concepto anterior de que

bandas pueden represemar un orden lineal de se ha llegado al intento de correlacionar la rganización de los genes con la organización de las Jndas. En el conjunto baploidc de D. melanogaster "-Y -5 000 bandas cuyo tamaño varía en más de ;: orden de magnitud. pero en promedio hay -20 • de DNA por banda. El método básico consiste en saturar una región _omosómica con mutaciones, las cuales suelen ser :-:1ci llamente reunidas como letales. sin analizar ' causa de ello. Cualquier mutación letal se toma .na identificar a un locus que esencial para el or__znismo. En ocasiones, las mutaciones provocan t'Ctos deletéreos visibles pero no letales, en cuyo -so, también se toman en consideración para idencar un locus esencial. Cuando las muracjone.s se .ocan en grupos de complememación. el número Jede ser comparado con el número de bandas de la =~ión, o incluso, cada grupo de complementación ~e de ser asignado a bandas indjviduales. El propó. • de estos experimentos ha sido determinar si hay a relación coherente entre las bandas y los genes, r ejemplo, ¿cada ba nda tiene un solo gen? Agrupando los análisis realizados en los úlri, s 30 años. el número de grupos de complemen· · :ión letales es -70% del número de bandas; aún desconoce si esta relación tiene algún sigruficafuncional. Independiemememe de la causa, la -.Jivalencia constituye un estimado razonable de - ~ 600 genes letales; desde cualquier pumo de vista, • Jrosophlia, el número de loci letales es significari~meme menor que el número total de genes. Si la proporción de genes esencia les humanos similar a Ja observada en otras cucariotas, se - ·m asticaría un rango de 4000 a 8000 genes en - que las mutaciones sedan letales o producirían «ros evidentemente dañinos. Actua lmente se han -·nriñcado 1300 genes en los cuales las mutaciones - '' 'ocan defectOs evldemes. proporción sustancial .. total esperado, particu larmente en vista de que _chos genes le tales pueden actuar tan precoz· ~nte que nunca veríamos sus efectos. Este tipo de ."Sgos también suele explicar los resultados de la . en la cual se observa que la mayoría de , defectos genéticos conocidos se debe a mutacioc,. puntuales (en donde es más probable que haya ~-mdo menos alguna función residual del gen). ¿Cómo se explica la supervivencia de genes ·a dcleción parece no tener efecto alguno? La -.licadón más probable es que el organismo tiene :-mas allernas de cumplir con la misma función. _.:. posibilidad más sencilla es la re dundancia, y • .: hay muchas copias de algunos genes, lo cual jeno en algunos casos. cuando muchos genes - acionado~) deben ser desactivados para producir decto. En u n escenario un poco más complejo, .1>

-~nes,

J

un organismo puede tener dos rutas independientes susceptibles de proporcionar cierta actividad. La desactivación de cualquiera de ellas no seria dañina, pero la ocurrencia simultánea de mutaciones en los genes de ambas sería dclctérea. Este tipo de situaciones puede evaluarse combinando mutaciones. Para empezar, en la misma cepa se introducen dcleciones en dos genes, ninguna letal de por sí, pero si el mutame doble muere, la cepa se denomina letal sintética. Esta técnica ha resultado muy efectiva en las levaduras, en las cuales puede automatizarse e l aislamiento de mLttantes dobles. procedimiento denominado aná lisis de matriz genética sintética (SGA, synthetic genetic array análisis). En la se resume el resultado de un análisis en el cual se realizó una SGA en cada una de las 132 delcciones viables para detectar si puede sobrevivir en combinación con cualquiera de las 4 700 deleciones viables. Cada uno de los genes de prueba tuvo por lo menos un compañero con el cual la combinación fue letal, y en la mayor parte de los genes de prueba fue ese el caso; la mediana es de -2 5 compañeros, y el número mayor se observó en un gen de prueba que tuvo 116 compañeros letales.

Sentido erróneo/sin sentido Corte y empalme Reguladoras

58% 10% <1%

Delaciones pequeñas Inserciones pequeñas

16% 6%

Delaciones grandes Reestructuraciones grandes

5% 2%

La mayor parte de los defectos genéticos conocidos de los genes humanos se debe a mutaciones puntuales; casi todos afectan directamente a la secuencia proteínica. El resto se debe a inserciones, deleciones o reestructuraciones de diferentes tamaños .

"' 2 .,a.s

~ 7

~ 5 Cl> ~ 4 a>

{l3

~ 2

E

~

1 1

1 10

20

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 Numero de genes letales interrelacionados (de 4 700)

Los 132 genes mutantes de prueba presentan algunas combinaciones letales si se combinan con alguna de las 4 700 mutaciones no letales. En la gráfica se ilustra cuántos genes letales interrelacionados hay por cada gen de prueba.

5.9 ¿Cuántos genes son esenciales?

91

Una pequeña proporción (-10%) de los pares mutantes interrelacionados codificaron proteínas que interactúan físicamente. Este resultado de alguna manera apunta hada la explicación de la falta aparente de efectO de tantas deleciones. l.a selección natural actuará contra estas deleciones cuando se encuentren a sí mismas en combinaciones de pares !erales. Hasta cierto punto, el organismo ha sido prOLegido contra los efectos dañinos de las mutadones merced a la redundancia, pero paga el precio al acumular la "carga genética" de mutaciones que no son deletéreas por sí mismas, pero que pueden causar problemas selios cuando se combinen con otras mutaciones semejantes en generaciones futuras. la teoría de la selección na tural sugeriría que la pérdida de genes individua les en dichas circunsta ncias produce una desventaja lo suficientemente grande como para mantener al gen activo durante la evolución.

Los genes se expresan en niveles muy diferentes Concepto~

pnncipales

• En una célula dada, la mayoría de los genes se expresa en niveles bajos. • Sólo un pequeño número de genes, cuyos productos son especializados para un tipo celular especifico, se expresan ampliamente.

La proporción de DNA represenrada en una población de RNAm puede determinarse por la cantidad de DNA susceptible de hibridarse con el RNA. Dicho análisis de saturación habitualmente identifica a -1% del DNA como proveedor de un molde para el RNAm. A panir de este descubrimiento es posible calcular el número de genes, siempre y cuando se conozca la longitud promedio de un RNAm. En una eucariora inferior, como u na levadu ra, el número tota l de genes expresados es -4 000, rnlemras que en los tejidos somáticos de las eucariotas superiores, suele ser de 1O 000 a 15 000; el valor es similar en las plantas y los vertebrados. (La única excepción que coincide con este tipo de valor es el cerebro de los mamíferos, en el cual aparentememe se expresan números mucho mayores de genes, aunque no se ha confirmado la cantidad exacta.) El análisis cinético de la reasociadón de una población de RNA permite determinar la complejidad de su secuencia. Este tipo de análisis suele identificar a tres componentes de una célula eucariótica. Igual que en una curva de reasociación de DNA, un solo componente se hibrida en cerca de dos décadas de valores Rot (concentración de RNA x tiempo), 92

CAPÍTULO 5 Secuencias genómicas y números de genes

y una reacción que abarque un rango más amplie debe resolverse por ajuste compmarizado de cu rva~ en componentes individuales. También aquí, estl representa lo que realmente es un espectro continuo de secuencias. Un ejemplo de una reacción Rt"\fAm excesivo) DNAc que genera tres componentes se muestra er la • El primer componente tiene las misma ~ características que una reacción de cootn: de RNAm de ovoalbúmina con su copia dt DNA, lo cual sugiere que el primer componente es de hecho sólo RNAm de ovoalbúmina (que ciertamente ocupa aproximadamenLc la mitad de la masa de mensajero de tejido del oviducto). • El siguiente componente proporciona 15°_ de la reacción, con una complej idad to ta. de 15 kb; corresponde a 7 a 8 especies de RNAm con una longitud promedio de 2 000 bases . • El último componente proporciona 35% de la reacción, que corresponde a una complejidad de 26 Mb, lo cual equivale a -13 OOl especies de .RNAm con una longitud promedio de 2 000 bases. A partir de este análisis se observa que aproximadamente la mitad de la masa del RNAm de l.;

Último componente

Primer componente

Segundo componente

50% a Rot0 0.0015

i5%a

35%a

Rot0 0.04

Rot0 30

l

100

~

z o

Qi

e: 75

8
r1

:e

·¡¡r

e: ~

o

0...

25

1

./

"'

1o- 4

10- 3

10-2 ;o-1 Rot

la hibridación entre RNAm excesivo y DNAc identifica a numerosos componentes de las células del oviducto de pollo caracterizadas por el Rot,/l de reacción.

:-.ttla representa un solo RNAm, -15cl/o de la masa proporciono da por sólo 7 a 8 moléculas de RNAm -35% de la masa se divide en la enorme cifra de \ 000 especies de RNAm, por lo tanto, es obvio _e las moléculas de RNAm que comprenden cada ~ponente deben estar presentes en cantidades ..ty diferentes. Al número promedio de moléculas de cada •Am por célula se le denomina abundancia , que -Ne calcularse de forma muy sencilla si se conoce nasa 1oral de RNA de la célula. En el ejemplo de la - .:ura 5.23, el RNAm rotal puede representarse ~o 100 000 copias del primer componente (Rl\J"Am - ovoa lbúmina) y 4 000 de cada una de las 7 a 8 •léculas de RNAm del segundo componente, pero -' -5 copias de cada una de las 13 000 moléculas de ;Am que constituyen el úllimo componente. La población de HNAm se puede dividir en dos lSes generales, el e acuerdo a s u ab undan cia: • El oviducto es un caso extremo, con gran pane del RNAm representada en una sola especie, pero la mayor parte de las células contiene un número pequeño de moléculas de RNA en numerosas copias. Este R N Am a bunda nte suele estar formado por <100 moléculas diferemes de RNAm en 1 000 a LO 000 copias por célula. Con frecuencia corresponde a gran parte de la masa, cerca de 50% del RNAm rotal. • Aproximadamente la mirad de la masa de RNAm consiste en un número imponante de secuencias, cerca de 10 000, cada una representada por sólo un pequeño número de copias en el RNAm, unas <10, que es la clase de RNAm escaso o RNAm complejo; es esta clase la que lleva a reacciQnes por satLtración.

¿Cuántos genes se expresan? -•<ep:os ptincipales _;;s RNAm expresados en niveles bajos se superponen ::.mpliamente en comparaciones de tipos de células. _as moléculas de RNAm abundantemente expresadas s..elen ser específicas del tipo de célula. -:o 000 genes expresados pueden ser comunes a la -.ayoña de los tipos celulares de una eucariota superior.

- ·¡ngo de genes expresados de muchos tejidos ~:icos de cucarioras s uperiores es de 1 o 000 a A>. ¿Qué tanta es la superposición entre genes ~e-;ados en tejidos diferente~? Por ejemplo, el ~;Jo de pollo se expresan de - 11 000 a 1 7 000 • \.i:O del valor que se observa en el oviducto de

-13 000 a 15 000. ¿Cuá ntos de estos dos conjuntos de genes son idénticos? ¿Cuánros son específicos de cada tejido? Estas interroga ntes suelen responderse al analizar el transcriptoma, o conjunto de secuen~ cías representadas en el RNA. De inmediato se observa que es probable que haya diferencias sustanciales entre los genes expresados en la clase abundante. La ovoalbúmina, por ejemplo, se ~inteti7.a sólo en eJ oviducto y para nada en el hígado, lo cual significa que el 50% de la masa de RNArn del oviducto es específica de dicho tejido. Sin embargo, las moléculas de RNAm abun· dante representan sólo una pequeña porción del número de genes expresados. Desde la perspectiva del n úmero total de genes del organismo y del nú mero de cambios que deben darse en la transcrip· ción entre uiferentes ripos de células, se necesita (<Jnocer la exiensión de la superposición entre los genes representados en la s clases de RNAm escaso de diferentes fenotipos celulares. Las comparaciones emre tejidos ctiferentes muestran que, por ejemplo, -75% de las !>ecuendas expresadas en el hígado y en el oviducto son las núsmas. en otras palabra~, -12 000 son expresados en el rugado y en el oviducto, -5 000 genes actidonales sólo en el rugado)' otros -3 000 se expresan sólo en el oviducto. Las moléculas de RNAm escaso se superponen ampliamente. Entre el riñon y el hígado del ratón, -90% de las moléculas de RNA.m escaso son idénticas, en función del número de genes expresados, una diferencia de sólo 1 000 a 2 000 entre tejido y tejido. El resultado general obtenido en varias comparaciones de este tipo revela que sólo -1 O% de las secuencias de RNAm de una célula son ún icas en e lla. La mayoría de las secuencia~ son comunes en numerosos üpos ce lu lares, quizá en rod0s. Esro sugiere que el co njunto común de funciones de los genes e~ presa dos. tal vez - 1o 000 en los mamíferos, com prende funciones necesarias en todos los tipos de células. En ocasiones, este tipo de genes se conoce como genes de mantenimiento o genes con s titutivos; sus actividades contrastan con las representadas por funciones especializadas (como la ovoalbúmina o la globina), necesarias sólo para fenotipos celu lares espeáficos. En ocasiones, a estos genes se les llama genes especializados.

El número de genes expresados puede medirse en masa Concepto~

principales

• La tecnologla del chip permite tomar una inst antánea de la expresión del genoma completo de una unidad celular de levadura .

S. lZ El número de genes expresados puede medirse en masa

93

~ 2000 a:

z

40%

Q)

~ 111

1500

:; V

•Q)

o

E 1 000 Q)

"E

18%

~ 500

·~

z

<1 1-1 o 1 0-1 00 > 100 Copias de RNAm por células de levadura

la abundancia de las moléculas de RNAm de las levaduras fluctúa entre <1 por célula (o sea que no todas las células tienen una copia de RNAm) y >100 por célula (que codifican a las proteínas más abundantes) .

El análisis de HDA permite medir los cambios en la expresión de cada gen (la parte superior izquierda es el primer gen del cromosoma I y la infe rior derecha, el último gen del cromosoma XVI). Los cambios en la expresión relativos a los tipos silvestres se indican en los colores rojo (reducción), blanco (sin cambios) o azul (increment o). Fotografías cortesía de Rick A. Young, Whitehead Institute, Massachusetts Institute of Technology. -75% (~4 500 genes) del genoma de las levaduras se expresa en condiciones de cultivo normales. • La tecnología del chip permite comparar detalladamente células animales relacionadas para determinar (por ejemplo) las diferencias de expresión entre una célula normal y una cancerigena.

La tecnología reciente permite estimar de manera más sistemática y precisa el número de genes expresados. Un método (análisis serial de la expresión génica o SAGE, serial analysis ofgene expression) permite utilizar una etiqueLa secuencial única para identificar a cada RNAm. La tecnología permite me-

94

CAPÍTULO 5 Secuencias genómicas y números de genes

dir posteriormente la abundancia de cada etiquete. Mediante este método se identifican 4665 genes expresados en S. cerevisiae cuando crece en condicioneo normales, con abundancias que fluctúan entre o.; y >200 transcritos/célula, es decir, que -75% de número total de genes ( -6 000) se expresa en dicha! condiciones. En la se resume el númer de moléculas diferemcs de RNAm que se encuentran en cada nivel de abundancia. La tecnología más poderosa utiliza chips qUL contienen maLrices de oligonucleótidos de alta densidad (HDA, high-density oligonu.cleotide aJTays) cuya construcción es posible porque se conoce la secuencia del genoma completo. En el caso de S. cerevisiae cada uno de los 6 !81 ORF están representados en la HDA por oligonudeótidos de 20 25-mer que corresponden perfectamente a la secuencia del mensaje } 20 oligonucleótidos no correspondientes que difieren en una posición de base. El nivel de expresión de cualquier gen se calcula sustrayendo la señal promedio de un apareamiento erróneo de su compañero perfecto. El genoma completo de las levaduras puede representarse en cuatro chips. Esta tecnología es lo suficientemente sensible com o para detectar los transcxitos de 5 460 genes (-90% del genoma) y mosLrar que numerosos genes se expresan en niveles bajos, con abundancias de 0. 1 a 0.2 trascritos/célula. Una abundancia de< 1 transcrito/ célula significa que no todas las células Lienen una copia del Lranscrito en un momento dado. La tecnología permite no sólo la medición de los niveles de expresión génica, sino también la deteccíón de diferencias de expresión en células mutantes respecto de células de tipo silvestre que crecen en condiciones de cultivo diferentes, etcétera. Los resultados de la comparación de dos estados se expresan en una cuadrícula en la cual cada cuadro representa un gen espeáfico y el cambio relativo en la expresión se indica mediante un color. La parte izquierda de la muestra el efecto de una mutación en la RNA polimerasa U, la enzima que produce al RNAm, la cual, como puede esperarse, provoca que la expresión de la mayoría de los genes se reduzca mucho. La parte derecha de la figura, por el contrario, muestra que una mutación en un componente accesorio del mecanismo de transcripción (SRBlO) tiene efectos mucho más restringidos y provoca incrementos en la expresión de algunos genes. La extensión de esta tecnología a las células animales perrrútirá que las descripciones generales basadas en el análisis de hibridación del RNA sean remplazadas por descripciones exactas de los genes expresados y de las abundancias de sus productos, en cua lquier tipo de célula dado. Un mapa de expresión génica de D. melanogaster detecta actividad de transcripción en alguna etapa del ciclo vital en casi

· 1dos (93%) los genes pronosticados y muestra que d 40% tiene formas alternas dt: corte y empalme.

Resumen _os genomas secuenciados incluyen numerosas bacerias y archaea, levaduras y un gusano, una mosca, .m ratón y al hombre. El número mínimo de genes .ecesarios para formar una célula viviente (un pa-ásito intracelular obligado) es -470; para una célu3 de vida libre, -1 700. Una bacteria gramnegativa pica úene -1 500 genes. El contenido génico de las :epas de E. coli fluctúa entre 4 300 y 5 400 genes. El ,t'n bacteriano promedio t1ene -1 000 bp de longi·.ud y se separa del siguiente por un espacio de -lOO p. Las levaduras S. pombe y S. cerevisine tienen 5 000 6 000 genes, respectivamente. Aunque la mosca D. m~lanogaster es llO organis-no más complejo y tiene un genoma más grande ;ue el del gusano C. elegrms, la mosca tiene menos ~'enes ( 13 600) que el gusano ( t 8 500) . La plana Arabidopsis tiene 25 000 genes y que uo hay una ·elación clara entre el tamaiio del genoma y el nú-:,ero de genes se demuestra porque el genoma del =:roz es cuatro veces más grande. pero contiene sólo ..::1 incremento de 50% en el número de genes, a -40 000. El ratón y el hombre rienen de 20 000 a ;l> 000 genes, cantidades mucho menores de lo espe:ado. la complejidad del dcsarroiJo de un organismo -.uede depender de la naturaJeza de las interacciones .otre los genes, así como de su número toral. En las procariOLas y en las eucariotas, aproxima.:amente 8 000 genes son comunes, y probablcmeoe estén implicados en fu ncioncs básicas. En otros rganismos multicelulares se pueden encontrar .1 000 genes. Para formar un animal, se agregan :ros 8 000, y 8 000 más (profundamente relacio~ados con el sistema nervioso y el inmunológico) se ':'!lcuenrran en los vertebrados. En los organismos :uyo genoma ha sido secuenciado, sólo el 50% de s genes tiene funciones definidas. El análisis de ~enes letales siguiere que sólo una minoría de genes .s esen cia l para cada organismo. Las secuencias que constituyen un genoma . 'Jcariótico pueden clasificarse en tres grupos: las ~cuencias no repetitivas son únicas; las secuencias '"'1 0deradamente repetitivas están dispersas y se re·Ien pocas veces como copias relacionadas, pero .o idénticas, y las secuencias muy repetitivas son nas, y se repiten como matrices en tándem. Las .nporcioncs de los tipos de secuencias son caracte -.sricas de cada genoma. aunque los genomas más _:andes tienden a presentar una proporción menor ~ DNA no repetitivo. Aproximadamente el 50% _d genoma humano consta de secuencias repeti ·as, de las cuales. la gran mayoría corresponde

a secuencias de transposones. La mayor parte de Jos genes estructurales se localiza en el DNA no repetitivo, cuya complejidad c:s mejor indicador de la complejidad del organismo que la complejidad total del gcnoma; el DNA no repetitivo llega a tener una complejidad máxima de -2 x 10° bp. Los genes se expresan en muy diversos niveles, de modo qtrc puede haber 1O' copías de RNAm de un gen abundante cuya proteína es el producto principal de la célula: l o~ copias de cada RNAm de <10 mensajes moderadamente abundantes, y <10 copia~ de cada RNAm de >lO 000 genes escasamente expresados. las superposiciones entre poblaciones de RNAm de célula~ con diferentes fcno!ípos son frecuentes; la gran mayoria de las moléculas de RNAm se encuentran en la mayoría de las células. La herencia no mendeliana se explica por la presencia de DNA en organelos localizados en el citoplasma. Las mitocondrias y los cloroplastos representan a sistemas delimitados por membranas en los cuales a lgunas proteínas son sintetizadas en el organelo, miemras que otras son importadas. El genoma de los organelos suele ser un DNA circular que codifica a todos los RNA y a algunas de las proteínas que necesita . El tamaño de los gcnomas mitocondriales varía mucho, desde el genoma minimalista de los mamíferos, de 16 kb hasta el de 5 70 kb de las plantas superiores. Se supone que los genomas más grandes codifican funciones acüctOnales. Los genomas de los cloroplastos oscilan entre 120 y 200 kb; los que han sido ~ecuenciados. tienen una organización y funciones codificadoras similares. Tanto en las mitocondrias como en los doroplastos, muchas de las proteínas mayores contienen algunas subunidades sintetizadas en el organelo y otras importadas del citosol. Las moléculas de DNA de los mamíferos se transcriben a un solo transcritO de la banda codificadora principal, en tanto que l<>s producros jndivlduales se generan por procesamiento de RNA. En las levaduras, las reeslntcturaciones son bastante frecuentes en el DNA mitocondriaL además de que se han encontrado recombinadones entre genomas müocondriales o genomas de cloroplastos. Las transferencias de DNA han tenido lugar de los cloropJastos o las mitocondrias a los genomas nucleares.

Referencias El número de genes bacterianos abarca un rango de un orden de magnitud

Mt ·

• de r. isi¿ r¡

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Referencias

97

Agrupamientos y repeticiones ESQUEMA DEL CAPÍTULO en un cromosoma recombinante y una duplicación correspondiente en el otro. • las talasemias diferentes son causadas por varias deleciones en que se elimina el gen de la globina a o el de la ~. La gravedad de la enfermedad depende de cada deleción.

Introducción la duplicación de los genes es una fuerza importante en la evolución • Los genes duplicados suelen separarse para dar lugar a genes diferentes o bien una de las copias se torna inactiva

los genes del RNAr forman repeticiones en tándem • El RNA ribosómico es codificado por un número considerable de genes idénticos que se repiten en tándem para formar uno o más agrupamientos. • Los agrupamientos de DNAr se organizan de manera tal. que las unidades de transcripción que resultan en un precursor unido a los RNAr principales alternan con espaciadores no transcritos.

los agrupamientos de globinas se forman por duplicación y por divergencia Todos los genes de las globinas descienden por duplicación y mutación de un gen ancestral que tenía tres exones. El gen ancestral dio origen a la mioglobina, la leghemoglobina y las globinas u y p • Los genes de las globinas a y p se separaron al principio del periodo de evolución de los vertebrados; oespués, las duplicaciones generaron agrupamientos individuales de genes similares a los genes a y p. Una vez que un gen ha sido desactivado por una mutación, puede acumular más mutaciones y convertirse en un seudogén homólogo al gen activo o los genes activos, pero que no tiene actividad funcional.

los genes repetidos de RNAr mantienen una secuencia constante • Todos los genes de un agrupamiento de DNAr tienen secuencias idénticas. • los espaciadores no transcritos consisten en unidades repetidoras m~s cortas cuyo numero varia, de modo que la longitud de cada espaciador es diferente.

llB La divergencia secuencial es la base del reloj

la fijación entrecruzada podría mantener repeticiones idénticas

evolutivo Las secuencias de genes homólogos en especies diferentes varlan en los sitios de remplazo (donde las mutaciones causan sustituciones de aminoácidos) y en los silenciosos (donde una mutación no afecta a la secuencia proteínica). • Las mutaciones se acumulan en los sitios silenciosos -10 veces más rápido que en los de remplazo. la divergencia evolutiva entre dos proteínas es medida por el porcentaje de posiciones en que difieren los aminoácidos correspondientes. • Las mutaciones se acumulan más o menos a una misma velocidad después de que los genes se separan, de manera que la divergencia entre cualquier par de secuencias de globina e5 proporcional al tiempo transcurrido desde la separación de sus genes.

• Un entrecruzamiento desigual cambia el tamaño de un agrupamiento de repeticiones en tándem. • las unidades de repetición pueden eliminarse o repartirse entre los agrupamientos.

los DNA satélite a menudo están en la heterocromati na • La secuencia de repetición del ONA altamente repetitivo es muy corta y no tiene función codificadora. • Se presenta en grandes bloques que pueden tener propiedades físicas diferentes. • Suele ser el constituyente principal de la heterocromatina centromérica.

los satélites de los artrópodos tienen repeticiones idénticas muy cortas

la velocidad de sustitución neutral puede ser medida a partir de la divergencia de secuencias repetidas

• La longitud de las unidades de repetición de tos DNA satélite

de los artrópodos es de sólo unos cuantos nucleótidos. La mayoria de las copias de la secuencia son idénticas.

• La velocidad de sustitución por año en sitios neutrales es mayor en el genoma del ratón que en el humano.

los seudogenes son callejones sin salida de la evolución

los satélites de los mamíferos constan de repeticiones jerárquicas

• Los seudogenes carecen de función codificadora, sin embargo, pueden 5er reconocidos por similitudes secuenciales con los genes funoonales existentes. Surgen de la acumulación de mutaciones en genes (anteriormente) funcionales.

.. El DNA satélite del ratón ha evolucionado por duplicación y mutac1ón de una unidad de repetición corta para dar origen a una unidad de repetición basica de 234 bp en la que pueden ser reconocidas la mitad, la cuarta parte y [a octava parte de la repetición original.

Mediante entrecruzamiento desigual se reestructuran los agrupamientos de genes Cuando un genoma contiene un agrupamiento de genes con secuencias relacionadas. el apareamiento enóneo entre genes no alélicos puede causal un entrecruzamiento desiguaL de modo que se produce una deleción

98

los minisatélites facilitan el mapeo genético • la variación entre los microsatelites o mi nisatélites de los genomas permite identificar la herencia inequívocamente, pues demuestra que el 50% de las bandas de un individuo derivan de un progenitor específico.

BJ;t

Resumen

111

Introducción

:..a familia d e genes es un agrupamiento constituido por descendientes por duplicación y variación de algún gen ancestral cuyos miembros se agrupan 1 dispersan en diferentes cromosomas (o ambos). El análisis del genoma muestra que muchos genes pertenecen a fam ilias. por ejemplo. los 25 000 del genoma humano identificados están en - J 5 000 familias, así que el gen promedio tiene varios parientes en el genoma (véase la Fig. 5.7). Las familias de genes ~.>clfían mucho en cuanto a grado de relación entre sus miembros. desde las que constan de múltiples OJ.iembros idénticos hasta aquellas en que la reladóo es bastante lejana. En general, los genes se relacionan :ínicameme por sus exones, pues sus intrones se han ~epara do (véase la sección 3.5, Las secuencias de los exones se conservan, pero las de los intrones varían) . los genes también pueden estar relacionados sólo por algm1os de sus exones, mientras que otros son ím.icos (véase la sección 3.9, Algunos exones pueden equipararse con funciones proteú1icas). El evento inicial que permite que los exones o 10s genes relacionados se desarrollen es una duplicadón, es decir, que de alguna secuencia del genoma se genera una copia. La duplicación en tándem ruando las duplicaciones permanecen jumas) pueJe provocar algunos errores de duplicación o de re (Ombinación. La separación de los duplicados puede :ener lugar por una translocacióo que transfiere material de un cromosoma a otro. Un duplicado en una ubicación nueva también puede ser producido directamente por un evento de transposición 3SOciado con la copia de una región de DNA de los alrededores del transposón. L<1 duplicación se aplica ;auto a genes intactos como a colecdones de exones, incluso a exoncs individua les. Cuando se trata de un gen intacto, la duplicación genera dos co!)ias cu yas actividades son indistinguibles, en cuyo ~aso, normalmente las copias difieren a medida que ~·an acumulando mutaciones diferenLes. Los miembros de una familia de genes esuucru:-aJes bien relacionados suelen tener funciones rela..:ionadas, incluso idémicas, a pesar de que pueden ~er expresadas en diferentes momentos o en diferentes tipos de células. Así pues, en los elitrodtos ae embriones y en los eritrocitos adultos se expre:>an proteínas diferentes de globina, mientras que -n las células musculares y en las no musculares se .Jtilizan diferentes actinas. Cuando los genes se se!'aran significativamente. o cuando sólo algunos de \S exoncs están relacionados, las proteínas pueden ·ener diferentes funciones. Algunas familias de genes están formadas por ::aicmbros idénticos, y el agrupamiento es tm re~u isiro previo para que lo sigan siendo, a pesar de

que los genes agrupados no son necesariamente idénticos. los agru pamien tos de genes van del caso en que una duplicación ha generado dos genes relacionados adyacentes hasta casos en que ciemos de genes idénticos yacen en una matriz en tándem: esta última puede ser frecuentísima si se necesitan cantidades in usualmente grandes del producto, por ejemplo, los genes de los RNAr o de las histonas. Este fenómeno da lugar a una situación especial respecto del mantenimiento de la identidad y los efectos de la pre~ión selectiva. Los agrupamientos de genes representan una oponunidad para examinar a las fuerzas implicadas en la evoluci6n del genoma en regiones más amplias que un gen. Las secuencias duplicadas, especialmeme las que permanecen eo Ja misma área, proporcionan el sustrato para una evolución posterior por rec:ombinación. Una población evoluciona mediante la recombinación clásica ilustrada en las y , en las cuales tiene lugar un entre cruzamiento exacto. Los cromosomas tccom.binanres esLán organizados de la misma manera que el cromosoma progenitor, comienen exactamente los mismos loci, en el mismo orden, pero las combinaciones de aletos difieren y proporcionan la materia prima para la selección natural. De cualquier forma, la l"Xistencia de secuencias duplicadas permite eventos aberrantes ocasionales que modifican el contenido de los genes y no sólo la combinación de los alelos. El entrecru zamiento desigual (o recombinación no recíproca) describe un evento de recombinación entre dos sitios no homólogos. La característica que hace posible estos eventos es la existencia de secuencias repetidas. En la se observa que estO permite que, en un cromosoma, la copia de una

Blvalente contiene 4 cromátldas. 2 de cada progenitor

Quiasma es orovocado por entrecruzamiento entre dos de las cromálidas

a a

A=====-=== B A

a

8

b

B

b

Dos cromosomas siguen siendo progemtores (AS y ab). A ~~~~~= B Los cromosomas recombinantes A e b contienen material de cada progenitor y nuevas a B 8 combinaciones genéticas (Ab y aB¡. b La formación del quiasma representa la generación

de recombinantes. b.l Introducción

99

en los agrupamienws de genes y en las regiones de DNA muy repetido. La fracción del genoma que se repite mucho está formada por mú ltiples copias en tándem de unidades de repetición muy cortas, que suelen tener propiedades inusuales, una de las cuales es que en un análisis de gradienLe de densidad de DNA pueden ser identificadas como un pico independiente, lo cual da lugar al nombre de D NA satélite. A menudo se relacionan con regiones inertes de los cromosomas, en particular los cenrrómeros (que contienen los puntos de unión para la segregad6n

Recombinación intermedia

en un huso mitótico o meiótico). Como resullado

Recombinantes

La recombinación implica apareamientos entre las cadenas complementarias de los dos DNA dúplex progenitores.

_

~::~:rm~m~m~ ~

__:__fB_!"J"l¡;;~~AB.Q~é.C•

~

ABCABCABCABCABCABCABCABCABCABC ABCABCABCABCABCABC El entrecruzamiento desigual resulta del apareamiento entre repeticiones no equivalentes en regiones de DNA formadas por unidades de repetición. Aquí la unidad de repeti-ción es la secuencia ABC, y la tercera rep,etición del cromosoma azul se ha alineado con la primera repetición del cromosoma negro. En toda la región de apareamiento, las unidades ABC de un cromosoma están alineadas con las del otro. El entrecruzamiento genera cromosomas con dieciséis repelticiones cada uno, y no ocho de cada progenitor.

repetición se desalinee y se recombine con unat copia dilerente de la repetióón en el cromosoma homólogo y no con la copia correspondiente. Cuando sucede la recombinación, aumenta el número de repetidones en un cromosoma y disminuye en el otro. De hecho, un cromosoma recombinante sufre una deleci6n y el otro una inserción. Este mecanismo es responsable de la evolución de los agrupamientos de secuencias relacionadas, y es posible rastrear su operaciótn contrayendo o expandiendo el tamaño de una matriz 100

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

de su organización xepetitiva, presentan parte del mismo comportamiento respecro de la evolución que los agrupamientos de genes en tándem. Además de las secuencias satélites, fragmentos más pequeños de DNA. llamados minisa télites, muestran un comportamiento similar, y permiten mostrar un alto grado de divergencia entre genomas específicos que pueden ser usados con fines de mapeo. Estos eventos que modifican la constitución del genoma son raros, pero importantes, durante la evolución.

111

La duplicación de los genes es una fuerza importante en la evolución

Concepto principal • Los genes duplicados suelen separarse para dar lugar a genes diferentes o bien una de las copias se torna inactiva.

Los exones se comportan como módulos para construir genes probados en varias combinaciones en el curso de la evolución. En un extremo, un exón individual de un gen puede ser copiado y utilizado en otro; en el otro extremo, un gen completo, lncJuidos exones e imrones, puede ser duplicado. En ta l caso, las mutaciones suelen acumularse en una copia sin atraer la atención adversa de la selección natural, de modo que esta copia puede evolucionar a una nueva función, expresarse en un lugar o tiempo distintos a los de la primera copia, o bien, asumir actividades diferentes. En la se resume la visión actual del ri Lmo a que ocurren es Los procesos. La probabilidad de que determinado gen sea incluido en una duplicación en un periodo de un millón de años es de -1%, y después de que el gen se ha duplicado, las diferencias desarrolladas son resultado de las mutaciones ocurridas en cada copia, las cuales se acumulan a una velocidad de -0.1% en un millón de

demuestra que las duplicacioues están sucediendo más o menos a pesar del contenido genético. Los genes de estas duplicaciones pueden ser especialmente interesantes por !a implicadón de que su evolución es reciente y, por lo tanto, pueden ser importantes para desarrollos evolutivos no demasiado lejanos (como la separación del hombre del mono).

Los agrupamientos de las globinas son fo rmados por duplicación y por divergencia Conceptos principales • Todos los genes de las globinas descienden por duplicación y mutación de un gen ancestral que tenía tres exones. Después de que un gen ha sido duplicado, las :iferencias pueden acumularse entre las copias. Los genes pue.;¿n adquirir funciones diferentes, o una de las copias tornarse ;,activa.

Jños (véase la sección 6.4, La divergencia secuencial t'S la base del reloj evolutivo). No es probable que el organismo necesite re:ener dos copias idénücas del gen, de modo que a medida que se desanollan diferencias entre los ~enes duplicados. es probable que suceda uno de estos dos eventos; • Ambos genes se vuelven necesarios porque las diferencias entre ellos generan proteínas con diferentes funciones o porque se expresan espeóficamente en lugares y momentos distintos. • De no ser así. es probable que uno de los g~nes sea eliminado porq ue haya adqu irido una mutación delerérea y no habrá una sclecdón adversa para eliminar dicha copia, fenómeno que habitualmente toma -4 millones de ai'ios. En dicha situación, es meramente una cuestión de probabilidad cuál de las copias se desactiva (lo cual puede contribuir a la incompatibilidad entre individuos, y, en última instancia. a la evolución de las especies, si diferentes copias se tornan inactivas en distintas poblaciones). El análisis de la secuen cia de l ge noma humaoo muestra que ~ 5 % comprende duplicaciones de segmentos identificables cuya JongiLud oscila entre lO y 300 kb. El número de dkhas duplicaciones se ha elevado recientemente porque no ha habido suficiente tiempo como para que la djvergencia emrc ellas elimine su relación; incluyen una parte proporcional (de -6%) de los exones expresados. lo cual

• El gen ancestral dio origen a la mioglobina, la leghemoglobina y las globinas ex y ~. • Los genes de Las globinas ex y p se separaron al principio del periodo de evolución de los vertebrados; después, las duplicaciones generaron agrupamientos individuales de genes similares a los genes ex y ~. • Una vez que un gen ha sido desactivado por una mutación, puede acumular más mutaciones y convertirse en un seudogén homólogo al gen activo o los genes activos, pero que no tiene actividad funcional.

El tipo más común de duplicación genera una segunda copia del gen cerca de la primera. En algunos casos, ambas copias permanecen asociadas y la duplicación posterior puede generar un agrupamiento de genes relacionados. El ejemplo mejor caracterizado de un agrupamiento de genes es el de los genes de globina, que constituyen una familia de genes antigua implicada en una función clave para el reino animal, el transpone de oxígeno por el torrente sanguú1eo. El constituyente mayor de los eritrocitos es el retrámero de globina que se asocia con su grupo hem (de unión al hierro) en forma de hemoglobina. Los genes funcionales de globina tienen la misma estructura general en wdas las especies, están divididos en tres exones ya ilustrados en la Figura 3.7. Se llega a la conclusión de que todos los genes ele las globinas derivan de u n solo gen ancestral, y siguiendo el desarrollo de los genes individuales de globina en una especie, o en especies diferen tes, se llegan a conocer los mecanismos involucrados en la evolución de las familias de genes. En las células adultas, el tetrámero de globina consisre en dos cadenas a idénticas y dos cadenas ~ idénticas. Las células sanguíneas de los embriones contienen tetrámeros de hemoglobina distintos de

6.3 Los agrupamientos de las globinas son formados por duplicación y por divergencia

101

~l

a

~~ 'Vcova~ a1

1 ,_ ... ~ ~ +-

~

Agrupamiento a

Agrupamiento 13

20

10 ~ Gen

30

func1ona1

40

50 kb

':Seudogén

Cada una de las familias de genes de globina tipo <X y tipo ~. está organizada en un solo agrupamiento que incluye genes funcionales y seudogenes (\!f).

Embrionario (<8 semanas): proteínas e 2(,2

¡;,

e

Y y

o.

(l

1

+

*

Fetal (3-9 meses): proteinas

o

+

o

~

..

1

y y

~2y2 ~e 2

a a

~y2

+

++

Adulto (desde el nac1m1ento): prote!nas a2&z (l

+ .. +

1

(l

~2

+

+ + Gen funcional Gen activo

_ Seudogén

Durante el periodo embrionario, el fetal y el adulto del desarrollo humano se expresan genes de hemoglobina diferentes.

los de la forma adulta, pues cada terráruero consta de dos cadenas idénticas tipo a y dos cadenas idénticas tipo ~ , cada una de las cuales está relacionada con e l polipéplido adulto y posteriormente es remplazada por él. Éste es un ejemplo del contro l del desarrollo, en el cual diferentes genes se activan y desactivan sucec;ivamente para proporcionar produeLOs alternos que realicen las mismas funciones en momentos diferentes. La división de las cadenas de globina en Lipo a y ripo ~ refleja la organización de los genes; cada ripo de globina es codificado por genes organizados en un solo agrupamiento. Las estructuras de Jos dos agrupamientos del genoma de los primates superiores se ilustran en la Con una extensión de más de 50 kb, el agrupamiento ~contiene cinco genes funcionales (é, dos y, 8 y~) y un gen no funcional (\lf~) . La secuencia co-

102

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

dificadora de los dos genes -y difiere en sólo un aminoácido, la variante G tiene gHcina en la posición 136, mientras que la variante A tiene alanina. La longjtud del agrupamiento a. más compaCLo tiene más de 28 kb e incluye un gen activo t;. un gen ~ no funcionaL dos genes a., dos genes a. no funcionales y el gen e, cuya función se desconoce. Los dos genes a codifican a la misma proteína. Dos (o más) genes idénlicos en el mismo cromosoma se describen como copias no alélicas. Los detalles de la relación entre la hemoglobina embrionaria y la adulta varían en fundón del organismo. En el humano, la ruta tien e tres etapas, embrionaria, fetal y adulta. La distinción entre embrionaria y adulta es común en todos los mamíferos, pero varía el número de etapas previas a la adulte7.. En el hombre, t; y a. son dos cadenas tipo a, en tanto que e, -y. 8 y~ son tipo~ · I!n la se muestra cómo se expresan las cadenas en diferentes etapas del desarrollo. En la ruta del humano, t; es la primera cadena tipo a en ser expresada, pero es rápidamente remplazada por a. En la ruta ¡3, e y y se expresan primero y 8 y~ los remplazan después. En el adulto, la fo rma o.2 ¡3 2 proporciona 97% de la hemoglobina y <X2 02 , -2%, en tamo que -1% es aportado por la persistencia de la forma fetal n 2y2• ¿Qué imponancia tienen las diferencias entre la gtobina embrionaria y del adulto? Las formas embrionaria y feLaiLienen mayor afinidad con el oxígeno para obtenerlo de la sangre de la madre, lo cual explica que no baya un equivalente en el pollo, por ejemplo. dado que las etapas embrionarias tienen lugar fuera del cuerpo {es decir, en el huevo). Los genes funcionales se definen por su expresión en RNA y. en última instanda. por las proteínas a las cuales codifican. Los genes no funcionales se definen como tales por su incapacidad para codificar proteínas por diferentes razones; Jas deficiencias pueden estar en la transcripción o la traducción (o en ambas). A estos genes se les denomina seudo genes y se indican mediante el símbolo \lf. Una organización general simi lar se encuentra en orros agrupamientos de genes de globina de vertebrados, pero los deLalles en cuanto a tipo, número y 01·den de los genes varía como se ilustra en la Cada agrupamiento contiene genes tanto embrionarios como adultos. y su longitud total varía ampliamente. El más largo se encuentra en la cabra, en donde un agrupamiento básico de 4 genes se ha duplicado 2 veces. La distribución de los genes activos y los seudogenes difiere en cada caso, lo cual ilustra la naturaleza fortuita de la conversión de una copia de un gen duplicado al estado de inactividad. La caracterización de estos agrupamientos de genes conduce a un pumo general importante: una

el Cabra

Ell

ljlp

pe

EIVIjlp

elll

PA

Ev ev'I)IP ~B

u

'l'Pno

13hl ljlh¡ 'l'h3

13\naj

p~in

.L

Ratón E

y

\¡1¡3

Genes embrionarios: e;¡

p

Genes adultos: 13

11

Conejo

p

pH p

E

Pollo

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

En los vertebrados se encuentran agrupamientos de genes de globina p y seudogenes. Siete genes de ratón ·incluyen dos genes embrionarios tempranos, un gen embrionario tardío, dos genes adultos y dos seudogenes. El conejo y el pollo tienen cuatro genes cada uno.

-milia de genes puede tener más miembros, tanto f u nczo_:!es como no funcionales, de lo que sospecharíamos con ;;.se en el análisis proteínico. Los genes funcionales .dkionales pueden representar duplicaciones que .:. ..~d ifican a pollpéptidos idénticos o estar relaciona : s con las proteínas conocidas, pero de difereme urma (y presumiblemente se expresan sólo de for¡¿¡ breve o en cantidades bajas). Respecto de la interrogante sobre cuánto DNA t: necesita para codificar a una función en pani:ular, se observa que la codificación de las gllobias tipo ~ requiere de un rango de 20 a 120 kb !'!1 distintos mamíferos, mucho más de lo qllle se =speraría sólo de analizar las proteínas conocidas J e la globina ~. incluso del análisis de cada gen. De .:ualquier forma, los agrupamientos de este tipo no son comunes; la mayoría de los genes se encuentran .:omo loci individuales. A partir de la orga nización de los genes de la ;lobina en una variedad de especies, debería ser Dosible rastrear la evolución de los actuales agrupamientos de genes de globina partir de un solo gen ancestral de globina. La perspectiva actual 'de la 3Scendencia evolutiva se ilustra en la El gen de leghemoglobina de las planras, relacionado con los genes de la globina, podría representar a la forma ancestral. Lo más que es posible : emontarse en cuanto a un gen de globina en su iorrna moderna depende de la secuencia de la cadena individual de la mioglobina de los mamíferos. :a cual se separó de la línea de ascendencia de la ~ob i na hace -800 millones de años. El gen de la mioglobina tiene la misma organizadón que los zenes de globina, de modo que es posible tomar !a estru ctura de tres exones para representar a su ancestro común.

.

Agrupamientos separados (mamífe ros y aves)

Pl ~

'

,/ 1

Expansión de tos agrupamientos

P2

~-

C<2

-

P!._ <X._ -

Separación de Jos genes

Genes

(J.-

Duplicación y

divergencia

Fusiónd1 axones

1

o., p

'- p 1 ligados

(anfibios y peces)

Gen de globina individual (lamprea y mixino) Globina ancestral (mioglobina)

Leghemoglobina

700 600

500 400 300 200 100 Millones de años

Todos los genes de globina han evolucionado por una serie de duplicaciones, transposiciones y mutaciones de un solo gen ancestral.

Algunos "peces primitivos" tienen sólo un tipo de cadena de globina, así que deben haberse separado de la línea de la evolución antes de que el gen

6.3 Los agrupamientos de las globinas son formados por duplicación y por divergencia

103

de globina a ncesrral se duplicara para dar lugar a las variantes o. y ~. lo cual aparentemente ocurrió hace -500 millones de años, durante la evoludón de los ost.eiaios. La siguiente etapa de la evolución esrá representada por el estado de Jos genes de globina de la rana Xenopus lnevis, que tiene dos agrupamientos de genes de globina. No obstanre, cada agrupamiento tiene ambos genes, o. y ~. ramo de tipo larvario como adulto, de modo que el agrupamiento debe haber evolucionado por duplicaci6n de un par o.~ ligado. seguida de la divergencia entre cada copia . Más tarde, el agrupamiento emero se duplicó. Los anfibios se separaron de la línea de mamíferos/ave~ hace -350 millones de años, así que la separación de los gene~ de globina a. y ~debe haber resu ltacio de una Lransposidón en la línea predecesora de mam(feros/aves después de dícbo periodo, lo cual probablemente ocurrió en las primeras etapas de la evolución de los venebrados. Tamo en aves corno en mamíferos bay agrupamientos independientes de globinas a. y ~. de modo que los genes aira y beta deben haberse separado físicamente ames de que mamíferos y aves divergieran de su ancestro común, evento ocurrido probablemente hace -270 millones de años. Los cambios sucedidos en los agrupamientos a y ~ son más recientes, como se verá a panir de la descripción de la divergencia de cada gen en la siguiente sección.

111

La divergencia secuencial es la base del reloj evolutivo

Conceptos principales • Las secuencias de genes homólogos en especies diferentes vañan en los sitios de remplazo {donde las mutaciones causan sustituciones de aminoácidos) y en los silenciosos (donde una mutación no afecta a la secuencia proteínica). • Las mutaciones se acumulan en los sitios silenciosos -10 veces más rápido que en los de remplazo. • La divergencia evolutiva entre dos proteínas es medida por el porcentaje de posiciones en que difieren los aminoácidos correspondientes. • Las mutaciones se acumulan más o menos a una misma velocidad después de que los genes se separan, de manera que la divergencia entre cualquier par de secuencias de globina es proporcional al tiempo transcurrido desde la separación de sus genes.

La mayor parte de los cambios de las secuencias proteínicas se debe a mutaciones pequeñas que se

104

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

acumulan lentamente con el riempo. Las mutaciones puntuales y las inserciones y deleciones pequeñas son aleatorias, quizá más o menos con la misma probabilidad en todas las regiones del genoma. Las excepciones ~on los puntos calientes, en los que las mutaciones suceden con mucha mayor frecuencia. Casi todas las mutaciones que modifican la secuencia de aminoácidos son deletércas y serán eliminadas por selección natUral. Pocas mutaciones son provechosas, y cuando ocurre una inusual, es muy probable que se extienda entre la población, remplazando de modo eventual a la secuencia aruerior. Cuando una nueva varia me rempl;u.a a la versión previa del gen, se dice que se hafijado en la población. Un aspecto cof!lro\rertido es qué proporción de mu taciones de una secuencia de aminoácidos es neutral. es decir, sin efecto en la función de las proteínas y. por lo tanto, susceptible de acumularse como resultado del flujo aleatorio y de la fija ción. La velocidad a la cual ~e acumulan los cambio~ derivados de mutaciones es característica de cada prorema, y presumiblemente depende, por lo menos en parte, de su nexibilidad respeao del cambio. En una especie, una proteína evoluciona por sustitución de mutaciones, seguida de deleción o de fijación en el acervo de reproducción individual. Cabe recordar que cuando se escudriña el acervo genético de una especie, se ven sólo las vatiames que han sobrevivido. Cuando múltiples variantes están presentes, puede que sean estables (porque ninguna tiene una ventaja selectiva), o de hecho, una podría ser transiwria porque está en proceso de ser desplazada. Cuando una especie se divide en dos nuevas especies, cada una de las resu ltantes cons~ituye un acervo independiente para la evolución . Al compararse las proteínas correspondientes de dos especies, se ven las diferencias acumuladas desde el momento en que sus ancestros dejaron de hibridarse. Algunas están muy conservadas y muesLran pocos cambios, o ninguno, de especie a especie, lo cual indica que casi cualquier cambio es ddetéreo y, por lo tanto, no seleccionado. La diferencia en tre dos proteínas se expresa como su divergencia, el porcenrajc de posiciones en que difieren los aminoácidos. La divergencia entre proteínas puede ser ctiferenre de la divergencia entre las secuendas de ácido nucleico correspondientes, debido a la representación de cada aminoácido en un codón formado por rres bases, en el cual, a menudo la tercera no incide en el significado. La secuenCia nudeorídica de una región codificadora puede dividirse en sitios de remplazo y s it ios silenciosos potenciales;

• En los sitios de remplazo. una mutación modifica al aminoácido codificado. El efecto de la muradón (deleréreo, neuu·al o beneficio· so) depende del resultado del remplazo del aminoácido. • En los sitios silenciosos. la mutación sólo sustituye a un codón sinónimo por otro. de modo qu e la proteína no se modifica. e n general. los sitios de remplazo representan el 75 % de una secuencia codificadora y los silenciosos. el 25 por dento. Adem ás de la secuencia codificadora, un gen :Llnticne regiones no traducidas, en cuyo caso, las a utadones so n también porencialmenre neutras, ~parte de sus efectos en la estructura secundaria en general, más bien corta) o en las señales reguadoras. A pesar de que las m uta ciones silenciosas son ~cutrales respecto de la proteína, pueden afectar .a expresión génica por el cambio de secuencia del ::t!'1A. Por ejemplo, un cambio en la estructura se::-undaria puede influ ir en la transcripción, el pro.:esamiento o ]a traducción. Otra posibilidad es que :m cambio en codones sinónLmos requiera de la reséfuesta de un RNAt diferente, de modo que influye =n la eficienda de la traducción. Las m utaciones en los sitios de remplazo deJen corresponder a la divergencia de aminoácidos determinada por el porcentaje de cambios en la ; ecuencia de la proteína). Una divergencia de áciJo nucleico de 0.45% en sitios de remplazo corresnonde a una divergencia de aminoácidos del l% suponiendo que el número promedio de sitios de remplazo por codón sea de 2.25) . De hecho, la di ' ergencia medida subestima las diferencias ocu rri.las durame la evo lución porque en un codón han ~currido muchos eventos, en cuyo caso. normalmente se hace una corrccdón. Tomando el ejemplo de las cadenas de globina 3 y 5 hu manas. en 146 residuos hay lO diferencias, :s decir, una divergenda de 6.9 por ciemo. La se:uencia de DNA tiene 31 cambios en 441 residuos. :\o obstante, estos cambios se distribuyen de ma nera muy düerente en los sitios de remplazo y los ):lenciosos: 11 en 330 sitios de remplazo. pero 20 en ,úlo 111 silenciosos, lo cual resulta en velocidades .!e divergencia (corregidas) de 3. 7% en los sitios de :emplazo y de 32 % en los silenciosos. una dileren :a de casi un orden de magnitud. La asombrosa diferencia en la divergencia de 1s siLi os de remplazo y los silenciosos demuestra .:. existencia de coacciones mucho mayores en las 1sicioncs de tos nudeótidos q ue influyen en la ..unstitución proLeínica respecto de aquellos en qu e :'O, de modo que probablememe muy pocos de los ...ambtos de aminoácidos son neutrales.

Supóngase que se toma el rango de mutación en sitios silenciosos para indicar el rango subyacente de fijación por mutación (lo cual supone que no hay selección en los sitios silenciosos}. de modo que en el periodo transcurrido desde la divergencia de los genes Py 5, debería haber cambios en 32% de los 330 sitios de rempla70, para un total de lOS. Todos, menos 11, han sido elinúnados, lo cual significa que -90% de las mutaciones no sobrevivieron. La divergencia entre cualquier par de secuencias de globina es (más o menos} proporcional al tiempo que llevan separadas, lo cual proporciona un reloj evoluUvo que mide la acumulación de mutaciones a un ritmo aparememente constante durante la evolución de u_na proteína dada. La velocidad de divergencia puede ser medida como la diferencia porcentual por millón de años, o como su recíproco, la unidad de periodo evolutivo (UEP, unit evolutionary period). el tiempo en mill ones de años qu e tarda en desarrollarse el 1% de divergencia. Una vez establecido el reloj por comparaciones pareadas entre especies (recuérdense las dificultades prácticas para establecer el tiempo real de la evolución de las especies), puede aplicarse a genes relacionados denrro de una especie. A partir de su divergencia se podrá calcular el tiempo transcurrido desde la duplicación que los generó. Comparando las secuencias de genes homólogos en diferentes especies. podrá determinarse la velocidad de divergencia tanto en sitios de remplazo como en sitios silenciosos. según se ilustra en la En las comparaciones pareadas. h ay una divergencia promedio de 10% en los sitios de remplazo de cualquiera de los genes de globina ex o ~ de los mam[feros sepa rados desde la radiación de los mamíferos, ocurrida hace -85 millones de años, que

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Sitios silenciosos

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t/! 100

200

300

400

500

Millones de años de separación

la divergencia de las secuencias de DNA depende de la separación evolutiva. Cada punto de La gráfica representa una comparación de pares . 6.4 La divergencia secuencial es La base del reloj evolutivo

105

f@'\ , " f\.!!3,1 #

., ,

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500

............. ~

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200/

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400 300 10~ Millones de años

2ciO

las divergencias en los sitios de remplazo entre pares de genes de globina ~ permiten la reconstrucción de la historia del agrupamiento humano. Este árbol representa la separación de las clases de genes de globina.

corresponde a una velocidad de divergencia de remplazo de 0.12% por .millón de ai\os. La velocidad es estable cuando la comparación incluye Jos genes que se separaron en épocas más distantes. Por ejemplo. el promedio de divergencia de remplazo entre los genes de globina correspondientes de mamíferos y pollos es de 23%, que relacionado con una separación ocurrida hace -270 millones de años, resulla en 0.09% por millón de años. Remontándose aún más, es posible comparar los genes de las globinas ex. y ~ de una especie, los cuales no han dejado de divergir desde que los tipos de genes individual es se separaron hace 500 millones de años (véase la Fig. 6.8), de modo que el promedio de divergencia de remplazo es de -50%, que resulta en una velocidad de 0.1% por millón de años. En el resum en de estos datos que aparece en la Figura 6.9, resalta que la divergencia de remplazo en los genes de globina tiene lugar a una velocidad promedio de -0.096 % por millón de años (o una UEP de 10.4). Considerando la incertidumbre en la estimación del momento en que las especies se separaron, los resultados proporcionan un buen respaldo a la idea de que existe un reloj lineal. La información sobre la divergenáa en los sitios silcndosos es mucho menos clara. En cada caso es evidente que es mucho mayor que la divergencia en los s itios de remplazo, por un factor que fluctúa entre 2 y 1O. No obstante, la difusión de las divergencias en los sitios silenciosos en comparaciones pareadas es demasiado grande como para mostrar

106

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

si el reloj es aplicable (de modo que las comparaciones temporales tienen que basarse en los sitios de remplazo). A partir de la Figura 6. 9 resulta obvio que la velocidad de los sitios silenciosos no es lineal respecto del tiempo. Si se supone que la diveromda debe ser cero a Los cero años de separación, se observa que la veloádad de ctivergencia en los sitios silenciosos es mucho mayor para los primeros - l OO millones de años de separación. Una interpretación es que una fracción de apro>..imadameme la mitad de los sirios silenciosos se satura rápidamente de mutaciones (en unos 100 millones de años) y se comporta como los sitios neutrales. La otra fracción acumula mu taciones más lentamente, a una velocidad aproximadamente igual a la de los sitios de remplazo; esta fracción identifica a los sitios silenciosos respecto de la proteína, pero por alguna otra razón, eso sucede por presión selectiva. Ahora es posible revertir el cálculo de las velocidades de divergencia para estimar el momento en que los genes de una especie se separaron. La diferencia entre los genes Pyohumanos es de 3.7% para los sitios de remplazo. En una UEP de 10.4, es~ tos genes deben haberse separado hace 10.4 x 3.7 = 40 millones de años, más o menos en la época de La separación de las líneas que dieron lugar a los monos del Nuevo Mundo y a Jos del Viejo Mundo, los grandes simios, y al hombre. Todos esros primates superiores tienen tanto genes Pcomo 8, lo cual sugiere que la divergencia génica comenzó justo anles de este punto de la evolución. Remontándose aún más. la divergencia enue los sitios de remplazo de los genes y y e es de 10%, lo cual corresponde a un momento de separación de hace -100 millones de años. La separación entre los genes de globina embrionarios y fetales, por lo tanto, puede haber precedido o acompañado la radiación de los mamíferos. En la se construye un árbol evolutivo de los genes de globina humanos. Las características que evolucionaron antes de la radjación de los mamíferos, como la separación de ~/o de y, deben encontrarse en todos los mamíferos, en tamo que las que evolucionaron después, como la separación de los genes de las globinas py S, deben encontrarse en líneas específicas de mamíferos. En cada especie han existido cambios comparativamente recientes en cuanto a las estructuras de los agrupamientos, lo cual se sabe por las diferencias observadas en el número (un gen de globina P adulto en el hombre, dos en el ratón) o el tipo (casi siempre en función de genes embrionarios y fetales independientes) de Jos genes. Cuando se ha reunido suficiente información sobre las secuencias de un gen en particulat, pueden

? enirse los argumentes y usar las cornparaciones ."" :.re genes de <.liferentes especies para evaluatr re .;.:iones taxonómicas.

GC ~AGCüTAGCTT: C ATTACCGGTACGTICAT~TTCGG

GCT7GCCTAG~ACGTTAC~GGTACGCGCATGTTüGG

7/38=0.18 6/38:0.16 6/38 =0.16 6138: 0.16 6138=0.16 7/38:0.18 7/38 = 0.18 5136= 0.13

GCCAGGCTAGCTTACG~ ACCGGTACGTGGATG1\~CGG

6138 =0.16

GCT ~GCGTAGCCTACGTTAGCGGTACGTGCATATTGGG GGTAGCCTACCTTAGG -TACCGGT~CGTGCTTGTTCGG

La velocidad de sustitución neutral puede ser medida a partir de la divergencia de secuencias repetidas , C::o11cer.to principal

GGTAGCCTAGCTTAGGTTA-.GGTA~GTGCATGTCCGG

GCTACCCTAGCTTACGTTA-CGGTACGTGTCrGTTCGG GCCACCC8AGCTCACGTTACCGGCACGTGCATG~TCGC

CCTAGCCTGGCTTTCGTTAGCGGTACCTGCATCTTCCG

-

La velocidad de sustitución pot· año en sitios neutr11les

es mayor en el genoma del ratón que en el genoma humano.

mejor manera de estimar la velocidad de sustución en los síríos neutrales es examinar la.s se . Jeodas que no codifican proteínas. (En este caso _ utiliza el térmi no neutral y no silencioso po•rq u e - . hay potencial codificador.) Se obtiene una com- 3ración Informativa comparando a los miembros .e una familia repetitiva común en los genmmts del - J mano y del ratón . El principio del análisis se resume en la . partiendo de una familia de secuencias rela:':onadas que han evolucionado por duplicac].ón y astilllción de un miembro original de la misma suponiendo que la secuencia ancestral común uede deducirse tomando la base más común en :ada posición. A partir de ahí se puede calcuJar la _:"ergencia de cada miembro específico de la famia como la proporción de bases que difieren de la : cuencia ancestra 1 deducida. En este ejemplo, la -~\'ergencia entre miembros individuales va de 0. 13 ; 0.18, y el promedio es 0.16. Una familia utilizada para este análisis en el ge.oma humano y el de ratón deriva de una secwencía -.:..te supuestamente dejó de estar adiva por la época _e la divergencia entre el hombre y los roedores (la ..:miJia UNES [long interspersed repeated seque;'lces] ; ease la sección 22.9, Los retroposo.nes se dividen !'!'! rres clases). Esto significa que durante wd,o ese ::empo no ha dejado de divergir sin presión selectiz en ambas especies. La divergencia promedio en :-.hombre es de -0. 17 sustituciones por sitio, lo cual _ •rresponde a un índice de 2.2 x 10-9 sustitucitones "'Or base por año en los 75 millones de años desde -2 separación. Sin embargo, en el genoma del ratón -:.an ocurrido sustituciones neutrales al doble de esta docidad, es decir, a 0.34 sustituciones por sitio en ;:. fam ilia. o a una velocidad de 4.5 x 10·9 . Nótese, n embargo, que si se calcula la velocidad por gene ·ación y no por año, sería mayor en el hombre que = ~ el ratón (- 2.2 x 10..s frente a -l0-9 ). -2

Calcula secuencfa de consenso

1

f

Calcula divergencia a partir de

la secuencia

GCTAGCCTAGCTTACGTTACCGGTACGTGCATGTTCGG de consenso

Una secuencia de consenso ancestral para una familia se calcula tomando la base más común de cada posición. la divergencia de cada miembro actual existente de la familia es calculada como la proporción de bases en que difiere de la secuencia ancestral.

Probablemente en estas cifras se subestima la velocidad de sustitución en el ratón; en el momento de la divergencia, ambas tasas deben haber sido las mismas y la diferencia debe haber evolucionado desde entonces. La velocidad acrual de sustit ución neutral por año en el ra tón es probablemente 2 a 3 veces mayor qt1e el promedio histórico. Estas tasas reflejan el equilibrio entre la ocurrencia de mutaciones y la capacidad del sistema genético del organismo paia corregirlas. La diferencia entre especies demuestra que cada especie tiene sistemas que fun cionan con una eficiencia característica. Comparar los genomas del humano y del ratón permiLe evaluar si las secuencias sinténicas (correspondientes) muestran signos de conservado o han diferido de la velocidad esperada de acumulació n de sustituciones neutrales. la proporción de sitios que muestra signos de selección es -5%, mucho más elevada que la proporción que codifica a proteínas o a RNA (-1 %), lo cual implica que el gcnoma incluye muchos más fragmentos cuya secuencia es importante para las fundones no codificadoras, no para las codificadoras. Los elementos reguladores conocidos tienden a representar sólo una pequeña parte de esta proporción. Esta cifra también sugiere que la mayor parte de las secuencias del genoma (es decir, el resto) , no ciene ninguna función que dependa de la secuencia exacta.

6.5 la velocidad de sustitución neutral puede ser medida a partir de la divergencia de secuencias repetidas

107

111

Los seudogenes son ca LLE~jones sin salida de la evolución

-

Concepto principal

• Los seudogenes no tienen función codificador:a, sin embargo, pueden ser reconocidos por similitudes secuenciales con los genes funcionales existentes. Surgen de La acumulación de mutaciones en g•enes (anteriormente) funcio nales.

Los seudogenes ( ~ ) se definen por su po·s esión de secuencias relacionadas con las de los gen,~s funcionales, pero que no pueden ser traducidas en una proteína funcional. Algunos tienen la misma cstn.lctura general que los genes funcionales, con secuencias que corresponden a los exones y los intrones en las ubicado~ ncs habituales, pero pu.e den haberse tornado inactivos por mutaciones que inhibieron una o rodas las etapas de la expresión génica. Los cambios pueden abolir las señales de inicio de la transcripción al impedir el corte y empalme en las uniones exón-inrrón o terminar la traducción prematuramente. En general. un seudogén tiene numerosas mutaciones deletéreas. pues, presumiblemente, una vtz que dejó de estar activo, ya no hubo impedimento para la acumulación de mutaciones adicionales. En varios sistemas se han encontrado seudogenes gue representan versiones inactivas de genes activos actualmente, entre otms, los de la globina, Jos de las inmunoglobuHnas y los de los antígenos de hiswcompatibilidad, en los cuales se localizan cerca del agrupamiemo de genes, a menudo intercalados con los genes activos.

Características del gen activo

Cambios en el seudogén

Promotor

Mutaciones del promotor

Empalmes

Pérdida de los empalmes

Marcos de lectura abiertos

Mutación sin sentido Mutaciones de cambie• de sentido

Desde que un gen de globina ~ se convirtió en seudogén, han ocurrido muchos cambios.

108

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

Un ejemplo típico es el seudogén o/~2 del conejo, que presenta la organización usual de exones e imrones y se relaciona muy íntimamente con eJ gen funcional de globina ~ 1, pero no es funcional. En la se resumen los múltiples cambios ocurridos en dicho seudogén. La deleción de un par de bases en el codón 20 de \f'P2 ha dado luga r a un cambio del marco de lectura que poco después llevará a la tennínación. Numerosas mmaciones puntuales han modificado a codones posteriores que representan a aminoácidos muy conservados en las globinas ~· Ninguno de los dos intrones tiene ya fronteras reconocibles con los exones, así que probablemente los intrones no podrían ser cortados, ni siquiera si el gen fuera t ranscrito. De cualquier forma, no hay transcritos que correspondan al gen, quizá porque ha habido cambios en la regió.o flanqueante 5'. Esta lista de defectos incluye mutaciones que podrían impedir cada etapa de la expresión génica, por Jo tanto, no se cuema con medios para decir qué evento desactivó originalmente a dicho gen. Ahora bien, si se mide la divergencia entre el seudogén y el gen funcional, será posible estimar el momento en que se originó el seudogén y cuándo se empezaron a acumular sus mutaciones. Si el seudogén se desactivó en cuanto fue generado por la duplícación de ~1 , se debe esperar gue la velocidad de divergencia tanto en sit ios de remplazo como en sitios silenciosos sea la misma (diferüán sólo si el gen es traducido para crear p resión selectiva en los süios de remplazo) . De hecho, hay menos sustituciones en los sirios de remplazo que en los silenciosos, lo cual sugiere que, al prlncipio (mientras el gen era expresado), hubo selec:ción contra la sustitución e n el sitio de remplazo. A partir de la extensión relativa de la sustitución en los dos tipos de sitio, podemos calcu lar que l.f'~2 se separó de ~l hace -55 m ill ones de años y siguió siendo un gen funcional durante 22 millones de años, pero ha sido un seudogén durante los últimos 33 millones de años. Es posible hacer cálculos similares para o tros seudogenes. Algunos patecen haber estado activos por algún tiempo antes de convertirse en seudogenes, en tanto que ot ros parecen haber estado inaclivos desde el momento mismo de su generacíón. El punto general manifestado por las estructuras de estos seudogenes es que cada uno evolucionó de maneta independiente durante el desarrollo del agrupamiento de genes de globina de cada espe cie, fenómeno que refuerza la conclusión de que la creación de nuevos genes, seguida de su aceptación como duplicados funcionales, de la variación para convertirse en nuevos genes funciona les o de

- :"lactivación como seudogenes. es un proceso :inuo en el agrupamiento de genes. La mayoría !as familias de genel> tienen miembros que son --Jogenes, los cuales suelen constituir una mino - :-educida del número total de genes. El gen de globina \}'cd del ratón tiene una pro_jad interesante. precisamente carece de ambos ·:ones. Su secuencia puede ser alineada (permi_:ldo la acumulación de mutaciones) con la del - -.\m de la globina a. El momenlO aparente de la ...;acrivación coincide con la duplicación originaL cual sugiere que el evento desactivador original -~uvo asociado con la pérdida de los intrones. Las secuencias genómicas inactivas similares al ~3nscrito de RNA se llaman seudogenes proce..ados, que después de un evento de transposición ~trógrada se originan por inserción e11 algún sitio ..eatorio de un producto derivado del RNA. como e describe en el Capítulo 22, Retrovirus y retropo>nes. Sus rasgos característicos se resumen en la ?Jgt.U"a

22.19.

Si los seudogenes son callejones sin salida de la .. \'olución, simples compañías no deseadas de la re :structuración de genes funcionales, ¿por qué aún :stán presentes eo el genoma? ¿Llevan a cabo algu :ta función o no tienen ningún fin. en cuyo caso, no debería existir presión selectiva para su retención? Cabe recordar que se ven los genes que han :-.obrevivido en poblaciones presentes. pero en el pa;,ado puede haber sido eliminado un número inde:erminado de ellos. Dicha eliminación pudo ocurrir por dclccíón de la secuencia como evento repentino o por la actlmulación de mutaciones hasta el punto de que el seudogén ya no fuera reconocido como miembro de Sl.J familia de secuencia original (probablemente el destino final de cualqu ier seudogén no eliminado repeminamente). Incluso lns reliquias de la evolución pueden ser duplicadas. En los genes de glohi na ~de la cabra hay tres especies adultas, PA, PB y pe (véase la Fig. 6.7). cada una con seudogén localizado algunas kiloba ses en flujo ascendente. Los seudogenes se relacionan mejor entre sí que con los genes de globina P adultos; en particular, comparten varias mutaciones desacrivadoras. Además, estos últimos se relacionan mejor entre sí que con los seudogenes, lo cual implica que se duplicó una estructura original \f'PP y se originaron genes ~ fundonales (que después se sepaiaron) y dos genes no funcionales (que divergieron hacia los seudogenes actuales).

Los mecanismos que causan la duplicación. la deleción y la reorgcmizad6n de los genes actúan en todas las secuencias reconocidas como miembros del agntpamiento, sean o no funcionales. Se deja a la selecdón la tarea de discriminar entre Jos productos.

Por definición, los seudogenes no codifican proteínas y en generaL carecen de función . Empero, cuando menos en un caso excepcional. un seudogén desempeña una función reguladora. La transcripción de un seudogén inhibe la degradación del RNAm producido por su gen activo homólogo. Muy probablemente hay una proteína responsable de esta degradación que unt: a una secuencia espeófica en el RNAm. Si esta secuencia está también presente en el RNA transcrito del seudogén, el efecto de la proteína se diluirá cuando el seudogén sea rranscriro. No está claro qué tan comunes puedan ser tales efectos, pero como regla general. podemos esperar que los efectos de dilución de este tipo sean posibles siempre que los seudogenes se transcriban .

111

Mediante entrecruzamiento desigual se reestructuran los agrupamientos de genes

ConreJ)tos p1incipales • Cuando un genoma contiene un agrupamiento de genes con secuencias relacionadas, el apareamiento erróneo entre genes no alélicos puede causar un entrecruzamiento desigual, de modo que se produce una deleción en un cromosoma recombinante y una duplicación correspondiente en el otro. • Las talasemias diferentes son causadas por varias deleciones en que se elimina el gen de la globina et o el de la ~. La gravedad de la enfermedad depende de cada deleción.

En un agruparnkoto de genes idénticos o relacionados hay oporrunidades frecuentes de reorganización, cuyos resultados se aprecian al comparar los agrupamiemos ~ ele los mamíferos incluidos en la Figura 6.7. A pesar de que los agrupamientos cumplen la misma función y todos tienen la misma organ ización genera l. difieren en tamaño y varía el número total y el tipo de genes de globina ~ ~ así como los números y las estructuras de los seudogenes. Todos estos cambios deben haber ocurrido desde la radiación de los mamíferos. hace -85 millones de años (último punto de la evolución común a rodos los mamíferos). La comparación resalta el pumo general de que la duplicación, la reorgani7.ación y la variadón de los genes son factores tan imponarnes en la evolución como la acumulación lenta de mutaciones en genes individuales. ¿Qué tipos de mecanismos son responsables de la reorganización génica? Como se describió en la introducción de este capíru lo, el entrecruzamiento desigual puede ser resulrado del apareamiento entre dos sitios no homó-

6. 7 Mediante entrecruzamiento desigual se reestructuran los agrupamientos de genes

109

Cromosoma 1 Entrecruzamiento Cromosoma 2

~

t

Cromosomas recombinantes recíprocos Entrecruzamiento desigual

Entrecruzamiento

lt

Cromosomas progenitores apareados erróneamente

Cromosomas recomblnantes no recfprocos

El número de genes puede ser modificado por entrecruzamiento desigual. Si el gen 1 de un cromosoma se aparea con el 2 del otro, las otras copias del gen quedan excluidas del apareamiento. La recombínación entre genes apareados erróneamente produce un cromosoma con un sola copia (recombinante) del gen y un cromosoma con tres copias del gen (una de cada progenitor y una recombinante).

logos. Normalmente, la recombinadón involucra a secuencias de DNA correspondientes situadas en alineación exacta entre los dos cromosomas homólogos. Sin embargo, cuando hay dos copias de un gen en cada cromosoma, un desalinea11Uemo ocasional permite que se apareen entre sí (lo cual implica que algunas de las regiones adyacentes se desapareen) . Esto puede suceder en una región de repeticiones cortas (véase la Fig. 6.3) o en un agrupamiento de genes. En la se observa que el entrecruzamiento desigual en un agrupamiento de genes puede tener dos consecuencias, una cuantitativa y otra cualitativa: • El número de repeticiones aumenta en un cromosoma y disminuye en d otro, de tal forma que un cromosoma recombinante sufre una deleción y el otro una inserción, independientemente de la localización exacta del entrecruzamiento. En la figura, en el primer recombinante aumenta el número de copias del gen, de dos a tres, en tanto que en el segundo recombiname se reduce de dos auna. • Si el evento de recombinación sucede en un gen (y no entre genes), el resultado depende de que los genes recombinados sean idénticos o sólo estén relacionados. Si las

110

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

copias uno y dos del gen no correspondiente son completamente homólogas, no hay cambios en la secuencia de ninguno de los genes. Sin embargo, también puede ocurrir un entrecruzamiento no equivalente cuando los genes adyacentes están bien relacionados (aunque la posibilidad es menor que cuando son idénticos). En este caso, cada uno de los genes recombinantes tiene una secuencia diferente de la de cualquiera de los progenitores. Que el cromosoma tenga una ventaja o una desventaja selectiva, dependerá de la consecuencia de cualquier cambio en la secuencia del producto del gen, así como del cambio en el número de copias. Un obstáculo para el entrecruzamiento desigual es representado por la estructura interrumpida de los genes. En un caso como el de las globinas, los exones correspondientes de las copias adyacentes del gen tienden a estar lo suficientemente bien relacionadas como para sostener el apareamiento, pero las secuencias de los intrones han divergido de manera notaría. La restricción de aparearse con los exones reduce considerablemente el fragmento continuo del DNA potencialmente involucrado, con lo cual se reduce la posibilidad de un entrecmzamiento desigual, por lo tanto, la divergencia entre intrones potenciaría la estabilidad de los agrupamiemos de genes y clisminuiría la posibilidad de un entrecruza míen to desigual. Las talasemia s son resultado de mutaciones que reducen o inhiben la sín tesis de la globina ex. o la p. La incidencia de entrecruzamiento desigual en los agrupa11Uentos de genes de la globina humana es revelada por la naturaleza de ciertas talasemias. Muchas de las ralasemias más severas resultan de deleciones de una parte del agrupamiento. Cuando menos en algunos casos, los extremos de la deleción se encuentran en regiones homólogas, que es exactamente lo que se esperaría si se hubiera generado por un entrecruzamientO desiguaL En la se resumen las deleciones que causan ralasemias a; las de cx.-tal - 1 son largas y su localización varía en el extremo izquierdo, en tanto que las posiciones del extremo derecho se localizan más aJJá de los genes conocidos y eliminan a los dos genes a. Las deleciones de cx.-ral-2 son corras y eliminan sólo a uno de los dos genes ex.. La deleción L elim ina 4.2 kb de DNA. incluido el gen c.x2; probablemente resulta de un ent recruzamiento desigual, porque los extremos de la deleción están en regiones homólogas, justo a la derecha de los genes \VCX. y a2, respectivamente. La deleción R resu lta de la eli minación de exactamente 3.7 kb de DNA, distancia exacta entre los genes c.xl y cx.2. Esta deleción parece haber sido generada por un entrecruzamiento des-

igual enrre los mismos genes o.l y o:2, precisamente la situación que se ilustra en la Figura 6.13. Dependiendo de la combinación diploide de cromosomas talasénúcos, un índividuo afectado puede tener de cero a tres cadenas a. Hay algunas diferencias emre el tipo silvestre (cuatro genes o:) en individuos con dos o tres genes a., pero si un individuo tiene sólo un gen a , el exceso de cadenas Pforma el inusual tetrámero P4 , que provoca la enfermedad de hemoglobína H (HbH). La carencia total de genes a resulta en hidrops fetalis (o hidropesía fetal). que es fatal al nacer o después del nacimiento. El mismo entrecruzamiento desigual que generó el cromosoma talasémico debe haber generado 1ambién un cromosoma con tres genes a. En dertos casos se han identificado inclividuos con dicha característica, y en algunas poblaciones. la frecuencia del locus a triple es casi la misma que la del Jocus o: sen cillo, mientras que en otras, los genes a triples son mucho menos comunes que los sencillos, lo cual sugiere que en diversas poblaciones operan factOres selectivos (desconocidos) que ajusta los niveles génicos. Las variaciones en el número de genes a son relativamente frecuentes, lo cual permite argumentar que el emrecruzamienro desigual en el agrupamien10 debe ser bastante común, si bien se observa con más frecuencia en el agrupamiento a que en el p, posiblemente porque los intrones de los genes o. son mucho más cortos y por lo tanto presentan menos impedimentos para el apareamiento erróneo entre genes no homólogos. Las dcleciooes que provocan las Lalasemias ~se res umen en la . En algunos casos (raros), sólo el gen Presulta afectado. con una deleción de 600 bp, a partir del segundo íntrón, pasando por las regiones flanqueantes 3'. En Jos otros casos, muchas de las deleciones son muy largas. del extremo 5', indicado en el mapa, hasta >50 k.b hacia la derecha. El tipo Hb Lepore proporciona la clásica evidencia de que la deleción puede resultar de un entrecruzamiento desigual entre genes ligados. Los genes ~ y B difieren únicamente -7% en sus se.::uencias. La recombínación desigual elimina material emre los genes, fusionándolos (véase Fig. 6.13). El gen fusionado produce una cadena individual 1ipo P formada por la secuencia terminal N de B. uoida a la secuenda terminal C de p. Acrualmente se conocen numerosos tipos de Hb :..epore, y la diferencia radica en el punto de transidón de las secuencias de B a ~. así que cuando los genes B a P se aparean por entrecruzamiento desigual, el pumo exacto de recombinación determina :a posición en que sucede cambio de secuencia oa 3 en la cadena de aminoácidos.

ljl~ IVCt ljiCX

........ .... et2

Ct 1

9

a-taJ-2L a-tai-2R cx-lal-1-Tailandesa

Borrado

Restante

las talasemias ce resultan de varias deleciooes en el agrupamiento de genes de globina ce.

Hb Lepare

G.,Ay HPFH G-¡Ay HPFH Hb Kenia

yj3 tal

bina

~

Las deleciones del agrupamiento del gen de glocausan varios tipos de talasemias.

El recíproco de este evento ha sido encontrado en la forma de Hb anti-Lepore, producida por un gen que riene la parte terminal N de ~ y la parte terminal e de EL gen fusionado está entre los genes y P normales. La evidencia de que pueden presentarse entrecruzamientos desiguales entre genes cuya relación es lejana proviene de la identificación de la Hb K enía, otra hemoglobina fusionada, la cual contiene la secuencia terminal N del gen""( y la secuencia terminal e del gen ~·La fusión debe haber resultado del entrecruzamiento desigual entre "'y y ~. cuyas secuencias difieren -20%.

o

o.

ó.7 Mediante entrecruzamiento desigual se reestructuran los agrupamientos de genes

111

A partir de las diferencias entre los agrupamientos de genes de glohina de varios mamíferos se observa que la duplicació n seguida (algunas veces) de la variación ha sido un elemento importante en la evolución de cada agrupamiento. las deleciones talasémicas humanas demuestran que el entrecruzamiento desigual sigue ocurriendo en amJ?os agrupamiemos de genes de globinas. Cada vez que un evento de esta nawrale1.a genera una duplicación y una deleción. debe tomarse en cuenta el futuro de los loci reco mbinantes de la población. Las deleciones también pueden ocurrir (en principio) por recombínación enn·e secuencias homólogas que se encuentran en el mismo cromosoma, fenómeno que no genera una duplicación correspondiente. Es difícil calcular la frecuencia natural de estos eventos porque las fuerzas selectivas ajustan rápidamente los niveles de los diversos agrupamientos de la población. En general. una conrracdón en el número de genes tiende a ser nociva y descartada a favor de otra, sin embargo, algunas poblaciones pueden Lener una ventaja compensadora quemantenga a la forma eliminada en una frecuencia baja. Las estructuras de los agrupamientos humanos actuales muestran varías Liuplicaciones que dan res1imonio de la importancia de tales mecanismos. Las secuencias funcionales incluyen dos genes a. que codifican a la misma proteína, bastante bien relacionados con los genes ~ y S, y dos genes y casi idénlicos. Estas duplicaciones independientes comparativameme reciem es han sobrevivido en la población, sin mencionar a las duplicaciones más distantes que originalmente generaron los diversos tipos de genes de globina. Otras duplicaciones pueden haber dado lugar a seudogenes o se han perdido. Es de esperar que la duplicación y la deleción continuas sean características de todos los agrupamkntos de genes.

Los genes del RNAr forman repeticiones en tándem l:tlnceptos principales • El RNA ribosómico es codificado por un número considerable de genes idénticos que se repiten en tandem para formar uno o más agrupamientos. • Los agrupamientos de DNAr se organizan de manera tal, que las unidades de transcripción que resultan en un precursor unido a los RNAr principales alternan con espaciadores no transcritos. En los casos descritos hasta ahora, hay diferencias entre los miembros individuales de un agrupamien tO de genes que permiten que la presión selectiva

112

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

actúe de manera independiente en cada gen, y hay. por e l contrario, dos casos de agrupamientos grandes de genes que contienen varias copias idénticas del mismo gen o genes. La mayoría de los organismos contienen múiLíplcs copias de los genes para las hisronas, que son un componente fundamental de los cromosomas, y casi siempre hay varias copias de los genes que codifican a los RNA ribosómicos; Jo que plantean interrogantes evolutivas de inrerés. El RNA ribosómico es el productO predominante de la transcripción, pues constituye del 80 at 90% de la masa LOta! del RNA celular de las eucariotas y las procariotas. El número de genes mayores de RNAr fluctúa entre 7 de E. co!i, lOO a 200 de las eu cariotas inferiores y varios cientos en las eucariotas superiores. Los genes que codifican al RN,Ar grande y al pequeño (encontrados en las subunidades grandes y pequeñas del ribosoma, respecLivamente) suelen formar un par en tándem (la única excepción son las milocondrias de las levaduras). La ausencia de una variación detectable en las secuencias de las moléculas de RNAr implica que todas las copias de cada gen deben ser idénticas, o cuando menos sus diferencias deberán estar por debajo del nive l de detección del RNAr (-1 %). Un punto de gran interés son los mecanismos utilizados para evitar que las variaciones se acumulen en las secuencias individuales. En las bacterias, los múltiples pares de genes de RNAr están dispersos, míemras que en la mayoría de los núcleos eucarióticos están contenidos en agrupamientos en tándem, regiones que suelen llamarse D N Ar. (En algunos casos, la proporción de DNAr en el total del D~A aunada a su composición básica atípica, es lo suficicmemente importante como para aislarse como fracción independiente. directamente del DNA genómico cortado.) Una característica cliagnóslica importante de un agrupamiento en tándem es que genera un mapa de restricción eirculaL como se muestra en la Supongamos que cada unidad de repetición tiene tres sitios de restricción. Cuando se mapean esws fragmentos por medios convenciona les, se observa que A está j unto a B, que está junto a C. que está j umo a A, generando un mapa circular. Si el agrupamiento es grande, los fragmentos internos (A, B y C) estarán presentes en cantidades mucho mayores que los terminales (X y Y), mismos que conectan al agrupamiento con el DNA adyacente. En un agrupamiento de l 00 repetidones. X y Y estarían presentes al l % del nivel de A. B y C. lo cual puede dificultar la obtención de los extremos de un agrupamiento de genes con fines de mapeo. La región del núcleo donde sucede la síntesis del RNAr tiene un aspecw característico, con un núcleo

1

Organización lineal del agrupamiento Repetición 1

Repetición 2

Espaciador no transcrito

Repetición 3

Repetición 4

Unidad de transcripción

1

1

~\/.'~\..lA~

~

~'VJVA:/"\J

~

~

Sitios de división por restricción

X

A

8

e

A

e

8

A

8

e

A

8 Y

Mapa de restrtccfón

e

A 8

Un agrupamiento de genes en tándem presenta alternancias en las unidades de transcripción y los espaciadores no transcritos y genera un mapa de restricción circular.

de naturaleza fibrilar rodeado de una corteza granular. El núcleo fibrilar es donde se transcribe e! RNAr a partir del molde de DNA, y la corteza granular está formada por partículas ribonucleoprotemicas en las cuales se ensambla el RNAr. El área completa se llama nucleolo, y su morfología característica es obvia en la Las regiones cromosómicas paniculares asociadas con un nucleolo se llaman organizadores nucle ola r es, cada uno de los cuales corresponde a un agrupamiento de genes de RNAr repetidos en tándem en un cromosoma. La concen tración de dichos genes, aunada a su muy inLensa transcripción, es la causa de la morfología característica de los nucleolos. El par de RNAr mayores es tra nscrito como el único precursor, tanto en los núcleos de las bacterias como de las eucariotas. Después de la transcripción. el precursor se divide para liberar a las moléculas individuales de RNAr. La unidad de transcripción es más pequeña en las bacterias y más larga en los mamíferos (en cuyo caso se conoce como RNA 455, según su velocidad de sedimentación). Un agrupamiento de DNAr contiene muchas unidades de transcripción. cada una separada de la siguiente por un espaciador no transcrito. La alternancia de una unidad de transcripción y el espaciador no transcrito es observable directamente en micrografías electrónicas. El ejemplo de la proviene del tritón Notopthalmus viridescens, en e! que cada unidad de transcripción se expresa intensa-

El centro nucleolar identifica a los DNAr en proceso de transcripción, y la corteza granular circundante consta de unidades ribosómicas ensambladas. Esta sección delgada muestra el nucleolo de la nutria Notopthalmus viridescens. Imagen cortesía de Osear Miller.

mente, de manera que varias polimerasas de RNA panicipan simultáneamente en la transcripción de una unidad de repetición. Las polimerasas están tan cercanas que los transcritos de RNA forman una matriz característica que muestra una longitud eredente a lo largo de la unidad de transcripción. 5 8 Los genes del RNAr forma n repeticiones en tándem

113

La transcripción de agrupamientos de DNAr genera una serie de matrices, cada una de las cuales corresponde a una unidad de transcripción separada de la siguiente por el espaciador no transcrito. Imagen cortesía de Osear Miller.

Región repetitiva 1

-500 bp

Región Transcripción Región repetitiva 3 repetitiva 2 Islote Islote Islote Bam Bam Bam

-300 bp

Longitud variable repeticiones de 97 bp

-300 bp

Longitud variable repeticiones de 60181 bp

2 300-5 300 bp

Longitud variable repeticiones de 60{81 bp

)1

EL espaciador no transcrito del DNAr de X. laevis tiene una estructura que se repite internamente y es La causa de sus variaciones de Longitud. Los islotes Bam son secuencias constantes cortas que separan a las regiones repetitivas.

Los genes repetidos de RNAr mantienen una secuencia constante Conceptos pt in ei pale;, Todos los genes de un agrupamiento de DNAr tienen secuencias idénticas. • Los espaciadores no transcritos consisten en unidades repetidoras más cortas cuyo número varia, de modo que la longitud de cada espaciador es diferentes.

La longitud del espaciador no transcrito varía mucho emre especies y (en ocasiones) dentro de una misma especie. Las levaduras tienen un espaciador no transcrito corto cuya longitud es relativamente constante. En D. melanogaster se observa una variación casi del doble emre diferentes copias de la unidad de repe[ición. En X. laevis la situación es similar. En cada uno de estos casos. todas las unidades de repetidón están presentes a manera de un solo agrupamiento en tándem individual en un cromosoma específico. (En el ejemplo de D. melanogaster, ésre re114

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

sulta ser el cromosoma sexual. El agrupamiento del cromosoma X es más grande que el del cromosoma Y, así que las moscas hembra tienen más copias de los genes de RNAr que las moscas mad1o.) En los mamíferos. la unidad de repetición es mucho más extensa, y comprende la unidad de transcripción de -13 kb y un espaciador no transcrito de -30 kb. Normalmente, los genes forman numerosos agrupamientos dispersos, en el caso del hombre y del ratón, los agrupamientos residen en cinco y seis cromosomas, respectivamente. Una pregunta interesante (pero sin respuesta) es cómo puede funcionar el mecanismo corrector que, presumiblemente funciona en un solo agrupamiento y garantiza la constancia de la secuencia del RNAr, cuando hay varios agrupamiemos. J~as dife rencias de longitud del espaciador no transcrito de un solo agrupamiento de genes contrasta con la conservación de la secuencia de la unidad de transcripción. A pesa r de esta variación, las secuencias de los espadadores no transcritos más extensos siguen siendo iguales a las de Jos espadadores no transcritos más corros, lo cual implica que cada espaciador no transcrito es internamente repetitivo, de modo que la variación en longilud resulta de los cambios en el n(•mero de repeticiones de alguna subunidad. Las características generales de los espaciadores no Lranscri[OS se ilustran con el ejemplo de X. laevis en la . Las regiones cuya longitud es fija, alternan con Las de longitud variable. Cada una de las tres regiones repetitivas comprende un número variable de repeticiones de una secuencia más bien cona. Un tipo de región repetitiva tiene repeticiones de una secuenda de 97 bp; el otro. presente en dos ubicaciones, tiene una unidad de repetición en dos forma s, de 60 bp y de 81 bp de largo. La valiación eo el número de unidades de repelición en las regiones repetitivas representa la variación total en la longitu d de los espaciadores. Las regiones repetitivas están separadas por secuencias constantes más cortas, llamadas is lotes Bam. (Su nombre se debe a que para el aislamiento se u tilizó la enzima de resuicción BamHT.) A partir de este tipo de organización. se observa que el agrupamiento ha evolucionado por duplicaciones en que está impli cada la región promotora . Es necesario explicar la falta de variaciones en las copias expresadas de los genes repetidos. Un modelo supondría la demanda cuantitativa de determinado número de secuencias "buenas'', pero esto permitiría que las secuencias mutadas se acumularan a tal pumo, que su porción en el agrupamiento sería lo suficiemcmente grande como para que fuera ejercida la presión selectiva. Es posible excluir

estos modelos por la ausencia de dicha variación en d agrupamientO. La falta de variación implica una presión selectiva insensible, en cicna forma, a las variaciones ' ndividuales. Un modelo '>ttpondría que el agru:-•amiemo entero es regenerado periódicamente a partir de uno o de varios miembros. De hecho, en .:ada generación. prácticamente en cualquier me:anismo necesita estar involucrada la regeneración. :=ste tipo de modelos puede ser excluido porque un .3grupamiento regenerado no mo~rraría variaciones =n las regiones no transcritas de las repeticiones in dividuales. Lo cual plantea un dilema. La va1iación en las ~egiones no transcritas sugiere frecuentes emrecruz.a.mientos desiguales. con lo cual cambiará el tama :lo del agrupamjento. pero no las propiedades de las ~pe ti ci ones individuales. ¿Entonces cómo se evita .a acumu lación de mutaciones? En la próxima sec..:i.ón se verá que la contracción y la expansión con:inuas de un agrupamiento suelen proporcionar u n :neca nismo para la homogenización de sus copias.

. • La fijación entrecruzada podría ma ntener repeticiones idénticas Conceptos pnncipale!i

• Un entrecruzamiento desigual cambia el tamaño de un agrupamiento de repeticiones en tándem. las unidades de repetición pueden eliminarse o repartirse entre los agrupamientos.

El mism o problema se encuentra siempre que un ~en ha sido duplicado. ¿Cómo imponer la selección . .:~ ra evitar la acumu lación de ID1.Jtadones dele té:t:as? La d uplicación de un gen probablemente resulte ::n u na relajación inmediata de la presión evolutiva obre su secuencia. Ahora qu e hay dos copias idén~cas, un cambio en la secuencia de una no privará z organismo de una proteína funcional. porque la ~ ::cuencia original de Jos aminoácidos sigue siendo .....Uficada por la Olra copia. Después, la presión se:,:tiva se difunde en ambos genes, hasta que uno -~ellos mura lo suficientemente lejos de su función =-iginal como para enfocar toda la presión selectiva _ . el otro. Inmediatamente después de la duplicación de -:i gen, los cambios pueden acumularse más rápida::nte en una de las copias, llevando eventualmente : :Jna nueva función (o a la obsolescencia en forma -:: seudogén). Si se desarrolla una nueva función, .:onces el gen evoluciona a la misma velocidad,

más lema, característica de la fundón original. Pro bablemente ést~ sea el tipo de mecanismo causante de la separación de las funciones entre los genes de globina embrionarios y Jos adultos. Aún así. hay instancias en que los genes duplica dos conservan la misma !unción. codificando proteínas idénticas o casi idénticas. Las proteínas idénticas son codificada~ por dos genes de globlna ahwnanos y sólo difiere un aminoácido entre las dos proteínas de globina y. ¿Cómo se ejerce la presión selectiva para mamener la idcnúdad de la secuencia? La posibilidad más obvia es que, de hecho, dos genes no tienen fuodones idénticas, sino que difieren en algunas propiedades (no detectadas), como el tiempo o el lugar de expresión. Orra posibilidad es que la necesidad de dos copias sea cuantitativa, dado que ninguna produce, de por sí, suficiente cantidad de proteín a. De cua lquier forma, en casos más extremos de repetición es imposible evitar la con clusión de que ninguna de las copias del gen es esencial. Cuando hay varias, los efectos in media Los de la mu tación en cualquiera de ellas deben ser muy leves. Las consecuencias de una mutación individual se diluyen por el gran número de copias del gen que conservan la secuencia de tipo silvestre, pueden acumularse muchas copia!. mutantes antes de que se genere un efecto letal. La letalidad se torna cuantitativa, conclusión que se refuerza por la observación de que la mitad de las unidades del agrupamiento de DNAr de X . laevis o de D. melanogaster pueden ser borradas sin efecros adversos. ¿Cómo se impide, entonces, que estas unidades act1mulen gradualmente mutaciones delctéreas? ¿Qué posibilidades hay de que la rara mmadón favorable muestre sus ventajas en el agrupamiento? El principio básico de los modelos para explicar la conservación de la idcnridad entre copias rep etidas es suponer que los genes no a lélicos no se h eredan de manera independiente, sino que deben ser regenerados continuamente de una de las copias de una generación precedente. En el caso m6s sencillo de dos genes idénticos, cuando en una copia ocurre una mutación, o es eliminada de forma aleawria (porque la secuencia de la otra copia toma el control), o se extiende a ambos duplicados {porque la copia mutante se convierte en la versión dominanre). La dispersión expone a la mutación a la selección. El resultado es que los dos genes evolucionan jumos. como si existiera un solo locus, fenómeno conocido como evolución coincid en tal o e volución concerta da (ocasionalmente, coevolución), que puede aplicarse a un par de genes idénticos (con suposiciones posredores) o a un agrupamiento que comenga numerosos genes.

ó. IO La fijación entrecruzada podría mantener repeticiones idénticas

l

115

Un mecanismo supone que las secuencias de los ge nes no alélicos se comparan direct-amente }' son homogeneizadas por las enzimas que detectan cualquier diferencia. Esto se logra por el inrexcambio de cadenas individuales para formar genes, una de cuyas cadenas deriva de una copia y la otra, de la otra copia. Cualesquiera diferencias se revelan como bases apareadas impropiamente, lo cual atrae la atención de las enzimas susceptibles de escindir y remplazar una base, de modo que sólo los pares A-T y G-C sobreviven. A este tipo de evento se le llama conversión génica y se relaciona con la recombinación genética. Debería ser posible comprobar el alcance de tales eventos al comparar las secuen cias de genes duplicados, pero si están sujetos a la evolución concertada, no debería verse la acumulación de sustitu ciones de s irios silenciosos (porque el proceso de bomogeneización se aplica tanro para éstos como p.;~ra los sitios de remplazo) . Se sabe que la extensión del mecanismo de mantenimiento no debe rebasar al gen mismo, puesto que hay casos de genes duplicados cuyas secuencias flanqueantes son enteramente distintas. De hecho, podrían verse límites abruptos que marcan los extremos de las secuencias homogeneizadas. Cabe recordar que la existencia de dichos me canismos puede jnvalidar la determinación de la historia de genes de ese tipo a uavés de su divergencia, puesto que la divergencia refleja sólo el tiempo

transcurrido desde el último evento de homogemización/ regeneración, no la duplicaciÓ11 original. El modelo de f ijación cruzada supone que un agrupamiento entero esrá sujeto a reestructuración continua por el mecanismo de entrecruzamiento desigual. Dichos evenws suelen explicar la evolución concertada de múltiples genes si el entrecruzamiento desigual provoca que todas las copias sean regeneradas físicamente a partir de una copia. Siguiendo el tipo de evento ilustrado en la Figura 6.13, por ejemplo, el cromosoma que porta un locus triple podría sufrir la deleción de uno de los genes. De los dos resta rnes, l l/2 representa la secuencia de una de las copias originales; sólo la mitad de la secuencia de la otra copia origjnal ha sobrevivido" Cualquier mutación de la primera región ahora exisTe en ambos genes y está sujeta a la presión selectiva. El agrupamiento en tándem proporciona oportunidades frecuentes de "apareamiento errón eo'' de genes cuyas secuenCias son las mismas, pero que ocupan diferentes posiciones en sus agrupamientos. Mediante la expansión y contracció n constantes del número de unidades por entrecruzamiento desiguaL es posible que rodas las unidades de un agrupamiento sean derivadas de una proporción bastante pequeña de las de un agrupamiento ancestral. 116

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

Las variaciones en la Jongiwd de los espadadores coinciden. con la idea de que los eventos de entrecruzamiento desigual suceden en los espaciadores apareados internamente de manera errónea, lo cual explícaría la homogeneidad de los genes comparada con la variabilidad de los espaciadores. Los genes son expuestos a la selección cuando unidades de repetición específicas son -amplificadas en el agrupamiento, pero los espaci<1dores son irrelevantes y pueden acumular cambios. En una región de DNA no repetitivo, la recombinación ocurre entre puntos coincidentes precisos de dos cromosomas homólogos, generando así recombinan,tes recíprocos. La base de esta precisión es la capacidad que tienen dos secuencias de DNA dúplex para alinearse exactamente. Se sabe que la recombioación desigua l puede ocu rrir cuando hay múltiples copfas de un gen cuyos exones están reladonados, incluso si sus secuencias flanqueadoras e interventoras difieren, y esto por el apareamiento erróneo entre exones correspondientes en genes no alélicos. fmag(nese qué tan frecuente debe ser la desalineación de un agrupamiento en tándem de repeti ciones idénticas o casi idénticas. ¡Exccpro en los meros extremos del agrupamiento, la cercana relación entre repeticiones sucesivas imposibilita incluso la definición de las repeticiones exactamente correspondientes! Esto tiene dos consecuencias: ajuste continuo de l tamaño del agrupamiento y homogeneización de la unidad de repetición. Considérese una secuencia formada por la unidad de repetición "ab'' con extremos "x" y ''y''. Si se representa un cromosoma de color negro y el otro de distinto color, el alineamiento exacto entre las secuencias alélicas sería:

xababababababababababababababababy xababababababababababababababababy Sin embargo, es probable que cualquier secuencia ab del cromosoma se aparée con cualquier secuencia ab del otro cromosoma, en una desalineación del tipo de:

xababababababababababababababababy xababababababababababababababababy la región de apareamiento no es menos estable que en e! par alineado, a pesar de ser más corta. No se sabe mucho acerca de cómo se in icia el apareamiento antes de la recombinación, pero es muy probable que empiece entre regiones conas correspondientes y luego se düunda. Si empieza en el DNA satélite, es más probable que no implique unidades de repelición que no tengan ubicaciones exactamente correspondientes en sus agrupamientos. Ahora supóngase que un evento de recombinación tiene lugar en la región apareada desigualmente.

Los recombinantes tendrán un número diferen te de unidades de repetición. En un caso, el agrupamiento será más largo y en el otro, se habrá acortado,

xababababababababababababababababy X

xabababababababab~babababababa baby

J. xababababababababababababababababababy +

xababababababababababababababy donde ~x" indica el sitio del entrecruzamiento. Si este tipo de evento es común, los agrupamientos de repeticiones en tándem estarán sometidos a expansión y con tracción continuas, lo cual puede Uevar a que una unidad de repetición en panicu lar se disperse en el agrupamiento, según se ilustra en la . Supóngase que el agrupam iento consiste in icialmente en una secuencia abcde. en la

cual cada letra representa una unidad de repetición. La relación entre las diferentes unidades de repetición es Jo suficientemente estrecha como para que se apareen erróneamente por recombinación, de modo que por una serie de eventos recombinames desiguales, el tamaño de la región repetitiva aumenta o disminuye, y una unidad se extiende para remplazar a todas las otras. El modelo de fijación cruzada pronosúca que cualquier secuencia de DNA no sometida a presión selectiva, seguramente será sometida por una serie de repeticiones en tándem idénticas generadas de esta manera. la suposición critica es que el proceso de fijación cruzada es bastante rápido respecto de la mutadón, de manera que las mutaciones nuevas son eliminadas (se pierden sus repeticiones) o llegan a tomar el control de todo el agrupamiento. Obviamente, en el caso del agrupamiento del DNAr, la selección impone un fa ctor posterior para una secuencia transcrita efectiva.

Los DNA satélite a menudo se encuentran en la heterocro mati na

5

abcde l atx:ae

Conceptos prir1Cipal•?S

6 abbcde

• La secuencia de repetición del DNA altamente repetitivo es muy corta y no tiene función codificadora. Se presenta en grandes bloques que pueden tener propiedades ñsicas diferentes. • Suele ser el constituyente principal de la heterocromatina centromérica.

abb~e l 9

abbbcdcde abbbcddde

,,

rbbbbbcdcdel a,bbqQ_bcdCde

10

bbbbbcdode bbbbbod€de

1 8

bbbbbcde

bbbb~de

1 10 6bbcde

bbbbbbb€de

l 7

bbbbbbb La recombinación desigual permite que una uni::aa de repetición especifica ocupe el agrupamiento entero. -=~números indican la longitud de la unidad de repetición en ::!:la etapa.

El DNA repetitivo se define por su (relativamente) rápido índice de renaturalización. El componente que se renaturaliza más rápidamente en el genoma eucariótico se llama DNA altamente repetitivo y con siste en secuencias muy cortas repetidas en tándem , varias veces, en agrupamientos grandes. Como su unidad de repetición es cona, suele describirse como D N A d e secu enda s imp le. Este tipo de compo nente se encuentra en casi todos los genomas eucarióticos superiores, pero, en general. la cantidad es muy variable. En los genomas de los mamíferos es típicamente <10%, pero en Drosophila virilis, por ejemplo, llega a -50%. Además de Jos agrupamientos extensos en que este tipo de secuencia se descu brió originalmente, hay otros más pequeños intercalados con DNA no repetitivo, que suele constar de secuencias cortas repetidas en copias idénticas o relacionadas en el genoma. La repelición en tándem de una secuencia cona crea una fracción con propiedades físicas distintivas que permiten aislarla. En algunos casos, la composición básica de la secuencia repetitiva es distinta de

6.11 Los DNA satélite a menudo se encuentran en la heterocromatina

117

Banda prrncipal Satéfite

'090 L

\

Densidad boyante

Por centrifugación, el ONA de ratón se separa en una banda principal y un satélite a través de un gradiente de densidad de CsCl.

la del genoma promedio, lo cual le permite fom1ar una fracción independiente en virtud de su densidad boyante diferente. Una fracción de este tipo se llama DNA satélite, término que, en esencia, es sinónimo de DNA de secuencia simple. Coincidiendo con su secuencia simple, este DNA ni se transcribe ni se traduce. Las secuencias repetidas en tándem están espedalmente obligadas a experimentar alineamientos erróneos durante el apareamiento cromosómico, de modo que sus dimensiones tienden a ser polimórficas. con amplias variaciones entre individuos. De hecho, Jos agrupamientos más pequeños de tales secuendas pueden usarse para caracterizar genomas individuales mediante la técnica de huella digital del DNA (véase la sección 6.14, Los minisarélites facilitan el mapeo genético) . La densidad boyante de un DNA dúplex depende de su contenido G-C según la fórmula empírica p= 1.660 + 0.00098 (%G-C) g-cm· 3 Normalmente. la densidad boyante se determina centrifugando el DNA a través de un gradiente d e d en sida d de CsCI. EL DNA forma una banda en la posición correspondiente a su propia densidad. Las fracciones de DNA que difieren en contenido G-C por >5%, usualmente pueden ser separadas en un gractieme de densidad. Cuando un DNA eucariótico es centrifugado en gradiente de densidad, pueden distinguirse dos tipos de materiales: • La mayor parte del genoma forma un continuo de fragmentos observables como un pico más bien ancho cemrado en la densidad boyante que corresponde al promedio de comenido de G-C del genoma. A estO se le denomina banda principal. 118

CAPÍTULO 6 Aqrupamientos y repeticiones

• En ocasiones, un pico adicional, más pequeño (o varios picos) , se observa en un val or diferente. Este material es el DNA satélile. En muchos genomas eucarióticos hay satélites. los cuales pueden ser más pesados o más lígeros que la banda principa l. pero casi nunca representan >5% delDNA total. Un ejemplo claro es el DNA de ratón que se ilustra en la . La gráfica es una exploración cuantitativa de las bandas que se (arman cuando dicho DNA es cenn·ifugado a través de un gradiente de densidad de CsCl. La banda principal contiene 92% del genoma y está centrada en una densidad boyante de 1.701 g-cm·l (que corresponde a su promedio de G-C de 42%, típico de los marrúferos). El pico más pequeño representa el 8 % del genüma y tiene una densidad boyante distinta de 1.690 g-cm-'; en él se encuentra el DNA saté1ite del ratón, cuyo contenido de G-C (30%) es mucho más bajo que en cualquiera otra parte del genoma. El comportamiento del DNA satélite en gradientes de densidad suele ser anómalo. Cuando se de termina la composición de bases real de un satélite. difiere del pronóstico basado en su densidad boyante porque p es una función no sólo de la composición de bases, sino de la consriwción en cuanto a pares de vecinos más cercanos. Para las secuencias simples, tienden a desviarse de las relaciones de apareamienro aleatorio necesarias para que se cumpla la ecuación de densidad boyante. Además, el DNA satélite puede estar metilado, lo cual cambia su densidad. A menudo, la mayor parte del DNA altamente repetitivo de un genoma puede ser aislado en forma de satélites. Cuando un componente de estas características no se separa de esa manera, en aislamiento, sus propiedades a menudo demuestran su similitud con las del DNA satélite. es decir, el DNA altamente repetitivo está formado por múltiples repeticiones en tándem con centrifugación anómala, Al material aislado de esta forma suele llamársele satélite críptico. Juntos. los satélites crípticos y los aparentes representan. en general, a wdos los grandes bloques repetidos en tándem del DNA altamente repetitivo. Cuando un genoma tiene más de un tipo de DNA altamente repetitivo, cada uno esrá en su propio bloque satélite (aunque. en ocasiones, bloques diferentes ocupan posiciones adyacentes). ¿En qué pane del genoma se localizan los bloques de DNA altamente repetitivo? Una extensión de las técnicas de hibridación de ácido nucleico permite determinar directamente la localización de secuencias satélite en el complemento del cromosoma. En las técnicas de hibridación in situ, el DNA cromosómico se desnaturaliza tratando células aplastadas en un cubreobjetos. A conrinuación, se

Secuencia predominante

Longitud total

Proporción del genoma

ACAAACT TG T TTGA

1.1 X 107

25%

11

ATAAACT TATTTGA

3.6 X 106

8%

111

ACAAATT TGTTTA A

3.6 X 106

8%

Crlptico

AATATAG TTATATC

Satélite

•

..

Los DNA satelites de D. virilis están relacionados. Más del 95% de cada satélite consiste en una repetición en tándem de la secuencia predominante.

La hibridación citológica muestra que el DNA Btélite del ratón est~ localizado en los centrómeros. Imagen ::>rtesía de Mary Lou Pardue and Joseph G. Gall, Carnegie Ins:itution.

aplica una solución que contenga DNA o RNAmar.::ado radioactiva mente. La sonda se híbrida con sus .:omplememos en el genoma desnaturalizado. La .ocalizadón de los sitios de hibridación puede determinarse por amorradiografía (véase la Fig. 28.19). Los DNA satélite se encuentran en regiones de heterocromatina, término. este último, utilizado ?ara describir a las regiones de los cromosomas permanentemente enrolladas con firmeza y que son nertes, a diferencia de la eucromatina, que repre·enta la mayor pane del genoma (véase la sección ~8.7, La cromatina se divide en eucromatina y he~erocromatina). la heterocromatina se encuentra :omúnmenre en los centrómeros (regiones en que -e forman los cinetocoros durante la mitosis y la .a eiosis para controlar el desplazamientO del cro-nosoma). La locación centromérica del DNA satéJte sugiere que tiene alguna función estructural en el cromosoma. la cual podría estar relacionada : m el proceso de segregación del mismo. En la se muema un ejemplo de Jo~alización del DNA satélite para el complemento ::-omosómico del ratón. En este caso. un extremo :e cada cromosoma está etiquetado porque es donde J S centrómeros se localizan en los cromosomas Mus ·:usculus.

Los satélites de los artró podos tienen repeticiones idénticas muy cortas Concepto principal La longitud de las unidades de repetición de los DNA satélite de los artrópodos es de sólo unos cuantos nucleótidos. La mayoría de las copias de la secuencia son idénticas.

En los artrópodos, tipificados por insectos y cangrejos, cada DNA satélite parece bastante homogéneo. Normalmen te, una unidad de repetición individual muy con a representa a >90% de los satélites, lo cua l hace relativamente senci lla la determinación de la secuencia . Drosophila virilis tiene tres satélites principales y un salélite críptico, que juntos representan >40% del genoma. Las secuencias de los satélites se resumen en la . Las secuencias de los tres satéliles principales están íntimamente relacionadas. la sustitudón de una sola base es suficiente para generar el satélite .O o el ID de la secuencia del satélite l. La secuencia de este último se encuentra en otras especies de Drosophi/a relacionadas con vin'lis, de modo que pueden haber precedido a la evoludón de las especies. Las secuencias de los satélites n y lli parecen específicas de D. virilis, así que pueden haber evolucionado del satélite I después de la evolución de las especies . La característica principal de estos satélites es su unidad de repe tición tan cona, de sólo 7 bp. En o tras especies se encuentran satélites similares. D. melanogasLer tiene varios satélites, muchos de los cua les tienen unidades de repetición m uy cortas (de 5, 7, 10 o 12 bp) . En los cangrejos se encuentran satélites comparables. La estrecha relación entre las secuencias de los satélites de D. virilis no es necesariamente una característica de otros genomas, en los cuales, las secuencias de los satélites podrían no estar relacionadas. Cada satélite surge de una ampliación lacera/ de una secuencia muy corta. la cual podría representar una variante de un satélite ya existente {como en D. virilis), o tener otro origen. Los satélites se generar y eliminan continuamente del genoma, lo cual dificulta establecer las relaciones evolutivas, ya que un satélite actual puede haber evolucionado de uno anterior, ya perdido. La característica importante de estos satélites es que representan fragmentos muy largos de DNA con secuen-

6.1l Los satelites de los artrópodos tienen repeticiones identicas muy cortas

i

119

cías poco complejas, dentro de los cuales se puede mantener u11a secuencia constante. Una de las características de muchos de estos satélites es una pronunciada asimetría en la orientación de los pares de bases de las dos cadenas. En el ejemplo de los satélites de D. virilis que se muestra en la Figura 6.22. una de las cadenas es mucho más rica en bases T y Gen cada uno de los sarélires mayores, con lo cual aumenta su densidad boyame, de manera que en la desnaturalización, esra ca d ena p ~sada (H. heavy) puede ser separada de la cadena ligera (L, liglzt) complcmemaria, procedimiemo que facilita la determinación de la secuencia del satélite.

1111

Los satélites de los mamíferos constan de repeticiones jerárquicas

Concepto plindpal El DNA satélite del ratón ha evolucionado por duplícadón y mutación de una unidad de repetición corta para dar origen a una unidad de repetición básica de 234 bp en la que pueden ser reconocidas la mitad, la cuarta parte y la octava parte de la repetición original.

En los mamíferos, tipificados por varios roedores, las secuencias que componen cada satélite muestran divergencias apreciables en las repeticiones en tándem. Las secuencias conas comunes se reconocen por su preponderancia entre los fragmentos de oligonucleótidos liberados por tratamiento químico o enzimático, si bien la predominante suele constituir una escasa minoría de las copias. Las secuencias cortas restantes se reladona n con la secuencia predominante por una variedad de sustituciones, deleciones e inserciones. Sin embargo, una serie de las variantes de la unidad corta puede constituir una unidad de repetición más larga, que a su vez. se repite en tándem con dertas variaciones, de modo que Jos DNA satélite de los mamíferos se consrruyen a partir de una jerarquía de unidades de repetidón. Estas unidades de repetición más largas constituyen las secuencias que se renaturalizan en el análisis de reasociación, las cuales también pueden ser reconoddas mediante digestión con enzimas de restricción. Cuando un DNA satélite es digerido con una enzima que tiene un sitio de reconoámiento en su unidad de repetición, se obtendrá un fragmento para cada unidad de repetición en la que se presente el sitio. De hecho, cuando el DNA de un genoma eucariótico es digerido con una enzima de restricción, la mayor parte de él produce una mancha generalizada debido a la distribución aleatoria de 120

CAPÍTULO 6 Aqrupamientos y repeticiones

los sitios dt división. No obstante, el DNA satéli te genera bandas agudas porque un gran número de fragmentos del mismo tamaño, o casi, son creados por división en los sitios de restricción separados por una distancia regular. La determinación de la secuencia del DNA satélite puede ser dificil. Usando las bandas discretas generadas por la división por restricción. se puede imemar directamenre la obtención de una secuencia, pero si hay una divergencia apreciable entre las unidades de repetición, en la misma posición, pero en repe[iciones distin[as. se presentarán diferentes nucleótidos, de manera que los geles de secuenciación serán oscuros. Si la divergencia no es considerable. digamos en el rango del -2%, será posible determinar una secuencia de repetición promedio. Se pueden insertar segmentos individuales del satélite en plásmidos, para su clonación. aunque un problema es que, en e l hospedador bacteriano, las secuencias satélite Lienden a ser escindidas del plásmido quimérico por recomb inadón. No obstante, cuando la clonación es exitosa, permite determinar sin ambigüedades la secuencia del segmento clonado. A pesar de que así se obtiene la secuencia de la unidad de repetición, o de las unidades. se necesitan varias de estas secuencias individuales para recons· truir como un lodo el tipo de divergencia úpico de Jos satélites. Mediante cualquier método de secuendación, la información que se puede obtener depende de la distancia analizable en un conjunto de geles de secuenda. La repetición de copias en tándem divergentes hace imposible la reconstrucción de secuencias más largas mediante superposiciones de fragmentos de restricción individuales. Bl DNA satéli1 e del ratón M. musculus es divicüdo por la enzima EcoRIT en unn serie de bandas, incluido un fragmemo mo11omérico predominante de 234 bp. Esta secuencia debe repetirse con pocas variantes en el 60% a 70% del satélite, que es dividido en la banda monomérica. Esta secuencía se puede analizar en función de las unidades de repetición constituyentes. cada vez más pequeñas. En la se ilustra la secuencia en cuanto a dos medias repeticiones. Al escribir la secuencia de 234 bp de manera que los primeros Ll 7 bp se alineen con los segundos, se observa que ambas mitades están basrantc bien relacionadas. aunque difieren co 22 posidones, lo cual con:esponde a una divergencia del 19%, es decir, que la unidad de repetición actual de 234 bp debe haberse generado en algún momento del pasado por duplicación de una un idad de repelición de 1 17 bp, y después se acumularon diferencias emre los duplicados. En la unidad de 117 bp se identifican dos sub· unidades más, cada una de las cuales corresponde a

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

~~GGAATATGGOGAGAAAACTGAAAATCACGGAAAATGAGAAATACACACTTTAGGACGTGAAATATGGCGAG~AAACTGAAAAAGGTGGAAAATT~GAAATGTCCACTGTA ~TGGAATATGGCAAGAAAACTGAAAATCATGGAAA~TGAGAAACATCCACTTI3ACGACTTGAAAAATGACGAAATCACTAAAAAAOGTGAAAAATGAGAAATGCACACTGAA

- ¿~

- ~ :e5

130

140

150

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190

200

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230

la unidad de repetición del DNA satélite del ratón contiene dos mitades de repetición. alienadas para mostrar las identi(en color azul).

10

20

30

40

50

GGACCTGGAATATGGOGAGAAAACTGAAAATCACGGAAAATGAGAAATACACACTTTA 60

70

80

120

130

90

11 o

100

G T GGACGTGAAATATGGCGAGAAAACTGAAAAAGGTGGAAAATTAGAAATGTCCACTGTA 140

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170

GGACGTGGAATATGGCAAGAAAACTGAAAATCATGGAAAATGAGAAACATCCACTTGA 180

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220

230

CGACTTGAAAAATGACGAAATCACTAAAAAACGTGAAAAATGAGAAATGCACACTGAA El alineamiento de los cuartos de repetición identifica homologías entre la primera y la segunda mitad de cada mitad de repetición. Las posiciones que son las mismas en todos los cuartos de repetición se muestran en color gris; las identidades que abarcan sólo tres de los cuartos de repetición se indican con letras negras en el área verde.

. - cuarto de repetición, respecto del satélite enteLos cuatro cuanos de repetición aparecen ali=ados en la . Las dos líneas superiores ~:;:> reseman a la primera mitad de repetición de la - .=,ura 6.24, las dos inferiores, a la segunda mitad _ repetición; es obvio que la divergencia entre los arro cuartos de repetición ha aumentado a 23 de - posiciones, o 40 por ciento. En cierta forma. los -""! \eros tres cuartos de repetición están mejor re- j onados, y gran parte de la divergencia se debe a _...,bios en el último cua rto de repetición. Observando cada cuarto de repetició n, se ve -~ cada uno consta de dos subunida des relaciona -z "> t un octavo de repetición), marcadas como se~ncias ex y~ en la . Todas las secuencias ::enen una inserción de C, en tanto que las ~ in ­ _\·en la inserción de un trinucleótido. respecto de -~ secuencia de consenso común. Esto sugiere que : uarro de repetición se originó por duplicación - u na secuencia como la secuencia de consenso. :·>;¡ués de lo cual ocurrieron cambios para gene- - los componentes que ahora observamos como p. Entre las secuencias cxp repetidas en tándem <eron lugar cambios posteriores para generar los ,:;tos y las mitades de la repetición origina] que ~~en hoy. Entre los octavos de repetición, la di -~encia actual es de 19/ 31 =61%. :.a sewencia de consenso se analiza d.irectamen en la , en la cual se demuestra que la . tienda satélite actual puede ser considerada como

un derivado de una secuencia de 9 bp. En el satélite se identifican tres variantes de esta secuenda. según se indica en la pane inferior de la figura. Si en una de las repeticiones se loma la siguiente base más frecuente en dos posiciones, y no la más frecuente, se obtienen tres secuendas de 9 bp bien relacionadas:

GAAAAACGT GAAAAATGA

GAAAAAACT El origen del satélite muy bien podría estar en una amplificación de u no de estos tres nonámeros. La secuencia de consenso general del satélite actual es GAA./\AA~~ T, que efectivamente es una amalgama de las eres repeticiones de 9 bp. La secuencia promedio del fragmento monomérico del DNA satélite del ratón explica sus propiedades. La unidad de repetición más larga. de 234 bp, se identifica mediante división por restricción. La unidad de reasociación entre las cadenas individuales del DNA satélite desnaturalizado es probablemente la mitad de la unidad de repetición de 117 bp porque los fragmentos de 234 bp pueden asociarse ambos en un registro y en medio regisuo (en el último caso, la primera mitad de repetición de una cadena se renaturaJiza con la segunda mitad de repetición de la otra). Hasta aquí se ha tratado al satélite presente como formado por copias idénticas de la unidad de reperición de 234 bp. y si bien esta unidad represen -

6.13 Los satélites de los mamíferos constan de repeticiones jerárquicas

121

GGACeTGGAATATGGeGAGA A

AAeTGAA

~

AATCAeGGAAAATGA

GAAATAeAeAeTTTA

~

GGAeG T GAAATATGGeGAGRA

~2

A A AG G T G GA A A A T TTA G A A A T G Te e A C T G T A

~

GGAeGTGGAATATGGeAAGAA

p3

A A T e A T G GA A AA T G A G A AA e A T e e A e T T G A

~

eGAeTTQAAAAATGAeGAAAT

~

AAAeGTGAAAAATGA

AAeTGAA AAeTGAA eAeTAAA

GAAATGeAeAeTGAA

GAAAT ........................................................... .

¿Ancestral? A A A e G T G A A A A A T G A G A A A T G e Ae Ae T G A A El alineamiento de los octavos de repetición muestra que cada cuarto de repetición consiste en una mitad o: y una ~· La secuencia consenso proporciona la base más común en cada posición. La secuencia "ancestral" muestra una secuencia muy estrechamente relacionada con la secuencia consenso, que pudo haber sido el predecesor de las unidades o. y p. (La secuencia satélite es continua, de manera que con el fin de deducir la secuencia consenso, se puede tratar como permutación circular, según indica la unión del último triplete GAA con los primeros 6 bp.)

tala mayor pane del satélite, también hay variantes de éste, algunas de las cuales están distribuidas aleatOriamente en el satélite y otras están agrupadas. la existencia de variantes se deriva de que el material iolcial para el análisis de secuencia haya sido descrito como fragmento "monomérico". Cuando el satélite es digerido por una enzima que tiene un sitio de división en la secuencia de 234 bp, también genera d(meros, trímeros y tetrámeros relativos al fragmento de 234 bp, los cuales surgen cuando una unidad de repetición ha perdido el sitio de división de la enzima como resultado de una mutación. La unidad monomérica de 234 bp es generada cuando dos repeticiones adyacentes tienen cada una un sitio de reconocimiento. El dímero se crea cuando una unidad ha perdido al sitio, un trímero cuando dos unidades adyacentes han perdido dicho sitio, y así sucesivamente. Con algunas enzimas de restricción, la mayor parte del satélite se divide en un miembro de sus series de repetición, como se muestra en el ejemplo de la . La declinación del número de d[meros. lrimeros, etc, muestra que hay una distribución alea toria de las repeticiones en la cual el sirio de reconocimiento de la enzima ha sido eliminado por mutación. En otras enzimas de restricción se observa un tipo diferente de comportamiento con el DNA satélite, pues siguen generando las mismas se1ies de bandas. De cualquier forma, dividen sólo una pe queña proporción del DNA, digamos de S% a 10%, lo cual implica que determinada región del satélite contiene una concenttación de unidades de repeti12 2

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

ción con este sitio de restricción panicular. Presumiblemente, todas las series de repeticiones de este dominio se derivan de una variante ancestral que poseyó a este sitio de reconocimiento (si bien en el modo com{m, algunos miembros lo han perdido desde entonces, por mutación). Un DNA satélite experimenta una recombinación desigual que tiene otras consecuendas cuando en la un idad de repeüciónhay una repetición interna. Volviendo al agrupamiento formado por repeticiones "ab", y suponiendo que los componentes "a" y "b" de la unidad de repetición tienen una reladón suficientemente estrecha como para aparearse, los dos agrupamientos podrán alinearse en medio registro, con la secuencia "a'' de un grupo alineada con la secuencia "b" del otro. La frecuencia con que esto ocurra, dependerá de la cercanía de la relación entre ambas mitades de la unidad de repetición. In vitro, en el DNA satélite del ratón, la reasociación entre las cadenas de DNA satélite desnaturalizado suele tener lugar en el medio registro. Cuando un evento de recomb inación sucede fuera de registro, cambia la longitud de las unidades de repeLición involucradas en la reacción:

xababababababababababababababababy X

xababababababababab,.¡oahabattflOi!baby

l xababababababababaababababababababy +

xababababababababbabababababababy

G G G G G T G G G G G G G A

G G G A A T A G A A A A A A G A A A

A e e A T G A A e T e A A T G

A T e A G G A e A T A T A G AG A A A A A A A A G G A A A A TT A A A T"e A T A G G A e G A A T A T A A T A A A

A G G A A G G A G A A T G A G A A G A A A A A

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e

e

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e

2

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A A A A e A A T e A A A A T G A e· e A e e G A e T A A A T G

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e

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G20A1sA:!1~A12A17 Ta G11As T7

Cs As

Cg Tts

~ • indica un triplete insertado en la secuencia ~

e en la posición 10 es una base extra en la secuencia a La existencia de una secuencia de consenso ge.,eral se muestra al escribir la secuencia satélite según una -~petición de 9 bp.

En el agrupamiento recombinante superior, :..na unidad "ab" ha sido remplazada por una u nidad aab", en tanto que en el inferior, la un idad "ab" ha >ido remplazada por una unidad "b" . Este tipo de evento exp1ica una característica J.cl extracto, digerido por enzimas de restricción, J el DNA satélite del ra tón. En la Figura 6.28 se ob-erva una serie desvanecida de bandas en los frag"':lentos de 1h , l lh, 21h y 3 !1.! unidades de repetición, .:demás de las repeticiones de fragmentos integrales ~ás fuertes. Supóngase que en el ejemplo precejcnte, "ab" representa a la repetición de 234 bp del .J)JA satélite del ratón, generada por división en .1..11 sitio del segmento "b". Los segmentos "a" y "b" :<)rresponden a las mitades de 117 bp de medias ~epeticiones.

Así pues, en el agrupamiento recombinante su--crior, la unidad "aab" genera un fragmento de 1\12 eces la longitud usual de la unidad de repetidón,

La digestión del DNA satélite del ratón con la enzima de restricción EcoRII identifica una serie de unidades de repetición (1, 2 y 3) que son multímeros de 234 bp y también una serie menor (1/2, 11/2 y 21/2) que incluye mitades de repeticiones (véase el texto de esta página). La banda det extremo izquierdo es una fracción resistente a la digestión.

en tanto que, en el inferior, la unidad "b" gen era un fragmento de la mitad de la longitud usual. (Los múltiples fragmento s de la serie de la mitad de la repetición se generan del mismo modo que los más largos de la serie integral, en cuyo caso, algunas unidades de repetición han perdido el sitio de restricción por mu tación .) Invirtiendo el argumento, la identificación de la serie de la mitad de la repetición en el gel muestra que la unidad de repetición de 234 bp está formada pot dos mitades de repetición relacionadas lo sufi cientemente bien como para aparearse, en ocasiones por recombinación. En la Figura 6.28 también pueden identificarse otras bandas bastante desvanecidas que corresponden a espaciamientos de IA y 3A de longitud, Jos cuales serán generados del m ismo modo que los espaciamientos de la mitad de la longitud, en los cuales la recombinación ocurre entre agrupamientos alineados en un cuarto de registro. La relación decreciente entre los cuartos de repeticiones. comparada con las mitades de repeticiones, explica la reducción en la frecuencia de las bandas de 1A y de ~. respecto de las bandas de !h.

Los minisatélites facilitan el mapeo ge nético Contepto principal • La variación entre los microsatélites o minisatélites de los genomas permite identificar la herencia inequívocamente, pues demuestra que el 50% de las bandas de un individuo derivan de un progenitor específico.

6.11> Los minisatélites facilita n el mapeo genético

123

. 1-

,;:,.:rnmn ;n.mh, (1I!iiJXI[Ji!ilJE11

1

repetición de 64 bp y se distribl.lye en la población de la manera siguiente:

Llill· l111!...,

Progenitores

GGGCAGGAXG CCCGTCCTXC División

No. de repetición

.

7% de ll% de 43% de 36% de 4% de

.

División Progenitor 1 y

y

6 ~

· ..-r->1'

................... .. . . .. ... 5 .... .... .... .... . 9 ............. .... .... ... ... ... .. ... .. 6 •• ••• ••• • . . ;'!.. ,!. 9

Progenitor 2• • • • • • • • • • • •. ~

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7

Progenie

.

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7

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5

.. .

7 6 5 j

Los aletos pueden diferir en cuanto al número de repeti· cienes en ellocus de un minisatélite, de modo que la división de cada lado genera fragmentos de restricción que difieren en longitud. Se puede seguir el patrón de herencia utilizando un minisatélite con alelas que difieren entre los progenitores.

Las secuencias que parecen satélites por su constitución de repeticiones en tándem de una unidad corta, pero que en general son mucho más cortas, por ejemplo, de 5 a 50 reperidones, son comunes en los genomas de Jos mamíferos y fueron descubiertas por casualidad como fragmentos cuyas cliroensíon es son muy variables en las genotecas del DNA humano . La variabilidad resalta cuando una población contiene fragmcmos de muchos tamaños diferentes que representan la misma región genómíca, y al examinar a los individuos, resulta que hay gran polimorfismo y que pueden encontrarse muchos alelas diferente>. El apelativo de microsatélite se utiliza en general cuando la longitud de la unidad de repetición es <1 O hp, en tamo la longitud de la unidad de repe tición dd minisatélite es de -1 O a 100 bp, aunque la terminología no ha sido definida con precisión. Este cipo de secuencias también se llaman regiones de repeticiones en tándem de número variable (VNTR.

variable number tandem repeal). La causa de la variación entre genomas en los rnicrosatélites o minisatélitcs es que cada alelo tiene un número difereme de unidades de repetición. Por ejemplo, un minisatélite tiene una longitud de 124

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

18 repericiones 16 repeticiones 14 repeticiones 13 repeticiones lO repeticiones

La velocidad de intercambio genético en las secuencia-; de Jos minisarélires es alta, de -10-4 por kb de DNA. (Se supone que la frecuencia de los intercambios por locus es proporcional a la longitud del minisaté!ite.) Esta velocidad es-lO veces mayor que la velocidad de rccombinación homóloga en la meiosis, es decir, en cualqu ier secuencia de DNA aleatoria . La gran va1·iabilidad de los minisatélites los hace especialmente útiles para el mapeo genérico, pues es alta la probabilidad de que los alelos de un individuo varíen en un locus determinado. En la se muestra un ejemplo de mapeo por minisatélites que constituye un caso exrremo en que dos individuos son heterocigotos en el locus de un minisatélitc y, de hecho. lo~ cuatro aletos son diferentes. Toda la progenie obtiene un alelo de cada progenitor del modo usual y es posible determinar sin ambigüedad la fuente de cada alelo de la progenie. En la terminología de la genética humana, las meiosis descritas en esta figura proporcionan gran cantidad de información por la variación enrre alelas. Una familia de m.inisatélites del genoma humano comparte una secuencia "nuclear? común. El núcleo es una secuencia rica en G-C de lO a 15 bp que muestra asimetría en la distribudón de purinas/pirimidinas en ambas dos cadenas. Cada mini· satélite ti ene una variante de la secuencia nudear. pero -l 000 minisatélites pueden ser detectados en la hibridarión por el método de Southern mediante una sonda formada por la secuencia nuclear. Considérese la situación mostrada en la Figura 6.29, pero multipl icada varias veces por la existencia de muchas de estas secuencias. E l efecto de la variación en los loci individuales es la creación de un patrón único para cada individuo. lo cual hace posible asignar sin ambigüedad la herencia entre los progenitores y la progenie al demostrar que 50% de las bandas de cualquier individuo derivan de un progenitor en particular. Esto constüuye la base de la técnica conodda corno Hhuella digital del DNA Tamo los microsatélites como los minisatélites son inestables. aunque por diferentes razones. Los primeros experimentan un apareamiento erróneo intracatenario cuando el deslizamiento durante la replicación conduce a la expansión de la repetición, como se muestra en la . Los sisrernas que reparan los daños que sufre el DNA, en particular N.

s que detectan pares de bases apareados errónea_1eme, son imponames para la reversión de tales _:;mbios. como se muestra por un gran iucremenen la frecuencia cuando los genes reparadores n desactivados. Las mutaciones de los sistemas -'= reparación contribuyen de manera imponame desarrollo del cáncer, pues las células tumora-~ suelen mostrar variaciones en las secuencias de • microsatélites. Los minisarélites experimentan _ 'llismo tipo de entrecruzamiento desigual entre . ~eticioncs descrito para los satélites (véase Fig. ~ 1. Un caso contundente es que el incremento en número de variaciones se relaciona con un puncalicnte meiótico. El evento de recombinacíón ' S\Jelc relacionarse con la recombinación entre .arcadorcs Oanqueames, pero presenta una forma mpleja en la cua l el nuevo alelo mutante obliene rormación tanto de la cromátida hermana como ~-otro cromosoma (homólogo). No es obvio en qué fragmento de repetición la ; JSa de la variación cambia de deslizamiento de nlicación a recomuinación.

~AGY'GTGTGJGTGÍ'G "AGTCACAf ACACACAr.J

I&AGTG._IGT~GIG TG

~cAéfoC.

TCAGTGT~T <3

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~C~ACACAcA~ Desllzamrento deuna repetictón

O..limmO•• de una repetición

Siguiente ciclo de repetición TC""'A-=e=m =r=
TCAGTGTGTGTGTG> TG ~CAC.

:::t:G 1o'i :r:G, (}

e

A~CACACAQ

TCAG~TGTG

TG

Resumen -.:si todos los genes pertenecen a familias, definí: ' éstas por secuencias relacionadas en los exones :e cada miembro. Las familias evolucionan por la ¡1licacíón de un gen (o genes) seguida de diver__ :lcia entre las copias, algunas de las cuales su...., mULaciones desactivadoras y se transforman · ·eudogenes que ya no tienen ninguna función. s :.eudogcnes también pueden ser generados como "lias de DNA de las secuencias de RNA.m. Un sistema de genes en proceso de evolución .ede mantenerse un id o en un agrupamiento o ¡¡ersa rse en nuevas ubicaciones por reestructu_,:ión cromosómica. En ocasiones, la organización. _ :os agrupamicmos existentes puede ser usada ::a inferir la serie de eventos ocurridos, los cuales •. Jan respecto de la secuencia y no de la función, =modo que incluyen tanto a scudogenes como a _: "les activos. las mutaciones se acumulan más rápidamente os sitios silenciosos que en los de remplazo (que -:n an la secuencia de aminoácidos). El rango de ~.:rgencia en los sitios de remplazo puede utilizar~ ara establecer un reloj calibrable en porcentaje - aivergencia por millón de aiios que se utilizana · ·.i calcular el tiempo de divergencia entre dos ..: mbros cualesquiera de la familia. Un agrupamiento en tándem está formado por .:has copias de una unidad de repetición que . . uye la(s) secuencia(s) transcrira(s) y a u11(os) a.dador(es) no transcriro(s). Los agrupamientos

A.Q AG CACACACAC C

El deslizamiento en la replicación sucede cuando la cadena hija se desliza hada atrás una unidad de repetición al aparearse con la cadena molde. Cada evento de deslizamiento agrega una unidad de repetición a la cadena hija. Las repeticiones extra se extraen como un lazo de cadena individual. La duplicación de esta cadena hija en el siguiente ciclo genera un DNA dúplex con un número mayor de repeticiones.

de genes de RNAr codifican a un solo precursor de RNAr. La conservación de los genes activos en los agrupam ientos depende de mecanismos como la conversión génica o el entrecruzamiento desiguaL que hacen que las mutaciones se esparza n por todo el agrupamiemo y queden expuestas a la presión evolutiva . El DNfl satélite consta de secuencias muy cortas repetidas muchas veces en tándem. Sus distintas propiedades de centrifugación reflejan su composición de bases sesgada. El DNA satélite se concemra en la heterocromatina cemromérica, pero se desconoce su función (si la tiene).las unidades de repetidón de los satélites de los artrópodos son idénticas, en tanto que las de los satélites de los mamíferos están relacionadas y pueden organizarse en una jerarquía que refleje la evolución del satélite por la ampliación y divergencia de secuendas elegidas de forma aleatoria. El entrccruzamicmo desigual parece haber sido un determinante importante en la organización del DNA satélite. La fijación cruzada explica la capaci6.. 5 Resumen

125

dad de las variantes para distribuirse por el agrupamiento. Los minisaté lites y los m icrosatélites consisten en secuencias de repetición aún más cortas que las de los satélites, <10 bp para los rnicrosatélites y de 1O a 50 bp para los minisatélites. El número de unidades de repetición suele ser de 5 a 50, con variaciones considerables en el número de repeticiones de un genoma a otro. El número de repeticiones de un microsatélite varía como resultado del deslizamiemo durante la replicación; la frecuencia es afectada por sistemas que detectan y reparan daños en el DNA. El número de rcpeciciones de un minisatélite varía como resulrado de eventos similares a la recomblnación. La variación en el número de repeticiones puede ser usada para determinar relaciones hereditarias por medio de la técnica conocida como "hue-

W.:ncrston. R. H. et al. (2002). Initíal sequencing and comparative analysis of tlte mouse genome. Nalure 420. 520-562.

los seudogenes son callejones sin salida de la evolución Artículo de investigación Hirotsune. S .. Yoshida. N., Chen, A., Garre11, L.. Sugiyama. F., Takahashi, S.. Yagami. K.,Wynshaw-Bo(is. A., and Yoshiki. A. (2003). An expressed pseudogene regulares rhe mcssenger- RN A stability of its homnlogous coding gene. Nature 423, 91-96.

la fijación entrecruzada podña mantener repeticiones idénticas

lla digita l del DNA".

Artículo de revisión

Referencias

Charleswortb. B., Sniegowski, P., and Stephan, w. (1994). The evolutionary dynamics of repelitive DNA in eukaryotcs. Nature 37 1, 21 5-220

La duplicación de los genes es una fuerza importante en la evolución A1tículo de investigación Bailcy, J. A., Gu, Z., Clark, R. A., Reinen, K., Sarnome, R V , Schwanz, S., Adams, M D., Myers. E- w., U , P. W., and Eichler, E. E . (2002). Reccnt scgmcntal duplkalions in the human genome. Science 297 , L003- 1007.

Los agrupamientos de las globinas son formados por duplicación y por divergencia Articulo de revisión Aardísnn, R (1998). Aemoglobins [rom bacreria 10 man: evolutíoo oC differenr pauerns oF gene expression, J. Exp. Biol. 20 l, 1099-J 117

La velocidad de sustitución neutral puede ser medida a partir de la divergencia de secuencias repetidas.

126

Artículo de investigación

CAPÍTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

Los minisatélites facilitan el mapeo genético Artículos de investigación Jeflreys. A. J .• Murray, J., and Neumann, R. (1998) . High-rcsol utio n mapping of crossovers in human sperm defines a minisatellite-associated recombinatlon hotspot. Mol. Cel/2. 267-273. Jeffreys, A . J., Royle, N. J., Wilson, V., and Wong, l. (J 988). Spontaneous mutation rates to new Jength alleles al tandem-reperitive hypervariable loci in human DNA. Nature 332, 278-281. Jeffreys, A. J., Tamaki, I<., MacLeod, A., Monckron. D.G., Neil, D. L.. and Armour, J . A. (1994). Complex gene conversion events in gcrmline mutalion at human minisatellítes. Na/. Genet. 6, 136-145. Jcffreys, A. J .• Wilson, V., and Theitl, S. L. ( 1985). Hypervariable mtnisarellite reglons in human DNA. Narure 314, 67-73. Srrand. M.. Prolla.. T. A.• Liskay, R. M.. and Petes, T. D. ( 1993). Ocsrabilizarion o( trans of shuple repctitivc DNA ln ycast by murations affecting DNA mismatch repaír. Naum~ 365, 274-276.

El RNA mensajero ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción El RNAm se produce por transcripción y se traduce

El RNAm eucariótico es modificado durante su transcripción o después de ésta

• Sólo una de las dos cadenas de DNA se transcri be en RNA.

• Un transcrito de RNAm eucariótico es modificado en el núcleo durante o poco después de su tra nscripción. las modificaciones incluyen la adición de un casquete metilado en el extremo 5' y una secuencia de poli(A) en el extremo 3'. El RNAm no es exportado del núcleo al citoplasma hasta que todas las modificaciones están completas.

El RNA de transferencia forma una hoja de trébol Un RNAt tiene una secuencia de 74 a 95 bases oue se dobla para formar una estructura secundaria de hoja d~ trébol con cuatro brazos constantes (y un brazo adicional en los RNAt más largos). • El RNAt se carga para formar un aminoacil·RNAt y da lugar a un enlace éster del grupo OH 2' o 3' del ácido adenilico en el extremo del brazo aceptar del grupo COOH del aminoácido. • la secuencia del anticodón mada más es responsable de la especiñcidad del aminoacil-RNAt.

El tallo aceptor y el anticodón se encuentran en los extremos de la estructura terciaria La hoja de trébol constituye una estructura terciaria en forma de L con el brazo aceptar en un extremo y el brazo anticodón en el otro.

El RNA mensajero es traducido por los ribosomas • l os ribosomas se caracterizan por su velocidad de sedimentación (70S en los bacterianos y 80S en los eucarióticos). • Un ribosoma está forma do por una unidad gra nde (de 50S o 60S en bacterias y eucariotas) y una subunidad pequeña (de 30S o 40$). El ribosoma proporciona el ambiente en el cual el aminoacil·RNAt agrega aminoacidos a la cadena polipeptidica creciente en respuesta a los codones correspondientes. • Un ribosoma se desplaza a lo largo de una molécula de RNAm en dirección 5' a 3'.

A una molécula de RNAm se unen numerosos ribosomas Una molécula de RNAm es traducida simultáneamente por numerosos ribosomas. Cada ribosoma se encuentra en una etapa diferente de progresión a lo largo del RNAm.

El ciclo vital del RNA mensajero de Las bacterias • En las bacterias. la transcripción y la traducción ocunen simultáneamente, pues los ribosomas empiezan a traducir un RNAm antes de que su síntesis esté completa. El RNAm bacteriano es inestable y su vida media es de sólo unos cuantos minutos. • Un RNAm bacteriano puede ser policistrónico. con vañas regiones codificadoras que represen tan a diferentes genes.

El extremo 5' del RNAm eucariótico posee un casquete • Un casquete 5' se forma al agregar una G a la base terminal del transcrito a través de una ligadura 5'-5: A la base o ribosa de la guanosina terminal nueva se agregan de uno a tres grupos metilo.

Dl!l

El extremo 3' está poliadenilado • Oespues ae la transcripción se agrega un fragmento de poli(A) de -200 nucleótidos a un transcrito nuclear. "' El poli(A) esta unido a una proteína específica {PABP). El poli(A) estabiliza al RNAm contra la degrada ción.

La degradación del RNAm bacteriano involucra a múltiples enzimas • La dirección global de la degradació n del RNAm bacteriano es de 5' a 3'. • La degraoac16n es resultado de la combinación de

divisiones endonucleoliticas seguidas de la degradación exonucleolítica del fragmento de 3'~5:

La esta bilidad del RNAm depende de su estructura y su secuencia • Las modificaciones de ambos extremos del RNAm lo protegen contra la degradación mediada por las exonucleasas. las secuencias espedficas de un RNAm pueden producir efectos estabilizadores o desestabilizadores. • la desestabilización puede ser activada por la pérdida de poli(A).

La degradación del RNAm implica múltiples actividades • Para la degradación del RNAm de las levaduras se requiere de la eliminación del casquete 5' y del poli(A) 3'. Una ruta de las levaduras implica la degradación exonucleolltica en dirección 5'~ 3: Otra ruta de las levaduras utiliza un complejo de numerosas exonucleasas que funcionan en dirección 3' La desadenilasa de las células animales puede unirse directamente con el casquete 5'.

, s·.

Continúa en la siguiente página

127

Las mutaciones sin sentido activan un sistema de vigilancia • Las mutaciones sin sentido provocan la degradación del RNAm. • En las levaduras y los gusanos se han encontrado genes que codifican al sistema de degradación.

Las moléculas de RNA eucariótico se transportan El RNA es transportado a través de una membrana a manera de partículas ríbonudeoproteínicas. Todas las mol~culas de RNA eucariótico que funcionan en el citoplasma deben exportarse desde el núcleo.

Introducción El RNA es uno de los panicipanLes principales de la expresión génica que en un principio se caracterizó como intermediario en la síntesis de proteínas, pero desde entonces se han descubierto muchas otras molécu las de RNA que desempeñan un papel es Lruccural o [uncional en otras etapas de la expresión génica. La implicación del RNA en muchas funcio -

El RNAm tiene una secuencia de bases que representa a una proteína

Rango de dimensiones de 500-1 O000 bases

El RNAt es una molécula pequeña de RNA con estructura secundaria extensa: Rango de dimensiones de 74-95 bases

Los RNAr principales tienen una estructura secundana ex1ensa y se asocran con protelnas oara formar el ubosoma: Rango de dimensiones de 1 500-1 900 (RNAr pequeño¡ y de 2 900-4 700 (RNAr grande)

Los tres tipos de RNA universalmente necesarios para la expresión génica son RNAm (que porta la secuencia codificadora), RNAt (que proporciona los aminoácidos correspondientes a cada codón) y RNAr (componente importante del ríbosoma que proporciona el ambiente necesario para la slntesis proteinica). 128

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

• Las moléculas de RNAt y el componente de RNA de una ribonudeasa se importan al interior de Las mitocondrías. • Las moléculas de RNAm pueden recorrer grandes distancias entre las células de las plantas.

El RNAm puede localizarse específicamente • El RNAm del Ash1 de la levadura forma una ríbonucleoproteina que se une a un motor de miosina. • Un motor lo transporta a lo largo de los filamentos actina en el brote germinal. • Se anda y se traduce en el brote, de manera que la protelna se encuentra sóto en el brote.

'*

Resumen

nes relacionadas co n la expresión génica respalc: la perspectiva general de que todo el proceso pud haber evolucionado en un "mundo de RNA" en t cual éste fue origi nalmente el componente acti.' responsab le de conservar y expresar la informació· genética. Muchas de estas fun ciones fue ron sut>secuemementc asumidas por las proteínas, con e consiguiente incremento de la versatilidad y, pro· bablemente, la eficiencia. . en la producComo se resume en la ción de las proteínas participan directameme tre: clases principales de RN A: • EJ RNA mensajero (RNAm, messenger RNA constituye un intermediario que porta le. copia de una secuencia de DNA que representa proteínas. • Los RNA de transferencia {RNAt, transfe· RNA) son moléculas pequeñas de RNA utilizadas para suministrar los aminoácidos correspondientes a cada codón específico de RNAm. • Los RNA ribosómicos (RNAr, ribosoma~ RNA) son componentes del ribosoma, com~ piejo ribonucleoproreínico de gran tamañc q ue contiene numerosas proteínas y sus: compon entes de RNA, los cuales propor• donan el mecanismo para polimerizar a los aminoácidos en una cadena polipeptídica. El tipo de función del RNA en cada caso es distinto. En el RNA mensajero, su secuencia es la característica imponame: cada triplere de nucleótido$ de la región codificadora del RNAm representa e un aminoácido en la proteína correspondiente. Sin embargo, la estructura del RNAm, en particular las secuencias localizadas a ambos lados de la región codificadora, puede ser importante para el contro: de su actividad y, por lo tanto, de la cantidad dt proteína producida a partir de él. En el RNAt se observan dos de los temas co· m unes gue rigen el uso del RNA: su estructure. tridimensional es imponante y tiene la capacidac de aparearse con otro RNA (RNAm). La estructurG.

Jirnensiona l se reconoce primero por una enzima _: constituye una diana apropiada para el víncu.:on un aminoácido espeáfico que crea un amj.acil-RNAt, identificado como la estructura que :Hiliza para la síntesis proteínica. La especifici-.: de uso de un aminoacii-RNAt se controla por :pareamiemo de las bases, cuando una secuencia ,tete cona (a n ticodón) se aparea con el triplete de .deóridos que representa a su aminoácido. En el RNAr se observa otro tipo de actividad; ..i de sus funciones es escructural. de manera que oporcionando un marco en el que se adhieren proteínas ribosómicas, además de que participa ·eaameme en las actividades del ribosoma . Una las actividades principales de este ú ltimo es su --·acidad para catalizar la formación de un enlace . Jrídico mediante el cual se incorpora un arruno- do a una p rorefna. Esta actividad reside en uno :os RNAr. Lo importante de este antecedente es que, al .templar la función del RNA en la síntesis pro~ica, se debe analizar como un componente que :empeña una función acciva y que puede ser . eto de regulación tanto por proteínas como por as moléculas de RNA; n o se debe olvidar, por otra :"í.e, que los RN/\ pueden haber sido las bases del '"':3Tato original. El tema constante en todas las acdades del RNA. ramo en la síntesis de prorefuas "!lo en otras partes, es que sus funciones depen~ fundamentalmente del apareamiento de bases ; :-a formar su estructura sccu ndaria y para imerac- ~r específicamente con olras moléculas de RNA. ~.u nción codHicadora del RNAm es única, si bien ~~At y el RNAr son ejemplos de una clase mucho .JS amplia de moléculas de RNA no codificadoras n djversas funciones en la expresión génica.

EL RNAm se produce por transcripción y se traduce 1

~cepto

codificadora relacionada con una secuencia proteínica a Lravés del código genético: cada triplete de nuclcótidos (codón) de la regjón codificadora representa a un aminoáddo . Sólo una de las cadenas de un DNA dúplex se transcribe en un RNA mensajero. Las dos cadenas de DNA se di!>tinguen ~egún se ilusua en la • La cadena de DNA que dirige la síntesis de RNAm por el aparcamiento complementario de bases se denomina cadena molde o ca d en a anticodificadora. (Antisentido es el término general para describir una secuencia de DNA o de RNA complementaria al RNAm) .

• La otra cadena de DNA tiene la misma secuencia que e l RNAm (excepto por T, en lu gar de U) y se le denomina cadena codificadora o cadena con sentido. En este capítulo se describe el RNA.m y su fun ción de molde para la síntesis proteínica. En el Capítulo 8, Síntesis proteínica, se analizará el proceso por el cual se sinteliza una proteína, en tanto que en el 9, Utilización del código genético, se describirá la forma en que se utiliza el código genético para interpretar el significado de una secuencia de RNAm. En el Capítulo lO, Localización de las proreínas, el enfoque está en la interrogante sobre cómo encuentra una proteína su localizadón apropiada en la célula durame la síntesis o después de ser sintetizada.

Transcripción

principal

Sólo una de las dos cadenas de DNA se transcribe en RNA.

-= expresión génica tiene lugar mediante un pro..... ú

de dos etapas. • La transcripción genera un RNA de cadena únka con una secuencia idéntica a la de una de las cadenas del dúplex de DNA. • La traducción convierte a la secuencia de nucleótidos del RNAm en una secuencia de aminoácidos que forman una p roteína. No todo el RNAm se traduce, pero cada RNAm contiene por lo menos una región

Traducción

La transcripción genera un RNA complementario a la cadena molde del DNA y tiene la misma secuencia que la cadena codificadora del DNA. La traducción interpreta cada triplete de bases y le asigna un aminoácido. Tres vueltas de una molécula de DNA duplohelicoidal contienen 30 bp, que codifican a 10 aminoácidos.

7.2 El RNAm se produce por transcri pción y se traduce

129

-Aminoácido

Conceptós pñncipales

AminoácidO ligado al extremo 3' del RNAt

--Aminoácido

El brazo está lormado por: • Tallo de bases apareadas • Lazo de cadena individual .--h]'.;¡ ""

El RNA de transferencia forma una hoja de trébol

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z: __,.

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Un RNAt tiene una secuencia de 74 a 95 bases que se dobla para formar una estructura secundaria de hoja de trébol con cuatro brazos constantes (y un brazo adicional en los RNAt más largos). El RNAt se carga para formar un aminoacil-RNAt y da lugar a un enlace éster del grupo OH 2' o 3' del ácido adenílico en el extremo del brazo aceptor del grupo COOH del aminoácido. La secuencia del anticodón nada más es responsable de la especificidad del aminoacil-RNAt.

•

~---f~

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~ . ~ --3. '~¡.- ..."';.. Apareamiento---- .. codón-anticodón ..}.~'J. '- ~ RNAm

Un RNAt tiene las propiedades duales de un adaptador que reconoce al aminoácido y al anticodón. La adenosina 3' está ligada de forma covalente a un aminoácido. El anticodón se aparea con el codón del RNAm.

El RNA mensajero se distingue del mecanismo responsable de su 1raducción mediante sistemas sin células para sinteTiza r p roteínas in vitro. Con un sistemr.

de síntesis de proteínas a partir de un tipo de células se puede traducir el RNAm de otro para demostrar que el códíg: genético y el mecanismo de traducción son universales. Cada triplete de nucleótidos del RNAm representa un aminoácido. La incongruencia estructura entre un trinucleótido y un aminoácido conduce inmediatamente a preguntarse cómo se aparea cada codón con su aminoácido específico. El Hadaptador es el RNA de transferencia (RNAt), que tiene dm propiedades clave: • Representa a un solo aminoácido, al cual se

une de forma covalente.

A

e e

7'?> 1 72 11 .3 70 4 '69 5 68

Brazo aceptor- 2 Brazo D

l

16 Pu \ 9 u· 17 A G" 1312Py10 G

ea

6 67 7 66

A 2223Pu25 26

l

Brazo TwC

1

Py59 65646362 o A" Pu 49505152G e Py

47

T

'1

l

27 43444546 28 42 29 41 30 40

3139 Py" 38 U

Brazo extra

Pli"

34

35

Anticodón

38

J

La hoja de trébol de RNAt tiene bases invariables. bases semiinvariables y un conjunto conservado de interacciones de apareamiento de bases.

130

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

• Contiene una secuencia de tres nudeótidos el anticodón , que es complementaria delcodón que representa a su aminoácido. El amicodón permite al RNAt reconocer e l codón por el apareamiento de bases complementarias. Todas las molécu las de RNAt tienen estructura5 secundarias y terciarias comun es. La estructura secundaria del RNAt puede describirse como una hoja de trébol, ilustrada en la , en la cual e· aparcamiento de bases complementarias forma los t a l los de los lazos de cadena única. Las estrucLuras tallo-lazo se denominan brazos de RNAt, y sus secuencias incluyen bases "inusuales" generadas por la modificación de las cuatro bases esLándar después de la síntesis de la cadena polinudeoúdica. La construcción de la hoja de trébol se ilustra en más detalle en la . Los cuatro brazos mayores reciben su nombre de acuerdo con su estructura o función: • El brazo acep tor consta de un tallo formado por bases apareadas que rermina en una secuencia no apareada cuyo grupo 2'- o 3'- 0H puede ligarse a un aminoácido. • El brazo TI¡IC se llama así por ese triplete. (\V representa a la seudouridina, una base modificada).

• En el brazo anticodón. el amicodón siem pre está en el centro del lazo. • El brazo D debe su nombre a que contiene la base díhidrouridina (otra de las bases modificadas del RNAt). • El brazo extra yace entre el T\jiC y el anticodón, y su extensión fluetúa entre tres y 21 base!>. El sistema de numeración del RNAt ilustra la astancia de su estructura. Las posiciones se nu~ran de 5' a 3' de acuerdo con la estructura del :At más común, el cual üene 76 residuos. El ranwtal de longitud de sus moléculas es de 74 a 95 : es, y la variación se debe a diferendas esrructues en el brazo D y en el extra. El apareamiento de bases que mantiene la es..mtra secundaria se muestra en la Figura 7.4. en - RNAt dado, la mayoría de los apareamiemos de es son asociaciones convencionales de A-U y -.:, aunque también se encuentran pares ocasio .:...es de G- U, G-'lf o A-ljl. Los tipos adicionales de =es de bases son menos estables que los regulares, -=-o de cualquier forma permiten que se forme una :ucrura duplo-he1icoidal en el RNA. Cuando se comparan las secuencias de las dife-:es moléculas de RNAt, las bases que se encuen.r. en determinadas posiciones son invariables (o servadas); casi siempre una base especíAca se :uemra en la misma posición. Algunas posidones ·escriben como semi-invariables (o semi-con-~a das ) porque están restringida!> a un tipo de (purina frente a pirimidina), pero puede haber ..: quier base del ripo correspondiente. Cuando un RNAt está cargado con el amino- que corresponde a su amicodón. se le llama -inoacil- RNAt y el aminoácido se liga mediante enlace éster que va del grupo carboxilo al hi-.ilo 2' o 3' de la ribosa de la base terminal 3' del -1.1 (que siempre es adenina). El proceso de carga ..n RNAt es catali7.ado por una enzima esped~a aminoacil-RNAt sintetasa. Hay (cuando - '"~s) 20 de ellas, y cada una reconoce a un solo ' )ácido y a todos los RNAl en los cuales puede - _Jlocado de manera legítima. :i.ay cuando menos un RNAt (pero en general ::tás) para cada aminoácido. Un RNAt se nomJtilizando como superíndice la abreviatura de .erras de cada aminoáddo, y si hay más de un -~para el mismo aminoáddo, se utilizan subín-: numéricos para distinguirlos. Así, dos RNAt _.J. Lirosina se describen como RNAt ;" y RJ"'{At/"· 1 .... XAL que transporta un aminoáddo, es decir, ':ninoacii-RNAt, se indica mediante un prefijo ~entifica al ami.noáddo, de modo que Ala-.RJ.'IAt ale a RNAtA1• que porta a su aminoácido.

?H Cisterna

<¡:;H 2

/

CH

0

'e~

NH2 ,

La desulfuraclón cambia al aminoácido

1

y R•conocim"n~ óc;C

del codón sin cambios

yH

3 Alanina CH O

/'

q

N~~ ACA UG.U

El significado del RNAt depende de su anticodón

y no de su aminoácido. ¿La secuencia anticodón por sí misma permire al aminoacii-RNAt reconocer al codón correcto? En la se ilustra un experimento clásico para responder esta pregunta. La desulfuración reducwra convierte al aminoácido del cistcinii-RNAt en alanina. generando alanjJ-RNAtc". El RNAt tiene un amicodón que responde al codón UGU. La modificación del aminoácido no iníluye en la especifiddad de la imcracdón anticodón-codón, de manera que el residuo de alanina es incorporado a la proteína en el lugar de la cisteína. Una vez que un RNAt ha sido cargado, el aminoáddo no desempeña ningún papel en su espedfiddad, la cual es determinada exclusivamente por rl anticodón.

El tallo aceptar y el anticodón están localizados en los extremos de la estructura terciaria Concepto principal • La hoja de trébol constituye una estructura terciaria en forma de L con el brazo aceptar en un extremo y el brazo anticodón en el otro .

La estructura secundaria de cada RNAt se dobla para formar una estructura terciaria compacta en forma de L en la cual el extremo 3' que se une al aminoácido está lejos del anticodón que se une al RNAm. Todos los RNAt tienen la misma estructura terciaria general, aunque se distinguen por variaciones individuales. los tallos duplo-helicoidales apareados por bases de la estructura secundaria se mantienen en la estructura terciaria, pero su dístribudón en tres dimensiones crea, esencialmente, dos hélices dobles en ángulo recto una respecto de la otra, como se ilustra en la . El tallo aceptar y el tallo TI¡IC forman una hélice doble continua con una sola

1.4 El tallo aceptar y el anticodón están localizados en los extremos de la estructura terciaria

131

La estructura de hoja de trébol tiene cuatro brazos 3' Brazo aceptor

S'

Brazo D

, Brazo T'I'C

La estructura principal adquiere la forma de una L A 1

CH

0 NH;' 'cf' Aminoácido - -

0

Brazo TljiC

Brazo aceptor

interrupción; e l tallo D y el tallo anticodón forma~· otra hélice continua doble, también con una intt· rrupción. En la reglón localizada entre las hétict' dobles, donde se forma el ángulo de la L, se encuer.tran el lazo T\j!C y el D, de modo que el aminoácid reside en la extremidad de un brazo de la estructur~ en L y el lazo anticodón forma el otro extremo. La estructu ra terciaria se crea mediante puem~ de hidrógeno formados principalmente por bases u apareadas en la estructura secundaria. Muchas delas bases invariables y semiinvariables están impEcadas en estos puentes de hidrógeno, lo cual explic< que se conserven . No todas estas interacciones so. universales, pero probablemente identifican el patrón general para establecer la estructura del RNAEn la se muestra un modelo molecu lar de la estructura del RNAtPhe, y la imagen dl lado izquierdo corresponde a l esquema de la pan inferior de la figura 7 .6. En otros RNAt se observa:diferencias estructurales que responden al dilen:: de que todos deben tener una forma similar, per que permita reconocer diferencias entre ellos. Po ejemplo, en el RNAtA•P, el ángulo entre los dos eje es ligeramente mayor, de modo que la conformación de la molécula es ligeramente más abierta. La estructura sugiere una conclusión genere; respecto de la función del RNAt: los sitios de la moi. -

cula que ejercen funciones particulares están separados .máximo. El aminoácido está lo más Jejas posible de antícodón, lo cual coincide con sus funciones en .: síntesis proteínica.

Anticodón El RNA de transferencia se dobla en una estructura terciara compacta en forma de L, con el aminoácido en un extremo y el anticodón en el otro.

El RNA mensajero es traducido por los ribosomas Conceptos principales • Los ribosomas se caracterizan por su velocidad de sedimentación {70S en los bacterianos y 805 en los eucarióticos). • Un ribosoma está formado por una unidad grande (de 50 o 605 en bacterias y eucariotas) y una subunidad pequeña (de 30 o 405). El ribosoma proporciona el ambiente en el cual el aminoacil-RNAt agrega aminoácidos a la cadena polipeptídica creciente en respuesta a los codones correspondientes. • Un ribosoma se desplaza a lo largo de una molécula de RNAm en dirección 5' a 3'.

Un modelo espacial compacto de esferas sólidas muestra que La estructura terciara del RNAtt>"• es compacta. Las dos perspectivas del RNAt giran 90°. Imagen cortesía de 5ung-Hou Kim, University of California, Berkeley.

132

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

La traducción de un RNAm en una cadena polipertídica es catali:tada por el rib osoma. Los ribosoma se describen tradicionalmente en función de su velocidad {aproximada) de sedimentación (medida eSvedbergs. donde un valor mayor de S indica un-

~¡ocidad de sedimentación mayor y mayor masa). - s ribosomas bacterianos generalmente se sedíeman a -70S. Los ribosomas del citoplasma de ~:> células eucarióticas superiores son más grandes ,;uelen sedimentarse a -80S. El ribosoma es una partícula r i bonu cleoproe íni ca compacta formada por dos subunidades, -da una de las cuales üen e un componeme de -.'\A, incluida una molécula muy larga de RNA y ~merosas proteínas. La relación entre un riboso.; y sus subunidades se ilustra en la -.l.S dos subunidades se disocian in vitro cuando se ..jucc la concentración de iones de Mg2+. En cada ..:so, la s ubunida d grande tiene una masaaproxiadamente dos veces mayor que la subunidad _equeña. Los ribosomas bacterianos (70S) tienen ..:.bunidades que se sedimentan a 50S y a 30S. Las J bunidades de los ribosomas citoplásmicos euca"-t icos (80S) se sedimentan a 60S y a 40S. Las s subunidades operan juntas como pane del risoma completo; sin embargo. cada una asume ~acciones distintas en la síntesis proteínica. Todos los ribosomas de un compartimiento ce:ar dado son idénticos y asumen la síntesis de di-

-

~ntes pr01eÍ11t1S asociándose con diferentes RNAnz que ,·vorcionan las secumcias codificadoras en sí.

El ribosoma crea el ambiente que controla el renocimiemo entre un codón de RNAm y un anticon de RNAt. Al interpretar el código genético como .,a selie de tripletes adyacentes, la símesís proteí.::a procede del inicio de una región codificadora _ :loa l. Una protefna se ensambla por adicíón secuencial

- aminoácidos er1 dirección del terminal N al terminal C :fvrme el ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm. Un ribosoma empieza la traducción en el ex.:mo 5' de u na región codiRcadora y traduce cada j ón en un aminoácido conforme procede hacia extremo 3'. En cada codón, el aminoacil-RNAt . ~apia do se relaciona con el ribosoma y dona su - jiJloácido a la cadena polipeptídica. En cualquier 1mento, el ribosoma puede albergar dos amiacil-RNAt que corresponden a codones sucesivos, crmitiendo que se forme un enlace peptídico ene los dos aminoácidos correspondientes. En cada ;so. la cadena polipeptídica creciente se alarga un tJnoácido más.

A una molécula de RNAm se unen numerosos ribosomas -.<:ot~tepto

principal

Una molécula de RNAm es traducida simultáneamente por numerosos ribosomas. Cada ribosoma se encuentra en una etapa diferente de progresión a lo largo del RNAm.

Ribosoma bactenano = 70S Eliminación de Mg2•

lt

Adición de Mg2·

sos 30S

Un ribosoma está formado por dos subunidades.

Cuando se aíslan ribosomas activos en forma de fracción asociada a proteínas recién sintetizadas, se encuentran como un complejo formado por un RNAm relacionado con numerosos ribosomas, estructura que se denomina polirrib osoma o polisoma. La suhunidad 305 de cada ribosoma se asocia con el RNAm y la subunidad 50S porta a la proteína recién sintetizada; el RNAt abarca ambas unidades. Cada ribosoma del polisoma sintetiza independ]ememcme a un polipéprido en panicular duran te su recorrido por la secuencia del mensajero. En esencia, el RNAm es jalado a través del ribosoma y cada rriplete de nucleóridos se traduce en un ami noácido, de manera que el RNAm tiene una serie de ribosomas que portan fragmentos crecientes del productO proteínico y que se desplazan del extremo 5' al 3', como se ilustra en la . Una cadena polipeptídíca en proceso de síntesis suele llamarse

proteína nacien te . En general, los 30 a 35 aminoácidos recientemente agregados a una cadena polipeptídica creciente están protegidos del ambiente por la estructura del ribosoma. Probablememe toda la parte anterior del polipéptido sobresale y es libre de empezar a plegarse en su conformación apropiada, de modo que las proteínas pueden exhibir pane de la conformación madura incluso ames de que concluya su síntesis. En la micrografía electrónica de la se muestra una caracterización clásica de polisomas. La globina es sintetiza por un conjunto de cinco ribosomas adheridos a cada RNAm (pentasomas}. los ribosomas aparecen como objetos esféricos deformados de -7 nm (70 Á) de diámetro, conectados por una h.ebra de RNAJn. Los ribosomas se localizan en varias posiciones a lo largo del mensajero. Los que se encuentran en un extremo apenas han empezado la síntesis proteínica, en tanto que los 7.ó A una molécula de RNAm se unen numerosos ribo somas

133

Un polirribosoma está formado por un RNAm traducido si multáneamente por numerosos ribosomas que se desplazan en dirección 5'-3'. Cada ribosoma tiene dos moléculas de RNAt, una que porta la proteína naciente y otra que porta al siguiente aminoácido que se agregará.

parte a la longitud del RNAm (que suele codifica:

La síntesis proteínica tiene lugar en los petisomas. Imagen cortesía de Alexander Rich, Massachusetts Institute of Technology.

~

l

.··········»

~

l ................................. Los ribosomas traducen el ANAm y regresan al banco

\ El ANAm es degradado

El RNA mensaj ero se traduce por medio de ribosomas que se reciclan en un banco.

del orro. están por terminar la producción de un polipéptido. El tamaño del polisoma depende de múltiples variables; en las bacterias, por ejemplo, es muy grande, con decenas de ribosomas dedicados simultáneamente a la traducción. Las dimensiones se deben en 134

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

numerosas proteínas) y en parte a la gran eficienc. con que se adhieren a éste los ribosomas. Los polisomas del citoplasma de una célu la e_ cariótica tienden a ser más pequeii.os que los de !.:. bacterias, y también en este caso, su tamaño es u~ función de la longitud del RNAm (que usualmer:· _ representa sólo a una proteína en las eucariota.s de la frecuencia característica con la que se adhi::-ren los ribosomas. Un RNA.m euca.riótico promeill probablemente tenga -8 ribosomas adheridos a _ vez. se ilustra el ciclo vital del :-En la bosoma. Los ribosomas son extraídos de un ba.nc ([ormado de h echo por subunidades ribosómicas se utilizan para traducir un RNArn yposteriormer::= se regresan para ciclos posteriores. El número c. ribosomas adheridos a cada molécula de RNAm qt. sintetiza a una proteína en panicular no se ha dete·· min ado de manera precisa ni en las bacterias ni e las eucarioras, pero es una cuestión de Hucluacic:. estadística deterrrtinada por las variables delta.maf. y la eficiencia del RNAm. La constituye una perspectiva globz de la a tención dedicada a la síntesis de proteínas euna bacteria intacta. Los aproximadamente 20 OC ribosomas representan un cuarto de la masa de :• célula. Hay > 3 000 copias de cada RN Al, y todas la moléculas de RNAt, juntas, son casi lO veces ma., numerosas que los ribosomas; la mayor parte es¡.: en forma de aminoacil-RNAt, listo para utilizarse d. inmediato en la síntesis proteínica. Dada su inestabilidad, es difícil calcular el número de molécula de RNAm, pero un cálculo razonable sería -150 en diferentes estados de síntesis y descomposidóHay - 600 tipos de RNAm en una bacteria, lo cu.: sugiere que, en general, hay sólo de dos a tres ce· pias de cada RNAm por cada una de ellas que, epromedio, codifican quizá a -3 proteínas. Si h2 1850 proteínas solubles diferentes, debe haber upromedio de > l 000 copias de cada proteína en ur.~ bacteria.

Elcic~~taldelRNA

mensajero de las bacterias ::._.,,reptos principales En (as bacterias, la transcripción y la traducción ocurren simultáneamente, pues los ribosomas empiezan a traducir un RNAm antes de que su síntesis esté completa. El RNAm bacteriano es inestable y su vida media es de sólo unos cuantos minutos. Un RNAm bacteriano puede ser policistrónico, con varias regiones codificadoras que representan a diferentes genes.

!t.~A

mensajero tiene la misma función en todas células, pero con diferencias importantes en los =·~lles de la síntesis y la estructura del RNAm eu.:..,ótico y del procariótico. Una diferencia importante en la producción del -A.m depende de dónde ocurran la transcripción .: rraducción: • En las bacterias, el RNAm se transcribe y se traduce en el companimiento celular único; los dos procesos están tan íntimamente relacionados que son simultáneos. Los ribosomas se adhieren al RNAm bacteriano incluso antes de que haya terminado su transcripción, de modo que el polisoma tiende a adherirse al DNA. El RNAm bacteriano suele ser inestable, y por lo tanto se traduce en proteínas durante sólo algunos minutos. • En una célula e ucariótica, la símesis y la maduración del.RNAm tienen lugar exclu sivamente en el núcleo, y sólo después de terminados dichos eventos. el RNAm es exportado al citoplasma, donde es traduddo por los ribosomas. El RNAm eucariótico es relativamente estable y sigue traduciéndose durante muchas horas. En la se muestra que en las bacterias - anscripción y la traducción están íntimamente ..=donadas. La primera empieza cuando la enzima ·"' polimerasa se une al DNA y posteriormente se "'laza formando una copia de una cadena. Tan mo se inicia la transcripción, los ribosomas se .eren al extremo 5' del RNAm y comienza la tra.::ión, incluso antes de que el resto del mensaje se ~sintetizado. Un grupo de ribosomas se mueve !argo del RNAm mientras éste es sintetizado. ~.tremo 3' del RNAm se genera cuando termina -~nscripción, en tamo que los ribosomas siguen _Jciendo el mRNA mientras sobrevive. pero se ;:ada en la dirección general 5'-43' con bastante

Componente Pared Membrana

Masa celular deshidratada (%)

Tipos Copias de Wo!éculas/célula diferentes cada tipo 1

10 10

ONA

1 2

2

1.5

RNAm RNAt RNAr Proternas ribosómicas

1 3 16

1500 200000 38000

9

10"

Proteínas solubles Moléculas pequeñas

46

2.0 x 10•

7.5 x to•

3

600

60 2 52

1850 800

2-3 >3000 19000 19000

>1 000

Análisis de E. coli en función de sus componentes maero moleculares.

Omin

Empieza la transcripción

PPP ~ El extremo 5' está trifosfatado

0.5 min

los ribosomas mielan la traducción

1.5 min

la degradación emp•eza en el extremo 5'

2.0

La ANA polímerasa termina

3.0 min

en el extremo 3'

la degradación continúa, los ríbosomas

terminan la traducetón

degrada

Sinopsis: el RNAm se transcribe, se traduce y se en las bacterias.

simult~neamente

7. 7 El ciclo vital del RNA mensajero de las bacterias

135

En las bacterias pueden observarse las unidades de

transcripción. Imagen cortesía de Osear Miller. rapidez. El RNAm es sintetizado, traducido por los ribosomas y se degrada, todo en rápida sucesión. Una molécula individual de RNAm sobrevive si aca· so, unos minutos. La transcripción y la traducción bacteriana tie nen lugar a velocidades similares. A una tempera tu· ra de 37°C la transcripción del RNAm ocurre a -40 nucleótidos/segundo, velocidad muy cercana a la de la síntesis proteínica, que es aproximadamente de 15 aminoácidos por segundo, de modo que se necesitan -2 minutos para transcribir y traducir a un RNAm completo de 5 000 bp, que corresponden a 180 kD de proteína. Cuando se inicia la expresión de un nuevo gen, su RNAm suele aparecer en lacélula en -2.5 minutos. La proteína correspondiente aparecerá quizás en medio minuto más. La traducción bacteriana es muy eficiente, y la mayoría de las moléculas de RNAm son traducidas por muchos ribosomas empacados de forma compacta. En un caso (trp RNAm), se inician aproximadamente 15 transcripciones por minuto y cada una de las 15 moléculas de RNAm probablemente sea traducida por - 30 ribosomas en el in tervalo que mectia entre su uanscripción y su degradación. La inestabilidad de la mayor parte del RNAm bacteriano es sorprendente. La degradación del RNAm sigue de cerca a su traducción y quizá empieza en un lapso de un minuto desde el inicio de la transcripción. El extremo 5' del RNAm comienza a degradarse anres de que el 3' haya sido sintetizado o traducido. La degradación parece seguir al último ribosoma del convoy del RNAm, pero la degradación procede con mayor lenrirud, tal vez aproximadamente a la mitad de la velocidad de la transcripción o la traducción. La estabilidad del RNAm influye de manera importante en la canridad de proteína que se produce; 136

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

suele expresarse en fun ción de la vida media.: RNAm que representa a un gen específico tiene e" vida media característica, pero el promedio es de- minutos en las bacterias. Obviamente, esta serie de eventos sólo es í' sible porque la transcripción, la traducción y la e gradación ocurren en la misma dirección. En la r; crografía de electrones de la se descut la dinámica de la expresión génica en delito flagrai' En estas unidades de transcripción (desconocida• varias moléculas de RNAm están en proceso síntesis simultáneamente y cada una porta nu~ rosos ribosomas implicados en La traducción. (Es corresponde a la etapa que se muestra en el segun panel de la Figura 7.13.} Un RN A euya s-íntesis aL no ha concluido con frecuencia se denomina R1'i naciente. Las moléculas de RNAm bacteriano varíeenormemente e11 cuanto al número de proteínas las cuales codifican. Algunos RNAm representan un sólo gen, son monocistrónicos, en tanto qL otros (la mayoría) portan secuencias que codifi.cz a numerosas proteínas y son policistrónicos. :: estos casos. una sola molécula de RNAm se transe- be a partir de un grupo de genes adyacentes. (Die!"' agrupamiento de genes constituye un operón co trotado como una unidad genética única; véase Capítulo 12. El operón.) Todos los RNAm constan de dos tipos de r e giones; la codificadora está formada por una ser de codones que representa a la secuencia de am noácidos de una proteína, empieza (n ormalmente con AUG y termina con un codón de terrninació~ No obstante. el RNAm siempre es más largo qu la región codificadora por la presencia de rcgione adicionales localizadas en ambos extremos. Una !kcuencia adicional en el extremo 5' que precede : inicio de la región codificadora se describe com líder o región 5' UTR (región no n·aducida). La secuencia adiciona l que sigue a la señal de terminaci RNA de los fagos) o ser muy conos, en cuyo cast sólo uno o dos nucleótidos separan al codón de terminación de una proteína del codón de inicio de siguiente. En un caso extremo, dos genes de hech se superponen, de manera que la última base de u~ región codjficadora también es la primera base de :.:; siguiente región codificadora.

El número de ribo~omas comprometidos en la ::jucción de un cimón en particular depende de eficiencia de su sitio de inicio, que para el primer -:rón está disponible siempre y cuando se síntetice !xtremo 5' del R.~Am. ¿Cómo se traducen los cisnes subsiguientes? ¿Las numerosas regiones codi.:::doras de un RNAm policistrónico se traducen de rma independieme o su expresión está conectada? ::: mecanismo de iniciación es el nlismo para todos cistrones o es diferente para el primer cisrrón y ;a los cistrones internos? La rraducción de un RNAm bacteriano proce~ de manera secuencial a través de sus cistrones. _,mdo los ribosomas se adhieren a la primera ren codificadora. las sub~ig u ientes aún no han sido _nscritas. Para cuando el segundo sitio ribosómico ~disponib l e, la traducción está muy avanzada a _ ·és del primer cistrón. En general. los ribosomas '7nínan la traducción al final del primer cistrón (y : Jisocian en subunidades), y un ribosoma nuevo ::-nsambla de manera independiente al principio = _a siguiente región codificadora. (El proceso de .=ación se describe en el Capítulo 8, Síntesis pro- "''ca.)

El RNAm eucariótico es modificado durante su transcripción o después de ésta ~-..:eptos

principales

~ n transcrito de RNAm eucariótico es modificado en el -jcleo durante o poco después de su transcripción . .25 modificaciones incluyen la adición de un casquete --etilado en el extremo 5' y una secuencia de poli(A) ;- el extremo 3'. ::. RNAm no es exportado del núcleo al citoplasma asta que todas las modificaciones están completas.

-roducción del RNAm eucariótico involu cra a ~ etapas posteriores a la transcripción. La tram"ión ocurre de la forma usual. iniciando un :rito con un extremo 5' trüosfato, pero el extre; se genera por división del transcrito, y no por 3~scripdón de termínación en un silio derermi- - Las moléculas de RNA que derivan de genes --:umpidos requieren de corte y empalme para _nar los intrones, generándose una molécula de ::1 más pequeña que conliene una secuencia -..:adora intacta. ;:, la se muestra que ambos extre~el transcritO son modificados por adiciones :::iores de nucleótidos (lo cual implica a sisre.:e enzimas ad iciona les). El extremo 5' del RNA J ificado por la adición de un "casq uete" vir-

Elllder precede al codón de iniciación

El remolque sigue al codón de terminación

La d1stancla intercistrónica varia de -1 a +40 bases

5'

Inicio

Alto

lnic1o

_ _l

3'

Alto

El RNAm bacteriano incluye regiones traducidas y no traducidas. Cada región codificadora tiene sus propias señales de iniciación y terminación. Un RNAm típico puede tener numerosas regiones codificadoras.

Casquete

1

!

El RNAm eucariótico es modificado por la adición de un casquete en el extremo 5' y un poli(A) en el 3'.

tualmeme Lan pronto como aparece. Éste remplaza al trifosfato del transcrito inicial con un nucleóndo en orientación inversa (3 '~5') , Hsellando", por lo ramo, el extremo. El extremo 3' es modificado por la adidón de una serie de nucleóridos de áddo adenílico [ácido poliadenílico o poli(A)] inmediatamente después de su división. Sólo un a vez conclu idos todos los eventos de modificación y de procesamiento, el RNAm puede ser exportado del núcleo al citoplasma. La demora promedio para salir del citoplasma es de -20 minmos. Una vez que el RNAm ha entrado al citoplasma, es reconocido por los ribosomas y traducido. En la se muestra que el dclo vital del RNAm eucariótico es más prolongado que el bacteriano. La transcripción en las células animales ocurre más o menos a la misma velocidad que en las bacterias, a -40 nucleótidos por segundo. Muchos genes eucarióticos son grandes, y un gen de 1O 000 bp necesita -5 minutos para rranscribirse. La transcripción del RNAm no termina con la liberación de enzima del DNA, más bien, la enzima sigue más allá del final del gen. Una serie coordinada de eventos genera el extremo 3' del RNAm por división y adhiere un fragmento de poli(A) al extremo 3' recién generado. El RNAm eucariótico constituye sólo una pequeña porción del RNA celular total (-3% de la masa). La vida media es relativamente corta en las

7.S El RNAm eucariótico es modificado durante su transcri pción o después de ésta

137

Empieza la transcripción: el extremo 5' es modificado

<1 mln

ppp

sustancia l en la estabilidad; el RNAm de las célt. animales es relativamente estable, con una vida e dia de entre 4 y 24 horas. Los polisomas eucarióticos son razonableme::estables. Las modificaciones de ambos extremos _ RNAm contribuyen a su estabilidad.

-~

El extremo 5' del RNAm eucariótico posee un casquet~ Concepto principal • Un casquete 5' se forma al agregar una Ga la base terminal del transcrito a través de una ligadura 5'-s: ='~ uno a tres grupos metilo se agregan a la base o ribos~ de la guanosina terminal nueva. 20 rnln

El extremo 3' es polladenllado

....~. El RNAm es transportado al citoplasma

25mtn

~-----...

PPP • --t

l

NÚCLEO ~--1

CITOPLASMA

\. 1\. n V V ' ,

AAAAAA

> 240 mrn Los ribosomas tratiucen al RNAm

·PPP

AAAAAA

Sinopsis: La expresión del RNAm en las células animales requiere de transcripción, modificación, procesamiento. transporte núcleo-citoplásmico y t raducción.

Presente en todos los casquetes 1 O eH3 Puede ser metilado 1 1 e ~· en el casquete 1 H "~e-··· 11 '.·r.H

r

c.

2HN ""'N'

NH2

e1

N""' 1 He

e r

-....Nb

N

'e-·

~eH /

11 e

o~'N' -....N ~H 2 e N; '-c..-N o· o· o· 1 u "eH

O O 11 " .. CH2 - 0-¡;'-0 -J;>-0-1;'-ü-eH

H~W'C:......N/

Presente en el casquete 1

o CH3

9

O-P-O-eH

o·

Presente en el casquete 2

El casquete bloquea el extremo 5' del RNAm y puede ser metilado en varias posiciones.

levaduras, en las cuales oscila entre l y 60 minutos. En las eucariotas superiores, hay un incremento 138

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

La transcripción empieza con un nucleósido trif fatado (casi siempre una purina, A o G). El prim nucleótid o retie ne a su grupo fosfato 5' y fo rre! enlace fo sfodiéster usual de su posición 3' a 5' del siguiente nucleólido. La secuencia inicial e transcritO puede representarse como: 5'pppAfGpNpNpNp ... Sin embargo, cuando el RNAm maduro es tr.: tado in vitro con enzimas que deben degradarlo t. nucleótidos individuales, el extremo 5' no origi:cl nucleósido tri fosfatado esperado, en cambio, co; tiene dos nucleótidos conectados por una ligadu 5' -5' tri fosfatO, e incluso ostenta grupos metilo. ::.. base terminal siempre es una guanina que se agref a la molécula de RNA original después de la tran cripción. La adición de la G 5' terminal es catalizada p· una enzima nuclea r, la guanilil transferasa. La rea.:ción tan poco después de iniciada la transcripdór que es imposib le detectar más que rastros del e'tremo 5' trifosfato en el RNA nuclear. La reacdóglobal puede representarse como una condensació.entre el GTP y el trifosfato terminal 5' del RNA. Pe> lo tanto 5'

5' + pppApNpNp . , .

.!. 5'- 5' ')ppApNpNp .. . + r , + p

El residuo de G nuevo adherido al extremo dé RNA se encuentra en orientación inversa respec: de los otros nucleótidos. A esta estructura se le denomina ca squ e t e, qu. es un sustrato de muchos eventos de metilación. Ela se observa la estructura completa d.: un casquete después de que se han agregado todc

' ::rupos metilo posibles. Los tipos de casquetes se ~.nguen por el número de roetilaciones de este - • ocun·idas: • La primera metilación ocurre en todas las eucar.iotas y consis te en la adición de un grupo met.ilo en la posición 7 de la guanina terminal. Un casquete que posee este gntpo metilo único se conoce como casquete O. La reacción procede hasta este punto en las eucariotas unicelulares, y la enzima responsable de esta modificación se denornina guanina-7 -metiltransferasa. • El siguiente paso es agregar otro grupo metilo en l.a posición 2' -0 de la penúltima base (que de hecho era la primera base original del transcrito ames de que se hicieran modificaciones), reacción catalizada por o tra em.ima, la 2' -0-metil-transferasa. A un casquete con dos grupos metilos se le denomi n a casqu ete 1, que es ellipo predominante en las eucariotas, excepto en los organismos unicelulares. • En u na pequeña minoría de eucariotas su periores, a. la segunda base se agrega otro grupo meülo, pero sólo cuando la posición es ocupada por adenina; la reacción implica la adición de un grupo metilo en la posición N6 . La enzima responsable actúa sólo en un sustrato de adenosina que ya tiene el grupo metilo en la posición 2' -0. • En algunas especies se agrega un grupo metilo a la tercera base del RNAm que cuente con casquete. El sustrato de esta reacción es el RNAm con casquete 1 que ya tiene dos grupos metilo. La modificación de la tercera base siempre es una metilación de una ribosa en Ja posición 2' -0, lo cual da lugar al casquete 2. En general. este caso representa menos del 10% all5 % de la población total con casquete. En una población de RNAm eucarióticos, todas molécuJ~ poseen casquete, y la proporción co;;pondieme a cada tipo es característica de cada ;.mismo. No se sabe si la estrucwra de una mo._ ..:a específica de RNAm es invariable o si puede · ~r más de un tipo de casquete. Además de la metilación implicada en el proceso :.a adidón del casquete, sólo en el RNAm de las :3Fiotas superiores ocurre una mettlación interna :'aja frecuencia merced a la generación de reside N6 metiladenina a una frecuencia de aproxi2al.cllileote una modificación por cada l 000 bases. - una o dos metiladeninas en un RNAm eucari ó:-ípico, aunque su presencia no es obligatoria; --nos RNAru no tienen ninguna de estas molé.....::5.

El extremo 3' está poliadenilado rrmccptos principales • Después de la transcripción se agrega un fragme nto de poli(A) de - 200 nucleótidos a un transcrito nuclear. • El poli(A) está un]do a una proteína específica (PABP). • EL poli(A) estabiliza al RNAm contra la degradación.

El fragmento 3' tcrmjnal de residu os de A con frecuencia se describe como cola de poli(A)¡ al RNAm con esta caracte1istica se Je denomina poli(A)+. La secuencia <.le poli(A) no se codifica en el DNA, más bien se adhiere al RNA del n úcleo después de la transcripción. La adición de poli(A) es catalizacla por la enzjma poli(A) polimerasa, que agrega -200 residuos de A al extremo 3'- 0H libre del RNAm. El tracto poli(A) del RNA nuclear y del RNAm se relaciona con una protefna. la proteína de unión al poli(A) (PABP, poly(A)-binding protein) . En muchas eucariotas se encuentran fo rmas relacionadas de esta proteína . Un monómero de la PABP de -70 kD se une cada 10 a 20 bases de la cola de poli(A) , así que una caracrerística común en muchas, o la mayoría, de las eucariotas es que el exrremo 3' del RNAm está formado por un fragmento de poli(A) tundo a una gran masa proteínica. La adición del pol i( A) es parte de una reacción en la que el extremo 3' del RNAm es generado y modificado por un complejo de enzimas (véase la sección 26.19, Los extremos 3' de los1{NAm se generan por división y polladenilación) . La unión del PABP con el facto r de inkiación eiF4G genera un lazo cerrado en el cual los extremos 5' y 3' del RNAm se encuentran sujetos al mismo complejo proteínico (véase la Fig. 8.20 de la sección 8.9, Las eucariotas utilizan un complejo de numerosos factores de iniciación). La formación de este complejo puede ser la causa de algunos de los efectos del poli(A) en las p ropiedades del RN Am, que suele ser estabilizado por aquéL La capacidad del poli(A) de proteger al RNAm contra la degradación implica la unión con la PABP. La eliminación del poli (A) inhibe el in icio de la traducción in vitro, en tanto que el agotamiento de la PABP en las levaduras in vivo tiene el mlsmo efecto, desenlaces que podrían depender de la unión de la PABP con el complejo de iniciación en el extremo 5' del RNAm. En el desarrollo embrionario temprano hay muchos ejemplos de ello, en los cuales la poliadeoilación de un RNAm específico está correlacionada con su traducción. En algunos casos, los RNAm se almacenan en forma de no poliadenilada y se agrega un poll(A) cuando es necesaria su 7 10 El extremo 3' está poliadenilado

139

"

r·

~

La mayor pane de la población de ANA es RNAr que carece de poli(A)

.

.

El ANAm con poli(A) representa una pequeña porción de RNA

--AAA

--& Selarosa - oligo(dT) -AAA- El ANA poli(A)'" -"AAA - AAA ·

se pega a la columna

El ANAr fluye a través de la columna

El RNA poli(A)• puede separase de otros RNA por fraccionamiento en sefarosa-oligo(dT).

traducción; en otros, los RNAm poli(A)+ son des· adenilados y se reduce su traducción. La presencia del poli(A) tiene una aplicación práctica imponame. La región poli(A) del RNA.m puede aparearse con un oligo(U) o con un oligo(dT), reacción que puede servir para aislar el RNAm poli(A)+. La técnica más conveniente es inmovilizar el o ligo (U o dT) en un so pone sólido y posteriormente, cuando se aplica una población de RNA a la columna, como ~e ilustra en la , sólo se retiene el RNA poli(A) .... El RNA puede liberarse tratando a la columna con una solución que rompa los enlaces. El único inconveniente de este procedimiento es que aísla todo el RNA que contiene poli(A). Por ejemplo, si se utiliza e l RNA de toda la célula, los RNA poli(At nuclear y citoplásmico serán retenidos, pero si se utilizan preparaciones de polisomas (un procedimiento común), la mayoría de los RNA po l i{A) ~ serán RNAm activos. Sin embargo, además del RNAm en los polisomas, en el citosol que contiene RNAm poli(A)+ también hay partículas ribonucleoprmeínicas que no se traducen. Este RNA puede ser "almacenado" para usarse en otra ocasión, de modo que el aislamiento del RNAm poli (A)• total no corresponde exactamente a la población del RNAm activo. El método de "clonación" para purificar el RNAm consiste en copiarlo para formar una cadena de DNA complementario (conocido como DNAc, complemenfCIIy DNA) que posteriormente podrá utilizarse como molde para sintetizar una cadena de DNA iuéntka a la secuencia del RNAm original. El producto de estas reacciones es un DNA de doble 140

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

cadena que corresponde a la secuencia delRNAm que puede reproducirse en grandes cantidades. La dispocübilidad de un DNA clonado facUi· el aislamiemo del RNAm correspondieme por m~. dio de técnicas de hibridación, incl uso Jas moléc las de RNAm cuyas copias por célula se presenta en cantidades reducidas pueden aislarse median este método. De hecho, sólo los RNAm presentes~ cantidades relativamente grandes pueden aislar< directamente, sin necesidad de la clonación. Casi todos los RNAm celulares poseen poli(A pero una excepción que debe tomarse en cuem son los RNAm que codifican a las proteínas de J¡; !listonas (componente estructural imponame d~; material cromosómico). Estos RNAm comprendt>· a la mayoría, si no es que a toda, de la fracci( poli(A)-. El significado de la ausencia de poli(A en el RNA.m de las histonas no ha sido definidr y no hay un aspecto particulat• de su función qu iustifique dicha ausencia.

La degradación del RNAm

bacteriano involucra a múltiples enzimas Conceptos principales

La dirección global de la degradación del RNAm bacteriano es de 5'-+3: • La degradación es resultado de la combinación de divisiones endonucleollticas seguidas de la degradación exonucleolítica del fragmento de 3' -+5'.

El RNAm bacteriano es constantemente degradad• :por una combinación de endonucleasas y exonu· clcasas. Las endonucleasas dividen a un RNA en u::sitio in terno, en tanto que las exonucleasas estár implicadas en t'eacciones de recorre en las cuale• los residuos adicionales son. retirados, base por base desde el extremo. Las exonucleasas bacterianas qut actúan en moléculas de RNA de cadena individua proceden a lo largo de la cadena de ácido nudeio a partir del extremo 3' . La manera en que dos tipos de enzimas trabajar. en conjunto para degradar al RNAm se muestra er la . La degradación de un RNAm bacteriano se inicia con un ataque endonucleolítico. po; el que pueden generarse numerosos extremos 3 media nte divisiones endonudeolíticas del RNA:m. La dirección global de la degradación (medida por la pérdida de la capacidad de sintetizar proteínas es 5'-+3', lo cual qui¿á se deriva de una sucesión de divisiones endonudeolíricas que siguen al último ribosoma. Más adelante, la degTadación de los fragmentos liberados de RNAm a nucleólido~

debe al ataque exonucleolítico del extremo libre -OH hada el extremo 5' (en dirección opuesta a

:ranscripción). El ataque endonudeolítico libera ·5mcnros con diferente susceptibilidad a las exo· Jeasas. Una región de la estrucmra secundaria RNAm puede ser un obstáculo para la exonu~3sa, de manera que se protegen las regiones loizadas en su lado 5'. Por lo ramo, la estabilidad = cada RNAm depende de la susceptibilidad de su .:uenria específica a las divisiones tanto endonu:: )JíLicas como exon udeolíticas. En E. coli se han enconrrado -1 2 ribonudea.Los mutames carentes de endorribonucleasas .cepto la ribonucleasa I, cuya ca rencia no tiene -:gú n efectO) acumulan precursores no procesados _ RNAr y RNAt, pero son viables. En el caso de mutantes que carecen de exonucleasas, con frecncia sus fenotipos éiparentemente no han sufrido eradones, lo cual sugiere que una enzima pued e _.,¡ir la ausencia de otra. Los mutantes que carecen _ ''arias en'l.imas en ocasiones no son viables. la RNAasa E es la enzima clave para iniciar la isión del RNAm, y podría ser la que hace la pri_!a división de numerosos RNAm. En los mutanbacterianos cuya ribonucleasa E está defectuosa, estabilidad del RNAm es mayor (de dos a tres -.:es), pero no es ésa su única función. La RNAasa : =e descubrió originalmente como la enzima cauo:te del procesamiento 5' del RNAr del transcritO - mario por un evento especifico de procesamiento Jonucleolítico. El proceso de degradación puede ser cataliza;lOr un complejo multienzimático (en ocasiones ..:""!lado d egra doso m a ) que incluye ribonucleasa - ?~Pasa (polinucleótido fosforilasa) y helicasa. La :\asa E 1iene funci ones duales. Su dominio rermi~ proporciona una actividad de endonucleasa, :an to que el1erm ina l C constituye un andamio ~ mantiene unidos a los otros com.ponemes . La _Jcasa desenrolla el sustrato de RNA para que esté ~uni ble para la PNPasél. De acuerdo con este mou, la RNAasa E realiza e l con e inicial y posrerior.:"'lte pasa los fragmentos a Jos ou·os componentes complejo para que sean procesatlos. Podrfa ser que la poliadenilación estuviera rela..,ada con el inicio de la degradación de algtmas .éculas de RNAm en las bacterias. En E. coli, la A) polimerasa está asociada con los ribosomas -=agregan fragmentos conos (de 1O a 40 nudeó.s) de poli(A) cuando menos a algunos RNAm. mutaciones triples que eliminan la poli(A) poerasa, la ribonudeasa E y la polinucleótido fos.asa (PNPasa, una exonuclcasa 3'- 5') ejercen un ~o contundente en la estabilidad. (El efecto de -nutaciones en genes individuales o en pares de es es apenas perceptible.) La poli(A) polimerasa

Endonucleasa

l

~~i,l-"r¿:

RNAasa E Exonucteasa

!

~~_rx:_

l K~

,....._.¡

~

¡-'

! La degradación del RNAm bacteriano tiene lugar en un proceso de dos etapas. las divisiones endonucleolítica.s proceden en dirección 5'-3', detrás de los ribosomas. los fragmentos liberados son degradados por exonucleasas que avanzan en dirección 3'-5'.

puede crear una cola de polí(A) que funge como sitio de unión para las nucleasas. así que su función en las bacterias sería diferente a su función en las células eucariólicas.

La estabilidad del RNAm depende de su estructura y su secuenc1a Conceptos principalc> las modificaciones de ambos extremos det RNAm lo protegen contra la degradación mediada por las exonucleasas. las .secuencias específicas de un RNAm pueden producir efectos estabilizadores o desestabilizadores. • la desestabilización puede ser activada por la pérdida de poli(A).

Las características principales del RNAm relacionadas . Tancon su estabilidad se resumen en la to la estructura como la secuencia son importantes. Las estructuras terminales 5' y 3' protegen contra

7.1l La estabilidad del RNAm depende de su estructura y .su secuencia

141

El casquete protege contra la exonucleasa 5'-3'

Los codones sin sentido activan el sistema de vigilancia

La endonucleasa ataca ala secuencia desestabilizadora

UM UAG UGA

....15'

5' UTR

xxxx

Región codificadora

3' /WW!AA

El poli(A) protege contra la exonucleasa 3' -5'

1

3'UTR

Las modificaciones de los extremos del RNAm lo protegen contra la degradación. Secuencias internas pueden activar a los sistemas de degradación.

í

(AUUUAI

--~

Proteina de unión a la secuencia ARE

~

Poli(A) ribonucleasa

~

CAOUOAín

Una ARE en una región no traducida 3' inicia la degradación del RNAm.

La protefna de unión ai iRE se une al IRE en ausencia de hierro

(A}n La prote!na de unión aiiRE se disocia en presencia de hierro

(A)n

Un IRE localizado en la región no traducida 3' controla la estabilidad del RNAm.

la degradación, y secuencias específicas del RNAm pueden [uncionar como ruanas para desencadenar la degradación o conferir protección contra ésta: • Las modificaciones de los extremos 5' y 3' de l RNAm rienen funciones importantes en la prevendón del ataque de las exonudea142

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

sas, de modo que el casquete evira qe .. exonudeasas 5'-3' ataquen el extrem y el poli(A} que las exonucleasas 3' -5 quen el extremo 3'. • Los elementos específicos de la secue:. del RNAm pueden esrabilizarlo o desebilizarlo. La localización más común dt elementos desestabil izadores se encue-:en la región no traducida 3'. La presend .; dicho elemento acorta la vida del RNAr • En la región codificadora, las mutaciones crean codones de terminación activar sistema de vigilancia que degrada al R.'\_(véase la secdón 7 .14, Las mutaciones sentido activan un sistema de vigilancia En numerosas moléculas de RNAm de las Jt. duras se han encontrado elementos desestabiliza.: res, aunque wdavía no se han observado secu cias comunes o no se sabe cómo desestabilizar RNAm. No necesariamente acrúan de forma dire:(proporcionando dianas para las endonucleas.o pero pueden 'funcionar de manera indirecta, qt.fomentando la dcsadenilación. El criterio para _ finir a un elemento desestabilizador de secuer:es que su introducción en un RNAm nuevo put-_ provocar su degradación, si bien la eHminadón un elementO de un RNAm no necesariamente lo e tabi]jza, lo cual sugiere que cada uno de ellos pue_ tener más de un elememo desestabi lizador. Una característica común de algunas molécu _ de RNAm inestables es una secuencia rica en AL': -50 bases (denominada ARE) en la regió11 rem _ que 3'. La secuencia de consenso de la ARE es_ pentanudeótido AUUUA, repetido varias veces. =.la se muestra que la ARE desencade:la desesrabilización por un proceso en dos etapa primero es desadenilado el RNAm y posteriormer.·se degrada. La desadenUación podría ser necesa:-' porque da lugar a la pérdida de la proteína de unióal poli(A), cuya presencia estabiliza a la región : (véase la sección 7 .1 3, La degradación del RNA.!: involucra múltiples actividades}. En algunos casos, un RNAm puede ser esrallilizado al inhibir específicamenre la función de u~ elemento desestabilizador. El RNAm de la transferrina contiene una secuencia denominada elemem de respuesta al hierro (IRE, iron-responsive elemen ~ que controla la respuesta del RNAm a los cambio, de concentración del mismo y que se localiza e: la región 3' no traducida, además de que contient' estructuras tallo-lazo que se unen a proteínas cuya afinidad por e l RNAm se controla por medio de. hierro. En la se muestra que la unión de la proteína con el IRE estabiliza al RNAm al inh.ibi~ la función de secuencias desestabilizadoras cercanas (no identificadas}. Éste es un modelo general de la

.:abilización del RNAm, es decir, la estabilidad es ;,ferida por la inhibición de la función de secuen3.5 desestabilizadoras. La eliminación del casquete y la degradación drten en complejos protemicos grandes localiza:s como unidades ciroplásmicas discretas denomi-.:ias cuerpos-P, en los cuales pueden localizarse :as enzimas implicadas en la producción o el me -~olismo del RNAm. De hecho. dichos cuerpos puen secuestrar a cualquier molécula de RNAm que esté involucrada activamente en la traducción.

Casquete 1

Poii(A)/PABP 1

AAAAAAAAAAAA

~ Desadenilación Ccr4 Dcp1

~ Eliminación del casquete

La degradación del RNAm im plica múltiples actividades 1 :.oJnceptos

XRN1

principales

Para la degradación del RNAm de las levaduras se requiere de la eliminación del casquete 5' y del poli(A) 3'. Una ruta de las levaduras implica la degradación exonucleolítica en dirección 5'~3'. Otra ruta de las levaduras utiliza un complejo de 1umerosas exonucleasas que funcionan en dirección 3'~5'.

..a desadenilasa de las células animales puede unirse directamente con el casquete

s·.

-: ia degradación del RNAm de las levaduras es de ~ue más se sabe. Básicamente hay dos rutas que ~pieza n con la eliminación de la cola de poli(A), :~racción cata lizada por una desadenilasa especí.2 que probablemente funciona como parte de un :!!piejo proteínico vasw. (La subunidad catalítica .a exonucleasa Ccr4 en las levaduras, así como - cxonucleasa PARN en los vertebrados, que está .a.:ionada con la RNAasa D.) La acción enzin1ática . ' regresiva, una vez que ha empezado a degradar - sustrato específico de RNAm, sigue desensam·'ldolo, base por base. La ruta de degradación principal se resume en la . La desadenilación del extremo 3' activa :Jminación del casquete del extremo 5'. La base .5ta relación es que la presencia de la PABP (pro· -.:de unión a poli(A)) en el poli(A) impide que la .=ma responsable de la eliminadón del casquete _:ta al extremo 5'. La PABP se libera cuando la ptud del poli(A) está por debajo de 1O a 15 resi- ;;, La eliminación del casquete ocurre al separar .=.se metilada del extremo S' para dejar un mono· 3W en la reacción: m 7 GpppX ... ~m7 GDP + pX... :-'1zíma requiere del grupo 7 -metilo. :::ada extremo del RNAm influye en los eventos • Jcurren en el otro extremo, lo cual se explica - 'Je ambos extremos del RNAm se mantienen

La desadenilación permite la eliminación del casquete, lo cual provoca la división endonucleolítica a partir del extremo 5~

unidos por los factores implicados en la síntesis proteínica (véase la sección 8.9, Las eucaríotas utilizan un complejo formado por numerosos factores de iniciación). El efecto de la PABP en la eliminación del casquete permite que el extremo 3' incida en la estabilización del extremo 5'. Asimismo, hay una conexión entre la estructura del extremo 5' y la degradación del extremo 3'. La desadenilasa se une directamente al casquete 5', interacción necesaria para su ataque exonucleolítico contra el poli(A). ¿Cuál es el fundamento de la conexión enue los eventos que ocurren en ambos extremos de una molécula de RNAm? Quizá sea necesario asegurarse de que el RNAm no permanezca en un estado (teniendo la estructura de un extremo, pero no la del orro) que pueda competir con el RNA.m activo por las proteínas que se unen a los extremos. La eliminación del casquete activa la ruta de degradación 5'·3', en la cual el RNAm es degradado rápidamenre a partir del extremo 5' mediante la exonucleasa 5 ' · 3' XRN l. La enzima responsable de la eliminación del casquete se concentra en locicitOplásmicos discretos, los cuales pueden ser "cuerpos de procesamiento" en que el RNAm es desadenilado y posteriormente degradado. después de eliminarse el casquete. En la segunda ruta, las moléculas de RNAm desadeniladas de las levaduras pueden ser degradadas por la actividad 3' -5' de la exonucleasa del exosoma, un complejo de >9 exonucleasas. El exosoma también participa en el procesamiento de precursores de moléculas de RNAr. La adición de las exonucleasas individuales al complejo del exosoma puede des7. d La degradación del RNAm i1nplica múltiples actividades

143

Las mutaciones sin sentido activan un sistema de vigilancia

Desadenilación

Conceptos pñncipales

Degradación endonucleolítica

Degradación exonucleolltica 5'-3'

• Las mutaciones sin sentido provocan la degradación del RNAm. • En las levaduras y los gusanos se han encontrado genes que codifican al sistema de degradación.

-

'~----------~~~~·

La desadenilación puede provocar directamente

la división endonucleolítica y la división exonucleolítica desde los extremos 3'.

El RNAm de tipo silvestre tiene una estabilidad normal Traducción -+

5'~

,c~ s·

Una mutación sin sentido acliva la degradación Traducción - - .

, -r

s· Terminación prematura /

Se inicia la degradación

Las mutaciones sin sentido pueden provocar la degradación del RNAm.

encadenar las actividades exonucleolíticas 3'- 5' para que sean conLroladas coordinadamente. De igual forma. el exosoma puede degradar a fragmentos de RNAm liberados por división endonucleolítica. En la se muestra que la ruta de degradación 3'-5' puede de hecho implicar combinaciones de actividad endonucleolítica y exonucleolílica. El exosoma también se encuentra en el núcleo. donde degrada a precursores de RNAm no empalmados. Los mu tantes de levaduras que carecen de cual quiera de las rutas exonucleolíticas degradan a su RNAm más lentamente. pero la pérdida de ambas rutas es leta l. 144

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

Otra ruta de degradación se identifica por la d egradación d e l RNAm m ediada por mutacion es sin sentido. En la se observa q ue la introducció n de una mutación sin sentido cor frecuencia in crementa la degradación del RNAm Corno puede esperarse de la dependencia de un codón de terminación, la deg radación ocurre e ~ el citoplasma, y podría representar un control de calidad o un sistema de vigilancia para eliminamoléculas de RNAm no funcionales. El sistema de vigilancia ha si.do mejor estudiadf' en las levaduras y en C. elegans, pero también puede ser importante en las células animales. Por ejemplo, durante la formación de inmunoglobulinas : de receptores de células Ten las células del sistema inmunológico. los gene~ son modificados por recombinación somática y mutación (véase el Cap. 23 La diversidad inmunitaria) , suceso que genera ur número signiCicativo de genes no funcionales cuyos productos de RNA son eliminados por un sistema de vigilancia. En las levaduras. la degradación requiere deelementos de secuencia (denominados DSE) de flujc descendente a panir de la mutación sin sentido. La posibilid ad más sencilla sería que se trata de elementos deses tabilizadores y que la traducción suprime su uso . Sin embargo, cuando se bloquea la traducción. el RNAm se estabiliza. lo cual sugiere que el proceso de degradación está vinculado de alguna forma directa con la traducción del RNAm o con el even to de terminación. Los genes necesarios para el proceso han sido identificados en S. cerevisiae (loci upf) y en C. elegans (loci smg) mediante la detección de supresores de degradación mediada por mutaciones sin sentido. Las mutaciones de estos genes estabilizan a las moléculas aberrantes de RNAm. pero no afectan la estabilidad de la mayoría de los transcritos de tipo silvestre. Uno de estos genes se conserva en las eucariotas (upfllsmg2) y codifica a una helicasa dependiente de ATP (enzima que desenrolla los áddos nucleicos de doble cadena para formar cadenas individua les). Esto implica que d reconocimiento del RNAm como objetivo apropiado para la degradación requiere de un cambio de estructura.

El gen Upfl interactúa con los (actOres de libe--ón (eRFl y cRF3) que catalizan la terminación. _~ es probablemente la forma en que reconoce el emo de terminación. Posteriormente puede "es-"""''iñar" aJ RNAm desplazándose hacia el extremo
Las moléculas de RNA eucariótico se t ransportan

Exón

lntrón

Corte y empalme

NÚCLEO

1-----CITOPLASMA

~

Exón

La proteína se une a la unión exón-exón

'-----1 Se unen más proteínas

La terminación prematura desencadena la degradación

Un sistema de vigilancia podña tener dos tipos de componentes. Las proteínas deben unirse en el núcleo para marcar el resultado de un evento de corte y empalme, en tanto que otras pueden unirse a la marca, ya sea en el núcleo o en el citoplasma. Éstas se activan para degradar al RNAm cuando los ribosomas terminan orematuramente.

ANA

Transporte

Localización

Todo el RNA

Núcleo -t citoplasma

Todas las células

:.l RNA es transportado a través de una membrana a 11anera de partículas ribonucleoproteínicas.

ANAl

Núcleo -t m1tooondrla

Muchas células

iodas las moléculas de RNA eucariótico que funcio nan en el citoplasma deben exportarse desde el núcleo.

RNAm

Célula nodriza -t ovocito

Génesis embrionaria de la mosca

...as moléculas de RNAt y el componente de RNA rle una ribonucleasa se importan al interior de las mitocondrias.

RIIIAm

Ovoclto anterior -t ovocito Génesis embrionaria posterior de la mosca

ANA m

Célula ~ célula

' :.: --ceptos principales

1

Floema de las plantas

...as moléculas de RNAm pueden recorrer grandes jistancias entre las células de las plantas. Las moléculas de RNA se transportan a través de membranas en diversos sistemas. -~-bacte rias

están formadas por un solo comparti ento, de modo que todos los RNA funcionan en ~smo ambiente en el cual son sintetizados, lo _.!:es particularmente sorprendente en el caso del ~. en cuyo caso, la traducción es simultánea a -anscripdón (véase la sección 7.7, El ciclo vital fu'lA mensajero bacteriano). El RNA se transporta a través de las membraen los diversos ejemplos resumidos en la . Transportar una molécula de RNA altamente ·.:.ativa a través de una membrana hidrófoba cons-

tituye un problema termodinámico que se soluciona transportándola empaquetada en p roteínas. En las células eucarióticas, los RNA se transcriben en el núcleo, pero la traducción ocurre en el citoplasma. Los diferentes tipos de RNA deben transportarse en el citoplasma para ensamblar el mecanismo necesario para la traducción. Asi. el RNAr se ensambla con las proteínas ribosómicas para formar subu n idades ribosómicas inmaduras que constituyen los sustratos para e l sistema de 7,. S Las moléculas de RNA eucariótico se t ransportan

145

transpone; el RNAt es transportado por un sistema de proteínas específico; el RNAm es transportado como una ribonucleoprOLeína, la cual se forma en el tramcrito de RNA en el núcleo (véase el Cap. 26, Corte, empalme y procesamiento del RNA). Estos procesos son comunes en rodas las células eucarióticas. Muchos RNAm se traducen en el citosoL si bien algunos se localizan en el interior de la célula porque se adh1eren a un elemento del ciwesquelew. En situaciones en que hay localización, es importante que el producto proteínico sea producido cerca del sitio de su incorporación a alguna esuuctura macromolecular. Algunas moléculas de RNA se forman en el núcleo, se exportan al citosol y posteriormente se importan al interior de las mitocond.rias, que en algunos organismos no codifican a todos los RNAt necesarios para la síntesis de prOteínas (véase la sección 4.1 O, Los genomas de los organdos son moléculas circulares de DNA que codifican a proteínas de los orgam·los). En estos casos, los RNAt adicionales deben importarse desde el citosol. La enzima ribonucleasa P, que contiene RNA y subunídades proteínicas, es codificada por genes nucleares, no obstante que se encuentra tanto en las rnitocondrias como en el núcleo, Jo cual significa que el RNA debe ser importado al interior de la mirocondría. Se sabe de algunas situaciones en que el RNAm es transportado incluso cnrre células. Durante el desarrollo del ovocito en Drosopltiltt, ciertas moléculas de RNAm son transporradas al imerior del óvulo desde la'> células nodrizas que lo rodean, dado que estas últimas rienen uniones especiali7.adas con el ovocito que permiten el paso del material necesario para el desarrollo inicial. Este marerial incluye ciertos RNAm, que una ve7. dentro del óvulo, asumen localizaciones específicas. Algunos sencillamente se difunden en e l extremo anterior por el que entran, pero otros recorren todo el úvulo, hasta el extremo posterior, mediante un motor adherido a mirrotúbulos. El caso más asombroso de transpone deJ RNAm es el de las plantas. El movimiento de ácidos nucleicos específicos por distancias largas se descubrió por primera ve1 en las plantas, en las cuales, las proteínas de movimiento vírico propagan la infección vírica rransponando el genoma de un virus de RNA a través de los plasmodesmos (conexiones entre las células). Por otra pane, las plamas tienen un sistema de defensa que hace que las células silencien a un virus infeccioso, el cual. de igual manera, puede implicar la dispersión de componentes, incluido al RNA. a grandes distancias enue las células. Ahora se ha descubierto que las moléculas de RNAmpueden ser transportadas por sistemas similares enlre las células de las planras, Aunque la existencia del sistema 146

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

se conoce desde hace tiempo, sólo recientemen. se demostró su importancia funcional al injenplanras de tomate de tipo silvestre en plantas e( la mmacióo dominante Me (que provoca cambi en la forma de la hoja). El RNAm de la reserva mutantes se transportó al imerior de las hojas d injerto de tipo silvestre. donde cambió su forma.

ELRNAm puede localizarse

es pedfi ca mente Conceptos pñncip<Jies • El RNAm del Ashl de La Levadura forma una ribonucleoprotelna que se une a un motor de miosina. • Un motor Lo transporta a lo largo de los filamentos de actina en el brote germinal. • Se ancla y se traduce en el brote, de manera que la proteína se encuentra sólo en el brote.

En una célula eucariótica, un RNAm se sintetiza e· d núcleo pero se traduce en el citoplasma; em~ en el citoplasma como una partícula ribonucleopr teínica que se transporta a través de un poro n_ dear. Una vez en el citosol, el RNAm puede as darse con los ribosomas y ser traducido. EL dto~ está atestado, lo ocupa una alta concemración e:. proteínas. No se sabe bien qué tan libremente puec difundirse un polisoma en el dtosol, y la mayor pa·t e de las moléculas de RNAm se traducen probable: mente en locaciones aleatOrias, determinadas P' su punto de entrnda al citosol y por la distancia qt. han recorrido hasta alejarse de él, aunque algun¿: se traducen en sitios específicos mediante diversc mecanismos: • Un RNAm puede ser transportado específ.camente a un sitio en el cual se traduce. • Puede estar distribuido universalmente per se degrada en todos lo sitios, excepto en t de traducción. • Puede difundirse Hbremente, pero qued= atrapado en el sitio de traducción. Uno de los casos mejor caracterizados de localización dentro de una célula es el del Ash 1 de la levaduras, que reprime la expresión de la endom:deasa HO en la célula hija que brota, así que eJ HO ~ expresa sólo en la célula madre. la consecuencia eque el tipo de apareamiento cambia sólo en la célul.: madre (véase la sección 19.24, La regulación de'= expresión de HO controla el cambio). La causa deL restricdón en la célula hija es que el RNAm del Ash. es transportado a partir de la célula madre, donde st produce, al interior de la célula hija que brota. Las mutaciones en cualquiera de los cinco ge· nes conocidos como SHE 1-5 lmpiden la loca]jzaciór

Citoplasma materno

Brote La She3 conecta a la She2 con la miosma La She1 se une al filamento de acUna

1

Filamento de actina

El RNAm del Ashl forma una ribonucleoproteína :;)ntiene un motor de miosina que se desplaza por un -,:nto de actina.

~

::dfica y hacen que el RNAm del Ashl se distrisimétricamente en los compartimjentos tanto ~ madre corno de la hija. Las proteínas She L 3 se unen al RNAm del Ashl en una partícu-:'Onucleoprotcínica que transporta al RNAm al se mues- ior de la célula hija. En la .as funcion es de las proteínas. Shelp es una ;!na (identificada previamente como Myo4), en que She3 y She2 son proteínas que conectan ..:osina con el RNAm. La miosina es un motor =:nueve al RNAm a lo largo de los filamentos .:.:üna. ::n la se resume el proceso completo. -_:.-\m del Ash 1 es exportado del núcleo en for- -~ ribonucleoproreína y en el citoplasma se une -ero a la She2, que detecta algunas estructuras _oda rias tallo-lazo en el RNAm. Posteriormente, _ "'e3 se une a la She2. después de lo cual se les : .3 miosina Shel. A continuación, la partícula se --Dcha a un fi lamento de actina y se transporta ~ el brote. Cuando el RNAm del Ashl llega al -: se ancla ahí, quizá por medio de proteínas :e unen específicamente al RNAm. :.:ros casos en los cuales el RNAm se transporta !S específicos son regidos por principios simiEI RNAm es reconocido mediante secuencias . ::uación en cis, las cuales suelen ser regiones -.ructura secundaria de la región no traducida :::. RNAm del Ashl es poco común en el sen_e que las regiones de actuación en cis están - marco codificador. ) El RNAm se empaca en - -.a,rúcula ribonucleoproteínka, y en ocasiones ::verse en panículas muy grandes denomina:-ánulos de RNAm, los cuaJes son los suficien-:te grandes (muchas veces el tamaño de un ::na) como para contener numerosas proteínas __ j pJes componentes de RNA. - .i

El RNAm del Ashl se exporta del núcleo al citoplasma, donde es ensamblado a un complejo con las proteínas She. EL complejo lo transporta a lo largo de los filamentos de actina, hasta el brote.

Una RNPm transportada debe conectarse a un motor que la mueve a lo largo de un sistema de vías, que pueden ser 6lamemos de actina o microtúbulos. Mientras que el Ash 1 utiliza un motor de miosina en las vías de actina, el Ri'lAm de la proteína osear del huevo de Drosophila utiliza un motor de cinesina para moverse a lo largo de microtúbulos. Una vez que el RNAm llega a su destino. necesita ser anclado para evitar que se difunda. Poco se sabe al respecto, pero el proceso parece ser independienre del transpone. Un RNAm transportado por microtúbulos puede anclarse a filamentos de actina localizados en su destino .

Resumen La información genética que porta el DNA se expresa en dos etapas, la transcripción del DNA en RNAm y la traducción del RNAm en una proteína. El RNA mensajero se transcribe de una cadena de DNA complementaria de esta cadena (no codificadora) e idéntica a la otra cadena (codificadora). La secuencia delRNAm, en codoncs triples 5'-3', está relacionada con la secuencia de aminoácidos de la proteína, del grupo terminal N al grupo terminal C. El adapLador que interpreta el significado de un codón es el RNA de transferencia, que tiene una estructura terciaria compacta en forma deL; un extremo del RNAt tiene un amicodón complementario del codón. y el otro extremo puede estar unído de forma covaleme al aminoácido específico que corresponde al codón diana. Un RNAr que porta un aminoácido se denomina aminoacil-RNAt. El ribosoma proporciona el mecanismo que permite que los aminoacil-RNAt se unan a sus codones en el RNAm: la subunidad grande transporta al polipéptido naciente. Un ribosoma se desplaza a lo largo de un RNAm a partir de un sitio de iniciación localizado en la región 5' hasta un sitio de terminación ubicado en la región 3', y los aminoacil-RNAt 7.17 Resumen

147

apropiados responden a sus codones, descargando a su aminoácido, de tal manera que la cadena polipeptídica creciente aumenta un residuo por cada codón recorrido. El mecanismo de traducción no es específico de cada tejido u cada organismo; un RNAm proveniente de una fuente puede ser traduddo por los ribosomas y por las moléculas de RNAL de otra fuente . El número de veces que un RNAm se traduce depende de la afinidad de su (s} sitio(s} de iniciación por los ribosomas y de su estabilidad. En algunos casos se impide específicamente la traducción de grupos de RNAm o de moléculas de RNAm, evento conocido como comrol de la traducción. Una molécu la 1ípica de RNAm contiene un líder 5' y un remolque 3' no traducidos y regiones codificadoras. El RNAm bacteriano suele se r policistrónico, con regiones no traducldas localizadas entre los cistroncs. Cada dstrón está representado por una región codiucadora que empieza con un s itio de iniciación específko y concluye en un sitio de terminación. Las subunidades ribosómicas se asocian en el sitio de iniciación y se disocian en el de terminación de cada región codificadora. Una bacteria E. coli en cultivo tiene -20 000 ribosomas y -200 000 moléculas de RNAr, principalmente en forma de aminoadt-RNAt. Hay -l 500 moléculas de RNAm, que representan a dos o tres copias de cada uno de los 600 mensajeros. Un solo RNAm puede ser traducido por numerosos ribosomas de manera simultánea y formar un polirribosoma (o polisoma ). Los polisomas bacterianos son grandes y en genera l están formados por decenas de ribosomas unidos a un solo RNAm. Los polisomas eucarióticos son más pequeños. típica· mente de menos de 1O ribosomas; cada RNAm pona sólo una secuencia codificadora. El RNAm bacteriano tiene una vida media extremadamente cona, de sólo unos minutOs; incluso, el extremo 5' empieza a ser traducido mientras las secuencias en cascada están siendo transcritas. La degradación es iniciada por las endonucleasas que realizan cortes en sitios discreros, siguiendo a los ribosomas en dirección 5'- 3'. Después, las exonucleasas reducen los fragmcnros a nucleótldos, degradándolos a panir del extremo 3' liberado bacía el extremo 5'. Cada secuencia puede promover o retardar la degradación en los RNAm bacterianos. El RNAm eucariótico debe ser procesado en el núdeo antes de <;er transportado al citoplasma para su traducción. Al extremo 5' se agrega un casquete metilado constituido por un nucleótido que se agrega al extremo original por un enlace 5' -5', después del cual se agregan grupos metilo. La mayor parte de las moléculas baCterianas de RNAm tienen una scwencia de -200 bases de pol i{A) adheridas a su 148

CAPÍTULO 7 El RNA mensajero

extremo 3'. en el n úclco. después de la transcr'ción, sin embargo, los RNAm poli(At parecen~ traducidos y degradados con la misma cinética q los poli(A}*. El RNAm eucariótico existe como u partícula ribonucleoproteínica; en algunos cas, RNPm esrán almacenados, por lo que no se trad cen. Los RNAm eucarióticos suelen ser estables d rante muchas horas y rcner varias secuencias q~ inician la degradación; hay ejemplos en los cua el proceso es regulado. El RNAm de las levaduras es degradado cua~ do menos por dos rutas que empiezan con la e minación del poli(A} del extremo 3', provocando pérdida de la proteína de unión al poli(A) , lo cual su vez conduce a la eliminación dd casquete me· lado del ~xtremo 5' . Una ruta degrada al RNAm panir del extremo 5' por medio de una exonuclea y la otra degrada al RNAm desde el extremo 3', a tr:: vés del t:xosoma, complejo que contiene numeras~ exonucleasas. La degradación mediada por mutaciones s · sentido provoca la destn.1cción de las moléculas e RNAm que tienen un codón de terminación (" sentido) antes del líltimo cxón; para el proceso necesitan los loci upf de las levaduras y Jos loci s1 de los gusanos, sitios que incluyen la actividad ~ la helicasa para desenrollar el RNArn y una prorena que interactúa con Jos factores que terminan sfntesis protefnica. Las características del proceso e las células de los mamíferos sugieren que algune de las proteínas se adhieren al RNAm en el núcle al momento del cone y empalme del RNA para e· minar a los intrones. Los RNAm pueden se r transportados a loca_zacioncs específicas dentro de una célula (especia mente en el desarrollo embrionario). En el slsterr· Ash 1 de las levaduras, el RNAm es t ransportad de la célula madre al interior de la célula hija p r medio de un motor de miosina que se desplaza s•bre filamentos de actina. En las plantas. los RNA:: pueden ser transportados grandes distancias entr las cé lulas.

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IIEJ

La degradación del RNAm implica múltiples actividades

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Referencias

149

Las mutaciones sin sentido activan un sistema de vigilancia

Las moléculas de RNA eucariótico se transportan

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150

CAPiTULO 7 El RNA mensajero

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. . 1ntes1s prote1n1ca ~

~

ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción La síntesis proteínica ocurre por iniciación, elongación y terminación • • • • •

El ribosoma tiene tres sitios de unión al RNAt. Un aminoacil-RNAt entra al sitio A. El peptidil-RNAt está unido al sitio P. El RNAt desacilado sale a través del sitio E. Al transferir el polipéptido oel peptidil-RNAt del sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A, se agrega un aminoácido a la cadena polipeptidica.

La precisión de la síntesis proteínica es controlada por mecanismos especiales • la precisión de la síntesis proteínica es controlada por mecanismos especificas en cada etapa.

La iniciación en las bacterias requiere de subunidades 305 y de factores accesorios • La iniciación de la slntesis proteínica requiere de subunidades ribosómicas 30S y 50S separadas. • También se necesitan factores de iniciación (lF-1, -2 y -3) que se unen a las subunidades 30S. • Para formar un complejo de iniciación, una subunidad 30S que porta los factores de iniciación se une a un sitio de inidadón del RNAm. • El If-3 debe ser liberado para permitir que las sub unidades 50S se unan a los complejos 305-RNAm .

Un RNAt iniciador especial em pieza la cadena poli peptídica • La síntesis proteínica empieza con una metionina usualmente codificada por el triplete AUG. • los diferentes RNAt de metionina están implicados en la iniciación y la elongación. • El RNAt iniciador tiene caracteristicas estructurales únicas que lo distinguen del resto de los RNAt. • El grupo NH. de la metionina unida al RNAt iniciador bacteriano está formilado.

El uso del fMet-RNAt, es controlado por el IF-2 y por el ribosoma • EllF-2 se une al fMet-RNAtf iniciador y le permite entrar al sitio P parcial de la subunidad 30S.

La iniciación implica el apareamiento de bases entre el RNAm y el RNAr • Un sitio de iniciación del RNAm bacteriano está formado por el codón de iniciación AUG precedido de un espacio de -10 bases que contiene el hexámero de potipurina ShineDalgarno.

• El RNAr de la subunidad ribosómica 30S bacteriana tiene una secuencia complementaria que se aparea con la secuencia Shine-Oa!garno durante la iniciación.

Las subunidades pequeñas buscan sitios de iniciación en el RNAm eucariótico • Las subunidades ribosómicas 405 se unen al extremo 5' del RNAm y exploran al RNAm hasta que llegan a un sitio de iniciación. • Un sitio de iniciación eucariótico está formado por una secuencia oe 10 nucleótidos que incluye un codón AUG. • Las subunidades ribosómicas 60S se unen al complejo en el sitio de iniciación.

Las eucariotas utilizan un complejo formado por numerosos factores de iniciación los factores de iniciación son necesarios en todas las etapas de ~sta. inctuida la unión del RNAt iniciador, la unión de las subunidades 40S al RNAm, el desplazamiento a lo largo del RNAm y la unión de la subunidad 60S. El RNAt iniciador eucariótico es un Met-RNAt diferente del utilizado en la elongación, pero la metionina no está formilada. El elF2 une al Met-RNAt, iniciador con el GTP y el complejo se une a la subunidad 40S antes de que se asocie con el RNAm.

1m ELfactor de elongación Tu carga al aminoacilRNAt en el sitio A • El EF-Tu es una protelna G monomérica cuya forma activa (unida al GTP) se une al aminoacil-RNAt. El complejo EF· Tu-GTP-aminoacil-RNAt se une al sitio A ribosómico.

La cadena polipeptídica se transfiere al aminoacilRNAt • la subunidad SOS tiene actividad peptidil transferasa. la cadena polipeptídica naciente se transfiere del peptidilRNAt del sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A. • la síntesis de enlaces peptidicos genera RNAt desacilado en el sitio P y peptidil-RNAt en el sitio A.

La transtocación mueve al ribosoma • la translocación ribosómica desplaza al RNAm tres bases a lo largo del ribosoma. • La translocación lleva al RNAt desacilado al interior del sitio Ey al peptidil-RNAt al interior del sitio P. además de vaciar el sitio A. • El modelo del estado híbrido propone que la translocación ocurre en dos etapas, en las cuales la subunidad 50S se mueve respecto de la subunidad 30S, y posteriormente

Continúa en la siguiente página

151

ésta se desplaza a lo largo del RNAm para restaurar la conformación original.

Los factores de elongación se unen alternativamente al ribosoma • La lranslocación requiere de EF-G. cuya estructura es

semejante a la del complejo aminoacil-RNAt-EF-Tu-GTP. • la unión de EF-Tu y Ef-G con el ribosoma es mutuamente excluyente. • la translocación requiere de la hidrólisis de GTP, la cual desencadena un cambio en la estructura del ribosoma.

la síntesis proteínica termina con tres codones • los codones UAA (ocre), UAG (ámbar) y I,JGA terminan la s!ntesis prote!nica. • En las bacterias se utilizan muy a menudo con frecuencias relativas UAA>UGA>UAG.

los codones de terminación son reconocidos por factores proteínicos • Los codones de terminacióA son reconocidos por factores de liberación de protelnas, no por moléculas de aminoacil-RNAt. • Las estructuras de los factores de liberación clase 1 son semejantes a las del aminoacil-RNAt-EF-Tu y del EF-G. • Los factores de liberación clase 1 responden a codones de terminación especificas e hidrolizan la ligadura polipéptido-RNAt. • Los factores de liberación clase 1 son asistidos por los factores de liberación clase 2 que dependen del GTP. • El mecanismo es similar en las bacterias (que tienen dos tipos de factores de liberación clase 1) y en las eucariotas (que tienen sólo un factor de liberación cl.lse 1).

• Virtualmente todas las proteínas ribosómicas están en contacto con el RNAr. • la mayor parte de los contactos entre las subunidades ribosómicas se realiza entre los RNAr 16S y 23S.

tos ribosomas tienen numerosos centros activos • las interacciones en que está implicado el RNAr son clave para la función del ribosoma. • El ambiente de los sitios de unión al RNAt depende ampliamente del RNAr.

El RNAr 165 desempeña un papel activo en la síntesis proteínica • El RNAr 16S desempeña un papel activo en las funciones de la subunidad 30S, pues interactúa directamente con la subunidad SOS y con los anticodones de las moléculas de RNAt localizadas en los sitios P y A.

Olil El RNAr 235 tiene actividad peptidil transferasa •

La actividad peptidil transferasa reside exclusivamente

en el RNAr 23$.

m:l Las estructuras ribosómicas cambian cuando se unen las subunidades • La cabeza de la subunidad 30S gira en torno al cuello cuando se forman los ribosomas completos. • El sitio activo peptidil transferasa de la subunidad 50S tiene mayor actividad en los ribosomas completos qlle en las subunidades individuales 50S. • La interfase entre las subunidades sos y 30S es muy rica en contactos disociables.

Resumen

El RNA ribosómico abarca ambas subunidades ribosómicas • Cada RNAr tiene muchos dominios distintos que se doblan de manera independiente.

Introducción Un RNAm contiene una serie de codones que interactúan de tal manera con los anticodones de los aminoacii-RNAt que la serie correspondiente de am inoácidos es incorporada a una cadena polipeptídica. El ribosoma proporciona el ambiente necesario para controlar la interacción entre el RNAm y el aminoacil-RNAL al compo:narse como una pequeña fábrica migraloria que viaja a lo largo del molde conduciendo ciclos rápidos de síntesis de enlaces peptídicos. Los aminoacil-RNAt entran y salen de la panícula a una velocidad impresionante mientras depositan am.inoáddos, y cienos facrores de elongación se asocian y disocian cíclicamente de ellos. Junto con sus factores accesorios, el ribosoma proporciona el rango completo de actividades necesarias para Lodos los pasos de la síntesis proteínica. En la se muestran las dimensiones relaLivas de los componentes del mecanismo de la síntesis proteínica. El ribosoma está formado por 152

CAPiTULO 8 Síntesis proteínica

dos subunidades que tienen funciones específicas en la símesis de proteínas. El RNA mensajero está asociado con la subunidad pequeña, de modo que -30 bases de l RNAm están comprometidas en uo momento dado. El RNAm se desliza por la superfide, cerca de la unión de la subunidades. Dos moléculas de RJ'\At presentan actividad en la síntesis proteínica en todo momento, de modo que la elongacióu del polipéptido implica reacciones que suceden (aproximadamente) dos de los 1O codones que abarca el ribosoma. Los dos RNAr se insertan en sitios internos que se extienden por las subunidades. Antes de ser reddada, una tercera molécula de RNAt puede permanecer en el riboc;oma después de haber sido utilizada en la síntesis proteínica. La forma básica del ribosoma se ha conservado durante la evolución, sin embargo, hay variaciones apreciables en el tamaño general y en las proporciones de RNA y de proteínas en los ribosomas de las bacterias, del citoplasma eucariótico y de los organelos. En la se comparan los componen-

..:e los ribosomas bacterianos y de los mamíferos, en ambos casos son partículas ribonucleoproteí-5 que contiene una mayor cantidad de RNA que -:-oteínas. Las proteínas ribosómicas se conocen

!

o proteínas r. Cada una de las subunidades ribosómicas con-:e un RNAr importante y cierta cantidad de eínas pequeñas. La subunidad grande también -:!e tener una o más moléculas pequeñas de ..... En E. coli, la subunidad pequeña (30$) esrá -.ada por RNAr l6S y 21 proteínas r, en tanto en la grande (SOS) se encuentran el RNAr 23$, ~XA pequeño SS y 31 proteínas. Excepto por - .ie la cual hay cua[ro copias por cada ribosoma, nay una copia de cada proteína. Las moléculas res de R..T\l'A constituyen la parte principal de la - .; del ribosoma bacteriano; su presencia es penee y, de hecho. todas o casi rodas las proteínas '~micas contactan al RNAr, de modo que los -:mayores constituyen lo que en ocasiones se dera como la columna vertebral de cada sub-~d. una hebra continua cuya presencia domina ~ estructura y determina las posiciones de las =:nas ribosómicas. :_:~s ribosomas citoplásmicos de las eucariotas ~ores son más grandes que los de las bacterias. ~renido total de RNA y de proteínas es mayor; Dléculas mayores de RNA son más largas (se ':linan RNAr 18$ y 28S) y hay más proteínas. ~vlememe la mayor parte de las proteínas, si _ ..¡oc todas, están presentes en camjdades es•métricas. El RNA sigue siendo el componente '1linante por masa. - s ribosomas de los organelos son distintos de o:.. citosol y asumen diversas formas, de mane...:. en algunos casos son casi del tamaño de los _-:anos y tienen 70% de RNA, mientras que en >ólo son de 60S y tienen <3 0% de RNA. ribosoma posee numerosos centros activos, :10 de los cuales está constituido por un grupo ·eínas relacionadas con una región de RNAr ::Uco. Los centros activos requieren de la par:::ón directa del RNAr en una función estrucincluso catalítica. Para algunas funciones ca·s se requiere de proteínas individuales, pero . •a de las actividades puede ser reproducida ~l'lteínas aisladas o por grupos de proteínas; nan sólo en el contexto del ribosoma. ~-el análisis del ribosoma son importantes dos -e información. Las mutaciones implican a -:as ribosómicas específicas o a bases del RNAr l~dones espeáficas. En el análisis estructuraL 3 la modificación directa de los componentes _:.soma y las comparaciones para identificar Kterísticas conservadas en el RNAr, se iden-

~-tll ~ 60Á

220A RNAm de 35 bases

Las comparaciones de tamaño muestran que el ribosoma es lo suAcientemente grande coma para unirse a los RNAt y el RNAm.

Aibosomas

ANAr

Protefnas r

Bacterianos (70S) masa: 2.5 MDa

sos

23S 2904 bases SS " 120 bases

=

31

66"/ode ANA

30S

16S

=1542 bases

21

2BS 60S S.BS SS

60"/ode ANA

40S

=4718 bases =160 bases =120 bases 1BS = 1874 bases

49

Mamíferos (80S) masa: 4.2 MDa

33

Los ribosomas son partículas ribonucleoproteínicas que contienen más RNA que proteínas y que se disocian en sub unidades grandes y pequeñas.

tifican las localizaciones específicas de componemes implicados en funciones particulares .

La síntesis proteínica ocurre por iniciación, elongación y terminación

=

Conceptos principales • • • • •

El ribosoma tiene tres sitios de unión al RNAt. Un aminoacil-RNAt entra al sitio A. El peptidil-RNAt está unido al sitio P. El RNAt desacilado sale a través del sitio E. Al transferir el polipéptido del peptidil-RNAt del sitio P al aminoacii-RNAt del sitio A, se agrega un aminoácido a la cadena polipeptídica.

Un aminoácido es transportado al ribosoma por un aminoacii -RNAt, y la adición a la cadena proteínica creciente se debe a una ínteracción con el RNAt que transportó al aminoácido previo. Cada uno de

8.2 La síntesis proteínica ocurre por iniciación, elongación y terminación

153

Codón "n + 1" ~ entra eJ aminoacii-ANAt

Codón "n" sujeta al peplidii-RNAt

\J

M= ntodel rlbosoma ~

5'-

3'

1 Antes de la formación del enlace peplidico, el peptidii-RNAI ocupa el sitio P; el aminoacii-RNAt ocupa el sitio A

2 En la formación del enlace peptldlco, el polipéptido es transferido del polipeplldii-RNAt del sitio P al aminoacii·ANAt del sitio A

3 La translocación mueve al ribosoma un codón; : coloca al peptidii·ANAt en el sitio P; el ANAl : desacilado sale por el sitio E; el sitio A es desocupado para el próximo aa-ANAl

!.

........

~ !i. \ '

. e0 don

n+

)¡_/

Codón "n + 2"

El ribosoma tiene dos siti os para unirse al RNAt cargado.

Los extremos aminoacilo del ANAl interactúan con la subunidad ribosómica grande

Los anlicodones están unidos a tripletes adyacentes del RNAm en la subunidad pequeña del ribosoma Los sitios P y A posicionan a los RNAt que i nteractúan a t ravés de ambas subunidades ribosóm icas.

154

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

estos RNAt yace en un sitio distinto del ribosoma. En la se muestra que los dos sitios tienen características distintas: • Un aminoacil-RNAt se une al sitio A , perc antes de que entre, el sitio expone el codór que representa al siguiente aminoácido que se agregará a la cadena. • El codón que representa al aminoácido más recientemente agregado a la cadena polipeptídica naciente está en el sitio P , el cua: es ocupado por el p e ptidii-RNAt, RNAt que porta la cadena polipepúdica naciente. En la se muestra que el extremo de. RNAt q ue lleva u n aminoácido se localiza en la subunidad grande, mientras que el anticodón ubicado en el otro extremo interactúa con el RNAm unido a la subunidad pequeña, de modo que los sitios P ~ A abarcan las dos su bunidades ribosómicas. Para que un ribosoma sintetice un enlace peptídico, debe encontrarse en el esrado que se muestra en el paso 1 de la Figura 8.3, cuando el peptidiiRNAt se encuentra en el sirio P y el aminoacil-RNAt en el A. La formación del enlace peptídico ocurre cuando el polipéptido rransponado por el peptidilRNAt es transferido al aminoácido transportado por el aminoacil-RNAt, reacción catalizada por la subun idad grande del ribosoma. La transferencia del polipéptido genera el ribosoma que se muestra en el paso 2, en el cual eJ RNAt desacilado, que carece de aminoácido, se encuentra en el sitio P, mientras que en el sitio A se ha creado un pepticW-RNAt nuevo más largo debido a que tiene un aminoácido más que el peptidil-RNAt que estaba en el sitio P en el paso l. Ahora, el ribosoma desplaza un triplete a lo largo del mensajero, etapa denominada translo cación . El movimiento transfiere al RNAt desaci· lado fuera del sitio P y desplaza al peptidil-RNAt al interior de éste (véase el paso 3 de la figura). El siguiente codón que debe ser n·aducido se encuentra ahora en el si tio A, listo para que entre un nuevo aminoacii-RNAt, repitiéndose así el ciclo. En la se resume la interacción emre los RNAt r el ribosoma. El RNAt desacilado abandona al ribosoma a través de otro sitio de unión de RNAr, el sitio E, ocupado transitoriamente por el RNAt después de que sale del sitio P y ames de ser liberado del ribosoma hacia el dtosol. Así pues, el RNAr entra al sitio A. pasa por el sitio P y sale por el sitio E (véase también la Fig. 8.28, sección 8.12). En la se compara el movimiento del RNAt y del Rl'IAm, que puede considerarse como una especie de engranaje en el cual la reacción es conducida por la interacción entre codón y anúcodón.

El aminoacii-RNAt entra al sitio A

El polipéptido es transferido al aminoacii-RNAt

La translocación mueve al peptidii-ANAI al sitio P

El aminoacil-RNAt entra al sitio A, recibe a la cadena polipeptídica del peptidilRNAt y es transferido al sitio P para el siguiente ciclo de elongación.

Iniciación La subunidad 50S se une a la 30S por medio del sitio de unión al ANAm y se agrega el aminoacii-RNAI

ANAl

~t \...:;lio •. .

E

yJ.~::.>'

Sitio P

•••

•·•••····· ·•••··•

~'IAm ~ · · •• • •• • • • • ••• •• •• ..-••• • •• • ••• • • • ••••• • ·

AUG Elongación El ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm, ampliando la proterna por transferencia del peptidii-RNAt al aminoacii-RNAt

El RNAt y el RNAm se mueven a través del ribo-

=.:n la misma dirección.

:.a síntesis proteínica se divide en tres etapas, -adas en la • la inidación implica las reacciones que preceden a la formación del enlace peprídico entre los primeros dos aminoácidos de la proteína, proceso que exige que el ribosoma se una al RNAm para forma r un complejo de iniciación que contiene al primer aminoacilRNAt. Este paso es relativamente lento en la síntesis proteínica y usualmente determina la velocidad a la cua l se traduce un RNAm. • La elongación incluye todas las reacciones que tienen lugar desde la síntesis del primer enlace peptídico hasta la adición del ú ltimo aminoácido. Los aminoácidos se agregan a la cadena uno a uno; la adición de un ami noácido es el paso más rápido en la síntesis proteínica. • La terminación comprende los pasos necesarios para liberar a la cadena polipeptídica completa; al mismo tiempo, el ríbosoma se disocia del RNAm. ::::cada etapa, el ribosoma es asistido por cti fe- conjuntos de factores accesorios: la energía -::e de la hidrólisis del trifosfato de guanosina -

::·!lanine Lriphosphate).

""'1

Terminación La cadena polipeptrdica es liberada del

RNAt y el ,;bosoma se d;,oda del

l

~

la sintesis proteínica se divide en tres etapas.

Durante la iniciación, la subunidad ribosómi ca pequeña se une al RNAm y posteriormente a la subunídad 50S. Durante la elongación, el RNAm se desplaza a Jo largo del ribosoma y se traduce en tri plctes. (Aunque en general se hace referencia a que el ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm, es más realista pensar que el RNAm es jalado a través del ribosoma.) En la terminación, la proteína se libera, el RNAm se separa y las subunidades ribosórnicas se disocian para poder ser utilizadas nuevamente.

8.2 La síntesis proteínica ocurre por iniciación, elongación y terminación

155

111

La precisión de la s1ntesis prote1nica es controlada por mecanismos especiales

Concepto pñncipal • La precisión de la síntesis proteínica es controlada por mecanismos específicos en cada etapa.

Se sabe que, en general, la síntesis de las proteínas es exacta por la coherenda con se determina la secuencia de una proteína, y aunque son pocas las mediciones detalladas de la tasa de error in vivo, suele pensarse que el rango de error oscila entre 104 y 10 5 aminoácidos incorporados. Considerando que la mayor parte de las proteínas se produce en grandes cantidades, la tasa de error es muy baja como para incidir en el fenotipo de la célula. No es inmediatamente obvio cómo se logra dicha tasa de error tan baja, y de hecho, la naturaleza de los eventos discriminatorios es un tema oeneral o planteado en varias de las etapas de la expresión génica. ¿Cómo reconocen las sintetasas justo a los RN Ar y a los aminoácidos correspondientes? ¿Cómo reconoce un ribosoma los RNAt y los aminoácidos correspondientes? ¿Cómo detecta un ribo soma al

Tasa de error

~J -

Base equivocada

~

1\.

Cambio del marco de lectura

1\.

Aminoacii-RNAI equivocado

~l

1 1

1

t NH 2

~il)lorH!C-H Aminoácido R~~ sinera~

l

~co equivocado ANAl equivocado

1

-

10-610-5 10~

Los errores se presentan a tasas que oscilan entre 10-6 y 5 x 10-4 en etapas difere ntes de la síntesis proteínica .

156

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

RNAt que corresponde al codón del sitio A? ¿Cómo identifican las enzimas que sintetizan DNA o RNr.. sólo a la base complementaria del molde? Cada caSI. plantea un problema similar: cómo distinguir a ur miembro específico en w1 conjunto en el que todc• los integrantes tienen las mismas características genera les. Es probable que uno de los miembros empiec~ por contactar el centro activo mediante un procesi de impactos aleatorios, pero después, los miembro erróneos son rechazados y sólo se acepta el apropiado, que siempre forma parte de una minoría (un· de 20 aminoácidos, uno de -40 RNAt, una de cuatr . bases), de modo que los criterios de discriminaciórdeben ser esuictos. El punto es que la enzima debt tener algún mecanismo que perfeccione el proceso de discriminadón respecto del nivel que podríc lograrse haciendo contacto sólo con Ias superficie'> disponibles en los sustratos. En la se resumen las rasas de error en cada paso que pueden afectru: la predsión de 12 síntesis proteínica. Los errores de transcripción del RNAm son pocr frecuentes, quizá de
La iniciación en las bacterias requiere de subunidades 305 y de factores accesorios : é'nceptos ¡:rincipales la iniciación de la síntesis proteínica requiere de subunidades ribosómicas 30$ y SOS separadas. También se necesitan factores de iniciación (IF-1, -2 y •3) que se unen a las subunidades 305. Para formar un complejo de iniciación, una subunidad 305 que porta los factores de iniciación se une a un sitio de iniciación del RNAm. a IF-3 debe ser liberado para permitir que las ;ubunidades SOS se unan a los complejos 305-RNAm.

- . ribosomas bélcterianos implicados en el alarga.=!lto de una cadena polipepLídica existen como -:ícu las 70S que en la terminación son liberadas RNAm como ribosomas libres. En las bacterias .:ultivo, la mayor parte de los ribosomas sinte.:'1 proteínas; el banco libre tiende a comener -_ ~r o de los ribosomas. :.os ribosomas que se encuentran en el banco ~pueden disociarse en subunidades indepen- tes, es decir, que lo!> ribosomas 70S están en _.ibrio dinámico respecto de las subunidades 50S

.S La iniciación de la síntesis proreí;zica no es una _,_:n de los ribosomas intactos, la asumen las subuni:s independientes, las cuales se reasodan durante 3Cción de la iniciación. En la se resu- =:ciclo de las subunidades ribosómicas durante ~tesis proteínica de las bacterias. :.a iniciación tiene lugar en una secuencia es.Jl localizada en el RN Am denominada sitio e unión con e l ribo soma, que es una secuencia -~de bases que precede a la región codifi cadora -~e la Fig. 8. 1). Las su b unidades grande y peque-: asocian en el sitio de unión con el ribosoma, · !ormar un ribosoma intacLO, medlame tma ren en dos pasos: • El rcconodrniemo del RNAm ocurre cuando se une una subunidad pequeña para formar un complejo de iniciación en el siúo de unión con el ribosoma. • Una subunidad grande se une al complejo para formar un ribosoma completo. -.-.~nque la subunidad 30S está involucrada en :iadón, no es susceptible de asumir por sí mis> reacdoncs que unen el RNA.m con el RNAt, ~ cual se necesitan proteínas adicionales deladas fa ctores de iniciación (IF, initiation "5), los cuales se encuentran sólo en las sub: 1es 305 y se liberan cuando éstas se asocian con unidades 50S para formar los ribosomas 70S.

Este comportamiento djstingue a los factores de iniciación de las proteínas estructurales del ribosoma. Los factores de iniciadón panicipan únicamente en la formación del complejo de iniciadón, no forman parte de los ribosomas 70S y no desempeñan rúnguna función en las etapas de elongación. En la se re~umen las etapas de la iniciación.

.........

Factores de iniciación

J

: Subunldades : 30S con : factores de

--+~

Subunidades separadas

•....

Banco de : rlbosomas • libres :

I'"'' II--------,

.

Á

......

Iniciación

Elongación

Terminación

La iniciación requiere de subunidades ribosómicas libres. Cuando los ribosomas son liberados en la terminación, la subunidad 305 se une a factores de iniciación y se disocia para generar subunidades libres. Cuando las subunidades se reasocian para formar un ribosoma funcional en la iniciación, liberan a tos factores.

1 La subunidad 30S se une al RNAm \f·J \f• 7

2 EIIF·2 acarrea al ANAl al sitio P \f·.?

l,,.;'·' 1/-l!'H..

....,

3 Los lF son liberados y se adhiere la unidad SOS

los factores de iniciación estabilizan a las subunidades 30$ libres y unen al RNAt iniciador con el complejo 305-RNAm.

a... la iniciación en las bacterias requiere de subunidades 30$ y de factores accesorios

15 7

Banco de Subunidades ribosomas 70S libres Equilibrio dinámico

__..,.

.__

l

""',;

La subunidad 30S con eiiF-3 puede unirse al RNAm, a diferencia de la subunidad SOS -.......,~

El IF-3 debe ser liberado antes de que la subunidad SOS pueda unirse

1

~ •• ••

La iniciación requiere de subunidades 305 que portan IF-3. Las bacterias utilizan tres factores de iniciación, denominados IF-1, IF-2 e IF-3, que el RNAm y el RNAt necesitan para entrar al complejo de iniciación: • El IF-3 permite que las subunidadcs 30S se unan específicamente a los sitios de iniciación del RNAm. • El TF-2 se une a un RNAt iniciador especial y controla su entrada al ribosoma. • El IF- 1 se une a las subunidades 30S sólo como pane del complejo de iniciación completo. Se une al sitio A y evita que entre el aminoacil-RNAt. Su localización también puede impedir que la subunidad 30S se una a la subunidad 50S. EllF-3 tiene múltiples funciones; primeramente es necesario para estabilizar a las subunidadcs 30S (libres); después las habilita para que se unan al RN/Vn y, como parte del complejo 30S-RNAm, inspecdona la exaclitud del reconocimiento del primer aminoacilRNAt (véase la sección 8.6, El uso del fMet-RNAtr es controlado por el IF-2 y por el ribosoma). La primera función del IF- 3 es controlar el equilibrio entre Jos estados ribosómicos. como se muestra en la . Este factor de iniciación se une a las subunidades 30S libres que son liberadas del banco de ribosomas 70S; su presencia evita que la subunidad 30S vuelva a asociarse con la subunidad SOS. La reacción entre el IF-3 y la subunidad 30S es esLcquiométrica: una molécula de IF-3 se une a cada subunidad. La cantidad de IF· 3 es relativamente escasa. por lo tanto. su disponibilidad determina eJ número de subunidades 30S libres.

158

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

El IF-3 se une a la superficie de la subunida 30S cerca del sitio A. Hay una superposición sign1ficativa entre las bases del RNAr L6S protegido pC1· el lf- 3 y las protegidas por la unión de ia subunidad 50S, lo cual sugiere que evita físicamente unión de las subunidades. de modo que el IF-3 s compona como un factor ami-asociativo que hac que una subunidad 30S permanezca en el banco d_ subunidades libres. La segunda función del IF-3 es controlar la capacidad de las subunidades 30S para unirse al RNAn Las subunidades pequeñas deben tener IF-3 par: formar complejos de iniciadón con el RNAm, fact1 · que debe ser liberado del complejo 30S-RNAm par. permitir que se una la subunidad 50S; una vez · · berado, inmediatamente se recicla a l en contrar otr_ subunidad 30S. EllF-2 tiene una actividad GTPasa dependjen:: de ribosomas, pues fomenta la hidrólisis de GTP e· presencia de ribosomas. liberando la energía alm.;· cenada en el enlace de alta energía . E l GTP es hidP !izado cuando se une la subunidad 50S para gener2 un ribosoma completo. La división del GTP podr estar implicada en el cambio de conformación d ribosoma. de modo que las subunidades unidas seatransformadas e n un ribosoma 70S activo.

111

Un RNAt iniciador especial empieza la cadena polipeptidica

Conceptos principales • La síntesis proteínica empieza con una metionina usualmente codificada por el tri plete AUG. • Los diferentes RNAt de metionina están implicados en la iniciación y la elongación. • El RNAt iniciador tiene características estructurales únicas que lo distinguen del resto de los RNAt. El grupo NHl de la metionina unida al RNAt iniciador bacteriano está formilado. La síntesis de todas las proteínas empieza con el xr mo aminoácido, la metionina. La señal para inió: una cadena polipeptídica es un codón de iniciado especial que marca el principio del marco de lectu;dicho codón de inidación suele ser el triple[e Al: : aunque en las bacterias también se utilizan los e dones GUG o UUG. Et codón AUG representa a la metionina, arr noácido que puede ser transportado por dos tiP' de RNAt. uno utilizado para la iniciación y el O!:'" para el reconocimiento de los codones AUG duran· la elongación.

En las bacterias y los organelos eucarióticos, el iniciador transporta una metionina formilada :n su grupo amino y poder formar una molécu := de N-fo rmil-metio n ii-RNAt, conocido como tL'lAtte1 _ El nombre del aminoacii-RNAt generalLente se abrevia como fMet-RNAt,. El RNAt iniciador adquiere a su aminoácid o odificado en una reacción de dos etapas, primero =carga con e l aminoácido para generar Met-RNAr1 posteriormente, la reacción de formilación ilus~da en la bloquea al grupo NH2 libre. -.Jnquc el grupo aminoáddo bloqueado evitará que iniciador participe en la elongación de la cade l no interfiere con la capacidad para iniciar una ·oteína. Este HNAt se miliza sólo para la iniciación, re:wce a los codones AUG o GUG (en ocasiones, a l _.,.J G). Dicho reconocimiento no es tan bueno en 11bos casos, la extensión de la Lniriación dJsm.inuye roximadamente a la mitad cuando el codón AUG remplazado por el GUG y nuevamente a la mirad ..::~ndo se utiliza el codón UUG. La especie responsable del reconocimiento de ~ codones AUG en loca lizaciones internas es el ~..'JAtmMel, el cual responde únicamente a los eones AUG internos. ¿Qué características distinguen al fMet-RNAt 1 ctador del Mer-RNAtm utilizado en la elongadón? ;unos rasgos característicos de la secuencia del _·At son importantes, como se resume en la , pues son necesarias para evitar que el inidador ..J utilizado en la elongación, mientras que otras m1iten su funcionamiento en la iniciación: • La formiladón no es estrictamente necesaria porque el Met·HNAr1 no formilado puede funcionar como iniciador, pero incrementa la el1ciencia con la cual es utilizado porque es una de las características reconocidas por e l TF-2 que se une a l RNAl iniciador. • Las bases que se enfrentan una a otra en la ú ltima posición del ta llo, a las cuales se conecta el aminoáddo, están apareadas e n todos los RNA t. excepto en el HNAt1Me•. Las mutadones que crean un par de bases en esta posición del RNAtte• le permiten actuar en la elongación, de modo que su ausencia es importante para evitar que el RNAtt•• sea utilizado en la elongadón; también es necesario para la reacción de la formilación. • En el RNAtrM•• hay una serie exclusiva de tres pares G-C en el tallo que precede al lazo que contiene al anticodón, los cuales son necesarios para permitir que el fMet-RNAr, se Lnsene directamente en e l sitio P. ~.XAl

El N-formil-metionil-RNAt (fMet-RNAt,) iniciador es generado por la formilación del metionil-RNAt utilizando al formil-tetrahidrofolato como cofactor.

Aminoácido formllado

Sin apareamrento de bases

e G

e

Necesario pata la íonnifación

G

G G

.e;

Gs "CGAG GCÚC

3 pares de bases G-C

El fMet- RNAt, tiene características únicas que lo distinguen como RNAt iniciador. En las bacterias y en las mitOcondrias, el resi duo formüo localizado en la rnetionina in iciadora es eliminado por una enzima desformilasa especifica para generar un grupo NH 2 terminal normaL Si la metionina resulta ser el aminoácido terminal N de la prmdna, este paso será el único necesario. Más o menos en la mitad de las proteínas, la merionina localizada en el extremo es eliminada por una aminopeptidasa, la cual crea una terminación nueva de~ (origina lmente el segundo aminoácido incorporado en la cadena). Cuando ambos pasos son necesarios, son secuendales. Las reacciones de eliminación son bastante rápidas, probablemente cuando la cadena polipeptídica naciente ha alcanzado u na longitud de 15 aminoácidos.

8 ; Un RNAt iniciador especial empieza la cadena polipeptídica

159

El uso del fMet-RNAtF es controlado por el IF-2 y por el ribosoma Concepto principal • EL IF-2 se une al fMet-RNAt1 iniciador y le permite entrar al sitio P parcial de la subunidad 30S.

El significado de los codones AUG y GUG depende de su contexto. Cuando AUG se utiliza para la iníciaci6n. se lee como formil -metionina. pero en la región codificadora represema a la metionina. Por oLra parte. el significado del codón GUG depende aún más de su localización, de modo que cuando se presenta como primer codón, mediame la reacción de iniciación se lee como formil-metionina, pero si está dentro de tm gen, es lefdo por el Val-RNAt, uno de los miembros regulares del conjunto del RNAL, para proporcionar valtna conforme Jo exija el código genético. ¿Cómo se interpreta el con texto de los codones AUG y GUG? En la se Uustra el papel decisivo del ribosoma cuando actúa en conjumo con los factores accesorios.

IF-2

!Mel

' os

Sólo el fMet-RNAt1 entra al sitio P parcial de la subunidad unida al RNAm

1M el

Sólo aa-RNAt entra al sitio A en el ribosoma 70S ~ completo ~

EF-Tu

aa

•'

.

Sólo el fMet-RNAt 1 puede ser utilizado por las

subumdades 30S para la iniciación; los otros aminoacil-RNAt (aa-RNAt) deben ser utilizados para la elongación por los ribosomas 70S.

160

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

En un complejo de iniciación, sólo La subunidac pequeña está unida al RNA y el codón de iniciaciór se encuemra en la parte de l sitio P que porra 1<. subunidad pequeña. El único ami.noacil-RNAr que puede formar parte del complejo de inidación <'S e iniciador, el cua l tiene la propiedad única de pode· entrar directamente al sirio P parcial para reconoce: a su codón. Cuando la subunidad grande se une al complejo, los sitios parciales de unión al RNAt se convierten en los sitios intactos P y A. El fMer -RNAt1 ocupe el süio P y e l sitio A está disponible para la enrradz del aminoacii-RNAt complementario del segund codón del gen. El primer enlace peptídico se [orm.; entre el RNAt iniciador y el siguiente aminoacil· RNAt. La in iciación prevalece si un codón AUG ( GUG) está dentro de un sitio de unión con el ribosoma porque sólo e l RNM iniciador puede entra· al sitio P parcial generado cuando la subunidad 30~ se une de novo al RNAm. Subsecuentemente pre· domina la lectura interna, cuando los codones so .. hallados por un ribosoma que sigue traduciendo u: RNAm, ya que sólo tos aminoacil-RNAL normalepueden emrar al sitio A (complero). Los factores accesorios son muy importante para controlar el uso de los aminoadl-R..a"!At, todos s relacionan con el ribosoma por la unión a un facto accesorio. El factor u tilizado en la iníciadón es IF-.:. (véase la sección 8.4, La iniciación en las bacteria requiere de subunidades 30S y de factOres accescrios) y el factor correspondiente péU:a la elongaciót es EF-Tu (véase la sección 8 .lO, El factor de elongación Tu carga al aminoacii-RNAt en el sitio A). EliF-2 coloca al RNAt iniciador en el sitio P, al formar un comp lejo espeáficamenre con el EMetRNAt,, asegu ra que sólo e l RNAt iniciador, y ning uno de los aminoacil-RNAt norma les, participe er la reacción de iniciación. Por el contrario, e l EF- Tt. que coloca los aminoacii-RNAt en el sitio A, no pue· den unirse a l fMc t-RNAtv cuyo uso, por lo tamo,~ excluido de la elongación. El IF-3 se encarga de realizar una verificació adicional de la exactiwd, por la cual se estabiliza unión del RNAt iniciador merced a la detección dtapareamiemo correctO de bases con la segunda y:.:. tercera base del codón de iniciación AUG. En la se detalla la serie de event< por medio de los cuales ellF-2 coloca al fMet-RNA ini ciador en el sitio P. El lF-2, unido al GTP se relaciona con el sitio P de la subunidad 30S. En es•. punto, dicha subunidad porta a todos los faCLor:: de iniciación. El fMet-RNAt 1 se une allF-2 en ' subunidad 30S y posteriormente el IF-2 transfier el RNAt a l sitio parcial P.

IF-1

IF-3 Comple1o 30S-RNAm ""\.;

Umón del nbosoma con el soho de 1nic•ació11 del RNAm

-./

l

Adk:oo de nucleasa para digerir todo el RNAm no protegido

IF-2

El IF2-GTP se une al compleío

"-' Se une el ANAl iniciador

Fragmento a•slado del RNAm protegido

l

fMet

l

l

Determinación de la secuencia AACAGGAGGAUUACCCC

___

.._

Se une la subunidad SOS y los IF1 . 2 y 3 son liberados

¡,.UCGAAGCAA... del RNAm protegido

Llder

JRegión codificadora 1

Shine·Dalgarno <10 bases en flujo ascendente desde eiAUG

en el centro del tragmento protegido

IMet

•.. •

~

IF-1 IF-2 IF-3 GDP P,

~

/

El IF-2 es necesario para unir al fMet-RNAt, con --otejo 305-RNAm. Después de la unión de la subunidad ::xlos tos IF son liberados y el GTP es dividido.

La iniciación implica el aparea miento de bases entre el RNAm y el RNAr ' ""ap:os principales

-- sitio de iniciación del RNAm bacteriano está ·: ·11ado por el codón de iniciación AUG precedido de -- espacio de -10 bases que contiene el hexámero de : :.ipurina Shine-Datgarno. · ~NAr de la subunidad ribosómica 305 bacteriana - -"e una secuencia complementaria que se aparea con .= ;ecuencia 5hine-Dalgarno durante la iniciación. ~:"iAm

contiene numerosos tripleres AUG, " se reconoce al codón de iniciación como :edor del punto de inicio de la traducción? :ios del RNAm en los cuales se inicia la síme- teínica pueden ser identificados por la unión osoma y el RNAm en condiciones en que se ea la elongación. Posteriormente, el ribosormanece en el sitio de iniciación. Cuando se _a la ribonucleasa al complejo de inidación -cado, LOdas las regiones del RNAm ajenas al ma son degradadas, pero las que están múdas ~tán protegidas, corno !le ilustra en la -Os fragmentos protegidos pueden ser recupey caracterizados.

Todas las reg1ones de iniciación tienen dos elementos de consenso

Los sitios de unión con el ribosoma del RNAm pueden ser recuperados de los complejos de iniciación; incluyen la secuencia de flujo ascendente Shine-Dalgarno y el codón de iniciación.

Las secuencias de iniciación protegidas por los ribosomas bacterianos tienen una longitud de -30 bases. Los sitios de unión al ribosoma de distintos RKAm bacterianos muestran dos características comunes: • El codón de iniciación AUG (o, con menos frecuencia, los codones GUG y UUG) siempre forma panc de la secuencia protegida. • En un espacio de diez bases de Oujo ascendente a partir del AUG hay una secuencia que corresponde total o parcialmente a l hexámero . 5' . .. A G G A G G ... 3' A este fragmento de polipurina se le conoce como

secuencia Shine-Dalgarno, y es complementaria de una secuencia muy conservada que se localiza cerca del extremo 3' del RNAr 165. (La extensión de la complementariedad es diferente entre las moléculas de RNAm y puede extenderse desde una secuenda fundamental rormada por cuatro bases GAGG, a una secuencia de nueve bases que se extiende más allá del hexámero.) Escrito de forma inversa, la secuenda del RNAr es el hexámero: 3' ... u e e u e e ... 5' ¿Se aparea la secuencia Shine-Dalgarno con su cornplemcmo del RNAr durante la unión ribosoma-RNAm? Las mLICaciones de ambas partes de esta reacción demuestran su importancia en la ioi-

8.7 La iniciación implica el apareamiento de bases entre el RNAm y el RNAr

161

ciación. Las mutaciones puntuales de la secuencia Shine-Dalgarno pueden impedir la traducción de un RNAm. Además, la introducción de mutaciones en la secuencia complementaria del RNA r es pcr" judicial para la célula y cambia el patrón de síntesis proteínica. La confi.rmación decisiva de la reacción de apareamiento de bases es que una mutación en la secuencia Shine-Dalgarno de un RNAm puede ser suprimida por una muradón compensadora en el RNAr que restaure el apareamiento de bases. La secuencia que se encuentra en el extremo 3' del RNAr se conserva entre procariotas y eucarlotas, con la diferencia de que en todas las eucarioLas tiene lugar la deleción de la secuencia de cinco bases CCUCC que es el complemento principal de la secuencia Shíne-Da!garno. No parece ha ber apareamiento de bases entre el RNAm y el RNAr 185 eucarióticos. Ésta es una diferencia significativa eo el mecanismo de iniciación. En las bacterias, una subun idad 305 se une directamente con
Iniciación

Iniciación

1

1

Primera región codlfi~adora

Segunda región cpdificadora

la iniciación ocurre de manera independiente en cada cistrón de un RNAm policistrónico. Cuando la región intercístrónica es más larga que la extensión del ribosoma, la disociación en el sitio de terminación es seguida por otra reiniciación independiente en el siguiente cistrón.

162

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

Cuando termina l.a síntesis de la primera proteína los ribosomas abandonan el RNAm y se disocian er subunidades, y a continuación, debe ensamblarseun ribosoma n uevo en la siguiente región codificadora para empeza r a traducir el siguiente cistrón. En algunas moléculas de RNAm bacteriano, !
111

Las subunidades pequeñas buscan sitios de iniciación en el RNAm eucariótico

Conceptos ¡)rincipales • Las subunidades ribosómicas 405 se unen al extremo 5' del RNAm y exploran al RNAm hasta que llegan a un sitio de iniciación. • Un sitfo de iniciación eucariótko está formado por una secuencia de 10 nucleótidos que incluye un codón AUG, • Las subunidades ri bosómicas 60S se unen al complejo en el sitio de iniciación.

La iniciación de la síntesis proteínica en el citopla.s· ma eucariótico es sjmilar al proceso observado e:. las bacterias, sin embargo, difiere el orden de l o. eventos y el número de factores accesorios es mayo: En la inidación, algunas de las diferencias están relacionadas co n una diferencia en la manera en que las subunidadcs 305 bacterianas y 40S eucariótic.? encuentran a sus sitios de unión en el RNAm pan iniciar la sfntcsis p roteínica. En las eucariotas, la subunidades pequeñas primero reconocen el extremo 5' del RNAm y posteriormente se trasladan al s-'tio de iniciación, donde se unen a subunidades grandes. (En lasprocariotas, las subunidades pequeñas _ unen directamente con el sitio de iniciación.) Virtualmente todos los RNAm eucari6tica son monocistrónicos, no obstante, cada RNAm e: sustancialmente más largo de lo necesario para C\' · dificar sólo a su proteína . La longitud del RNAr promedio del citoplasma eucariótico es de l 000 ~ 2 000 bases, tiene un casquete metilado en el e1

~:no

5' y porta un poli(A) de 100 a 200 bases en extremo 3'. El líder 5' oo traducido es relativamente cor~ ormalmeme de <1 00 bases. La longitud de la ~1ón codificadora depende del tamaño de la pro- ~a. El remolque 3' no traducido a menudo es -~ante largo, y en ocasiones llega a tener hasta :lOO bases. La primera característica en ser reconocida du--¡e la traducción de un RNAm eucariótico es el ->4Uete metilado que marca el extremo 5'. Los -:-n<;ajeros cuyos casquetes han sido eliminados no .raducen ctidcntemenre in vitro. La unión de las unidades 405 con el RNAm requiere de numes .factores de iniciación, incluidas proteínas que _._ nacen la estructura del casquete. La modificación del extremo 5' ocurre en casi _ 15 los RNA.m celulares o víricos y es esencial para 'raducción en el ci10plasma cucariótico (aunque =n los organelos). La única excepción a esta regla .algunos RNAro víricos (como en los poliovirus), cuales carecen de casquete; sólo estOs RNAm :os excepciona les pueden ser traducidos in vitro - "asquetes. Utilizan una ruta alterna que elude -ecesidad del casquete. Algunos virus toman ventaja de esta diferencia. 'llecdón por poliovirus inhibe la traducción de ~~Am hospedadores al interferir con las proas de unión con el casquete necesarias para la _..ición de los RNAm celulares, pero que son su.uas para el RNAm carente de casquete de los virus. 5e ha analizado el proceso de iniciadón consi;..'ldo que el sitio de unión con el ribosoma siem ~s tá disponible, pero esta disponibilidad puede bstaculi7.ada por la formación de una estructura ndaria. Bl reconocimiento del RNAm requiere - .tmerosos faclüres adicion ales; una pan e im-ame de su fun ción es eliminar cualqu ier esu·ucsecundaria del RNAm (véase la Fig. 8.20). =o ocasiones, el codón de iniciación AUG se en_aa entre las primeras 40 bases del extremo 5' -=~'\Am, de manera q\le el casquete y el codón . .: t>Stán en el intervalo de uni ón con el ribosoma. :>srante, en muchos RNAm el casquete y el co"\UG están más lejos, en casos extremos, separa4Sta por l 000 ba~es, pero el casquete continúa • necesario para que se forme un complejo es~n el codón de iniciación . ¿Cómo puede valerse .som a de dos sitios tan distantes? =.:~ la se ilustra el modelo de "rasque supone que la subunidad 405 reconoce :ro el casquete 5' y posteriormente "migra• a ·.;u del RNAm. El rastreo desde el extremo 5' proceso lineal. Cuando las subunidades 405 t'an la región líder, pueden deshacer horquillas

de estructura secundaria con estabilidades de hasta - 30 kcal, pero las horquillas de mayor estabilidad obstaculizan o evitan la migración. La migración cesa cuando la subunidad 40S se encuentra con el codón de iniciación AUG. En general, aunque no siempre, el primer triplete AUG que se encuentre será el codón de iniciadón, aunque por sí mismo no es suficiente como para interrumpir la migración; se reconoce eficientemente como codón de iniciación sólo cuando se encuentra en el contexto adecuado. Los determinantes más importantes del contexto son las bases que ocupan las posiciones -4 y+ l. Un codón de iniciación puede ser identificado en la secuencia NNNPuNNAUGG. La presenda de una purina (A o G) tres bases antes del cod6n AUG, y laG que viene inmed iatamente después de él IJLieden influir en la eficiencia de la tradu cción hasta por lO veces. Cuando la secuencia líder es larga, el exLremo 5' puede ser reconocido por subunidades 405 adicionales antes de que la primera haya aban· donado el sitio de iniciación, creando una cola de subunidades que proceden a lo largo del líder. h acia el sitio de iniciación. Probablemente sea verdad que el codón de iniciación es el primer triplete AUG en ser encontrado en los RNAm más eficientemente traducidos. ¿Qué sucede, sin embargo, cuando hay un triplete AUG en la región no traducida 5'? Hay dos mecanismos de escape posibles para un ribosoma que empieza a

_._.,~/'V'V'.r...GCC~CCA ~ G

~quete

rnetilado

Silio de unión / con el ribosorna

La sub unidad pequena se une al casquete rnetllado

""·-~ /~~ GCCAGCCAU~G 2 La subunldad peque na rnlgra al sitio de unión

3 Si elllder es largo, las subunidades pueden formar una cola

L(JS ri bosomas eucarióticos migran del extremo S' del RNAm al sitio de unión con el ribosoma, el cual incluye

un codón de iniciación AUG.

3.& Las subunidades pequeñas buscan sitios de iniciación en el RNAm eucariótico

163

rastrear desde e l extremo 5'. El más común consisre en que la exploración presenta fugas, en otras palabras, un ribosoma puede pasar por alto un codón AUG que no sea de iniciación debido a que n o se en cuentra en el contexto conecro. En casos poco frecuentes en que el ribosoma sí reconoce al AUG, puede iniciarse la traducción, pero terminará antes del codón de iniciación apropiado, después de lo cual reanuda la exploración. Una gran pane de los eventos de iniciación eucarióticos implican el rastreo desde el casquete 5', sin embargo, hay un medio de inid ación alterno utilizado especialmente por ciertos RNA víricos, en el cual una subunidad 4-0S se asocia directamente con un sitio interno denominado IRES (intern.al ribosome entry site) (q ue elude por completo cualquier codón AU G que se e ncuentre en la región 5' no traducida). Hay pocas secuencia homólogas entre los elementos de los lRES conocidos; con base en su irncracción con la subunidad 405 es posible distinguir tres tipos: • Un ti po de IRES incluye el codón de i niciación AUG en su frontera de flujo ascendente. la sub unidad 405 se une directamente a él utilizando un subconjumo de los mismos factores necesarios para la iniciación en los extremos 5'. • Otro está localizado incluso a l 00 nucleótidos del AUG en flujo ascendente, lo cual implica una subunidad 40S que migre, también en este caso quizá por un mecanismo de rastreo. • Un tipo excepciona l de lRES del virus de la hepatitis C puede unirse a la subunidad 405 de forma directa, sin necesidad de factores de iniciación. El orden de los eventos es diferente del de la iniciación de todas las eucarióticas. Después de la unión 40S-RNAm, se une un complejo q ue contiene factore s iniciadores y RNA t iniciador. El empleo de 1RES es especialmente importante en la infección por picornavirus, en la cual se descubrió por primera vez, debido a que el virus inhibe la síntesis proteínica del hospedador, destruye las estructuras de los casquetes e inhibe los factores de iniciación que los unen (véase la sección 8.9, Las eucariotas utilizan un complejo formado por numerosos factores de iniciación). f..a unión se estabiliza en el süio de iniciadón. Cuando a la subunidad 40$ se le une una subunidad 60$, el ribosoma intacto se localiza en el sitio identificado por el análisis de protccdón_ Una subunidad 405 protege a una región de hasta 60 bases; cuando las subunidades 60S se unen al complejo, la región protegida se contrae a aproximadamente la misma longitud de 30 a 40 bases que se observa en las procariotas. 164

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

1111 Las eucariotas utilizan un complejo formado por numerosos factores de iniciación Conceptos principales • Los factores de iniciación son necesarios en todas las etapas de ésta, incluida la unión del RNAt iniciador, la unión de las subunidades 405 al RNAm, el desplazamiento a lo largo del RNAm y la unión de la subunidad 605. • El RNAt iniciador eucariótico es un Met-RNAt diferente del utilizado en la elongación, pero la metionina no está formilada. El eiF2 une al Met-RNAt, iniciador con el GTP y el complejo se une a la subunidad 405 antes de que se asocie con et RNAm .

En las e ucariotas, la iniciación tiene las mismas características generales que en las bacterias, pues usan un codón de iniciación específico y un RNAt iniciador. Para la iniciación, el citoplasma eucariótico utiliza el codón AUG como iniciador. El RNAt iniciador. denominado RN At,M~•. es una especie distinta, pero su metionina no se formila, así que enu-e los MetRNAt. la diferencia radica únicamente en la porción de RNAt, donde el Met-RNAt, es utilizado para la iniciación y el Met-RNAtm para la elongación. El RNAtttt iniciador de las levaduras tiene por lo menos dos características únicas, posee una estructura terciaria inusual y se modifica por fosforiladón en la posición 2' de la ribosa, en la base 64 (si se evita esta modificación, el iniciador puede ser utilizado eo la elongación). Así pues, el principio de una distinción entre el Met-RNAt iniciador y el utilizado en el proceso de elongación se conserva en las eucariotas. pero su base estructural es diferente a la de las bacterias (para comparar, véase la Fig. 8.13) . las célu las eucari óticas tienen más factores iniciadores que las bacterias, la lista actual incluye 12, directa o indirectamente necesarios para la iniciación, los cuales reciben su nombre de forma similar a las bacterias, en ocasiones por analogía con los factores bacterianos; se les asigna el prefijo ''e" para indicar su origen cucariótico. Participan en rodas las etapas del proceso, enrre otras: • formación de un complejo de inidadón con el extremo S' del RNAm; • formación de un com plejo con el Met-RNA~; • unión del complejo RNAm-factor con el complejo Met-RNAt,-factor; • capacitación del ribosoma para la exploración del RNAm del extremo 5' al primer codón AUG;

~mplejo43S

El eiF4F es un heterotrlmero fonmado por eiF4G, protefna de andamiaje eiF4E, une al casquete metilo 5' eiF4A, hellcasa que se desenrolla hacia la estructura 5'

siF2, eiF3, .1et-RNAt¡

Complejo de unión casquete + mANA ;;tF4A, 8, E y G

3'

eiF4G, une otros dos factores eiF48, estimula a la helicasa eiF4A PABP, se une al poU(A) 3'

::1 complejo 43S ~e

une al extremo

5' del RNAm

9 complejo 48S se forma en el codón ;e iniciación e1F2, stF3, eiF1, 1A. e1F4A, 8, F

El heterotrímero elF4F se une al extremo 5' del RNAm y también a más facto res.

El eiF-2 está formado por subunidades

......

Algunos factores de iniciación se unen a La sub-

:=:l ribosómica 405 para formar el complejo 435, en tanto -:s 5e unen al RNAm. Cuando el complejo 435 se une al RNAm, -:a al codón de iniciación y forma el complejo 485.

• detección de la unión del RNAt iniciador con el codón AUG en el sitio de iniciación, y • mediación en la unión de la subunidad 60S. se resumen las etapas de iniEn la .:.ón, además de que se muestran los factores de _,1dón implicados en cada etapa: el eiF2 y el eiF3 nena la subunidad ribosómica 40S; el elF4A, el --:3 y el eiF4F, al RNAm, y el eiFl y el eiFlA, al ;'leja sub unidad ribosómica-RNAm. ::n la se observa el grupo de factores 5e unen al exL remo 5' del RNAm. El factOr eiF4F :: complejo proteínico que contiene tres de los :es de iniciación, aunque no está daro si antes -.:llrse al RNAm se ensambla como complejo, o -· subunidades individuales se agregan separa·eme para formar el complejo en el RNAm. In! la subunidad de unión con el casquete eiF4E, _Jcasa elF4A y la subunidad de "andamiaje" - -.:i. Después que el eiF4E se une al casquete, .::4A desenrolla cualquier estructura secunda- ~e haya en las primeras 15 bases del RNAm. _.ergía necesaria para desenrollar la estructura ene de la hidrólisis de ATP. El desenrollado =::or de la estructura a lo largo del RNAm lo ;:. cabo el ciF4A aunado a otro [actor, el elF4B. -=--dón principal del e1F4G es ligar otros campo:;, del complejo de iniciación. _a subunidad eiF4E es un centro de regulación - .!ctividad se incrementa por Iosforilación, la

eiF-28

.-.~ GD~TP

...~

El eiF2B genera la forma activa del eiF2

Mel Complejo temarfo

'~ ~

En la iniciación eucariótica, el eiF-2 forma un complejo terminal con el Met-RNAt1• El complejo ternario se une a las subunidades 405 libres, las cuales se unen al extremo 5' del RNAm. Después en la reacción, el GTP es hidrolizado cuando el eJF-2 es liberado en forma de eiF2-GDP. El eiF-28 regenera la forma activa.

cual es desencadenada por estímulos que acentúan la síntesis proteínica y revenida por estímulos que la reprimen. La subunidad eiF4F tiene una actividad cinasa que !osíorila al eiF4E. La disponibilidad del eiF4E también es controlada por proteú1as que se unen a él (llamadas 4E-BPl, -2 y -3) para impedir que funcione en la iniciación. La subunidad eiF4G también constituye una diana para la degradación durante la infección por picornavirus, como parte de la destrucción de la capacidad para iniciar en las estructuras de los casquetes 5' (véase la sección 8.8, Las subunidades pequeñas buscan sitios de iniciación en el RNAm eucariótico) . La presencia de poli (A) en el extremo 3' de un RNAm esLimula la formación de un complejo de

8.9 Las eucañotas utilizan un complejo formado por numerosos factores de iniciación

165

El eiF3 mantiene en forma libre a las subunidades 408 El eiF2 une al Met-RNAt con la subunidad 40S

Met ~~~ .$3$

El eiF2 es una GTPasa El eiF2B es el factor de intercambio

2.,~

~

2 GDP -

2 GTP

®

Los facto res de iniciación unen al Met-RNAt iniciador con la subunidad 405 para formar un complejo 435.

Posteriormente, en la reacción, el GTP es hidrolizado cuado el eiF-2 es liberado en forma de eiF2-G DP. El eiF-2B regenera la forma activa.

Interacciones posibles: el eiF4G se une al eiF3, el RNAm une al e1F4G, al eiF3 y a la subunidad 40S

Las interacciones que involucran a los factores de iniciación adquieren importancia cuando el RNAm se une al complejo 43$.

El eiF1 y el eiF1A activan la exploración

-'! El eiFS induce la hidrólisis de GTP por el eiF2

-

Complejo 48S

1

El eiF2 y el e1F3 son líberados El e1F5B media la unión • de la subunidad 60S .,.~

El eiF1 y el eiFlA ayudan al complejo de iniciación 435 a explorar el RNAm hasta que llega a un codón AUG. El eiF2 hidroliza a su GTP para permitir su liberación junto con el eiF3. El eiFSB media la unión 60$-40$.

iniciación en el extremo 5', para lo cual es necesaria la proteína de unión al poli(A) (Pablp en las leva duras). La Pab 1p se une a la proteína de andamiaje elF4G, fenómeno que implica que el RNAm se organizará de forma circular siempre y cuando el efFG esté unido con los extremos 3' y 5' sujetos a este complejo (véase la Fig. 8.20). La importancia de la formación de este lazo cerrado no es obvia, aunque podría tener muchos efectos, por ejemplo: • estimular la iniciación de la traducción; 166

CAPÍTU LO 8 Síntesis proteínica

• p romover la reiniciación de los ribosomas de manera que cuando terminan en el extremo 3', las subunidades liberadas ya se encuentran cerca del extremo 5'. • estabilizar el RNAm contra la degradación, ! • permitir que los factores que se unen al extremo 3' regulen la iniciación de la traducción. La subu nidad eiF2 es el factor clave en la unió!' del Met-RNAt;; se trata de una proteína monomérica de unión con el GTP típica, la cual se activa cuando se une al GTP y se desactiva al un.irse co1~ el difosfato de guanosina (GDP; guanine diphosphate). En la se muestra que el complejo eJF2-GTP se une al Met-,RNAt;, producto que suele denominarse complejo ternario (debido a sus u-e~ componentes, el F2, GTP y Met-RNAtJ En la J se observa que el complejo ternario ubica al Met-RNAt¡ sobre la subunidad 40$, ICl cual genera el complejo de iniciación 43$. La reacción es independiente de la presencia de RNAm. Dehecho, el Met-RNAt iniciador debe estar presente para que la subunid~d 40$ se una al RNAm. Uno de los facto res de este complejo es el eiF3, necesaü0 para mantener a las subun idades 40$ en estado de disociación. El eiF3 es un factor muy grande, formado por 8 a 1O subunidades. El siguiente paso consiste en la unión del complejo 43.$ con el extremo 5' del RNAm. En la l se muestra que las interacciones impli cadas eu esta etapa no están completamente definidas, pero probablemente involucren a elF4 y eiF3, asl como al RNAm y a la subunidad 40$. La subunidad e(F4G se une al efF3 para permitir que la subunidad ribosómica 40$ se una al eiF4F, y por lo tanto. sea reclu tada en el complejo. En efecto, la [unción del eiF4F es colocar al elF4G de manera que pueda atraer a la subunidad rihosómica pequeña. Cuando la subunidad pequeña se ha unido ai RNAm, migra (habitualmente) al primer codónAUG, evento que requiere de gasto de energía en forma de ATP, con ayuda de los factores elFl y elFl A. En la se observa que la sub-unidad pequeña se detiene cuan do llega al sitio de iniciación, formando un complejo 48S. La unión de las subu oidades 60S con el complejo de iniciación no ocurre hasta que el eiF2 y el eiF3 han sido liberados de dicho complejo por mediación del e!F5, de modo que e l e1F2 hidroliza a su GTP. La reacción ocu rre en la subunidad ribosómica pequeña e impUca que el RNAt iniciador esté apareado con el codón de iniciación AUG. Todos los factores restantes probablemente sean liberados cuando se forma el ribosoma completo 80S. Por último, el factor eiF5B pe¡;mite que la subunidad 60S se una con el complejo y forme un ribosoma intacto. listo para iniciar la elongación. La

:.JOunidad cTFSB tiene una secuencia similar a la -=l faaor procariótico IF2. el cual tiene una función 'lliJar en la hidrólisis del GTP (además de participar - la unión del RNAt iniciador). Una vez que Jos faaores han sido liberados, pue-_a asociarse con el RNAr inidador y las su bunidades - .osórnicas en otro ciclo de iniciación. La subunidad :!=2 ha hidrolizado a su GTP, y como resultado, debe . _5enerarse la forma activa, Jo cual se logra por me_, de ouo factor, el eiF2B. que desplaza al GDP para _e pueda ser remplazado por un GTP. La subunidad elF2 constituye un objetivo para - :egulación. Muchas cinasas reguladoras acrúan _ la subunidad a del eiF2. La fosforilación evita ~e

el eJF2B regenere la forma activa, evento que

~ ) ···... ..················¡ ""'·' ..... .••..... """ Ts ··.•.. .. ...... . .. . .. ~~ .~: ~· .·.. .... ._.

Tu·GTP

~

•• ••

Tu-Ts

Comple~•~1

GDP•.t.,.. ~

·.. -;

ternario •

,., Tu-GDP

...

~ita

la acción del eiF2B a un ciclo de iniciación y, :lo tamo, inhibe la síntesis proteínica. ....=a El aa-RNAt entra al sitio A de la subunidad 30S

El factor de elongación Tu carga al aminoacil-RNAt en el sitio A

El extremo CCA se desplaza al interior del sitio A de la subunldad 50S

El EF-Tu-GTP coloca al aminoacil-RNAt en el ribosoma y posteriormente es liberado en forma de EF-Tu-GOP. El EF-Ts es necesario para mediar el remplazo de GOP por GTP. La reacción consume GTP y libera GOP. El único aminoacil-RNAt que no puede ser reconocido por el EF-TU-GTP es el fMet-RNAt1, cuya incapacidad para unirse evita que resoonda a los codones internos AUG o GUG.

: C..."''ceptos principales El EF-Tu es una proteína G monomérica cuya forma activa (unida al GTP) se une at aminoacil-RNAt. El complejo EF-Tu-GTP-aminoacil-RNAt se une al sitio A ribosómico.

-.a vez formado el ribosoma completo en el codón tniciación, la etapa está Usra para un cido en el _:J el aminoacil-RNAt entra al sitio A de un ribo-na cuyo sitio P está ocupado por peptidii-RNAt. ~~quier aminoacil-RNAt, excepto el iniciador, in- .:'5a al sitio A. entrada mediada por un factor de •ngación (EF-Tu en las bacterias). El proceso es lilar en las euca.riotas; el EF-Tu es una proteína ~~-conservada en las bacterias y en las m.itocon..>,5. y es homólogo a su contraparte eucariótica. ~gua! que su contraparte en la iniciación (IF-2 ). :=F-Tu se asocia con el ribosoma sólo en el proceso =ntrada del arninoacil-RNAt, y una vez en su lu-- abandona al ribosoma para funcionar de nuevo :. otro aminoacil-RNAt, de manera que exhibe ~adón y disociación cíclica del ribosoma, una . ?aerística distintiva de los factores accesorios. ~a ruta de entrada del aminoadl-RNAt al sirio - e ilustra en la . El EF-Tu porta una _; :üna. El factor es una proteína G monoméri:-.Jya actividad es controlada por el estado de la _:;:.ina: • En presencia de GTP, el factor se encuentra en su estado activo. • Cuando el GTP es hidrolizado a GDP, el factor se desactiva.

• La aclividad se restaura cuando el GDP es remplazado por GTP. El complejo binario formado por EF-Tu-GTP se une al aminoacil-RNAt para formar un complejo ternario constituido por aminoacil-RNAt-EF-TuGTP, e l cual se une sólo con el sitio A de Jos ribosomas cuyos sitios P ya están ocupados por un peptidil- RN At. Esra es reacción es crítica para asegurar que el arrunoacil-RNAt y el peptidil-RNAt estén correctamente posicionados para la formación del enlace peptídico. El aminoaci l-RNAr es cargado en el sitio A en dos etapas; primero, el extremo anticodón se une con el sitio A de la subunidad 305, y posteriorme nte, el reconocimiento codón-anticodón desencadena un cambio en la conformación del ribosoma, fenómeno que estabiliza la unión del RNAt y provoca que elEF-Tu hidrolice a su GTP. El extremo CCA del RNAt ahora entra al sitio A de la subunidad 505 y es liberado el complejo binario EF-Tu-GDP. Esta forma de EF-Tu está desactivada y no se une al aminoadlRNAt de forma efectiva. Otro factor, el EF-Ts, media la regeneración de la forma utilizada, EF-Tu-GDP aEF-Tu-GTP. Primero, el EF-Ts desplaza al GDP del Ef-Tu para formar, así, el factor combinado EF-Tu-EF-Ts. que a su vez será desplazado por el GTP. para reconstituir el EF-TuGTP. El complejo binario activo se une al aminoacilRNAt y el EF-Ts liberado puede ser redclado.

8.10 El factor de elongación Tu carga al aminoacil-RNAt en el sitio A

167

Hay -70 000 moléculas de EF-Tu por bacteria (-5% de l total de las proteínas de la bacteria), cifra

que se aproxima al número de moléculas de aminoacil-RNAt. Esto implica que la mayor parte de los aminoacil-RNAr tiendan a presemarse en complejos ternarios. Hay sólo - 1O 000 moléculas de EF-Ts por célula (más o menos el mismo número de ribosomas). La cinética de la interacción entre EF-Tu y EF-Ts sugiere que el complejo EF-Tu-EF-Ts existe sólo transiLoriamente, de manera que el EF-Tu se convierte muy rápidamente en la 'forma unida a GTP y después en un complejo ternario. La función del GTP en el complejo ternario ha sido estudiada sustimyéndolo con un análogo que no pueda ser hidrolizado. Et compuesto GMP-PCP tiene un puente metilénico en vez del oxígeno que se liga a los fosfatos ~ y y del GTP. En presencia de GMP-PCP puede formarse un complejo ternario que une el aminoacil-RNAt con e l ribosoma, pero no puede formarse el enlace pepLídico, de manera que se necesira GTP para que el aminoacil-RNAt se una al sitio A; la hidrólisis no es necesaria hasta después. La kirromicina e s un antibiótico que inhibe la función del EF-Tu. Cuando este último se une a la kirromicina, sigue siendo susceptible de unir e l aminoacil-RNAt con e. pero el complejo EF-TuGDP no puede liberarse del cromosoma. su presencia continua evita la formación del enlace peptídico entre el peptidil-RNAt y el aminoacil-RNAt. de tal forma que el ribosoma se queda "atascado" en el RNAm, frenando la síntesis proteínica . Este efecto de la kirromicina demuestra que la inhibición de uno de los pasos de la síntesis proteínica bloquea el siguiente porque la presencia continua del EF-Tu impide que el extremo am.inoacilo del

Cadena peptfdica, J t!_-6o

~\

·===~HN=~ ~ =

La formación del enlace peptidico se debe a la reacción que ocurre entre el polipéptido del peptídíl-RNAt en el sitio P y el aminoácido del aminoacii-RNAt en el sitio A.

168

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

aminoacil-RNAt entre al sitio A de la subunidad 50S (véase la Fig. 8 .31), de modo que para que el ribosoma lleve a cabo la formación del enlace peptídico. es necesaria la liberación del complejo EF-Tu-GDP. El mismo principio se observa en otras etapas de la símesis proteínica: una reacción debe terminar de forma adecuada antes de que pueda tener lugar la siguiente. La imeracción con EF- Tu también desempeña una función en el control de calidad. Los aminoacilRNAt son innoducidos en el sitio A sin saber si sus amicodones corresponderán con el codón. La hidió!isis del .EF-Tu-GTP es relalivamente lenta¡ el tiempo que necesita un aminoacil-RNAt para disociarse del sitio A es mayor del necesario, por lo tanto, lamayor parte de las especies incorrectas son eliminadas en esta etapa. La liberación del EF-Tu -GDP después de la hidrólisis también es lema, así que cualquier aminoadl-RNAL incorrecto, sobreviviente, puede disociarse en esta etapa. El principio básico es que las reacciones que involucran a 1 EF- Tu ocurren con la lemirud suficiente como para permitir que los RNAt incorrectos se disocien antes de que queden atrapados en la síntesis proteínica. En las eucariotas, el factor erf es el responsable de acarrear el anunoacil-RNAt al ribosoma, también en una reacción que implica la división de un enlace de aira energía del GTP, que igual que su homólogo procariótico (EF-Tu), es una proteína abundante. Después de la hidrólisis del GTP, la forma activa es regenerada por el factOr eEFl~y. contraparte del EF-Ts.

La cadena polipeptídica se transfiere al ami noacil-RNAt Conceptos principales • La subunidad 50S tiene actividad peptidi l transferasa. • La ca.dena poUpeptídica naciente se transfiere del peptidii-RNAt del sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A. • La síntesis de enlaces peptídicos genera RNAt desacilado en el sitio P y peptidil-RNAt en el sitio A.

El ribosoma se mantiene en posición m ientras la cadena polípeptíd.ica se a larga al transferir el polipéprido adherido a l RNAt en el sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A. La reacción se ilustra en la . La actividad responsable de la síntesis del enlace peptídico se llama peptidil transferasa. La naturalez.a de la reacción de trans[erencia es revelada por la capacidad del antibiótico puromicina, asemeja a un am inoácido adherido a la adenosina terminal del RNAt. para jnhibir la síntesis proteínica. En la se muestra que dicho antibiótico tiene un N en vez del O que une un

noácido al RNAt. y es tratado por el ribosoma ·o si fuera un aminoacU-RNAt entrante. después = 'cual el polipéptido adherido al peptidil-RNAt .:-ansferido al grupo NHl de la puromicina. La porción de puromicina no está anclada al A del ribosoma, por lo que de éste es überado el lucro poüpeptidil -puromidna. Esta terminadón :natura de la síntesis proteínica es la causa de la ón letal del anlibiótico. la peptidil transferasa es una función de la subiad ribosómica grande (SOS o 60S). La reacdón ; esencadena cuando el EF-Tu libera el exrremo .noacilo de su RNAt, que después se traslada a 5itio cercano al extremo del peptidil-RNJ\t cuya - ·;idad peptidi! transferasa asegura esendalmente ransJerencia rápida de la cadena pepríclica al arniacil-RNAt. El RNAr y las proteínas de la subuni50S son necesarias para dicha actividad, pero la .1Hsis es una propiedad del .RNA ribosómico de la anidad SOS (véase la sección 8.19, El RNAr 23$ -.e actividad peptidil transfcrasa).

aminoacil-RNAt

Aminoácido

Puromicina

La puromicina imita al aminoacil-RNAt porque - -:mejante a un aminoácido aromático ligado a una porción _:¡¡·-base.

liD

La translocación mueve al ribosoma

Concepto!> principales • La translocación ribosómica desplaza al RNAm tres bases a lo largo del ribosoma. • La transloccción lleva al RNAt desac1lado al interior del sitio E y al peptidil-RNAt al interior del sitio P. además de vaciar el sitio A. • El modelo del estado híbrido propone que La translocación ocurre en dos etapas, en las cuales la subunidad 505 se mueve respecto de la subunidad 305, y posteriormente ésta se desplaza a lo largo del RNAm para restaurar la conformación original.

El ciclo de adición de aminoácidos a la cadena polipeptídica creciente culmina con la tran slocación , cuando el ribosoma avanza tres nucleótjdos a lo largo del RNAm. En la se observa que la transJocadón expele al RNAt descargado del sitio P para que pueda emrar el nuevo pepticlil-RNAt, de modo que el ribosoma tiene un sitio A vaáo listO para la entrada del aminoacil-RNAt correspondiente al siguiente codón. Como se muestra en la figura, en las bacterias, el RNAt descargado es transferido del sjrio P al E (del cual es expelido hacia el citOplasma). En las eucariotas se expulsa düectameme al citosoL Los sitios A y P se extienden a ambos lados, hasta abarcar la subunidad grande y la pequeña; el sitio E (en Las bacterias) se locaUza principalmente en la subunidad 50S, pero tiene algunos contactos en la 30S. Casi todas las ideas en torno a la translocación se guían por el modelo de estado híbrido, el cual propone que tiene dos etapas. En la se muestra que primero hay un cambio de la subunidad 50S respecro de la 30S, segu ido de un segundo cambio que tlene lugar cuando la subun idad se mueve a lo largo del RNAm para restaurar la conformación original. La base de este modelo fue la observación de que el patrón de contactos del RNAt con el ribosoma (medidos por la impresión química de las huelJas) cambia en dos etapas. Cuando se agrega puromicina a un ribosoma que tiene un RNAt am1noacilado en el ~itio P, los contactos del Rl"'Al en la subunidad SOS cambian del sitio P al sido E, pero los contactos con la subunidad 30S no cambian, lo cual sugiere que la subunidad 50S se ha despla?ado a un estado de postransferencia. si bien la subunidad 30S no ha cambiado. La interpretación de estos resultados sugiere que los extremos aminoacilo de los RNAt {loca lizados en la subtmidad 50S) se mueven primero a sitios nuevos (mientras que los extremos anti codón permanecen unidos a sus a nticodones en 8.12 La translocación mueve al ribosoma

169

$rlioE

S•ho A SitioP

La subunidad SOS se desplaza respecto de la subunidad 305 Pretranslocación: El peptidii-RNAI se encuentra en el sitio P:

elemlooaoii·ANAI e~l'" al slllor

lf

El ANAl descargado sale a través del sitio E \

.J>.,' :!

\r._ "V\/

!

Postranslocación: El ANAl desacilado se mueve al sitio E; el peptidii-RNAI se desplaza al sitio P

Un ribosoma bacteriano tiene tres sitios de unión con el RNAt. El aminoacil-RNAt entra al sitio A de un ribosoma que tiene peptidil-RNAt en el sitio P. La síntesis del enlace peptídico desacila al RNAt del sitio P y genera peptidilRNAt en el sitio A. La translocación mueve al RNAt desacilado al interior del sitio E y desplaza al peptidil-RNAt al interior del sitio P.

la subunidad 305). En esta etapa, los RNAt están u nidos efectivamente a si ti os híbridos, formados por los silios 505E/30S P y 50SP/305 A. Después, el movimiento se extiende a las subunidades 305. de manera que la región de apareamiento anticodón-codón se encuentra en el sitio correcto. El medio más probable para crear el estado híbrido es el movimiento de una subunidad ribosómica respecto de la otra, de manera que la translocación efectivamente implica dos etapas y la restauración de la estructura normal del ribosoma sucede d u rante la segunda. El ribosoma enfrenta un dilema interesante en la translocación, pues tiene que romper muchos de sus contactos con el RNAt para permitir el movimiento, pero al mismo tiempo debe mantener el 170

CAPÍTULO 8 Sintesis protelnica

aa-ANAl entrante

Los modelos de translocación constan de dos etapas. Primero, en la formación del enlace peptídico, el extremo aminoacilo del RNAt localizado en el sitio Aes reubicado en el P. En la segunda etapa, el extremo anticodón del RNAt se traslada al sitio P.

aparcamiento entre el RNAr y el amicodón (rompiendo el aparearnienro del RNAr desacilado en el momento preciso). Una posibilidad es que el ribosoma cambie entre conformaciones alternas y discre tas. El cambio puede consistir en variaciones en el apareamiento de bases del RNA r. La precisión de la traducción depende de ciertas mutaciones que influyen en el aparcamiento alterno de las bases de las secuencias. La interpretación más probable es que el efecto es mediado por la estrechez de la unión de las conformaciones alternas con el RNAt.

E

Los factores de elongación se unen alternativamente al ribosoma

Conceptos principales • La translocación requiere del EF-G, cuya estructura es semejante a la del complejo aminoacii-RNAt-EF-Tu-GTP. • La unión de EF-Tu y de EF-G al ribosoma es mutuamente exclusiva. • La translocación requiere de la hidrólisis de GTP, la cual desencadena un cambio en la estructura del ribosoma.

_: uanslocaci6n requiere de GTP y de otro factor elongación, denominado EF-G, el cual es uno de .actores constituyentes mayoritarios de la célula, ::-s hay -J copia por ribosoma (20 000 moléculas -célula). Los ribosomas no pueden unirse al EF-Tu y al ---G simultáneamente, de modo que la síntesis .eínica sigue el ciclo ilustrado en la Figura 8.31, -::1 cual los factores se unen al ribosoma y se libede él alternativamente, por lo tanto, el complejo -~--:-u-GDP debe ser liberado antes de que el EF-G -=da unirse; después. el EF-G debe ser liberado .::s de que pueda unirse al complejo aminoacil-\t-EP-Tu-GTP. ¿La capacidad que Liene cada factor de elonga:: para excluir a otro se basa en un efecto alos-co sobre la conformación total del ribosoma o a competcnda directa por sirios de unión su ?uestos? En la se observa una simld extraordinaria entre las estructuras del com- ) t.ernario de aminoacil-RNAt-EF-Tu-GDP y el .:. - -G. La estructura de este último es similar a la -uctu ra global del EF-Tu unido al tallo aceptor aminoácido del aminoadl-RNAt de donde la -.·erura inmediata de que completan el mismo de unión (presumiblemente en las cercanías sitio A). La necesidad de cada factor de ser libeantes de que el otro pueda unirse, garantiza :: los eventos de la síntesis proteínica proceden ':lanera ordenada. Ambos factores de elongación son pmteínas .•oméricas de unión al GTP las que se activan jasa éste, pero están inactivas cuando se unen :::>P. Para la unión al ribosoma se necesita la for: ·aifosfatada para asegurar que cada factor tenga :eso al ribosoma sólo en compañía del GTP que .esita para cumplir con su función. El EF-G se nne al ribosoma para promover la .:ulocación y es liberado después del movimiento 1bosoma. El EF-G aún puede unirse al ribosoma ~· GMP-PCP es sustituido por GTP; por Jo tamo. ·a la unión es necesaria la presencia de guanina, que su hidrólisis no es absolutamente esencial ·:la translocación (si bien la rranslocadón es m u- más lenta sin la hidrólisis del GTP). La hidrólisis üTP es necesaria para liberar al EF-G. ~a necesidad de la liberación del EF-G se desnó por los efectos del ácido fusídico, antibiótico :-:oideo que "atascaN al ribosoma en ese estado .erior a la translocación {véase la ). P)resencia de ácido fusídico ocurre un ciclo de -·locación: el Ef-G se une al ribosoma, el GTP es ·olizado y el ribosoma se mueve tres nudeóridos. embargo, el ácido fusidico estabiliza el complejo soma -EF-G-GDP, de manera que el EF-G y el ? permanecen en el ribosoma en lugar de ser

Aminoacii·RNAt·EF·Tu·GTP

La estructura del complejo ternario aminoacilRNAt-EF-Tu-GTP (izquierda) es semejante a la del EF-G (derecha). La estructura conservada de los dominios del EF-Tu y del EF-G se encuentran en color rojo y verde; el RNAt y el dominio del EF-G semejante a él es púrpura. Imagen cortesía de Poul Nissen, University of Aarhua, Denmark.

Unión del aminoacii·RNAt EF-Tu-GTP· aminoacO·RNAt

Hidrólisis de GTP

Sfntesls del enlace pep!ldlco

Translocactón EF·G/GTP

Hidrólisis de GTP - - - -.... EF·G +GDP

la unión de los factores EF· Tu y EF-G se alterna conforme los ribosomas aceptan nuevos aminoacil-RNAt, forman los enlaces peptídicos y se transfieren a otra posición.

S.l3 Los factores de elongación se unen alternativamente al ribosoma

17 1

liberados, de modo que este úlrimo no puede unirse al aminoadi-RNAt y no se agregan más aminoácidos a la cadena. La translocación es una propiedad intrínseca del ribosoma que requiere de un cambio mayor en la estructura (véase la sección 8.17, Los ribosomas tienen numerosos centros acüvos), sin embargo, es activada por el EF-G aunado a la hidrólisis del GTP, que ocurre ames de la translocación y acelera el movimiento del ribosoma. El mecanismo más probable consiste en que la hidrólisis de GTP provoca un cambio en la estructura del EF-G, eJ cual a su vez (uerza un cambio en la estructura del ribosoma. En la translocación tiene lugar una reorientación del EF-G que, ames de ésta, se encuentra unido mediante las dos subunidades ribosómicas. Lamayor parte de sus contactos con la subunidad 305 depende de una región llamada dominio 4, que se insena en el sitio 1\ y que puede ser responsable de desplazar al RNAt. Después de la translocacion, el dominio 4 estará, por el contrario. orientado hada la subunidad 50S. La contraparte eucariólica del EF-G es la proteína eEf-2, la cual funciona de forma similar a una translocasa dependiente de la hidrólisis de GTP cuya acción también es inhibida por el ácido fusídico. Es posible aislar un complejo estable formado por eEF2 y GTP. en tamo que el complejo puede unirse a los ribosomas con la consiguiente hidrólisis de su GTP. Una reacción única del eEF2 es su susceptibilidad a la toxina diftérica, que utiliza dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD, nicotinamide admine dinucleotide) como cofactor para transferir una porción de ribosil-adenosina difosfato (ADPR. adenosine diphosphare ribosyl) al eEF2. El conjugado ADPR-eEF2 está inactivo en lo síntes.i.s proteínica . El sustra to al que se un e d icho conjugado es un aminoácido inusua l que se produce al mollificar u na histidina; es común al eEF2 de muchas especies. la ribosilación del ADP provoca los efectos leta les de la toxina d iftérica. La reacción es extremadamente efectiva, pues una sola molécula puede modificar suficiemes moléculas de eEF2 como para matar una célula.

La síntesis proteínica termina con tres codones Conceptos principales • los codones UAA (ocre), UAG (ámbar) y UGA terminan la síntesis proteínica. .. En las bacterias se utilizan muy a menudo con frecuencias relativas UAA>UGA>UAG.

172

CAPtTULO 8 Síntesis proteínica

Sólo 61 rrípletes son asignados a aminoácidos, o tros tres so n codones d e terminación (o codc. nes de parada) con los que concluye la sínte• proteínica cuyos nombres informales provienen la historia de su descubrimiento. Eltriplete UAG llamado codón ámbar, el UAA es el codón ocre y secuencia UGA suele denominarse codón ópalo. En un principio, las características de estos t:pletes se demostraron mediante un análisis genétL por el que se distinguieron dos tipos de mutacion.: puntuales: • La mutación puntual que modifica a un e dón de manera que represente a un am noácido difcrenre se denomina mutación protcíníCLJ del codón mutame y en la célu mutante sólo se produce la primera pane e la proteína. Este fenómeno tiende a suprim la función proteínica (dependiendo, por S1:. puesw, de qué tan lejos en la proteína se eTcuentre el sitio mutante). Un cambio de es:_ tipo se denomina mutación sin sentido. (En ocasiones, el término codón sin sentido : _ utiliza para describir a los tripletes de terminadó:La expre.~ión •sin sentido" es errónea, dado que k codones sí tienen signiticado, aunque perjudicial eun gen muta me. Un término más adecuado es "c(>dón de terminación''). En los genes secuenciados, uno de los codooe~ de terminación se ubica inmediatamente desput del codón que representa al aminoácido termina e de la secuencia de tipo silvestre. Las mutaciones in sentido muestran que cualquiera de los tres codones basta para termina r la síntesis proteínica er un gen. Las secuencias de los triple tes UAG, UAA: UGA son, por lo tanto, necesarias y ~uficientes par¿ terminar la sínlesis proteínica si ocurren de manerc natural al .final de un gen o son creadas por mutadón en una secuencia coclificadora. En los genes bacterianos, el triplere UAA es e codón de terminación más comúnmente utili7ado La secuencia UGA se utiliza con mayor frecuenci3 que la UAG, aunque parece haber más errores er: la lectura de la UGA. (Un error al leer un codón de terminadón, cuando el aminoacil-RNAt responde;: él equivocadamente, resulta en la cominuación de la síntesis proteínica hasta que se encuentra otrc codón de terminación .)

Los codones de terminación so n reconocidos por factores proteí ni eos :.:>nceptos principales • Los codones de terminación son reconocidos por factores de liberación de proteínas, no por moléculas de aminoacil-RNAt. • Las estructuras de los factores de liberación clase 1 son semejantes a las del aminoacil-RNAt-EF-Tu y del EF-G. los factores de liberación clase 1 responden a codones de terminación específicos e hidrolizan la ligadura oolipéptido-RNAt. los factores de liberación ctase 1 son asistidos por los 'actores de liberación clase 2 que dependen del GTP. tl mecanismo es similar en las bacterias (que tienen !los tipos de factores de liberación clase 1) y en las eucariotas (que tienen sólo un factor de liberación ;lase 1). ~n de

la traducción implica dos etapas. La reacción :. rminación tiene que ver con la liberación de la ~~na proteínica del último RNAL. en tanto que .•1cción de posterminación implica la liberación del - -\t y del RNAm y la disociación del ribosoma. ~inguno de los codones de terminación es re~enta nd o por un RNAt. funcionan de manera - diferente a los orros codones y son reconocidos =-.
Los faclores de liberación clase 1 son asislidos por los factores de liberación clase 2. que no son especificas de ningún codón. Los Jacrores clase 2 son proteínas de unión al GTP. En E coli. la función del fattor clase 2 es liberar al factor clase 1 del ribosoma. Aunque el mecanismo de terminación general es similar en las procariotas y las eucariotas. las interacciones emre los factores clase 1 y clase 2 presentan algunas diferencias. Los factores de clase l. RF 1 y RF2. identifican a los codones de terminación y activan el ribosoma para hidrolizar al peptidll-RNAt. La clivisión del polipéptido y el RNAl üene lugar mediante una reacción análoga a la transferencia usual del grupo peptidil. excepto que el aceptor es H 20 en vez de aminoacil-RNAl (véase la Fig. 8.34) En este punto. el Rfl o el RF2 es liberado del ribosoma por el factor clase 2 RF3, que está re ladonado con el EF-G. El RF3-GDP se une al ribosoma ames de que ocurra la reacdón de terminación y el GDP es remplazado por GTP. lo cual faculta al RF3 para contactar al centro GTPasa del ribosoma. donde provoca la liberación de los RFl 12 cuando se termina la cadena polipeptídica. El RF3 se asemeja a los dominios de unión del EF-Tu y del EF-G con el GTP, en tanto que el RFl y el RF2 son similares al dominjo lerminal C del EP-G, parecido al RNAt. Esto sugiere que los factores de iiberación utilizan el mismo sitio empleado por los factores de elongación. En la se ilustra la

EF-Tu

,,

,

.t , .1/t

, ,,

~'

, ,,

RNAt

EF-G

~mo ~

RF3

''

RFl /2

RRF

El mimetismo molecular permite que el complejo factor de elongación Tu-RNAt. el factor de translocación EF-G y los factores de liberación RF1/2-RF3 se unan al mismo sitio ribosómico. El RRF es el factor de reciclaje del ribosoma (véase la Fig. 8.35).

8.15 los codones de terminación son reconocidos por factores proteínicos

173

GGQ

Domlnio2 (extremo aminoacílo)

Dominio 1 (extremo anticodón) La estructura del factor de terminación eucariótico eRF1 imita a la del RNAt. El componente GGQ localizado en la punta del dominio 2 es esencial para hidrolizar a la cadena polipeptídica del RNAt. Imagen cortesía de David Barford, The Institute of Cancer Research.

Elongación

Terminación

Centro de transferencia del peptidilo

Centro de transferencia del peptidilo

Base:~

Base:

Sitie. p

A

CJ

cadena peptldica 1

H·N1

y---:1' '

Sil1oP

cadena peptldica

,

1

'i

1

dc'o ANAl

l

1

')

~:~-Rr-. ~.

1

H·C-R

j

R

,r ~o

ovLe' o

1

1

'

,

ANAl

cadena peptrdíca 1

H·N1

cadena peptfdica

H-C-R

e

o• , ,H 1

(

H

o 1

ANAl

1

1

,l ~

1

H·N1

H·C·A 1

o•e,,.,

o

RNAI

La transferencia y la terminación del péptido son reacciones similares en que una base del centro de transferencia del grupo peptidilo desencadena una reacción de transesterificación al atacar a un enlace N-H u 0- H, liberando al N o al O para que ataque la ligadura formada con el RNAt.

idea básica de que todos esws factores tiene la misma forma general y se unen al ribosoma de fo rma 174

CAPÍTULO 8 Slntesis proteínica

sucesiva en el mismo siüo (básicameme el sitio r. una región sobrepuesta a ésta). El raCLor eucariótico de liberadón clase 1 eRF 1, es una proteína individual que reconoc~ los tres codones de terminación cuya secuenda ~ está relacionada con la de los factores bacteria:Y puede terminar la síntesis proteínica in vitro ~ el facLOr clase 2, eRF2, aunque in vivo es esenc en las levaduras. La estru ctura del eRFl sigue· contexto familiar; en la se muestra q_ está formada por tres dominios que simulan la e tructura del RNAt. Un componente esencial de los u·es arninoádd GGQ se exhibe e11 la parte superior del dominio.::. Su pos ición en el sitio A corresponde a l.a Joca zación usual de un aminoácido en un aminoaC'. RNAt, lo cual lo posi.ciona para utilizar la glutam i~ (Q) para sustitu ir al am inoácido del aminoacil-Rl\.con una molécula de agua en la reacción de trar: ferencia del grupo peptid ilo. En la • compara la reacción de terminación con la de tran. ferencia pcptídica usual. La terminación transfie, un grupo hidroxilo del agua e hidroliza de mane: efectiva el enlace péptido-RNAt (véase la Fig. 8.~ para la descripción de cómo funciona el centro pe:tidil transferasa ). Las mutaciones en los genes RF reducen la ef ciencia de la terminación, como se observa por \...:: incremento de la capacidad para continuar la sí:-resis proteínica más allá del codón de terminacióc La expresión excesiva de RF 1 o de RF2 incremem.: la eficiencia de la terminación en los codones en Ir cuales actúa. lo cua l sugiere que la identificació. de éstos por uno u otro compite con los aminoacLRNAt que reconocen erróneamente a Jos codonede terminación. Los factores de liberación identiflcan sus secuencias diana de forma muy eficiente. La reacción de terminación implica la liberaciór del polipéptido completo, pero deja a un RNAt desacilado y al RNAm todavía asedados con el ribosoma En la se muestra que la disociación de lo componentes restantes (RNAt, RNAm y subunidades 30S y 50$) requiere del factor de reciclaje del r!bosoma (RRF, ribosome recyc/ingfactor). El RRP actúé con el EF·G en una reacdón que utiliza la hidrólisi5 de GTP. En cuanto a los otros factores implicados er la liberación, la estructura del RRF imita al RNAt excepto que carece de un componente equivalente de la región 3 ' de unión aJ aminoácido. Tambiér. se necesi1a IF-3 para cerrar el ciclo de cuando fue descubierto originalmeme y se propuso que ¡era ur:: factor de disociación! El RRF actúa sobre la subllnidad 50S y el IF-3 elimina el RNAt desadlado de la subunidad 30$. Obviamente, una vez que se han separado las subunidades, el IF-3 sigue siendo necesario para evitar que vuelvan a asocia1·se.

El RNA ribosómico abarca ambas subunidades ribosómicas 1

1. El RF libera a la protelna

2. El RRF entra al sitio A

(onceptos principales Cada RNAr tiene muchos dominios distintos que se croblan de manera independiente. Virtualmente todas las proteínas ribosómicas están en contacto con el RNAr. la mayor parte de los contactos entre las subunidades tibosómicas se realiza entre los RNAr 165 y 235.

l

l

RF

~

RRF

./X..;

3. El EF-G lransfiere al RAF

s tercios de la masa de los ribosomas bacterianos

án constiwidos por RNAr. El enfoque de análimás penetrante de la estructura secundaria de \!éculas grandes de RNA consiste en comparar -secuencias de los RNAr correspondientes en or.~ismos relacionados. Dichas regiones importantes : la estructura secundaria conservan la capacidad - interactuar por apareamiento de bases, de modo ~si se requ iere de un par de ellas, puede formarse -. _a misma posición relativa de cada RNAr. Este ~:odo ha permirido la creación de modelos dera~Jus del RNAr 165 y del RNAr 23$. Los principales RNAr pueden trazarse en una ;unura secundaria con numerosos dominios dis:ros. En el RNAr 16$, que forma cuatro dominios -:1erales, poco menos de la mitad de la secuencia =~enta apareamiento de bases (véase la Fig. 8.45), ianto que el RNAr 23S forma seis. Las regiones de t-le hélice individuales tienden a ser cortas (<8 bp); n frecuencia, las regiones dúplex no son perfectas :mtienen abultamientos de bases no apareadas. :se han trazado modelos comparables de Jos R.l~Ar .:ocondtiales (más conos y con menos dominios) y ~.os RNAr del citosol eucariótico (más largos y con .;s dominios) . La mayor longitud de Jos Rl'fAr eu·- 'ióticos se debe principalmente a la adquisición de ~Jendas que representan a dorninios adiciona les. _: ~mu ctura cristalina (o tridimensional) del ribo"'!la muestra que en cada subunidad, los dominios -· RNAm mayor se pliegan independientemente y -~pan un lugar discreto. Cuando las subunidades 30S se comparan con :ibosomas 70S se encuentran diferencias en la -""acídad del RNAr 165 para reaccionar con los ,.::!ues químicos: asimismo, hay diferencias entre jbosomas libres y loe; comprometidos en la sínre:-'roteínica. Los cambios de reactividad del RNAr - resentan cuando el RNAm está unido, cuando se dan las subunidades o cuando se ha incorporado R..'\At. Algunos cambios refleja n una interacción -_era del RNAr con el RNAm o el RNAt, mientras -=otros son provocados indirectamente por ca m
El RF (factor de liberación) termina la síntesis proteínica liberando a la proteína. El RRF (factor de reciclaje del ribosoma) libera al último RNAt y el EF-G libera RRF, provocando la disociación del ribosoma.

punto principal es la flexibilidad de la conformación del ribosoma durante la símesis proteínica. Una característica de la estructura primaria del RNAr son los residuos melilados . Hay -1 O grupos metilo en los RNAr 16$ (localizados principalmen te hacia el exnemo 3' de la molécula) y -20 en el Rl~Ar 23$. En las células de los mamíferos, el RNAr lBS y el 28$ portan 43 y 74 grupos metilo. respectivamente, de modo que -2% de los nucleótidos están merilados (aproximadamente tres veces la proporción de metilados en las bacterias). La subunidad ribosómica grande también con tiene una molécula de RNA 55 de unas 120 ba ses (en rodos Jos ribosomas. excepto en los de las mitocondrias). La secuencia del RNA 5S no es tan buen como la de las secuencias de los RNAr mayores. Todas las moléculas de RNA 55 exhiben una estrucLUra con intenso apareamiento de bases. En los ribosomas del citosol de las eucariotas está presente otro RNA pequeño en la subunidad grande, el RNA 5.85 . Su secuencia corresponde al extremo 5' del RNAr 23S procariótico. Algunas prorcínas ribosómicas se unen fuerte mente al RNAr aislado: otras no se unen al RNAr libre, pero pueden hacerlo después de la incorporación de otras proteínas, lo cual sugiere que la conformación del RNAr es importante para determinar S. ~ 6 Et RNA ribosómico abarca ambas subunidades ribosómicas

175

Surco rico en RNA

~ Plataforma Cabeza

Cuell() Cuerpo

La subunidad 305 tiene una cabeza separada del cuerpo por un cuello, con una plataforma protuberante.

Protuberancia central SS

Pedunculo

\

Hendidura

La subunidad 50S tiene una protuberancia central do nde se encuentra el RNAr 55, separada por una hendidura del pedúnculo formado por copias de la proteína L7.

La plataforma de la subunidad 305 embona en la hendidura de la subunidad 505 para fo rmar el ribosoma 70S.

La subunidad ribosómica 305 es una partícula ribonucleoproteínica. Las proteínas se muestran en color amarillo. Imagen cortesía de V. Ramakrishnan, Medical Research Council (UK).

si existen sitios de unión para algunas proteínas. Conforme se une cada una de éstas, introduce cam176

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

bios conformacionales en el RNAr que hacen posible la incorporación de más proteínas. En E. col virtualmente todas las proteínas ribosómicas 305 interactúa n (si bien en diferente medida) con el RNk l6S. Los sirios de unión localizados en las proteína: muesu·an una amplia variedad de características esLrucrurales que sugiere diferendas en los mecanismos de reconocimiento proteína-RNA. La estructura del ribosoma 70S es asimétrica En la se observa una representación esquemática de la estructura de la subunidad 30$, que se divide en cuatro regiones, cabeza, cuello, cuerpt~ y plataforma, y en la , una representación similar de la 50S, donde dos característica.; prominentes son la pron.1beranda central (donde se localiza el RNAr 55) y el pedúnculo (formado por múltiples copias de la proteína L7). En la se muestra que la plm:aforma de la subunidao pequeña encaja en la hendidura de la grande; entrt: ambas subunidades hay una cavidad que contiene algunos de los sitios importantes. La estructura de la subunidad 30S sigue la organización del RNAr 16S, en donde cada característica estru ctural corresponde a un dominio. El cuerpo está basado en el dom inio 5', la plataforma en e: central y la cabeza, en la región 3'. En la se muestra que la distribución de RNA y proteínas de la subunidad 30S es asimétrica . Una característica importante es que la plataforma de esta subunidad. que proporciona la interfase para la subunidad 50S. está compuesta casi por completo de RNA Sólo dos proteínas (una parte pequeil.a de la S7 y posiblemente de la Sl2} se localizan cerca de la interfase. es dedr, que la asociación y la disociación de las subu nidades ribosómicas deben depender de las in· Leracciones con el RNAr 16$. La asociación de la$ subunidades experimenta una mutación en un lazo de RNAr 16S (posición 719), localizado en la interfase de la subunidad, además de que por medio de experimentos de modificación/interferencia se ha demostrado que otros nucleótidos del RNAr 16S están involucrados. Este comportamiento respalda la idea de que el origen evolutivo dellibosoma pudo haber sido una parúcula formada por RNA y no por proteínas. La subunidad 50S presenta una distribución de componentes más uniforme que la 305, con varillas largas de RNA de doble cadena que entrecruzan la estructura. El RNA forma u na masa de bélices estrechamente empaquetadas. La superficie exterior consta principalmente de proteínas, con excepción del centro pepridil transferasa (véase la sección 8.19, El RNAr 23S tiene actividad peptidil transferasa). Casi todos los segmentos del RNAr 235 interactúan con las proteínas, si bien muchas de las proteínas carecen relativamente de estructura.

La unión de las subunidades en el ribosoma 70S 'llica contactos entre el RJ.\!Ar 16$ (muchos en la ~:-ión de la plataforma) y el 23$, así como algunas ·eracciones entre el RNA.J de cada subunidad con "'rotcínas de la otra, y pocos comactos proteína1!eína. En la se identifican los puntos ~ :ontacto de las estructuras del RNAr. En la se abre la estructura (imagínese la subunidad 5 rotada en direcdón contraria a las manecillas _ reloj y la 30$ en sentido contrario, en torno al =je la figura) para mostrar las localizaciones de los '1WS de contacto en la cara de cada subunidad.

70~

710 '

690

790,

,soo

780· 770'1

890 .. 900 1400·

,152Q

1410> -~~~ 14201 <._ 1430, - ::~g -880

89()-

,710

72fi"

RNAr 16S

Los ribosomas tienen numerosos centros activos i

:>o...,ceptos principales

Los puntos de contacto entre los RNAr están localizados en dos dominios de RNAr 16$ y en uno de RNAr 235. Reproducida de Yusupov, M. M. 2001. Science. 292: 883-896. © 2001 AAAS. Imagen cortesía de Harry Noller, University of California, Santa Cruz .

..as interacciones en que está implicado el RNAr son :lave para la función del ribosoma. ~ . ambiente de los sitios de unión al RNAt depende .ampliamente del RNAr.

::1ensaje básico que no debe olvidarse sobre el · ;oma es que se trata de una estructura coopea que depende de cambios en las relaciones en; us sitios activos durante la síntesis proteínica . .hos sitios no son regiones discretas y pequeñas - o los centros activos de las enzimas, son regioextensas cuya construcción y cuyas activida~ueden depender tamo del RNAr como de las .eínas ribosómicas. Las estructuras cristalinas .:1s subunidades individuales y de Jos ribosomas -~rianos proporcionan una buena impresión de : ganización general y subrayan la función del -J. La estructura más reciente, a una resolución ::.5 Á, identifica claramente la ubicación de los -.:y de los sitios funcionales, ele modo que ahora ' Sible dar cuenta de muchas funciones ribosó~ ' en función de su estructura. ..as funciones ribosómicas giran en torno a la in_:a ón con los RNAt. En la se mueStra - _:->soma 70S con las posiciones de los RNAt en -:és sitios de unión, en los sitios A y P están casi z..~los; todos se alinean con sus lazos anticodón .os al RNAm en el surco de la subunjdad 30$ y ~o de cada RNAt se une a la subun.idad SOS. El _eme que rodea a cada RNAt es proporcionado ::palmente por el RNAr. En cada sitio, el RNAr 3 cta al RNAt en partes de la estructura univercote conservadas. s,cmpre ha sido un gran enigma cómo dos -:voluminosos pueden acomodarse uno al lado :ro en codones adyacentes de lectura. la es...ra cristalina muestra un doblez de 45° en el

Los contactos entre las subunidades ribosómicas son principalmente de RNA (en color púrpura}. Los contactos que implican proteínas se identifican con color amarillo. Las dos subunidades se han rotado para alejar una de otra y mostrar las caras en que tienen lugar Los contactos; desde un plano perpendicular a la pantalla, la subunidad 505 ha sido girada 90° en dirección contraria a las manecillas del reloj, en tanto que la 305 ha sido rotada 90° en dirección de Las manecillas del reloj (aquí muestra al contrario de la orientación usual}. Imagen cortesía de Harry Noller, University of California, Santa Cruz.

RN/\m, entre los sitios P y A, que permite que los RNAL embonen, según se ve en la ampliación de la . Los RNAr de los sirios P y A se ubican en un ángulo de 26• respecro de ellos mismos, en sus anticodones. La aproximadón mayor entre las columnas vertebrales del RNAt ocurre en los extremos 3', donde convergen con una separación 5 Á (perpendicular al plano de la pantalla), lo cual permite que la cadena peptídica sea transferida del peptidilRNAt del sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A. Para que el EF-Tu hidrolice al GTP y sea liberado del ríbosoma, es necesario que el aminoacilRNAt sea insertado en el sitio A por el EF-Tu y que se aparé e con el codón (véase la sección 8.10, El factor de elongación Tu carga al aminoacil-RNAt en el sitio A). Para empezar. el EF-Tu coloca al aminoacil8.!} Los ribosomas tienen numerosos centros activos

177

El ribosoma 70S está formado por la subunidad 50S (blanco) y la 30S (púrpura), con tres moléculas de RNAt localizadas superficialmente: representadas con color amarillo en el sitio A, azul en el sitio P y verde en el E. Imagen cortesía de Harry Noller, Uníversity of California, Santa Cruz.

Las tres moléculas de RNAt tienen orientaciones distintas en el ribosoma. El RNAm gira entre los sitios P y A para permitir que los aminoacil-RNAt se unan a codones adyacentes. Imagen cortesía de Harry Noller, University of California, Santa Cruz.

RNAt en la subunidad pequeña, donde el anticodón se aparea con el codón. Es necesario que el RNAtse mueva para que penen·e totalmente en el sitio A, ruando su extremo 3' entra al centro peptidil transferasa en la subunidad grande. Hay diferentes modelos que explican cómo ocurre este proceso. Uno de ellos exige que el RNAt completo gire, de manera que el codo de la estructura en forma deL formada por los brazos D y T"PC entre en el ribosoma para que el brazo T"PC se aparée con el Rl'IAr. En otro se requiere que la estructura interna del Rl'iAt cambie y urilice el lazo anticodón como bisagra para que el resto del RNAt rote de una posición en la cual está apilado en el lado 3' del lazo anticodón, a una en que esté apilado en el lado 5' . Después de la rransi118

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

ción, el EF-Tu hidroliza al GTP para que proceda Ja síntesis proteínica. La rranslocación implica movimientos amplio$ en las posiciones de los R At en el ribosoma. E. extremo amicodón del RNAt se mueve -28 Á de. sitio A al P, y posteriormente otros 20 A del P al E Como resuhado del ángulo de cada RNA respecte del amicodón, el volumen del RNAt avanza distancias mucho más grandes: 40 Á del sitio A al P, y 55 del P al E, lo cual sugiere que la translocación exige: una importante reorganización de la estructura. Durante muchos años se pensó que la translocación podía ocurrir sólo en presencia del facto; EF-G, sin embargo, el antibiótico esparsomidna (que inhibe la actividad de la peptidil Lransferasa) )¡; desencadena. Esto sugiere que la energía necesaria para conducir la translocación de hecho es almacenada en el ribosoma después de que se ha formad o e l enlace peptídico. En general, el EF-G actúa en e. ribosoma para liberar esa energía y permitirle conducir la translocació n, no obstame La esparsomicina p uede tener la misma función. La esparsomicina inhibe la peptidiltransferasa al unirse al peptidil-Rl'\A: al bloquear su interacdón con e l aminoacii-RNAt Probablemente crea una conformadón semejanrt a la conformación postranslocación usual, que as~ vez, favorece el movimiemo del peptidil-RNAL Lr importante es que la translocadón es una propiedac intrínseca del ribosoma. El modelo de estados híbridos sugiere que la translocación puede suceder en dos etapas, con un.: unidad ribosómica desplazándose respecto de la otrc? para dar lugar a un a etapa intermedia en la cua. hay sitios de unión al RNAt híbridos (SOSE /305 P ~ SOSP/305 A) (véase la Fig. 8.29). La comparación de la estructura del ribosoma entre el estado previo y el posterior a la tra nslocación y de la conformación del RNAr 16$ entre las subunídades 30S libres y Jos ribosomas 70S, sugie re que la m.otilidad de la estructura es especia lmente obvia en las regiones dt la cab~za y de la plataforma de la subunidad 305. Una perspectiva interesante del modelo de estados híbridos proviene de que numerosas bases del RNAr implicadas en la asociación de las subunidadcs están cerca de bases involucradas en la interacción con el RNAt, fenómeno que sugiere que los sitim de unión con el RNAt están próximas a la interfa se entre las subunidades e implica que cienos cambios en la interacción entre éstas tengan reladón con e. movimiento del RNAt. Gran pane de la estructura del ribosoma es ocupada por sus centros activos. La perspectiva esquemática de los sitos ribosómicos de la muestra que constituyen unos dos tercios d<: la estructura ribosórnica. Un RNAt entra al sitio A es transferido por translocación al interior del P '

<eriormeme abandona el ribosoma (bacteriano) :avés del sitio E. Los ~itios A y P cubren las dos Jnidades ribo~ómicas; el RNAt se aparea con el ~en la subunidad 30S. sin embargo, la transfe.:ia del péptido sucede en la subunidad 50S. Los s p y A son adyacentes, lo que permite que la .Joca ción desplace al RNAt de un sitio al intedel otro. El sitio E está localizado cerca del sitio .>sición a medio camino hacia la superfide de .. bunidad 50S). El centro peptidil transferasa se J.i7.a en la subunidad SOS, cerca de los extremos 'loacilo de los RNAL de los sitios A y P (véase la .:!ón 8.18, El RNAr 16S desempeña una función ~.-a en la síntesis proteinica). :-odas las proteínas de unión al GTP que fun...m en la síntesis proteín ica (EF·Tu, EF·G, IF·2 · FI, -2 y -3) se unen al mismo silio de unión al 'T (en ocasiones !Jamado centro GTPasa), el cual - 1blem cme desencadena la hidrólisis de sus GTP. ~itio se encuentra en la base del ped únculo de la .midad grande, formada por proteínas L7 y L12 - ~s una modificación de Ll2 y tiene un grupo io en la terminal N). Además de esta región, _ 'llplejo formado por la proteína Lll con un _'":Tiento de 58 bases del M 1Ar 235 provee el sitio nión para algunos antibióticos que inciden en . _ ividad GTPasa, y si de hecho ninguna de estas _cruras ribosómicas posee actividad GTPasa, am•on necesarias para ello. La función del riboso.s activar la hidrólisis de GTP mediante factores os al sitio de unión con el factor. ....a unión inicial de las subunidades 30S con el -..m requiere de la proteína S 1, que posee una ~e afinidad por el ácido nudeico de cadena in Jual y es responsable del mantenimiento del o de cadena llnica en el RNAm unido a la sub_ad 30S. Esta acción es necesaria para evitar que ·_·Aro adquiera una coniormación de bases patea1adecuada para la traducción, La estruCLura de • •Le ína S l es demasiado a la rgada y se relaciona as proteínas S 18 y S2l; las tres constituyen un rtio involucrado en la unión inicial del R.~Am .mión del RNAt iniciador, lo cual ubica el sitio . .ión con el RNAm en las cercanías de la hendí: Je la sub unidad pequeña (véase la Fig. 8.3 ). El .;-mo 3' del RNAr, que se aparea con el sitio de ~dón del RNAm, se localiza en esta región. :_"'S factores de iniciación <;e unen a la misma "l del ribosoma. EllF-3 puede estar entrelazado ~-extremo 3' del RNAr, así como con numero· oteínas ribosómicas, incluidas las que proba~m e están implicadas en la unión del RNAm. "lción del JF-3 podría ser estabilizar la unión .:n-subunidad 30S; posteriormente sería desplaal un irse la subu nidad SOS.

Membrana SllloA Sitio p Silfo SS 1- Sitio de \ LSIL812 salida de DJOtemes

s,uoe -

~

~con el RNAñf S 1/S18/S21

l

1

.

i

~

Un:ón deiiF y el EF

RNAm

El ribosoma tiene numerosos centros activos y puede estar asociado con una membrana. ~l RNAm gir.a .al pasa! a través de los sitios P y A, que forman un angula. El s1 t10 Eesta más allá del P. El sitio oeptidil transferasa (no ilustrad_o) aba~ca las regiones superiores de los sitios P y A. Parte del s1tlo umdo al EF-Tu/G se encuentra en la base de los sitios Ay P.

la incorporació n del RNA SS a las subunidades SOS ensambladas in vitro depende de la capacidad de tres prmetnas, L5, L8 y l25, para fonnar un co mplejo estequiométrico con él. Dicho complejo puede unirse con eJ RNAr 235, a diferencia de los componentes aislados; se encuentra próximo a los sitios A y P. Una proteína naciente emerge a través del ribosoma. lejo~ de los sitios activos, en el interior de la reuión en la cual los ribosomas pueden ser adheri o dos a las membranas (véase el Capítulo JO, La localización de las proteínas). Una cadena polipeptídica emerge del ribosoma a través de un canal de salida que va del sitio peptidil tramferasa a la superficie de la subunidad SOS. El túnel está formado principalmente por RNAr. Es bastante angosto, ~de . de 1 a 2 nm, y tiene -JO nm de largo. El pohpepudo na cien te emerge del ribosoma a -1 S Á de distancia del sitio peptidil transferasa. En el túnel caben - 50 aminoácidos y probablemente constriñe a la cadena polipcptídica, de manera que no pueda plegarse hasta abandonar el domino de salida.

El RNAr 165 desempeña una función activa en la síntesis proteínica Concepto principal • El RNAr 165 desempeña un papel activo en las funciones de la subunidad 305, pues interactúa directamente con la subunidad SOS y con los anlicodones de las moléculas de RNAt localizadas en los sitios P y A.

Originalmente se pensaba que el ribosoma era una colección de proteínas con varias actividades catalí· ricas mantenidas juntas por interacciones proteína·

8.1E El RNAr 165 desempeña una función activa en la síntesis proteínica

179

-De precisión

DominioS'

Dominio menor 3'

11

Algunos sitios del RNAr 165 están protegidos de sondas químicas cuando las subunidades 50S se unen a las 30S o cuando el aminoacil-RNAt se une al sitio A. Otros son los sitios de mutaciones que afectan a la síntesis proteínica. los sitios de supresión TERM pueden afectar la terminación en algunos o muchos codones de terminación. Los bloques grandes coloreados indican los cuatro dominios del RNAt.

proteína y por unión al RNAr. Sin embargo, el descubrimiento de moléculas de RNA con actividades catalíticas (véase el Capítulo 26, Cone, empalme y procesamiento del RNA) sugiere inmediatamente que el RNAr puede tener una participación más activa en la función del1ibosoma. Ahora hay evidencias de que el RNAr jnteractúa con el RNAm o con el RNAt en todas las etapas de la traducción y que las proteínas son necesarias para mantener al RNAr en una estructura en la cual pueda realizar las funciones catalíticas. En numerosas interacciones están involucradas regiones específicas del RNAr: • El extremo 3' del RNAr interactúa directamente con el RN Am en la iniciación. • Regiones específicas del RNAr 16S interactúan directamente con las regiones anticodón de los RNAt en el sitio A y el P. De manera similar. el RNAr 23S interactúa con el extremo CCA del peptidjl-RNAten el sitio A y el P. 180

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

• La interacción de las subunidades implica interacciones entre los RNAr l6S y 235 (véase la sección 8.16, El RNA ribosómico abarca ambas subuoidades ribosómicas). Median te antibióticos que inhiben el proceso en ciertas etapas se ha obtenido mucha información acerca de cada paso de la síntesis proteínica bacteriana. La diana del antibiótico puede ser identificada por el componente en e l cual ocurren mutaciones resistentes. y si bien algunos antibióticos actúan sobre proteínas ribosómícas individuales, muchos inciden en el RNAr, lo cual sugiere que está involucrado en muchas de las funciones del ribosoma. si no es que en todas. Las funciones del RNAr se han investigado mediante dos tipos de métodos. Los estudios estructurales muestran que regiones especificas están localizadas en sitios importantes del1ibosoma y quelas modificaciones qulmicas de estas bases impider: funciones paniculares de los ribosomas. Por otra pane. las mutaciones identifican a bases del RNAr necesarias para funciones ribosómicas particulaxes. En la se resumen los sitios del RNAr l6S identificados por estos medios. Un indicio de la importancia del extremo 3' de' RNAr 16S es su susceptibilidad al agente letal co· licína E3 producida por algunas bacterias, la cua: divide a -50 nucleótidos del extremo 3' del RNAr 16S de E. co li. Esta división suprime por complete el inicio de la síntesis proteínica. Muchas funcione~ importantes necesitan la región dividida, como}¿ unión del factor IF- 3. el reconocimiento del RN'Am y la unión del RNAt. El extremo 3' del RNAr 16S participa directamente en la reacdón de inidadón por apareamiemt con la secuencia Shine-Dalgarno en el sitio de uniór: con el ribosoma del RNAm (véase la Fig. 8.16). Otra función directa del extremo 3' del RNAr 16S en la síntesis proteínica se demuestra por las propiedades de Jos mutames resistentes a la kasugamicina que carecen de ciertas modificaciones en el RNA: 16S, La kasugamicina bloquea la iniciación de la sfutesis proteínica. Los m uta mes resistentes del tipe ksgA carecen de la enzima melilasa que introduce' cuatro grupos metilo a adernnas adyacentes localizadas en un sitio cercano al extremo 3' del RNA: 16S. La metilación genera la secuencia altamente conservada G-ro. ~A-m26A. que se encuentra en e: RNAr pequeño de las eucariotas y las procarlotas La secuencia metilada se relaciona con la unión de las subunidades 30S y 50S, la cual a su vez esta vinculada con la retención deL RNAr iniciador eL el ribosoma completo. La kasugamicina induce le liberación del fMet-RNAlr de los ribosomas sensitivos (metilados), pero los ribosomas resistentes sor capaces de retener al inídador.

/ 885

890 '

G G G G A G '-

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GGGGAG e ue

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•

Interacción RNAm-RNAI El complejo codón-anticodón forma 3 pares de bases

........_

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ft'f '1

~~0/ ~

Durante la síntesis proteínica puede ocurrir un ':iloio en la conformación del RNAr 165.

Los cambios en la estructura del RNAr l6S ocucuando los ribosomas están implicados en la _-:tesis proteínica, como se observa por la protec-- n de bases particulares contra ataques químicos. - s sitios individuales se encuentran en algunos --upos concentrados en los dominios 3' menor y ..:;ntral. Aunque las localizaciones están dispersas -la secuencia lineal del RNAr 165, parece probable .e la posición de las bases involucradas en la mis.a función estén de hecho ubicadas en la estructura ==-daría, cerca una de la otra. Algunos de los cambios del RNAr 16S son in_ddos por la unión de las subunidades 50S, la del ---_-\m o la del RNAt. Dichos cambios indican que ~:>s eventos tienen relación con cambios en la con:-:nación del ribosoma que afectan la exposición e. RNAr, aunque no necesariamente indican la ~:ticipación directa del RNAr en estas funciones. -- la se muestra un cambio que ocurre -~ante la síntesis proteínica; implica un movimienocal para modificar la naturaleza de una secuen=dúplex cona. El RNAr 16$ tiene que ver con la función del - , A y del P, y cuando estos sitios están ocupa, ocurren cambios significativos en su estnlctu - Ciertas regiones distintas están protegidas por ~;--.¡At unido al sitio A (véase la Fig. 8.45). Una d lazo 530 (que también es el sitio de una mu"1Ón que impide la terminación en los codones -_.\, UAG y UGA). La otra es la región 1400 a 1500 :.:~ominada así porque las bases 1399 a 1492 y adeninas 1492-1493 son dos fragmentos de ca~...a única conectados por una horquilla larga). - _os los efectos de la unión del RNAt en RNAr 5 pueden ser producidos por el oligonucleótido ~do del tallo-lazo anticodón, de tal manera que ~::tión RNAt-subunidad 30S debe involucrar a ,; región. las adeninas que se encuentran en 1492 y --3 proporcionan un mecanismo para detectar --:piejos codón-anticodón apareados adecuada-~te. El principio de la interacción es que la es~n

La combinación apareada erróneamente tiene sólo dos pares de bases ausente

\

El apareamiento codón-anticodón respalda la interacción con las adeninas 1492 a 1493 del RNAr 165, si bien los apareamientos erróneos RNAt- RNAm no pueden interactuar.

truc[Ura de RNAr 165 responde a la estructura de los dos primeros pares de bases en el surco menor del dúplex formado por la interacción codón-anticodón. El cambio de la posición Nl de la base 1492 o de la 1493 en el RNAr impide la unión del RNAt con el sitio A. Sin embargo, las mutaciones en las posiciones 1492 y 1493 pueden ser suprimidas por la introducción de fluorina en la posición 2' de las bases correspondientes del RNAm (con lo cual se restablece la interacción). En la se muestra que el apareamiento entre el codón y el anticodón permite que el N 1 de cada aden.ina interactúe con el grupo OH-2' de la estructura principal del RNAm. Cuando entra un RNAt incorrectO al sitio A, la estructura del complejo codón-anticodón se distOrsiona y no puede tener lugar dicha interacción, que la asociación del RNAt con el sitio A. El RNAt localizado en el sitio P protege a una variedad de bases en posiciones dircreotes del RNAr 16S; muy probablemente las bases se encuentren cerca una de la otra en la estructura Lerciaria. De hecho, hay más contactos con el RNAL cuando se encuentra en el sitio P que cuando se encuentra en el A, situación que puede ser responsable de la mayor estabilidad del peptidil-RNAt respecto de la del ami-

8.18 EL RNAr 165 desempeña una función activa en la síntesis pro teínica

181

noacil-RNAt. Esto tiene sentido, p ues una vez que el RNAt ha llegado a l sitio P, el ribosoma ha decidido qu~ está correctamente unido, mientras que en el sirio A tiene lugar la evaluación de las uniones. La región 1400 puede entrelazarse ctirecrameme con el peptidil-RNAt, lo cual sugiere que esta región es un componente estructural del sitio P. La conclusión básica derivada de estos resultados es que el HNAr tiene numerosas interacciones con el RNAt y con el RN.Am y que estas interacciones se repiten cada ciclo de formación de enlaces peptídicos.

El RNAr 235 tiene actividad

peptidil transferasa Conc(•plo principal • La actividad peptidil transferasa reside exclusivamente en el RNAr 235. Los sitios implicados en las fundones delRNAr 235 no están tan bien identificadas como los del RNAr 165, sin embargo, se observa el mismo patrón general: las bases de ciertas posiciones influyen en funciones específicas. Las bases ubicadas en algunas posiciones del RN.Ar 23$ son afectadas por la conformación del sitio A o del P; en particular, los oligonudeóúdos derivados del CCA terminal 3' del R:--rAt protegen a un conjunto de bases del RNAr 235, esencialmente las mismas protegidas por el peptidii-RNAt, lo cuaJ sugiere que la imeracción principal del RNAr 235 con el peptidii -RNAt en el sitio P involucra al extremo 3' del RNAr. El RNAt establece comactos con el RNAr 235 tanto en e l sitio P como en el A. En el sitio P, la G2552 del RNAr 23$ se aparea con la C74 del peptid il -RNAt. Una m utación en laG del RNM evita la iJ1teracción con el HNAt. si bien d icha interacción es restablecida por una mutación compensadora en la e del extremo amino aceptar del R.!~AL En el sit io A, la G2553 del RNAr 235 se aparea con la C75 del aminoacii-RNAt. de modo que en ambos sitios de unión con el RNJ\t hay una función cercana del RNAr. Ciertamente, cuando se renga una perspectiva estructural más clara de la región, será posible entender los movimientos del RNAr entre los sitios A y P en cuanto a establecimiento y pérdida de contactos con el RNAr. Otro sitio que se une al RNAt es el E. localizado casi exclusivamente en la subuuidad 50S. Las bases afectadas por su conformación pueden ser identificadas en el RNAr 235. ¿Cuá l es la naturaleza del siüo de la subunidad 50S que proporciona la función peptidil transferasa? Primero se indicó la implicación del RNAr debido a 182

CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

que una región del RNAr 235 es el sitio de mutaciones que confiere resisrencia a los antibióticos qut inhiben a la peptidil transferasa. No se ha tenido éxito en una l arga búsqued.:: de proteínas ribosómicas que pOLencialmeme tengan actividad catalítica, aunque resultados recient<."_ sugieren que el RNA ribosómico de la subunida grande posee dicha actividad. La extracción de cas. todo el contenido proteínico de las subunidade~ 50S deja al RNAr 23S asociado en gran medida cor fragmentos de proteínas que represeman <5% dt la masa de las proteínas ribosómicas. Esta preparación retiene la actividad peptidil transferasa. Lr:· tratamientos que dai'ían al metabolis m o del RNn su primen la actividad ca Lalítica. A partir de estos resultados. e l RNAr 23S prc:parado por transcripción in vitro puede cata lizar l2 formación de un en lace peptídico entre el Ac-PheRNAt y el Phe-RN At. El rendimien to del AC -PhePhe es muy bajo, lo cual sugiere que e l RNAr 235 J'cqu icre de proteínas para funciona r con la máxima eficiencia. Sin embargo, debido a que e l RN Atiene la actividad catalítica básica, la función de la· proteínas debe ser indirecta, de modo que plieguer al RNAr de forma adecuada o para presentar a é los sustratos. Por otra parte, la reacción funciona aunque con menor efectividad, si los dominios deRNAr 235 son sintetizados separadamente y después se combinan. De hecho, el dominio V, que tiene al centro catalítico, presenta cierta actividad Esta última es abolida por mutaciones en la posiciór 2252 del domino V que yace en el sitio P. La cstructun:t cristalina de la subunidad 50S de las archaea muestra que el sitio peptidil Lransferas.: básicamente está formado por RN'Ar 23S. ;No ha' proteínas a una distancia de 18 Á del sitio activo e~ donde ocu rre la reacción de transfer encia entre e. pepcldii-RNAt y el aminoacíl-R NAt! La s(m csis de l en lace peptídico exigu e q ue e: grupo amino de un aminoácido a taque al gru,pc carboxilo de otro aminoácido. La catá lis is implica que un residuo básico acepte el átomo de hid rógeno liberado del grupo amino, como se m u estra en la . Si el RNAr es el catalizador, debt proporcionar dicho residuo, sin embargo no se sabe cómo sucede esto. Las purinas y las pirimidinas n c son básicas a pH fisiológico. Una base ampliamente conservada (eo la posición 2451 de E. coli) había sido implicada, pero ahora parece no tener las propic::dades adecuadas ni ser crucial para la actividad peptidil transferasa. Las proteínas unidas al RNAr 23S fuera de la región peptidil transferasa casi seguramente necesaria~ son que que el RNAr forme la est ructura apropiada in vivo. La idea de que este ültimo es el componente catalítico coincide con Jos resultados descritos en el

Peptidii·RNAt Centro de transferencia del pept~ 'dilo

H,

Base:

cadena peptidica

H·N'

~

H.C·R

' H-C-R

óa;;+)

dé'D

1

ANAl

~

1 f

RNAI cadena pepVdica

N:~-t'J H-C-R

H-C·R

Base

e

6

á b ' RNI\1

o' ..o

'

~

RNAt

cadena peptídioa

' H-N ' H-C·R

d

e' ~/rl 1

~ '

RNAt

H-C-R

o-c·o 1

RNAI

La formación de enlaces peotídicos requiere de en la cual se transfiere un átomo de H a

~.isis ácido-base · -~siduo básico.

- ímlo .26, Corte, empalme y procesamiento del -\, los cuales identifican las propiedades cataliticas - RNA involucradas en numerosas reacdones de ..::esamiento del RNA. además de que concuerda la n oción de que el ribosoma evolucionó a panir unciones originalmente posefdas por el RNA.

Las estructuras ribosómicas cambian cuando se unen las subunidades L_..,-¡ceptos principales cabeza de la subunidad 305 gira alrededor del cuello se forman los ribosomas completos. :1 sitio activo peptidil transferasa de la subunidad 505 :s más activo en los ribosomas completos que en las subunidades individuales SOS. _a interfase entre las subunidades SOS y 305 es muy rica en contactos disociables. _a

~ando

.:has evidencias indirectas sugieren que las es.luras de las subunidades individua les cambian - .ifica tivamente cuando se juntan para formar un

ribosoma completo. Las diferencias de susceptibili dad de los RNAr a agentes externos constituyen uno de los indicadores más poderosos (véase la sección 8.18, El RNAr 165 desempeña una función activa en la sínresis proteínica). De forma más directa, las comparaciones entre estructuras cristalinas de alta resolución de las subunidades individuales y la es tructura de menor resolución del ribosoma imacro sugieren diferencias significativas, idea confirmada por una estructura cristalina del ribosoma de E. coli a 3.5 Á, la cuaL además, identifica dos conformaciones diferentes del ribosoma que prueban representar etapas diferentes de la síntesis proteínica. El cristal contiene dos ribosomas por unidad, cada tmo con diferente conformación. Las diferencias se deben a cambios en el posicionamiento de los dominios en cada subunidad, ~'la más importante consiste en que en una conformación, la cabeza de la subunidad pequeña ha girado aproximadamente 6° en tOrno a la región del cuello, hacia el sirio E. Asimismo, la rotación de 6• en la di rección opuesta se observa en las estructuras (de baja resolución) de los ribosomas de Thermus thermophilus que están unidos al RNAm y que tienen moléculas de RNAt en los sitios A y P. lo cual sugiere que la cabeza puede girar en total 12· . dependiendo de la etapa de la síntesis proteínica. La rOtaCión de la cabeza sigue el curso de los RNAt a través del ribosoma, haciendo posible que su rotación comrole el movimiento del RNAm y el RNAt. Los cambios de conformación que ocurren con la unión de las subunidades son mucho más marcados en la subunidad 305 que en la 50S, y proba blemente están relacionados con el control de la posición y con el movimiento del RNAm. El cambio más si.gnificativo en la subunidad SOS concierne al centro peptidil transfcrasa. Las subunidades 50S son - 1 000 veces menos efectivas en la catálisis de la síntesis de los enlaces pcptídicos que Jos ribosomas comple tos, quizá por un cambio en la estructura que posiciona al sustrato de .forma más efectiva en el sitio activo del ribosoma completo. Una de las características p1incipales derivadas de la estructura del ribosoma completo es la densidad extremadamente alta de contactos disodables en su interfase, que puede ayudar a establecer y rom per contactos, fenómeno esendal para la asodación y disociación de subunidades que también podría estar involucrado en los cambios estructurales que ocurren durante la translocación.

liD

Resumen

Los ribosomas son partículas ribonucleoproteínicas en las cuales la mayor parte de la masa es propor8.21 Resumen

183

clonada por el RNAr. La forma de todos los tibosomas suele ser similar, no obstante, sólo los de las bacterias (70S) han sido caracterizados en detall('. La subunidad pequeña (30S) es de forma alargada y está constituida por un "cuerpo" que contiene aproximadamente dos tercios de la masa dividida ata altura de la '' cabeza'1 por una hendidura . La subunidad grande (50$) es más esférica, con un "pedúnculo" prominente en la pane dered1a y una "protuberancia cen Lral'' . En la subunidad pequeña se conoce la localizadón de aproximadamente todas las proteínas, Cada subunidad contiene u.n RNAr mayor único, de 16S y 23S en las procariotas y de 18S y 28S en el citosol eucariótico. También hay RNAr menores, notablemente el 5$ loca lizado en la sub unidad grande. Los RNAr presentan un extenso apareamiento de bases, principalmente en forma de conos tallos dúplex apareados de manera impeliecta con lazos de cadena ú ruca. Las características conservadas en el RNAr pueden ser identificadas al compaxar las secuencias y las estructuras secundarias que pueden extraerse de los RNAr de diversos organismos. El RNAr }65 tiene cuatro dominios, en tanto que el 235 posee seis dominios diferentes. Los RNAr eu carióticos tienen dominios adicionales. La estructura cristalina muestra que en la subunidad 305 la distríbución del RNA y las proteínas es asimétrica, el primero está concentrado en la interfase con la suburlldad SOS. La subunidad SOS tiene una superficie de proteínas con varillas largas de RNA de cadena doble que se entrecruzan sobre la estructura. La unión de las subunidades 30S y 50S implica conracLOs entre el RNAr 16$ y el RNAr 235. La interfase entre las subunidades es muy rica en contactos disociables. En ambas sub unidades ocurren cambios estructurales cuando se unen para formar un ribosoma complero. Cada sub unidad Liene varios centros activos concemrados en el domino de traducción del ribosoma, donde las proteínas son sintetizadas. Estas últimas abandonan al ribosoma a través del dominio de salida, el cuaJ puede asociarse con una membrana. Los sitios activos principales son A y P, así como el E y los sitios de urllón con el EF-G y el EF-Tu, elpepticlil transferasa y el de unión con el RNAm. La conformación del ribosoma puede cambiar en etapas de la síntesis proteínica; se han detectado cliferendas en la accesibilidad de regiones específicas de los HNAr mayores. Los RNAt localizados en los sitios A y P son paralelos. Los lazos anticodón están unidos al RNAm en un surco localizado en la sub unidad 305. El resto de cada RNAt se Ltne a la subunidad 50S. Un cambio conformacional del RNAL en el sitio A es nece-

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CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

sario para colocar su e-xtremo aminoacilo en yuxtaposición con el extremo del peptidil·RNAt del sitio P. El sitio peptidil transferasa que liga a los sitios de unión A y P está hecho de RNAr 23$, el cual tiene actividad catalítica peptidil transferasa 1 aunque las proteínas son probablemente necesarias para que se adquiera la estructura correcta. La función activa del RNAr en Ja síntesis protei· nica es indicada por mutadones que inciden en la fundón ribosómica, las interacciones con el RNAm o el RNAt que pueden ser detectadas por ligamiento cruzado químico y los requerimienLos para mantener las interacciones de apaream iento de bases individuales con el RNAt o el RNAm. La región 3 rerm.inal del RNAr se aparea con el RNAm en la iniciación. Las regiones internas forman contactos individuales con los RNAt en los sitios P y A. El RNA libosómico es el objetivo de algunos antibióticos u otros agentes que inhiben la síntesis pxoteínica. Un codón en el RNAm es reconocido por un aminoadl-RNAt el cual tiene un anticodón comple~ mentario del codón que transporta al aminoácid0 correspondiente a dicho codón. Un RNAt iniciaqor especial (fMet-RNAtr en las procarioras o Met-RNAt_ en las eucariotas) reconoce al codón AUG, el cual es utHizadú para iniciar todas las secuencias codificadoras. En las procariotas también se utiliza el codón GUG. Sólo los codones de terminación (sin sentido), UAA, UAG y UGA, no son reconocidos por los aminoacil-RNAr. Los ribosomas son liberados de la síntesis proteínica para entrar a un banco de ribosomas libres que están en equilibrio con subunidades pequeñas y grandes separadas. las subunidades pequeñas se unen al RN Am y postcriormenre se ensamblan con las .sub unidades grandes para formar ribosomas ]ntactos que asumen la sín tesis proteínica. El reconocimiento de un sitio de iniciación procariórico implica la urllón de una secuencia localizada en el extremo 3' del RNAr con la secuencia Shine-Dalgarno, la cual precede al codón AtJG {o GUG) en el RNAm. El reconocimiento de un RNAm eucariólico involucra la unión con el casquete 5'; posterionnente. la suburlldad pequeña migra a l sitio de iniciación aJ buscar codones AUG, y cuando reconoce al apropiado (en general, aunque no siempre, el primero que encuentra), se le adhiere una subunidad grande. On dbosoma puede portar dos aminoacii-RNAt simultáneamente: su sitio Pes ocupado por un polipeptidil-RNAt, el cual transporta la cadena polipeptídica sintetizada hasta el momento, mientras que el sitio A es utHizado como entradil por un aminoacil-RNAt que porta al siguiente aminoácido que será agregará a la cadena. Los übosomas bacterianos también tienen un sitio E a través del cual pasa

-=t.'IAt desacilado ames de su liberación después ~abe r sido utilitado en la síntesis proteínica. La - •.:na polipcptídJca ubicada en el sitio P se transfie3 aminoacii-RNAt del sirio A, creando un RNAt ~ciJado en el sitio P y un peptidil RNAt en el A. Después de la síntesis de Jos enlaces peptídicos, el ·oma rransfiere un codón a lo largo del RNAm, ~lazando al RNAt desadlado al interior del sitio E - pepridil-RNAt del sitio A al imerior del sitio P. La - .slocación es catalizada por el !actor de elongadón --G y, como muchas otras etapa-; de la fundón del soma, requiere de la hidrólisis de GTP. Durante la . ·locadón, el ribosoma pasa por una etapa híbrida a cual la subunidad 50S se mueve. respecto de \lbunidad 30S. ~a síntesis proteínica es un proceso costoso. ~ ') que se utiliza ATP para proporcionar energía · 'lUrnerosas etapas, incluida la carga del RJ~At con lminoácido y el desenrollamiento del RNAm. ¡Se ~s rimado que hasta el 90% de las moléculas de -= sintetizadas en una bacteria que se desarrolla Jamenre es consumido en el ensamblaje de Jos --:oácidos para formar proteínas! En cada etapa de la sín tesis proteínica se necefactores adicionales, los cuales son definidos su asociación cíclica con el ribosoma y por su dadón del mismo. Los IF están implicados en la : .1dón procarióúca. El TF- 3 es necesario para que .tbunidades 305 se unan al HNAm. y también --=sponsable del mantenimiento de la subunidad = en forma libre. El fF-2 es necesario para que el :-RNAt1 se una a la subunidad 305 y es responr de excluir a otros aminoacil-RNAt de la reacJe iniciación. El GTP es hidroll!ad o después .. e el RNAL iniciador se ha unido al complejo de 3Ción. Los factores de iniciación deben ser libe~ para permi tir que se adhiera una subunidad -de a l complejo Je iniciación. :.a iniciación eucariótica implica un mayor núde factores, algunos de Jos cuales están im·dos en la unión inicia l de la subunidad 40S _.tremo 5' del RNAm, que posee un casquete, 'o el RNAt iniciador está unido a otro grupo de :-es. Después de esta unión iniciaL la subunidad .. eña explora al RNAm hasta que reconoce al !1 AUG correcto. En ese punto, son liberados ..:aores de iniciación y la subunidad 60S se une :nplejo. -"'S EF procarióricos tienen que ver con la elon::. El EF-Tu une el aminoacil-RNAt con el rilla 70S. El GTP se hidroliza al ser liberado el -:..!,y para regenerar lil forma activa del EF·Tu, .cesita EF-Ts. El EF-G es necesario para la trans:.)n. La unión de los !actores EF-Tu y EF-G con ....,='osomas es excluyente, de modo de garantizar

la conclusión de cada paso antes de que se inide el siguiente. La terminación ocurre eo cualquiera de los cedones especiales, UAA, UAG y UGA. Los RF clase 1 que identifican específicamente a Jos codones de terrninadón aclivan al ribosoma para que hidrolice al peplidil- RNAt. Un RP clase 2 es necesario para liberar al RF clase 1 del ribosoma. Los factores de unión con el GTP, IF-2, EF-Tu, EF-G y RF3, tienen estructuras similares. además de que los dos últimos simulan la estructura RNA-proteína de los primeros dos cuando están unidos a RNI\t. Todos se unen al mismo sitio ribosómico, el sitio de unión al factor G.

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E

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CAPÍTULO 8 Síntesis proteínica

EJ

Las estructuras ribosómicas cambian cuando se unen las subunidades

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_.___ ·.... 9

'1

~

tilización del código genético ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción Los codones relacionados representan a aminoácidos relacionados • Sesenta y uno de los sesenta y cuatro tripletes posibles codifican a veintiún aminoácidos. • Tres codones no representan a aminoácidos y provocan la terminación. • El código genético fue congelado en una etapa inicial de la evolución y es universal. • La mayoría de los aminoácidos están reoresentados por más de un codón. • Los codones múltiples asignados a un aminoácido suelen estar relacionados. • los aminoácidos relacionados con frecuencia tienen codones relacionados, asl se minimizan los efectos de la mutación.

El reconocimiento codón-anticodón implica balanceo • Los codones múltiples que representan al mismo aminoácido frecuentemente difieren en la posición de la tercera base. • El balanceo del apareamiento entre la primera base del anticodón y la tercera base del codón resulta de la estructura del lazo anticodón.

Los RNAt son procesados a partir de precursores más largos • Un RNAt maduro se genera por el procesamiento de un precursor. • El extremo 5' se crea por división mediada por la endonucleasa RNAasa P. • El extremo 3' se genera por división seguida de recorte de las últimas bases y de la adición del trinucleótido terminal común CCA.

El RNAt contiene bases modificadas • Los RNAt contienen >50 bases modificadas. • La modificación implica generalmente la alteración directa de las bases primarias del RNAt, si bien hay algunas excepciones en que una base es eliminada y remplazada por otra.

Las bases modificadas afectan el apareamiento codón-anticodón • Las modificaciones del anticodón inciden en el patrón de apareamiento por balanceo y por lo tanto son importantes para La determinación de la especificidad del RNAt.

El código universal tiene alteraciones esporádicas • En el código genético universal de algunas especies han ocurrido cambios. • Estos cambios son muy comunes en los genomas mitocondriales, en los cuales puede construirse un árbol filogenético de los cambios.

En los geno mas nucleares, los cambios son esporádicos y normalmente afectan sólo a los codones de terminación.

En ciertos codones de terminación pueden insertarse aminoácidos nuevos • En ciertos genes pueden ocurrir cambios en la lectura de codones específicos. la inserción del seleno~Cis·RNAt en ciertos codones UGA implica que muchas proteínas modifiquen al Cis·RNAt y lo inserten en el ribosoma. • La pirrolisina puede ser insertada en ciertos codones UAG.

Los RNAt son cargados con aminoácidos por medio de sintetasas Las aminoacil·RNAt sintetasas son enzimas que cargan al RNAt con un aminoácido para generar aminoacil~RNAt en una reacción de dos etapas que utiliza energía proveniente del ATP. • las células tienen 20 aminoacil·RNAt sintetasas, cada célula porta todos los RNAt que representan a un aminoácido específico. • El reconocimiento de un RNAt se basa en un pequeiio número de puntos de contacto en la secuencia del RNAt.

Las aminoacil-RNAt sintetasas se clasifican en dos grupos • Las aminoadl·RNAt sintetasas se dividen en clase 1 y clase II de acuerdo con su secuencia y sus similitudes estructurales.

Las sintetasas utilizan mecan ismos de corrección para incrementar la precisión La espedficidao del reconocimiento del aminoácido y del RNAt es controlada por las aminoacil~RNAt sintetasas por reacciones de corrección que invierten la reacción catalítica en caso de que haya sido incorporado un componente erróneo.

Los RNAt supresores tienen anticodones mutados que leen a codones nuevos • Un RNAt supresor suele presentar una mutación en el anticodón que cambia los codones a los cuales responde. • Cuando el anticodón nuevo corresponde a un codón de terminación, se inserta un aminoácido y la cadena polipeptidica rebasa al codón de terminación, lo cual resulta en la supresión de una mutación sin sentido en el sitio de una mutación sin sentido, o en la lectura a través de un codón natural de terminación. La supresión de mutaciones de sentido erróneo ocurre cuando el RNAt reconoce a un codón distinto del normal. de manera que un aminoácido es sustituido por otro-

Continúo en lo siguiente págino

189

1

Hay supresores de mutaciones sin sentido para cada codón de terminación

..

• Cada tipo de codón sin sentido es suprimido por moléculas de RNAt con anticodones mutantes. Algunos RNAt supresores extraños presentan mutaciones en otras partes de la molécula.

los supresores pueden competir con La Lectura de tipo silvestre del código los RNAt supresores compiten con los RNAt de tipo silvestre que tienen el mismo anticodón para leer el codón o los codones correspondientes. • La supresión eficiente es perjudicial porque resulta en una lectura qUe rebasa codones de terminación. • El codón UGA es permeable y no es interpretado correctamente por el Trp·RNAt del 1 al 3% de las veces.

El ribosoma influye en la precisión de la traducción La estructura del RNAr 165 de los sitios P y Adel ribosoma influye en la exactitud de la traducción.

Introducción La secuencia de una cadena codificadora de DNA que se lee en dirección 5' a 3', está formada por tripletes de nucleótidos (codones) que corresponden a la secuencia de aminoácidos de una proreína leída del grupo terminal N al terminal C. La secuenciación del DNA y las protei'nas perrrúte comparar de manera directa las secuencias correspondientes de nucleótídos y aminoácidos. Hay 64 codones (uno de los cuatro nucleótidos posibles puede ocupar una de las tres posiciones del codón, es decir, 4) -= 64 secuendas de trinucleóridos posibles). Cada uno de estos codones tiene un significado específico en la síntesis proteínica. 61 codones representan a aminoácidos; tres provocan la terminación de la síntesis proteínica. El signiricado de un codón que representa a un aminoácido depende del RNAt que le corresponde; el sign ifi cado de los codones de terminación es determinado directamente por factores proteínicos. La descodificación del código genético demostró originalmenre que la información genética se almacena en forma de tripletes de nudeótidos, pero no reveló la forma en que cada codón especifica al aminoácido correspondiente. Antes de la secuenciación, las asignaciones de los codones se deduáan con base en dos tipos de estudios in vicro. En 1961 se introdujo un sistema que implicaba la u-aducción de polinucleótidos sintéticos, cuando Nirenberg demostró que el ácido poliuridílico fpoli(U) J dirige el ensamblado de la fenilalanina en la polifenilalanina, resultado que implica que el triplete UUU debe ser un codón de fenilalanjna. Después se introdujo un segundo sistema en el cual se utilizaba un rrinucleótido para imitar a un codón, para que el ami-

190

CAPÍTULO 9 Utilización del código genético

liiiil La modificación de la codificación cambia el significado de los codones los cambios de significado de los codones pueden ser provocados por RNAt mutantes o por RNAt con propiedades especiales. • El marco de lectura puede ~ufrir modificaciones por desviación o por cambios en la pauta de lectura que dependen de las propiedades del RNAm.

Los cambios del marco de Lectura ocurren en las secuencias resbaladizas • El marco de lectura debe ser influido por la secuenci< del RNAm y por el ambiente ribosómico. • las secuencias resbaladizas permiten que el RNAt se desplace una base después de que se ha apareado ce· su anticodón, cambiando así el marco de lectura. • la traducción de algunos genes depende de la aparición regular de cambios programados del marco de lectura.

la evasión implica el movimiento del ribosoma Resumen

noacii-RNAt co rrespondiente se uniera a un rib· soma. Al identificar el componente aminoácido d aminoacii·RNAt, se puede encontrar el significac del codón. Las dos técnicas combinadas leasignarr un significado a LOdos los codones que represemG. a aminoácidos. Sesenta y uno de los 64 codones representan aminoácidos, lo tres restantes provocan la terrr nación de la sínte~is proteínica. La asignación u los aminoácidos a los codones no es aleawria, m~ bien muestra relaciones en las cuales la tercera ba" Liene menos efectO en el significado del codón. P otra parte. los aminoácidos relacionados suelen ~ representados por codones relacionados.

Los codones relacionados representan a aminoácidos relacionados Conceptos principales " Sesenta y uno de los sesenta y cuatro tri pletes posible$ codifican a veintiún aminoácidos. • Tres codones no representan a aminoácidos y provocan la terminación. El código genético fue congelado en una etapa inicial de la evolución y es universal. La mayoría de los aminoácidos están representados po• más de un codón. • Los codones múltiples asignados a un aminoácido suelen estar relacionados. • Los aminoácidos relacionados con frecuencia tienen codones relacionados, así se minimizan los efectos de la mutación.

digo se resume en la . Hay más coque aminoácidos. de modo que casi todos .1inoácidos están representados por más de un 1. Las únicas excepciones son la metionina y el !ano. los codones que tienen el mismo signifise denomínan sinónimos. El código genético - de hecho en el RNAm, de modo que suele ~birse en función de las cuatro bases presentes .RNA, U, C, AyG. - •S codones que representan al mismo aminoo a aminoácidos relacionados tienden a tener ·ccuencia similar. Con frecuencia, la base de la . :a posición de un codón no es significativa por• )$cuatro codones que ctifieren sólo en la tercera :5

Segunda base

::::l

;ringue sólo entre Llna purina y una pirimictina posición. La menor especificidad de la ú ltiosición se conoce como degeneración de la .. era base. _a interpretación de un codón impli<.:a el aparea ro de sus bases con el anticodón del aminoacil.._¡ correspondiente. La reacción ocurre dentro oosoma: los trinucleótidos complementarios _ ..os suelen ser demasiado conos para aparearse rma estable, sin embargo, la interacción es eszada por el ambiente del sitio A del ribosoma. !Smo, el apareamiento de bases entre el codóo y ·icodón no es sólo una cuestión de aparearoien:re A-U y G-C; el ribosoma controla el ambiente .anera que el apareamiemo convencional tiene -~ · en las primeras dos posiciones del codón, a r de que las reacciones adicionales suceden en la . ra base. El resultado es que un solo aminoacil-.• puede reconocer a más de un codón, lo cual ...-sponde al patrón de degeneración. Por otra -.;::. las imeracciones de apareamiento también ~ en ser influida~ por la introducción de bases . .:iales en el RNAL, sobre Lodo por modificaciones anticodón o cerca de él. _a tendencia de los aminoácidos similares a ser -~sentados por codones relacionados minimiza ::~ectos de las mutaciones, con lo cual se incre· - :a la probabilidad de que el cambio aleatorio na sola base no resulte en una sustitución de 1oácido o en un cambio que involucre arnino' 5 de características similares. Por ejemplo. una adónde CUCa CUG no produce ningún efecto - ~:.te ambos codones representan a la leucina, en · • que una mutación de CUU a AUU resulta en -:mplazo de lcucina por isoleucina, aminoácido ~.:hameme relacionado. =.n la es una gráfica del número de mes que represeman a cada aminoácido frente .recuencia con que el aminoácido es utilizado .Js pro teínas (en E. coli). Los aminoácidos más -unes rienden sólo ligeramente a ser represen-

A

G

UCU} UAU} . UGU} . UAC Tir UGC CIS

¡ uuu}Phe UCC uuc UCA I UUA} 1 UUG Leu UCG

Ser UAA} ALTO UGA ALTO UAG UGG Trp

CAu} e u"} Leu ccu} cuc CCC CAC ""

Ql

"'

~u CUA ~

CUG

Q)

ll.

<[

AUU } AUC lle AUA AUG Met

"""}


GUA L__!GUG

ProCAA} CAG Gln

CGUlCGC Arg CGA CGG-

ACU} AAU} ACC AAC Asn

AGU l -ser AGC_

CCA CCG

E ·e

representan al mismo aminoácido. En OCC!Siones -;..a

e

u

Val

:rreo AAA} AAG Lis

ACA ACG

AGA}Arg AGG

GCU} GAU}A•p oouGCC GAC GCA GCG

AlaGA~ GA

Glu

~~;}"''

J

GGG

Todos los codones tienen significado; 61 representan a aminoácidos y tres inducen la terminación (ALTO) .

Leu.

m

e

'Qj

E

a. J2 e <1>

(/)

o => 'O ·¡¡; ~ Q)

8

6

Lis ,

• Val lle .

XIsn..

• Treo Pro

Ser.

Arg.

Phe•

4

Tir •

Cl>

'ro

eo

• Ala • Gli

ASR·

'O

e:Cl>

Glu .

2

Met . His Cis . Trp.

ll.

2

3 4 5 Número de codones

__ 6

___.

El número de codones para cada aminoacido no estrechamente con la frecuencia de uso en las

se correlaciona proteínas.

tados por más codones. de modo que no parece que el código genético haya sido optimizado respecro del uso de los aminoácidos. Los tres codones (UAA, UAG y UGA) que no represeman a aminoácidos se utilizan específicamente para terminar la símesis proteínica. Uno de los cadones de terminación marca el final de cada gen. ¿El código genético es el mismo en rodos los organismos vivientes? La comparación de las secuencias de DN/\ con las secuencias proteínicas correspondienres revela que se utiliza un conjunto idéntico de asignación

9.2 Los codones relacionados representan a aminoácidos relacio nados

191

de codones en el citoplasma e u<.:ariótico y en las bacterias, de modo que el RNAm de una especie en general puede ser traducido correctamente i11 vitro o in vivo por el mecanismo de síntesis de proteínas de otra especie¡ por lo tant o, los codones utilizados en el RNAm de una especie tienen el mismo significado para los ribosomas y para los RNAt de otras especies. La universalidad del código sugiere que debe haber sido establecido muy al principio de la evolución, quizá como una forma primitiva en la que un número reducido de codones se utilizaba para represemar a Ltn número comparativamente pequeño de aminoácidos; es posible, incluso, que un codón correspondiera a cualquiera de los miembros de un grupo de aminoácidos y que el significado más preciso de otros codones y aminoácidos adicionales hubieran sido introducidos pos te~;iormente. Una posibilidad es que, al principio, sólo dos de las tres bases de cada codón se utilizaran; la discriminación en la tercera posición pudo haber evolucionado después. (Originalmente pudo haber una relación estereoquímica entre Jos aminoácidos y los codones que los representaban, la cual después evoludonó un sistema más complejo.) La evolución del código pudo "congelarse" en un punto en el que el sistema llegó a ser tan complejo que cualquier cambio en el significado de los codones hubiera deteriorado a las pToteínas exis-

uuu uuc

ucu ucc

UUA UUG

UCA UCG

cuu cuc

ccu ccc

CUA CUG AUU AUG AUA AUG GUU GUC GUA GUG

CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG

Relación de la tercera base } }

UAU UAC UAA UAG CAU CAC CAA

CAG AAU AAC

AAA

AAG GAU GAC

g~

UGU UGD UGA UG6 CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG

Terceras bases Número con el mismo de significado -:odones

La tercera base no es pertinente Las purlnas difieren de las pirlmidinas Codones únicos

U, C, A, G U, C,A AoG U oC SóloG

32 3 14 10 2

Las terceras bases influyen muy poco en el significado de los codones. las cajas i ndican grupos de codones dentro de los cuales la degeneración de la tercera base asegura que el significado sea el mismo.

192

CAPÍTU LO 9 Utilización del código genético

ten tes por la sustitución con aminoácidos inaceptables. Su universalidad implica que estO debjó habe:ocurrido en una erapa tan temprana que todos lo: organismos vivientes descienden de un solo bancr de células primitivas en el que esto tuvo lugar. Las excepciones a la universalidad del códigr genético son raras. Los cambios en el significado de genoma principal de una especie en general conciernen a los codones de terminación. Por ejempk en los micoplasmas, el cod6n UGA codifica al tript6fano; en ciertas especies de los ciliadas Tetrahymen. y Paramecium, los codones UAA y UAG codiftcan : la glutamina, y modificaciones sistemáticas del cócligo sólo se han presentado en el DNA mitocondria (véase la sección 9.7, El código universa l tiene alteraciones esporádicas).

El reconocí miento codónanticodón involucra balanceo Conceptos pnncipales • Los codones múltiples que representan al mismo aminoácido frecuentemente difieren en la posición de la tercera base. • El balanceo del apareamiento entre la primera base del anticodón y la tercera base del codón resulta de la estructura del lazo anticodón.

La función del RNAi en la síntesis proteínica se litva a cabo cuando reconoce al codón en el sitio ~ ribosómico. La interacción entre el amicodón y e codón sucede por apareamiento de bases, pero er. función de reglas que llevan el apareamiento máallá de las asociaciones usuales A-U y G-C. Las reglas que rigen la interacción pueden deduciJ·se a partir de las secuencias de los amicodone que corresponden a codones espeáficos. La capacdad de cualquier l~NAt para responder a un codór dado puede medirse directamente por la prueba o._ unión a trinucleótidos o utilizándolo en un slstem~ de síntesis de proteínas in vit1•o. el código genético proporciona algunas pista importantes respecto del proceso del reconocimiento de los codones. El patrón de degeneración de -~ Lercera base se ilusrra en la , la cual muestra que, en casi todos los casos, la tercera base es n pertinente o sólo se distingue emre purinas y pirmidinas. Hay ocho familias de codones en las cuales 11 cuatro codones que comparten las mismas primen~ dos bases tienen el mism.o significado, de maneE que la tercera base no desempeña n inguna [unció; en la determinación del aminoácido. Hay siete pare de coclones en los que el s ignificado es el mismc

-pendiemememe de qué pirimidina esté presenla tercera postción, y cinco pares en los que de presentarse cualquier purina sin cambiar al 1oácido codificado. Son sólo tres los casos en que la presencia de .: base panicular en la tercera posición confiere -ignificado único: AUG (para merionina), UGG a triptófano) y UGA (para lemlinación), de ma. que la C y el U nunca tienen un significado :1 en la tercera posición, y la A nunca significa 3m.inoácido (mico. El anticodón es complementario del codón; por ~nto, Ja primera base de la secuencia del anticoescrira convencionalmente en dirección 5' a 3', .J que se aparea con la cercera base del codón, '1!0 de la misma manera (de 5' a 3'). Así pues, . •mbinación -!1

Codón ..~nricod ón

e u e

5' 1\ G 3' 3' G 5'

~cribe generalmente como codón ACG/anticodón _•. donde la secuencia del a.nticodón debe ser leída :-vés para que sea complementaria del codón. Para evitar confusiones, se debe obedecer la • ención usual de escribir todas las secuencias -" , pero marcar las secuencias anticodón con una 'la dirigida en sentido jnverso como recordatorio •u relación con el codón, de modo que el ame.:aparcamiento codón/amicodón se escribe ACG ::;u, respectivamente . ¿Cada codón triple exige su propio RNAt con anticodón complementario, o es posible que un At individual responda a ambos miembros de par de codones y a los cuatro miembros (o al -"lOS algtmos) de una familia de codones? A menudo un RNAt puede reconocer a más de -:odón, o sea que !a base que ocupa la prirne msición del anticodón debe ser susceptible de :r~arse con bases alternas en la tercera posición ~cspondiente del codón. El aparea miento debaen esta posición no se limita a las asociaciones -.!luales G-C y A-U. Las reglas que rigen el reconocimiento de los '!!pañeros se resume en la hipótesis d e l balan=o. que establece que el apareamiento entre el co- y el amicodón en las primeras dos posiciones .. codón siempre sigue las reglas normales, pero - _ en la tercera posición se presentan "balanceos" ...epcionales. El balanceo se debe a que la con-nación del lazo anticodón del RNAt confiere :bilidad a la primera base del anticodón. En la se muestra que pueden formarse pares -~.además de los normales. Este cambio crea un patrón de apareamiento de es en el que la A ya no puede tener un significado .:o en el codón (debido a que el U que la reconoce

también debe reconocer a laG). De manera sjmilar, la C ya no tiene un significado único (porque la G que la reconoce también debe reconocer al U). En la se resume el patrón de reconocimiento. Así pues, el reconocimiento de codones únicos sólo es posible cuando las terceras bases son G o U, opción no frecuente debido a que UGG y AUG son los únicos ejemplos del primer tipo y no hay ninguno del segundo. (Los pares G-U son comunes en las e!>rructuras dúplex de RNA, pero cuando sólo pueden formarse tres pares de bases, la formación de contactos estables e m re el codón y el anticodón es más estrecha, o sea que los pares G-U pueden contribuir sólo en la última posición del codón.)

Los pares de bases estándar ocurren en ladas las posiciones H

. . e' c ..... N 'H

Citosina

HC..... 1

.

o

11

./N,

~

'

Aw~r

,...N

11 H,N .... c'c-N Guanina ' CH 1 11 H,N,...C""N,..C-N/

0

~

CH 3

~t r-.P Uracilo H[ t" /"'~N,H Azúcar

"Azúcar

H,N.H

(

1

~'e-N Adenina H 11 ):H "'N'C'N

O

"A.

zucar El apareamiento de balanceo entre G y U ocurre sólo en la tercera posición del codon H

·

Urac1lo

H~c,c~.o

N

/

1

'G,...N'H•.

Azúcar

6..

g

• H....N" 'C'N, •

'eH

u

Guanina

H,N,c~N,..c ...N

H

"Azúcar

El balanceo en el apareamiento de bases permite que se formen pares G-U entre la tercera base del codón y la primera del anticodón.

-Base en la primera pOSICión del anticodón

u

e A G

Bases reconocidas en la tercera posición del codón AoG SoloG Sólo U CoU

El apareamiento codón-anticodón implica balanceo en la tercera posición. 9.3 El reconocimiento codón-anticodón involucra balanceo

193

Los RNAt son procesados a partir de precursores más largos Concepto~

pnncipales

.

• Un RNAt maduro se genera por el procesamiento de un precursor. • El extremo 5' se crea por división mediaaa por la endonucleasa RNAasa P. • El extremo 3' se genera por división seguida de recorte de las últimas bases y de la adición del trinucleótido terminal común CCA.

Los RNAt se sintetizan comúnmente como cadenas precursoras con material adicional en uno o am bos ex tremos. En la se observa que las secue ncias adicionales son eliminadas por combinaciones de actividades endonu deolíticas y exonucleolíticas. Una característica común a todos los RNAt es que los tres nucleó tidos localizados en el extremo 3', siempre la secuencia ¡ripie CCA, no son codificados en el gcnoma, sino agregados como parte del procesamiento del RNAr.

El ANAl precursor tiene secuencias 5' y 3' adicionales S'

- 3'

n1

Se divide el ex1remo 3'

5'

...

Endcrwcleasa Se recorta el extremo 3'

3'5'

3'

El extremo S' del RNAt se genera por una c. ción de división ca talizada por la enzima ribon cleasa P. Las enzimas que procesan el extremo 3' estG' mejor caracterizadas en E. ro/i, donde una endon cleasa activa la reacción al dividir al precursor • flujo descendente y después. muchas exonudeas. recortan el extremo por degradación en cürecdóo: S'. En las eucarimas, la reacción también involucra numerosas enzimas y genera un RNAt que necest que se agregue el trinudeótido CCA al exLremo 3 La adición de la secuencia CCA es exclush mente resultado de un proceso enzimático, en om palabras, la actividad enzimática porra la especi cidad de la secuencia del trinucleótido, que no determinada por un molde. Ilay numerosos n: delos para el proceso, que puede ser diferente organismos distintos. En a lgu nos o rganismos, el proceso es cata liza por una sola emjma. En un modelo se propo11e q una sola enzima se une al extremo 3' y en secue--cia adhiere C, C y A, y que la especificidad de ca etapa depende de la estructura del exrremo 3'. E otros modelos se propone que la enzima tiene siñ activos diiercmes para el trifosfato de citosina (C:cytosine tripl10sphace) y para el tri fosfato de adenosil (ATP, adenosine triphosphate) .

En otros organhmos, son orras las enzimas re: ponsables de la adición de residuos de e y de A funcionan en forma secuenciaL Cuando un RNAt no es procesado adecua(;. mente, atrae la atención de un sistema de cont: de calidad que lo degrada, con lo cual se garanu que el mecanismo de síntesis de proteínas no s~ bloqueado por moléculas no funcionales de RNA

....

Exonucleasa

El RNAt contiene bases modificadas Conceptos plinópiiles

Se divide el ex1remo 5'

Endonvcleasa (RNAasa P) ~

~

5'3'

Se agrega CCA 3' Enzimas de

¿aCl,ción del

5,c exrremo 3'

El extremo 3' del RNAt se genera por medio de división y recorte seguidos de la adición de la secuencia CCA; el extremo 5' se genera por medio de corte. 194

CAPÍTULO 9 Utilización del código genético

• Los RNAt contienen >50 bases modificadas. • La modificación implica generalmente la alteración directa de las bases primarias del RNAt, si bien hay algunas excepciones en que una base es eliminada y remplazada por otra.

EL RNA de transterencia es úmco entre íos ádd nucleicos debido a su contenido de bases Hinusu.: les#. Una base inusual es cualquier anillo de puri'" o de pirimidina diferente de Jos anillos normales A, G. C y U a parrir de Jos cuales se sintetizan tod los RNA; las demás bases se producen por mod ficación de una de estas cuatro después de que han incorporado a la cadena polirribonucléotícüc

-1das las cl«scs de RNA exhiben cierto grado de icación, pero en rodos los casos, excepto en el ; se trata de eventos bastante sencillos, como •.:::ión de grupos metilo. En el RNAt, la gama 'ldificaciones es amplia, desde metilaciones es hasta la reestructuración total del anillo de .:.. y en cualquier parte de la molécula; hay >50 Jiferentes de bases modificadas en el RNAt. ::-. la se muesuan algunas de las ba - Jdificadas más comunes. Las modificaciones -- pirimidinas (C y U) son menos complejas que e las purinas (/\y G). En la posición 2'-0 del de ribosa, ademá~ de las modificaciones de las : :ambién ocurren meúlaciones. 1s modificaciones más comunes de la uridina cncillas. La metilación en la posición 5 crea m1idina (T), y aunque la base es la misma que -.:::uentra comúnmenre en el DNA, en est~ caso Jdherida a una ribosa y no a una desoxirribosa. = RNA, la timina constituye una base inusual ~da de la modificación del U. -1 dihidrouridina (D) se genera por la saturade un doble enlace que modifica la estructura ::1illo. La seudouridina ('1') intercambia las po-:les de los átomos de N y de C (véase la Fig. - ' ·En la 4-tiouridina, el azufre es sustituido xígeno. :. nucleósido inosina suele estar en la célula intermediario de la ruta de biosímesis de las - Js, sin embargo, no se incorpora directamente "A, en cambio, su existencia depende de la mo_.;dón de la A para crear r. Otras modificaciones :A incluyen la adición de grupos complejos. - )S series complejas de nucleólidos dependen - modificación de la G. Las bases Q, como la 1sina, tienen un anillo pemonilo adicional ,;ado mediante una ligadura de NH al gru.etilo de la 7-meti lguanosina, e l cua l puede .,onar varios grupos adicionales. Las bases Y. la wyosina, Liencn un anillo adicional fusio ..:on el propio 01nillo de purina. Ese anillo adi- transporta una cadena larga de carbono a la .ambién en este caso, se agregan más grupos .erentes casos. _a reacción de modificación suele implicar dificación de bases existentes del RNAt o el _ado de grupos adicionales. Una excepción es ·:csis de las bases Q eo el RNAt, pues una enespecial intercambia queuosina libre por un ..o de guanosina. La reacción implica la rotura t!consrrucción de enlaces en ambos lados del _ J'\ido. -)S n ucleósidos modificados son sintetizados '"DZimas específicas modificadoras del RNAt. cleósido original presente en cada posición

se puede determinar comparando la secuencia del RNAt con la de su gen o (con menos eficienda) aislando moléculas precursoras que carezcan de una o de todas las modificaciones. Las secuencias de los precursores muestran que durante la maduración del RNAt se introducen c:tiversas modificaciones en etapas distintas . Ciertas modificaciones son características constantes de todas las moléculas de RNAt, por ejemplo los residuos D que dan lugar al nombre del brazo D y los residuos \ji que se encuemran en la secuencia T1¡tC. En el lado 3' del anticodón siempre hay una purina modificada, aunque la variedad de modifi-

caciones es amplia. Otras modificaciones son específicas de determinados RNAt o grupos de RNAt, como las bases de wyosina, que son características del RNAtrhc de las bacterias. las levadura) y los mamíferos. Por otra parte, hay también algunos patrones espedficos de cada especie. Las numerosas enzimas modificadoras del RNAL (-60 en las levaduras) varían enormemente en cuanto a especificidad. En algunos casos, una enzima actúa y provoca una modificadón en particular en una sola posición, mientras que en otros casos, una enzima puede modificar bases en diversas posiciones diana. Algunas enzimas asumen reacciones únicas en RNAt específicos, en tanto que

Bases normales

Bases modificadas

H~_...&__JH

o'C-,_N H 1

Uridina

Las cuatro bases del RNAt pueden ser modificadas. 9.5 El RNAt contiene bases modificadas

195

otras lienen un rango de moléculas de susrraro. Se desconocen las características reconocidas por las enzimas modificadoras de RNAt. pero probable meme implican la idenrificación de caracteristicas estructurales en torno al sitio de modificación; algunas modificaciones requieren de la acdón de más de una enzima.

1

Uracilo

H ~e . . e~

Hf

/ N,

Azúcar

11

.,N

O

g

H,N_..6,e,N lnosina ' 11 ''eH HC,N..

C'N

~car

La inosina puede aparearse con U, C y A.

Un enlace no es soliciente ·¡ H, . TlOUrBCI O ¿ C 0 He"' e? 1

11

./ N'C_...N ,

11

Azúcar S

Azúcar

El 2-tlouracllo se aparea únicamente con A eH 3

/

He...b'é'0 1 t N "'

.

'9..-''H ~

Azucar nouracilo

-

' H

u

'11.1-n

~-

' N,c,~-N~ ¡·

HC,N"'

Adenina

~CH

-t/

'

Azúcar

La modificación de la 2-tiouridina restringe el apareamiento sólo a la A, pues sólo puede formarse un enlace de H con G. 196

CAPÍTULO 9 Utilización del código genético

. . Las bases modificadas afectan E apareamiento codón-anticodón Concepto pñncipal Las modificaciones del anticodón inciden en el patrón de apareamiento por balanceo y por lo tanto son importan~ para la determinación de la especificidad del RNAt

El efecro más direcro de la modificadón se obse va en el anticodón. donde el cambio de secuenc influye en su capacidad de aparearse con el codét determinado así el significado del RNAt. Las modi caciones en cualquier olro lado. en las cercan ías e: anticodón. también inOuyen en su apareamientl' Cuando se modifican las bases del a nticodór suelen producirse patrones de apareamiento a
tacilita que siga apareándose con la A, pero que se aparee por balanceo con la G. !:.stas y ot ras relaciones de apareamiento resan la conclusión general de que hay muchas uas de construir un conjunto de moléculas de -t suscepl ibles de reconocer los 61 codones que esentan a los amjnoáddos. Ningún patrón espe- :o predomina en un organismo dado, aunque la n da de de na ruta de modificación puede evitar ;~1 de a lgunos patrones de reconocimiento, de ~(1 que una familia de codon es en particular se .::ce leer con moléculas de RNAt con amicodones ::-entes en organismos distintos. ':on frecuencia, RNAt tendrán respuestas su·.:uestas, de tal manera que un codón en partí·:- pueda ser leído por más de 1Jn RNAt, en cuyo podrá haber diferencias en cuanto a la eficienJ e las reacciones de reconocimiento alterno. · :no regla generaL los codones que se utilizan únmente tienden a ser leídos de forma más _ente.) Además de la construcción de un con-:1 de RNAt susceptible de reconocer a todos los . - nes, podría haber muchas moléculas de RNAt :: ~espondjeran a los mismos codones. ~os pronósticos del apareamiento por balanceo · .:-:.1erdan muy bien con las capaddades observadas ~si todos los RNAt, pero hay excepciones en las _:os codones reconocidos por un RNAt difieren de ~ ronosticados por las reglas del balanceo. Dichos _::os probablemente se deban a la innuencia de ~s vecin<Js o a la conformación del lazo anticodón .: estructura terciaria global del RNAt. De hecho, ""r!ponancia de la estrucwra de lazo del anticodón nherente a la idea de la hipótesis del balanceo. - .:::Slamiento de mutantes ocasionales en los que ~~ bio de una base en alguna otra región de la ~-ru la modifica la capacidad del anticodón para nocer a los codones, proporciona soporte adk1o- ¿ la influencia de la estructura circundante. Otra reacción de apareamiento inesperada se =::ifiesta po r la capacidad del iniciador bacteriano, _ 1et-RNAtr, para reconocer ramo al codón AUG -:ü al GUG. Este comportamiento erróneo impli· : !a tercera base del anticodón. -i!

EL código universal tiene alteraciones esporádicas '

~eplos

principales

En el código genético universal de algunas especies ·¡¡n ocurrido cambios. :Stas cambios son muy comunes en los genomas ~itocondriales, en los cuales puede construirse un §fbol filogenético de los cambios. Er. los geno mas nucleares, los cambios son esporádicos y -.¡¡rmalmente afectan sólo a los codones de terminación.

La universalidad del código genético es impresionante, pe ro hay excepciones que tienden a afectar a los

codo nes implicados en la inidadón o la terminación y que resultan de la producción (o ausencia) de los RNAt que representan a ciertos codones. Los cambios encomrados en los genomas principales (bacterianos o n ucleares) se resumen en la Casi todos los cambios que permiten que un codón Tepresente a un aminoáddo afectan a los codones de terminadón: • En la proca1iota Mycoplasma capricolum, el triplete UGA no se utiliza para la terminación, sino que codifica al triptófano (Trp). De hecho, es el codón Trp predominan te, y la secuenda UGG es utilizada con poca frecuencia. Existen dos especies de Trp-RNAt que tienen anticodones UCA' (que lee a UGA y a UGG ) y CCA... (que sólo lee a UGG) . • Algunos ciliactos (protozoaríos unicelulares) leen a las secuencias UAA y UAG como glutamina y no como señales de terminación. Uno de e llos, Tetrahymena thermophila, contiene tres especies de RNAtG1", de las cuales, una reconoce a los codones usuales CAA y CAG para glutami.na; la segunda, a los tripletes UAA y UAG (de acuerdo con la hipótesis del balanceo), y la tercera, sólo aJ triplere UAG. Se supone que la espedficidad restringida del factOr de liberación eRF es un cambio posterior respecto del de otras eucariotas . • En otro ciliado (Euplotes octacarin.atus), el codón UGA codjfica a la cisteína; sólo se utiliza eltriplcte UAA como codón de terminación y falta la secuencia UAG. El cambio en el

UUU Phe

ucu

lJUA UUG Leu

UCC Ser UCA UCG

uuc

cuu cuc

ccu

UGUC. UGC IS UM ALTO -+ Gln UGA ALTO -+ Trp, Cis. Sel UAG UGGTrp UAU Tir UAC

CAU Hís CAC CAA Gln CAG

CGU CGC CGA Arg

AAU ACU AUU AAC Asn UC lle ACC Treo MA AUA lle~ NULA ACA AAG Lis ACG AUG Met

AGU AGC Ser

Leu

CUA CUG Leu->Ser

GUU GUC GUA GUG

Val

CCC Pro CCA CCG

GCU GCC Ata GCA GCG

GALI Asp GAC GM GAG Glu

CGG Arg

~

NULA

AGA Arg ~ NULA AGG Arg GGU GGC GGA Gli GGG

Los cambios del código genético en los genomas bacterianos o nucleares eucarióticos usualmente asignan aminoácidos a codones de terminación o cambian a codón, de manera que deja de codificar a un aminoácido. Es ra ro un cambio de sig nificado de un aminoácido a otro. 9.7 El código universal tiene alteraciones esporádicas

19 7

A

AGQ= Alto

Vertebrados Insectos

AAA=Asn

Moluscos Equinodermos Nematodos

AAA=Asn

Platelmintos

AUA=Met CUN =Treo

Monos Levaduras Plantas

.1\UA elle AIJA""'Met A AGQ=Ser

UGA=Trp

l

Código un1versal

Los cambios del código genético de las mitocondrias pueden rastrearse en una filogenia. El número mínimo de cambios independientes se genera al suponer que los cambios AUAcMet y AAAaAsn tuvieron lugar de manera independiente en dos ocasiones, y que el cambio temprano AUA: Met se revirtió en los equinodermos.

significado del codón UGA puede lograrse por una modi ficación en e l anticodón del RNAt'" para permitirle leer a la secuencia UGA con los codones usuales UGU y UGC. • La única sustitución en la codificación de aminoácidos ocurre en una levadura (Can dida), en la que eltriplete CUG representa a la scrina y no a la leucina (y el triplete UAG se utiliza como codón codificador) . Para que un codón de terminación adquiera una función codificadora se necesitan dos tipos de cambios, un RNAt debe ser mutado para reconocer al codón y el factor de liberación clase I debe mutar para que la terminación no tenga lugar en dicho codón. El otro tipo común de cambio es la pérdida del RNAt que responde a un codón, de 01anera que éste ya no especifique a ning(m aminoácido. Lo que s uceda a dicho codón dependerá de que el facto r de tenrúnación evolucione para reconocerlo. Todos estos cambios son esporádicos, es decir, parecen haber ocurrido de manera independiente en líneas de evolución específicas; pueden concentrarse en los codones de terminación porque los cambios no implican la sustitución de un aminoácido por otro. Una vez establecido el código genético al principio de la evolución, cualquier cambio general en el significado de un codón hubiera provocado una sustitución en todas las proteínas que contuvieran dicho aminoácido. Parece probable que el cambio podría haber sido perjudicial cuando menos en algunas de estas proteínas, con el resultado de una eliminación selectiva determinante. Los usos divergentes de Jos codones de terminación tal vez representaron su "captura" con fines de codificación normal. Si algunos codones de terminación rara vez

198

CAPÍTU LO 9 Utilización del código genét ico

eran utilizados. sólo serían reclutados para codificación por cambios que permitieran que los RNAt lo' reconocieran. En las mirocondrias de nun1erosas espedes tam· bién se observan excepciones al código genético uni· se representa una filogeni;; versal. En la de los cambios en la cual se sugiere que hubo tll código universal modificado en varios periodos d.: la evolución miwcondrial. El primero de ellos fue~ empleo del triplete UGA para codificar altriptófan~.: que es común en wdas las mitocondrias (ajenas"' las plantas). Algunos de estos cambios simplifican el códig al rempla7a r dos codoncs con significados diferentt por un par con significado único, entre los que se in· cluyenlos tripletes UGG y UGA (ambos representar a Tl:p, e n vez de que uno represente Trp y el o tro, !.: term inación) y /\UG y AUA (ambos M et. y no un Met y el otro lle). ¿Por qué han podido evolu cionar los cambiC' en el código mitoco ndrial? La mitocondria sintetiz..: a un número pequeño de proteínas (-10), de mod que el problema de la discominuidad provocada pr cambios de significado es mucho menos grave. E probable que los codones alterados no fueran mli utilizados en localizaciones en que las sustitucion~:. de aminoácidos hubieran sido nocivas. La varied¡¡ de cambios encontrados en las mitocondrias de dileremes especies sugiere que dichos cambios han ev1 . lucionado de manera aislada y no por transmisirde un código mitocondrial ancestral común. De acu~do con la hipótesis del balapceo, se necesita un míni'rQo de 3 1 RNAt (exduido el iniciado· para reconocer los 6-l c.QQ.gn~(sc;mii~cesarios cuar do menos dos RNA de transferencia para cada fam lia de codones y un RNAt por cada par de codont o por cada codón). No obstante, cuando men os e: las miwcondrias de los m amíferos se presenta un· situación inusual, pues sólo hay 22 RNAt. ¿Cóm caben en este conju nto lim itado de moléculas e RNAt tOdos los codones? La característica clave es una simplificación ¿e aparearnien10 codón-anticodón, de manera que t;,RNAt reconoce a los cuatro miembros de una fami' de endones, con lo que se reduce a 23 el númer mínimo de moléculas de RKAt necesarias para re pender a todos los codones normales. El uso de 1 trípletes AGA e para la terminadón elimina la nec"' sidad de otro RNAt y los reduce a 22. En las ocho familias de codones, la secuenc. del RNAt comiene un U no modificado en la prim~ ra posición del anlicodón y los codones restantes , agrupan en pares, en los cuales, los que termina. en pirimidinas son leídos por tma G del anticod y todos los que terminan en purinas son leídos p

-;;modificado en el anticodón, como se pronosti-

en la hipótesis del balanceo. La complicación del ..:ón in dividual UGG se evita mediante un cambio el código, de modo que los tripletes UGA y UGG nterpreten como tríptófano. En los mamíferos, :~cue ncia AUA deja de representar a la ísoleucina e lee como melionina. aunada alniplete AUG, Jo ¿: permite que todos los codones que no son de - amilía sean leídos como 14 pares. Así pues, los 22 genes de RNAt identificados ifican a 14 moléculas de RNAt que representan ares, y a ocho moléculas de RNAt que represena familias, lo cual implica que los dos codones ~ .erminación usuales. UAG y UAA, además del -de codones AG\, no sean reconocidos por el -~ t. En las mitocondrias de los hongos aplican : .as similares.

En ciertos codones de terminación pueden insertarse aminoácidos nuevos 1

r!Wl<eptos principales ~n

ciertos genes pueden ocurrir cambios en la lectura :e codones específicos. _a inserción del seleno-Cis-RNAt en ciertos codones .1GAimplica que muchas proteínas modifiquen al :is-RNAt y lo inserten en el ribosoma.

.a pirrolisina puede ser insertada en ciertos codones JAG. - .:iertos genes ocurren cambios específicos en la ~ ra del código. La especificidad de dichos cam~ irnplica que la lectura de un codón en pal"ticu lar =nderá de las bases circundantes. En dos casos ~sertan aminoácidos diferentes a Jos 20 clásicos medio de amínoacil-RNAt especiales. t:n ejemplo destacado es la incorporación del 1oácido modificado selenocisteína en ciertos - illes UGA localizados en los genes que codifi- a selenopr o teínas tanto en procariotas como .1cariotas. En genera l. estas proteínas catalizan ·eacciones oxidación-reducción y contienen un residuo de selenocisteína, el cual forma parte >ilio activo. Se sabe más sobre el uso de Jos co~ ~es UGA en tres genes de E. coli que codifican : isoenzimas formato deshidrogenasa. El codól1 _,. interno es interpretado por un RNAt de secistefna, reacción inusual determinada por la Jctura secundaria local del RNAm, en particular ·a presencia de un lazo en horquilla en flujo ~ endente del UGA.

Las mutaciones en cuatro genes se/ crean una deficiencia en la síntesis de selenoproteínas. El gen se/C codifica a RNAt (con el anticodón ACU<-) que se carga con serina. Los genes s.elA y se!D permiten transformar a la serina en selenocisteína. SelB es un factor alterno de elongación; se trata de una proteína de unión a guanina que actúa como factor específico de traducción para la entrada del se lenoCis-RNAt al sitio A y, por lo tanto, proporciona \ID remplazo para el factor EF-Tu (sólo para este Rl~At). La secuencia de la proteína SelB está relacionada con la del EF-Tu y la dellF-2. ¿Por qué se inserta el seleno-Cis-RNAL sólo en ciertos codones UGA? Dichos codones van seguidos de una estructura tallo-lazo en el RNAm. En la se muestra que el tallo de la misma es reconocido por un dominio adicional de la proteína Se1B (el cual no está presente en el EF-Tu ni en el IF-2). Por un rnecanJsmo similar se interpretan algunos codones UGA enJas célu las de los mamíferos, con la salvedad ele que se necesitan dos proteinas para identificar los codones UGA apropiados. Una proteína (SBP2) se une a la estru ctura tallo-lazo en flujo descendente, lejos del codón UGA, mientras que la contraparte del SelB (denominada SECIS) se une a la SBP2 y simultáneamente une el RNAt con el codón UGA. Otro ejemplo de la inserción de un aminoácido especial es la colocación ele pirrolisina en un codón UGA en las archaea y las bacterias a través de un mecanismo probablememe similar al de la ínserdón del seleno-Cis-RNAL Un RNAt inusual se carga con lisina, el cual presurnlblemente será modJficado más tarde. El RNAt tiene un anticodón CUA que responde al rrlplete UAG. y debe haber otros componen tes del sistema que restrinjan su respuesta a los melones UGA apropiados.

r

...... SelB es un factor de elongación que une específicamente el seleno·Cis-RNAt con el codón UGA, que va seguido de una estructura tallo-lazo en el RNAm.

9.i3 En ciertos codones de terminación pueden insertarse aminoácidos nuevos

199

Los RNAt son cargados co n aminoácidos por medio de si ntetasas Conceptos principales • las aminoacil-RNAt sintetasas son enzimas que cargan al RNAt con un aminoácido para generar aminoaciiRNAt en una reacción de dos etapas que utiliza energía proveniente del ATP. • las células tienen 20 aminoacii-RNAt sintetasas, cada célula porta todos los RNAt que representan a un aminoácido específico. • El reconocimiento de un RNAt se basa en un pequeño número de puntos de contacto en la secuencia del RNAt.

Es necesario que los RNAt tengan ciertas características en común, y que aun así, onas permitan distinguirlos uno de otro . La característica clave que confiere esta facultad, es la capacidad del RNAt para doblarse en una estructura terciaria específica. Los

Enzima Siho del aminoácido

Sitio del ATP

La sintetasa tiene 3 sitios de unión

Sitio del RNAt

El aminoácido y el ATP forman aminoacii-AMP

Se une el

RNAt

El RNAt es cargado con aminoácido

Una aminoacil-RNAt sintetasa carga al RNAt con un aminoácido. 200

CAPÍTULO 9 Utilización del código genético

difcremes detalles de esta estru ctura, como el ánguk que forman los dos brazos de la HLN o la protrusión de bases únicas, son los que caracterizan a cada RNAt. Todo~ los RNAt pueden embonar en los sitio> P y A del ribosoma, en un extremo se asocian cor el RNAm por el apareamien to codón-anticodón , ) en el otro, el polipéptido está siendo transferido De manera similar, todos los RNAt (excepto el iniciador) companen la pO!>ibilidad de ser reconocido: por Jos factores de traducción (EF-Tu o eEF 1) pare: umrse al ribosoma. Por el contrario, el RNAt iniciador es reconocido por el IF-2 o por el elF2, de modo que el conjunto de moléculas de RNAL posee características comunes para inreractuar con los factores de elongación, si bien es posible reconocer a RNAt iniciador. Los aminoácidos entran a la ruta de la símesj, proteínica a través de las aminoacii-RNAt sintetasas las cuales proporcionan la interfase para la conexiórcon el ácido nucleico. Todas las sintetasas funcionar. por medio del mecanismo de dos pasos que se ilustra en la • Primero, el aminoácido reacciona con e ATP para formar aminoacil-adenilato, liberando pírofosfato. La energía necesaria pare la reacción es proporcionada por la divisiór del enlace de aha energía del ATP. • Después. el aminoácido activado es Lransferido al RNAt, liberál1dose AMP. Las sintetasas clasifican a los RNAr y a los aminoácidos en sus conjuntos correspondientes. Cad2 simetasa reconoce sólo a un aminoácido y a lodo: los RNAt que deben ser cargados con él. En generaL cada aminoácido es representado por más d (: un RNAt, y pueden necesitarse muchos RNAt pau responder a codones sinónimos; por otra parte suele haber varias especies de RNAt que reaccit'· nan con el mismo codón. Los múltiples RNAr que representan al mismo aminoácido se denomina~ RNAt iso a ceptor e s. y cumo la misma sintetas.: los reconoce a todos, también se definen como su RNAt cogn a dos. Mediante muchos intemos para deducir las similitudes de las secuencias de los RNAt o para indud: alteraciones químicas que inciden en su carga se ha demostrado que la base de reconocimiento no es :¡ misma para los diferentes RNAt y que no necesaria · mente yace en alguna característica de la estructurz primaria o secundaria. Gradas a la estructura cristalina se sabe que el tallo acepwr y el tallo amicodó::forman comacws firmes con la sintetasa y que la mutaciones que influyen en el reconocimiento de un RNAt se encuentra n en estas dos regiones. (E amicodón no necesariamemc es reconocido com tal; por ejemplo, las mutaciones "supresoras" qu ~ se describen más adelante en este capítulo cambia::-

; base del anticodón y. por lo tamo, a los codones 5 cuales responde un RNAt. sin aherar su carga el aminoácido correspondiente.) Un grupo de R!\At isoaceptorcs debe ser carga-.ólo por la aminoacii-RNAt sintetasa específica -:¡ su aminoácido, de modo que deben compartir - ~nas características que permitan a la enzima dis;uirlos de los otros RNAt. Todo el complemen.:e moléculas de RNAt !>e divide en 20 grupos .:ceptores, y cada grupo es su:>ceptible de ídenti-, a su sintetasa panicu.lru·. Los RNAt son identificados por sus sintetasas illame contactos que reconocen a un número _~ -r cido de bases. en general, de una a cinco. 1\or- rnenre se uúlizan tres tipos de características: • Generalmente (pero no siempre). se reconoce cuando menos una base del anticodón. En ocasiones todas las posiciones del anúcodón son importantes. • Con frecuencia se reconoce uno de los tres últimos pares de base~ del tallo aceplbr. Un caso extremo lo representa el Ala-RNAt, identificado sólo por un par de bases único en el tallo aceptar. • La así llamada base discriminadora. que se encuenua enrre el tallo aceptar y el CCA terminaL nunca varía en Jos RNAr ic;oaceptores. ~inguna de estas características consüruye un -~io único para distinguir 20 conjuntos de mo.as de RNAt ni proporciona suficiente especiad. de modo que, aparentemente, el recono--emo de Jos RNAt es idiosincrásico, y cada uno ~ ~ su s reglas. .Xumerosas sintetasas pueden cargar de mane ipecífica una "mini -héliceH formada sólo por el _ J aceptor y el T\¡1 C (equ ivalentes a un brazo .; molécula en Iorma de L) con el aminoácido -ecto. En ciertos RNAt, la especiftcidad depende ..;sivamente del tallo aceptar. pero es obvio que 'ariaciones significativas entre los RNAt y que, 1.gunos casos, la región anticodón es importan_as mutaciones del anticodón pueden afectar el nacimiento por la Phe-RNAt simetasa clase Ir, ~eden estar implicadas muchas características; 11ini-hélices del RNAtv•l y del RNAtM« (de los es sabemos que el amicodón es importante in pueden reaccionar específicamente con sus crasas. Así pues, el reconocimiento depende de una in_.;-dón entre varios puntos de contacro del RNAt, ..:entrados en las extremidades, y unos cuantos .. 1oácidos que constituyen el sirio activo de la .eina. La importancia relativa de las funciones :allo aceptar y del amicodón difiere en cada in .: :dón RNAt-sintetasa.

Las aminoacil-RNAt sintetasas se clasifican en dos grupos Concepto principal • Las aminoacil-RNAt sintetasas se dividen en clase 1 y clase II de acuerdo con su secuencia y sus similitudes estructurales.

A pesar de c;u función común, las sintetasas constiruyen un grupo de proteínas más bien variado. Las subunidades fluctúan entre 40 y 110 k.D, y las enzimas pueden ser monoméric.as. diméricas o tetramé1ícas, y es raro que se pare7can. Obviamente, el siúo activo que reconoce al RNAt comprende una parte bastante pequeña de ln molécula, y es interesrulle comparar los sitios activos de diferentes stmetasas. Las sintetasa~ se han dividido en dos grandes grupos, cada uno l'ot·mado por 1O enzimas, con base en la estructura del dominio que contiene a] sitio se Uu~tra un tipo general de aclivo. En la organización aplicable a ambos grupos. El dominio catalítico incluye a los sitios de unión con el ATP y al aminoácido. y se distingue por ser una región extensa interrumpida por la inserción del dominio que se une a la hélice aceptara de RNAt. lo cual coloca a.l extremo del RNAt cerca del sitio catalítico. Un dominio independiente se une a la región anticodón del RNAt. La~ simetasas mulliméricas rambién poseen un dominio de oligomerización . Las sintetasas clase I poseen un dominio caialítico terminal N que se identifica por dos secuencias cortas de aminoácidos parcialmente conservadas que en ocasiones se denominan "secuencias distintivas''_ El dominio catalítico asume la forma de un rasgo llamado pliegue de unión con el nucleótido (que también se encuentra en otras clases de enzimas que se unen a nucleótictos). Dicho pliegue

Domimo catalltlco: Unión de la Unfón con Formación sitios del ATP y hélíce aceptara antlcodón del del aminoác•do de RNAI del ANAl oligómero Pliegue nuoleóhdo (clase 1) Hélice a o lámina ~ antiparalela (clase 11) o barril ~ Clase 1principalmente monómeros, algunos homodlmeros

Clase 11 principalmente homodlmeros, 2 tetrámeros

Una aminoacii-RNAt sintetasa contiene tres o cuatro regiones con funciones distintas. (Sólo las síntetasas multiméricas poseen un dominio de oligomerización.)

9.1C Las aminoacil-RNAt sintetasas se clasifican en dos grupos

201

Las estructuras cristalinas muestran que las aminoacilRNAt sintetasas de clase I y II se unen a caras opuestas de sus sustratos de RNAt. El RNAt se muestra en color rojo y la proteína en color azul. Imagen cortesía de Di no Moras, Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology.

Se interrumpe er par de bases U1-A72 /

U1~;2 / El tallo aceptar se

' / encuentra en una cavidad profunda de ~ la proteína o. .. •'--El ATP se une cerca del tallo aceptar

-

El lazo anticodón se distorsiona en U35-U36

Gln-RNAt slntetasa

Una RNAt sintetasa de clase I contacta al RNAt en el surco menor del tallo aceptar y en el anticodón.

está formado por cadenas J3 paralelas y hélices a; la secuencia distintiva forma pane del sitio de unión con el ATP. La inserción que hace contacto con la hélice aceptora del RNAt difiere ampliamente entre enzimas de clase l. Los dominios terminal C de las sintetasas clase 1, que incluyen el domino de unión con el amicodón del RNAt, y con cualquier dominio de oligomerización, también difieren bastame uno de otro. Las enzimas clase Il comparten en sus dominios catalíticos tres similitudes de secuencia bastante generales. El sitio activo contiene una gran lámina p 202

CAPÍTULO 9 Utilización del código genético

anúparalela rodeada de hélices a. También en t: caso, el dominio de unión con la hélice aceptora interrumpe el dominio catalítico tiene una estruc ra que depende de la enzima individuaL El dom de unión con el anticodón tiende a ser termina~ La localización de los dominios de oligomerizaC' es muy variable. El hecho de que aparentemente no haya Lrelación entre los dos grupos de sintetasas es enigma, quizás evolucionaron de manera indepc diente, incluso parece posible que existiera una ; ma de vida ancestral con proteínas formadas s por los lO aminoácidos codificados por uno u 1 tipo de sinterasas. Un modelo general de la unión de las RNAt s. retasas sugiere que la proteína se acopla al RNAt el "lado" de la molécula con forma deL, y el mis:principio general se aplica a todas las uniones de • RNAL sintetasas: la adhesión al RNAt tiene lugar :: bre wdo en sus dos extremidades, y la mayor pade la secuencia del RNAt no participa en el rececimiento por medio de una sintetasa. Sin embar _ la naturaleza detallada de la interacción difiere tre las enzimas clase i y clase JI, como se obse:en los modelos de la , que se basan estructuras cristalinas. Ambos tipos de enzima~ aproximan. al RNAL por lados opuestos, lo cual h;; que los modelos RNAt-protefna luzcan casi coimágenes en espejo. Una enzima clase I (Gln-RNAt sintetasa) abo: ellado del lazo D del RNAt, reconoce el surco mer: del tallo aceptor localizado en un extremo del si: de unión e interactúa con el lazo anticodón del m extremo. La es un diagrama de la esrru.:.tura cristalina del complejo RNAt<¡¡"-sinterasa. C: _ característica reveladora de la estructura es que ~ contactos con la enzima cambian la estructura dRNAt en dos puntos importantes, que se observan .;. comparar las líneas punteadas y las continuas ubicadas en el lazo anticodón y el tallo aceptor: • Las bases U35 y U36 del lazo anticodón st jalan para alejarlas del RNAt, hacia el interior de la proteína. • El extremo del tallo aceptor se distorsiona mucho, lo cual resulta en la interrupción de~ apareamiento de bases entre Ul y A72. E: extremo de cadena única del tallo se empotra en una cavidad profunda de la proteína sintetasa que también contiene al s itio de unión para el ATP. Esta estructura explica porqué los cambios del U35, la G73 y el par de bases Ul-A72 afectan la identificación del RNAt por su sintetasa. En todas estas posiciones se forman ligaduras de hidrógenC' entre la proteína y el RNAt.

:Jna enzima clase ll (Asp -RNAt sintetasa) se xima al RNAt por el otro lado y reconoce el lazo - able y el surco mayor del tallo aceptor, como .ustra en la . Este último conserva :mformación hclicoidal regular y el ATP proba:lente se una cerca de la adcnina terminal. En -ro extremo del sitio de unión hay un contacto
las sintetasas utilizan mecanismos de corrección para incrementar la precisión f ~t' pto

rcrincipal

especificidad del reconocimiento del aminoácido _ del RNAt es controlada por las aminoacil-RNAt ;'ntetasas por reacciones de corrección que invierten .a reacción catalítica en caso de que haya sido 'lCorporado un componente erróneo. -<1

.xminoacil-RNAt sintetasas tienen una labor dipues cada simetasa debe distinguir a uno de re 20 aminoácidos y diferencia a los RNAt cog•s (típicamente de uno a ues) del conjumo total _ zá lOO en total). :Iay muchos aminoácidos íntimamente relacio•S entre sf, amén de que LOdos están relacíona:on los intermediarios metabólicos de su ruta ·e:ica particular. Es especialmente difídl distin- entre dos aminoácidos que difieren sólo en la ~i tud del esqueleto de carbonos (por ejemplo. J n grupo CH 2 ). La discriminación intrínseca ba' en las e t1ergías relativas de la unión de estos 3tUiooácidos seria sólo de - l/5. Las enzimas
La cola de

cadena - individual yace profundamente en la protelna

El lazo anticodón se - -distorsiona Asp·RNAt sintelasa

Una aminoacil-RNAt sintetasa clase 11 contacta al RNAt en el surco mayor de la hélice aceptora y en el lazo anticodón.

ácidos correctos y los RNAt cognados podrían formar una unión estable en el sitio. • Ahernarivameme. la reacdón avanza por algunas de estas etapas, después de las cuales se dedde si la especie correcta está presente; en caso contrario, la reacción se revierte o se toma una ruta de evasión, y el miembro erróneo es expulsado. Este tipo de escrutinio posterior a la unión suele llamarse corrección . En el ejemplo de las sintetasas, implica que la reacción de carga proceda a través de ciertas etapas, incluso si hay un RNAt o un aminoácido erróneos. Las sinrctasa~ utiUzan mecanismos de correcdón para controlar el reconocimiento de ambos tipos de sustrato, y mejoran sign iñ cativamente en las diferencias intrínsecas emre aminoácidos o entre RNAt, pero coincidiendo con las diferencias intrínsecas de cada grupo, cometen más errores al seleccionar aminoáddos (las tasas de error van de 1Q-4 a 10 5 ) que al seleccionar RNAt (en cuyo caso, la tasa de error es -1 Q-6) (véase la Fig. 8.8). El RNA de tra nsferenda se une a la sintetasa mediante la reacción ilustrada en la . Los RNAt cognados tienen una mayor afinidad intrínseca por el sitio de unión, por lo que se unen más rápidamente }'la disoáación es más lenta. Después de la unión, la enzima analiza al RNAt que se ha unido, y si es el RNAL correcto, la unión es estabilizada por un cambio de conformación en la e mima, lo cual permite que la aminoacilación ocurra rápidamente. Si se presenta un RNAr equivocado. no ocurre el cambio de conformación. la reacción sucede mucho más despacio y se incrementan las probabilidades de que el RNAt se disocie

9.11 Las sintetasas utilizan mecanismos de corrección para incrementar la precisión

203

y

l

\ y

lt

El RNAt cognado se asocia rápidamente, se disocia lentamente

El RNAt no cognado se asocia lentamente, se disocia rápidamente

,NH RCH

' CO 1\MP

~~i~~At ~ El aminoacil-adenilato es hidrolizado

.1 NH~

RCH

) eo

AMP 1

El RNAt cognado desencadena un cambio de conformación

't

Adenilación

,

NH

r

' OC

.....,.

l

'COOH El aminoacii-RNAI es hidrolizado

.... NH2 RC(H

~ ~ CO

La amJnoacilaclón sin cambio de oonlormaclón es lenta

1 t

~-

Aminoácido Incorrecto ~

.....,.

correcto

AMP

El reconocimiento del RNAt correcto por la sintetasa se controla en dos pasos. En el primero, la enzima tiene mayo( afinidad por su RNAt cognado, y en el segundo, la aminoacilación del RNAt incorrecto es muy lenta.

de la enzüna antes de ser cargado. Este tipo de control se denomina corrección cinética. La especi'ncidad por los aminoácidos varía emre las sintetasas; algunas son muy específicas y se unen inicialmente a un solo aminoácido, mientras que otras Lambién pueden activar aminoácidos estrechamente relacionados con el sustrato apropiado. En ocasiones, el aminoácido análogo puede ser convertido a la forma adcnilada, pero en ninguno de estos casos se utiliza un aminoácido incorrectamente activado para formar un aminoacil-RNAt estable. El RNAt cognado usualmente es necesario para activar la corrección, incluso si la reacción ocurre en la etapa previa a la formación del complejo aminoacil-adenilaro. (Una excepción es la Met-RNAt sintctasa, que puede rechazar a complejos aminoacilo-adenilata no cognados incluso en ausencia de RNAt.) Hay dos etapas en que puede hacerse la corrección de un aminoacil-adenilato incorrecto durante 204

CAPÍTU LO 9 Utilización del código genético

Ré~H2 ' COOH

,NH2 RCH

"-CO

AMP

AMP

~-

1 Aminoácido

't

;

...a aminoacilacíón es rápida

,

NH 2 AMP RCH

AMP

~~r~~At /

y

Aminoácido

ÁCI- 2 incorrecto

YA~inoacii-RNAI

Cuando una sintetasa une al aminoácido incorrecto, la corrección requiere de la unión con el RNAt cognado [a cual puede tener lugar por un cambio conforrnacional qu~ provoque la hidrólisis del aminoacil-adenilato incorrecto o pomedio de la transferencia del aminoácido al RNAt, seguida de hidrólisis.

la formación del aminoacii-RNAt. En la se observa la aplicación de una corrección quimica, en la cual la reacción catalítica es invertida. El grado de predominio de una ruta u orra varía de acuerdo con cada sintctasa : • EL aminoadl-adenilato no cognado podría hidrolizarse si se une el RNAt cognado. En este mecanismo es utilizado de manera predominante por numerosas sin retasas, incluidas las de merionina, isoleucina y valiDa. (En general, la reacción no puede observarse ir. vivo, pero puede ser seguida por la Met-RNAt simerasa cuando el aminoácido activado incorrectamente es la homocisteína, que ca rece del grupo metilo de la mectonina.) La corrección libera una forma modificada del aminoácido, como la homocisteína tiolactona. De hecho, ésta es producida en E. col: como un producto derivado de la reacción de carga de la Met-RNAt sintetasa, Lo cual demuestra que la corrección continua es parte del proceso de carga de un RNAt con su aminoácido.

• Algunas si.metasas utilizan la corrección qtúmica en una etapa posterior. De hecho, el aminoácido erróneo es transferido al HNAt, después es reconocido como incorrecto por su estructura en el sitio de unión con el RNAt, y por lo tanto, hidroli1.ado y liberado. El proceso requiere de un ciclo continuo de ligamiento e hidrólisis hasta que se transfiere el aminoácido correcro al RNAt. ::.a Ilc-RNAt sintetasa de E. coli constituye un en trar a ese sirio, de modo que se hidroliza al-RNAt 1k inco rrecto. En esencia. la en zima flrciona un filtro molecular doble, en el que el 1ño del aminoácido es utilizado para discriminar ;; especies estrechamente relacionadas. :.:na característica imcresame de la lle -RNAt .:~asa es que los sitios sintético y de edición están iJerablemente separados,- 34 Á. Una esrructu ..;stalina de la cmima que forma un complejo ~ n análogo editado de isoleucina muestra que ninoácido es transportado del sirio sintético al ~Jición. En la 5é"Observa que esto ca un cambio en la conformación del RNAt. El aceptor del aminoácido del RNAt1k puede pre~rse en conformaciones alternas. por ejemplo, a una estructura de horquilla inusual para ser .oacilado por un aminoácido en el sitio sintético ~ués recupera la estructura helicoidal más copara mover el aminoácido al sitio de edición.

Frecuencia de errores

[ Paso Activación de vahna , a Vai-AMP118

11225

liberación de Vai-RNAt Tasa global de error

L

1/270 11225 x 1/270 =1160 000

1

La precisión de la carga del RNAt11< por medio de su sintetasa depence del control de los errores en dos etapas.

y

o-s

El sitio de edición es más pequeño que el sintético Sitio sintético

Sitio de edición

La Leu es muy grande para entrar al sitio sintético

~

-

La lle entra en el sitio sintético pero no en el de edición

~

La Val pasa del sitio sintético al de edición

L

La Ile-RNAt si ntetasa tiene dos sitios activos. los aminoácidos más grandes que la leucina no pueden ser activados debido a que no embonan en el sitio sintético, en tanto que los más pequeños son eliminados porque son susceptibles de entrar al sitio de edición.

Extremo de horquilla alterno

Extremo helicoidal usual

Sitio de edición

34Át Sttio sintéuco

Un aminoácido es transportado oel sitio sintético al de edición de la Ile-RNAt sintetasa por un cambio en la conformación del tallo aceptor del aminoácido del RNAt.

9.1! Las sint etasas utilizan mecanismos de corrección para incrementar la precisión

205

La translocación entre sitios es el paso que limi ta la velocidad de la corrección. La Ile-RNAt sinletasa es una simetasa de clase I. sin embargo, el mecanismo de doble filtro Lambién es utilizado por las sintetasas clase n.

Tipo silvestre: El codón UUG es leido por el Leu-RNAt AUG

Leuj

Los RNAt supresores t ienen anticodones mutados que leen a codones nuevos Conceptos principales • Un RNAt supresor suele presentar una mutación en el anticodón que cambia los codones a los ruales responde. • Cuando el anticodón nuevo corresponde a un codón de terminación, se inserta un aminoácido y la cadena polipeptídica rebasa al codón de terminación, lo cual resulta en la supresión de una mutación sin sentido en el sitio de una mutación sin sentido, o en la lectura a través de un codón natural de terminación. • La supresión de mutaciones de sentido erróneo ocurre cuando el RNAt reconoce a un codón distinto del normal, de manera que un aminoácido es sustituido por otro.

El aislamiento de los RNAt mutanres ha sido una de las herramientas más potentes para analizar la capacidad de un RNAt para responder a sus codones en el RNAm y para determinar los efectos que tienen diferentes partes de la molécula de RNAt en el reconocimiento codón-anticodón. Los RNAt mutames se aíslan por su capacidad para superar los e{ectos de las mutaciones en genes codificadores de proteínas. En terminología genética general, una mutación susceptible de superar los efectos de oLra se denomina supresora. En los sistemas de RNAt supresores, la mutación primaria transforma un codón de un RNAm de manera que el producto proteínico deja de ser funcional. La mutación supresora secundaria cambia el amicodón de un RNAt, de tal forma que éste reconoce a l codón mutame en lugar de (o también) a su codón diana original. El aminoácido que se inserta ahora restaura la función de la proteína. Los supresores se describen como supresores de mutaciones sin sen t ido o supresores de mutacio n es d e sentido e rróneo, dependkndo de la naturaleza de la mutación original. En una célula de tipo silvestre, una mutación sin sentido es reconocida sólo por un factor de liberación que termina la síntesis proteínica. La mutación supresora crea un aminoacil-RNAt capaz de reconocer al codón de terminación, y por medio de la inserción de un aminoácido, permite que la 206

CAPÍTULO 9 Utilización del código genético

UUG AAC

UAA

¡

Le u

Mutanre sin sentido: termina el oodón UAG

AUG

U.AG

UAA

F~oc.de

liberacíón

Mutación supresora: cambia al anticodón del Tir-RNAt

Las mutaciones sin sentido pueden ser suprir das por un RNAt con un anticodón mutante, el cual inserta~ aminoácido en el codón mutante, de modo que se produce Lproteína de longitud total en La cual el residuo de Leu origir ha sido remplazado por Tir.

síntesis proteínica rebase el sitio de la m utación s sentido. Esta nueva capacidad del sistema de u·actución permite que se sinteticen proteínas de longit.... completa, como se ilustra en la . En ca de que el aminoácido insertado por supresión~­ diferente del que estaba originalmente en ese sL de la proteína de tipo silvestre, la actividad de proteína puede ser modificada. Las mutaciones de senlido erróneo transform:. a un codón que representa a un aminoácido en codón que representa a otro que no pueda fundor_ en la proteína en lugar del residuo original. (Ftmalmente, cualquier sustitución de aminoácic constituye una mutación de sentido erróneo, pe-en la práctica se detectada sólo si altera la activio~ de la proteína.) La mutación puede ser supri.ml por la inserción del aminoácido original o de alg_ otro que sea aceptable para la proteína. En la se demuestra que la suprest de una mutación de sentido erróneo puede logr~

_ je la misma manera que la supresión de una . 7ación sin sentido, mutando el anticodón de un ·.- \t que pona a un aminoácido aceptable de ma,~a que responda al codón mutante. Por lo tanto, .;upresión de una mutación de sentido erróneo .,.,Jica un cambio en el significado del codón de - J~mi n oácido a otro.

Tipo silvestre: el codón GGA es leído por el Glí-RNAt AUG

GGA ce u

UAA

GI;J ~

Hay supresores de mutaciones sin sentido para cada codón de terminación

Gli

Sent1do erróneo: el triplete AGA es leído por el Arg·ANAt .:.:.nceptos principales

AUG

~ada

tipo de codón sin sentido es suprimido por moléculas de RNAt con anticodones mutantes.

GA ucu

UAA

J

o\lgunos RNAt supresores extraños presentan 11utaciones en otras partes de la molécula.

~

Atg ~ supresores de mutaciones sin sentido se enea· _an en tres clases, una por cada tipo de codón de Supresión: el trlplete AGA es leído por el Gli·ANAt mutante ..-:ninación. En la se describen las pro· .:dades de algunos de los supresores mejor caracAUG GA UAA cu -cZados. Nf:t .K_~ Los más fáciles de caracterizar han sido los su· ccu cu~ ~ ·=sores ámbar. En E. coli se han murado cuando ::tos seis RNAt para reconocer a los codones UAG. - -OS los RNAt supresores ámbar tienen el anúcon CUA- y derivan del lipo silvestre por un solo "'lbio de base. El sitio de la mutación puede ser . .:.:quiera de las tres bases del anticodón, corno se erva en supD, supE y supF. Cada RNAt supresor La supresión de una mutación de sentido erróneo ocurre cuando el anticodón del RNAt es mutado de tal manera :.,noce sólo al codón UAG, no a sus codones an· que responde al codón incorrecto. La supresión es solamente -ores. Los aminoácidos insertados son serina, gluparcial porque tanto el RNAt de tipo silvestre como el RNAt "Tlina o tirosina, los mismos que portan los Ri'\fAr supresor pueden responder al tri plete AGA. :tipo silvestre corresp ondientes. Los supresores ocre también surgen por mu· :.ones del anticodón; los que mejor se conocen _supe y supG, que insertan tirosina o lisina en . ..:.:..J.I ' '::';y-'-"" "TlUesta a los codones ocre (UAA) o a los ámbar . o\G), fenómeno que concuerda con el pronóstico Locus ANAl Tipo silvestre Supresor - a hipótesis del balanceo de que un triplete UAA ,.. . no es susceptible de ser reconocido. ~ ' Un supresor UGA tiene una propiedad inessupO (su1) Ser UCG CGA C JA UAG -~.ada, es un derivado del RNAtTrp, pero su única supE (su2) Gln CAG CUG c .JA UAG _:ación consiste en la sustitución de una A y no ..!na Gen la posición 24. Con este cambio se remsupF (su3) Tir UA5 GUA UA UAG ..::2 u n par G-U por un par A-U en el tallo O, de supe (su4) Tir UA5 GUA UA UA~ do que se incrementa la estabilidad de la hélice. _ ;ecuencia del anticodón se mantiene igual que supG (suS) Lis AA~ uuu u u UA~ ~:tipo silvestre, CCA.... Por lo tanto. las mutacio- jel tallo D deben. de alguna manera, alterar la supU (su7) Trp UGG CCA CA UG~ ~:onnaci ón del lazo anticodón al permitir que el .ere CCA... se apareé con el UGA en un balanceo los RNAt supresores de mutaciones sin sentido -SUal que permite el apareamiento entre e y A. son generados por mutaciones en el anticodón.

GI;J~

J

9.13 Hay supresores de mutaciones sin sentido para cada codón de terminación

207

El RNAt supresor sigue reconociendo a su codón usual, UGG. En un RNAr eucariótico se observa una respuesta similar. El hígado bovino contiene un RN A t5"' con el anticodón '"CCA-. Las reglas del balanceo pronostican que este RNAt debe responder al codón de triptófano UGG, pero de hecho responde al codón de terminación UGA, de modo que es posible que el triplete UGA sea suprimido de forma natural en esta situación. La importancia general de estas observaciones yace en la demostración de que el reconocimiento codón-anticodón del RNAt silvestre o del RNAt rnutame no es pronosticable completamente a pani.J: de las secuencias de los tripletes peninentes, sino que raml.Jién depende de otras características de la molécula.

Los supresores pueden competir con la lectura de tipo silvestre del código Conceptos principales • Los RNAt supresores compiten con los RNAt de tipo silvestre que tienen el mismo anticodón para leer el codón o los codones correspondientes. • La supresión eficiente es perjudicial porque resulta en una lectura que rebasa codones de terminación. • El codón UGA es permeable y no es interpretado correctamente por el Trp-RNAt dell al 3% de las veces.

El factor de liberación termina la sín tesis en un codón de terminación

AUG

J"G

AUC

El RNAt supresor lee el codón UAG y la proteína se extien~e al codón de Ttr term~nac1on

Js

~ 1 t

J ''· • Factor de liberación

Tir

Los supresores de mutaciones sin sentido también leen a través de los codones de terminación, sintetizando así proteínas más largas que las de tipo silvestre.

208

CAPÍTULO 9 Utilización del código genético

Hay una diferencia interesante entre el reconocimiento usual de un codón por el aminoacil-RNAt apropiado y la situación en la cual la mutación permite que un RNAt supresor reconozca a un codón nuevo. En una célula de ripo silvestre sólo puede atribuírsele un significado a un codón determ inado. el cual represenra a un aminoácido particular o a una señal de Lerminación. Sin embargo, en una célula que porta una mutadónsupresora. el codón mutante tiene la alternativa de ser reconocido por el RNA: supresor o de ser leído con su significado usual. Un RNAt supresor de mutaciones sin semid1 debe compeür con los factores de liberación qu( reconocen al codón o a los codones de terminación. Un RNAt supresor de mutaciones de senridt erróneo debe competir con los RNAL que responden adecuadameme a su nuevo codón. La exten · sión de la competencia influye en la eficiencia de 1.: supresión, de modo que la efectividad de u n supre-sor panicular depende no sólo de la afinidad ente su antícodón y el codón diana, sino también des· concentración en la cél u la y de los parámetros q¡; · rigen las reacdones competitivas de t:erminadón de inserción. La eficiencia con la que se lee cualquier codó en particular depende de su local ización, de mod que la extensión de la supresión de una mutació sin sentido por un RNAt dado puede variar amplizmente, según el contexto del codón. Se desconoce ~ efecto de las bases vecinas del RNAm en el recon• ~ cimiento codón-anticodón, pero el contexw p uer cambiar la (rentencia con que un codón es reconl cido por w1 RNAt específico en más de un orden magnitud. El efecto de la base que se encuentra t el lado 3' de un codón parece ser particularme!'1 con runden te. Un supresor de mutaáones sin sentido es a¡ lado por su capacidad para responder a un cod. mutan te sin sentido. ¡Pero el mismo triple te cons tuye una de las señales de terminación de la célu' El RNAt mutante que suprime una mutación~ sentido debe, en princip io, ser capaz de supJirr la terminadón natural en el extremo de cualqu gen que utilice dicho codón. En la muestra que esta ultralectura del codón de t minación natUral resulta en la símesis de una p-:teína más larga, con material terminal e adicior La proteína ampliada terminará en la siguiente cuencia de term inación que se encuentre en la t ; del marco de lectura. Cualquier supresión exte'"' de la terminación probab lemente sea perjudic para la célula porque se han producido protet. ampliadas cuyas fundones han sido modificada Los supresores ámbar tienden a ser relati mente eficientes, en general fu nciona n il tasas l 0% a 50%, dependiendo del sistema. Esta efici'=

~es posible porque los codones ámbar se utilizan .!alivamenre con poca frecuencia para tenninar .a rresis proteínica de E. coli. Los supresores ocre son diffciles de aislar, siem ~e son mucho menos eficientes. su actividad suele :ar por debajo del 10% . El crecimiento de todos !-supresores ocre e!"> deficiente. lo cual indica que .::supresión de los triplctes UAA y UAG es dañina ara E. coli, probablemente debidu a que el codón .:-e se utiliza con mayor frecuencia como señal de ...minación natural. El triplete UGA es el menos eficiente de los co- 'les de terminación en su función natural; e l Trp'At lo interpreta de manera erróne
na de la cubierta del fago de RNA Q~. La formación de panículas Q~ ineficientes implica que el codón de terminación ubicado en el extremo de ese gen sea suprimido a baja frecuencia para generar una pequeña proporción de proteínas de cubierta con una extensió n termmal C. En c·fecto, este codón de terminación es permeable, y la razón es que el Trp-RNAt reconoce al codón a baja frecuencia. La ultralectura de los codones de tNminación también ocurre en las eucariotas, dondt? los vi rus de RNA son los qLle la utilizan con más frecuencia, fenómeno que puede implicar la supre~ión de Jos triplctes UAG/UAA por el Tir-RNAt, el Gln-RNAt o el Leu-RNAt. o bien la supre~ióo del triplete UGA por T!p· l~NAL o Arg-RKAt. La extensión de la supresión parcial la diera el contexto circundanre del codón.

El ribosoma influye en la precisión de la traducción Concepto principal • La estructura del R'liAr 165 en los sitios P y A del ribosoma inf.uye en la exactitud de la traducción. La falta de una variació n detectable cuando se analiza la secuencia de una proteína demuestra que la síntesis proteínica debe ser extremadamente precisa. Mu}' pocos errores son aparentes en forma de sustiruciones de un aminoácido por otro. Hay dos etapas generales en la síntesis proteínica en las cuales pueden comcterse errores (véase la Fig. 8.8, sección 8.3, La precisión de la síntesis pro teínica es conuolada por mee a nismos especiales): • No hay duda de que cargar a un RNA~ sólo con su aminoácido correcto es importantísimo, lo cual es una de las funciones de la am inoacil-RNAt sintetasa. La tasa de e rror pwbablememe varía en función de la enzima específica, pero en general, se producen errores en < 111o~ aminoadlaciones. • la especificidad del reconocimiento codónamicodón es cruda!. pero desconcertante. Aunque las constantes de unión varían según la reacción codón-amicodón, la especificidad siempre es demasiado baja como para proporcionar una tasa de error < 1o->. Cuando se encuentran libres en solución, los RN A r se u ncn a sus codones m u y débilmente. Los tripletes relacionados, pero erróneos (con dos de tres bases correcras), son reconocidos de 1o-~ a 1 2 veces más eficientemente que los correctos. Así plles. el apareamiento de bases codón-anricodón parece ser un punto débil en la exactitud de

o-

il, 5 El ribosoma influye en la precisión de la traducción

209

la traducción. El ribosoma tiene una fundón importante en el control de la especificidad de esta reacción, funciona de manera directa o indirecta como un "corrector" para distinguir entre apareamientos codón-anticodón correctos e incorrectos, de modo que la diferencia intrínseca bastante modesta se amplía -1 000 v~ces. Además de la función del ribosoma, los factores que ponen a los aminoadl-RNAt y a los RNAt iniciadores en el ribosoma también pueden influir en la reacción de apareamiento. Debe haber algunos mecanismos para estabilizar al aminoacil-RNAt correcto y permitir que su aminoácido sea aceptado como sustrato para recibir a la cadena polipeptídica; los contacros con un aminoacil-RNAt incorrecto deben romperse rápidamente, de manera que el complejo salga sin reaccionar. Supóngase que no hay especificidad en la cohsi6n jnicial entre e l complejo aminoacil-RNAt-

El ANAl correcto interactúa con el ANAr

~

RNAm

Un ANAl incorrecto sale del silio A

Un aminoacil-RNAt puede ser colocado en el sitio A (por el EF-Tu), pero sólo uno que se apareé con el anticodón puede hacer contactos estabilizadores con el RNAr. En ausencia de estos contactos, el aminoacil-RNAt se difunde fuera del sitio A.

210

CAPÍTULO 9 Utilización del código genético

EF-Tu-GTP y el ribosoma. Si cualquier complejo. independicmcmente de su RNAt, puede entrar al sitio A, el número de emradas incorrectas debe exceder por mucho el de emradas correct.as. Hay dos modelos básicos que explican cómo el ribosoma discrimina entre aminoacii-RNAt apareados correcta o in correctameme. La siruación actuaJ incorpora elementos de ambos modelos. • El modelo de reconodmiento directo supont que la estructura del ribosoma está diseñada para reconocer a los aminoacii-RNAL apareados de forma correcta, lo cual significaría que el apareamiento correcto resulta er. algún cambio pequeño en la conformación del aminoacil-RNAt, que puede reconoce al ribosorna. La discriminación ocurre ante~ de cualquier reacción posterior. • El modelo de la corrección cinética propone que ha y cuando menos dos etapas en el proceso, de manera que el aminoaciJ-RNAt tiene mú ltiples oportunidades para disgregarse. Un aminoacil-RNAt apareado incorrectamente puede pasar a través de algunas etapas de la reacción antes de ser rechazado. En principio, la selectividad global puede ser productc de las selectividades de cada etapa. La es un diagrama de lo que sucede a los aminoacil-RNAt apareados de manera conecté e incorrecta. Un aminoacii-RNAt apareado de forma correcta es susceptible de establecer contactos estabilizadores con el RNAr, en tamo que el incorrectamente apareado no forma dichos comacros y, por lú tanto, puede difundirse fuera del sitio A. La ruta del descubrimiento de estas interacciones comenzó con investigaciones de los efecto~ de la estreptomicina, un antibiótico, en la década de 1960. Dicho fármaco impide la síntesis proteí· nica al unirse al RNAr 165 e inhibir la capacidar de l EF-G para catalizar la translocación. Asimismo incrementa el nivel de lecturas erróneas de las piri· midinas U y C (una suele ser confundida con la otu y, en ocasiones, con A). La proteína 512. cuya secuencia ha sido modificada en mutan tes resistentes inflltye en e l sitio en que actúa la estreptomicina Lo~ ribosomas con u na proteína S 12 derivada dé bacterias resistentes muestra una reducdón en e' nivel de lecturas erróneas respecto de Jos ribosomas de tipo silvestre, pues efectivamente, la S 1: comrola el nivel de lecturas erróneas, y cuando emutada para disminuirlas, suprime el efecto de li estreptomicina. La Sl2 estabiliza la estructura del RNAr 16S er la región que se une a la estreptOmicina. Lo impor· tan/e aquí es que la regió11 de los sitios P y A influye t7 la precisión de la traducción. que puede ser más o mene precisa al cambiar la estructura del RNAr 16S. La com-

zción de Jos efectos de la proteína S J 2 y de la

rptomicina en la estructura del RNAr explica el ~:portamiento de mutantes diferentes de la S12, . _nos de Jos cuales incluso hacen aJ ribosoma de..:;'iente de la estreptomicina para realizar la tra · ....ctón correcta. ?or la estructura cristalina del ribosoma ahora . .:-mos que el RNAr 16S se encuentra en posición - -~ formar contactos con el aminoacU-RNAt. Dos .....--s del RNAr 16S pueden hacer contacto con el :o menor de la hélice formada por el aparea eme entre el anticodón del RNAt y las dos pri· .-a<; bases del codón del RNAm, lo cual estabiliza ·ectamente la estructura cuando se Io rman los ,:actos correctos codón-anticodóo en las prime · dos posiciones del codón, pero no monitorea a ron tactos de la tercera posición. 1.a estabilización de Jos aminoacil-RNAt correcta · ·'lte aparcados puede tener dos efectos. Al mante e! aminoacil· RNAt en el si tio A, se evita que esca3"ltes de la siguieme etapa de la síntesis proteínica. - .ambio conformactonal del RNAr puede ayudar a ~ ar la siguiente etapa de la reacción, que consiste .: hidrólisis de GTP por medio de EF· Tu. Una parte del efecto de corrección depende del -1po. Un aminoacii-HNAt ubicado en el sitio A . :Je, en efecto, quedar atrapado si la siguiente _;'a de la síntesis proteínica ocurre mientras se ."\.lentra ahí, de modo que un retraso entre la en ; ll al sitio A y la lrans!erencia del grupo peptid.ilo .:je incrememar la posibilidad de d.isociadón de .aminoacii-RNAt apareado de forma incorreCLa, lo :. ocurre con mayor rapidez que en el aminoacil~ \t apareado de forma correcta, probablemente = eces, de modo que su oportunidad para escapar :-!Crementa cuando disminuye la velocidad de la : de transferencia del péptido. Se supone que la especificidad de la decodi fi ca' reside en el ribosoma. pero resultados recientes .. eren que los factores de traducción in fl uyen en ·oceso en Jos sitios P y A. Un indicio de que el ~-:u está implicado en la conservación del marco ~ ectura son los mutantes del factor que suprime . -ambios . de este ú ltimo, lo cual implica que el --:u no simplememe transporta aminoacil -Rl'\IAt ~-:io A, sino que también está involucrado en el .donamiento del aminoacil-RNAt entrante res. :::o del peptidil- RN AL del sitio P. Un caso sobresaliente en el cual los factores inea en el significado es la intciadón. La mutación .. .:odón de iniciación AUG a UUG en el gen HIS4 ~as levaduras evita la iniciación, pero pllede ser ::las mutaciones supresoras extragénicas permi..¡ue se inicie la síntesis proteínica en el codón .. ante UUG. Se ha demostrado que dos de estos :esores se encuentran en los genes que coctifican

a las subunidades a y ~ del eiF2, factor que une al Met-RNAt con el sitio P. La mutación del eiF~2 resi' de en una parte de la proteína que casi seguramente se relaciona con la unión del ácido nucleico. parece probable que su diana sea la secuencia de iniciación del RNAm como ralo la asociación de apareamiento de bases entre el codón del RNAm y el amicodón del Met-RNAt,. lo cual sugiere que el eiF2 participa en la discriminación de los codones de iniciación y en el transpone del RNAt iniciador al sitio P. El costo de la síntesis proteínica en cuanto a enlaces de alta energía puede incrementarse por los procesos de corrección. Una pregunta importante en el cálculo del cosro de la síntesis proteínica es en qué erapa se toma la decisión de aceptar al RNAt. Si inmediatamente se torna la decisión de liberar un complejo amlnoacil·RNAt-EF-Tu-GTP, hay poco costo extra por rechaza r el gran número de RNAt incorrectos q ue (estadísticamente) tienden a en trar al sitio 1\. antes de que el RNAt sea reconocido. Sin emba rgo, si el GT.P es rudrolizado antes de que se disocie e l aminoadl-RNAt apareado de manera errónea, el costo será mayor. Un aminoacU· RNAt apareado erróneamente puede ser rechazado antes o después de la división del GTP, aunque aún no sabemos dónde, en promedio, es rechazado. Hay evidencias de que el uso de GTP in vivo es mayor que el de los tres enlaces de alta energía utilizados en la adición de cada aminoácido (correcto) a la cadena.

La modificación de la codificación cam bia el significado de los codones Conceptos principales

• Los cambios de significado de (os codones pueden ser provocados por RNAt mutantes o por RNAt con propiedades especiales . • El marco de lectura puede sufrir modificaciones por desviación o por cambios en la pauta de Lectura que dependen de las propiedades del RNAm.

El marco de lecmra de un mensajero suele ser in · variable. la traducción empieza en un codón AUG y continúa en tripletes hasta un codón de terminación. La lectura no nota el sentido: la inserción o deleción de una base provoca una mutación de cambio de marco, en la cual la fase de lectura va más allá del sitio de la mutación. Los ribosomas y los RNAt siguen inevitablemente en tripletes, sin · retizando una serie de aminoácidos completamente ctiferente. Hay algunas excepciones al patrón usual de rraducdón que permiten que un marco de lecru -

9.16 La modificación de la codificación cambia e( significado de los codones

211

La supresión es provocada por el anticodón mutado

l-l NNNNN

~

0

Cambio del marco de lectura -1 en el ""ovlrus VIH

NNNNUUUUU ~

GGNNNNNNNN

NNNNNNNNNN Último codón leído en la tase de lectura inicial

Factor especial + RNAI reconocen al codón Sei-Cis~

NNNNN

-g

NN NN NN NN

~ NNNNNNNNNN

Una mutación en un RNAt i ndividual (usualment e en el anticodón) puede suprimir el significado normal de ese codón. En un caso especial, un RNAt específico se une a un factor de elongación i nusual para reconocer a un codón de termi nación adyacente a un lazo de horquilla .

ra con algún Lipo de imerrupción, como un codón sin semido o un cambio en el marco de lectura, sea traducido en un proteína de longitud total. Los eventos de recodificación son responsables de las excepciones a las reglas usuales e involucran a cierto tipo de eventos. El cambio del significado de un solo codón permite que un aminoácido sea sustituido por otro o que un aminoácido se inserte en un codón de terminación . En la se muestra que estos cambios se basan en las propiedades del RNAt individual que responde al codón: • La supresión implica el reconocimiento de un codón por un RNAt (mutante) que usualmente respondería a un codón diferente (véase la sección 9 .12, Los RNAt supresores tienen amicodon es m utados que leen a codones nuevos). • La rede·finición del significado de un codón ocurre cuando se modifica un aminoaciiRNAt (véase la sección 9.8, En ciertos codones de terminación pueden insertarse aminoácidos nuevos) . Los cambios del marco de lectura ocurren en dos tipos de situaciones: • Los cambios del marco de lectura típicamente implican permutaciones en la fase de lectura cuando el aminoacii- RNAt se desliza una base, hacia delante + 1 o hacia atrás - l (véase la siguieme sección, Los cambios del marco de lectura ocurren en las secuencias resbaladizas). El resultado que se muestra en la es que la traducción rebasa al codón de terminación. 212

CAPÍTULO 9 Utilización del código genético

P.rtmer codón leído en la nueva tase de leciUra Lectura sin cambio en la tase de lectura

NNNNUUUU U IACGNNNNN NNN Lectura después del cambio del marco de lectura

NN NNU UUUUJ? ~ NNN NN N Un RNAt que se desliza una base en el apare< miento con un codón provoca un cambio en el marco de lecL que suprime la terminación. La eficiencia suele ser de -5°/c.

Evasión de 60 nucleólidos en el gen 60 del lago T4

~

GAUGGA ... u C............AUUGGAUUA Último codón del marco de lectura original Prtme codón del nuevo marco de lectura

- - - ---------; Lectura sin cambio del marco de lectura

GAUGGA l C'

C ......... .. .AUUGGAUUA

Lectura después del cambio del marco de lectura

GAUGGALW AC.... .. .. ... ..:.UUGGAiUtJA" la evasión ocurre cuando el ribosoma se e<:. plaza a lo largo del RNAm, de manera que el peptidil-R' localizado en el sitio P es liberado del apareamiento cor codón y posteriormente repara con otro codón localizado • adelante en la cadena.

• La evasión implica un movimiento del r' soma para cambiar al codón apareado l el peptidii-RNAt que se localiza en el siritLa secuencia entre los dos codones no p de ser representada en una proteína. Co se muestra en la . esta situac permite que la traducción vaya más alla cualquier codón de terminación localiZ?' en la región intermedia.

Los cambios del marco de Lectura ocurren en las secuencias resbaladizas ·=~•o'!:eptos.

Pollpéptldo-Le~ /A~ CUUAGGC El Arg-RNAt reconoce al tnplete AGG Continúa la lectura normal

principales

:. marco de lectura deoe ser influido por La secuencia :el RNAm y por el ambiente ribosómico. .as secuencias resbaladizas permiten que el RNAt se Jesplace una base después de que se ha apareado con su anticodón, cambiando así el marco de lectura.

..a traducción de algunos genes depende de la aparición

Modos altemos de traducción resultan en Tya o Tya-Tyb Protefna Tya

'Oi Iniciación

Terminación

-egular de cambios programados del marco de lectura.

"' - ..:ambio del marco de lectura se relaciona con moJlas de RNAt específicas en dos circunstancias: • Algunos RNAt supresores mutames recono cen a un "codón" por cuatro bases y no por las tres usuales. • Cienas secuencias "resbaladizas" permiten que el RNAt se mueva una base hacia adelante o hacia atrás del RNAm en el sitio A Las mutaciones de cambio del marco de lectu:esultan de la inserción o deleción de una base, ~eden ser suprimidas al restaurar el marco de ::"'ura original compensando deleciones e insernes de bases en un gen (véase la sección 2.8, El ~igo genético se lee en mpletes). Sin embargo, los resores de los cambios del marco de lectura ex - ~énicos también pueden encontrarse en forma de léculas de RNAt con propiedades aberrantes. El tipo más sencillo de supresor de cambios del >rco de lectura externo corrige la fase de lectura .mdo se ha provocado una mutación por la in-~dón de una base adicional en un fragmento de -~iduos idénticos, por ejemplo, una G puede ser ~ertada en una serie de muchas bases G contiguas. :;: supresor de cambio del marco de lectura es tm \'AtGu que tiene una base extra insertada en su lazo !icodón, convirtiendo al anticodón de la secuen: triplete usual ccc ~ en la secuencia cuádruple :ce.... El RNAt supresor reconoce a un "codón" (Uatro bases. Algunos supresores de los cambios del marco de nu ra pueden reconocer a más de un "codón ~ · cuatro bases, por ejemplo, un supresor RNAtu• · ~'t eriano puede responder a las secuencias AAAA ::. AAAU, y no al codón usual AAA. Otro supresor _ede leer cualquier "codón" de cuatro bases con .::e en las tres primeras posiciones; la sigujente -,e no es pertinente. En estos casos, las bases almas aceptables en la cuarta posición del "codón " islargo no están relacionadas con las reglas deba_;¡ceo normales. El RNAt supresor probablemente conoce a un codón de tres bases, pero por alguna

Iniciación ~

. ula¡yb

"t•

CambiOdel Terminación marco de lectura ~

Fusión protefnica Tya-Tyb

--~~--------------;

En ausencia de Arg-RNAt, elleu-RNAt se desliza una base, Gli-RNAt reconoce al triplete GGC

~

_. L, / f -

éUUAGGC

CUUAGGC

Para la expresión del gen tyb del elemento Ty de las levaduras se necesita un cambio +1 del marco de lectura, el cual tiene lugar en una secuencia de siete bases en la que dos codones de Leu van seguidos de un codón de Arg escaso.

razón, probablemente obstaculización espacial, la base adyacente está bloqueada, lo cual fuerza a pa sar por alto una base ames de que el siguiente RNAt pueda encontrar un codón. Las situaciones en que el cambio de marco de lectura es un evento normal se presentan en fagos y virus, y pueden afectar la continuación o terminación de la síntesis proteínica, además de ser resultado de las propiedades intrínsecas del RNAm. En los retrovirus, la u·aducción del p1imer gen es terminada por un codón sin sentido en fase con el marco de lectura. El segundo gen se encuentra en un marco de lectura diferente, y (en algunos vims) se traduce por un cambio del marco de lect ura que modifica una segunda fase de lectura y, por lo canto, evade al codón de terminación (véase la Fjg. 9.29 e incluso la sección 22.3, Los genes retrovíricos codifican a poli proteínas) . La eficiencia del cambio de marco de lectura es baja, habitUalmente -5%; de hecho, este hallazgo es importante en la biologia del virus, un incremento en la eficiencia puede ser dañino. En la se ilustra la situación similar del ele memo Ty de las levaduras, en el cua l el codón de terminación del gen tya debe ser evadido por u o cambio del marco de lectura para leer al gen tyb subsecuente.

<J.H Los cambios del marco de lectura ocurren en Las secuencias resbaladi zas

213

Dicha situación aclara porqué la rara (pero predecible) ocurrenda de eventos de "lectura errónea" puede basarse en urr paso necesario de la traducción natural, llamada cambio programado del marco de lectura, que ocurre en sitios específicos a frecuencias lOO al 000 veces más altas que la tasa a la cual se presentan errores en sitios no programados (-3 x 10-; por codón). Hay dos características comurres en este tipo de cambio del marco de lectura: • Una secuencia "resbaladiza" permite que un aminoacil -RNAt se apa reé co n su codón y que después se desplace + 1 base (poco frecuen te) o -1 base (más frecuente) para aparearse con una secuencia triple te superpuesta que cambien puede aparearse con su anticodón. • El ribosorna se demora en el sirio del cambio de marco de lectura de modo de dar tiempo a que el am.inoad l-RNAt reestructure su apaream:iento. Las causas de la demora pueden ser un codón adyacenle que necesita un aminoacil-RNAt que escasea; un codón de termi.nación. que tarda en ser reconocido por su facror de liber ación, o un impedimento estructural del RNAm (por ejemplo, un "seudonudo'', conformación particular del RNA) que obstaculiza al ribosoma.

C .. ••.... ,...AUUG6ÁUUA

El ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm

GAUGGAUGAC .......... .. AUUGGAUUA

1

Aterrizaje El peptldii-RNAt se aparea nuevamente con un codón nuevo

En el modo de evasión, un ribosoma cuyo sitio P está ocupado, puede detener la traducción si se desliza a lo largo del RNAm hasta un sitio en donde el peptidit-RNAt se aparee con un codón nuevo en el sitio P. Se reanuda la síntesis proteínica. 214

CAPÍTULO 9 Utilización del código genético

Los eventos de deslizamiento suelen implicar movimiento en cualquier dirección; se provoca un cambio del marco de lectura - l cuando el RNAt se desplaza hacia atrás. y al contrario, un cambio del marco de lectura+ l cuando se mueve hacia delante. En cualquier caso, el resultado es la exposición de un triple fuera de fase en el sitio A para el siguiente aminoac'ii-RNAt. E\ evem o del cambio de marco de lectura ocurre antes de la síntesis del enlace peptídico, muy comúnmenLe, cuando es activado por una secuencia resbaladiza aunada a una horquilla de flujo descendeme del RNA.m y las secuencias cir· cundanres influyen en su eficiencia. El cambio de marco de lectura de la Figura 9.31 muestra el comporramiento de una secuencia resbaladiza típica. La secuencia CUUAGGC de siete nucleótidos suele ser reconocida por el Leu-RNAt en el codó11. CUU y después por e l Arg-RNAt en el triplete AGG. Sin embargo, el Arg-RJ\'(AL es escaso, y cuando la escasez resulta en retraso, el Leu-RNA.t se desliza del codón CUU al rriplete superpuesto U1JA para provocar un cambio en el marco de lectura, debido a que el siguiente triplete en fase como el nuevo apareamiento (GGC) es leído po r el Gli-RNAt. Normalmente, el deslizamiento ocurre en el sitio P (cuando el Leu-RNAt de hecho se ha convertido en peptidil-RNAt y porta la cadena naciente). El cambio de marco de lectura en un codón de terminación da lugar a la u ltralectura de la proteína. La base que se localiza en el lado 3' del codón de terminación influye en las frecuencias relativas de terminación y en los cambios de marco, y po¡; lo tanto, en la eficiencia de la señal de terminación, lo cual facilita la explicación de la importancia del contexto en la terminación.

IIEI

La evasión implica el movimiento del ribosoma

Ciertas secuencias desencadenan un evento de evasión, en e l que un ribosoma deüene la traducción. se desliza a lo largo del RNAm con el pepticlil-RNAt en el sitio P y posteriormente reanuda la traducción (véase la Figura 9.30), pero es un fenómeno bastante raro, sólo se han autentificado -3 ejemplos. E! ejemplo de evasión más impactante 'se observa en el gen 60 del fago T4, donde el rlbosoma se desplaza sesema nudeótidos a lo largo del RNAm. La clave del sistema de evasión son los codones idénticos (o sinónimos) en ambos extremos de la secuencia evadida . En ocasiones se les denomina sitios de ''despegue" y de ''aterrizaje". Antes de la evasión, el ribosoma se posiciona con un peptidilRNAt apareado con el codón de "despegue'', en e! sitio P, con un sitio A vacío en espera de la entrada

.:: aminoacil-RNAt. En la se muestra ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm ; :.a condición hasta que el peptidil-RNAt puede :3rse con el codón del sitio de aterrizaje. Una ---..erística sobresaliente del sistema es su gran -:;:Ida. -50 por ciento. :...a secuenda del RNAm desencadena la evasión. ~aracterísticas importantes son los dos codones - :'ara el despegue y el aterrizaje, el espado en• os, una estructura tallo-lazo que incluye al '::.de despegue y el codón de terminadón adya.c a él; además está involucrada la proteína que ;a sintetizando. ";:)2ra la etapa de despegue se 11ecesita el desapaemo del pepth.W-RNAl de su codón. seguido de vimiemo del RNAm que evita que se aparee _mente. Después, el ribosoma explora al RNAm - ~ue el peplidil-RNAt puede aparears~ de nue-. el codón en la reacción de aterrizaje, seguido :eanudación de la síntesis proteínica cuando el acii-RNAr entra al sirio en la forma usual. _,;ua l que en el cambio del marco de lectura, . , ción de evasión depende de que el ribosoma Jna pausa. La probabilidad de que el peptidil- · se disode de su codón en el sitio P se inae=con la demora de la entrada del arninoacil-- al sítio A. La escasez de aminoáddos puede -cadenar la evasión en los genes bacterianos - al retraso provocado porque no hay ami·RNAt disponible para entrar al sitio A. Una ., de la estructura del RNAm en el gen 60 del -::-.¡puede ser la reducción de la eficienda de la ~..adón, que da lugar al retraso necesario para -.;cdón de despegue.

. =·

Resumen :Jenda de) RNAm Leída en trip letes 5'~3' ~ na por medio del código genético con una se.:..1 de aminoácidos de una proteína leída de la al N a la rerminal C. De los 64 tripletes, 61 co- aminoácidos y eres proporcionan seña les de ación. Los codones sinónimos que represenos mismos aminoácidos están reladonados, :.Jdo por un cambio en la tercera base delco=:sra degeneración de la tercera base, acoplada ---:lrón en el cual los aminoáddos relacionados ;..na ser codificados por codones relacionados, ~iza los efectos de las mutaciones. El código ro es universal y debe haber sido establecido ·emprano en la evolución. Los cambios de los -::Jas nucleares son raros, pero han ocu.rrido aldurante la evolución mitocondrial. .Jchos RNAt pueden responder a un codón en .Jar. El conjunto de moléculas de RNAt que

responde a los varios codones de cada aminoáádo es distintivo de cada organismo. El reconocimiento codón-anricodón impUca un balanceo en la primera posición del anricodón (tercera del codón) que permite que algunos RNAt reconozcan a varios codones. Todos Jos RNAt tienen bases modificadas, inuoducidas éstas por enzimas que reconocen a las bases diana de la estructura del RNAt. El apareamiento codón-amícodón depende de modificaáones deJ codón mismo y también del contexto de las bases adyacentes, en espectal del lado 3' del anticodón. Aprovechando el balanceo codón-anticodón, las mirocondrias de Jos venebrados utilizan sólo 22 RNAt pñra reconocer a Lodos los codones. a diferencia del mínimo usual de 31 moléculas de RNAt; en esto colaboran los cambios del código mitocondriaJ. Cada aminoácido es reconocido por una aminoacil -RNAr slntctasa específica. que también reconoce a todos los RNAt que codifican a dicho aminoácido. Las aminoacii-RNAt sintetasas tienen una función correctora que explora los productos de amlnoacil-RNAt e hidroliza las moléculas unidas de manera incorrecta. Las aminoacil-RNAt sinLetasas varían amplia meme, pero se clasifican en dos grupos generales según la estructura del dominio calalítico. Las sinretasas de cada grupo se unen lateralmente aJ RNAt, formando contactos principalmente con las exne midades del tallo aceptar y con el tallo-lazo anticodón, y lo hacen por lados opuestos. La imponancia relati va del tallo aceptor y la región anticodón para el reconocimiento específico varía en función de cada RNAt. Las mutaciones pueden permitir que un RNAt lea codones diferentes; la forma más común de dichas mutaciones ocurre en el anticodón. La alteración de su especificidad puede permitir que et RNAt suprima una mutación de un gen codificador de una proteína. Un RNAt que reconoce a un codón de tenninaá6n es un supresor de cambio de sentido, y el que cambia al aminoácido que corresponde a un codón, es un supresor de sentido erróneo. Los supresores de los codones UAG y UGA son más eficientes que los de UAA, lo cual se explica porque el UAA es el codón de terminación natural más comúnmenre utíli7ado. La eficiencia de todos los supresores. sin embargo. depende del conrexto del codón diana individual. Los cambios del marco de lectura de tipo + l pueden ser provocados por RNAt abeuames que leen a "codonesH de cuatro bases. Los cambios del marco de lectura+ l o - l pueden ser provocados por secuencias resbaladizas locaUzadas en el RNA.m, las cuales permiten que un peptidil-RNAt se deslice de su codón a una secuencia superpuesta que también 9.19 Resumen

215

puede aparearse con su anricodón. Este cambio del marco de lectura también requiere de otra secuen cia que hace que el ribosorna se retrase. Los cambios del marco de lectura determinados por la secuencia del RNAm pueden ser necesarios para la expresión de genes naturales. La evasión ocurre cuando un ribosoma detiene la traducción y se desplaza a lo largo del RNAm con su peptidil-RNAt en el sitio P, hasta que éste se aparea con un codóo apropiado; posteriormente se reanuda la traducción.

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111

Las bases modificadas afectan el apareamiento codón-anticodón

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216

CAPÍTULO 9 Utilización del código genético

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lm1J

Las aminoacii-RNAt sintetasas se clasifican en dos grupos

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:so.

Los supresores pueden com petir con tipo silvestre del código

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1111

Los cambios del marco de lectura ocurren en las secuencias resbaladizas

la lectu ra de

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Referencias

217

Localización de las proteinas ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción El desplazamiento a través de una membrana requiere de un mecanismo especial • Las proteínas atraviesan las membranas por estructuras proteínicas especializadas insertadas en la membrana. • Los sustratos proteinicos interactúan directamente con el sistema de transporte del ER, las mitocondrias o los ctoroplastos, pero requieren de proteínas acarreadoras para interactuar con los peroxisomas. • Para el transporte dentro del núcleo es necesario un mecanismo mucho más grande y complejo.

La translocación de las proteínas puede ser posterior a la traducción o durante ésta • Las proteínas que son importadas al interior de los organelos citoplásmicos se sintetizan en los ribosomas libres del citosoL • Las proteínas que son importadas al interior del sistema ER-Golgi se sintetizan en los ribosomas que están asociados al ER. • Las proteínas se asocian con las membranas por medio de secuencias de aminoácidos especificas denominadas secuencias de señal. • Las secuencias de señal con mayor frecuencia son lideres localizados en la terminal N. • Las secuencias de señal terminal N usualmente son separadas de la proteína durante el proceso de inserción.

Los chaperones pueden ser necesarios para el plegamiento de las proteínas • Se dice que las proteinas que pueden adquirir su conformación de manera espontánea se autoensa mblan. Con frecuencia, las proteínas pueden ensamblarse en estructuras alternas. Un chaperón dirige a una protefna a una ruta particular al excluir rutas alternas. • Los chaperones evitan la formación de estructuras incorrectas al interactuar con proteínas no plegadas para impedir que se plieguen de manera incorrecta.

Las proteínas desnaturalizadas y las sintetizadas recientemente necesitan chaperones • Los chaperones actúan en proteínas recien sintetizadas, en proteínas que atraviesan membranas o en proteínas que han sido desnaturalizadas. • la Hsp70 y algunas proteínas relacionadas constituyen una clase mayor de chaperones que actúan en numerosas protefnas diana.

218

• Las chaperoninas del grupo I y del grupo U son ensambles oligoméricos extensos que actúan en proteínas diana a las cuales secuestran en cavidades internas. • La proteína Hsp90 es un chaperón especializado que actúa en proteínas de rutas de transducción de señal.

La familia Hsp70 es ubicua • Los miembros de la familia Hsp70 se encuentran en el citosol. el ER. las mitocondrias y los cloroplastos. • la proteína Hsp70 es un chaperón que actúa en proteínas diana aunada a los chaperones OnaJ y GrpE.

Las secuencias de señal inician la translocación • l as proteínas se asocian con el sistema del ER sólo durant>< la traducción. • La secuencia de señal del sustrato proteínico es responsable de la asociación con la membrana.

La secuencia de señal interactúa con la SRP • La secuencia de señal se une a la SRP (partícula de reconocimiento de señal). • La unión señal-SRP provoca la interrupción de la síntesis proteínica. • La sfntesis proteínica se reinicia cuando la SRP se une al receptor de la SRP en la membrana. • La secuencia de señal es separada de la proteína de translocación por la peptidasa señal localizada en la cara "interna" de la membrana.

La SRP interactúa con el receptor de SRP • la SRP es un complejo formado por RNA 7S y seis proteínas. • El equivalente bacteriano de la SRP es un complejo fonnaopor RNA 4.55 y dos proteínas. • El receptor de la SRP es un dímero. • La hidrólisis de GTP libera a la SRP de su receptor después de su interacción.

El traslocón forma un poro • El complejo trimérico Sec61 proporciona el canal para que pasen proteínas a través de una membrana. • Una proteína transferente pasa directamente del ribosoma al traslocón sin exponerse al citosol.

La translocación requiere de inserción en el traslocón y (en ocasiones) de un trinquete en el F • El ribosoma, la SRP y el receptor de la SRP bastan para insertar una proteína naciente en un traslocón. • Las protefnas que se insertan después de la traducción requieren de componentes adicionales en el citosoly del BiP en el ER.

• El BiP es un trinquete que evita que una proteína se deslice hacia atrás.

ll!IJll

_a translocación inversa envía proteínas al cítosol para que sean degradadas

• El transporte a través de las membranas mitocondriales interna y externa utiliza diferentes complejos de receptones. • El complejo TOM (membrana exterior) es un complejo grande en el que los sustratos proteínicos son dirigidos al canal Tom40 por uno de dos subcomplejos. • Los diferentes complejos TIM (membrana interna) se utilizan dependiendo de que el sustrato proteínico está dirigido a la membrana interna o allumen. • las proteínas pasan directamente del complejo TOM al complejo TIM.

• Los traslocones Sec61 pueden utiliza rse para la translotación invetsa de proteínas del ER al citosol

Las proteínas residen en las membranas por medio de regiones hidrófobas • Las proteínas del grupo 1 tienen al grupo terminal N en el extremo distante de la membrana y las del grupo Il presentan una orientación opuesta. • Algunas protefnas tienen múltiples dominios transmembrana.

Las secuencias de anclaje determinan la orientación de las proteínas • Una secuencia de anclaje detiene el paso de una proteína a través del traslocón. Habitualmente esta secuencia se localiza en el extremo ey resulta en una orientación de grupo 1 en la cual el extremo N ha pasado a través de la membrana. • Para insertar a una proteína en la membrana y anclar el sitio de inserción puede utilizarse una secuencia combinada ancla-señal. Tlpicamenle. esto es interno y resulta en una orientación de grupo n en la cual el extremo N es cltos6lico.

II!II!J Los peroxisomas emplean otro tipo de sistema de translocación • las proteínas son importadas al interior de los peroxisomas en su estado de plegamiento completo • Tienen una secuencia PTSl en el extremo e o una secuencia PTS2 en el extremo N. • El receptor Pex5p se une a la secuencia PTS1 y el Pex7p a la PT$2. • Los receptores son proteínas del citosol que transbordan al interior del peroxisoma portando un sustrato proteínico y después regresan al cítosoL

IIi!m Las bacterias utilizan tanto translocación cotraduccional como translocación postraduccional

¿Cómo se insertan las proteínas en las membranas?

• Las proteínas bacterianas exportadas a las membranas o a través de ellas utilizan mecanismos postraduccionates y cotraduccionales.

• La transferencia de los dominios transmembrana del

traslocón al interior de la bicapa de llpidos es activada por la interacción de la región transmembrana con el traslocón.

II!fD

La inserción en la membrana después de la traducción depende de las secuencias líder

m!lJ Sistemas de translocación independientes de Sec en Eschen·chia coli

Una jerarquía de secuencias determina la loca lización dentro de los organelos • La porción terminal N de una secuencia llder dirige a una proteína a la matriz mitocondrial o allumen del cloroplasto. • Una secuencia adyacente puede controla r la dirección a una membrana o a los espacios in~ermembranosos. • Las secuencias son divididas sucesivamente de la protelna.

El sistema Sec transporta proteínas al interior de la membrana interna y a través de ella • El traslocón bacteriano SecYEG de la membrana interna esta relacionado con el traslocón eucariótico Sec61. • En la orientación de las proteínas secretadas al traslocón están implicados varios traslocones.

• Las secuencias lider terminales N proporcionan la

información que permite a las proteinas asociarse con la~ membrana~ de las mitocondrias o de los cloroplastos.

La membrana mitocondrial interna y la externa tienen traslocones distintos

• E. coti y los organelos tienen sistemas de translocación

protelnica relacionados. • Un sistema permite que ciertas proteínas se inserten en las membranas sin un mecanismo de transtocación. • YidC es homólogo al sistema mitocondrial para transferir protelnas al interior de la membrana interna. • El sistema tat transfiere protelnas con un elemento de arginina doble al espacio periplásmico.

II!!i)

Resumen

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

219

111

Introducción

Las proteínas son sintetizadas en dos tipos de loca ciones: • La vasta mayoría de las proteínas es sintetizada por los ribosomas en el cirosol. • Una pequeña minoría se sintetiza en los organelos (mitocondrias o cloroplastos). Las proteínas sintetizadas en el citosol pueden dividirse en dos clases generales según su Localización, las que no están asociadas con las membranas y las asociadas con ellas. En la se ilustra la célu la en función de los destinos finales probables de una prote(na recién sintetizada y los sistemas que la transportan. • Las proteínas citosólicas (o "solubles'') no se encuentran en ningún organelo en particular, se sintetizan en el citosol y permanecen

•

•

•

•

Proterna de la membrana plasmát•ca Señal de retención del aparato de Golgi

/

•

Señal mitocondrial

_Ribosomas "membranosos•·

ahí. donde funcionan como cen rros catalíticos individuales, actuando sobre merabolitos que se encuentran en solución en el citosol. Las estructuras macromoleculares pueden localizarse en sirios específicos del citoplasma; por ejemplo, los centríolos están asociados con las regiones que se convienen en los polos del huso mitótico. Las proteínas nucleares deben ser transportadas de su sitio de símesis en el citosol. a través de la envoltura nuclear, al imerior del núcleo. La mayoría de las proteínas local izadas er. los otganelos citoplásmicos se sinretizan en el citosol y se transportan específicamente a la membrana del organelo y a través de ella, por ejemplo, a las mitocondrias. los peroxisomas o los cloroplastos (en las cél ulas de las plantas). (Las pro temas que se sintetizan dentro del organelo permanecen en él.) El citoplasma comiene una serie de cuerpos membranosos, incluidos retículo endoplásmico (ER, endoplasmic reticulum), apaxato de Golgi, endosomas y lisosomas. En ocasiones. a este conjumo se le conoce como "sistema reticuloendotelial". Las proteínas dentro de estos companimiemos se inserran e n las membranas del ER y luego son dirigidas a sus localizaciones particulares por el sistema de transpone del aparato de Golgi. Las proteínas que son secretadas a partir de la célula son transportadas a la membrana plasmática y después deben pasar a través de ella, hacia el exterior. Su síntesis empieza de la misma n1.anera que la de las proteínas asociadas con el sistema rcriculoendotelial, pero pasan completamente a través del sisrema en lugar de detenerse en algún punto panicular dentro de él.

11J El desplazamiento a través de una membrana requiere de un mecanismo especial Transporte postraducclonal

Transporte cotraduccional

L---~--~--------------~--

Conceptos principales

Sinopsis: la!> proteínas localizadas de forma postraduccional son liberadas en el citosol después de ser sintetizadas en los ribosomas libres. Algunas tienen señales de asignación a organelos como el núcleo o como las mitocondrias. Las proteínas así localizadas se asocian con la membrana del ER durante la síntesis, de modo que sus ribosomas están "unidos a la membrana". las proteínas pasan al interior del retículo endoplásmico a un lado del aparato de Golgi y después a través de la membrana plasmática, a menos que posean señales para ser retenidas en alguna de las etapas de la ruta. Incluso pueden ser dirigidas a otros organelos, como los endosomas o los lisosomas.

• Las proteínas atraviesan las membranas por estructuras proteínicas especializadas insertadas en la membrana. Los sustratos proteínicos interactúan directamente con el sistema de transporte del ER, las mitocondrias o los cloroplastos, pero requieren de proteínas acarreadoras para interactuar con los peroxisomas. • Para el transporte dentro del núcleo es necesario un mecanismo mucho más grande y complejo.

220

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

receso de inserción de una proteína en la memtravés de ella se denomina t ranslo d ón proteínica. El mismo dilema debe resolverse a cada situación en la que una proteína atraviesa .a membrana. La superficie de la proteína es hi:mca, pero la membrana es hidrófoba, y como ~5ua y el aceite, ambos componentes preferirían :nezclarsc, de modo que la solución es crear una -uctura especial en la membrana para que pase ~otcína. Hay tres tipos diferentes de distribución ·a dichas estructuras. El retículo endoplásmico, las mirocondrias y doroplastos contienen estructuras proteínicas :tlstadas en sus membranas que permiten que ~rotdnas pasen a través de ellas sin entrar en -~:acto con los llpidos hidrófobos circundantes. En se muestra que un sustrato proteínico ::te directamente a la estructura, es transportado · eUa al otro lado y posteriormente, liberado. ....os peroxisomas también cuentan con dichas :Jcturas en sus membranas, pero los sustratos - •roteínas no se unen directamente a ellas. En se observa que más bien se unen a ·eínas transportadoras localizadas en el cirosol, :uales son acarreadas por el canal al interior del •~isoma y, posteriormente. el sustrato proteíni-:. liberado. ?ara el transporte hacia el interior del núcleo -:iliza una estructura mucho más grao de y más ¡>leja, el poro nuclear. En la se mues:me aunque dicho poro proporciona el ambiente -permite que un sustrato entre (o salga) del núde hecho no proporciona un sistema que se - a los sustratos proteínicos y los desplace. Este .,;anismo incluye proteínas transportadoras que <en a los sustratos y los transportan a través del • hacia el otro lado. ~'1a o el paso a

La translocación de las proteínas puede ser después de la traducción o durante ella 1

1 Protefna Las proteínas entran al ER o a una mitocondria al unirse a un traslocón que las transporta a través de la membrana.

1 Acarreador

.!;.,eptos principales

_:.s proteínas que son importadas al interior de los : ·ganelos citoplásmicos se sintetizan en los ribosomas ·:~res del cito sol. 2s proteínas que son importadas al interior del :'stema ER-Golgi se sintetizan en los ribosomas que ;;.srán asociados al ER. _35 proteínas se asocian con las membranas por medio :: secuencias de aminoácidos especificas denominadas ::cuencias de señal. .2s secuencias de señal con mayor frecuencia son deres localizados en la terminal N. ..as secuencias de señal terminal N usualmente son ;.;paradas de la proteína durante el proceso de inserción.

10

j

Las proteínas son transportadas al interior de los peroxisomas por una proteína acarreadora que se une a ellas en el citosol, pasa con ellas a través del canal de La membrana y las libera en el otro lado.

Hay dos maneras de que una proteína haga su contactO inicial con una membrana : • La proteína naciente puede asociarse con el mecanismo de rranslocación mientras sigue siendo sintetizada en el ribosoma, proceso conocido como t rans locació n co traducciona l.

La translocación de las proteínas puede ser después de la traducción o durante ella

221

La localización de un ribosoma depende de que la proteína que está siendo sintetizada esté asociada de manera cotraduccional con una membrana: • Las proteínas que entran al retículo endoplásmico (ER, endoplasmicreticulum) utilizan translocación corraduccional. La consecuencia de esta asociación es que el ribo soma está en la superficie del ER. Los ribosomas se asocian con las membranas del ER durante la síntesis de estas proteínas, por lo tanto, se encuentran en fracciones de membrana de la célula, por lo que suelen decirse de ellos que están "unidos a la membrana". • El resto de los ribosomas están en el cito-

t Proteína

sol,

Acarreador

t Las proteínas entran al núcleo al atravesar poros nucleares bastante amplios. El mecanismo de transporte es distinto del poro e incluye com ponentes que transportan a la proteína a través del poro.

Organelo

Señal de Tipo localización

Longitud de la señal

Mitocondria Cloroplasto Núcleo Peroxisoma

Terminal N Terminal N Interna Terminal C

12-30 >25 4-9

Hélice antipática Cargada Básica o bipartita Péptido corto

3-4

Las proteínas sintetizadas en los ribosomas libres del citosol son dirigidas después de su liberación a destinos específicos por medio de elementos de señal cortos.

• La proteína puede ser liberada de un ribosoma una vez terminada la traducción. Posteriormente, la proteína completa se difunde a la membrana apropiada y se asocia con el mecanismo de translocación. A esto se le denomina translocación postraduccional . 222

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

y

como no esrán asociados con ningún

organelo y se fraccionan separadamente de las membran as, en ocasiones se les denomina "ribosomas libres", los cuales sintetizan a todas las proteínas, excepto las sometidas a tran.slocación cotraducciona l. Las proteínas son liberadas en el citosol mientras se completa su síntesis. Algunas de estas proteínas permanecen libres en el citosol en fmma casi soluble, mientras que otras se asocian con estructuras macromoleculares citosólicas, como filamentos, microtúbulos, centríolos, etc., son transportadas al núcleo o se asocian con organelos unidos a membranas por translocación postraduccional. Para asociarse con una membrana (o con cualquier otro tipo de estructura), una proteína requiere de una señal apropiada, habitualmente un fragmento de secuencia que hace que ésta sea reconodda por un sistema de translocación (o sea ensamblada en una esu·uctura macromolecular). En la se resumen algunas señales uti1izadas por las proteínas liberadas de los ríbosomas citosólicos.la importación al interior del núcleo resulta de la presencia de una variedad de secuen cias más bien cortas en el interior de las proteínas. Estas "señales de localización nuclear" les penni ten pasar a través de los poros nucleares. Un tipo de seña l que determina el transporte al perox.isoma es una secuencia terminal C muy corta. Las proteínas mitOcondriales y de los doroplastos se sintetizan en los ribosomas "libres"; después de su liberación en el dtosol, se asocian con las membranas de los organelos por medio de secuencias terminales N de -25 aminoácidos de longitud reconocidas por receptores localizados en la envoltura del organelo . Las proteú1as que residen dentro del sistema retículoendotelial entran al ER mientras están siendo sintetizadas. El principio de la translocadón cotra duccional se resume en la . Una característica importante de este sistema es que la proteína naciente es responsable del reconocimiemo del me-

''"~ismo

de translocación, para lo cual se necesita -'! la señal para la translocación corraduccional for· - pane de laptoteína que se sintetiza primero y, de ..:bo, usualmente se loc:aliza en el extremo N. Las proteínas que utilizan secuencias terminales · · para ser transportadas de forma cotraduccional :=Ro postraduccional a las mitocondrias o los do"TTlastos tienen una característica común. La se-r:-nda terminal N incluye un líder que no forma .!rte de la proteína madura. La proteína que porta ;:-ste líder se denominada prepr oteí na y es un ~ecursor transitorio de la proteína madura. El líder - separado de la proteína durante la translocación -lteinica.

CITOSOL

/

Las proteinas pueden entrar a la ruta ER-Golgi sólo asociándose con el retículo endoplásmico mientras están siendo sintetizadas.

Los ch aperones pueden ser necesarios para el plegamiento de las proteínas 1

Parche hidrófobo

:onceptos principales Se uice que las proteínas que pueden adquirir su cwnformación de manera espontánea se auto· ensamblan. • Con frecuencia, las proteínas pueden ensamblarse en estructuras alternas. Un chaperón dirige a una proteína a una ruta particular al excluir rutas alternativas. Los chaperones evitan la formación de estructuras incorrectas al interactuar con proteínas no plegadas para impedir que se plieguen de manera incorrecta.

·...gunas proteínas son susceptibles de adquirir su _· nformación madura de forma espontánea, y una -11nera de probarlo consiste en desnaturalizada y : '1 determinar si se renaturaliza en la forma actic:. Esta capacidad se denomina autoensamblaje. -'1S proteínas con esta capacidad pueden plegarse o :plegarse en el estado activo a partir de otras con:maciones, incluido el estado en que inicialmente ~ sintetizó, lo cual implica que las interacciones in~ :-nas se dirijan intrínsecamente a la conformación rrecta. El caso clásico es el de la ribónucleasa; en .: Jécada de 1970 se demostró que, cuando la enzia es desnaturalizada, puede renaturalizarse in vitro n la conformación correcta. Más recientememe el ~ >ceso del plegamiento intrfuseco ha sido descrito . detalle para algunas proteí.nas pequeñas. Cuando no tiene lugar el p legamiento correcto iu elen ocurrir conjuntos alternos de interacciones, .a proteína puede quedar atrapada en una canforación estable que no es la forma final pretendida, _ cuyo caso no puede autoensamblarse, y para ad.:irir la estructura apropiada requiere de la asistena de un chaperón.

\ .t'

Las regiones hidrófobas de las proteínas in· teractúan intrínsecamente, y a menos que se les impida, se agregarán entre sí cuando una proteína sea sintetizada (o desnaturalizada).

El plegamiento de las proteínas se debe a interacciones entre superficies reactivas que, en generaL están formadas por cadenas laterales hidrófobas expuestas cuyas interacciones forman un centro hidrófobo. La reactividad intrínseca de estas superficies significa que las interacciones podrían ser incorrectas, a menos que el proceso sea controlado. En la se ilustra este ca<;o. Confo rme una proteúla recién simetizada emerge del ribosorna, uno de los parches h idrófobos de la secuencia tiende a agregarse a otro, asociaciones genera lmente aleatorias que quizá no representen la conformación deseada de la proteína . Los chaperones son protemas que median el ensamble correcto al provocar que una proteína diana adquiera cierta conformació n y no otras posibles por la unión de los chaperones a superficies reactivas de la proteína diana expuestas durante el proceso de ensamblaje, de modo de impedir que dichas superficies interactúen con otras regiones de la proteína

10.4 Los chaperones pueden ser necesarios para el plegamiento de las proteínas

223

Las proteínas desnaturalizadas y las recién si ntetizadas necesitan chaperones Conceptos r•rindpales Chaperón·

\

-

1

El chaperón controla las interacciones

-

Los chaperones se unen a las regiones interactivas de las proteínas conforme son sintetizadas para evitar la agregación aleatoria. Las regiones de las proteínas son liberadas para que interactúen de forma ordenada y adquieran, así, la conforma.ción apropiada.

para establecer una conformación incorrecta. La función de los chaperones es evírar la formación de estructuras incorrectas, no de promover la formase ción de estrucruras correctas. En la muestra un ejemplo en el que un chaperón efectivamente secuestra a un parche hidrófobo de modo de permitir interacciones que no hubieran sido posibles en su presencia, como puede observarse al comparar el resultado con la Figura 10.7. Una estructura incorrecta puede ser producto del plegamiento erróneo de una sola proteína o de interacciones con otra proteína. La densidad de las proteínas en el citosol es aira, y el "hacinamiento macromolecular'' puede incrementar la eficiencia de numerosas reacciones respecto de las tasas observadas in vitro. El hacinamiento puede provocar que las proteínas plegables se agreguen, pero los chaperones pueden contrarrestar este efecto, así pues, una de las funciones de los chaperones podría ser proteger a una proteína de manera que pueda plegarse sin resultar afectada de manera adversa por el hacinamiento en el ciwsol. Se desconoce la proporción de proteillas susceptible de autoensamblarse, contrario a la que requiere la asistencia de un chaperón. (No es axiomático que una proteína capaz de auroensamblarse in vitro de hecho se autoensamble in vivo porque puede haber ctiferendas de proporciones en una y otra conctidón, y Jos chaperones aún pueden estar involucrados in vivo. Sin embargo, debe distinguirse entre las proteínas que básicameme pueden autoensamblarse y las que en principio deben tener un chaperón que las ayude a adquirir la estntctura correcta.) 224

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

• Los chaperones actúan en proteínas recién sintetizadas, en proteinas que atraviesan membranas o en proteínas que han sido desnaturalizadas. La Hsp70 y algunas proteínas relacionadas colílstituyen una clase mayor de chaperones que actúan en numerosas proteínas diana. • Las chaperoninas del grupo I y del grupo II son ensambles oligoméricos extensos que actúan en proteínas diana a las cuales secuestran en cavidades internas. • La proteína Hsp90 es un chaperón especializado que actúa en proteínas de rutas de transducción de señal.

la capacidad de los chaperones para reconocer conformaciones proteínicas incorrectas les permite desempei'íar dos funciones relacionadas que conciemen a la estructura proteínica: • Cuando tma proteína es simetizada .inidalmente, es decir, cuando sale del ribosoma para entrar al citosol. aparece desplegada. Posteriormente, el plegamiento espontáneo se produce conforme la secuencia emergente interactúa con las regiones de la proteína que se sintetizaron previamente. Los chaperones influyen en. el proceso de plegamiento controlando la accesibi lidad de las superficies reactivas. Este proceso está involucrado en la adquisidón inicial de la conformación correcta. • Cuando una proteína es desnaturalizada, se exponen nuevas regiones que adquieren la capacidad de interactuar. interacciones que son similares a las que se producen cuando una proteína se pliega (transitoriamente) de forma errónea conforme empieza a sintetizarse y los chaperones reconocen la confonnación de pliegues in9tJrrectos. Este proceso está implicado en el ~econocim.ienro de w1a proteína desnaturaliZada y ayuda a la renaturalización o hace qu'e sea eliminada por degradación. Los chaperones también pueden ser necesarios para la ·formación de estructuras oligoméricas y para et transpone de proteú1as a través de las membranas, respecto del cuaL un tema persistente es la importancia del control (o la demora) del plegamiento. En la se muestra que, dada la geometría del pasaje, podría ser necesario mantenerlas no plegadas antes de que penetren la mem-

llolil~-- La proteína adquiere

su conformación después de atravesar la membrana

la proteína se inserta en una cámara cerrada

la proterna emerge después del plegamiento

~

La proteína debe pasar a través del canal de la membrana la conformación l:b:l'.iJ>----plegada podría impedir el paso a través de la membrana

Una proteína se aprieta en un pasaje a11gosto :Jnforme atraviesa la membrana.

Una chaperonina forma un complejo oligomérico amplio y pliega a un sustrato proteínico en su interior.

t Las proteínas emergen desplegadas del ribo: la o del pasaje que atraviesa la membra>1a, de forma que .::"'"aen a los chaperones para que las protejan del plegamiento _,...jneo.

--ana, sencillamente porque la proteína madura po.a ser demasiado grande como para embonar en (anal disponible. Los chaperones evirar(an que :a proteína adquiriera una conformación que imuiera su paso por la membrana, de modo que su '1ción sería, básicamente, mantener la proteína _'ible y sin plegarse. Una vez que ha pasado por membrana, puede requerir otro chaperón que le .tde a plegarse en su conformación madura, casi la misma forma en que una proteína dtosólica ~ uiere de la asistencia de un chaperón al salir del _asoma. Probablemente el estado de la proteína . .forme emerge de una membrana es similar a •lel en que se encuentra cuando emerge del ri'oma, básicamente extendida, en posición más o . nos lineal. Se han caracterizado apropiadamente dos tipos - :1cipales de chaperones que inciden en el plega·nto merced a dos mecanismos diferentes: • En la se muestra que el sistema

Hsp70 consiste en proteínas individuales que se unen a los suscrnros cuyo plegamiento debe ser controlado y actúan en elfos y las reconoce

conforme son sintetizadas o emergen de las membranas (incluso cuando son desnatu ralizadas por estrés). Básicamente, controla las imeracciones entre las regiones reactivas expuestas de la proteína. permitiéndole plegarse en la coniormadón correcta in siru. Los componenres del sistema son Hsp70, Hsp40 y GrpE, y su nombre refleja la identificación original de la Hsp70 como una proteína inducida por choque térmico. Las proteínas Hsp70 y Hsp40 se unen individualmente a los sustratos proteínicos y utilizan la h.idrólisis de ATP para proporcionar la ener· gía necesaria para cambiar la estructura del sustrato proteínico, además de que trabajan en conjunto con un factor de intercambio que regenera ATP a partir de ADP . se muestra que un sistema • En la

de chapero11inas está formado por un ensamble oligomérico extenso (representado como un cilindro). Este ensamble forma una estructura en la cual se insertan las proteínas no plegadas . El ambiente protegido dirige su plegamiento. Hay dos tipos de sistemas de chaperoninas, el GroEL/GroES se encuentra en todo tipo de organismos y el TRiC, en el citosol de las eucariotas. Los componenres de los sistemas se resumen en la figura . El sistema Hsp70 y los dos sistemas de chaperoninas actúan sobre numerosos sustratos proteínicos distintos y otro, el de la proteína Hsp90, funciona en conjunto con la Hsp70, sin embargo,

.C\ " Las proteínas desnaturalizadas y las recién sintetizadas necesitan chaperones

225

[· • Sistema

.

:

-¡IZ\1

.

.- '

de las proteú1as de choque térmico son chaperones y fueron descubiertas y nombradas inicialmente

Eshuctura/función

como parte de la respuesta al choque térmico.)

Chaperones Individuales Sistema Hsp70 Hsp70 (DnaK) Hsp40 (DnaJ) GrpE (GrpE)

ATPasa Estim ula a la ATPasa Factor de intercambio de nucleótidos

Hsp90

Funciones en las proteínas implicadas en la transducción de señal

La familia Hsp70 es ubicua Conceptos principales • Los miembros de la familia Hsp70 se encuentran en el citosol, el ER, las mitocondrias y los cloroplastos. " La protefna Hsp70 es un chaperón que actúa en proteínas diana aunada a los chaperones DnaJ y GrpE.

EstrucllJras oligoméricas (chaperoninas) Grupo 1 Hsp60 (GroEL) Hsp10 (GroES) Grupo 11 TRiC

Forma dos anillos heptaméricos Forma un casquete

Forma dos anillos octaméricos

La familia de chaperones tiene contrapartes eucarióticas y bacterianas (nombres entre paréntesis).

Hsp70 hidroliza ATP

Hsp70-ATP se une a Hsp40 + sustrato

Hsp40 se une al sustrato

··ATP DnaK - Hsp70

.... ........

.

Q) o

~ Q_o·

GrpE desplaza al ADP

Hsp40 es liberado

Hsp70 se disocia

~=

Q) '

"'o •'

¡g : u•

w:.

ADP

El Hsp40 se une al sustrato y después al Hsp70. La hidrólisis de ATP dirige un cambio conformacional. El GrpE desplaza al AOP, de modo que los chaperones son liberados. Durante el plegamiento de un sustrato proteínico pueden ocurrir múltiples ciclos de asociación y disociación.

se dirige a clases específicas de proteínas involucradas en la transducción de señaL especialmente los receptores de hormonas esteroideas y las cinasas de señalización. La función básica del sistema Hsp90 es mantener a sus dianas en una conformación adecuada hasta que sean estabilizadas por la interacción con otros componentes de la rllta. (La razón de que muchas de estas proteínas se denominen "Hsp", "proteína de choque térmico'' [por sus siglas en inglés, heat shock protein], es que el incremento de temperatura induce la producción de este tipo de proteínas cuya función es minimizar el daño provocado por la desnaruralización calórica. Muchas 226

CAPÍTULO 10 l ocalización de las proteínas

La familia Hsp70 se encuentra en las bacteria~, el cirosoJ de las eu cariotas, el ER, los clo.roplastos y las mitocondrias. Una Hsp70 típica tiene dos dominios, de los Cllales, la terminal N es una ATPasa y la terminal C se une al sustratO polipep tídico. Cuando eslá unida a ATP, la Hsp70 se une a los sustratos y los libera rápidamente, por el contrario, con ADP las reacciones son lentas. El reciclaje entre estos estados es regulado por otras dos proteínas, la Hsp40 (DnaJ) y la GrpE. En la 1 se muestra que la Hsp40 (DnaJ) se une primero a una proteína naciente conforme emerge del ribosoma. La Hsp40 contiene una región denominada dominio J (cuyo nombre se deriva de DnaJ) que interactúa con la Hsp70 (DnaK) . Esta última se une a la Hsp40 y a la pro tema desplegada . En efecro, dos chaperones que interactúan se unen a la proteína. El dominio J representa la especifidad de la interacción de apareamiento y conduce a una Hsp40 específica a seleccionar al compañero adecuado de la familia Hsp70 . La interacción de la Hsp70 (DnaK) con la Hsp40 (DnaJ) estim ula la actividad ATPasa de la Hsp70. La fo rma del complejo unida a ADP se mantiene asociada con el sustrato proteínico basta que la GrpE desplaza alADP, fenómeno que provoca la pérdida de la Hsp40 seguida de la disociación de la Hsp70, que se une a otro ATP y el ciclo puede repetirse. La GrpE (o su equivalente) se encuentra sólo en las bacterias, las mitocondrias y los cloroplastos; en otras ubicaciones. la reacción de disociación está acoplada a la hldrólisis de ATP de manera más compleja. El plegamiento de las proreí:nas se logra mediante múlriples ciclos de asociación y disociación. Conforme se alarga la cadena proteínica, la Hsp70 (DnaKI puede disociarse de un sitio de unión y posteriormente reasociarse a otro, de modo de Uberar partes del sustrato proteínico para plegarlo correcta y ordenadamente. Por último, La proteína intacta se libera del ribosoma plegada en su conformación madura. Diferentes m iembros de la clase Hsp70 funcíonan en varios tipos de proteínas diana. las proteínas

..:rosol (Hsp70 epónima y una proteína relacio- llamada Hsc70) actúan en las proteínas na.es de los ribosomas. Las variantes del ER (denadas BiP o Grp78 en las eucariotas superiores -2 en Saccharomyces cerevisiae), las mitocondrias • cloroplastos, funcionan de manera bastante _ar en las proteínas conforme se introducen en rganelo o en su paso a través de la membrana. .=Qué característica reconoce la Hsp70 en una eína diana? Se une a un fragmento lineal de 1oácidos incrustados en un contexto hidrófolue es precisamente el tipo de elemento que ="'tierra en el centro hidrófobo de una proteína ~1ra adecuadamente plegada, de modo que su ;sición indica que la proteína es naciente o está aruralizada. Los elementos de esta naturaleza :esentan aproxim adamente cada 40 aminoáciy la unión con el elemento evita que éste se · de manera errónea a otro. Este modelo de acción explica la forma en que .-oteína Hsp70 Bip puede cumplir con dos fun es, ayudar a la oligomerización y al plegamiento ;oteínas recién translocadas en el ER y eliminar ·eínas plegadas de forma errónea. Supóngase . la Bip reconoce cienas secuencias peptídicas _cesibles en la con formación de una proteína ura plegada adecuadamente: dichas secuencias ·ponen y atraen a la Bip cuando la proteína ·a allumen del ER en una forma esendalmeote .:!imensional. Si una proteína es plegada de maJ incorrecta o es desnaturalizada, la secuencia e ser expuesta en su superficie, en vez de ser ~rrada adecuadamente.

Las secuencias de señal inician la translocación :..: --<.cp~ us

principalc~

_as proteínas se asocian con el sistema del ER sólo :urante la traducción. -.3 secuencia de señal del sustrato proteínico es i!Sponsable de la asociación a La membrana.

proteínas que se asocian con las membranas _iante líderes terminales N urilizan una jerar- de señales para encontrar su destino final. En -~O del sisrema reticuloendotelial, la localización .; de una proteína depende de la forma en que irigida conforme transita por el retículo endo'llico y el aparato de Golgi. La secuencia lider ....,duce la proteína a la membrana, y la conse..cía intrínseca de la interacción es que la proJ pasa a través de la membrana hacia el interior .:ompanimiento. Para que una proteína resida

.. .. ..... . ~ KDEL terminal C • . .. .... • • Golgi.....-~~

Retlculo endoplásmico Lis osoma ~.

Manosa -6fosfato

~

Mernbrana plasmáhca

~

..

Señal de residencia

... .

PREDETERMINADA Extracelular

Las proteínas que entran a la ruta ER-Golgi pueden fluir a través de la membrana plasmática o ser desviadas a otros destinos por medio de señales específicas.

en la membrana, se necesita una señal adicional que le impida atravesarla. Para que una proteína sea designada a un destino panicular. en otras palabras, para que permanezca dentro de la membrana o del lumen de algún compartimiento específico se necesita otro tipo de señales. El proceso general necesario para la localización del destino final de una proteína transponáodose a través de sistemas membranosos sucesivos se denomina tráfico de pr oteínas o asignación, y se describe en el tráfico de proteínas. Las características generales de la ruta se resumen en la . La "ruta predeterminada" lleva a una proteína a través del ER, al interior del aparato de Golgi y a la membrana plasmática. Las proteínas que residen en el ER poseen un tetrapéptido terminal C (KDEL, el cual de hecho propor ciona una sefial para que las proteínas regresen del aparato de Golgi al ER) . La señal que desvía a una proteína al l.isosoma es una modificación covalente, es decir, la adición de un azúcar en particular. Para que una prote(na se transforme en un constituyente permanente del aparato de Golgi o de la membrana plasmática, se necesitan otras seiiales. Hay un punro de inicio común para las proteínas que se asocian con el sistema reticuloendorelial de membranas o que pasan a través de él. Estas proteínas pueden asocinrse con la membra11a sólo mientras están siendo sintetizadas. Los ribosomas que sintetizan a estas proteínas se asedan con el ER. de modo de permitir que la proteína naciente sea transferida de forma cotraduccional a la membrana. En ocasiones, a las regiones en las que están asedados ribosomas y ER se les llama "ER rugoso", en contraste con las regiones de "ER Uso" que carecen de polisomas asociados y tienen una apariencia tubular, en vez !0. 7 Las secuencias de señal inician la translocación

227

de laminar. En la se muestran los ribosomas en la transferencia de prorefnas nacientes a las membranas del ER. Las proteínas sintetizadas en el ER rugoso pasan delribosoma directamente a la membrana, para después ser transferidas al aparato de Golgi y finalmente dirigidas a su destino final, ya sea un lisosoma, una vesícula de secreción o la membrana plasmática. El proceso ocurre en un ambiente membranoso, puesto que las proteínas son acarreadas entre los organelos en vesículas pequeñas con revestimiento de membrana. La inserción cotraduccional es dirigida por una secuencia de señal, que suele ser una secuencia líder divisible de l 5 a 30 aminoácidos terminales N. En el extremo N, o cerca de él, hay numerosos residuos polares, y dentro del líder, un centro hidrófobo que consiste exclusiva, o principa lmente, de aminoácidos hidrófobos. No ~e conserva ninguna otra secuencia. la es un ejemplo de ello. La secuencia de señal es n ecesaria y su fi ciente para promover la transferencia de cualquier polipéptido a l interior de la membrana diana. Una secuencia de señal agregada al extremo N de una globina, por ejemplo, hace que sea secretada a través

El retículo endoplásmico está fo rmado por una lámina de membranas muy plegada que parte del núcleo. Los pequeños objetos adheridos a la superficie externa de las membranas son los ribosomas. Imagen cortesía de Lelio Orci, University of Geneva, Switzerland.

de las membranas de las células en lugar de qut pe rmanezca en el citosol. La secuencia de señal proporciona la con exió:"' que permite a los ribosomas adherirse a la membrana. No hay una diferencia intrínseca entre lo ribosomas libres (que sintetizan proteínas en el árosol) y los adheridos al ER. Un ribosoma empieza l.; síntesis de una proteína sin saber si será sintetizada en el citosol o será transferida a una membrana. l.; síntesis de una secuencia de señal es la que provoca que el ribosoma se asocie con una membrana. 1 :

La secuencia de señal interactúa con la SRP

La secuencia de señal se une a la SRP (partícula de reconocimiento de señal). La unión señal-SRP provoca la interrupción de la síntesis proteínica. La síntesis proteínica se reinicia cuando La SRP se une al receptor de la SRP en la membrana. La secuencia de señal es separada de la proteína de translocación por la peptidasa señal localizada en la cara Ninterna" de la membrana.

La translocadón proteínica puede dividirse en do~ etapas generales, primero, los ribosomas que ponar. polipéptidos nacientes se asocian con las membranas y posteriormente la cadena naciente es transferida al canal y transportada a través de él. La unión de los ribosomas a las m emb rana~ exige la partícula de reconocimiento d e señal (SRP, signa! recognition parlicle), que tiene dos capacidades imponames: • Puede un irse a la secue ncia de señal de u na prorefn a secretora naciente. • Puede unirse a una proteína (receptora de la SRP) loca lizada en la membrana. La SRP y su receptor funcio nan de manera catalítica para transferir a un ribosoma que pon a una

Iniciación

.~flS l ~,......, I G-

....

ei At:~Jr•o ~·

• Polar•~Centro hidrófobo __..,.

1 Pro~Ttp• Treo~ ,....-¡, V ·GI,./ Ala .,/JI .-.~

Leu

División

Pro

Proteína vat

madura

Cis

La secuencia de señal de la hormona de crecimiento bovina está formada por 29 aminoácidos terminales N y tiene una región central altamente hidrófoba, precedida o flanqueada por regiones que contienen aminoácidos polares. 228

CAPll ULO 10 Localización de las proteínas

..:ína naciente a la membrana . El primer paso es a SRP reconozca la secuencia de señal, se una a ::ceptor y el ribosoma a la membrana . Las etapas ~aducción de las proteínas de la membrana se :nen en la :..a función del receptor de la SRP en la rrans_jón proteínica es transitoria; cuando la SRP se a la secuencia de señal, detiene la traducción, _:: eneral cuando se han incorporado -70 ami....idos a la cadena polipeprídica (en este punto tier de 25 residuos ha quedado expuesto, con ~o aminoácidos siguientes aún enterrados en el )Oma). ( u ando la SRP se une a 1 receptor correspon.-::e, libera la secuencia de señal y el ribosoma .:dhiere a otro componente de la membrana, m.en to en que la traducción puede continuar. ;. ndo el ribosoma haya pasado a la membrana, _,mdón combinada de la SRP y del receptor de la ? habrá concluido. Después se reciclan y son li-> para fomentar la asociación de otro polipéprído · jente con la membrana. Este proceso puede ser necesario para contro.a conformación de la proteína. Si la proteína ' jeme fuera liberada en el citoplasma, adquiriría .a conformación que no le permitiría atravesar la : mbrana, por lo tamo, la capacidad de la SRP para :ibir la traducción mientras el ribosoma es entre -- _:o a la membrana es imponanre para evitar que _,roteína sea liberada en el ambiente acuoso. El péptido señal es separado de una proteína en .;aslocación por un complej o de cinco proteínas . 'laminado peptidasa señal, que suele ser más .mdante que la SRP y que su receptOr, casi equi : ,e a la cantidad de ribosomas unidos, lo cual su- ~!"e que su capacidad de funcionamiento es estruc~al. Dicho complejo se localiza en la cara luminal la membrana del ER, lo cual implica que tOda la :\.-uencia de señal debe atravesar la membrana an~ de que ocurra la división. En las eubacrerias, las ·.:haea y las euca.tiotas pueden reconocerse peptía sas de señal homólogas.

La interacción emre la SRP y su receptor es elevento principal de la traducción eucariótica que transfiere un ribosoma que pona a una proteína naciente a la membrana. Las bacterias tienen un sistema de interacción análogo, aunque su función está más restringida. La SRP es un complejo ribonucleoproteínico llS que contiene seis proteínas (con una masa toral de 240 kD) y un RNA 7$ pequei'io (de 305 bases, lOO kD). En la se muestra que el RNA 7$ proporciona el esqueleto a la partícula; las proteínas no se ensamblan si .no está preseme. El RNA 7S de la SRP se divide en dos panes; las 100 bases del extremo 5' y las 45 del extremo 3'

Cara íntema del EA

Cara

El ribosoma inicia la síntesis proteínica en el mANA ''libre"

j

crtosOII~

y .., ...,

~Líder ~

Receptor

La SRP se adhiere a la secuencia líder; se interrumpe la traducción

-~ delaSRP ~ 'SRP ~

La SRP se une al receptor respectivo; el ribosoma se adhiere a la membrana; se reinicia la traducción

La secuencia líder entra a la membrana

La proteína pasa a través de la membrana; el líder es dlvfdido; continúa la traducción

La SRP interactúa con el receptor de la SRP ; •• llc.qll~l~ 111 incipales

La prote1na es secretada a través de la membrana; las subunidades ribosómicas son liberadas del mANA

• la "SRP es un complejo formado por RNA 75 y seís proteínas. El equivalente bacteriano de la SRP es un complejo formado por RNA 4.SS y dos proteínas. El receptor de la SRP es un dímero. La hidrólisis de GTP libera a la SRP de su receptor después de su i nteracción.

Los ribosomas que sintetizan proteínas secretoras están adheridos a la membrana por medio de la secuencia de señal localizada en el polipéptido naciente.

Jl

1

La SRP interactúa con el receptor de la SRP

229

..,_ _ _ _ _ 23-24 nm _ _ _ _ _..,.

t

,._Dominio Alu RNA+ . _ Dominio S

E

e

l , ,lf

.4<"JIDIJJ.')~ ~ ~ SAP9/14

~ ~ síB?

La secuencia de señal emerge del rlbosoma; la SRP se aproxima en conformación extendida

ANA~

Dominio IV -

Secuencia de señal

SAPS!f

SRP68~2

SRP54

SRP19 l..)n\ól'l con

SRP1 9 -'2

\Ot

Bisagra ~

~ ~b ~ o_,o

;

'(~ ¡,. ·

d'($1,%. "~/ "19_,

~

l

SRP19

SRP68/72 SRP54M

1

SRP54NG Secuencia de señal

230

SRP54

La SRP se une a la secuencia de señal y se dobla en la bisagra para contactar al ribosoma

El RNA 75 de la SRP tiene dos dominios. Las proteínas se unen como se muestra en el diagrama bidimensional (arriba) para formar la estructura cristalina que se muestra abajo. Cada función de la SRP está asociada con una parte discreta de la estructura.

La SRP se une a una secuencia de señal tan pronto emerge del ribosoma. La unión provoca que la SRP cambie de conformación y se doble en la "bisagra", de modo de permitir que la SRP54 entre en contacto con el ribosoma en el sitio de salida de la proteína, en tanto que la SRP19 fo rma un segundo conjunto de contactos.

están estrechamente relacionadas con la secuencia de Alu RNA, un pequeño RNA común en los mamíferos, de modo que definen al dominio Alu. La parte restante del RNAforma el d omittio S. Las diferentes partes de la estructura de la SRP representadas en la figura 10.18 desempeñan funciones independientes en la asignación de las protemas. La SRP54 es la subunidad más importante; se localiza en un extremo de la estructura de RNA y es responsable directa de reconocer al sustrato proteínico por la unión con la secuencia de señaL además de que se une al receptor de la SRP junto con el dímero SRP68-SRP72 localizado en la región central del RNA. El dímero SRP9-SRP14 está en el otro extremo de la molécula y se encarga de la interrupción de la elongación. La SRP es una estructura flexible que en su forma libre (separada de la secuencia de señal) es bastante amplia, como se observa en la estructura cristalina de la figura 10. 18. En la se muestra que la unión con una secuencia de señal desencadena un cambio conformacional. La proreína se dobla en una bisagra para permitir que el extremo SRP54 haga contacto con el rlbosoma en el sitio de salida de la proteína, mientras que la SRP19

se balancea para contactar al ribosoma en el sitio de unión con el factor de elongación, lo cual le permite provocar la interrupción de la elongación y dar tiempo a la asignación del sitio de rranslocación en la membrana. El receptor de la SRP es un climero que contiene subunidades SRo: (de 72kD) y SR~ (de 30 kD). La subunidad ~es una proteú1a integral de membrana. El extremo N de la subunidad o: grande es a nclado por la subunidad ~ · El grueso de la proteína o: sobresale hacia el citosol. Gran parte de la secuencia de la región dtoplásrnica de la proteína se asemeja a una proteína de unión con ácido nucleico con m uchos residuos positivos. Lo cual sugiere la posibilidad de que el receptor de la SRP reconozca al RNA 75 de la SRP. En las bacterias hay una contraparte de la SRP, aunque contiene menos componentes; B. coli, por ejemplo, tiene un RNA 4.55 que se asocia con los ribosomas y es homólogo del RNA 7S de la SRP. Se asocia con dos proteínas, Fth es homóloga de la SRP54 y FtsY, de la subunidad o: del recep tor de la SRP. De hecho, la FtsY remplaza las funciones de las subunidades a y ~ de la SRP; su dominio terminal N sustituye a la SRP~ en la asignación de

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

.brana y el dominio termjnal e interactúa con ·oteína diana . La función de este complejo es limitada que la del complejo formado por el ~tor de la SRP y la SRP; quizá sea necesario para -:ener a algunas proteínas secretadas (aunque a rodas) en una conformación que les permiteracruar con el mecanismo de secreción. Ésta ;a ser la conexión original emre la síntesis proca y la secreción; en las eucariotas, la SRP ha • irido las funciones adicionales de provocar la rrupción de la traducción y permitir el acceso a embrana. : Por qué la SRP debe tener un componente de ? La respuesta debe estar en la evolución de la debe haberse originado muy al principio de olución, en un mundo dominado por el RNA. um iblemente en conjunto con un ribosoma cuJnciones eran responsabilidad principalmente 0 u'fA. La estructura cristalina del complejo entre minio de unión con la proteína del RNA 4.55 Je unión con el RNA de la Ffh sugiere que el ~. sigue desempeñando algún papel en la función ~ SRP. El RNA 4.55 tiene una región (dominio JV) muy .ar a l dominio TV del RNA 75 (véase la ~ 0.18). La Fth está formada por tres dominios .G y M ). El dominio M (asf llamado por su alto .enido de moléculas de metionina) realiza las dpales funciones de unión . Tiene una cavidad ·"ifoba que se une a la secuencia de señal de ~ roteína <.liana. Las cadenas laterales hidrófoe los residuos de merionina crean la cavidad ..oyectarsc en una hendidura de la estructura proteína. Junto a la cavidad se encuentra un ento hélice-vuelta-hélice típico de las proteíje unión con el DNA (véase la sección 14.11, El ·.:sor utiliza un elemento hélice-vLlelta-hélice : unirse al DNA). : a estructura cristalina muestra que la estruc. hélice-lazo-hélice del dominio M se une a una . 'n dúplex del RNA 4.5$ en el dominio IV. El es c:to del RNA targado negativamente está j unto . .:avidad hidrófoba, lo cual s ugiere la posibilidad Je una secuenda de señal de hecho se un a a :omponentes proteínicos y de RNA de la SRP. ;;ecuencias cargadas positivamente que inidan :rueocia de señal (véase la Fig. 10.16) podrían ·actuar con el RNA, mientras que la región hi•ba de la secuencia de señal podría postrarse :cavidad. :.a hidr6Hsis de GTP tiene una función impor~ en la inserción de la secuencia de señal a la .brana. La SRP y su receptor tienen capacidad -:asa. La subunidad de unión con la señal de la ~ SRPS4, es una GTPasa. Las dos unidades del re-..,r de la SRP son GTPasas. Todas las actividades

la SRP transporta GDP cuando se une a la secuencia de señal. El ribosoma hace que la GDP sea remplazada por GTP.

RETfCULO ENDOPLÁSMICO

'

\ GTP GTP

GDP ~

CITOSOL - GDP

La SRP y su receptor hidrolizan GTP cuando la secuencia de señal es transferida a la membrana.

GTPasa son necesarias para que una proteína naciente sea transferida a la membrana. En la se muestra que la SRP empieza con GDP cuando se une a la secuencia de señal y posteriormente el ribosoma estimula el remplazo del GDP por GTP. La sen1encia de señal inhibe la hidrólisis de GTP con lo que asegura c¡ue a l complejo se le haya urudo GTP cuando encuentre al receptor de la SRP . Para que la proteína naciente sea transferida de la SRP a la membrana, la SRP debe ser liberada de su recepto r. En la se muestra que para ello es necesario que se hayan hidrolizado las moléculas ele GTP de la SRP y de su receptor. La reacción se ha caracterizado en el sistema bacteriano, donde tiene la característica inusual de que la Ffh active la hidrólísis mediada por FtsY, y la FtsY active recíprocamente la hidrólisis mediada por la F(h.

Er!D

El tras locón forma un poro

Conceptos principales • El complejo trimérico Sec61 proporciona el canal para que pasen proteínas a través de una membrana. • Una proteína transferente pasa directamente del ribosoma al traslocón sin exponerse al citosol.

Hay un problema básico en el paso de una proteína hidrofUica (en gran medida) a través de una membrana hidró[oba. La eoergélica de la interacción entre la proteína cargada y los Jípidos hidrófobos es 10. O El traslocón forma un poro

231

Sello en la porción lt.lminal

R.ETÍCULO ENDOPLÁSMICO

CITOSOL El poro contiene

un canal acuoso

El traslocón es un trímero de Sec61 que forma un canal a través de la membrana. Está sellado en la porción lominat (del ER).

muy desfavorable. Sin embargo, una proteína en proceso de translocación a través de la membrana del ER puede ser extraída por agentes de desnaturalización efectivos en un ambiente acuoso, que no son Jos que extraen las proteínas que son compo nentes residentes de la membrana, fenómeno que sugiere el modelo de translocacíón que se ilustra en la , en el cual las proteínas que for man parte de la membrana del ER constituyen un canal acuoso a través de la bicapa. Una proteína en proceso de translocaéión se desplaza por este canal e interactúa con las proteínas residentes, no con la bicapa de lípidos. El canal es sellado en el lado luminal para detener la transferencia libre de iones entre el ER y el cirosol. El canal que atraviesa la membrana se deno mina traslocón. Sm componentes se han identificado de dos formas: las proteínas que residen en la membrana del ER entrecruzadas con proteínas t.ransferemes son subunidades potenciales del canal y los mura mes sec de las levaduras (así llamados porque son incapaces de secretar proteínas} incluyen una clase que provoca que los precursores de las proteínas de secreción o de la mernbnma se acumulen en el cirosol. Mediante estos métodos juntos se idemificó el complejo Sec61, formado por tres proteínas transmembrana, Sec6 l o:, p y y. Sec6 1 es el componente principal del rras1ocón. En detergente (que proporciona un ambiente hidrófobo que imita el efecto de una membrana circundante}¡ el Sec6l forma oligómeros cilíndricos con un diámetro de -85 A y un poro cen tral de -20 Á, cada uno de los cuales consta de cuatro heterotrímeros. En todos los organismos se encuen.tra una estructura trimérica similar para el canal, que en las bacterias y las archaea se denomina complejo SecY. La subunidad Sec6lo: (o la SecY correspondiente de las bacterias/archaea) proporciona el poro a través 232

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

del cual pasa la proteína, y es la mejor conservada en cuanto a secuencia. El poro se crea a panir dt dín1eros del complejo trimérico organizados ininterrumpidamente de manera que las subunidades a se fus ionan en un solo canal. Un complejo de canal de la membrana puede contener dos dímeros, probable· mente organizados lado a lado, aunque el ribosomé sólo puede acceder a uno en un momento dado. ¿El canal es una estructura preexistente (comt'" se implica en la figura) o puede ser ensambladc como respuesta a la asociación entre una secuenci~ de señal hidrófoba y la bícapa de lípídos? Los canales pueden ser detectados por su capacidad para permitir el paso de iones (medida como un cambio localizado en la conducción eléctrica). En la membrana de ER pueden ser detectados canales conductore! de iones, y su estado depende de la translocaciór proteínica, lo cual demuestra que el canal es una característica permanente de la membrana. Un canal se abre cuando un polipéptído naciente es transferido de un übosoma a la p1embrana del ER. La proteína transferente llena el canal por completo, de manera que los iones son incapaces de atravesar durante la u·anslocación, pero si la proteína es liberada mediante tratamiento con puromiclna, el canal se torna permeable. Si los ribosoma~ son eliminados de la membxana, el canal se cierra lo cual sugiere que el estado de abieno exige y 1.. presencia del ribosoma y que el canal es controlad• en respuesta a una proteína rransferente. La medición de la capacidad de entrada al cana . de los agentes de desactivación de fluoresce ncia de di(erentes tamaños sugiere que es grande, con ur. diámetro interno de 40 A a -60 Á, mucho mayoque el de un fragm ento de proteína a helicoídal, : también es más grande que el poro que se observ • en perspectivas visuales directas del canal, discrepancia que aún debe ser explicada. El ambiente acuoso de un aminoácido en un.;. proteína puede med irse incorporando aminoácido variables con residuos fororreactivos. La fluorescel1cia de estos residuos indica si se encuentran er. un ambiente acuoso o en un medio hidrófobo. Et! experimentos con dichas sondas se ha observad< que cuando se sintetiza inicialmente la secuencia de señal en el rlbosoma, se encuentra en un estad acuoso, pero es inaccesible para los iones del cítoso permanece en estado acuoso durante su interacci61. con una membrana; esto sugiere que la proteína transfereme viaja directamente de un túnel induid1 en el ribosoma al interior de un canal acuoso localizado en la membrana. De hecho, el acceso al poro es controlado ~ "cercado") en ambos lados de la membrana, ame-· de que se una el ribosoma, el poro se cierra de. lado luminal. Eh la se muestra que.

_dherirse el ribosoma, sella al poro del lado del sol. Cuando la proteína n aciente alcanza una gitud de -70 aminoácidos, muy probablemente .mdo se extiende por completo a través del canaL oro se abre del lado lum.inaL de modo que. en 1 momento está cerrado de un lado o del otro. meniendo las integridades iónicas de cada com..-imiento. El traslocón es versátil y puede ~er utilizado por .eínas transferemes de mucha maneras: • Es el medio por el cual las proteínas nacientes son u·ansferidas de los ribosomas citosólicos al lumen del ER (véase la sección 10.11, La translocación requiere de inserción en el traslocón y [en ocasiones] de un trinquete en el ER). • También es la ruta por la cual las proteínas integrales de la membrana del sistema ER son transferidas a la membrana, para lo cual es necesario que el canal se abra o desagregue en alguna forma desconocida. de manera que la prQ[eína se pueda desplazar lateralmente dentro de la bicapa de lípidos (véase la sección 10.15, ¿Cómo se insertan las proteínas en las membranas?). • Las proteínas también pueden ser transferidas del ER al citosol, evento que se conoce como rranslocadón i.nversa (véase la sección 10.12, La translocación inversa envía proteínas al citosol para que sean degradadas).

La translocación requiere de inserción en el traslocón y (en ocasiones) de un trinquete en el ER , - , t•pto~ p1 i 1cipales - ribosoma, la SRP y el receptor de la SRP bastan para -sertar una proteína naciente en un traslocón. -3s proteínas que se insertan después de la traducción .:¡uieren de componentes adicionales en el citosol y -t. BiP en el ER. : BiP es un trinquete que evita que una proteína se slice hada atrás.

.:slocón y el receptor de la SRP son los campoes básicos de la translocación cmraduccional. Jo el complejo Sec6J. es incorporado a mem') artificiales con el receptor de la SRP, puede ... ar la rranslocación de proteínas nacientes, 1tras requieren de la presencia de un compoadicionaL la proteína de membrana asociada _ polipéptido de translocación (TRAM, crans.:l chain-associating membrane). una proteína

AETfCULO ENOOPLÁSMICO

--...__ El ribosoma sella el lado citosólico CITOSOL

Una proteína naciente es transferida directamente del ribosoma al traslocón. El ribosoma sella el canal en el lado citosólico.

CITOSOL

La translocación requiere de traslocón, SRP, receptor de SRP, Sec61, TRA~I y peptidasa señal.

mayor que se entrecruza con una cadena transferente naciente. La TRAM estimula la translocación de todas las proteínas. Lo~ componentes del trasloc6n y sus funcio nes se resumen en la . La sencillez de este sistema genera varios puntos importantes. El Sec61 se visualiza como parte del canal y también interactuando con el ribosoma. La asignación inicial se realiza cuando la SRP reconoce la secuencia de señal con1orme empieza a emerger del ribosoma la proteína recién sintetizada y se une a su receptor, y la secuencia de señal es transferida al traslocón. Cuando esta última entra al traslocón, el ribosoma se ad.luere al Sec61 para formar un sello que impide que el poro sea expuesto al citosol. En este sistema no ocurre la separación del péptido señal, de modo que no puede ser necesaria por sí misma para la translocación. En este sistema no se necesitan los

10.11 La translocación requiere de inserción en el traslocón y (en ocasiones) de un trinquete en el ER

233

RETfCULO ENDOPLÁSMICO

CITOSOL

CITOSOL

El BiP hace las veces de trinquete para evitar la difusión hacia atrás de una proteína transferente.

componentes del lado !u minal de la membrana para la translocación. Por supuesro, la eficiencia del sistema in vitro es relativamente baja, pues in vivo pueden requerirse otros componentes para lograr una transferencia eficiente o para evitar que otras proteínas celu lares interfieran con el proceso. En ciertos casos en que se inserta una proteína en una membrana de manera postraduccio nal, se necesita un mecanismo más complicado. El m.ismo complejo Sec61 forma al canal, pero también son necesarias otras cuatro proteínas Sec, además del chaperón BiP (miembro de la clase Hsp70) y del abastedmiemo de ATP en el lado lum.inal de la membrana. En la se muesn·a que el chaperón BiP se comporta como un trinquete, que de no estar, el movimien to brovvn.iano perm itirá que la proteína se deslice hacia atrás, al interior del citosol. En caso contrario, afianza a la proteína dentro del ER conforme sale del poro e impide que se desplace hacía atrás. El BiP no jala a la proteína, sólo evita que se deslice hacia atrás. (La razón de que se necesite Bü> para la translocación posrraduccionaL pero no para la cotraduccional, puede ser que una p ro teína recién sintetizada es extraída continuamente del ribosoma y, por lo tanto, es incapaz de deslizarse hacia atrás.)

E

La t ra nslocación inversa envía proteínas al citosol para que sean degradadas

Concepto principal • Los t raslocones Sec61 pueden utilizarse para la translocación inversa de proteínas del ER al citosol.

234

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

La translocación inversa utiliza el traslocír para enviar I,J n(l proteína desp\egada del ER al citosol, t;londe es degradada. Se desconoce el mecanismo para orientar ; t raslocón en reversa.

En el ER tienen lugar varias actividades importantes. Las proteínas se desplazan a través del ERrumbo a dJversos destinos, glucosiladas y plegadas en s L conformación final. El ER p roporciona un sistema de "control de calidad" por el cual se identifican ·. degradan las proteínas plegadas de forma errónea No obstante, la degradación no sucede en el ER, ~ podría ser necesario que la proteína se exportara nuevamente al citosoL La primera indicación de que las proteínas de ER son degradas en el citosol y no en el BR mismr provino de evidencias de implicación del proteasoma, agregado proteínico grande con numerosa< actividades proteolíticas. Los in hibidores del proteasoma evitan la degradación de proteínas aberran te~ del ER . Las proteínas por degradar son marcadas po: el proteasoma cuando son modificadas por la adición de ubiquitina, pequeña cadena polipeptidica. El punto importante es que la aclidón de ubiquitina y la degradación por proteasomas ocurren en el citosol (y una proporción menor e n el núcleo) . El transporte del ER al citosol se debe a la inversión del proceso usual de importació¡1, al que se le llama translocación inversa (en ocasiones también se le llama retrotranslocación o clislocación) para la cual se utiliza el traslocón Sec61. Las concliciones son distintas; por ejemplo. el rraslocón no está asociado con un ribosoma. Algunas m utaciones del Sec6 1 impiden la translocación inversa, pero no la transiocación ordenada, quizá por diferencias en el proceso o (muy probablemente) porque estas regiones interactúan con otros componentes necesarios para la translocación inversa. En la se señala que se desconoce la forma en que se abre el canal para permitir la inserción de la p roteína en el lado del ER; presu m iblemente están implicados componentes especia les. Un modelo consiste en que los chaperones reconocen las pro temas mal ensambladas o plegadas

- róneamcnte y las transfieren al traslocón. En un -o específico. el citomega lovirus (CMV) humano lifica a proteínas citosóücas que destruyen a pronas clase I del complejo mayor de histOcompariidad (MH C, majar hiszocompatibility complex) redén lletizadas. para lo cual se necesita un producto 1teínico vírico (el US 11 ), el cual es una proteína . membrana que funciona en el ER interactúa con proteínas del MHC y probablemente las rransrta al traslocón para la rranslocación inversa. El sistema implicado en la degradación de pro'las aberrantes del ER puede ser identificado me~"lte mutaciones (e o las levaduras) que conducen 1 acumuladón de las mismas. En la mayoría de ·casos, una proteína que se pliega erróneamente .-,>ducida por un gen mutame) es degradada y no "nsportada a través del ER. Los mutantes de leva.as incapaces de degradar al sustrato se clasifican los grupos, los que identifican a componentes - mecanismo proteolítico. corno las enzimas invo.:'!adas en la adición de ubiquitina. y los que iden..an a componentes del mecanismo de transpone. :.uidos Sec6 1, Bip y Sec63. Las proteínas in volucradas en el sistema tamn han sido identificadas por sus interacciones el sistema del CMV. cuya proteína USll pasa <; susrraros del MHC a una proteína denomina- )erlin que se localiza en la membrana del ER. noteína Derlin, a su vez, pasa a los suslralos a ~ ATPasa citosólica llamada p97. la cual proba'Jleme es responsable de sacarlos del canal, hacia ....oso!. La proteína Derün es un homólogo de la -~p de las levaduras, una de las proteínas idenadas por mutaciones corno parte del sist~rna de .5locación inversa.

Las proteínas residen en las membranas por medio de regiones hidrófobas J<~ptos

principales

_3s proteínas del grupo 1 tienen al grupo terminal N en extremo distante de la membrana y Las del grupo II esentan una orientación opuesta .

~

- gunas proteínas tienen múltiples dominios :•osmembrana.

las membranas biológicas contienen proteíetenidas en la bkapa de lípidos por medio de ~acciones no covalentes. La defirúción operaJI de una p roteína integral d e membrana _e requiere de la discontinuidad de la bicapa de .s para ser liberada de la membrana. Una cara cica común de dichas proteínas es la presencia

JS

Las protelnas del grupo 1tienen el extremo N en el lado distante y el extremo e en el citosol Ell1remo N EXTERIOR

eiTOSOL

e

Extremo Las protelnas del grupo 11 tienen el extremo e en el lado distante y el N en el cltosol ExlremoC EXTERIOR

eJTOSOL

Extremo N las proteínas transmembrana del grupo I y del grupo II tienen orientaciones opuestas respecto de la membrana.

de por lo meno~ un dominio transm embrana, formado por un fragmento a-helkoidal de 21 a 26 aminoácidos hidrófobos. Una secuencia que cumpla con los criterios para la inserdón en la membrana puede idemificarse por medio de un diagrama de hidropatía, el cual mide la hidrofobicidad acumulativa de un fragmento de aminoácidos. Una proteína que tiene dom inios expuestos en ambos lados de la membrana se denomina proteína transmembrana . La asociación de una proteína co n una. membrana adopta diferentes formas, y esta topografía depende del n úmero y de la distribudón de las regiones rransmembrana. Cuando una proteína tiene Wla sola región transmembrana, su posición determina la porción que se expond rá a un lado y otro de la membrana. Una proteína puede tener extensos dominios expuestos a ambos lados de la membrana o un sitio de inserción cerca de un extremo, de manera que en un lado se expone muy poco material, en su caso. La longitud de la cola terminal N o terminal e que sobresale de la membrana. cerca del sitio de inserción, puede ser insignificante o de dimensiones considerables. En la se muestra que las proteínas con un solo dominio transmernbrana se agrupan en dos clases; las del grupo 1, en las cuales el grupo terminal N apunta hacia el espacio exlracelular, son más comunes que Las del grupo ll, en las cuales

10. 13 las proteí nas residen en las membranas por medio de regiones hidrófobas

235

Las proteínas que tienen un número impar de dominios transmembrana 1ienen los ex1remos N y e en lados opuestos

Las proteínas con un número par de dominios transmembrana tienen los ex1remos N y C del mismo lado

La orientación de Los extremos de las proteínas con múltiples segmentos transmembrana depende de que haya un número par o impar de segmentos transmembrana.

la orientación ha sido invertida, de manera que el grupo termjnal N apunta hacia e1 citoplasma. La orientación se determina durante la inserción de la proteína en el ER. En la se muestra la orientación de las proteínas que úenen múltiples dominios transmembrana. Un número impar significa que ambos extremos de la proteína están en lados opuestos de la membrana, mientras que un número par implica que los extremos se encuentran del mismo lado. La extensión de los dominios expuestos en uno o ambos lados depende de la localización de los dominios transmembrana; los que están en uno u otro extremo pueden estar expuestos, y las secuencias internas ubicadas entre dominios forman "lazos" en el espacio cx tracelular o en el citoplasma. Un tipo común de estructura es el pasaje de siete dominios transmembrana. o receptor "serpentina"; otro es el pasaje de 12 dominios transmembrana que forma parte de un canal de iones. ¿Un dominio transmembrana desempeña un papel importante en la función proteínica, además de permitir que la proteína se inserte en la bicapa de lípidos? En las proteínas simples del grupo I o del IL tiene poco qué hacer, y con frecuencia puede ser remplazado por cualquier otro dominio transmem~36

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

brana. Sin embargo, estos últimos desempeñan un papel importante en la función de las proteínas que atraviesan varias veces la membrana o que tienen subun.idades que se oligomerizan dentro de la membrana. En tales casos, los dominios nansmembrana a menudo contienen residuos polares, los cuales no se encuentran en los domiruos individuales transmembrana de las proteínas del grupo I ni en las del grupo TI. Las regiones polares de los dominios rransmembrana no interactúan con la bicapa de lípidos, interactúan entre sí, lo que les permi te formar un poro o canal polar dentro de la bicapa de lípidos. La interacción entre ruchos dominios transmembrana puede crear un pasaje hidrofQico por el interior hidrófobo de la membrana y permitir que las moléculas o los iones altamente cargados pasen a través de la membrana, además de ser importante para la función de los canales de iones y el transporte de los ligandos. Otro caso en el que la conformación de los dominios transmembrana es importante, es el de ciertos receprores que se unen a ligandos lipoJílicos. en cuyo caso, los dominios transmembrana (y no los dominios extracelularcs) se unen a Jos ligandos dentro del plano de la membrana.

Las secuencias de anclaje determinan la orientación de las proteínas ( onceptos ptintipi!les • Una secuencia de anclaje detiene el paso de una proteína a través del traslocón. Habitualmente esta secuencia se localiza en el extremo Cy resulta en una orientación de grupo I en la cual el extremo N ha pasado a través de la membrana. Para insertar una proteína en la membrana y anclar el sitio de inserción puede utilizarse una secuencia combinada ancla-señal. Típicamente, esto es interno y resulta en una orientación de grupo 1I en la cual el extremo N es citosólico.

Las proteínas secretadas por la célula atraviesan la membrana mienrras permanecen en el canal acuoso del traslocón, por el contrario, las que residen en las membranas empiezan el proceso de la misma manera, pero después se transfieren del canal acuoso al interior del ambiente hidrófobo. El reto al explicar la inserción de proteínas en el interior de las membranas es diferenciar a las proteínas transmembrana de las secretadas y encontrar la causa de esta transferencia. La rura por la cual las proteínas de tipo 1 o de tipo II son insertadas en la membrana es igual a la ruta inicial de las proteínas secretOras, basada en una secuencia de señal que funciona de forma co-

uccional. Sin embargo, las proteínas que deben '1nanecer en la membrana poseen una segunda -..al de parada de transferencia que asume la ta de un agruparnienro de aminoácidos hidrófoadyacentes a algunos residuos iónicos. El agruüemo sirve como ancla para enganchar la proa en la membrana y evitar que pase. Una propiedad sorprendente de las secuencias .,nclajc es que funcionan como secuencias de - 1 cuando se forman en una localización difec. Cuando se coloca en una proteína que carece -ras señales. dicha secuencia suele favorecer la ; locación membrana!. Una explicación posible -stos res u Ira dos es e¡ u e la secuencia de señal y ~:cuencia de anclaje inreractúan con a lg unos .ponentes comunes del mecanismo de translo'm. La unión de la secuencia de ser'lal inicia la ~ locación, aunque la aparición de la secuencia ~nclaje desplaza a la secuencia de señal y detiene ansfereocia. :.a inserción de la membrana empieza con la ción de una secuencia de señal en forma de un de horquilla en el que el grupo terminal N perece en el lado citoplásmico. Dos características _.minan la posición y la orientación de una proen la membrana: Ja separación de la secuencia .::ñal y la localización de la secuencia de ancla. :.a inserción de las proteínas tipo l se ilustra en . La secuencia de señal es terminal N, JCalización de la secuencia de anclaje determimomemo en que se detiene la transferencia .; proteína. Cuando esta secuencia se arraiga en embrana, los dominios localizados en ei lado =nal N estarán en el lumen, mientras que los , !zados en el lado C, apuntarán al citosol. ·.:na localización común para una secuencia de ·Ja de transferencia es el extremo C. Como se _stra en la figura, la transferencia se detiene sólo .do las últimas secuencias de la proteína emran aembrana. Este tipo de distribución es respon: de la localización de numerosas proteínas en ..:mbrana, induidas Jas de la superficie celular. ayor pane de la secuencia de la proteína está esra en el lado luminal de la membrana, con .:ola pequeña o insignificante apuntando hacia - •sol. _as prOleínas tipo TI carecen de una secuencia Jivisible en el extremo del grupo N. En cambio, uencia de señal se combina con una secuencia :claje. Supue~tamente, la ruta general para la --ación de las proteínas tipo l en la membrana ...era los pasos ilustrados en la .•-uencia de señal emra a la membrana, pero las _11cias de señal y de anclaje unidas no pueden . v permanecerán en la membrana (quizá in .uando directamente con la bicapa de lípidos). lQ.J

1. La secuencia entra a la membrana

2. La señal es separada; la translocación continúa

3. La secuencia de anclaje interrumpe la transferencia

e las proteínas que residen en las membranas entran por la misma ruta que las secretadas, pero su transferencia es interrumpida cuando la secuencia de anclaje pasa a través de la membrana . Si el ancla se encuentra en el extremo C, el volumen de la proteina atraviesa la membrana y se expone en la superficie distante.

mientras que el resto del polipépüdo creciente continúa enrollándose en el ER. La secuencia señal-ancla suele ser imerna, y su localización determina las panes de la proteína que permanecerán en el citosol y las que serán exrracelula res. En esencia, todas las secuencias terminales N que preceden al complejo sei1al-ancla están expuestas en el cirosol, mt1y frecuentemente la cola cirosólica es corta. de -6 a 30 aminoácidos. En efectO, el extremo N es restringido, mientras que el restO de la proteína atraviesa la membrana, con lo cual se reviene la orientación de la proteína respecto de la membrana. Las secuencias señal-ancla combinadas de las proteínas tipo li se asemejan a las secuencias señal divisibles; en la se ilustra un ejemplo . Igual que en las secucncia5 divbibles, la composición de aminoácidos es más importante que la secuencía en sí. Las regiones localizadas en las extremidades de la secuencia señal-ancla portan cargas positivas;

Las secuencias de anclaje determinan la orientación de las proteínas

23 7

la región central no tiene carga y se parece al cenohidrófobo de un líder divisible. Las mutaciones que introducen aminoácidos cargados en la región central evitan la inserción en la membrana; las mutaciones localizadas a ambos lados evitan que funci one el ancla, de manera que la proteína es secretad¿ o colocada en un compartimiento incorrecto. La distribución de cargas en torno a la secuencia de anclaje produce un efecto importante en la orientación de la proteína. Normalmente hay más carga) positivas en el lado del citoplasma (lado terminal .de las proteínas tipo ll), pero si las cargas positiva son removidas por una mutación, la orientación de la proteína puede invertirse. El efecto de las carga' en la orientación se resume en la regla del "interiopositivo", la cual asevera que el lado del ancla cor las cargas más positivas se localizará en el citoplasma. En efecto, las cargas positivas proporcionan u:garfio que se engancha en el lado citoplásmico de la membrana, que a su vez controla la dirección er que se inserta la región hidrófoba, determinando aS' la orientación de la proteína.

1 . La secuencia señal-ancla entra a la membrana

2. La señal-ancla permanece y la translocación continúa

tro-.~

3. La translocación termina

E

¿Cómo se insertan las proteínas en las membranas?

Concepto principal • La transferencia de los dominios transmembrana del traslocón al interior de la bicapa de lípidos es activada por la interacción de la región transmembrana con el traslocón. Una secuencia combinada señal-ancla hace que una proteína invierta su orientación, de manera que el extremo N permanezca en la cara interna y el Cse exponga en la cara externa de la membrana.

,..... Met

Es razonable la comprensión de los procesos por lo• cuales las proteínas secretadas pasan a través de la' membranas y de cómo esto se relaciona con la inser-

t

--Iniciación

rtoolá,mioo' le

@/Se~

Región transmembrana

La secuencia combinada señal-ancla de la neuramidasa de la influenza se localiza en el extremo N y tiene un centro hidrófobo.

238

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

La protefna transferente se desplaza a través del canal

La protelna transmembrana reside en la bicapa de llpidos r

¿Cómo hace la transición una proteína trans-embrana y se desplaza a través de un canal proteínico para ~:eractuar directamente con la bicapa de lípidos?

ín de las proteínas del grupo L y del grupo D con dominio transroembrana individual. pero aún es posible explicar los detalles de la inserción de las oteínas con múltiples domirUos transmembrana. Se sabe cómo una proteína secretada atraviesa '"la m embrana sin problema, sin embargo. es más ícil aplicar el mismo modelo a una proteína que .side en la membrana. En la se ilustra Jifercncia entre la organizadón de una prore(na .msfercnte, protegida de la bicapa de lípidos por el m al acuoso, y la de una proteína transmembrana, ... e tiene un segmento hidrófobo en contacto cli-~o con la membrana . La pregunta clave es cómo transfiere una proteína del canal proteínico al :erior de la bicapa de lipidos. En la se sugiere la posibilidad de e baya un mecanismo que transfiera dominios .irófobos transmembrana directamente del canal nterior de la membrana. Esta idea está respaldada las observaciones de un sistema in vitro en el cual . midió la transferencia de proteínas con diferentes minios transmembran a aJ interior de un ambienipídico. Cuando el dominio pasó un umbral de ·rofobicidad, la proteína pudo pasar de un canal Sec61 y TRAM al interior de la bicapa de lípidos. emás de la hidrofobicidad global. la localización os residuos polares en los segmentos transmem .!na tiene un efecto importante. La explicación '1

Las proteínas de membrana recién sintetizadas son capaces de transferirse lateralmente del traslocón al interior de la bicapa de lípidos. Se desconoce el mecanismo de transferencia.

más sencilJa es que la estructura del canal permile que la proteína transferenre entre en contacto con la bicapa de lipidos, de manera que un segmento lo suficientemente hidrófobo pueda distribuirse de manera sencilla directa mente en ellípido. la estructura del traslocón sugiere que emre dos hélices podría haber una compuena para la transferencia. Siempre se ha supuesto que, independientemente del mecanismo exacto, la transferencia del segmento transmembrana al interior de la membrana es activada por la secuencia transmembrana qLte está en el poro. Sin embargo, los cambios del poro ocurren ames, como respuesta a la síntesis de la secuencia transmembrana en el ribosoma. Cuando una proteína secretada pasa a través del poro, el canal se mantiene sellado del lado del citosot pero se abre del lado Luminal después de la síntesis de los primeros 70 residuos. Tan pronto como se ha sintetizado completamente una secuencia transmembrana. en otras palabras, mientras está totalmenre dentro del ribosoma, el poro se cierra del lado tu minal. No sé sabe bien a bien cuál es la relación de este cambio con la transferencia de la secuenda transmcmbrana en el interior de la membrana. El proceso de inserción en una membrana ha sido caracterizado para las proteínas de tipo l y las de tipo IT, en las cuales hay un solo dominio transmembrana. ¿De qué manera se insena una proteína con múltiples regiones transmembrana en una membrana? Se sabe mucho menos acerca de este proceso, pero se supone que se basa en las secuen cias con capacidades de sei'ia l o de ancla. Un modelo consiste en suponer que hay una serie ahernante de secuencias de señal y de a ncla, y que la translocadón se inicia en la primera secuencia de señal y continúa hasta que es detenida por la primera secuencia de an claje. Después se reinicia mediante una secuencia de señal subsiguiente basta que la interrumpe la siguiente ancla. Es posible que haya 10.1; ¿Cómo se insertan las proteínas en las membranas?

239

varias rutas para la integración en la membrana, pues en algunos casos el dominio transmembrana parece desplazarse al interior de la bicapa de lípidos tan pronto entra al traslocón. En otros, sin embargo, puede presentarse una demora hasta que se hayan si~tetizado otras regiones transmembrana.

La inserción en la me mbrana después de la traducción depende de las secuencias líder Concepto principal

Las secuencias líder terminales N proporcionan la información que permite a las proteínas asociarse con las membranas de las mitocondrias o de los cloroplastos.

ORGANELO

La protefna pasa a través de la membrana y la secuencia líder es separada

Líder J Protelna madura

t

La secuencia líder se une al receptor en la membrana del organelo CITOSOL

rvvv Las secuencias líder permiten que las proteínas reconozcan las superficies de las mitocondrias o de los cloroplastes por medio de un proceso postraduccional.

Las mirocondrias y los cloroplastos sintetizan sólo a algunas de sus proteínas, las primeras sólo a -1 O y los segundos, a -50. La mayoría de las proteínas de los organelos es sintetizada en el citosol por e' mismo banco de ribosomas libres que sintetiza a las proteínas de éste; después deben ser importadas a! interior del organelo . Muchas proteínas que entran a Las mitocondrias o a los cloroplastos por un proceso postraduccionaJ tienen secuencias líder encargadas del reconocimiento primario de la membrana exterior del organelo. Como se muestra en el diagrama simplificadr de la , la secuencia líder inicia la interacción entre el precursor y la membrana del organelo, la proteína atraviesa la membrana y el líder e~ dividido por una proteasa en el lado del organelo. En general, los líderes de las proteínas importadas al interior de las mitocondrias y de los cloroplasLos tienen aminoácidos hidrófobos y básicos; están formados por fragmentos de aminoácidos sin carga interrumpidos por aminoácidos básicos y carecee de aminoácidos ácidos, hay poca homologfa de mro tipo, como en la . El reconocimiento de. líder no depende de su secuencia exacta, sino de su capacidad para formar hélices antipáticas, en la5 cuales una cara tiene aminoácidos hidrófobos y la otra, aminoácidos básicos. La secuencia líder contiene toda la informaciór n ecesaria para localizar una proteína de organelo. La capacidad de una secuencia líder puede evaluarse construyendo una proteína artificial en la cual e líder de una proteína de organelo se une con una del citosol. El experimento consiste en crear un ger híbrido que posteriormeme es traducido en la pro· teína híblida. Mediante estos experimentos se ha demostrado que numerosas secllencias líder son independientes para dirigirse a cualquier secuencia adherida a la mitocondria o al cloroplasto; por ejemplo, si la secuencia líder de la figura 10.35 está adherida a la proteína del citosol DHFR (dihidrofolato reductasa ) la DHFR estará en la mitocondria. La secuencia lfder y la proteína transportada representan dominios que se pliegan de manera inde-

+ Hidrófobo

Polar

Básico

Iniciación

+ r Treo

1

•Mef

+----

@(ser

!Ser

Señal de asignación a la matriz - - - - - .

La secuencia líder de la subunidad IV de la citocromo e oxidasa de las levaduras está formada por 25 aminoácidos neutros y básicos. Los primeros 12 son suficientes para transportar a la matriz mitocondrial cualquier polipéptido adherido. 240

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

-endiente. A pesar de la secuencia a la cual se adere, el líder debe poder plegarse en una estrucwra . '1ropiada para ser reconocido por los receptores de - envoltura del organelo . La secuencia polipeptídi: adherida no desempeña ninguna función en el <'onocimiento de la envoltura. ¿Qué restricciones se imponen al transporte de . :~a proteína hidrofílka a través de la membrana hiófoba? Una respuesta podría ser la observación de ~e el metotrexato, un ligando de la enzima DHFR, oquea el transpone al interior de la mitocoud.ria = la DHFR fusionada a un líder mitocondrial. La "1ión estrecha del metotrexato impide a la enzima !'splegarse cuando se transfiere a través de la rnem .:-ana. Para ser asignada, la secuencia de la proteína .msportada no tiene importancia, pero para seguir su líder a través de la membrana, de flexibilidad .na desplegarse. Para la rranslocación, la hidrólisis de ATP es ·.:esaria demro y fuera; podría tener que ver con "!!pujar la proteína desde el exterior y jalarla des: el interior. En caso de importación mitocondrial bacteriana, también se requiere de un potencial :!ctroquimico a través de la membrana interna · ra transferir la porción terminal N del líder.

Una jerarqu1a de secuencias determina la localización dentro de los organelos

que especifica su destino en el orga.nelo. Un líder formado por varias porciones contiene señales que funcionan de manera jerárquica, como se resume en la . La primera parte del líder dirige a la proteína al organelo. y necesita la segunda parte si su destino está en alguna parte ajena a la matriz. Las dos partes del líder son eliminadas por divisiones sucesivas. Ejemplo de ello es el citocromo el, que está unido a la membrana interna y apunta hacia el espacio intermembrana. Su secuencia líder está formada por 61 aminoácidos y puede dividirse en regiones con funciones distintas. La secuencia de los primeros 32 aminoácidos, o incluso la mitad terminal N

de esta reglón, puede transportar la DHFR a la matriz, de modo que la primera parte de la secuencia líder (los 32 aminoácidos terminales N) comprende una señal de asignación a la matriz. El líder intacto, sin embargo, lleva adherida una secuencia, por ejemplo, la DHFR murina, en el interior del espacio intermembrana. ¿Qué impide que la proteína rebase el espacio imermembrana si el líder está intacto? La región

~ Señal para

la membrana externa

Roceptoc

: c-oceptos :>rincipales La porción terminal N de una secuencia líder dirige a una proteína a la matriz mitocondrial o allumen del doroplasto. Una secuencia adyacente puede controlar la dirección a Jna membrana o a los espacios intermembranosos . ..as secuencias son divididas sucesivamente de la :>roteína.

mitocondria está rodeada de una envolwra for: la por dos membranas, y las proteínas importaal interior de las mitocond1ias pueden estar en 1 embrana externa, el espacio ímermembrana, la .mbrana interna o la matriz; cualquiera que forme --:e de una de las membranas. puede estar oriental e tal manera que apunte hacia un lado o hacia :ro. ¿Qué dirige a una proteína mitocondrial al . partintieuw apropiado? La ruta "predetermi_a" para una proteína importada al interior de .:. mítocondria es a través de las dos membranas, .a la matriz, propiedad que le confiere la por. termina l N de la secuencia líder. Una proteí.xaJjzada en el espacio intermembrana o en la ~ tnbrana interna requiere de una señal adicional

TOM~

E•pado ;monnombcana

Receptor TI M ~=--

Membrana externa

Señal para el espacio intermembrana

Las mitocondrias tienen receptores para el transporte proteínico en las membranas interna y externa. El reconocimiento en la membrana externa puede provocar el transporte a través de ambos receptores, al interior de la matriz, donde el líder es escindido. Si la proteína tiene una señal de asignación a ta membrana, puede ser reexportada.

10.17 Una jerarquía de secuencias determina la localización dentro de los organelos

241

Iniciación

+-1

Mel

1'1

Región líder cargada para la asignación a la mitocondria ----. + + + + 'Ser As~ e s-;,. ~ (Á¡ Trp Ala 'Gill fre 'ser'{Ut;

-

+ 'Gil Ser fÚS' Sen Ala Ala Gli

T~

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T~c) Ala t~ Se~ q.¡.

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Ala

División 2 El líder del cito cromo el de las levaduras contiene una región terminal Nque dirige la proteína a la mitocondria, seguida de una región que dirige a la proteína (dividida) a la membrana interna. Él líder es eliminado por dos eventos de división.

posterior aJa señal de asignación a la maLriz (formada por 19 am in oácidos del líder) proporciona otra señal que ubica a la proteína en la membrana interna o en el espacio intermembrana. Para fines de trabajo, esta señal se denomina señal de asignación a la membrana. La composición de las dos partes de un lider que contiene ambos tipos de señal es clislinta. Como se , los 35 aminoácidos terindica en la minales N son semejantes a otras secuencias Jider de los organelos en cuanto al alto contenido de aminoácidos sin carga intercalados con aminoácidos básicos, pero los siguientes 19 comprenden un fragmento ininterrumpido de aminoácidos sin carga lo suficientemente grande como para abarcar una bicapa de lfpidos. Esta señal de asignación a la membrana se asemeja a las secuencias impücadas en la translocación de las proteínas en el interior de las membranas del ER (véase la sección 10.7, Las secuencias de señal inician la translocación). La di.visión de la señal de asignación a la matriz es el único evento de procesamiento que necesitan las proteínas residentes en la matriz, señal que también debe separarse de las proteínas que residen en el espacio intermembrana; sin embargo, después de esta división, la señ.al de asignación a la membrana (que es ahora la secuenda terminal N de Ja proteína) dirige a la proteína a su destino en la membrana externa, el espacio intermembrana o 242

CAPÍTULO 10 l ocalización de las ptoteínas

la membrana interna. A su vez, la señal se clividir= posteriormente. L<1 señal de asignación a la matriz termina] . funciona de la misma manera en todas las proteú1a mitocondriales, al ser reconocida mediante un receptor de la membrana externa será transportada ~ través de las dos membranas. Nótese que el mism proceso está involucrado en la división de la señ.< de asignación a la matriz, a pesar del destino fin ¿ de la proteína. Esta proteasa es una enzima solub· . en agua y dependiente de Mg2 • que se localiza en · ~ ma triz. así que la secuencia termina l N debe lleg: a ésta, incluso si la proteina finalmente residirá e· el espacio intermembrana. La residencia en la matriz ocurre en ausen · de cualquiera otra señal, pero si hay una señal · asignación a la membrana. ésta se activará por ~ división de Ja sei'ia l de asignación a la matriz. Dt- ~ pués, la porción remanente del líder (que ahora ~ terminal N) provoca que la proteína se aloje en ~ destino D.nal. La naturaleza de la señal de asignación a membrana es motivo de controversia. Median un modelo se a·firma que tOda la proteína entra a matriz, después de lo cual la sel'ial de asignaciór la membrana hace que sea reexportada al interi o a través de la membrana interna. En un mod alrerno se propone que la secuencia de asignaci• a la membrana simp lemente evita que el resto

proteína siga al Jider a través de la membrana erna hasta el interior de la matriz. Independien11ente del modelo que se aplique, otra proteasa
:mbrana de tilacoides, hasta el lumen; en su camitas proteín as destLnadas a las membranas de los :coides o allumen deben atravesar el estroma. Las señales de asignación de los cloroplastos asemejan a las de las mitocondrias. El líder está , nado por -50 aminoácidos y la mitad terminal 1ermite reconocer la envoltura del cloroplasto. : re las posiciones 20 y 25 tiene lugar una división !'ante o después del paso a rravés de la envoltura, - modo que las proteÚ1as destinadas a la mem Jna de los tilacoides o al lumen tienen un líder ~al N nuevo que dirige el reconocimiento de 11embrana de los tilacoides. Son varios Jos sislas (cuando menos cuatro} del cloroplasto que .Jlizan la importación de proteínas al interior de "-1embrana de los tilacoides. Así pues, el principio general que rige el trans•e de las proteinas al interior de las rnitocondrias -= los cloroplastos consiste en que la porción tera l N del líder dirige a una proteína a la matriz organelo, y para ubicarla proteína en la merona externa, el espacio intermembrana o la .mbrana interna es necesaria u na secuencia adi:la l (dentro del lider).

Las membranas mitocondriales interna y externa tie nen traslocones disti ntos 1

--<eptos principales H transporte a través de las membranas mitocondriales 'nterna y externa utiliza diferentes complejos de -eceptores. El complejo TOM (membrana exterior) es un complejo ;¡rande en el que los sustratos proteínicos son dirigidos al canal Tom40 por uno de dos subcomplejos. -OS diferentes complejos TIM (membrana interna} se Jtilizan dependiendo de que el sustrato proteínico está :lirigido a la membrana interna o allumen. t.as proteínas pasan directamente del complejo TOM al complejo TIM.

10.18

Una proteína se aproxima al cloroplasto desde el citosol con un líder de -so residuos. La mitad terminal N del líder promueve el paso al interior de la envoltura o a través de ella hacia el estroma. La escisión ocurre durante el transporte a través de la envoltura.

CITOSOL Receptor Tom37, 71.70 Receptor Tom22,20

Tom5,6,7

Las proteínas TOM forma n un complejo de receptores, o varios, necesario para la translocación a través de la membrana mitocondrial externa.

Los receptores que median el transporte a través de cada membrana del cloroplasto y la mitocon dria son diferentes. En el primer caso se denomina TOC y TIC, en tanto que en las miLOcondrias son T OM y TIM, refriéndose a las membranas externa e inrema, respectivamente. El complejo TOM está formado por aproximadamente nueve proteínas, muchas de las cuales son proteínas integrales de membrana. En la se muestra un modelo general del complejo. El agregado TOM mide >500 kD, con un diámetro de -138 Á , y forma un canal conductor de iones. Un complejo cons ta de dos o tres anillos de 75 Á

Las membranas mitocondriales interna y externa tienen traslocones distintos

2 43

ESPACIO INTERMEMBRANA

nm1 7-23 =¿canal?

\

MATRIZ

Tim44 MGE

Las proteínas Tim forman el complejo de transtocación a través de la membrana mitocondrlal interna.

de diámetro, cada uno con un poro de 20 Á de diámetro. El Tom40 está incrustado profundamente en la membrana y proporciona el canal para la transloca ción. además de contactar a las proteínas conforme atraviesan la membrana externa y de unirse a u·es proteínas más pequeñas. Tom5. 6 y 7, que pueden ser componentes del canal o factores de ensamblaje. Hay dos subcomplejos que proporcionan recepto· res de superficie. Tom20 y Tom22 forman un subcomplejo con dominios expuestos en el dtosol. La mayoría de las proteínas importadas al ímerior de las rnitocondrias son reconocidas por el subcomplejo Tom20,22, receptor primario que recon oce a la secue ncia term inal N de la proteína transferente. Tom 37,70,7 1 proporciona un receprorpara un nú mero más reducido de proteínas que tienen secuencias de asignación imerna. Cuando una proteína es translocada a través del complejo TOM. pasa. de estar expuesta al dtosol a estar expuesta al espacio imermembrana. pero normalmeme no es liberada. sino transferida direcrameme al complejo TTM. Es posible capturar intermediarios en las cuales el líder es separado de la matriz por la proteasa. dejando gran parte del precursor expuesta en la superficie citosólica de la envoltura. lo cual sugiere que, durante el paso. una proteína abarca las dos membranas. Los complejos TOM y TIM no parecen interactua r directamente (o cuando menos no forman un estable complejo detectable). de modo que pueden esrar ligados nada más por una p roteína en tránsito. Cuando una proteína transfereme llega al espacio inrcrmembrana, de inmediato los residuos expuestos pueden unirse a un comple244

CAPÍTU LO 10 Localización de las proteínas

jo TIM, mientras que el resto de la p roteína sigt transfiriéndose a través del complejo TOM. En la membrana interna hay dos complejos TL de los cuales. Timl7·23 transfiere proteínas al!· men. Los sustratos son reconocidos porque posee una señal Lerminal N cargada positivameme. l; proteínas transmembrana Ti mI 7 a Tim23 forma el canal. En la se muestra que esta asociadas con la proteína Tim44 eo el lado de : matriz de la membran a. proteína que a su vez< une al chaperón Hsp70. asodado también con otr el Mge. conrraparre del GrpE bacteriano. Esta asv ciacíón garantiza que cuando la proteína importat: llegue a la matriz. se una al chaperón Hsp70. La graafiDidad del Hsp70 por la con fonnación no plegaa· de la proteína conform e emerge de la membran.; interna ayuda a "ja lar" ésta a través del canaL Una importante actividad del chaperón en ~­ matriz rnirocondria l proviene del Hsp60 (que fo-ma la misma clase de estructura que su contraparte GroEL} . La asociación con el Hsp60 es necesari· para la unión de las subunidades de proteínas importadas que forman complejos oligoméricos. Un: proteína importada puede ser "transmitida" deHsp70 al Hsp60 en el proceso de adquisición de L:; conformación correcta. El complejo Tim22-54 transfiere a proteína~ que residen en la membrana interna. ¿Cómo encuentra una proteína rransferente SLo camino del complejo TOM al complejo TIM apropiado? Dos complejos proteínicos localizados en e espacio imermembrana escoltan a una proteína que se transfiere del complejo TOM al TIM. Los comple· jos Tim9- l O y Tim8- I 3 fungen como escoltas de diferentes conjuntos de susuaws proteínicos. El Tim9-l e puede d irigir a sus su stratos al complejo Tim22 ·5~ o al Tim23-17. mientras que el complejo Tim813 los dirige sólo at Tim22-54. Algunos sustrato~ no utilizan el Tim9-l O ni el Tim8-1 3, de manera que también debe haber rutas, que se resumen en la ¿Cuál es la función de los complejos de escolta:' Tal vez sean necesarios para ayudar a la proteína a salir del complejo TOM, así como para reconocer a: complejo TTM. En la se m uestra que una proteína en proceso de transferencia puede pasar directamente del canal TOM al complejo Tim9IO y después al interior del cana l Tim22-54. Una proteína mitocondrial se pliega en diferentes condiciones ames y después de atravesar la membrana. Las condiciones iónicas y los chapexones presentes difieren en el citosol y la matriz mítocondrial, de modo que es posible que una proteína mitocondrial adquiera su co nfo rmación madura s6lo en la micocondria.

CITOSOL

TOM

Los peroxisomas emplean otro tipo de sistema de translocación Conceptos principales

ESPACIO INT ERMEMBRANA

Tim17-23

Tim22-54 MATRIZ

El complejo Tim9-10 lleva proteínas del TOMa :Jier complejo TIM, y TimS-13 a Tim22-54.

TOM

CITOSOL

MATRIZ

Una proteína transferente puede ser transpor:'rectamente de TOM a Tim22-54.

• las proteínas son importadas al interior de los peroxisomas en su estado de plegamiento completo. • Tienen una secuencia PTSl en el extremo Co una secuencia PTS2 en el extremo N. • El receptor Pex5p se une a la secuencia PTS1 y el Pex7p a la PTS2. • Los receptores son proteínas del citosol que transbordan al interior del peroxisoma portando un sustrato pro te! nico y después regresan al cítosol.

Los peroxisomas son cuerpos pequeños (de 0.5 a 1.5 lJin de diámetro) cubiertos por u na sola membrana que contienen enzimas implicadas en el uso del oxígeno que lo convierten en peróxido de hidrógeno al eliminar átomos de los sustratos. Posteriormente, la catalasa utiliza el peróxido de hidrógeno para oxidar diversos sustratos; sus actividades son cruciales para la célula. Desde que se encontró que la enfermedad fatal del síndrome de Zellweger es provocada por falta de peroxisomas, > 15 enfermedades humanas han sido vinculadas con trastornos de funcionamiento de los peroxisomas. Todos los componentes del peroxisoma son importados del cirosol; las proteínas necesarias para su formación se denominan peroxinas, y se han identificado 23 genes que las codifican. Por otra parte, se han localizado enfermedades del peroxisoma humano en 12 grupos de complementación, de las cuales, la mayoría se identifica con genes específicos. Los pcroxisomas parecen estar ausentes de las células con mutaciones nulas e n algunos de estos genes, que en ciertos casos reaparecen con la introducción de un gen de tipo silvestre. En genera l se supone que, igual que otros organelos unidos a membranas, los peroxisomas pueden surgir sólo por duplicación de peroxisomas preexistentes. Sin embargo, estos resultados despiertan la duda de si sería posible ensamblarlos de novo a partir de sus componemes. Cuando menos en algunos casos, la ausencia de peroxinas deja a las células con fantasmas peroxisómicos, o cuerpos membranosos vaáos. Incluso si no es fácil verlos, resulta difícil excluir la posibilidad de que haya remanentes que sirvan para regenerarlos. El transpone de las proteínas a los peroxisomas ocurre después de la traducción. Las proteínas importadas a la matriz tienen una de dos secuencias cortas, la sei1al de asignación peroxisómica 1 (PTS, peroximaltargeting signa!) y la PTS2. La PTS 1 es un

10.19 Los peroxisomas emplean otro tipo de sistema de translocación

245

túpéptido o tetrapéptido localizado en el extremo C que originalmente se caracterizó corno la secuencia SKL (Ser-Lis-Leu), pero se ha demostrado que una gran variedad de secuencias hacen las veces de una PTS l. La adición de una secuencia adecuada al extremo C de las proteínas del citosol es suficiente como para garantizar la importación al interior del organelo. La PTS2 es una secuencia de nueve aminoácidos, muy diversos, también en este caso, que puede locali zarse cerca del extremo N o internamente . Podría haber incluso un tercer tipo de secuencia, la PTS 3. Para la ilnportadón de proteínas desde el d tosol son necesarias numerosas proteínas peroxísómicas, cuyos receptores, ya unidos a los dos tipos de señales se llaman Pex5p y Pex7p, respectivamente. Las otras proteínas son parte de complejos asociados a membranas e involucrados en la reacción de translocación. El transporte al interior del peroxisoma exhibe características inusuales que marcan importantes diferencias del sistema utilizado para el transporte a otros organelos. Las proteínas pueden ser imp011adas al interior del peroxísoma en estado maduro, totalmente plegadas, lo cual con trasta con la necesidad de desplegar una prote[na para que se introduzca en el ER o la mitocondlia, donde se desplaza a través de un canal localizado en la membrana, en el interior del orga nelo, de forma semejante a una cadena desplegada de aminoáddos. Si bien no está claro de qué manera podría expandirse la estructura de un canal preexistente para permitirlo, una posibilidad sería resucitar una idea antigua y suponer que el canal se ensambla en torno al sustrato proteínico cuando se asada con la membrana. Los receptores Pex5p y Pex7p no son proteínas integrales de membrana, son más bien citosólicas, con sólo una pequeña proporción asociada con los peroxisomas. además de que se comportan de la misma manera, alternando entre el peroX-isoma y el citosol. En la se muestra que el recepwr se une al sustratO proteínico en el citosoL lo lleva al peroxisoma, se desplaza con él a través de la membrana hada el interior y después regresa al citosol para emprender otro ciclo. Este comportamiento de transbordador es semejante al sistema acarreador de importación hacia el interior del núcleo. Las rutas de importación convergen en la membrana del peroxisoma. donde Pex5p y Pex7p interactúan con el mismo complejo proteína-membrana fonnado por Pexl4p y Pexl3p. Los receptores se ensamblan a este complejo, y después, muchas otras peroxinas se involucran en el proceso de transportación allumen; los detalles del proceso aún no han sido aclarados. 246

CAPÍTU LO 10 Localización de las proteínas

El receptor Pex5p se une a un sustrato protlf~ nico en el citosol, lo transporta a través de la membrana haó el interior del peroxisoma y después regresa al cítosol.

Las proteú1as incorporadas a la membrana de perox:isoma llevan una s,ecuencia denominada mPT5 pero poco se sabe sobre el proceso de integraciór La Pex3p puede ser una proteína clave porque si n está presente, en Jas membranas de los peroxisomas no se encuentran otTas proteínas. Por otra parte Pex3p tiene su propia mPTS, que lleva a preguntars-_ cómo entra a la membrana, quizá interactúa con e Pex3p que ya se encu entra en ésta, lo cual influy en la duda respecto de que los peroxisomas puedaensamblarse de nuevo.

lE

Las bacterias utilizan tanto translocación cotraduccional como translocación postraduccional

Concepto principal • Las proteínas bacterianas exportadas a las membranas o a través de ellas utilizan mecanismos postraduccionales y cotraduccionales.

La envoltura bacteriana está formada por dos capa de membrana, y el espacio intermedio se conoce como periplasma. Las proteínas se exportan de citoplasma para que residan en la envoltura o sea; secretadas por la célula. Los mecanismos de secreción de las bacterias son similares a los caracteriza:-

_ en las células eucarióticas, con la posibilidad de :onocer aJgunos componemes reladonados . La muestra las proteínas exportadas del 1plasma con uno de cuatro destinos posibles: • ser insertadas en la men1brana interna • ser transferidas a través de la membrana interna para postrarse en eJ periplasma • ser insertada en la membrana externa o • ser nanslocadas a través de la membrana, hacia el medio. Varios de los complejos proteínicos de la mem : na interna son responsables del transpone de las teí:nas, ya sea que estén destinadas a atravesar 1embrana interna o a permanecer en ella. Esta ~a.ción es semejante a la observada en las mito- llrias, donde complejos diferentes de la membra- interna y de la externa manejan su bconjuntos ;ntos de sustratos proteínicos, dependiendo de ·estino (véase la sección 10.16, La inserción en la _-nbrana después de la traducción depende de las . . .endas líder). Una diferencia con la importación terior de los organelos esquela transferencia en :_,¡¡ puede ser cotraduccional o postraduccíonal. , _,nas protemas son secretadas de manera cotra:óonal o posrraduccional, y la cinética relativa - traducción frente a la secreción a LTavés de la _ nbrana podría determinar el balance. Las proteínas bacterianas exportadas tienen se_ncias líder terminales N con un extremo N hitJ1ico y un centro hidrófobo adyacente. El líder .:para mediante una peptidasa señal que recono3S formas precursoras de muchas proteínas ex-.adas. La peptidasa señal es una pro tema inLegral "lembrana localizada en la membrana interna. ;nutaciones que se producen en los líderes terales N evitan la secreción, y son suprimidas por _..:lciones de otros genes, que, por lo tamo, son :ridos como componentes del mecanismo de exación de proteínas. Muchos genes, de acuerdo .a descripdón generaJ del sec, están implicados .a codificación de componentes del mecanismo -etor por las mutaciones que bloquean la secrede muchas, o todas, las proteínas exportadas.

EL sistema Sec transporta proteínas al interior de la membrana interna y a través de ella -; €'ptos principales - traslocón bacteriano SecYEG de la membrana interna relacionado con el t ra slocón eucaríótico Sec61. :r la orientación de las proteínas secretadas al ::aslocón están implicados varios traslocones. ~

Proteína de la membrana

Proteína de la membrana ext¡.rna

Transporte protelnico .._ postraduccional 11 J

CITOPLASMA

/

.r

Translocacíón cotraduccfonal

Membrana interna PERIPLASMA

"-.Membrana externa Las proteínas bacterianas pueden ser exportadas de manera postraduccional o cotraduccional y ser ubicadas en la membrana o en el espacio periplásmico, o bien, ser secretadas.

La peptidasa sei'\al divide el extremo N

CITOPLASMA SecB es un chaperón que se une a la proteínas naciente

El SecYEG es un complejo transmembrana

SecA es un motor asociado a la membrana

El sistema Sec consta del traslocón SecYEG incrustado en la membrana, la proteína asociada a SecA que impulsa a las proteínas a través del canal, el chaperón SecB que transfiere las proteínas nacientes al SecA y la peptidasa señal que divide la señal terminal N de la proteína translocada.

Hay varios sistemas de transporte a través de la membrana interna, pero el mejor caracterizado es el sistema Sec, cuyos componentes se muestran en la . El traslocón incrustado en la membrana consta de tres subunidades relacionadas con los componentes del Sec61 de las levaduras y los mamíferos, cada una de las cuales es una proteína integral transmembrana (SecY tiene 10 segmentos nansmembrana; SecE, tres). El traslocón funcional es un trímero con una copia de cada subunldad. La ruta principal para dirigir a las proteínas al traslocón consiste en SecA y SecB. Este último es un cha perón que se une a la proteína naciente para con-

_0.21 El Sistema Sec transporta proteínas al interior de la membrana interna y a través de ella

247

SecB transfiere la proteína a SecA

r

\. CITOPLASMA

4.5S ANA

--FtsY

1 -Ffh

t

SecA inserta proteínas en eltraslocón

SecB/SecA transfiere proteínas al traslocón que pasa a través de la membrana. El RNA 4.55 transfiere a las proteínas que entran a la membrana.

trolar el plegamiento y que transfiere a la proteína al SecA, el cual. a su vez, la transfiere al traslocón. En la se muestra que son dos las formas principales de dirigir las proteínas al canal See: • el chaperón SecB y • la SRP basada en el RNA 4. SS Muchos chaperones pueden incrementar la eficiencia de la exportación proteínica bacteriana impidi endo el plegamiento premaruro; incluyen el "factor desencadenante" GroEL (caracterizado como chaperón que colabora con la exportación) (véase la sección 10.5, Las proteínas desnaturalizadas y las recién sintetizadas requieren de chape rones, y la lO .8, La secuencia de seña 1 interactúa con la SRP) y la proteína SecB (identificada como el producto de uno de los mutantes sec). SecB es la menos abundante de estas proteínas, pero desempei1a la importante función de fomentar la exportación, que comprende dos actividades. Primero, la SecB se comporta como chaperón y se une a u na proteína nacien te para retrasar el plegamienw, no puede revenir el cambio de estructura de una proteína plegada, de manera que no funcio na como factor de desdoblamiento, por lo tanto, su función es inhibir el plegamiento erróneo de la proteína recién sintetizada. Segundo, la SecB tiene cierta afinidad por la proteína SecA que le permite dirigir a un precursor proteínico a la membrana. La ruta SecB-SecYEG se utiliza para la translocación de proteínas secretadas en el interior del periplasma y se resumen en la SecA es una gran proteú1a periférica de membrana que tiene alternativas para asociarse con la membrana . Como proteína periférica de membrana, se asocia con esta membrana gracias a su afinidad 248

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

SecA se recicla

Sec8 transfiere una proteína naciente al Sec;. el cual la inserta en el canal. La translocación requiere de 2 hidrólisis de ATP y de una fuerza protonmotriz. SecA ejecu¡¡; ciclos de asociación y disociación con el canal y proporcior ~ la fuerza motriz para empujar la proteína.

por lípidos ácidos y por el componente SecY de traslocón, los cuales son parte de un complejo dt subunidades múltiples que proporciona la fundó!" rranslocasa. No obstante, en presencia de otras proteínas (SecD y SecF), SecA puede asumir la forma de una proteína transmembrana. Probablememe consliluye el moror que empuja al sustrato proteínico a través del Lraslocón SecYEG. La SecA reconoce a la SecB y al precursor proteínico, a los cuales sirve de chaperón; es muy probable que las características de la secuencia de la proteú1 ~ madura, así como su líder, sean necesarias para e_ reconocimiento. La SecA tiene actividad ATPasa que depende de la unión con lípidos, Ja SecY y la proteína precursora. La ATPasa funciona de forma cíclica durante la t.ranslocación. Después de unirse a un precursor proteínico, la SecA se une al ATP y -20 aminoácidos son translocados a través de la membrana. Para liberar al precursor de la SecA se necesita la hidrólisis de la ATP, para que pueda repetirse el ciclo. El precursor proteínico se une de nuevo y

'10rciona el estímulo para unir más moléculas de .,_ transferir otro segmento de proteína y liberar :ecursor. La SecA puede alternar entre la forma ~gral y la periférica de la membrana durante la ~locación; en cada ciclo, un dominio de 30 kD SecA puede insertarse en la membrana y después -1ctarse. La translocación también puede suceder por proceso. Cuando un precursor es liberado por - ~cA. puede ser conducido a través de la mem.a por una fuerza protonmotriz (es decir, un po · ~ial eléctrico a través de la membrana), que no Je iniciar la transferencia a través de la membra· 'lero sí continuar el proceso iniciado por un ciclo .:cción ATPasa de la SecA, de modo que después 1s ciclos de la reacción mediada por el complejo -"'- ·ATP, o entre ellos, Ja fuerza protenmotriz pue:npulsar la rranslocación del precursor. El complejo ribonucleoproreínico de E. coli ado por RNA 4.55 y las proteínas Ffh y FrsY ~t ituye una contraparte de la SRP eucariótica _.:se la sección 1O. 9, La SRP interactúa con el re. ' r de la SRP), cuya función quizá sea mantener a :uteína naciente en una conformación aproa hasta que interactúe con otros componentes ""1ecanismo secretor, se necesita para la secrede algunas proteínas, pero no de todas. Como serva en la Figura l 0.46, sus sustratos son pro'S integrales de membrana. La base de la se1ecdiferencial de sustratos es que la SRP de E. coli "1oce una secuencia de anclaje localizada en la dna (por definición, las secuencias de anclaje : presentes sólo en las proteínas integrales de ~brana). Los cloroplastos tienen contrapartes 3· proteínas Ffh y FtsY, pero no requieren de un 10neme de RNA.

Sistemas de translocación independientes de Sec en E. coli · -- :eptos principales

:;:herichia cali y los organelos tienen sistemas de ~~nslocación proteínica relacionados. - sistema permite que ciertas proteínas se inserten . las membranas sin un mecanismo de translocación. ;;( es homólogo al sistema mitocondrial para la · -:nsferencia de protefnas al interior de la membrana ·:erna. ~ ;,istema tat transfiere a proteínas con un elemento ; arginina doble al espacio periplásmico. .ema alterno más sobresaliente para la translon de proteínas en E. coli se presenta en la pro-

El contacto inicial es electrostático

La protelna se transfiere

:%> Interacciones hidrófobas

++1 :uerza protonmotriz

La proteína de envoltura M13 se inserta en la membrana interna al hacer un contacto electrostático inicial, seguido de la inserción de secuencias hidrófobas. La translocación es conducida por interacciones hidrófobas y una fuerza protonmotriz hasta que la secuencia de anclaje entra a la membrana.

leína de envoltura de l fago Ml 3. En la se observa que ¡parece no necesitar ningún mecanismo de rranslocaciónl Puede insertarse de forma postraduccional en el interior de los liposomas sin proteínas. Dirigir la proteína hacia la membrana implica secuencias específicas (formadas por residuos básicos) en las regiones terminal N y terminal C que pueden interactuar con cabezas de fosJolípi dos con carga negativa. Posteriormente, La proteína entra a la membrana utilizando grupos hidrófobos en su secuencia líder terminal N y una secuencia de anclaje interna. La hidrofobictdad es La fuerza impulsora principal para la translocadóo, pero puede ser asistida por una fuer7a protonmotriz generada entre el lado periplásmico de la membrana, cargado positivamente, y una región ácida de la proteína, que lleva a ésra atravesar la membrana; la peptidasa del líder puede posteriormente separar la secuencia

10.22 Sistemas de translocación independientes de Sec en E. coli

249

terminal N. La generalización de este mecanismo en las bacterias no está clara, puede aplicarse sólo al caso especial de las proteínas de en~o ltura del bacteriófago. Algunas proteínas de los doroplastos pueden insertarse en la membrana de los tilacoides por una ruta similar. Las mutaciones del gen yidC bloquean ]a inserción de proteínas en la membrana iurerna. Dicho gen es homólogo de la proteína Oxalp, necesaria cuando las proteínas son insertadas en la membrana roitocondrial interna desde la marriz, el cual puede funcionar independientemente de la SecYEG o aunada a ella. La inserción de algunas pro teínas dependientes del YidC requiere de SecYEG, lo cual sugiere que YidC actúa en conjunto con el traslocón para desviar el sustrato en la inserción a la membrana de manera opuesta a la secreción. Otras proteínas cuya inserción depende del YidC no necesitan SecYEG, parece probable que sean necesarias otras funciones (no identificadas) y no el traslocón . El nombre del sisrema tat se deriva de su capacidad para transportar proteínas que portan un elemento de a rginina dobJe; su responsabilidad es la translocación de proteínas que tienen cofactores estrechamente unidos, lo cual podría implicar limitaciones en su capacidad para desplegarse y a travesar la membrana. Este fenómeno iría en contra del principio de la mayoría de los sistemas de translocación, en los cuales la proteína pasa desplegada a través de la membrana y ya madura, después de haber pasado, se pliega. Este sistema está relacionado con un sistema dellumen del tilacoide del cloroplasto llamado Hdl06. Ambos transportan proteínas al interior del periplasma.

E

Resumen

Una proteína que se inserta en una membrana o que la atraviesa, tiene una secuencia de sena! reconocible por un receptor que forma parte de la membrana o que puede asociarse con eUa. La proreina pasa a través de un canal acuoso creado por la proteína transmcmbrana queteside en la membrana. En casi todos los casos, la proteína pasa desplegada por el canal, y es necesario que se asocie con los chaperones cuando emerge para adquixir la conl'ormación correcta. La excepción principal es el peroxisoma, en el cual una proteína importada con cmúormación madura, se une a una proteína del citosol que la transp orta a través del canal localizado en la membrana . La síntesis de pro telnas en el citosol empieza en los tibosomas "libres". Las proteú1as secretadas en la célula o insertadas en membranas del sistema reticuloendotelial inidan con una secuencia de señal terminal N que hace que el ribosoma se adhiera a la 250

CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

membrana del retículo endoplásmico. La proteína es translocada a través de la membrana por transferencia cotraduccional. El proceso empieza cuando la secuencia de señal es reconocida por la SR ~ (part[cula ribonucleoproteínica), que interrumpe le traducción, se une a su receptor en la membranc? del ER y transfiere la secuencia de señal al recepto Sec6l/TRAM ubicado en la membrana. La símesi se rein.i,cia y la proteína es translocada a través de L membrana mientTas está siendo sintetizada, a unqu~. no hay una conexión energética entre los procesm E l cana l que atraviesa la membrana proporciona u¡ ambiente hidroú1ico y está formado principalmem._ por Sec6l . Una proteína secretada atraviesa por comple1 la membrana, hasta el lumen del ER. Las proteína integradas en las membranas se dividen en dosti'pc generales, con base en su orientación. En las proteJnas íntcgrales de men1br:ana tipo I, la secue,ncia de señal terminal N es dividida y la transferencia a través de la membran a se interrumpe posreriormem ... por una secuencia de anclaje. La proteína se oriem..: en la membrana con su extremo N localizado e: el lado alejado y con su extremo C, ubicado en e. citosol.las proteínas tipo IT no tienen una seña l ter· m inal N divisible, síno una secuencia combinada señal-ancla, la cual entra a la membrana y se incrusu en ella, fenómeno que provoca que eJ extremo e se localice en el Lado alejado, m ientras que el extrem• N permanece en el dtosol. La orientación de la secuencia señal-ancla depende de la regla del ''interio· positivo'', que afirma que el lado del anda conmá cargas positivas se localizará en el citoplasma. La pro teínas que tienen regiones transmembrana únicas se desplazan lateralmente del canal a la bica¡:1.: de lípidos; dichas regiones pueden ser varias, con lazos loca lizados entre ellas que sobresalen en ambo lados de la membrana. Se desconoce el mecanismo de inserción de segmentos múltiples. Sí no hay una señal específica, una p roteína<:<· liberada en el citosol cuando termina su síntesis. La proteínas se importan de manera posnaducciona al interior de las miwcondrias y de los cloroplastos poseen secuencias líder terminales N que las dirige• a la membrana externa de la envoltura del organelo y posteriormente son transportadas a t ravé· de las membranas interna y externa, a la matriz. La transl.ocación requiere d.e ATP y de un potencial para atravesar la membJana incerna _ El lide: terminal N es escindido por una proteasa que st encuentra en el organelo. Las proteínas que reside& en las membranas o en el espacio illlermembranposeen una señal (que se vuelve terminal N cuand• se elimina la primera parte del líder) que provoca le exportación de la matriz a la localización apropiad~ o que detiene la transferencia antes de que roda ...:

na haya entrado a la matriz. El control del - Miento mediante Hsp70 y Hsp60, ubicados en · .riz m itocondriaL es una característica irnporJel proceso . ..as mitocondrias y los doroplastos tienen comde receptores separados que crean canales és de la membrana interna y de la externa. - las proteínas imponadas pasan directamencomplejo TOM localizado en la membrana '"!la a un complejo TW que se encuentra en la ,rana interna. Las proteínas que residen en el o intermembrana o en la membr ana externa -cexporradas desde el complejo TIM después ...e entran a la matriz. El complejo TOM utiliza

.. mes receptores para proteínas importadas de· _endo de q ue tengan secuencias de seña l terrni~ o internas, y las dirige al interior del canal 40. Hay dos receptores TlM e n la memb ra na -.,a, uno es utilizado por las proteín as cu yo des na! es la matriz interna y e l otro por las que -eexportadas al espado in termembrana o a la :.:>rana externa . ..as bacterias tienen componentes para la trans_,ón a través de la membrana que se relacionan •s del sistema cotraduccional eucariótico, pero ~nslocación a menudo tiene lugar mediante un :nismo posrraduccional. SecY /E proporcionan · uslocasa, y la SecA se asocia con e l canal. ade · 1e esta r implicada en la inserción y la propuiJel sustrato proteínico. SccB es un chaperón ~carrea a la proteína hasta al canal. Algunas ~ 'nas integrales de membrana son insertadas canal por una intcracdón con un aparara se- "lte a la SRP, formado por RNA 4 .5$ y por las _,nas Ffh y FtsY. ::..a proteína YidC es homóloga a una proteína :ondrial, es necesaria pa ra la inserdón de a l~ pro teínas de membrana.

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CAPÍTULO 10 Localización de las proteínas

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E

La translocación requiere de inserción en el t raslocón y (en ocasiones) de un trinquete en el ER

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La translocación inversa envía proteínas al citosol

para que sean degradadas ~ .tlos

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IIIJ:D

la inserción en la membrana después de la traducción depende de las secuencias líder

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m

los peroxisomas emplean otro tipo de sistema de translocación

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254

CAPÍTULO 10 l ocalización de las proteínas

Gould. S. J .. I
E

El sistema Sec t ra nsporta

proteínas al in terior de le membrana int erna y a través de ella

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Referencias

255

Transcripción ESQUEMA DEL CAPÍTULO

Introducción

• El DNA estAunido en un canal y entra en contacto con las subunidades ~ y ~~

La transcripción ocurre por medio de apareamiento de bases en una ''burbuja" de ONA no apareado

La polimerasa de RNA está formada por La enzima central (o enzima medular) y por un factor cr

la polimerasa de RNA separa las dos cadenas de DNA en una "burbuja" transitoria y utiliza una cadena como molde para dirigir la síntesis de una secuencia complementaria de RNA. la longitud de la burbuja es -12 a 14 bp y lz longitud del híbrido de RNA-DNA dentro de ella es oe -8 a 9 bp.

La reacción de la transcripción consiste en tres etapas La polimerasa de RNA inicia la transcripción después de unirse a un sitio promotor en el DNA. • Durante la elongación la burbuja de tra nscripción se desplaza a lo largo del DNA y la cadena de RNA se extiende en dirección 5'·3'. Cuando la transcripción se detiene, el dú plex de DNA se vuelve a formar y la polimerasa de RNA se disocia en un sitio de terminación.

liD La polimerasa de RNA del fago T7 es un sistema de modelos útil • las polimerasas de RNA de los fagos T3 y T7 son polipéptidos individuales con actividades mínimas en el reconoci miento de un pequeño número de promotores de fagos. • Las estructuras cristalinas de la polimerasa de RNA T7 con ONA identifican la región de unión al DNA y el sitio activo.

La estructura cristalina sugiere un modelo de desplazamiento enzimático El DNA se desplaza por un surco de la polimerasa de RNA de las levaduras que forma una vuelta pronunciada en el sitio activo. • Un puente proteínico cambia la conformación para controlar la entrada de los nucleótidos al sitio activo.

La polimerasa de RNA bacteriana está formada por múltiples subunidades Las polimerasas centrales de RNA bacterianas son complejos de subunidades múltiples de -500 kO con una estructura general cx,~W-

256

• la polimerasa de RNA bacteriana puede dividirse en la enzima central a1 ~~·, la cual cataliza la transcripción. y er la subunidad CJ, que es necesaria sólo para la iniciación. El factor a cambia las propiedades de unión al DNA de la polimerasa de RNA de tal manera que su afinidad por el DNA general se reduce y su afinidad por tos promotores aumenta. • las constantes de unión de la potirrerasa de RNA a diferentes promotores vañan en alrededor de seis órdenes de magnitud, lo cual corresponde a la frecuencia con la cual la transcripción es iniciada en cada promotor.

La asociación con el factor cr cambia en la iniciación • Cuando la polimerasa de RNA se une a un promotor, separa (as cadenas de DNA para formar una burbuja de transcripción e incorpora hasta nueve nudeótidos en el RNA. Puede haber un ciclo de iniciaciones abortivas antes de q~
Una polimerasa de RNA varada puede rei niciar la transcripción • Una polimerasa de RNA varada puede rein iciar la transcripción al separar al transcrito de RNA para generar un extremo 3' nuevo.

¿Cómo encuentra una polimerasa de RNA las secuencias promotoras? • la velocidad con la cual la polimerasa de RNA se une a los promotores es demasiado alta para que la justifique la difusión aleatoria. Es probable que la polimerasa de RNA se una a sitios aleatorios del DNA y los intercambie por otras secuencias con bastante rapidez hasta que encuentra un promotor.

El factor cr controla la unión al DNA Un cambio en la asociación entre el factor a y la holoenzima modifica la afinidad de unión por el DNA de t<

manera que la enzima central puede desplazarse a lo largo del DNA.

Uno de los genes tempranos codifica un ractor o que hace que la polimerasa de RNA transcriba los genes intermedios. • Dos de los genes intermedios codifican subunidades de un factor o que llace que la po!imerasa de RNA transcriba los genes tardios.

El reconocimiento del promotor depende de las secuencias de consenso • Un promotor es defimdo por la presencia de secuencias de consenso cortas en localizaciones especificas. • las secuencias de consenso oromotoras estan formadas por una purina en el punto de inicio. por el hexámero TATAAT centrado en -10, y por otro hexámero centrado en -35. • los promotores indiViduales suelen diferir del consenso en una o mas posiciones.

La eficiencia de los promotores puede aumentar o disminuir por medio de mutaciones • las mutaciones lentificadoras que disminuyen la eficiencia de un promotor a menudo reducen la adaptación a las secuencias de consenso, mientras que las mutaciones aceleradoras tienen el efecto contrario. • Las mutaciones que se presentan en la secuencia -35 suelen afectar la unión inicial de la polimerasa de RNA. • Las mutaciones localizadas en la secuencia -10 a menudo influyen en la reacción de desnaturalización que convierte un complejo cerrado en uno abierto.

La polimerasa de RNA se une a una cara del DNA • Las secuencias de consenso localizadas en -35 y - 10

La esporulación es controlada por factores cr la esporulactón divide a una bacteria en una célula madre que es desintegrada y una espora que es liberada. • Cada compartimiento avanza a la siguiente etapa de desarrollo al sintetizar a un factor o nuevo que desplaza al factor o antenor. • La comunicación entre los dos compartimientos temporiza las sustituciones de los factores o.

[IBJ

La polimerasa de RNA bacteriana termina en sitios discretos • La terminación puede requerir el reconocimiento de la secuencia terminadora en el ONA y la formación de una estructura en forma de horquilla en el producto de RNA.

Hay dos tipos de terminadores en E. coli • los terminadores intrínsecos están formados por una horquilla abundante en G-C localizada en el producto de RNA seguida por una región rica en U en la cual ocurre ..a terminación.

¿Cómo funciona el factor p?

proporcionan la mayo• parte de los puntos de contacto para la polimerasa de RNA en el promotor. • Los puntos de contacto se encuentran en una de las caras del DNA.

• El factor p es una proteína terminadora que se une a un sitio rut ubicado en un RNA naciente y viaja por el RNA para liberarlo de la estructura del híbrido de RNA-ONA en la pobmerasa de RNA.

El superenrollamiento es una caracteñstica importante de la transcripción

La antiterminacíón es un episodio regulador

• El superenroltamiento negativo incrementa la eficiencia de algunos promotores al ayudar en la reacción de desnaturalización • La transcripción genera superenrollamientos positivos delante de la enzima y superenrollamientos negativos detrás de ella, y éstos deben ser retirados por la girasa y por la topoisomerasa.

La sustitución de los factores cr puede controlar la iniciación • Escherichia.coli tiene numerosos factores o, cada uno de los cuales provoca que la polimerasa de RNA inicie en un conjunto de promotores definido por secuencias especificas -35 y -10. • o70 se utiliza en la transcripción general y los demás factores o son activados por condiciones esoeciales.

Los factores cr contactan de manera directa al DNA • o'0 cambia su estructura para liberar a sus regiones de unión al DNA cuando se asocia a la enzima central. o'" se une a las secuencias -35 y -1 O.

Los factores cr pueden organizarse en cascadas Una cascada de factores o se crea cuando un factor o es necesario para transcribir al gen que codifica al siguiente factor o. los genes tempranos del fago SPOl son transcritos por una potimerasa de RNA hospedadora.

• la terminación es inhibida cuando las proteínas antiterminac1ón actúan sobre la polimerasa de RNA para provocar que ésta lea a traves de un terminador específico o de vanos de ellos. • El fago l tiene dos prote1nas antiterminación, pN y pQ, las cuales actúan en Oiferentes unidades de transcripción.

Dllit La antiterminación requiere sitios que sean independientes de los terminadores • El sitio en el cual una proteína antitermmación actúa se encuentra en sentido ascendente al sitio de terminación en la unidad de transcripción. • la localización del sitio antiterminador varía en casos diferentes y puede ubicarse en el promotor o dentro de la unidad de transcripción.

Los factores de terminación y de antiterminación interactúan con la polimerasa de RNA • Numerosas proteínas bacterianas son necesarias para que la pN de A mteractúe con la poh me rasa de RNA. • Estas proteínas también participan en la antiterminación en los operones rm de la bacteria hospedadora. • El antiterminador pQ de).. tiene un mecanismo de acc.1ón diferente que comprende la unión al DNA en el promotor.

Resumen

11 Transcripción

257

Caoonc; codllte&(lora

.

~-

-------

~t ~r t ( Al ' C _ · ' 1( "'T Al 3' ATGCGCCATGCCAGTTACGTAGATGGA

Cadena molde

T RANSCRIPCIÓN

Transcrito de RNA

La secuencia de RNA es complementaria a la cadena molde e idéntica a la cadena codificadora

5' UACGCGGUACGGUCAAUGCAUCUACCU

'

--

La función de la polimerasa de RNA es copiar a RNA una cadena del DNA dúplex.

Punto de inicio

t Terminador

Proximal ~

Sentido

Distal

Sentido

ascendente descendente

Una unidad de transcripción es una secuencia de ONA transcrita a una cadena individual de RNA, que comienza en el promotor y finali za en el terminador.

Introducción La transcripción comprende la sú1tesis de una cadena de RNA que representa a una cadena del DNA dúplex. Cuando se dice "que representa", lo que se quiere decir es que el RN A tiene una secuencia idéntica a una de las cadenas del DNA la cual se denomina ca d e n a codificadora. Es complemmtaria a la otra cadena, la cual es la cadena molde para su sú1tesis. La recapitula la relación entre el DNA de doble cadena y sn n·anscrito de RNA de cadena indiViduaL La síntesis de RNA es catalizada por la enzima p o limerasa d e R NA. La transcripción comienza cuando la polimerasa de RNA se une a una región especiaL el p romotor, que se encuentra en el inicio del gen. El promotor rodea al primer par de bases que se transcribe en RNA, el punto de inicio. A partir de este punto, La polimerasa de RNA se desplaza a lo largo del molde, sintetizando RNA, hasta que alcanza a una secuencia ternúnadora (t). Esta acción define a una u n idad de transcripción gue se extiende desde el promotor hasta el terminador. La caracterís258

CAPÍTULO 11 Transcripción

tica determinante de la unidad de {ranscripción, qu_ se describe en la , es que constituye u: fragmento de DNA expresado por medio de la produccitf de una sola molécula de RNA . Una unidad de transcü¡;· ción puede incluir a más de un gen. las secuencias que se encuentran antes delpur:· to de inicio se describen en flujo ascend ente a é aquellas que se encuentran después del punto de ir..:.cio (denu·o de la secuencia transcrita) se encuentraen flujo descendente a él. Convencionalmen te, l.; seruendas se escriben de tal manera que la transcrir ción proceda de izq uierda (en flujo ascendente) . derecha (en flujo descendente). Esto corresponde a ~ ­ escritura del RNAm en la dirección h abitual 5'~3 La secuencia de DNA a menudo se escribe par mostrar sólo a la cadena codificadora, la cua l tien la m tsma secuencia que el RNA. Las posiciones las bases se numeran en ambas direcciones lejos d~ punto de inicio, al cual se le asigna eJ valor+ l ; l números se incrementan a medida que ava nzan ~ flujo descendente. A la base anterior al punto de i= cío se le asigna el número - 1, y los números nep tivos se incrementan en flujo ascendente. (No h.' ninguna base a la qLLe se le asigne el número 0.) Al producto inmediato de la transcripción se denomina t ranscri to primario . Consiste e n R.."\ que se extiende desde el promotor hasta el teriT' nador y posee los extremos originales 5' y 3'. S embargo, el transcrito primario casi siempre es ine ta ble. En las procariotas, se degrada con rapidez RNAm) o se divide para formar productos madur (RNAr y RNAr). En las eucariotas, es modificado elos extremos (RNAm) o dividido para formar P=" duetos maduros (todos Jos RNA). la transcripción es la primera etapa de la e presión génica y el paso principal en el cual es co t rolada. las proteínas reguladoras determinan un gen parlicular está disponible para ser transen por la polimerasa de RNA. El paso inicial (y e fre cue11da el único) en 1a regulación es la decisL de transcribir o no a un gen. La mayoría de los e¡ soctios reguladores ocurren en la iniciación de

~cripción,

aunque en ocasiones son reguladas as subsiguientes de la transcripción (u otras eta:ie la expresión gén ica). ~n este contexto, surgen dos interrogantes bácon respecto a la expresión génica: • ¿Cómo encuentra la polimerasa de RNA a los promotores en el DNA? Éste es un ejemplo particular de una pregunta más general: ¿Cómo distinguen las proteínas a sus sitios de unión específicos entre otras secuencias en el DNA? • ¿Cómo interactúan las proteínas reguladoras con la polimerasa de RNA (y entre sí) para activar o reprimir pasos esped.ficos en la iniciación, en la elongación o en la terminación de la transcripción? .=n este capítulo se analizan las interacciones de limerasa de RNA bacteriana con el DNA des.:l contacto inicial con un gen, a través del de la transcripción, hasta que es liberada cuantranscrito se ha completado. El Capítulo 12, El ·ón, describe los diversos medios por los cuales -oreínas reguladoras pueden facilitar o impedir .a polimerasa de RNA bacteriana reconozca un "'"~articular para transcribirlo. En el Capítulo 13, - "SA regulador, se abordan otros mecanismos egulación, como el uso de moléculas pequeñas ~'\A, y se analiza la manera como estas interac-::S pueden ser conectadas en redes reguladoras grandes. En el Capítulo 14, Estrategias de los ;; se estudia cómo las interacciones reguladoras ,-iduales pueden ser conectadas en redes complejas. En el Capítulo 24, PromotOres y .e.'1áadores, y en el Capím.lo 25, Activación de la .scripdón, se abordan las reacciones análogas en1:. polimerasas de RNA eucruióticas y sus moldes.

La transcripción ocurre por medio de apareamiento de bases en una //burbuja" de DNA no apareado -""Xeptos principales

...a polimerasa de RNA aparta las dos cadenas de DNA - una "burbuja" transitoria y utiliza una cadena :-:lmo molde para dirigir la síntesis de una secuencia :::mplementaria de RNA. ..3 longitud de la burbuja es -12 a 14 bp y la longitud =~l híbrido de RNA-DNA dentro de ella es de -8 a 9 bp. ~anscripción

ocurre por medio del apareamien se c bases complementarias. En la .:-a el principio general de transcripción. La :::sis de RNA sucede dentro de una "burbuja de

3'

5'

3' ....,¡..;:..;:¡..J.:J~;;..:¡,.,¡,;:;.u,.u.IW-..iLIIII.ibi!=........ 5' El DNA es desnaturalizado

¡

La sintes1s de RNA 1 Cadena codificadora inicia en la burbuja t

3'

5'

La cadena de RN.A se extiende

¡

Cadena molde

las cadenas de DNA se secaran para formar una burbuja de transcripción. El RNA es sintetizado por apareamiento complementario de bases ccn una de las cadenas de DNA.

transcripción", en la cua, las cadenas individuales del DNA son separadas de manera transitoria y la cadena molde se utiliza para dirigir la síntesis de la cadena de RNA . La cadena de RNA se sintetiza del extremo 5' hacia el extremo 3'. El grupo 3'- OH del último nucleótido agregado a ta cadena reacciona con un nudeósido enuante 5' tri fosfatado. El nucleósido entrante pierde dos de sus grupos fosfato terminales (y y~) ; su grupo CJ.. se utiliza en el enlace fosfodiéster uniéndolo a la cadena. La velocidad tOtal de la reacción es -40 nucleótidos/s a 37"C {para la polimerasa de RNA bacteriana); y es casi igual a la tasa de rraducción ( 15 aminoáddos/s). pero es mucho más lenta que la tasa de replicación del DNA (800 bp/s) . La polimerasa de RNA crea la burbuja de rranscripdón cuando se une a un promotor. La muestra que a medida que la polimerasa de RNA se desplaza a lo largo del DNA, la burbuja se mueve con ella y la cadena de RNA crece. El proceso de apareamiento de bases y adición de bases dentro de la burbuja es catali7.ado y escudriñado por la enzima. La estructura de la ':>urbuja dentro de la polimerasa de RNA se muestra en la imagen ampli. Conforme la polimerasa ficada de la de RNA se desplaza a lo largo del molde de DNA,

11.2 lq transcripción ocurre por medio de apareamiento de bases en una ''burbuja" de DNA no apareado

259

últimos 25 ribonucleótidos agregados a una cader: creciente se encuentran formando un complejo co el DNA o con la enzima en un momento dado.

1111

La reacción de La transcripciór

consiste en t res etapas Conceptos principales • La polimerasa de RNA inicia la transcripción después d;, unirse a un sitio promotor en el DNA. • Durante la elongación la burbuja de transcripción se desplaza a lo largo del DNA y la cadena de RNA se extiende en dirección 5'-3'. • Cuando la transcripción se detiene, el dúplex de DNA se vuelve a formar y la polimerasa de RNA se disocia e.un sitio de terminación.

La transcripción tiene lugar en una burbuja, en la cual se sintetiza RNA por medio de apareamiento de bases con una cadena de DNA en la región desenrollada de manera transitoria. Conforme progresa la burbuja, el DNA dúplex se reconstituye detrás de ella, desplazando al RNA en forma de una cadena polinucleotídica individual.

Movimiento de la enzima Punto de enrollamien~na codihcadora de DNA Punto de desenrollamiento

Durante la transcripción, la burbuja se mantiene dentro de la polimerasa de RNA bacteriana, la cual desenrolla y enrolla al DNA y sintetiza RNA.

desenrolla al DNA dúplex frente a la burbuja (en el punto de desenrollamiento) y enrolla al DNA por detrás (en el punto de rebobinado). La longitud de la burbuja de transcripción es de -12 a 14 bp, pero la longitud de la región del híbrido de RNA-DNA dentro de ella es más cona. Hay un cambio importante en la topología del DNA que se extiende cerca de una vuelta. pero no es evidente qué porción de esta región está de hecho pareada con el RNA en un momento dado. Sin duda el híbrido de RNA·DNA es cono y es transitorio. Conforme se desplaza la enzima, se reconstituye el DNA dúplex y el RNA es desplazado como una cadena polinucleotídica libre. Aproximadamente los 260

CAPÍTULO 11 Transcripción

La reacción de la transcripción puede dividirse t"' las etapas que se ilustran en la , en ,cuales se crea una burbuja, comienza la síntesis RNA, la burbuja se desplaza a lo largo del DNA por último la burbuja es terminada: • El reconocimiento del molde comienza con unión de la polimerasa de RNA a un pr motor localizado en el DNA de doble c.: dena para formar un "complejo cerradt> Después las cadenas de DNA se separa para formar el "complejo abierto" que de: la cadena molde disponible para realizar ~ aparcamiento de bases con Jos ribonucleó< dos. La burbuja de transcripción se crea p un desenrolla miento local que comienza t"el sitio en el que se une la polimerasa G RNA. • La iniciación describe la síntesis de los pr meros en la ces de nucleótidos en el RNA. t· enzima permanece en el promotor miertras sintetiza los primeros nueve enlacr de nucleótidos, aproximadamente. La fa de iniciación se prolonga por los episodi abortivos que tienen lugar, en los cuales enzima forma transcritos cortos, los libe y después reinicia la síntesis de RNA. ~ fase de iniciación termina cuando la enzi.rr logra extender la cadena y libera al pr motor. La secuencia de DNA necesaria pa que la polimerasa de RNA se una al moldr

logre la reacción de iniciación se denomina pr motor. Es probable que la iniciación abo tiva comprenda la síntesis de una cade:de RNA que abarque la tOtalidad del sif' activo. Si se libera al RNA, la iniciación ~ cancelada y debe iniciar de nuevo. La ir dación se logra siempre y cuando la enzirr. se desplace a lo largo del molde para lle\·¿

la siguiente región del DNA al interior del sitio activo. • Durante la elongació n la enzima se desplaza a lo largo del DNA y extiende la cadena creciente de RNA. A medida que la enzima se desplaza, desenrolla la hélice de DNA para exponer un segmento nuevo del molde en una condición de hélice individual. Los nucleótidos son agregados de forma covalente al extremo 3' de la cadena creciente de RNA, lo que forma un híbrido de RNA-DNA en la región desenrollada. Atrás de la región desenrollada, la cadena de DNA que funciona como molde se aparea con su pareja original para volver a formar la doble hélice. El RNA emerge como una cadena indiv idual libre. La elongación comprende el movimiento de la burbuja de transcripción por una interrupción de la estructura del DNA, en la cual la cadena molde de la regi6n desenrollada de manera Lransitoria se aparea con el RNA nacimte en el punto de crecimiento. • La terminación implica el reconocimiento del punto en el cual no deben agregarse más bases a la cadena. Para terminar la transcripción, la formación de enlaces fosfodiéster debe cesar y el complejo de transcripción debe separarse. Cuando se agrega la última base a la cadena de RNA, la burbuja de transcripción se colapsa a medida que el híbrido de RNA-DNA se disocia, el DNA adquiere de nuevo su estado dúplex y la en zima y el RNA son liberados. La secuencia de

Reconocimiento del molde: La pollmerasa de ANA se une al DNA dúplex

la transcripción sucede en cuatro etapas: la enzima se une al promotor y desnaturaliza al ONA, permanece estacionaria durante la iniciación, se desplaza a lo largo del molde durante la elongación y se disocia en la terminación.

DNA necesaria para estas reacetones se denomina terminador. la elongación tradicionalmente se aprecia como proceso monótono, en el cual la enzima se des.ua hacia adelante un par de bases a lo largo del -A por cada nucleótido agregado a la cadena de ·.-\. En ciertas circunstancias ocurren cambios en ·~ pa trón, sobre rodo cuando la pol imerasa de • -A hace una pausa. Un tipo de patrón consiste en e el "extremo frontal " de la enzima permanezca -acionario mientras el "extremo posterior" coníe moviéndose, comprimiendo así la impresión a huella en el DNA. Después del movimiento largo de numerosos pares de bases, el "extreiromal" es liberado, con lo que se restaura una resión de huella de longitud total. Esto da pie ~odelo de transcripción de la "oruga geómetra" geometrino"), en el cual la enzima avanza de .:nera interrumpida, comprimiendo y liberando :nanera alternada la impresión de huella del :\. Sin embargo, puede ser que estos episodios .:riban una situación aberrante en vez de la transción normal.

1111

La poli merasa de RNA del fago T7 es un sistema de modelos útil

Conceptos principales • Las polimerasas de RNA de los fagos T3 y T7 son polipéptidos individuales con actividades mínimas en et reconocimiento de un pequeño número de promotores de fagos. • Las estructuras cristalinas de la polimerasa de RNA T7 con ONA identifican la región de unión al ONA y el sitio activo.

La existencia de polimerasas de RNA muy pequeñas, que constan de cadenas polipepúdicas individuales codificadas por cienos fagos, ofrece una idea del mecanismo "mínimo" necesario para la transcripción. Estas polimerasas de RNA reconocen sólo unos cuantos promotores en el DNA de los fagos, y no tienen la capacidad de cambiar el conj unto de promotores a los cuales responden. Proporcionan

t l 4 la polimerasa de RNAdel fago T7 es un sistema de modelos útil

261

La lámina de especifícidad 13 se une en un surco amplio

Movimiento de la enzima ----+

la polimerasa de RNA T7 tiene un lazo de especificidad que se une a !.as posiciones del promotor que se encuentran entre -7 y -11, mientras las posiciones -1 a -4 entran al sitio activo.

La poHmerasa de RN A T7 reconoce su secuenct: diana en el DNA uniéndose a bases en el surco mz. yor en una posición que se ubica en flujo ascende1 · te desde el punto de inicio, como se muesLra en . La enzima utiliza un lazo de espedflddr que se forma por un listón ~· Esta característica e-única de la polimerasa de RNA (no se observa e: las polimerasas de DNA). La ca¡.acn:ristiEa..~omú~ de todas las polimerasas de RNA es que la enzirm reconoce bases específicas del DNA en el flujo a5cendente de la secuencia que es transcrita. Ct1ando comienza la transcripción, la conformación de la enzima permanece esencialmen• igual mientras se agregan numerosos nucleótidos la cadena molde transcrita es "rriturada" en el siti activo. El siúo activo puede contener un transcrit de seis a nueve nucleótidos. La transición de la iniciación a la elongación se define como el punro erel cual la enzima comienza a despla1.arse a lo larg . del DNA. Esto ocurre cuando el transcrito naciemo: rebasa el sil io activo e interactúa con el lazo de especificidad. El RNA emerge a la superfide de la enzim.cuando se han sintetizado de 12 a 14 nudeótido~ Estas características son similares a aqueUas exhib-das por la polimerasa de RNA bacteriana.

1111

La estructu ra cristalina sugiere un modelo de desplazamiento enzimático

Conceptos principales Las subunidades ~ (en color azuloso) y W(en color rosa) de la polimerasa de RNA tienen un canal para el molde de DNA. la síntesis de un transcrito de RNA (en color cobre) acaba de iniciar; ta cadena molde (en color rojo) y la cadena codificadora (en color amarillo) de DNA son separadas en una burbuja de transcripción. Fotografía cortesía de Seth Darst, Rockefeller University.

sistemas de modelos simples para caracterizar la unión de la polimerasa de RNA al DNA y la reacción de iniciación. Las polimerasas de RNA codificadas por los fagos relacionados T3 y T7 son cadenas poüpepúdicas individuales de< l 00 kD cada una. Sintetizan RNA a una velocidad de -200 nucleóúdos/s a 37°(, mayor que la de la polimcrasa de RNA bacLeriana. la polimerasa de RNA del fago T7 es homóloga a las polimerasas de DNA y tiene una estructura similar, en la cual el DNA yace en una "palma" rodeada de "dedos" y de un "pulgar" (véase la Figura 18.7). Ahora se tiene una vista directa del sitio activo a partir de la estruclura cristalina de una polimerasa de RNA del fago T7 realizando la transcripción. 262

CAPÍTULO 11 Transcripción

• Et DNA se desplaza por un surco de la polimerasa de RNA de las levaduras que forma una vuelta pronunciada en el sitio activo. • Un puente proteínico cambia la conformación para controlar la entrada de los nucleótidos al sitio activo. A11ora se tiene bastante información sobre la estructura y la función de la polimerasa de RNA, como eresultado de las estructuras cristalinas de las em:i.ma: de las bacterias y de las levaduras . Las dimension~ totales de la polimerasa de RNA bacteriana son -9( x 95 x 160 Á; la polimerasa de RNA eucariótica e.: más grande pero menos alargada. El análisis estructural muestra que companen un tipo de estructuré común, en el cual hay u n "canal" o surco en la superficie de - 25 Á de ancho que podría ser la ruta de. DNA. En la se muestra un ejemplo de este canal en la polimerasa de RNA bacteriana. u longitu d del surco podría contener 16 bp en la en7lma bacteriana y -25 bp en la enzima eucariótka pero este represenra sólo una parte de la longüut total del DNA unido durante la transcripción. L; superficie de la enzima tiene cargas negativas en su

•r parte, pero el surco está revestido con cargas :Jvas, lo que le permite interactuar con los gru osfato del DNA cargados negativamente. :.a enzima de las levaduras es una estructura :'1sa con 12 subunidades (véase la sección 24.2, olimerasas de RNA eucarióticas están formadas :1umerosas subunidades). Se han localizado lO .:n idades de la polim erasa ele RNA Tl de las le Jras en la estructura cristalina, como se muestra 3 . El sitio cata lítico se forma por una didura entre las dos subunidades grandes (#l ~2), la cual sujeta al DNA en flujo descendente un par de "mandíbulas" a medida que entra - polimerasa de RNA. Las subunidades cuatro y :e están ausentes en esta estructura; forman un .complejo que se disocia de la enzima completa. - lo general, la estructura es similar a la de la ·irnerasa de RNA bacteriana. Esto p uede obser:se con mayor claridad en la escrucw ra cristalina - .a . la polimerasa de RNA rodea al _ ·A, como se observa en la . En el si activo se encuentra un ion catalítico de Mg2 •. El ;A es pinzado en posición en el sitio activo por las ~unidades 1, 2 y 6. La muestra que :>NA es for1.ado a dar una vuelta en la entrada al ..o debido a la presencia de una pared adyacente : protefna. La longitud del híbrido de RNA está -1itada por otra obstrucdón proteínica, denomi na - timón (o guía). Es probable que los nucleótidos ""'tren al sitio activo desde abajo, por los poros que ·aviesan la estructura. La imagen ampliada del sitio activo en la muestra que la burbuja de transcripción inclu~ nueve pares de bases del híbrido de RNA·D~A. =~donde el DKA da la vuelta, las bases que se en..lentran en flujo descendente giran hacia afuera de ~ hélice de DNA. A medida que la enzima se despla:, a lo largo del DNA, la base que se encuentra en la :adena molde al inicio de la vuelta será girada para "'ue ap ume al sitio de entrada de los nucleótidos. ~1 ex tremo 5' del RNA es forzado a abandonar al :>SA cuando choca con el timón de proteína (véase .3 Figura 11.12). Una vez que el DNA ha sido desnawralizado, .as cadenas individuales adquieren una estructura .exible en la burbuja de transcripción. Esto permite JI DNA dar la vuelta en el sitio activo . No obstante, .;mes de que comience la transcripción. el DNA de joble cadena es una estructura recta relativam~nte :igida. ¿Cómo entra esta estructura a la ~etasa ;in ser bloqueada por la pared? La respuesta es que Jebe ocurrir un gran cambio de conformación en .a enzima. Adyacente a la pared hay una pinza. ~la forma libre de la polimerasa de RNA. esta pinza 5e balancea para alejarse de la pared y permitir que -:!l DNA siga una ruta direcra a través de la enzima .

9 2

12.

-.o '~

11

8

\1.

/

Mandfbula

(/

Sitio activo

6

A partir de la estructura cristalina de la polimerasa de RNA se ubican 10 subunidades. Los colores de las subunidades son los mismos que los de las estructuras cristalinas de las figuras siguientes.

La vista desde arriba de la estructura cristalina de la polimerasa II de RNA de las levaduras muestra que el DNA es sujetado en sentido descendente por un par de mandíbulas y es oinzado en la oosición adecuada en el sitio activo, el cual contiene un 10n de Mg-. Fotografía cortesía de Roger Kornberg, Stanford University School of Medicine.

la vista desde el extremo de la estructura cristalina de la polimerasa II de RNA de las levaduras muestra que el DNA es rodeado por proteína en un área de -270°. Fotografía cortesía de Roger Kornberg, Stanford University School of Medicine.

ll.S La estructura cristalina sugiere un modelo de desplazamiento enzimático

263

La polimerasa comacta al ácido nucleico Molde

EIDNA entra alas mandíbulas

~~"!!"'!'~!fll:r~ron

Se agrega una base nueva y 'Se rompen los enlaces

Nucleótidos

El DNA es forzado a dar una vuelta en el sitio activo por una pared de proteína. los nucleótidos pueden entrar al sitio activo a través de un poro localizado en la proteína.

La burbuJa de

La vista amplificada del sitio activo muestra la vuelta pronunciada que se encuentra en el camino del ONA.

Después de que el DNA ha sido desnaturalizado para crear la burbuja de transcripción, la pinza debe balancearse y regresar a su posición contra la pared. Uno de los clilemas de cualquier polimerasa de ácido nucleico es que la enzima debe formar contactos estrechos con el sustrato de ácido nucleico y con el producto, pero debe romper estos contacros y rehacerlos en cada ciclo de adición de n ud eótidos. Considérese la situación que se ilustra en la . Una polimerasa hace una serie de contactos específicos con las bases, en posiciones particulares. Por ejemplo, el contacro "1" se hace con la base que se encuentra en el extremo de la cadena creciente y el contacto "2" se hace con la base que se encuentra en la cadena molde que es complementaria a la siguiente base que será agregada. Obsérvese. sin embargo. que las bases que ocupan estas ubicaciones en las cadenas de ácido nucleico cambian cada vez que se agrega un nucleótido. 264

CAPÍTULO 11 Transcripción

La enzima s e desplaza y reconstituye los enlaces

El movimiento de una polimerasa de ácid o ~ __ cleico requiere el rompimiento y la reconstitución de e n la c~ de ácidos nucleicos en posiciones fijas en relación con la ~ tructura de la enzima. Los nucleótidos que se encuentran ;;r estas posiciones cambian cada vez que la enzima se mueve L-' base a lo largo del molde.

Los segmentos superio r e inferior de la figu ;-· muestran la misma situación: una base está por s~... agregada a la cadena creci.en te. La diferencia es q¡· ~ esta cadena creció una base en el segmento infe· rior de la figura. La geometría de ambos complej• es exactamente la misma, pero los contactos "l" "2" en el segmento inferior se hacen con bases elas cadenas de ácido nucleico que se localizan ur.;; posición más lejos a lo largo de la cadena. El sesmento del centro muestra que esto debe significa· que, después de que la base es agregada (y antes d que la enzima se mueva en relación con el ácid nucleico), los contactos establecidos con posicioné" específicas deben romperse para que p uedan reh.=cerse con las bases que ocupan dichas posiciont después del desplazamiento. La estructura de la polimerasa de RNA sugiere una idea de cómo la enzima mantiene comac; con su sustrato mientras rompe y restaura enlac~ Una estructura ubicada en la proteína denominaa · puente es adyacente al sitio activo (véase la Figurz 11 .12). Esta característica se observa en las enzima de las bacterias y deJas levaduras, pero tiene forma diferentes en las estructuras cristalinas distintas. E-

está doblada y en la otra es recta. La sugiere que el cambio de conformación de la :"..lctura del puente se relaciona de manera cerca- .:on la rranslocación de la enzima a lo largo deJ l nudeico. Al inicio del ciclo de translocación, el pueme e una conformación vertical y se encuentra ad~tnre al snio de enrrada de los nucleótidos. Esto -nite que el siguiente nucleótido se una en el sile entrada de los nucleótidos. El puente está en :acto con el nucleótido que acaba de agregarse. "'lUés la proteína se desplaza un par de bases a lo =- del sustrato. El puente cambia su conformación dobla para mantener comacto con el nucleótido en agregado. En esta conformación. el puente .:Jea el sitio de entrada de los nudeótidos. Para .=.:zar el ciclo. el puente regresa a su conformación - ral c.:on Jo que permite de nuevo el accrso al sitio "1trada de los nucleótidos . El puente actúa com o :inquete que libera a las cadenas de DNA y de para la translocación al tiempo que se sujeta al :'IDO de la cadena creciente. .J

La poli merasa de RNA bacteriana está form ada por múltiples subunidades

Puente proteína

ANA Sito de entrada de los nu<:leótldos Nucteótldo agregado a la cadena

Translocación por un par de bases

J El puente regresa a su co'lformaclón recta

:3-<ep:os ·principales -~

potimerasas centrales de RNA bacterianas son :)mplejos de subunidades múltiples de -500 kD con _"'a estructura general Ct.z~~: : DNA está unido en un canal y entra en contacto con =s subunidades J) y !)'.

lirnerasas de RNA meJor caracterizadas son las eubacterias, de las cua les Escherichia coli es un ·ípico. Un solo tipo de polimerasa de RNA parece ;¡,me de casi toda la síntesis de RNAm y de toda la :.:i6n de RNAr y de RNAt, en una eubacteria. Hay ::dor de 7 000 molécu las de po limerasa de RNA : a célula de E. coli. Muchas de ellas imervienen _ •ranscripción; es probable que de 2 000 a 5 000 __ as estén sintetizando RNA en un momento pero el número depende de las condidones

.;e

'.

-llVO. _3

enzima completa o la holoenzima en

:_,/í tiene un peso molecular de -465 kD. Las '1idades que la componen se describen en la subunidades ~y P' juntas forman el centro Sus secuencias están relacionadas con as de las subunidades más grandes de las poli_;;as de RNA eucarióticas (véase la sección 24.2, limerasas de RNA eucarióticas están formadas -umerosas subunidades), Jo cual sugiere que

-
~ico.

El ciclo de elongación de la polimerasa de RNA comienza con un puente recte adyacente al sitio de entrada de los nucleótidos. Después de la adición de los nucleótidos, la enzima se desplaza un par de bases y el puente se dobla al tiempo que mantiene contacto con el nucleótido que acaba de agregarse. Cuando el puente es liberado, el cido puede comenzar de nuevo.

hay caracterfsticas comunes en las acdones de todas las polimerasas de RNA.. La subunidad ~puede entrecruzarse con el molde de DNA, con el producto de RNA y con los ribonucleótidos de los sustratos; las mutaciones en rpoB afectan a todas las etapas de la transcripción. Las mutaciones en rpoC muestran que la subunidad P' rambién está implicada en todas las etapas. La subunidad ex es necesaria para el ensamblaje de la enzima cemral. Cuando el fago T4 infecta a E. coli, la subunidad ex es modificada por la transferencia deun~ molécula ADP-ribosa a un residuo de arginina (lo\que se conoce como ADP-ribosilación de la arginina ). La modificación se relaciona con una menoraflnidad por los promotores que antes reconoóa la holoenzima, lo cual sugiere que la subunidad ex tiene cierta función en el reconocimiento del promotor. La subunidad ex también participa en la interacción de la polimerasa de RNA con algunos otros factores reguladores.

11 ó La polimerasa de RNA bacteriana está formada por múltiples subunidades

265

Gen

Producto

Funciones

rpoA

2 subunidades a (40 kD cada una)

rpoB

Subunidad ~ (155kD)

ensamble enzimático, reconocimiento del promotor y unión a algunos activadores

rpoC

Subunldad W (160 kO)

rpoD

Subunidao a (32-90 kD)

r

1

} '~'" ~"''"00

r especificidad del

Enzima de

E. coli = 465 kD

Las polimerasas de RNA de las eubacterias tienen cuatro tipos de subunidades¡ C'J., ~y Wtienen dimensiones bastante constantes en diferentes especies bacterianas, pero cr vaña de manera más amplia.

Subuntdad ~ SentiCfo

asce~dente

'' ~ /

SentiCfo descendente

~ '

~: ?\1\/NlflY::;;:nJ~!JV/\

oNA

~

R~

1

1

J

1¡ Subunldad W La cadena molde y la cadena codificadora del DNA son contactadas por las subunidades ~ y Wsobre todo en la región de la burbuja de transcripción y en sentido descendente. ELRNA es contactado sobre todo en la burbuja de transcripción. No hay RNA en sentido descendente, excepto en el caso especial que se presenta cuando la enzima se desplaza hacia atrás.

La subunidad cr interviene de manera específica en el reconocimiento del promoror, y se cuenta con más húormadón acerca de sus funcio nes que de las de cualquier otra subunidad (véase la sección 11.7, La polimerasa de RNA está formada por la enzima central y por un factor cr). La estructura cristalina de la enzima bacteriana (véase la Figura 11.8) muestra que el canal paTa el DNA yace en la interfase de las subunidades ~y W· (Las subunidades a son invisibles en esta imagen.) El DNA está desenrollado en el sitio activo, en donde una cadena de RNA está siendo s intetizada. Los 266

CAPÍTULO 11 Transcripción

experimentos de entrecruzamiento identifican 1 puntos en los cuales las subunidades de la polimerasa de RNA entran en contacto con el DNA. Éstas resumen en la . Las subunidades ~ y . entran en contacto con el DNA en numerosos pu:c tos localizados en se ntido descendente con respecal sitio activo. Forman numerosos contactos con cadena codificadora en la región de la burbuja L transcripción, lo que estabiliza las cadenas indis, duales independientes. El RNA es contactado sot · todo en la región de la burbuja de transcripción. El medicamento rifampicil)a (un miembro de •. familia de las rifamicinas) qlt quea la transcripdt1 mcdiada por la poHmerasa de RNA bacteriana. :::. un medicamento importantl:l_para el tratamiento ~ la tuberculosis. La estructuracristaHna de la p0~ merasa de RNA unida a la rifampicina explica ~ acción: se une a una hendidura de la subunidad _ a > 12 Á de distancia del sirio activo, pero en Ufposición en la que bloquea la ruta del RNA en pr ceso de elongación. Al impedir que la cadena ~ RNA se extienda más allá de dos o tres nudeótidr se bloquea la transcripción. Definida en un principio sóJo por su capacida . para incorporar nucleótidos en el RNA bajo la a. rección de un molde de DNA, la enzima polin1era~ de RNA ahora se considera parte de un mecanism más complejo que interviene en la transcripción . .:...

capacidad de cata/izar la síntesis de RNA define al comrnente mínimo que puede describirse como polimerasa : RNA. Supervisa el apareamiento de bases de los :-bonucleótidos de los sustratos con el DNA y caraJL.; la formación de enlaces fosfodiéster entre ellos. Todas las subunidades de la polimerasa básic.. que participan en la elongación son necesarias pa:~ la in iciación y para la terminación. No obstante, le: unidades de transcripción difieren en cuanto a qt. dependen de poüpépüdos adidonales en las etap.? de iniciación y de terminación. Algunos de esr . pohpéptidos adicionales son i11dispensables en tod· los genes, mientras que otros se necesitan de mau::ra específica para la iniciación o para la terminacicen genes particulares. La analogía con la división e labores entre el ribosoma y los factores de la sínte~ proteínica es evidente. La polimerasa de RNA de Escherichia coli puetranscribir cualquiera de las muchas unidad~ de transcripción (> 1 000). Por lo tanto, la enzim.. requiere la capacidad de interactuar con una varíe~ dad de .funciones hospedadoras y de los fagos qu modifican sus actividades intrínsecas de transcrir ción. Por lo ramo, la complejidad de la enzima, :. menos en parte, refleja su necesidad de inleractu:: con factores reguladores, en vez de una demanc: inhereme en su actividad catalítica .

La polimerasa de RNA está formada por la enzima central y por un factor cr

La enzima central se une a cualquier secuencia de DNA

::-:-nceptos principales ..a polimerasa de RNA bacteriana puede dividirse en la enzima central a2 ~W. la cual cataliza la transcripción, i en la subunidad cr, que es necesaria sólo para la 'niciación. El factor cr cambia las propiedades de unión al ONA de la polimerasa de RNA de tal manera que su afinidad por el DNA general se reduce y su afinidad por los promotores aumenta. las constantes de unión de la polimerasa de RNA a diferentes promotores vaña en alrededor de seis órdenes de magnitud, lo cual corresponde a la frecuencia con la cual la transcripción es iniciada en cada promotor.

- holoenzima (a.2 ~Wcr) puede separarse en dos :nponentes, la enzima central (a2 ~W) y el fac_r cr (el polipéptido cr). Sólo la holoenzima puede iní-

la transe~ipción. El factor cr garantiza que la polimeRNA bacteriana se una de manera estable al DNA ~·en los promotores. El "factor" cr suele ser liberado .1 de

raodo la cadena de RNA alcanza ocho o nueve :.;es de longitud. lo que permite que el centro de la -.zima asuma la elongación. La enzima cenera/tiene

:apacidad de simetizar RNA a parlír de un molde de :A, pero no puede iniciar la transcripción en los sitios ,atados. La enzima central tiene una afinidad general : el DNA, en el cual la atracción electrostática : :re la proteína básica y el ácido nucleico ácido :sempeña tma fun ción muy importante. Cual..:ier secuencia (a leatoria) de DNA que se une a la ~imerasa cemral en esta reacción de unión gene-~. se describe como s itio de unión d ébil. Ningún ~m bio ocurre en el DNA, el cual continúa siendo ~p lex. El complejo en tal sitio es estable, con una ja media de disociación de la enzima del DNA de - 10 rnin. La enzima cmtralJto distinoue entre promoto.. y otras secuencias del DNA. La muestra que el factor cr inrro_Jce un cambio importante en la afinidad de lapo:nerasa de RNA por el DNA. La holoenzima tiene

:a capacidad drásticamente reducida para reconocer los -:.os de unión débiles, es decir, para unirse a cualquier :cuencia general del DNA. La constante de asocia .Jn de la reacción disminuye -10 4 veces, y la vida - cdia del complejo es <1 s. Por lo tanto, el factor cr ~sestabiliza la capacidad general de unión de forma -UY considerable. Nótese que el factor cr también confiere la capaci·d de reconocer sitios de unión específicos. La holoenzi -

El factor a desestabiliza la unión

La holoenzima se une al promotor

La enzima central se une en forma indiscriminada a cualquier secuencia de DNA. El factor a reduce la afinidad de la unión independiente de la secuencia y confi ere especificidad por los promotores.

rna se une a los promotores de manera muy fume, con una constante de asociación incrementada (en promedio) 1 000 veces con respecto a la de la enzima central y con una vida media de varias horas. La especificidad de las holoenzimas por los promotores en comparación con otras secuencias es de -107 , pero éste sólo es un promedio debido a que hay una amplia variación en la velocidad con la cual la holoenzima se une a secuencias promotoras diferentes. Éste es un parámetro importante para clererminar la eficiencia de un promotor individual en la iniciación de la transcripción. Las constantes de unión osci lan entre -lO" y -106 • Otros factores también afectan la frecuencia de la iniciación. la cual varía de -lis (en los genes de RNAr) a -l/30 m in (en el promotor la el).

111J

La asociación con el facto r cr cambia en la iniciación

Conceptos wincipales • Cuando la polimerasa de RNA se une a un promotor, separa las cadenas de DNA para formar una burbuja de transcripción e incorpora hasta nueve nucleótidos en el RNA.

• Puede haber un ciclo de iniciaciones abortivas antes de que la enzima avance a la siguiente fase. • El factor cr puede ser liberado de la polimerasa de RNA cuando la cadena naciente de RNA alcanza una longitud de ocho a nueve bases.

1. S La asociación con el factor o cambia en la iniciación

267

Holoenzima

... : ; ; Unión al DNA

Constante de equilibrio Ka = 10s-10s M-1 C-omplejo binario cerrado

Complejo binario abierto Constante de velocidad

11¡- 10-a s-1 Complejo ternario

Despeje del promotor

1-2 S Com1enzala sfntesis de RNA

La polimerasa de RNA atraviesa por numerosos pasos antes de la elongación. Un complejo binario cerrado se transforma en un complejo abierto y luego en un complejo ternario. Ahora se pueden describir las etapas de la transcripdón en rérminos de las interacciones entre las di ferentes formas de polimerasa de RNA y del molde de DNA. La reacción de iniciación puede describirse con los parámetros que se resumen en la • La reacción holoenzima-promotOr com ienza al formarse un complejo binario cerrado. ''Cerrado" implica que el DNA sigue siendo dúplex . La formación del complejo binario cerrado es reversible; por lo ramo. suele describirse por una constante de equiUbrio (K6 ). Hay un incervalo amplio de valores de la constante de equilibrio para formar el complejo cerrado. • El complejo cerrado se transforma en un complejo abierto cuando se "desnaturalizaN una región cona de DNA demro de la secuencia a la que se ha unido la enzima. La serie de eventos que conducen a la formación de un complejo abierto se denomina unión fu erte. En el caso de los promotores fu enes, la conversión a un complejo binario abierto es irreversible, por lo que esra reacdón se describe por medio de una constante de velocidad (k1 ). Esta reacción es rápida. 268

CAPÍTULO 11 Transcripción

El facto r cr participa en la reacción de desnatura lización (véase la sección 11.16, L.! sustitución de los factores crpuede controlala iniciación). • El siguiente paso es incorporar los primen.. dos nucleótidos; entre ellos se forma un enlace fosfodiéster. Esto genera un complejo ternario que contiene RNA, DNA y la en· zima. La formación del complejo ternario se describe por medio de la constante de veladdad k1; ésta es incluso mayor que la constanre de velocidad k2• Pueden agregarse más nucleótidos sin ningún movimiento enzimáric para generar una cadena de RNA de hast~ nueve bases. Después de que se agrega cad;; base. hay cierta probabilidad de que la enzima libere a la cadena . .Esto comprende \me iniciación abortiva, después de la cual la enzima comienza de nuevo con la primer.: base. Por lo general, hay un ciclo de iniciaciones abortivas que generan una serie de oligonucleótidos muy conos. • Cuando la iniciación es exitosa. el facror G deja de ser necesario, y la enzima realiza la transición al complejo ternario de elongación de polimerasa centraJ-DNA-RNA naciente. El parámetro fundamental en este suceso es cuánto tiempo requiere La polimeras~

para dejar el promotor de modo que otra po/imerasa pueda iniciar. EsLe parámetro es e. tiempo de despeje del promotOr; su valor mínimo de l a 2 s establece que la frecuencia máxima de iniciación es menor a un episodio por segundo. Luego la enzima stdesp laza a lo largo del molde y la cadena de RNA se exliende más allá de lO bases. Cuando la polimerasa de RNA se une al DNA la dimensión elongada de la proteína se extiende a lo largo del DNA, pero ocurren algunos cambio~ morfológicos interesames durante la transcripción. Las transiciones de forma y de tamaño originan tres formas del complejo. como se ilustra en la • Cuando la polimerasa de RNA en forma dt holoenzima se une en un inicio aJ DNA, cu bre unas 75 a 80 bp y se extiende de -55 a +20. (La larga dimensión de la polimerasa de RNA (160 Al podría abarcar ~so bp de DNA en forma extendida. lo cual implica que la unión de un fragmento más largo de DNA debe suponer algún plegamiento de~ ácido n ucleico.) • La forma de la polimerasa de RNA cambia en la mmsición de la iniciación a la elongación. Esto se asocia a la pérdida de contacto~ en la región que abarca de -5 5 a -35,lo que

deja sólo -60 bp de DNA cubiertas por la enzima. Esto coincide con el concepto que indica que la parte que se encuentra más distante del promotor en sentido ascendente interviene en el reconocimiento inicial por parte de la polimerasa de RNA. pero no es indispt'nsable en las últimas etapas de la iniciación (véase la sección 11.13, La eficiencia de los promotores puede incrementar o disminuir por medio de mutaciones). • Cuando la cadena de RNA se extiende de 15 a 20 bases. la enzima realiza una transición posterior para formar el complejo que se hace cargo de la elongación; ahora abarca de 30 a 40 bp (de acuerdo con la etapa del ciclo de elongación). H.a sido un dogma de la transcripción, desde poco :spués de su descubrimiento, que el factor cr es li-:-!ado después de la iniciación. Es posible que esto sea del tOdo cierto. Las mediciones directas de • comp l ejo~ de polimerasa de RNA en proceso elongación muestran que -70% de eUos reúene 1actor cr. Un tercio de las polimerasas en proceso _elongación carecen de cr; por lo tamo, la conclu':1 original. la cual afirma que no es indispel15able ~:a la elongación, es sin duda correcta. En los casos los que permanece asociado a la enzima central, casi seguro que la naturaleza de la asociación ha ....:.mbiado (véase la sección 11.11, El factor cr controla - :m.ión al DNA).

111J

Una polimerasa de RNA varada puede reiniciar la transcripción

El complejo de lntciaclón tncluye al factor cr

y cubre de 75 a 80 be_

...--

-50 -40 -30 -20 -10 1 +10 +20 +30

El complejo de elongación inlc1al se forma cuando la cadena de RNA se extiende 10 bases, puede perder a o y deja de hacer contactos desde la posición -35 hasta la posición -55

-50 -40 -30 -20 - 10 1 +10 +20 +30

El complejo de elongación general se forma cuando la cadena de RNA se extiende de 15 a 20 bases y abarca de 30 a 40 bp

-so -40 -30 -2o -1o 1 +10 +20 +30

La polimerasa de RNA en un inicio hace contacto con la región -50 a +20. Cuando se disocia cr. la enzima central hace contacto desde la posición - 30; cuando la enzima se desplaza pocos pares de bases, se organiza de forma más compacta en el complejo de elongación general.

1 Conct'pto principal

a la polimerasa separa r unos cuantos dbonudeóti-

Una polimerasa de RNA varada puede reiniciar (a t ranscripción al separar el transcrito de RNA para generar un extremo 3' nuevo.

_., polimerasa ele RNA debe estar en condiciones de .anejar situaciones en las que se bloquea la trans""ipción. Esto puede suceder, por ejemplo, cuando -- DNA ha sido dai1ado. Un sistema modelo de di - .as situaciones lo proporciona la interrupción de elongación in viera al omitir uno de los nucleón- s precursores necesarios. Cuando el nucleótido úame es restaurado, la enzima puede superar el 1queo al dividir el extremo 3' del RNA. para crear n extremo 3' nuevo para la elongación de la cade3. La división implica a [actores accesorios además -t: la enzima. En el caso de la polimerasa de RNA de 7 (O/i, las proteínas GreA y GreB liberan a la poli- .erasa de RNA de la interntpción de la elongación. -:1 las células eucarióticas, la polimt!rasa de RNA II .quiere un factor accesorio (TF0S), el cual permite

dos del extremo 3' del producto de RNA. El sitio cata lítico de la polimerasa de RNA realiza la división en cada caso. Las funciones de GreB y de TF0 S son convenir el sirio catalítico de la enzimas en u n sitio ribonucleolírico. Aunque no hay homoJogía en la secuencia de los factores, las estructuras cristalinas de sus complejos con las polimerasas de RNA respectivas sugieren que funcionan de manera similar. Cada uno de Jos factores inserta un dominio proteínico angosto (en un caso una cinta de cinc, y en el otro una hélice superenroUada) de manera profunda en la polimerasa, en donde termina en el interior del sitio catalítico. El dominio insertado coloca dos aminoácidos ácidos cerca del ion de magnesio catalitico primario del sirjo activo; esto permite la introducción de un segundo ion de magnesio, el cual conviene el sitio catalítico en un sitio ribonuclcolírico. .Esta reacción puede deberse a que la demora provoca que el molde sea posicionado de manera

1 •• 9 Una polimerasa de RNA varada puede reiniciar la transcripción

269

incorrecta, de tal forma que el extremo 3' ya no se localiza en el sitio activo . La división y el retroceso son necesarios para colocar el extremo en la ubicación correcta para la adición de más bases. Por lo tarno, se observa que la polimerasa de RNA tiene las capacidades de desenrollar y de rebobinar el DNA, de sujetar el producto de RNA y las cadenas del DNA separadas, de catalizar la adición de ribonucleótidos a la cadena creciente de RNA y de ajustarse a dificultades en el p roceso al separar el producto de RNA y reiniciar la símesis de RNA (con la ayuda de algunos factores accesorios).

enzimas centrales en complejos débiles 500-1 000

holoenzimas en complejos débiles

500-1 000

holoenzimas ~,....._."""" .~~C~~~cl~~~f:.jl\.. . en complejos promotores

-2 500

enzimas centrales implícadas en la transcripción La enzima central y la holoenzima están distribuidas en el DNA y muy poca polimerasa de RNA se encuentra en estado libre.

La constante de velocidad hacia delante de la unión de La polimerasa de RNA a los promotores es más veloz que la difusión aleatoria.

270

CAPÍTULO 11 Transcripción

¿Cómo encuentra una poli me rasa de RNA las secuencias promotoras? Conceptos princípale> • La velocidad con la cual la polimerasa de RNA se une ~ los promotores es demasiado alta para que la justiAc.-= la difusión aleatoria. • Es probable que la polimerasa de RNA se una a sitios aleatorios del DNA y los intercambie por otras secuencias con bastante rapidez hasta que encuentre un promotor.

¿Cómo se distribuye la polimerasa de RNA e! célula? Una imagen (un tamo especulativa) de la tuación de la enzima se ilustra en la • El exceso de enzima central existe en g~ medida en forma de complejos cerrados ,_ biles porque la enzima entra en ellos e mucha rapidez y los abandona con lentic Hay m t\y poca enzima central libre, si es la hay. • Hay suficiente factor cr para que cerca un tercio de las poli merasas existan co:holoenzimas y éstas se distribuyen er: complejos débiles localizados en sitios específicos y complejos binarios (en su r. yor parte cerrados) en los promotores, • Cerca de la rrútad de las polirnerasas de ~ consisten en enzimas centrales que inten nen en la transcripción. • ¿Qué cantidad de holoenzimas se encue tran en forma libre? Se desconoce la re puesta, per o se sospecha que la cantidad muy pequeña. La polimerasa de RNA debe encontrar promo~ res dentro del contexto del genoma. Supóngase < r un promotor es un fragmento de -60 bp. ¿Cómo. distingue de las 4 x l 0 6 bp que forman el genor de E. coli? las nes figuras siguientes ilustran el pri!:cipio de algunos modelos posibles. La muestra el modelo más sencC para la unión con el promotor, en el cual la po:. merasa de RNA se desplaza por difusión aleatorio: Con rapidez, la holoenzima se asocia a los sitios ü unión débiles y se disocia de ellos . De tal maner.; puede continuar formando y rompiendo una ser de complejos cerrados hasta que (por probabilida.: encuentra un promotor, y el reconocimiento de · secuencia específica permitirá la unión firme mediante la formación de un complejo abierto. Para que la polimerasa de RNA se desplace C: un sit io de unión del DNA a otro, debe disociar~ del primer sitio, encomrar el segundo sitio y después asociarse a él. El desplazamiento de un sic

rro está limitado por la velocidad de difusión a 'vés del medio. La difusión establece un límite erior Vla dimensión, como se muestra en la se detiene sólo cuando encuentra un promotor. 5ín embargo, n o hay pruebas de que la polimerasa de RNA (u otra proteína de unión al DNA) pueda Wlcionar de esta manera.

I.a polimerasa de RNA enfrenta un cUlema para reconciliar sus necesidades para la iniciación y la elongación. La iniciación requiere una unión fuerte sólo con secuencias particulares (promotores), mientras que la elongación requiere una asociación fuerte con todas las secuencias que la enzima encuentre durante la transcripción. La ilustra cómo se resuelve el dilema por medio de la asociación reversible entre el factor cr y la enzima central. Como se mencionó antes (véase la secdón 11.8, La asociación con el factor cr cambia en la iniciación), el facror cr es liberado después de la iniciación o cambia su asociación con la enzima central de tal manera que ya no participa en la unión al DNA. Hay menos moléculas de factor cr que de enzima central; por lo ramo, el uso de la enzima cenu·al requiere el reciclaje de cr. Esto ocurre inmediatamente después de la iniciación (como se muestra en la figura ) en cerca de un tercio de los casos; se supone que cr y la enzima central se disocian en un momento posterior en los demás casos.

El intercambio con el

promotor puede ser rápido

A :y: ?.

La polimerasa de RNA se une de manera muy rápida a secuencias de DNA aleatorias y podña encontrar un promotor por desplazamiento directo de la secuencia de unión del DNA.

El factor cr controla la unión al DNA : Concepto pnncipal • Un cambio en la asociación entre el factor o y la holoenzima modifica la afinidad de unión por el DNA de tal manera que la enzima central puede desplazarse a lo largo del DNA.

1

La polimerasa de RNA no se desliza por el DNA. 11. 1 El factor o controla la unión al DNA

271

Rápido~

f

Lento Enzima central almacenada en el DNA

El factor cr se asocia a la enzima central

Muy rápido

t La holoenzima se desplaza hacia los promotores

La enzima central sintetiza ANA

La enzima central termina y es liberada

El factor cr y la enzima central se reciclan en puntos diferentes durante la transcripción .

A pesar de la sincxoni%ación exacta de su liberación de la enzima central. el factor cr interviene sólo en la iniciación. Se hace innecesario cuando la inidación abortiva concluye y la símesis de RNA ha logrado iniciarse. Se desconoce si el estado de la poli merasa cambia porque se supera la iniciación aboniva o si, por el contrario, es el cambio de estado el que finaliza la iniciadón abortiva y p ermite que comience la elongación. Cuando el factor a es liberado de la enzima centra L queda disponible de inmediato para ser utilizado por otra enzima central. Sin importar si el factor cr es liberado o perma n ece asociado con mayor debilidad a la enzima central, esta última está unida con bastante íuerza al DNA en el complejo ternario. Esendalmente está ''encerrada" hasta que se completa la elongación. Cuando finaliza la transcripción, la enzima central es liberada. Entonces se "almacena" uniéndose a un sirio débil del DNA. Si ha })érdido su factor cr, debe encontrar otro para emprender un nuevo ciclo de transcripción. La enzima cemral tiene una afinidad iOLrínseca alta por el DNA, la cual se incrementa en la presen272

CAPÍTULO

11

Transcripción

cía de un RNA naciente. Sin embargo, su afinid.¡ por los sitios de unión déb iles es muy alta para pe mírir que la enzima distinga de manera eficaz l• promotores entre las otras secuencias. Al reducir estabilidad de los complejos débiles, el facto r a pe1 mite que el proceso ocurra mucho más rápido; y a estabilizar la asociación en los sitios de unión fu ente el fac tor conduce la reacción de manera irreversib hacia la formación de complejos abiertos. Cuando enzima libera el factor cr (o cambia su asociación ce él), vuelve a tener una afinidad general por tod el DNA, sin importar la secuencia, que le perrni:: continuar con l a transcripción. ¿Qué controla la capacidad de la holoenzima paunirse de manera específica a los promotores? F factor a tiene dominios que reconocen al DKpromotor. Como un polipéptido independiente, factor cr no se une al DNA, pero cuando la h oloer.zima forma un complejo de unión fuerte, a em-: en contacto con el DNA en la región localizada e~ scmldo ascendente con respecto al punto de inici o Esta diferencia se debe a un cambio en la conformación del facto r 0 cuando se u ne a la enzima centra La región terminal N del factor 0 libre suprime '· actividad de la región de unión al DNA; cuando cr ·une a la enzima central, esta inhibición es Jiberac: y puede unirse de manera específica a las secuer cias promotoras (véase también la Figu ra 11.35 d _ la sección 1 1.17) . La incapacidad del factor a libr. de reconocer las secuencias promotoras puedes~· importante : si a pudiera unirse libremente a Jos pr<~ motores, pod.ría bloquear la iniciación de la tran '· cripcíón mediada por la holoenzima .

m

El reco nocimiento del promotor depende de las secuencias de consenso

Conceptos principales

Un promotor es definido por la presencia de secuencias de consenso cortas en localizaciones específicas. Las secuencias de consenso promotoras están formadas por una purina en el punto de inicio, por el hexámero TATAAT centrado en -10, y por otro hexámero centrado en -35. Los promotores individuales suelen diferir del consenso en una o más posiciones.

Al ser una secuencia de DNA cuya función es sr reco11ocida por ciertas proteínas. un promotor difiere c.. las secuencias cuyo papel es ser rranso·itas o tradud · das. La información para la función del promotor ~ proporciona de manera directa la secuencia de DNr. su estructura es la señal. Éste es un ejemplo clásic

n sitio de actuación en cis, como se definió ames .a Figura 2.16 y en la Figura 2.17. En contras.as regiones expresadas adquieren su significado después de que la información es transferida a -- forma de ácido nucleico o proteína. Una pregunta fundamental en la exploración de ·reracdón entre la polimerasa de RNJ\ y su pro:or es, ¿cómo reconoce la proteína una secuen ~romotora específica? ¿Tiene la enzima un sitio :o que distingue la estruCiura química de una ·encta panicular de bases en el DNA de doble hé"' ¿Qué tan específicos son sus requerimientos? Una manera de diseñar un promotor podría sistir en una secuencia panicular de DNA que ~reconocida por la polimerasa de RNA . Cada pro()t estaría formado por, o al menos incluiría. esta 1en cia. En el genoma bacteriano, la longitud mí- .a que p odría proporcionar una señal adecuada -a de 12 bp. (Es probable que ocurra alguna se::-ncia más cona, sólo por casualidad, con suficien-ecuencia para proveer señales fa lsas. la longitud -ima necesaria para el reconocimiento exclusivo 11ema con el ramaiio del genoma .) la secuencia 12 bp no necesjta ser contigua. Si un número -ecífico de pares de bases separa dos secuencias -srantes más corras, ~u longitud combinada po· l ser menor a 12 bp, debido a que la misma dis:ia de separación ofrece una parte de la señal .:luso si la sewencia intermedia es irrelevante) . Los in remos por idenúficar las características del 'A que son necesarias para la unión de la polime~ de RNA iniciaron al comparar las secuencias de ..!ntos promotores. Toda secuencia esendal de nuiidos debe estar presente en todos los promotores; .ice que dichn secuencia está conservada. Sin ero.-50, no es necesario que una secuencia conservada 1cida en cada una de las posiciones: se permite "la variación. ¿Cómo se analiza una secuencia de ' A para determinar si está lo suficiencemenLc con · ~·ad a para c:onstituir una señal reconocible? Los presumas si Líos de reconocimiento del DNA •den definirse como una secuencia idealizada que :esem a la base que está presente con mayor fre;:Ucia en cada posidón. Una s ecuenda d e con-:: iSO consiste en la alineación de tOdos los ejemplos -qoddos para aumentar al máximo su homologia. . a que una secuencia sea aceptada como cansencada base panicular debe predominar de mane:azonable en su posición y la mayor pane de los mplos debe relacionarse con el consenso por sólo a o dos sustituciones. La característica sobresaliente de la secuencia de promotores de E. co/i es que no hay una conse1vaextensa de seCLLencía en los 60 bp asociados a la ime rasa de RNA. La seCllenda de gran parte del o de unión es irrelevante. Sin embargo, algunos

fragmentos conos demro del promotor están conservados y son de::terminantes para su función. La

conservación sólo de secuencias de consenso muy cortas es ww característica típica de los sirios reguladores (co!llo los promotores) en los genomns de los organismos procarióci· cos y eucarióticos Hay cua1ro (!al vez cmco) características con servadas en un promotor bacteriano: el punto de inicio, la secuencia - lO, la seC\1enc1a -35, la separación entre las secuencias -10 y -35 y (en ocasiones) el elemento UJ>: • El punto de inicio casi siempre (>90% de las veces) es una purina. Es frecuente que el punto de .inicio sea la base central de la secuencia CAT, pero la conservación de esLe triplete no es lo suficientemente representativa para considerarlo como una seña l obligatoria. • Al lado del punto de inicio en sentido ascendente, en casi todos los promoto res es reconocible una región de 6 bp. El centro del hexámero en general se localiza a unos LO bp en sentido ascendente con respecto al punto de inicio: en los promotores conocidos, la distancia varía de -18 a -9. Debido a su localización, el hcxámero a menudo es denominado s ecuencia - 10. Su secuencia de consenso es TATAAT y puede describirse de la siguiente manera: Tso A~; T4s Aóa Aso T?6 en donde el subíndice denora el porcemaje de apa ricioncs de la base observada más a menudo. el cual varía de 45 a 96%. (Una posición en la cual no hay una preferencia discernible por ninguna base se indica con la leu·a N.) Si la frecuencia de apariciones incti· ca una importancia probable en la unión de la polimerasa de RNA, se esperaría que las bases TA iniciales, alramcnt~.:: conservadas, y la base T final, casi por completo conservada, de la secuencia -1 O fueran las bases más imponanres . • Otro hcxámero conservado se centra a -3 5 bp en senrido ascendente desde el punto de inlcio. A éste se le denomina secuencia - 35. La secuencia de cunsenso es ITGACA; en forma más dcLallada, la conservación es: T S! T S I G7S A"' (54 A~$ • La distancia que separa Jos sitios -10 y -35 es de entre 16 y 18 bp en 90% de los promotores; en los casos excepciona.es, llega a ser de apenas 15 bp o de hasta 20 bp. Aunque

la secuencia de la regi6n mcermedia no es impor· tante, la distancia es crucial para que los dos sitios conwwnla sept1ración adecuada para la geometría de la polimerasa de RNA.

11.12 El reconocimiento del promotor depende de las secuencias de consenso

273

Punto de inicio -35 TTGACA

1EH9 bp

-10 TATAAT

1

5-9 bp

Un promotor típico tieqe tres componentes, que son las dos secuencias de consenso localizadas en -35 y en -10 y el punto de inicio.

• /\Jgunos promotores tienen una secuencia. abundante en A-T localizada más lejos en sentido ascendente . A ésta se le denomina elemento UP. Interactúa con la subunidad a de la polimerasa de RNA. Suele encontrarse en los promotores que se expresan de manera amplia, como los promotores de los genes de RNAr. El promotor óptimo es una secuencia formada por el hexámero -35, separada por 17 bp del hexám.ero-10. postrándose a 7 bp en sentido ascendente del punto de inicio. En la se ilustra la estructura de un promotOr y muestra el intervalo de variación permitido a panir de este parámetro ópümo.

La eficiencia de los promotores puede incrementar o disminuir por medio de mutaciones Cono~ptos . principales

• Las mutaciones Lentificadoras que disminuyen La eficiencia de un promotor a menudo reducen la adaptación a las secuencias de consenso, mientras que las mutaciones aceleradoras tienen el efecto contrario. e Las mutaciones que se presentan en la secuencia -35 suelen afectar la unión inicial de la polimerasa de RNA. • Las mutaciones localizadas en la secuencia - 10 a menudo influyen en la reacción de desnaturalización que convierte un complejo cerrado en uno abierto.

Las mu taciones son una fuente importante de informacíón de la función de los promotores, Las mutaciones de los promotores afectan el nivel de la expresión de los genes que controlan sin alterar los productos génicos. la mayor parte es identificada como mutames bacterianos que perdieron , o redujeron en gran medida. la capacidad de transcripción de los genes adyacentes. Se conocen como m utaciones lentificadoras. Con menor frecuencia, se encuentran mutantes en los que la transcripción aumenta por el promotor. Éstas son mutaciones a celeradoras. Es importante recordar que las mutaciones "aceleradoras" y "lentificadoras" se definen de acuerdo 274

CAPÍTULO 11 Transcripción

a la eficiencia habitual con la cual [unciona un pro· motor particular. Esto varía mucho. Por lo tanto. ur cambio identificado como una mutación lentificadoraen un promotor podría nUJ;lca haberse aislado e:otro promowr (el cual en su estado silvestre podrí• ser incluso menos eficiente que la [arma mu tantt del primer promotor) . La información adquirida e_ estudios in vivo tan sólo idemifica la dirección globa del cambio provocado por la mutación. . ¿El promotor más eficaz es aquel que tiene la secuencias de consenso reales? Esta expeaativa surge de la sencilla regla que afirma que las muta don~ . aceleradoras por lo general incrementan la homol<'gía con una deJas secuencias de consenso o acortar la distancia enrre ellas a 17 bp. Las mutaciones len rificadoras casi siempre disminuyen la semejanza de cualquiera de los sitios con respecto a las secuencia de consenso o incrementan la distancia entre ellos z más de 17 bp. Las muractones lentiflcadoras tiendera concentrarse en las posiciones mucho más conse:rvadas. lo cual confirma su importancia particul;; como el determinante principal de la eficiencia d . un promotor. Sin embargo, J1ay excepciones ocasionales a estas reglas. Para determinar los efectos absolutas de las mL:.· raciones de los promotores, se debe medir in vitro 1: afinidad de la poUmerasa de RNA por los promoto· res murames y de tipo silvestre. Hay una variaciór cercana a 100 veces en la velocidad a la cual la pv· limerasa de RNA se une a promotores diferentes f· vilro. lo cual se correlaciona bien con las frecuencia · de la transcripción que se observa cuando sus gene: correspondientes se expresan in vivo. Si se profundiza más en este análisis, se puede investigar la etap.: en la cual una mutación influye en la capacidad dt promotor. ¿Cambia la afinidad del promotor por }¿ polimerasa de RNA? ¿Queda la enzima con capaddad de unirse pero es incapaz de iniciar? ¿Se a lter=. la i.nfluencia de un facto r accesorio? Al medir las constantes cinéticas de la forma · ción de un complejo cerrado y de su conversión .= un complejo abierto, como se define en la Figur.; 11.19, se pueden analizar las dos etapas de la reacdón de iniciación: • Las mutaciones lentificadoras de la secuencia - 35 reducen la velocida
DNA a•slado y desnaturalizado en cadenas individuales

Complejo polimerasa de RNA·promotor parcialmente atacado por la DNAasa l

,...,

---+

•

.•

2. El compleJO cerrado se forma en una región promotora

r.

,.., -'' ' ''·

3. La desnaturalización en la región -1 O transforma el complejo a su forma abierta

1

'f La secuencia -35 se utiliza para el reconoci-;~nto inicial y la secuencia -10 se utiliza en la reacción de ::snaturalización que transforma un complejo cerrado en un : 11plejo abierto.

,Jimerasa de RNA, miemras qu~ la secuencia - 10 ermite al complejo pasar de la forma cerrada a la nna abierta. Se puede considerar que la secuencia -'; constituye un Hdominio de reconocimiento", ·.ientras que la secuencia -10 es un Hdominio de .-:seruollamicnto" del promotor. La secuencia de consenso del sitio -10 está for -ada de manera exclusiva por pares de bases A-T, n a configuración que ayuda a la desnaturalización ~icial de las cadenas individua le~ del DNA dúplex. _}menor cantidad de energía necesaria para sepa~r los pares A· Ten comparación con la requerida :ra romper los enlaces de los pares G-C indica que ~1 fragm ento de pares A·T demanda la camidad nú·ma de energía para la separación de las cadenas. La secuencia ubicada alrededor del punro de ini-'1 influye en el episodio de la iniciación. La región iciaJ [ranscrita (de +1 a +30) afecta la velocidad a .: cual la polimerasa de RNA despeja al promotor por lo tanto, tiene cieno efecto sobre la fuerza :el promotor. En consecuencia, la fuerza global de :1 promotor no puede predecirse por completo por s secuencias de consenso -35 y -1 O. Un promotor "típicoH se vale de sus secuencias -;5 y -1 O para ser reconocido por la polimerasa de . "A, pero una de las dos secuencias está ausente í. cienos promotores (excepcionales). En algunos -=estos casos, el promotor no puede ser reconocido lo por la polimerasa de RNA; la reacción requiere ·oteínas auxiliares, las cuales superan la deficien.a en la interacción intrínseca entre la polimerasa '= RNA y el promotor.

- ---+

DNA etiquetado en un extremo de una de las cadenas

ELECTROFORESIS Punto más distante con _ _ respecto al extremo etiquetado

GEL EXPERIMENTAL

GEL DE CONTROL =

Las bandas ausentes ldenllhcan el s1tlo de uniÓn

El DNA no unido a la polimerasa presenta bandas = en las posiciones correspond1entes = = a los cortes en cada uno de los =enlaces

=

=

=

Punto más

cercano al extremo etiquetado

la impresión de huellas identifica los sitios de unión de las protelnas al DNA por su protección contra la formación de mellas.

La poli me rasa de RNA se une a una cara del DNA Conceptos principales • Las secuencias de consenso localizadas en - 35 y -lO proporcionan la mayor parte de los puntos de contacto para ta polimerasa de RNA en el promotor. • Los puntos de contacto se encuentran en una de las caras del DNA.

La capacidad de la polimerasa de RNA (o, de he cho, de cualquier proteína} para reconocer el DNA puede caracterizarse por medio de impresión de huellas. Una secuencia de DNA unida a la proteína es digerida de manera parcial con una endonucleasa que rompe los enlaces Iosfodiéster individuales en el interior del ácido nucleico. En condiciones apropiadas, un enlace fosfodiésrer panicular se rompe en algunas moléculas de DNA, pero no en todas. Las posiciones que son cortadas se reconocen mediante 11.14 La polimerasa de RNA se une a una cara del DNA

275

Secuencia -35

~

Secuencia -10

Punto de inic1o

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Cadena codifiCadora

ATA

Cadenamolde

ltll 11 1Desenrolla 1 f

iento

TTAXXXXC

11

1t

La mayor parte de los puntos de contacto se encuentra en uha cara del DNA (en la cadena codifiCadora)

...

---~-¡

J. Modilicaciones que 1mp1den que se una la polimerasa de RNA

J. Si1ios en los cuales la pollmerasa de ANA brinda protección contra las

t

modificaciones Mutaciones que eliminan o disminuyen la actividad del promo1or

Una cara del promotor contiene los pun tos de contacto para el RNA.

DNA etiquetado en una cadena en un solo extremo. El principio es el mismo que rige la secuenciación del DNA: la d ivisión parcial de una molécula etiquetada en un extremo en un sitio susceptible crea un fragmento de longitud única. Como se puede observar en la después del tratamiento con la endonucleasa, los fragmentos de DNA son recuperados y sometidos a electroforesis en un gel que los separa de acuerdo con su longitud . Cada fragmento que retiene un extremo etiquetado produce una banda radioactiva. La posición de la banda corresponde al número de bases que tiene el fragmento. l os fragmenros más cortos se desplazan con más rapidez, por lo que la distancia de l extremo etiquetado se cuenta a panir del fondo del ge l. En un DNA libre, cada posición de enlace susceptible se rompe en una u otra molécula . Sin embargo, cuando el DNA forma un complejo con una proteína, la región cubierta por la proteína de unión al DNA está prolegida en cada molécula . Asf, dos reacciones corren en paralelo: un conu:ol de DN A solo y una mezcla experimental que contiene moléculas de DNA unidas a la proteína. Cuando uua

proceb1a unida bloquea el acceso de la nucleasa al DNA, los enlaces de la secuencia 1m ida no se rompen en la mezcla expenmemal. En el control se rompen todos los enlaces. Esto genera una ~erie de bandas, en donde una banda representa a cada base. Hay 31 bandas en la figura. En el fragmen to protegido, los enlaces no pueden romperse en la región unida a la proteína, por lo que las bandas que representan los fragm entos de los tamaños co rrespondienres no se generan. la ausencia de las bandas 9 -18 en la figura identifica un sitio de 276

CAPÍTULO 11 1ranscripción

unión a la proteína que cubre la región localizada a 9-l8 base!> del extremo del DNA etiquetado. Al comparar las líneas de control y las experimentales por medio de una reacción de secuenciación que corre en paralelo, es posible ''leer" en fo rma directa la secuencia correspondiente, e identificar así la secuencia de nudeótidos del sitio de unión . Como se describió antes (véase la Figura 11.20), la polimerasa de RNA se une en un inicio a la región de -50 a +20. Los sitios en los cuales la polímerasa de RNA sí entra en conracto con el promotor pueden identificarse cuando se modifica la técnica de impresión de huellas para tratar los complejos promotor-polimerasa de HNA con agentes reactivos que modifican bases paniculares. Se puede realizar el experimento de dos formas: • El DNA puede ser mowficado antes de que se una a la polimerasa de RNA. Si la modificación evita qtle la polimerasa de RNA se una, se habrá identificado la posición de una base en la cual el contactO es esenciaL • El complejo DNA-polímerasa de RNApuede ser modificado. Después se compara el pa trón de bandas protegidas con el del DNA libre y con el del complejo no modificado. Algunas bandas desparecen. lo que permite identificar sirios en los cuales la enzima protegió al promoror contra la modificación. Otras bandas aumentan en intensidad, con lo que se identifican siLios en los cuales el DNA debe perman ecer en una conforma ción en la cual está más expuesto. Los cambios de sensibil idad revelan la geometría del complejo, como se resume en la , con un promotor típico. Las regiones -10 y - 35 contienen la mayor parte de los sitios de contacto para la enzima. Dentro de estas regiones, los mismos conjuntos de posiciones tienden a impedir la un ión si fueron modificados con anterioridad y a mostrar un incremento o una disminución de la susceptibilidad a la modificación después de la unión. Los puntos de contacto no co inciden por completo con los sinos de mU[ación; no obsrante, ocurren en la misma región limitada. Es notable que las mismas posiciones en diferentes promotores ofrezcan los puntos de conracto. aunque haya una base diferente . Esto indica que hay un mecanismo común para la unión de la pCIlimerasa de RNA, aunque la reacción no depeod. de la presencia de bases particulares en algunos dIos sitios de contactO. Este modelo explica porqL algunos de estos puntos no son sitios de mutacióAdemás, no wdas las mutaciones se encuentran l un punto de contacto; las mutaciones pueden ir fluir en la vecindad sin ser tocados por la enzima

Es especialmente significativo que Jos experi-

:ntos con modificaciones previas identifican sólo en la misma región que csrá protegida por la zima comra la modiiicación subsiguiente. Estos "experimentos evalúan cosas diferentes. La mo~cadón previa identifica a rodos aquellos sitios que enzima debe reconocer para unirse al DNA. Los ~erimentos de protección reconocen todos los sis que en realidad hacen contacto en el complejo :1ario. Los silios protegidos incluyen todos los si-s de reconocimiento e incluso algunas posiciones idonalcs, lo cual sugiere que la enzima primero .conoce una serie de bases indispensable para que ?-errice" y luego extienda sus puntos de contaao '~tras bases. la región del DNA que está desenrollada en el ::nplejo binario puede identificarse de manera di::.::ta por medio de cambios químicos en su disponi. idad. Cuando se separan las cadenas ele DNA. las -ases no apareadas se hacen susceptibles a agentes =activos que no pueden alcanzarlas en la estructu:: de doble h élice. Dichos experimentos implican siciones entre -9 y +3 en la reacción inicial de :::maturalización. La región desenrollada durante : iniciadón. por lo tanto, incluye el extremo dere.o de la secuencia -1 O y se extiende jusro después _l sitio de inicio. En una perspectiva tridimensional, LOdos los ntos de contacto que se encuentran en semido .:endente de la secuencia -1 O se localizan en una .:-a del DNA. EstO puede observarse en el dibujo ;~rior de la Figura 11.29. en donde los pumos de .~tacto están marcados en una doble hélice vista -~de uno de los lados. La mayor pane yace en la ca_;!a codificadora. Es probable que estas bases sean · ~o nocidas en la formación inicial de un complejo "!ario cerrado. Esto permitiría que la polimerasa de ;A se aproximara al DNA por un lado y recono ~ra dicha cara del DNA. A medida que comiem.a desenrollamiento del DNA, más sitios que origi ,;.!mente yacen en la otra cara del DNA pueden ser _-onoddos y pueden realizarse uniones con ellos. JS

El superenrollamiento es una característica importante de la transcripción (onceptos principales El superenrollamiento negativo incrementa la eficiencia de algunos promotores al ayudar en la reacción de desnaturalización. La transcripción genera superenrollamientos positivos delante de la enzima y superenrollamientos negativos detrás de ella, y éstos deben ser retirados por la girasa y por la topoisomerasa.

(Superenrollamientos Transcripción del DNA negativos)

La lopoisomerasa relaja los superenrollam1entos negativos

Sobregirado (superenrollamientos positivos)

La girasa introduce superenrollamientos positivos

1 ~

~1 DNA dúplex (10.4 bp/vuelta)

La transcripción genera DNA enrollado de forma más compacta (superenrollado positivamente) por delante de la polimerasa de RNA, mientras que el DNA que se encuentra detrás de ésta está enrollado de forma más laxa (superenrollado negativamente) .

La importancia de la separación de las cadenas en la reacción de iniciación sobresale por Jos efecLos del superenrollamiento. Las polimerasas de RNA euca rióticas y procariótica) pueden iniciar la transcripdón con mayor eficiencia in vicro cuando el molde está sobregirado. al parecer porque la estrucLu ra superenrollada requiere menos energía libre para la desnaturalización inicial del DNA en el complejo de inidadón. La eficiencia de algunos promotores está determinada por el grado de )Uperenrollamiento. La relación más frecuente es que el superenrollamiemo negativo ayude a la transcripción. En principio, se entiende cómo esta situación colabora en la reacción de iniciación. Sin embargo, ¿por qué algunos promotores dependen de la extensión del superenrollamiento en tamo que otros no? Una posibilidad es que sea su secuencia la que de termine la dependencia de un promotor en el enrollami eoto excesivo. Esto pennjtiría pronosticar que algunos promotores tienen secuencias más fáciles de desnaturalizar (y. por lo tanto. menos dependientes del superenrollamlemo). al tiempo que oLros tienen secuencias más complejas (y una necesidad mayor de estar supcrenrollados). Una alternativa es que la localización del promotor puede ser importante si las regiones diferentes del cromosoma bacteriano úenen grados distimos de superenrol!amiemo. El superenrollarnlento también tiene una participación constante en la transcripción. A medida que una polirnerasa de RNA transa·ibe el DNA, ocu rre descnrollamiento y enrollamiento, como se ilustra en 1<~ Figura 11.4. Esto requiere que el complejo de Lranscripción completo gire en torno al DNA o que el DNA mismo gire sobre su eje helicoidal. Las consecuencias de la rotación del DNA se ilustran en la en el modelo del bidominío para

11.15 El superenrollamiento es una caracteñstica importante de la transcripción

277

la transcripción. Conio.rme la polimerasa de RNA avanza por la doble hélice, genera superenrollamiento positivo (DNA enrollado de manera más compacta) por delante y produce superenrollamiento negativo (DNA enrollado de forma más laxa) por detrás. Por cada vuelta he licoidal recorrida por la polimerasa de RN A, se genera un giro +1 adelante y un g iro - 1 atrás. Por lo tanto, la rranscripción tiene ~m efecto significativo en la estructura (local) del DNA. Como resultado, las enzimas girasa (que introduce supercnrollamientos negativos) y ropoisomerasa I (la cual retira los superenrollamientos negativos) son necesarias para recrificar la situaciólJ adelante y detrás de la polimerasa, respectivameme. El bloqueo de las actividades de la girasa y de la topoisomerasa provoca cambios importantes en el supercnrollamiento del DNA. Por ej emplo, en las levaduras que carecen de una enzima que relaje superenrollamieotos negativos, la densidad del superenrollamiemo negativo se duplica en una región transcrita. Una implicació11 posible de estos resultados es que la transcripción se encarga de generar una proporción significativa del superenrollamiento que ocurre en la célula. Eo la replicación sucede una situación similar, cuando el DNA debe ser desenrolJado en una horquilla de replicación en movimiento de modo que las cadenas individuales separadas puedan utili7.arse como moldes pa ra la síntesis de cadenas hijas. (Más adelante, en la Figura 19.20, se indican las solu ciones de las restricciones topo lógicas asociadas a dichas reacciones.)

La sustitución de los fa ctores cr puede controlar la iniciación Conceptos principales

• Escherichia coii tiene numerosos factores cr, cada uno de los cuales provoca que la polimerasa de RNA inicie en un conjunto de promotores definido por secuencias específicas -35 y -10. • cr 70 se utiliza en la t ranscripción general y los demás factores cr son activados por condiciones especiales.

La división de labores entre la enzima central, que realiza la elongación de la cadena, y un factor cr, que interviene en la selección del sitio, de i.n.mectiato da 01igen a la pregunta de si hay más de un t ipo de factor o , cada uno específico para una clase diferente de promotores. La muestra el principio de un sistema en el cual una sustitudón del factor o cambia la elección de promotor. Escherichia coli utiliza factores o alternativos para responder a cambios ambientales generales¡ éstos se enlistan en la . (Reciben su nombre 278

CAPlTULO 11 Transcripción

La holoenzlma que incluye a o70 reconoce a un conjunto de promotores ~

0

-

.... .

La sustitución del factor o provoca que la enzima reconozca a un conjunto diferente de promotores

El factor o asociado a la enzima central determina el conjunto de promotores en los cuales debe iniciarse la transcripción.

por el peso molecular del producto o por el gen, El factor general, el cual se encarga de la Lranscrip~ ción de la mayor p arte de los genes bajo condicione~ normales, es cr70 . Los factores o alternativos u 5, o;: oE y o 54 son activados en respuesta a cambios ambientales; el factor o 28 se utiliza pa ra la expresiór: de genes flagelares durante el crecimiento norma! pero su nivel de expresión responde a cambios er el ambiente. Todos los factores cr, excepto cr 54 pertenecen a la misma familia de proteínas y funcionar de la misma forma general. La fluctuación de temperatura es un tipo frecuente de cambio ambiental. Numerosos organismos, Lanto eucarióticos como procariólicos, responden de manera similar. En presencia de u :iucremento de temperatura, la sfntesis de las proteínas que se estaban produciendo se inter rumpe o disminuye y se sintetiza un nuevo conjunto d~ proteínas. Las proteínas nuevas son los producto de los genes de choque térm ico, cuyas funcione-o son proteger a la célula contra el estrés ambienta: Los genes de chogue térmico también se expresaen respuesta a condiciones ajenas al choque térmico. Varias de las proteínas de choque térmico so,.. chaperones. En E. coli, la expresión de 17 proteína de choque térmko es activada por cambios en ll t ransoipclón. El gen rpoH es un regulador necesario para activar la respuesta al choque térm ico. S_ producto es o 32, e l cual func iona como un fact• · cr alternativo que provoca la transcripción de ll genes de choque térmico. La respuesta al choque tér.mico se logra al ircrementar la cantidad de cr 32 cuan.do la temperatu:· aumenta y al disminuir su actividad cuando el cau.bio de temperatura se revierte. La señal básica qt..

..:ce la producción de crH es la acumulación de :eínas desplegadas (desnaturalizadas en forma .jal) que resultan del incremento de la tempera. La proteína crn es inestable, lo cual es im-:ante porque permite que su cantidad aumente • sminuya con rapidez. Las proteínas cr 711 y cru den competir por la enzima cemral disponible. ;.al manera que el conjumo de genes transcritos ~3nte el choque térmico depende del balance en ellos. Los factores cr cambiante~ ~on un asumo • '"'l.l que repercute de manera generalizada en la resión de los genes en las bacterias. Por lo tanto, ~s sorprendente que la producción de facrores cr ~vos pueda ser el objetivo de numerosm circuitos ;;uladores. El factor cr5 es inducido cuando la bac'"'ia transita de la fa~e de crecimiento a la fase estanana y también en otras condiciones de estrés. Es enrolado en clos niveles. La trnducción del RNAm .'S se incrementa con la reducción de la tempe·•ura o con la osmolaridad elevada. La proteólisis =-producto p roteínico es inhibida por escasez de _~bono (la señal típica de la fase estacionaria) y por ~ernperatura alra. Otro grupo de genes regulados por cambios tér~cos e!> controlado por el factor cre. Responde a :mbios más extremos de temperatura que cr}2 y es ·ducido por la acumulación de proteínas desple_..:das en el espacio periplásmico o en la membrana terna. Es controlado por el circuito intrincado que =resume en la . El factor crE se une a na proteína (RseA) que se localiza en la membrana -rema. Como re!>ultado, no puede activar la trans_ipción. la acumulación de proteínas desplegadas _:riva a una proteasa (DegS) en el espacio periplás""!ico, la cual separa el extremo C ele la proteína -:-:.eA. Esta separación activa otra proteína locaUzada ~'i la m embrana interna (YaeL), la cual divide a la ·tgión renninal N de la RseA. Cuando esto sucede. .: factor crF es liberado y puede activar enronces la ;anscripción. El resultado neto es que la acumula_ón de proteínas desplegadas en la periJería de la .acteria se enca rga de la activación del conjunto de _enes controlados por el factor cr. Este circuito tiene dos simiütudes interesantes .:on orros circuitos reguladores. La respuesta a las roteínas desplegadas en las células eucarióticas ambién utiliza una rULa en la cual una proteína 1esplegada (ubicada dentro del retículo endoplás::Uco) acLtva una proteína de membrana. En este .:aso, la proteína de membrana es una eodonuclea sa que divide a un RNA. lo que al final conduce a m cambio en el corte y empalme que ocasiona la .'reducción de un factor de transcripción (véase la ;ección 26.17, La respuesta a proteínas desplegadas ~e relaciona con el corte y empalme del RNAt). Una ~i.m ilitu d más directa se encuentra en el p rime r caso

en ser descubierto, en el cual la separación de una proteína de membrana activa un factor de transcripción. En este caso, el propio fnctor de transcripción es sintetizado como una proteína de membrana y el nivel de esteroles en la membrana controla la activadón de las proteasas que liberan al factor de uanscripción del dominio citosóüco de la proteína . Otro factor cr se utiliza en condiciones de escasez de nitrógeno. Las células de F. co/i contienen una pequeña camidad de cr5 '. el cual es activado cuando no hay amonio en el mectio. En estas condiciones, los genes son activados para permiúr el uso de otras fuentes de niuógeno. Las contrapartes de este fac tor cr se han encontrado en una amplia variedad de bacterias, por lo que representa un mecanismo de respuesta que se ha conservado en la evoluci ón. Otro caso de conservación evolutiva de los factOres cr es el del factor crF, el cual se presenta en pequei'ías cantidades y hace que la polimerasa de RNA

Gen

Factor

Uso

rpoD

0 10

general

rpoS

estrés

rpoH

aS a32

enoque térmico

choque térrn1co

rpoE

aE

rpoN


escasez de Ollrógeno

ffiA

0 2e (aF)

slntesis flagelar

Además de cr10, E. coli tiene numerosos factores cr que son introducidos por condiciones ambientales particulares. (El superíndice del factor indica su masa.)

PERIPLASMA

e

División por DegS

___,.

División

por YaeL

AseA

N

CITOPLASMA

o liberado

Activa la transcripción

RseA es sintetizada como una proteína en la membrana interna. Su dominio citoplásmico se une al factor crf. RseA es dividida de manera secuencial en el espacio periplásmico y después en el citoplasma. la división citoplásmica libera cr1•

n.L6 La sustitución de los factores cr puede controlar La iniciación

279

Gen

Factor

rpoD

(J70

rpoH

dl2

rpoN

c¡54

fliA

(J28

sigH

(JH

Secuencia -35 Separación

(d')

TIGACA CCCTTGAA CTGGNA CTAAA AGGANPuPu

16·18 bp 13-15 bp 6 bp 15 bp 11-12 bp

TATAAT CCCGATNT TTGCA GCCGATAA GCTGAATCA

Los factores o de f. coli reconocen promotores con diferentes secuencias de consenso.

Unión de la en~lma central

t 400

600 t ~~

1. 1 1.2 Impide la

2.12.22.4

unlOn el DNA

• •••• 1

••• •

4.14.2

lnleracclones con el promotor

•• ••••

1

•

! l

••• ••••• •• •

-10

1

-.35

..,_ Gen - - - - - TAATAT•ACAGTT• 5' Un mapa del factor o 10 de f. coli identifica regiones conservadas. Las regiones 2.1 y 2.2 contactan a la polimerasa central, la región 2.3 es necesaria para la desnaturalización y las regiones 2.4 y 4.2 contactan a los elementos promotores de las secuencias -35 y -10. La región terminal N impide que 2.4 y 4.2 se unan al DNA en ausencia de la enzima central.

transa·iba genes que intervienen en la quimiotaxis y en la estructura flagelar. Su contraparte en Bacillus

subtilis es cr0 • el cual controla los genes flagelares y de motilidad; en numerosas especies de bacte1ias hay factores con la misma especificidad promotora. Cada [actor cr provoca que la polimerasa de RNA inicie en u n conjunto panicula r de p romotores. Al analizar las secuencias de estos promotOres, se puede demostrar que cada conjumo es identificado por elementos de secuencia únicos. De hecho. la secuencia de cada üpo de promotor asegura que sea reconocido sólo pox la polimerasa de RNA dirigida por el factor cr apropiado. Se pueden deducir las reglas generales del reconocimiento de los promotores a partir de la identificadón de los genes que responden a los factores cr que se encuentran en H. coli y de aquellos que participan en la esporulación en 8. subtilis (véase la sección 11.19, La esporulación es controlada por factores cr). Una característica significativa de Los promotores para cada en:z_ima es que tienen el mismo tamaño y localización relativa con respecto al pu111o de inicio y muestran secuencias C011Sen,adas sólo alrededor de los centros usuales - 35 y - 1O. (El factOr cr 54 es una excepdón en la cual las secuencias de consenso esrán más cerca 280

CAPÍTULO 11 Transcripción

una de la otra y se ubican en -24 y - 12; véase la sección 11. 17, Los facwres cr entran en comacto de manera directa con el DNA.) Como se resume en la . las secuencias de consenso para cada conjunto de promotores son diferentes entre sí en una de las posiciones -35 y -10, o en ambas. Esto significa que una enzima que contiene un factor o particular puede reconocer sólo su propio conjunt(' de promotores, por Jo que la transcripdón de lo> diferentes grupos es mutuamente excluyente. Er; consecuencia, la sustitución de un factor cr por otr(l desactiva la transcripción del conjunto antiguo de genes y activa la transcripción de un conjunto nuevo . (Algunos genes son expresados por polimerasas de RNA con facwres cr distintos debido a que tiene!" más de un promotor. cada uno con un conjunto d iferente de secuencias de consenso.)

Los factores cr entran en contacto de manera directa con el DNA Conceptos principales • o-10 cambia su estructura para liberar sus regiones de unión al DNA cuando se asocia a la enzima central.

• o 10 se une a las secuencias -35 y -10.

La definición de una serie de secuencias de consenso diferentes reconocidas en - 35 y - lO por ho1oenzimas que contienen factores cr diferentes (véase la Figura 11.34) conlleva la imp licación inmediata de que la subunidad cr debe entrar en contacto con e! DNA en estas regiones. EstO sugiere el principio general que afirma que hay un tipo común de relación entre el factor cr y la enzima central. en la cual el factor cr es colocado de u na m anera específica para que establezca contactos cru ciales con las secuencias promotoras en la vecindad de -35 y -1 0. Las mutaciones del facwr cr que suprimen las: mutaciones en las secuencias de consenso ofrecer indicios dirccws de que el facLor cr entra en contactC' de manera directa con el promotor en las secuencia!" de consenso -35 y -1 O. Cuando una mutación er, una posición panicular del promotor impide que sea reconocido por la polimerasa de RNA y una mutación compensadora en el factor cr permite que la polimerasa utilice el promotor mutanre. la explicación más probable es que el par de bases relevante del DNA sea comacrado por el aminoácido que ha sido sustiruido. Las comparaciones de las secuencias de numerosos factores cr bacterianos permiten identificar las regiones que se han conservado. Sus localizadones en el factor cr70 de E'. coli se resumen en la

srrucwra cristalina de un fragmento de [actor o

a bacteria Thermus aquacicus muestra que estas -~·mes se pliegan en

tres dominios independientes

.a proteína: el dominio o2 contiene a 1.2-2.4. cr3 "lriene a 3.0-1.3 y cr4 contiene a 4. L-4.2 . La Figura 11.35 muestra que dos partes peque de las regiones do~ y cualro (nombradas 2.4 y

2 parLicipan en el contacto con las bases en los -10 y -35, respectivamcme. Estas dos _;ones forman fragmentos peque1ios de hélice ~n la proteína. los experimentos con moléculas - erodúplex muestran que cr70 hace comacLOs con bases sobre todo en la cadena codificadora. y ..:otiene estos conracros después de que el DNA ha desenrollado en esta región. Esto sugiere que actor cr podría !.er importante en la reacción de -;:'la tura lización. .l:il uso de elementos helicoidales o. en las pro•. :1as para reconocer secuencias de DNA d(tplex es ·.cuente (véase la sección 14.11, El represor utili=un elemento hélice-vuelta-hélice para unirse al "A). LO!> aminoácidos separados por tres a cuatro >iciones se encuentran en la misma cara de una ~lice o. y, por lo tanto, están en una posición en o que pueden establecer contacto con los pares de ,;ses adyacentes. La muestra que los ~inoácid os que se encuenrran a lo largo de una ..;ra ele la región 2.4- de la h élice a contactan a las 3Ses de las posiciones - 12 a -10 de la secuencia ·omoLOra - lO. La región 2.3 es semejanre a las proteínas que ~ unen a ácidos nucleicos de cadena individual y -srticipa en la reacción de desnaturalización. Las ~iones 2.l y 2.2 (las cuales forman la pane más - •nservada del [acwr o) intervienen en la interacón con la enzima central. Se asume que todos los ..:¡crores cr se unen a las mismas regiones de la poli terasa central, lo cual garantiza que las reacciones .ean compet itivas. La región terminal N de cr70 tiene funciones re_¡Jladoras importantes. Si es retirada , la proleína -conada adquiere la capacidad de unirse de manera "'pecífica a secuencias promotoras. Esto sugiere que ; región rerminal N actúa como un dominio de au1inh.ibición. Ocluye los dominios de unión al DNA ·¡ando cr7ú está libre. La asociación con la enzima .:entra! cambia la conformación de cr, de tal mane :a que la inhibición es liberada y Jos dominios de m ión al DNA pueden hacer contacto con el DNA. La esquematiza el cambio de con. Hmación del factor o en Ja formación de un com ,Jejo abierto. Cuando el factor cr se une a la polime·asa central. el domino terminal N se balancea -20 \y se aleja de los dominios de unión al DNA, y los .:ominios de unión al DNA se separan uno de otro -15 Á. al parecer para adquirir una conformación ~men10~

Posición

-1~12-11-lo-9-a-7

los aminoácidos de la hélice a 2.4 de cr'0 hacen contacto con bases específicas en la cadena codificadora de la secuencia promotora -10.

Dominios de unión al DNA La región terminal N se une a los dom1nios de unión al DNA en etlaclor a libre Reglón termmal N

El DNA desplaza al extremo N cuando se forma el complejo con eiDNA Reg1ón lerm1nal N

El extremo N de cr impide que las regiones de unión al DNA se unan al DNA. Cuando se forma un complejo abierto, el extremo N se separa 20 Áy las dos regiones de unión al DNA se alejan 15 A.

más alargada, apropiada para hacer contacto con el DNA. Las mutaciones en cualquiera de las secuencias -35 o -1 O impiden que un facror o 70 (grupo terminal N eliminado) se una al DNA, lo cual sugiere que cr10 comacta ambas secuendas de manera simultánea. Esto implíca que d factor cr debe tener una estructura bastante alargada, que rebase los -68 Á de dos vueltas de DNA. En la holoenzima libre. el dorrúnio terminal N se localiza en el sitio activo de los componentes de la enzima central, esendalmenre imitando la localización que el DNA ocupará cuando se forme un complejo de tramcripción. Cuando la holoenzima forma un complejo abierto en el DNA, el dominio terminal N cr es desplazado del sitio activo. Su relación con el resto de la proreína es. por lo tanto. muy flexible; la relación cambia cuando el factor cr se une a la enzima central y de nuevo cuando la holoemima se w1e al DNA. Las comparaciones de las estructuras cristalinas de la enzima central y de la holoenzima muestran que el factor o se encuentra sobre todo en la superfi-

11.17 los factores cr entran en contacto de manera directa con el DNA

281

o-

Enzima centr~l

El factor cr tiene una estructura alargada que se extiende por la superficie de las subunidades de la enzima central cuando se forma la holoenzima.

de transcripción dirigido por cr 54 requiere que otros aclivadores se uóah a silios que están bastante distantes del promotor. Esto contrasta con los otro~ tipos de promotores bacterianos. para los cuales lo~ sitios reguladores están siempre muy cerca del promotOr. El comportamiento de crs4 es diferente al de otros facrores cr. sobre todo en lo que se refiere a su capacidad para unirse al DNA independientementt de la polimerasa central. En este aspecto, cr 5'1 es m~ parecido a los reguladores eucarióticos que se analizan en el Capítulo 24, Promotores y potenciadores. que a los reguladores procarióricos típicos que se abordan en el Capüulo 12, El operón.

Los fa ctores cr pueden organizarse en cascadas Conceptos IJrincipJles Una cascada de factores cr se crea cuando un factor cr es necesario para transcribir al gen que codifica al siguiente factor cr. Los genes tempranos del fago SPOl son transcritos por una potimerasa de RNA hospedadora. • Uno de los genes tempranos codifica un factor cr que hace que la polimerasa de RNA transcriba los genes intermedios. • Dos de los genes intermedios codifican subunidades de un factor cr que hacen que la polimerasa de RNA transcriba los genes tardfos.

El DNA en un inicio entra en contacto con el factor a (en color rosa) y con la enzima central (en color gris). Se desplaza más hacia el interior de la enzima central para formar contactos con la secuencia -10. Cuando a es liberado, la anchura del pasaje que contiene al DNA aumenta. Reproducida de Vassylyev, O. G., et at. Nature. 2002. 417: 712-719. Fotograña cortesía de Shigeyuki Yokoyama, The University of Tokyo.

cie de la enzima centraL La muestra que tiene una estructura alargada que rebasa el sitio de urúón al DNA. Esto lo coloca en una posición que le permitehacercomacto con el DNA durante la unión inicial. La hélice de DNA tiene que desplazarse unos 16 Á a partir de la posición inicial para entrar al sitio activo. La ilustra este movimiento. visto en cone transversal a lo largo del eje heJicoidal del DNA.

En el factor crH se observa una diferencia interesante de comportamiento. Esto provoca que la polimerasa de RNA reconozca los promoLOres que tienen una secuencia de consenso distinta, con un elemento conservado en -12 y con otro en la cercanía ubicado en -24 (expuesto en la columna "'-35H de la Figura ll.32). Por lo tanto, la geometría del complejo poümerasa-promotor es difere::nte bajo la dirección de este factor cr. Otra diferencia en el mecanismo de regulación es que un nivel alto 282

CAPÍTULO 11 Transcripción

Los factores cr se utilizan de manera amplia para controlar la iniciación de la transcripción en la bacteria B. subtilis, en la cual se conocen -lO factores e distintos. Algunos se encuentran en las células vegetativas; otros se producen sólo en circunstancia' especiales de infecciones por fagos o en el cambh. de crecimiento vegerativo a esporulación. La pri.ndpal polimerasa de RNA observada en la~ células de B. sub tilis que participan en el crecimient vegetativo normal Lienc la misma estructura que 1? polimerasa de RNA de E. coli, a2 ~Wcr. Su factor e (descrito como crH o cr") reconoce promotOres cor las mismas secuencias de consenso urilizadas por la enzima de E. coli bajo la dirección de cr70 • Much ~ variantes de la polimerasa de RNA que conriene:otros factores cr se encuentran en cantidades much más pequeñas. Las enzimas variantes reconoce~ promotores distintos con base en las secuencias dt consenso localizadas en -35 y en - 10. La transición de la expresión de un conjunt de genes a la expresión de otro conjunto es un: característica común de la infección por bacteriófagos. En todos las casos, excepro en los que son m u simples, el desarrollo del (ago comprende cambie en el patrón de transcripdón durante el ciclo infec-

tSO. Esros cambios pueden lograrse gracias a la ..tesis de una polimerasa de RN A codificada por los !!OS o a los esfuerzos de los factores accesorios coleados por los fagos que controlan Ja polimerasa - RNA bacteriana. Un ejemplo bien caracterizado . :: comrol mediante la producción de factores cr _evos ocurre dura me la infección por el fago SPO 1 : B. subcilis. El ciclo infeccioso de SPO 1 pasa por tres eta~, de expresión génica. En cuanto tiene lugar la ..:ección se transcriben los gen es t empranos del -?O. Después de 4 a 5 min, cesa la transcripción de s genes tempranos y comienza la transcripción =los genes interm edios. A los ocho a 12 min, la -:mscripción de los estos genes es remplazada por -transcripción de los genes tardíos. Los genes tempranos son transcri tos por la he enzima de la bacteria hospedadora. En esencia, . imposible distinguirlos de los gene~ hospedado-S cuyos promotores tienen la capacidad intrín.:ca de ser reconocidos por la polimerasa de RNA

Temprano Los promotores del lago son reconocidos por la holoenzima bacteriana

0

El gen temprano 28 codifica a un factor a nuevo que desplaza al factor a bacteriano

Intermedio La enzima central-gp28 transcribe a los genes intermedios del faso

-~wcr·u.

La expresión de los genes de los fagos es indiscnsable para las transiciones a la transcripción de 5 genes intermedios y tardíos. Tres genes regulares, 28, 33 y 34, controlan el curso de la transcrip~·n. Sus funciones se resumen en la parrón de reguladón crea una cascada, en la cual - enzima hospedadora transcribe un gen tcmpracuyo producto es necesario para transcribir los nes intermedios. Después de esta transcripción, s de los genes intermed ios codifican productos - jispensables para transcribir los genes tardíos. Los organismos con mutaciones en el gen tem-ano 28 no pueden transcribir los genes interme)$ . El producro del gen 28 (denominado gp28) una proteína de 26 kD que remplaza al factor - hospedador en la enzima central. Esta sustitución d único hecho requerido para hacer la transición de -expresión de los genes tempranos a la expresión de los zes intermedios. Esto crea una holoenzima que ya puede transcribir más los genes del hospedador .:'O cambio transcribe de manera específica los ge<:S intermedios. No se sabe cómo el producto gp28 ..:splaza a cr0 o qué le sucede al polipéptido cr hosc:dador. Dos de los genes intermedios panidpan en la ;uiente transición. Las mutaciones en el gen 33 en el gen 34 impiden la transcripción de los ge~s tardíos. Los productos de estos genes forman ~ dímero que remplaza a gp28 en la polimerasa =mral. Una vez más, se desconoce cómo gp33 y _.... 34 excluyen a gp28 (o a cualquier cr-' 3 hospedador =-sidual), pero una vez que se han unido a la enzima 1tral, ésta es capaz de iniciar la transcripción sólo en los -.mwtores de los genes tardfos.

Tardio La enzima central·gp33·gp34 transcribe los genes tardíos del lago

=

La transcripción de los genes del fago SP01 es controlada por dos sustituciones sucesivas del factor a que cambian la especificidad de la interacción.

Los remplazos suces ivos del factor cr tienen consecuencias dobles. Cada ve7 que se cambia la subunidad, la polimerasa de RNA adquiere la capacidad de reconocer a una nueva clase de genes y deja de reconocer a la clase anterior. Por lo tanto, estos cambios constituyen cambios globales en la actividad de la polimerasa de RNA. Es probable que teda, o casi toda, la enzima central se asocie al factor cr de ese momento, y el cambio es irreversible.

La esporula ción es controlada

por factores o Conceptos pdncipates • La esporulación divide a una bacteria en una célula madre que es desintegrada y una espora que es liberada. • Cada compartimiento avanza a la siguiente etapa de desarrollo al sintetizar un factor a nuevo que desplaza al factor cr anterior.

• La comunicación entre los dos compartimientos temporiza las sustituciones de los factores

a.

11.19 La esporulación es controlada por factores a

283

getativa) da origen a dos células hijas djstintas cor

o

Bacteria vegetativa

El DNA se replica

Se forma el tabique

destinos diferentes: la célula madre a la larga se lis..:

VM'VN/VNNI \lli1NNNI\INI

VNJVMIVJVNI V.t.IM MVN1

El DNA se transfiere al interior de la pre-espora

VNA/MVJVN/

La espora es engullida

V /Vi\/I'V 1\IA/lVr

Se forma la cubierta de la espora

~11

La célula madre se lisa

La espora se libera

VX/lVNNJVNI

¿/ \

~¡'

"'~ ~

'\..

klv;] ~~:;¡

~

La esporulación comprende la dife(enciación de una bacteria vegetativa en una célula madre que se lisa y en una espora que se libera.

Quizá el ejemplo más extenso de cambios en los factores cr lo ofrece la esporulación, otra forma de vida de disponer algunas bacterias. Al final de la fase vegetativa en un cultivo de bacterias, el crecimiento logarítmico es interrumpido debido a que los nutrientes en el medio se agotan. Esto activa 1a esporuladón. como se ilustra en La El DNA es replicado, un genoma es segregado en un extremo de la célula y a la larga el genoma es rodeado por la cubierta rígida de 1a espora. Cuando se forma eJ tabique. genera dos compartimientos independientes, el de la célula madre y el de la pre · espora. Al principio del proceso se adhiere un o-omosoma a cada polo de la célula. El tabique creciente atrapa parte de un cromosoma en la pre-espora, y después una transloc:asa (Spol-IIE) bombea al resto del cromosoma al interior de la pre-espora . La esporulación sucede en unas 8 h. Puede con siderarse como un tipo primitivo de diferenciación. en el cual una célula progenitora (la bacteria ve284

CAPÍTUlO 11

Transcripción

y la espora que es liberada tiene una estructura p()completo diferente a la de la baCLeria original. La esporulación implica un cambio drástico er las actividades biosintéticas de la bacteria, en el cua participan numerosos genes. El nivel básico de con· troJ sucede en la transcripción. Algunos de los gene que funcionaron en la fase vegetativa son apagadl durante la esporulación, pero la mayor parte conL=... núa siendo expresado. Además, los genes especi&cos utilizados para la esporulación se expresan só! durante este periodo . Al final de la esporuladóc ~40% del RNAm bacteriano es especifico de la ~­ porulación. Las formas nuevas de polimerasa de RNA se activan en las células sometidas a esporuladón; ésta contienen la misma enzima central que las célulavegetativas, pero tienen proteú:las diferentes en lug~ del factor o-4 3 vegetativo. Los cambios en la especific-dad de la transcripción se resumen en la El principio especifica que en cada companimiem el factor cr existente es desplazado en forma sucesi\: por un factor nuevo que provoca la transO'ipción é. un conjunto diferente de genes. La comunicacié entre Jos compartimientOs ocurre para coordim la cronología de los cambios en la pre-espora y e11 :. célula madre. La cascada de esporuladón inicia cuando la. condiciones ambientales activan un fosforrelevador, en el cual un grupo fosfato pasa por una ser' de proteú1as hasta que alcanza a SpoOA. (Numer" sos productos génicos intervienen en este proce~ cuya complejidad puede reflejar la necesidad de e' tar errores y desencadenar de manera innecesaria esporulación.) SpoOA es un regulador de la tran cripdón cuya actividad es afectada por la fosfori!!' ción. En la foxma fosfori lada, acLiva la transcripd oe dos operones, cada uno de los cuales es transcr· por una forma diferente de la polimerasa de R~. hospedadora. Bajo la dirección de un SpoOA fe forilado. 1a enzima hospedadora que utiliza el egeneral transcribe al gen que codifica al factor cr' la enzima hospedadora cfuigida por un {actor men\ crH, transcribe al gen que codifica al factor pro-a ". E tos dos factores cr nuevos son producidos antes de formación del tabique, pero se activan después. El factor crF es el primero en ser activado en comparUmienLo de la pre-espora. Es inhib ido r un factor anti-cr que se une a él; en la pre-espora, _ factor anti-anti-cr retira al inhibidor. Esta reacci es controlada por una serie de episodios de fos rilación /desfosforilación. El determinante inicia · una fosfatasa (SpollE) que es una proteína lme~ :· de membrana que se acumula en el polo, lo c. resulta en un incremento de la concentración .

CÉLULA MAD~E La holoenzlma contiene di o a 43

El fosforrelevador activa la síntesis de aFyaPro·E

'.!;:.E

~y

aE es activado

PRE·ESPORA

~

cf(

aF remplaza a a 43

desplaza

en la enzima central

a a43

~

Se crea el gen crK; es transcrito por aE

-~

l

aG es el producto de un gen

l

temprano de la esporulación

~ Se activa aG y desplaza a oF

Se activa crK y desplaza a crE

~

l

cr'

El factor aK achvado promueve la transcnpción de Jos genes tardfos

El factor aG activado promueve la transcripción de los genes tardfos

La esporulación involucra cambios sucesivos en los factores o que controlan la especificidad de la iniciación de la polimerasa de RNA. Las cascadas de la célula madre (lado izquierdo) y de la pre-espora (lado derecho) están vinculadas por señales que pasan a través del tabique (indicadas con flechas horizontales).

.'Ominio fosfatasa en la pre-espora . Desfosforila y, --or lo tanto, activa, al factor SpollAA, el cual a su ~z desplaza al factor ami-o SpoiiAB del complejo SpoUAB-or. La liberación de oF lo activa. La activación de oF determina el inicio de la esorulación. Bajo la dirección de oF, la polimerasa :.e RNA transcribe el primer conjunto de genes de .:sporulación en vez de los genes vegetativos que ~taba transcribiendo ames. Es probable que la reacjón de remplazo afecte sólo a parte de la población .ie polimerasa de RNA, debido a que oF se produce sólo en pequeñas cantidades. Una escasa cantidad ue enzima vegetativa prevalece durante la esporula,.:ión. El cru desplazado no es destruido; puede ser re.:uperado de extractos de células en esporulación.

Dos episodios reguladores siguen a la actividad de crF, como se detalla en la . En la preespora, orro factor, oG, es el producto de uno de los genes tempranos de la esporulación. El factor crG hace que la polimerasa de RNA transcriba los ge· nes de esporulación tardíos en la pre-espora. Otro producto génico temprano de la esporulación se encarga de la comunicación con el compartimiento de la célula madre. El facror crF activa a SpoliR, el cual es secretado de la pre-espora. Después acliva a la proteína de unión a la membrana SpoiiGA para transformar al precursor inactivo pro-oc en el factor activo crEen la célula madre. (Cualquier oE produ cido en la pre-espora es degradado por funciones específicas de la pre-espora.) 11,19 La esporulación es controlada por factores cr

285

CÉLULA MADRE

El factor crr desencadena la síntesis del siguiente factor cr en la pre-espora (crc) y activa a Spo11R, que provoca que SpoiiGA divida a pro-crE.

1-

CÉLULA MADRE

PRE-ESPORA SpoiiE-SpoiiAA

··....... 0 ••..·

. y Proteólisis

crK

•

SpoiiiA y Factor

..

• •.._ desconocido

......·

el'

La regulación entrecruzada de la esporulación coordina la cronología de los episodios que suceden en la célula madre y en la pre-espora .

La cascada continúa cuando aE es remplazado por aK. (De hecho, la producción de aK es bastante compleja. debido a que primero su gen debe ser creado por un episodio de recombinación.) Este factor también es sintetizado como un precursor inactivo (pro-aK) que es activado por una proteasa. Una vez que aK ha sido activado, desplaza a aE y provoca la t ranscripción de los genes tardíos en la célula madre. La cronología de estos sucesos en los doS"Compartirnientos es coordinada por seña les adicionales. La actividad de aE en la célula madre es necesaria para la activación de aG en la pre-espora; en cambio, La aaividad de aG es necesaria para generar una señal que es transmitida a través del tabique para activar a a K. De este modo, la esporulación es controlada por dos cascadas, en las cuales los factores a de cada 286

CAPÍTULO 11 Transcripción

La poli me rasa de RNA bacteriana termina en sitios di scretos Concepto principal

aF

SpoiiGA-SpoiiR Proteólisis

compartimiento son activados en forma sucesiva cada uno dirige la síntesis de un conjunto partícut de genes. La ilustra la forma en la cu_ las dos cascadas están conectadas por la transmisk de señales de un compartimiento al otro. A medit que se activan los factores a nuevos, los factor(' a antiguos son desplazados, de tal manera que 1.: transiciones de los factores a apagan y enciendea los genes. La incorporación de cada factor en polimerasa de RNA detennina cuándo se expre ..~ su conjunto de genes diana, y la cantidad de facr disponible influye en el nivel de expresión gét: ca. En un momento dado puede activarse más -.:. un factor a, y las especificidades de algunos de i factores a se superponen. Se desconoce de qué dr-pende la capacidad de cada facto r a de remplazar su predecesor.

• La terminación puede requerir el reconocimiento de la secuencia terminadora en el ONA y la formación de una estructura en forma de horquilla en el producto de RNA .

Una vez que la pollmerasa de RNA ha iniciado _: transcripción, la enzima se desplaza por el molct~ sintetizando RNA, hasta que encuentra una secuer: cía terminadora. En este punto, la enzima deja d agregar nucleótidos a la cadena crecieme de RN.libera el p roducto terminado y se disocia del me · de de DNA. La terminación requiere que todos ir puentes de hidrógeno que mantienen unido al cor:-plejo RNA-DNA se rompan, después de lo cual :;. reconstituye el DNA dúplex. Es difícil definir el sitio de terminación ó~ una molécula de RNA que ha sido sintetizada en urcélula viva. Siempre es posible que e1 extremo : de la molécula haya sido generado por división detranscrito primario y, por lo tamo, no representa t sitio real en el cual terminó la polimerasa de RN.~ La mejor identificación de los sitios de term. nación la ofrecen los sistemas en los cuales la pc. limerasa de RNA termina in vitro. La capacidad dt la enzima para terminar depende en gran medid_ de cienos parámetros como la fuerza iónica; cmr resultado, su terminación en un punto panicul:. in vitro no demuestra que este mismo punto sea u term inador natural. Sin embargo, se pueden identificar extremos 3' auténticos cuando se genera mismo extremo in vitro e in vivo. La resume los dos tipos de caractt• rísricas en los termi11adores bacterianos.

• Los terminadores de las bacterias y de sus fagos se han identificado como secuencias necesarias para la reacción de terminación (in vitro o in vivo). Las secuencias de los terminadores procarióticos no muestran similirudes más allá del sitio en el cual se agrega Ja última base al RNA. La responsabiJjdad de la terminación recae en las secuencias ya transcritas por la polimcrasa de RN A. Por Jo tanto, la terminación se basa en la exploración del molde o del producto que la polimerasa está transcribiendo en este momento. • Muchos terminadores requieren que se forme una horquilla en la esuuctLua secunda ria del RNA que está siendo transcrito. Esto

1111

Hay dos tipos de terminadores en E. coli

Concepto principal l os terminadores intñnsecos están formados por una horquilla abundante en G-C localizada en el producto de RNA seguida por una región rica en U en la cual ocurre la terminación.

En E. coli, los terminadores se distinguen por la necesidad de la polimerasa de RNA de algún ou·o factor para realizar la terminación in vitro:

indica que la terminación depende de un producto de RNA y no está determinada tan sólo por la exploración de la secuencia de DNA durante la transcripción. Los terminadores varían mucho en cuanto a su _fictencia de terminación. En algunos terrninado~s. el episodio de terminación puede impedirse por ~edio de factores accesorios específicos que interac:Jan con la polimerasa de RNA. La antiterminad ón hace que la enzima continúe la transcripción -nás allá de la secuencia de terminación, un suceso :!enominado u ltra lectura (el mismo término uti~zad o en la sección 9.l4, Los supresores pueden :ompetir con la lectura de tipo silvestre del código. :-tara describir la supresión de los codones de termi,adón de un ribosoma). Al examinar el hecho de la terminación, se le debe considerar no sólo como un mecanism o para ;5enerar el extremo 3' de la molécula de RNA. sino como una oportunidad de comrolar la expresión génica. Por lo tanto, las etapas en las cuales la poirnerasa de RNA se asocia al DNA (iniciación) o se disocía de él (terminación) están sujetas a un control específico. Hay similitudes interesantes entre los sis:emas empleados en la iniciación y en la terminaáón. Ambos requieren que se rompan los puentes de hidrógeno (desnaturalización inicial del DKA en la inkiación y disociación del complejo de DNA-RNA en la terminación), y ambos requieren la adición de proteínas para interactuar con la enzima cenual. De hecho, se logran por formas alternativas de la polimerasa. Mientras que la iniciación se basa tan sólo en la interacción entre la polimerasa de RNA y el DNA dúplex, el episodio de terminación implica el reconocimiento de señales en el transcrito por parte de la polirnerasa de RN A o de factores accesorios, así como el reconocimiento de las secuencias del DNA.

TOdas las secuencias n e<:esat1o~ para la 1ermlno.clón se encuentran on la reg16n uenscrila

'

La horqu1na que se

l tocatiza on el RNA

+puedtt ser necesaria La polimerasa de RNA y el RNA 500 ~befados

las secuencias de DNA necesarias para la terminación se localizan en sentido ascendente con respecto a la secuencia terminadora. La formación de una horquilla en el RNA puede ser necesaria.

AGUU

U

A

G G A A UG GC GC CG

a Ao UA GC

'eAUdi AU AU

gg Reglón abundante en pares G·C e G localizada en el tallo CG

u

A GCA

A

Fragmento de cadena lndilltdual

u jrtroenu UUUUU

los terminadores intrínsecos incluyen regiones de palíndromos que forman horquillas cuya longitud varía de 7 a 20 bp. la estructura tallo-lazo incluye una región rica en G-C y es seguida por un fragmento abundante en residuos de U. 11.21 Hay dos tipos de terminadores en E. coli

287

• La enzima cenrral puede terminar i11 vitro en cienos sitios en ause11eia de algún orro facro r. Esros sitios se denominan termina-

dores intrínsecos. • Los terminadores dependientes de p se definen por la necesidad de aüad.ir el factor rho (p) in vitro, y las mutadones demuestran que el factor interviene en la terminación in vivo. Los term inadores intrínsecos tienen dos características estructurales mostradas en la una horquilla en la estructura secundaria y una región en el extremo de la unidad abundanre en residuos de U. Ambas características son indispensables para la Terminación. La horquilla casi siempre contiene una región rica en G-C cerca de la base del tallo. la distancia típica entre la horquilla y la región rica en U es de siete a nueve bases. Hay -1 100 secuencias en el genoma de E. coli que cumplen con estos criterios, lo cual sugiere que cer.ca de la mirad de los genes t iene terminadores imrínsecos. Las mutaciones puntuales que impiden la terminación ocurren dentro de la región del tallo de la horquilla. ¿Cuál es el efecto de una horquilla en la lranscripclón7 Es probable que rodas las horquillas que se forman en el producto
288

CAPÍTULO 11 Transcripción

terminación. Sin embargo, la e fi ciencia de la ternünación in vitro varía de 2% a 90% y no se correlaciona de manera sencilla con la constitución de la horquilla o con e l número de residuos de U en la región rica en U. Por lo ramo, la horquiUa y la región abundante en U son necesarias, aunque insuficientes, y otros parámetros influyen en la interacción con la polimerasa de RNA. Dn particular. las secuencias que se encuentran en sentido ascendente y descendente con respecto al ter minador inn·ínseco afectan su eficiencia. Se conoce menos aún sobre las señales y sobre los facw res accesorios involucrados en la terminación de las polimerasas eucarióticas. Cada clase de polimerasa miliza un mecanismo diferente (véase el Capítulo 26, Corte, empalme y procesamiento dei RNA).

liD

¿Cómo funciona el factor p?

Concepto principal

• El factor p es una proteína terminadora que se une a un sitio rut ubicado en un RNA naciente y viaja por el RNA para liberarlo de la estructura del híbrido de RNA-DNA en la polimerasa de RNA.

El factor p es una proteína esencial en E. coli que funciona sólo en la etapa de la tenninadón. Actúa en terminadores dependientes de p, los cuales representan cerca de la mitad de los terminadores de

E. coli. La muestra cómo funciona p. Primero se une a una secuencia dentro del transcrito en sentido ascendente con respecto a l sitio de terminación. A esta secuencia se le denomina sitio rur (po.r sus siglas en inglés: rho utilization). El p después viaja por el RNA hasta que encuentra una polimerasa de RNA. Cuando la polimerasa de RNA alcanza el sitio de terminación, p actúa sobre ellu'brido de RNA-DNA en la enzima para provocar la líberación del RNA. La pausa que hace la poUmerasa en el sitio de terminación proporciona riempo para que e. factor p se uansfi.era al fragmento híbrido, lo cual e~ una característica importante de la terminación . Se observa <1quí un principio general importante. Cuando se conoce el sitio del DNA en el cu
~:.üere

sitios que sean independientes de los ter"'"Jadores). Las características comunes de !os sitios rut son _::: la secuencia tiene una alta concentración de ~duos de C y una concemración baja de residuos - G y que no tienen una estructura secundaria. En se ilustra un ejemplo. La C es por ~cho la base más común (41 %) y laG es la base :::1os frecuente ( 14% ). La longitud de los sitios rut - variable. Como regla general. la eficiencia de un ·o rut aumema con la longitud de la región rica :: e y escasa en G. El factor p es un m iembro de la fam ilia de las =licasas hexamérícas dependientes de ATP. La bunidad tiene un dominio de unión al RNA y un minio de hidrólisis de ATP. El hexámero funciona pasar el ácido nuclcico por una cavidad ubicada :" la mitad del ensamble formado a panir de Jos - minios de unió n al RNA de las subunidades. La muestra que la estwctura del factor p 7ece algunos indicios de cómo funciona. Enrolla el =':\A desde el extremo 3' alrededor del exterior de - dominios terminales N, y empuja el extremo S' -=la región unida hacia el interior. en donde se une ~m dominio secundario de unión al RNA en los •minios terminales C. La forma inicial del factor p =.;un anillo discontinuo, pero la unión del RNA lo ~ )nviene en un anillo cerrado. Después de la unión al sitio rut, p utiliza su ac...,., idad helicasa. conducida por la hidrólisis de ATP. ara transferirse a lo largo del RNA hasta que al:anza al fragmento híbrido de RNA-DNA en la po merasa de RNA. Después desenrolla la estructura . :lplex. No se sabe sl esta acción es suficiente para ....:Jerar el transcrito o si p también interactúa con la -<>limerasa de RNA para ayudar a liberar el RNA. ~ factor p actúa como factor accesorio de la poli"tlerasa de RNA; por lo generaL su actividad máxi::-~a in vitro se exhibe cuando está presente en una :oncentración de - 1O% de la concentración de la - olimerasa de RNA.

Au .. G

La polimerasa de ANA transcribe al DNA

El factor p se transfiere a lo largo del ANA

La pollmerasa de ANA hace una pausa en la horquilla y se agrega el factor~

-:r

~ La

-

r

'

El factor p desenrolla al híbrido ~ANA-DNA

El factor p se une al RNA en un sitio rut y se transfiere a lo largo del RNA hasta que encuentra un híbrido de RNA-DNA en la polimerasa de RNA, en donde libera al RNA del DNA.

UA ' U AUAU J r1K - u~ Ur' AAA-:: Gr UA Bases 41% A 25% u 20% G 14%

..,

!:Mic.J:I~i.JI:ó:ll:.li.'l'-'L:~,....C.~Io.&l'o.'T.Of' ....-~- ..•

U GA

AGAAAGGCGU U UU

delación impide la terminación ~

Un sitio rut tiene una secuencia rica en Cy deficiente en G que precede al sitio, o a los sitios, de terminación. La secuencia corresponde al extremo 3' del RNA. 11.22 ¿Cómo funciona el factor p?

289

El monomero p tiene dos dominios

( de unión al ANA

Domln

El anillo hexaménoo

se une al ANA

3'

El factor p tiene un domi nio terminal N de unión al RNA y un dominio terminal C con actividad ATPasa. Un hexámero en forma de anillo discontinuo se une al RNA a lo largo del exterior de los dominios terminales N. El extremo 5' del RNA se une a un sitio de unión secundario en el interior del hexámero.

Es necesario para p lransferirse a lo largo del RNA desde el silio rut hasta el lugar de la terminación. Eslo requiere que el factor se desplace más rápido que la polimerasa de RNA. La enzima hace una pausa cuando alcanza un terminador y la terminación ocurre si p lo captura ahí. Por lo tanto, hacer una pausa es importante en la terminación

TIPO SILVESTRE

dependiente de p, del mismo modo que en la temu· nación intrínseca, porque hay tiempo de que ocurran los demás sucesos necesarios. La idea de que p se desplaza por el RNA conduce a una predicción importante con respecto a la relación entre la transcripción y la traducción Rho primero debe tener acceso a una secuencia de unión en el RNA y después deber ser capaz de desplazarse a lo largo del RNA. Una o ambas condiciones pueden ser impedidas si los ribosomas está!'! traduciendo un RNA. Por lo tanto, la capacidad de: factor p para alcanzar a la polimerasa de RNA er: un terminador depende de lo que está sucediendc en La traducción. Este modelo explica un fenómeno desconcertante. En algunos casos, una mutación sin sentidc en un gen de una unidad de transcripción impide la expresión de los genes subsiguientes en la unidad. Este efecto se denomina p ola ridad. Una causa frecuente es la ausencia del RNAm que corresponde a las partes subsiguientes (distales) de la unidad. Supóngase que hay terminadores dependiente~ de p dentro de la unidad de transcripción, es decir ames del terminador que se utiliza de manera habitual. Las consecuencias se ilustran en la En general, estos terminadores más tempranos no son utilizados debido a que los ribosomas impider. que p alcance a la polirnerasa de RNA. Sin embargo una mutación sin sentido libera a los ribosomas, de tal manera que p es libre de adherirse al RNAm e desplazarse por él, lo que le permiLe acLuar sobre lé

MUTANTE SIN SENTIDO

Los ribosomas empaquetan al RNAm detrás de la polimerasa de RNA

Los ribosomas impiden la adhesión o el movimiento del factor p

Los ribosomas se disocian en la mutación

p se adhiere pero los ribosomas impiden su movimiento

p obtiene acceso a la polimerasa de ANA

La transcripción continúa

La transcripción termina de forma premalura

La acción del factor p puede crear un vínculo entre la transcripción y la traducción cuando el terminador dependiente de p se encuentra enseguida de una mutación sin sentido.

290

CAPÍTULO 11 Transcripción

=:asa de RNA en el terminador. Como resulenzima es liberada y las regiones distales de ;dad de transcripción nunca son expresadas. -qué debe haber terminadores internos? Quizá ·3n sólo secuencias que por coincidencia imi. terminador dependiente de p usual. ) Algunas ::-:ulas estables de RNA que tien en una estructu=:-undaria extensa son protegidas de los efectos _:-::os, al parecer debido a que la estructura impide :.ilesión o el movimiento de p. : .as mutaciones del gen rho influyen de muy .rsas maneras en la terminación. La naturaleza ~ del efecto es la incapacidad de realizar la ter~ción. Sin embargo, la magnitud de esta impo_dad, como se observa en el porcentaje de ultra-$ a in vivo, depende del locus diana particular. - -"rma similar, la necesidad de factor p in vitro es .5ble. Algunos terminadores (dependientes de p) .áeren concentraciones relaüvamente altas de p, ~tras que otros funcionan muy bien con nive ¡)ajos. Esto sugiere que terminadores diferentes ..,Jieren niveles distintos de factor p para la termi_ón y, por lo tamo, responden de forma diferente s niveles residuales de factor p en los mutantes :o mutantes p suelen ser permeables ). Algunas mutaciones del gen rho pueden ser su· .midas por mutaciones en otros genes. Este mé.:o ofrece u na manera excelente para iden tificar proteínas que imeractúan con p. La subu nidad .!e la polimerasa de RNA participa en dos tipos .:: mutaciones. En el primero, las mutaciones en el -n rpoB pueden reducir la terminación en un sitio ::-'"~endiente de p. En el segundo, las mutaciones del -~~ rpoB p ueden restaurar la capacidad de terminar transcripción en sitios dependientes de p en bac.:rias con rho mutantes. Sin embargo, se desconoce ..:é f1.mción tiene la interacción. .3

La antiterminación es un episodio regulador

TERMINACIÓN

Sólo se transcribe la región 1

• - - - Región 1 --~•---- Aegión Promotor

2-----.

Terminador

El RNA es sólo de la región 1 ANTiTEAMINACIÓN

Se transcriben las regiones 1 y 2

La polimerasa de ANA continúa

El ANA representa las regiones 1 y 2

La antiterminación puede controlar la transcripción al determinar si la polimerasa de RNA termina o lee la siguiente región atravesando un terminador particular.

l a polimerasa de A NA transcribe desde el promotor hasta el terminador

La proteina antiterminación permite a la polimerasa de RNA dejar atrás al terminador

Conceptos princ.1pales • La terminación es inhibida cuando las proteínas antiterminación actúan sobre la polimerasa de RNA para provocar que ésta lea a través de un terminador específico o de varios de ellos. • El fago A. tiene dos proteínas antiterminación, pN y pQ, las cuales actúan en diferentes unidades de transcripción.

_a antitermina ción sirve como un mecanismo de :ontrol en los circuitos reguladores de los fagos y en os operones bacterianos. La muestra que la antiterminación controla la capaddad de la enzima para leer a través de un terminador a los ge-

Proteína antiterminación RNA Las protefnas antiterminación actúan en terminadores específicos Unidad de transcripción Temprana inmediata Temprana inmediata Tard ía

Promotor

Terminador

pl

/l

PAI

tA l

p A,

IR·

Proteína antiterminación pN pN pQ

Una proteína antiterminación puede actuar sobre la polimerasa de RNA para permitirle la ultralectura de un terminador específico . 11.23 La antiterminación es un episodio regulador

291

nes que yacen más allá. En el ejemplo que se muestra en la figura. la rura predeterminada establece que las polimerasas de RNA terminen al final de la región 1; sin embargo, la antirerminación le pernúte continuar la transcripción a través de la región 2. El promotor no cambia, por lo que ambas situaciones producen un RNA con las mismas secuencias 5'; la diferencia es que después de la antiterminación el RNA se extiende para incluir secuencias nuevas en el extremo 3'. La ami terminación se descubrió en las infecciones por bacterió{agos. Una característica frecuente en el control de la infección por fagos es que muy pocos de los genes de estos virus (los genes "tempranos~) pueden ser transcriros por la polimerasa de RNA hospedadora. No obstante, entre estos genes hay reguladores cuyos productos permiten que se exprese el siguiente conjunto de genes de los fagos (véase la secdón 14.4, Dos tipos de episodios reguladores con trolan la cascada lítica). Uno de estos tipos de regulador es una p r oteína antiterminación . La muestra que ésta permite que la polimerasa de RNA lea a U'avés de un terminador, lo q ue extiende el transcrito de RNA. En ausencia de la proteína antiterminación, la polimerasa de RNA termina en el terminador (segmento superior de la figura) . Cuando la proreína antitemúnación está presente, continúa más allá del terminador (segmento medio de la f1gura). El ejemplo de amiterminacióo mejor caracterizado lo proporciona el fago A., en el cual se descubrió el fenómeno. Se utiliza en dos etapas de la expresión del fago. La proteína anliterminación producida en cada etapa es específica para las unidades de transcripción particulares que se expresan en esa etapa. como se resume en el segmento inferior de la Figura 11.52. La poHmerasa de RNA hospedadora transcribe en un inicio dos genes, los cuales se denominan genes tempranos lnmediatos. La transición a la siguiente etapa de expresión se controla al impedir la terminación en los extremos de los genes tempranos inmediaLos, lo cual da como resultado la expresión de los genes tempranos retrasados. (Se abordó la regulación general del desarrollo de A. en el Capítulo 14, Estrategias de los fagos.) El gen regulador que controla el cambio de la expre~ión temprana inmediata a la expresión temprana retrasada se idenrifica por medio de mutaciones en el gen A. N que transcribe sólo los genes tempranos inmediatos; no siguen su curso en el ciclo infeccioso. Hay dos unidades de transcripción de genes tempranos inmediatos (transcritos a partir de los promotores PL y P1J La transcripción por la polimerasa de RNA de E. coli se detiene en los terminadores localizados en los extremos de estas unidades de transcripción (tll y TRI' respectivamente).

292

CAPÍTULO 11 Transcripción

Ambos terminadores dependen de p; de hecho, ést fueron los terminadores con los cuales se idemific a p en un principio. La situación cambia por la e< presión del gen N. El producto pN es una proteír antiterminadón que actúa e n las dos unidades transcripción temprana inmediata y permite que polimerasa de RNA lea a través de los terminador= a los genes tempranos re1rasados que se encuentr.:.. más allá de ellos. Como sucede en otros fagos, es necesario u· control más para expresar los genes tardíos qt codifican los componemes de la partícula del fag Este cambio es regulado por el gen Q, uno de 1 genes tempranos retrasados. Su producto, pQ, ~ otra proteína anriterminación, una q ue permite manera especifica que la potimerasa de RNA inicen otro sitio, el promotor tardío PR, para la ultrale:· tura de un terminador que se encuentra entre did' p romotor y los genes tardíos. Las distintas especificidades de pN y de pQ e< tablcccn un principio general importante: la polim. rasa de RN!J i11teractúa con las unidades de transcripci.; de cal manera que un faclor accesorio puede promove·r antiterminación específicamente de a/gw1os Lranscril<

La terminación puede ser controlada con la misrr. precisión que la iniciación.

La antiterminación requiere sitios que son independientes de los terminadores Conceptos prinopales • El sitio en el cual una proteína antiterminación actúa se encuentra en sentido ascendente al sitio de terminación en la unidad de transcripción. • La localización del sitio antiterminación varía en casos diferentes y puede ubicarse en el promotor o dentro de la unidad de transcripción. ¿Qué sitios intervienen en el control de La espeC1ficidad de la antiterminaci6n? La actividad antirer· minación de pN es muy específica. pero el episoa·.

de la a111iterminací6nno está determinando por los term na dores tL 1 y t R:; el sílio de reconocimímto necesario pala anliterminación se encuentra en sentido ascendente Q.' respecto a la unidad de transcripción, es decir, en un Lug.distinto al sitio de terminación en el cual concluye al fin; la acción. La muesrra las ubicacione~ de los sitios necesarios para la amiterminación eel fago A.. Los sitios de reconocimiento necesarios par: la acc16n de pN se denominan nut (por sus sigla en inglés: N utiliza tion). Los sirios encargados d determinar la anlitcrminación hacia la izquierd:

1acia la derecha se describen como nutL y nutR, El mapeo de las mutaciones nut .:aliza a nutL entre el punto de inicio de PL y el .:io de la región codificadora de N. En contraste, -~R se encuentra entre el extremo del gen ero y tL 1. =-o significa que los dos sitios nurse encuentran - posiciones diferentes en relación con la organi~~ión de sus unidades de transcripción. Mientras ue nucL está cerca del promotor, nurR está ubicado _.:rca del terminador. (De nuevo qur es difereme y .:::encuentra dentro del promotor.) ¿Cómo ocurre la anriterminación? Cuando pN · ~onoce el sitio nuc, debe actuar sobre la polimerasa ~ RNA para garantizar que la enzima no pueda res""~nder más al termjnador. Las localizaciones variables ..e los sitios mtt indican que este episodio no está ügal a la iniciación ni a la terminación, pero que puede ....-unir conforme la polimerasa de RNA alarga la ca.ena de RNA más allá del sitio nuc. Como se ilustra en . la polimerasa después se transforma tn una fuerza inexorable que rebasa al ter mjnador, -n prestar atendón a ~u señal. (Esta reacción implica .s antitemlinación en Jos terminadores dependientes p, pero pN también suprtme la terminación en los -:ormjnadores in trinsecos.) ¿Es la capacidad de pN para reconocer una ecuencia cona dentro de la unidad de transcripj ón un ejemplo de un mecanismo de amitermi~ación más utilizado? Los fagos que están reladona.:.os con /.. rienen genes N dHerentes y especificidades antiterminación distintas. La región del genoma ..:el fago en la cual se encuentran los sitios nut tiene -na secuencia diJerente en cada uno de estos fagos cada fago debe, por lo tanto, tener sitios nut carac:erísticos reconocidos de manera específica por su ¿ ropio pN. Cada uno de estos productos pN debe ener la misma capacidad general para interactuar .:on el mecanismo de transcripción y p rovocar la ~ntiterminació n, pero también tienen una especifi jdad diferente para la secuencia de DNA que activa :-t mecanismo. , ~pecrivamente.

-=

.:e

1111 1

Los factores de terminación y de antitermi nación interactúan con la polimerasa de RNA

La

pollmerasa de ANAtranscribe desde el promotor hasta el terminador

t

Promotor PL

o

PA

o

PR'

"'

pN actúa en nutL para permiHr que la polimerasa de ANA deje atrás IL

__..

pN actúa en nutA para permitir que la pollmerasa de ANAdeje atrás IA1 nulA

PA

__,.

~

qut

PR'

!"' RNAm extendido La oolimerasa de RNA hospedadora transcribe los genes A. y termina en los sitios t. pN le permite la ultra lectura de los terminadores en las unidades L y Rl; pQ le permite la ultralectura del terminador R'. Los sitios en los cuales actúa la proteína pN (nut) y en los cuales actúa la proteína pQ (qut) se localizan en posiciones relativas distintas en las unidades de transcripción.

Promotor

Sitionut

Terminador

Conceptos principales • Numerosas proteínas bacterianas son necesarias para que la pN de A. interactúe con la polimerasa de RNA. • Estas proteínas también participan en la antiterminación en los operones rrn de la bacteria hospedadora. • El antiterminador pQ de ), tiene un mecanismo de acción diferente que comprende la unión al DNA en el promotor.

Los factores actúan sobre la polimerasa de ANA

p no puede realizar la terminación

Los factores accesorios se unen a la polimerasa de RNA a medida que pasa por el sitio nut. Impiden que p ocasione la terminación cuando la polimerasa llega al terminador.

11.25 Los factores de terminación y de antiterminación interactúan con la polimerasa de RNA

293

Sitio nut

Promotor

boxA

Terminador

boxB

CGCTCTTANNNNNNNNNAGCCCTGAAPuAAGGGCA GCGAGAAT NNNNNNNNNTCGGGACTTPyT TCCC GT

NusB-810 se une a boxA

O

NusG facilita pN se el ensamblaje une a del complejo boxB

r

NusA

Factor de terminación general

' Los factores accesorios se unen a la polimerasa de RNA a medida que pasa por ciertos sitios. El sitio nut está formado por dos secuencias. NusB-SlO se une a la enzima central cuando pasa por boxA. Después, NusA y la proteína pN se unen conforme la polimerasa pasa por boxB. La presencia de pN le permite a la enzima la ultralectura del terminador, lo que produce un RNAm unificado que contiene secuencias tempranas inmediatas adheridas a las secuencias tempranas retrasadas.

La terminación y la antitenninación están conectadas de manera cercana e involucran a proteínas bacterianas y de los fagos que interactúan con la polimerasa de RNA. Numerosas proteínas implicadas en la terminación han sido identificadas al aislar mutantes de E. colí en los cuales pN es ineficiente. Muchas de estas mutaciones se encuentran en el gen rpoB. Esto demuestra que pN (como el factor p) interactúa con la subunidad ~de la enzima central. Otras mutaciones en B. coli que obstaculizan la {unción de pN identifican los loci nus: nusA, nusB. rzusE y nusG. (El rérrnino "nus" es un acrónimo de "sustancia utilizada por N", por sus siglas en inglés: N utilization substance) Un sitio nut A. está formado por dos elementos de secuencia denominados boxA y boxB. Los elementos de secuencia relacionados con boxA también se encuentran en los operones bacterianos. boxA es necesario para la unión de proteínas bacterianas que son indispensables para la antiterminación en los operones de los fagos y de las bacterias. boxB es específico del genoma de los fagos. y las mutaciones en boxB eliminan la capacidad de pN para provocar la antiterminación. Los loci nus codifican proteínas que forman parte del mecanismo de transcripción, pero que no se aíslan con la enzima polimerasa de RNA. Las funciones de nusA, nusB y nusG tienen que ver sólo con la terminación de la transcripción. llusB codifica la proteína ribosómica SlO; la relación entre su ubicación en la subunidad 305 y su función ert la termi· nación no es clara. 1.as protemas Nus se unen a la 294

CAPÍTULO 11 Transcripción

polimerasa de RNA en el sitio nut, como se resume en la N usA es un factor general de transcripción que incrementa la eficiencia de la terminación, tal vet: al aumentar la tendencia de la polimerasa de RNA de hacer pausas en los terminadores (y de hechc en otras regiones de la estructura secundaria; véase más adelante). NusB y SJO forman un dímero que se une de manera específica al RN A que contiene una secuencia boxA. NusG puede estar relacionado con el ensamblaje general de todos los factores Nu! en un complejo con la polimerasa de RNA. Los terminadores intrínsecos y depend ientes de p tienen diferentes rcq Llerimientos de facrore5 Nus. NusA es necesario para la terminación en lo~ terminadores intrínsecos y la reacción puede se: impedida por pN. En los terminadores dependientes de p son necesarias las cuatro proteínas Nus, ~ una vez más pN por sí solo puede inhibir la reacción. La característica común de pN en ambos tipo~ de terminadores es impedir la función de NusA en la term inación. La unión de pN a NusA inhibe la capacidad de NusA para unirse al RNA, lo cual e~ necesario para la terminación. La antiterminación ocurre en los operones rn: (RNAr) de E. coli y comprende las mismas funcione~ mts. Las regiones líderes de los operones rrn contienen secuencias boxA; los dímeros NusB-S lo reconocen estas secuencias y se unen a la polimerasa de RNA a medida que se alarga más allá de box.A. Esta altera las propiedades de la polimerasa de RNA de taJ manera que puede realizar ahora la ulcralectura de los terminadores dependientes de p que están dentro de la unidad de transcripción. La secuencia boxA del RNA A. no se une a NusBS lO y es probable que la presencia de NusA y de pN le permitan hacerlo; la secuencia boxB podría ser necesaria para estabilizar la reacción. Por lo tao· to, las variadones en. las secuenci.as boxA pueden determinar qué conjunto particular de fac tores se requiere para la antiLerminación. Las consecuenci~ son las mismas: cuando la polimerasa de RNA pasa del sitio nut, es modificada por la adición de facwre~ apropiados y es incapaz de terminar cuando se encuentran desp ués los sitios de terminadón. La ami terminación en A. requiere pN para unirse a la polímerasa de RNA en una forma que depende de la secuencia de la unidad de transcripción. ¿Reconoce pN el sitío boxB en el DNA o en el transcrito de RNA? No se une de forma independiente a ningún tipo de secuencia, pero sí se une a un complejo de cranscripción cuando la enzima cemral pasa dei sitio boxB, pN tiene dominios separados que reconocen la secuencia boxB del RNA y la proteína NusA. Después de unirse al complejo de transcripd6n, pi" permanece asociado a la enzima central y se uan.s-

~a

en efecto en una subunidad adicional cuya el reconocimiento de los termina :-es. Es posible que pN de hecho continúe uniénse a la secuencia boxB del RNA y a la polimerasa • RNA. la cual mantiene un lazo en el RNA; de este •do, la f undón de la secuenda boxB del &"1 A será - pane sujetar a pN en la vecindad e incrementar ~ manera eficaz su concentración local. El producro pQ, el cual inhibe la terminación :-spués en la infección por fagos al actuar en qut, -;:¡e un mecanismo propiedades de las formas de terminación com -~encía cambia

~tentes.

la te rminación parece relacionarse muy de cer-

.a con la forma de elongación. En su forma básica e transcripción, la polimerasa central está sujeta a -mchas pau!>as dura me la elongación y realizar una -:illsa en un sitio de terminación es un prerrequisito ·ara que ocurra la terminación . Bajo la influencia ~ e factores como NusA, las pausas se extienden, ~que incrementa la eficiencia de la terminación; ::liemras que bajo la ~nfluencia de pN o de pQ, las

pausas son más breves. lo que disminu ye la eficacia de la terminación. los sitios de reconocimiento para estos factores se encuentran sólo en ciertas unidades de transcripción. y como resultado las pausas. y en consecuencia la terminación. son alteradas sólo en dichas unidades.

E

Resumen

Una unidad de transcripción está forma da por el DNA que se encuenrra er..tre un promotor, en donde inicia la transcripción. y un terminador. en donde finaliza. Una cadena de DNA en esta región sirve como molde para la síntesis de una cadena comple · mentaría de RJ'IA. la región del híbrido de RNADNA es corra y transitoria, conforme la "burbuja'' de transcripción se desplaza por el DNA. La holoenzima polimerasa de .RNA que sintetiza el RNA bacteriano puede separarse en dos componentes. La enzima centra l es un multímcro de estructura o: 2 ~~- que se encarga de alargar la cadena de RNA . El facror cr e.s una subunidad individual indispensable en la etapa de la iniciación para el reconocim iento del promotor. La enzima central tiene afrnidad general por el DNA. La adición del factor o reduce la afinidad de la enzima por la unión no específica al DNA, pero incrementa la afinidad por los promotores. La velocidad con la cual la polimerasa de RNA encuentra sus promotores es dema~iado alta para que la justifiquen la difusión y los contactos aleatorios con el DNA; ral vez haya un ~mercamb io directO de Las secuencias de DNA sujetas por la enzima. Los promotores bacterianos son identificados por dos secuencias corras conservadas. centradas en - 35 y - 1O en relación con el punto de inicio. la mayor panc de los promotores tiene secuencias que están muy relacionadas con las secuencias de consenso en estos sitios. La distancia que separa las secuencias de co nse nso es de 16 a 18 bp. la polime rasa de RNA en un inicio "aterriza" en la secuencia - 35 y luego extiende sus contactos a la región - 10. l a enzima abarca -77 bp del DNA. El complejo binario "cerrado" inicial es transformado en un complejo binario "abierro" al desnaturalizar una secuencia de -12 bp que se extiende de la región -1 O al pumo de inicio. La composición rica en pares de bases A-T de la secuencia -1 O puede ser importante en la reacción de desnaturali7ación. El complejo binario es transformado en un complejo ternario por la inserción de precursores ribonucleotídicos. Hay múltiples ciclos de iniciación abortiva, durante los cuales la polimerasa de RNA sintetiza y libera cadenas de RNA muy cortas sin desplazarse del promotor. A1 Onal de esta etapa, hay '11.26 Resumen

29 5

un cambio en la estrucmra y la enzima central se conrrae para cubrir -50 bp. El factor cr es liberado (en 30% de los casos) o cambia su forma de asociación con la enzima central. La enzima central después se desplaza por el DNA, sintetizando RNA . Una región del DNA desenrollada de manera local se mueve con la enzima. La enzima se contrae más para cubrir tan sólo de 30 a 40 bp cuando la cadena naciente ha alcanzado una longítud de 15 a 20 nudeótidos; después continúa hasta el final de la unidad de transcripción. La "fuerza " de un promotor describe la frecuencia con la cual la polimerasa de RNA !nida la transcripción; se relaciona con la cercanía con la cual sus secuencias -35 y -1 O se ajustan a las secuencias de consenso ideales, pero también influyen en ella las secuencias que se localizan enseguida del punto de inhibición en sentido descendente. El superenrollamiento negativo incrementa la fuerza de ciertos promorores. La transcripción genera superenrollamienros positivos delante de la polimerasa de RNA y deja superenrollamiemos negativos detrás de la enzima. La enzima central puede ser ctirigida a recono cer promowres con diferentes secuencias de consenso por medio de otros factores cr. En E. coli esros Jacrores cr son activados por condiciones adversas, como un choque térmico o escasez de nitrógeno. B. subtilis contiene un solo factor cr importante con la misma especificidad que el factor a de E. coli y también contiene una variedad de factores cr menores. Otra serie de factores es activada cuando se inicia la esporulación; la esporulación es regulada por dos cascadas en las cuales los remplazos de los factores cr ocurren en la pre-espora y en la célula madre. Asimismo, el fago SPO 1 utiliza una ca$cada para regular la transcripción por medio de la sustitución de factores cr. La geomeLría del reconocimiento enu-e la polimerasa de RNA y el promotor es similar para las holoem.irnas que contienen a todos los factOres cr (excepto al factor cr54 ). Cada factor cr hace que la polimerasa de RNA inicie la transcripción en un promotor que se ajusta a un consenso particular en - 35 y -10. Los contactos directos entre cr y el DNA en estos sitios se han demosrrado en el factor cr 70 de E. coli. El factor cr70 de B. coli tiene un dominio auroinhlbidor terminal N que impide que las regiones de unión al DNA reconozcan al DNA. La región de auLoinhibidón es desplazada por el DNA cuando la holoenzima forma un complejo abierto. La polimerasa de RNA bacteriana forma la transcripción en dos tipos de sitios. Los terminadores intrínsecos contienen una horquilla rica en G-C seguida por una región ríca en U. Son reconocidos in vitro por la enzima cenera] sola. Los terminadores 296

CAPÍTULO 11 Transcripción

dependientes de p necesitan el factor p in vitro e Íli vivo; p se une a los sitios rut que son abundantes ePC y deficientes en residuos de G y que preceden a; sitio real de la terminación. pes una belicasa hexaméríca dependiente de ATP cuya acüvidad es transferirse a lo largo del RNA hasta que alcanza la regióc del híbrido de RNA-DNA en la burbuja de transcripción de la polimerasa de RNA, en donde disocia al RNA del DNA. En ambos tipos de terminación, la~ pausas que realiza la polimerasa de RNA son importanres para que tenga lugar la terminación. Los factores Nus son indispensables para la terminación. NusA es necesario p
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1111

Los factores cr entran en contacto de manera dire~ con el DNA

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111m

La esporulación es controlada por factores cr

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IIE

La polimerasa de RNA bacteriana termina en sitios discretos

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iE

¿Cómo funciona el factor p?

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E

los factores de terminación y de antitermi nación interactúan con la polimerasa de RN A

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Re ferencias

299

El Operón -----------

----ESQUEMA DEL CAPÍTULO

lfB

Introducción La regulación puede ser positiva o negativa

Las mutaciones constitutivas de actuación en cis identifican al operador

• En un • En ele de

• La> mutaciones localizadas en el operador provocan la expresión constitutiva de los tres genes estructurales loe. • Estas mutaciones act(Jan en configuración cis y afectan sólo a aquellos genes que se encuentran en el fragmento contiguo de DNA.

la regulación negativa, una proteína represora se une a operador para evitar que se exprese un gen. la regulación positiva es necesario que se una un factor transcripción al promotor para permitir a la polimerasa RNA iniciar la transcripción.

Los agrupamientos de genes estructurales son controlados de manera coordinada • Los genes que codifican protelnas que funcionan en la misma ruta pueden ser adyacentes y ser controlados como una unidad individual que se transcribe en un RNAm policistrónico.

Los genes lac son controlados por un represor

•

• la transcripción del agrupamiento de genes locZYA es conttolada por una proteína represora que se une a un operador que se superpone al promotor en el inicio del agrupamiento. • la protelna represora es un tetrámero formado por subunidades idénticas codificadas por el gen loeJ.

•

El operón lac puede ser inducido

•

• Las moléculas pequeñas que inducen a un operón son idénticas al sustrato en lo que se refiere a sus enzimas, o están relacionadas con ét. • Los galactósidos p son los sustratos para las enzimas codificadas por lacZYA. • En ausencia de galactósidos p, el operón loe se expresa sólo en un nivel (basal) muy bajo. • la adición de galactósidos p especlficos induce la transcripción de los tres genes del operón. • El RNAm loe es muy inestable; como resultado, la inducción puede revenirse con rapidez. • Los mismos tipos de sistemas que permiten a los sustratos inducir a los operones que codifican enzimas metabólicas pueden ser utilizados para permitir a los productos finales reprimir a los operones que codifican las en2imas biosintéticas.

El represor es controlado por una pequeña molécula inductora • Un inductor funciona al convertir a la proteína represora en una forma con menor afinidad por el operador. El represor tiene dos sitios de unión, uno para el operado¡ y otro para el inductor. • El represor es desactivado por una interacción alo>térica en la cual la unión del inductor a su sitio cambia las propiedades del sitio de unión al ONA.

300

Las mutaciones de actuación en trans identifican el gen regulador

•

Las mutaciones localizadas en el gen lacl actúan en configuración trons y afectan la exoresión de todos los agrupamientos loclYA en la bacteria. las mutaciones que eliminan la función de lad provocan expresión con;titutiva y son recesivos. las mutaciones que se encuentran en el sitio de unión al ONA deltepresor son constitutivas debido a que el represor no puede unirse al operador. las mutaciones que se localizan en el sitio de unión al inductor del represor le impiden ser desactivado e impiden la inducibilidad. Las mutaciones de los promotores son no inducibles y de actuación en ds.

Las proteínas multiméricas tienen propiedades genéticas especiales • Un represor activo es un tetrámero formado por subunidades idénticas. • Cuando se presentan subunidades muta11tes y silvestres, una sola subunidad mutante lacJ·4 puede inactivar a un tetrámero cuyas subunidades restantes sean silvestres. • las mutaciones lad·j ocurren en el ;itio de unión al DNA. Su efecto se explica porque la actividad del represor requiere de todos los sitios de unión al ONA en el tetrámero para que sea activo.

HE El monómero represor tiene numerosos dominios • Una subunidad represora individual puede ser dividida en un dominio terminal Nde unión al ONA, una biS<Jgra y el nlícleo de la proteína. • El dominio de unión al DNA contiene dos regiones helicoidales a cortas que se unen al surco mayor del ONA. • La región de la bisagra se inserta en el surco menor como una hélice a corta y plegada. • El sitio de unión al inductor y las regiones responsables de la formación de los multimeros se localizan en el núcleo.

La inducción reduce la afinidad por el operador a 10• veces la de los sitios de baja afinidad, por lo que sólo 3'1'o de los operadores están unidos. • La inducción provoca que el represor se mueva del operador a un sitio de baja afinidad por desplazamiento directo. • Estos parámetros podrían cambiarse con un incremento o reducción de la concentración efectiva de DNA in viva.

Un represor es un tetrámero formado por dos dímeros • Los monómeros forman un dímero al hacer contactos entre los dominios nucleares 1 y 2, y es posible que ent.re las hetices de oligomerización. • Los dlmeros forman un tetrámero por medio de interacciones entre Las hélices de oligomerización.

La unión al DNA es regulada por un cambio alostérico en la conformación

La represión puede suceder en múltiples loci • Un represor actuara en todos los loci que tengan una copia de su secuencia operadora diana.

• El dominio de unión al DNA de cada monómero dentro de un di mero se inserta en el surco mayor de\ DNA, La hélice bisagra se inserta en el surco menor del DNA operador. • Un represor activo tiene una conformación en la cual los dos dominios de union al DNA de un dímero pueden insertarse en vueltas sucesrvas de 1a doble hélice, • La unión del inductor interrumpe la hélice bisagra y c~mbia la conformación de tal manera que los dos sitios de unión al DNA no se encuentran en la geometña correcta para hacer contactos simultaneas.

El AMP cíclico es un efector que activa al factor CRP para que actúe en múltiples operones • CRP es una proteina activadora que se une a una secuencia diana en un promotor. • Un dímero de CRP es activado por una sola molécula de AMP cíclico.

El factor CRP funciona de formas diferentes en operones diana distintos

Los fenotipos mutantes se correlacionan con la estructura del dominio

CRP introduce un giro de 90° en el DNA en su sitio de unión. Los sitios de unión al CRP se encuentran en ubicaciones muy variables con respecto al promotor. CRP interactúa con la potimerasa de RNA, pero los detalles de la interacción dependen de las ubicaciones relativas del sitio de unión al CRP y del promotor.

• Diferentes tipos de mutaciones ocu11en en dominios distintos de la subunidad del represor.

La proteína represora se une al operador • La proteína reoresora se une a la secuencia de DNA de doble cadena del operador. • El operador es una secuencia palindrómica de 26 bp. • Cada repetición invertida del operador se une al sitio de unión al DNA de una subunidad represora.

La traducción puede ser regulada • Una proteína represora puede regular la traducción al impedir que un ribosoma se una a un codón de iniciación. • la accesibilidad a los codo nes de iniciación en un RNAm polidstrónico puede ser controlada por medio de cambios en La estructura del RNAm. los cuales ocurren como resultado de la traducción .

La unión del inductor libera al represor del operador • La unión del inductor provoca un c¡¡mb ro en la

conformación del represor que reduce su afinidad por el DNA y lo libera del operador.

La síntesis de Las proteínas r es controlada por medio de regulación autógena

El represor se une a tres operadores e interactúa con la polimerasa de RNA • Cada dímero localizado en un tetrámero represor puede unirse a un operador, de tal manera que el tetrámero puede unirse a dos operadores de forma simultánea. • La represión total requiere que el represor se una a un operador adicional localizado en flujo descendente o ascendente así como al operador en el promotor lacl. • La unión del represor al operador estimula la unión de la polimerasa de RNA al promotor, pero im pióe la transcripción.

El represor siempre está unido al DNA • Las proteínas que tienen gran afinidad por una secuencia especifica de DNA también tienen una afinidad baja por otras secuencias del DNA. • Cada par de bases localizado en el genoma bacteriano es el inicio de un sitio de unión de baja afinidad para el represor. El gran número de sitios de baja afinidad garantiza que toda la proteína represora esté unida al DNA. El represor se une al operador al desplazarse desde un sitio de baja afinidad en vez de hacerlo al equilibrarse en la solución.

La traducción de un operón de protelna r puede ser controlada por un producto del operón que se une a un sitlo localizado en el RNAm policistr6nico.

lEfa

La p32 del fago T4 es controlada por un circuito autógeno p32 se une a su propio RNAm para impedir la Iniciación de la traducción.

La reg ulación autógena se utiliza a menudo para controlar la síntesis de ensambles macromoleculares El precursor de los microtúbulos, la proteína tubulina libre. inhibe la traducción del RNAm de .a tubulina.

Resumen

El operador compite con los sitios de baja afinidad para unirse al represor En ausencia de inductor. el operador tiene una afinidad por el represor que es 101 veces mayor que la de un s1tio de baja afinidad. El nivel de 10 tetrámeros represores por células asegura que el operc1dor esté unido al represor 96% del tiempo.

CAPÍTULO 12 El operón

301

La expresión génica puede ser controlada en cualquiera de las múltiples etapas, las cuales se dividirán en términos generales en transcripción, procesamiento y traducción: • La transcüpción a menudo es controlada en la etapa de iniciación. La transcripción casi nunca se controla en la elongación, pero puede ser controlada en la terminación para determinar si a la polimerasa de RNA se le permite dejar atrás un terminador y avanzar al gen o a los genes que se encuentran después de él. • En las células eucarióticas, el procesamien -

secuencias de actuación en cis (por lo general sir,ios en el DNA). En términos más formal es: • Un gen es una secuencia de DNA que codifica un producto capaz de difundirse. Este producto puede ser una proteina (corn1 en la mayor parte de los genes) o puede ser RNA (como en los genes que cod ifica~ RNAt y RNAr). La característica fundamema. es que el producto se difunde lejos del sitio de s1. síntesis y actúa en otra ubicación. Cua lquier producto génico que es libre de difundirse para encontrar su objetivo se describe coml de acLuación en trans. • La descripción del concepto actuación en cis se aplica a cualquier secuencia de DNA

ro del producto de RNA puede ser regulado

que no es transformada a ninguna otra for-

en la etapa de modificación, en la de corte y empalme, en la de transporte o en la de estabilidad. En las bacterias, un RNAm en principio está disponible para la traducción tan pronto ha sido sintetizado, e incluso durante su síntesis, pero durante este periodo las etapas de conrrol no están disponibles. • la traducción puede ser regulada, por lo general en las etapas de iniciación y de terminación (como la transcripción) . La regulacíón de la iniciación es formalmente análoga a la regulación de la transcripción: el sistema de circuitos puede ilustrarse en términos similares para regulación de la iniciación de la transcripdón en el DNA o de la iniciación de la traducción en el RNA. El conceptO básico que explica cómo se controla la transcripción en las bacterias lo proporcionó la formulación clásica del modelo para el control de la expresión génica elaborado por Jacob y Monod en 1961. Ellos distinguieron dos tipos de secuencias en el DNA: las secuencias que codifican los productos de actuación en trans y las secuencias de actuación en cisque funcionan de manera exclusiva dentro del DNA. La actividad génica es reg1Jlada por las imeraccioncs específicas de los productos de actuación en trans (por lo general proteínas) con las

ma, pero que funciona de manera exclusiva como una secuencia de DNA in situ, que afecta sólo al DNA al cual está ffsicamentt: ligado. (En algunos casos, una secuencia de. actuación en cis funciona en un RNA en vez de hacerlo en una molécula de DNA.) Para ayudar a distinguir entre los componente~ de los circuitos reguladores y los genes a los cuales regulan, en ocasiones utílízamos los términos ger. estructural y gen regulador. Un gen estructural e· tan sólo ut1 ge11 que codifica un producto proteínkc (o un RNA). los genes estructurales representan una enorme variedad de funciones y estructuras proteínicas, como las proteínas estructurales, las enzimas con actividades catalíticas y las proteínas reguladoras. Un gen regulador simplemente descl'ibe a un gen que codifica una proteína (o una molécula de RNA) que interviene en la regulación de la expresión de otros genes. la forma más sencilla del modelo regu lador se ilustra en la : un gen regulador codifica una proteína que controla la transcripción al unirse a un sitio particular del DNA. o a varios. Esta interacción puede regular a un gen diana de forma positiva (la interacción activa al gen) o de forma negativa (la interacción d·csactiva al gen). Los sitios delDNA casi siempre (pero no de forma exclusiva) se localizar. enseguida del gen diana, en sentido ascendente. Las secuencias que indican el inicio y el fin de la unidad de transcripción, el promotor y el terminador, son ejemplos de sitios de actuación en cis. Un promotor sirve para iniciar In transcripción sólo dC' gen o de los genes que están conectados físicamente a él et; el mismo fragmento de DNA. En la misma forma, ur terminador puede finalizar la transcripción só lo por medio de una po)imerasa de RNA que ha atrave sado al gen o a los genes precedentes. En su forme más simple, los promotores y los terminadores sor elementos de actuación en cis que son reconocidos por la misma especie de actuación en trans, es decir

Introducción

Gen regulador

¡

RNAm

¡

-

Plotelna reguladora

\. ~ Sitio diana

~ Gen estructural

Un gen regulador codifica una proteína que actúa en un sitio diana del DNA.

302

CAPITULO 12 El Operón

. la polimerasa de RNA (aunque otros factores '"'1bién participan en cada sitio). Hay otros sitios reguladores de actuadón en cis ~e a menudo están yuxtapuesros al promotor o eminados en él. Un promotor bacteriano puede ner uno o más de dichos sitios localizados en la ;cania, es dedr, en la vecindad inmediata del punde inicio. Un promoror eucariótico es probable .le tenga un número mayor de sitios dispersos en '"'!a distancia más larga.

Promotor/operador de actuaciOn en cls precede a los genes estructurales Promotor operador

r

Gen 8/lcendido: la poi rnerasa de RNA inrcia en el promotor

La regulación puede

ser positiva o negativa \ onceptos principales En La regulación negativa, una proteína represora se une a un operador para evitar que se exprese un gen. En la regulación positiva, es necesario que se una un factor de transcripción al promotor para permitir a la polimerasa de RNA iniciar la transcripción.

_·n modelo clásico del control en las bacterias es igatívo: una proteína represora impide que un gen ca expresado. La muestra que el "estao predeterminado" de dicho gen es ser expresado través del reconocimiento de su promotor por la olimerasa de RNA. Cerca del promotor se encuen,.a otro sitio de actuación en cis denominado opera' or, el cual es el objerivo de la proteína represora. ":uando el represor se une al operador, se le impide · la polimerasa de RNA iniciar la transcripción y. orlo tanto, la expresi6n génica es desactivada. Hay un modelo alternativo de control positivo. ~5te se uriliza en las baCLerias (probablemente) con _na frecuencia casi igual a la del control negativo ·es la forma de control más común en las eucario.as. Un factor de transcripción es necesario para Jyudar a la polimerasa de RNA en la iniciación en d promotor. La muestra que el estado redeterminado típico de un gen eucariólico es inlctivo: la polimerasa de RNA no puede iniciar por sí llisma la transcripción en e l promotor. Numerosos .actores de actuación en trans tienen sitios diana •calizados en la vecindad del promotor y la unión .4r:? algunos o de todos estos factores permite a la polímerasa ir:? RNA iniciar la transcripción. El rema unificador es que las proteínas regulado~as son factores de actuación en trans que reconocen dernenros de actuación en ds (por lo general) locali::ados en sentido ascendente con respecto al gen. Las :onsecueneias de este reconocimiento son la activajón o la represión del gen, según el tipo individual .:e proteína reguladora. Una característica típica es ~ue la proteína funciona al reconocer una secuencia '!IUy corta localizada en el DNA, casi siempre con

El gen es apagado cuando el represor se une al Of)erador Represor 1

En el control negativo un represor de actuación en trans se une al operador de actuación en cis para apagar la transcripción.

GEN APAGADO EN FORMA PREDETERMINADA Punto de lnrcro ,;..;..;....;.;;......;¡¡.;• Gen Promotor '( GEN ENCENDIDO POR LOS ACTIVAOORES Los factores Interactúan con la poltmerasa de RNA

ANA

En el control positivo, los factores de actuación en trans deben unirse a Los sitios de actuación en cis para que la polimerasa de RNA inicie la transcripción en el promotor.

una longitud <JO bp, aunque la proteína de hecho se une a un fragmento del DNA un tantO mayor. El promotOr bacteriano es un ejemplo: la polimerasa de RNA cubre >70 bp del DNA enia inidación, pero las secuencias cruciales a las cuales reconoce son los hexámeros centrados en las posidones -35 y -10. Una diferencia significativa en la organización de los genes entre las procariotas y las eucariotas es que los genes estructurales de las bacterias están organizados en agrupamientos, mientras que los de las eucariotas se presentan de manera individual. El agrupamiento de los genes estructurales les permite ser controlados de forma coordinada por medio de interacciones en un solo promotor: como resuLl i ? La regulación puede ser positiva o negativa

303

tado de estas interacciones. el conjunto completo de genes se transcribe o no se transcribe. En este capítulo se anali7.a esta forma de control y su uso por parte de las bacterias. Los medios empleados para coordinar el control de los genes eucarióticos dispersos se abordan en el Capítulo 25, Activación de la transcripción.

Los agrupamientos de ge nes estructurales so n controlados de manera coordi nada Concepto pñncipal • Los genes que codifican proteínas que funcionan en La misma ruta pueden ser adyacentes y ser controlados como una unidad individual que se transcribe en un RNAm policistrónico.

Los genes estructura les bacterianos con frecuencia están organizados en agrupamientos que incluyen genes que codifican proteínas cuyas funciones están relacionadas. A menudo los genes que codifican las enzimas de una ruta metabólica están organizados en uno de esws agrupamientos. Además de las enzimas que intervienen en la ruta, la unidad de control coordinado puede incluir otras actividades relacionadas; por ejemplo, la proteína encargada de transportar la molécula peque1ia (sustrato} al interior de la célula. El agrupamiento de los tres genes estructurales Lac, lacZYA, es típico. La resume la organización de los genes estructurales, sus elementos reguladores asociados de actuación en cis y el gen regulador de actuación en traJ1S. La característica

principal es que el agrupamiento se transcribe en U/1 solo RNAm policistrónico a partir de un promotor en el cual se regula la iniciación de la transcripción. Los productos pro refnicos permiten a las células absorber y metabolizar los galactósidos p, como la

p

la el

PO

1 040

82

ONA

lactosa. Las funciones de los tres genes estructurales son: • El gen /acZ codifica la enzima galacwsidasa ~~ cuya forma activa es un tetrámero de -500 kD. La enzima separa un galactósido p en sus azúcares constitutivas. Por ejemplo, la lactosa es dividida en glucosa y galactosa (las cuales son metabolizadas posterionncnte). Esta enzima también elabora un subproducto importante, la alolactosa P-1, 6, la cual tiene cierta función en la regulación. • El gen lacY codifica la permcasa de galactósido p, una proteína de -30 kD unida a la membrana, componente del sistema de transpone. Ésta transporta a los galactósidos Pal imerior de la célula. • El gen lacA codifica la transacetilasa de galactósido ~ . una enzima que transfiere un grupo acetilo de la acetil-CoA a Jos galactósidos p. Las mutaciones en lacZ o en /acYpueden crear el genotipo lac, en el cual las células no pueden urilizar la lactosa. (La descripción genotípica HlacH sin un calificativo indica pérdida de la función.) Las mu taciones JaeZ eliminan la actividad enzimática e impiden de manera directa el metabolismo de la lactosa. Los mutames lacY no pueden absorber la lactosa del medio. (Ningún dcfeno es idemificable en Jas células lacA. lo cual es desconcertante. Es posible que la reacdón de acetilación proporcione una ventaja cuando las bacterias crecen en presencia de cienos análogos de Jos galactósidos ~que no pueden ser metabolizados, debido a que la modificación da origen a la desintoxicación y la excreción.) El sistema completo, incluidos los genes estructurales y los elementos que controlan su expresión. forma w1a unidad común de regulación denominada operón. La actividad del operón es controlada por el gen o los genes reguladores cuyos productos proteínicos interactúan con los elememos de control de actuación en cis.

JaeZ ~q rr.

facY

,-,

,

3510

780

825

l

l

l

RNAm

Proleina

l

Represor

Galactosldasa ~

EL operón loe ocupa -6 000 bp del DNA. En el lado izquierdo el gen /acl tiene su propio promotor y su propio terminador. EL extremo de La región lac es adyacente al promotor, P. El operador, O, ocupa los primeros 26 bp de la unidad de transcripción. El gen largo lacl comienza en la base 39 y es seguido por los genes lacY y lacA y por un terminador.

304

CAPÍTULO 12 El Operón

,

Los genes loe son controlados por un represor

Punto de inicio

/.JIVJMtviM'WV~

.

Conceptos principales La transcripción del agrupamiento de genes lacZYA es controlada por una proteína represora que se une a un operador que se superpone al promotor en el inicio del agrupamiento. l1l proteina represora es un tetrámero formado por subunidades idénticas codificadas por el gen /acl.

~

Desenrollamiento -so -40 -30 -2o -1o

1

1

10

---+

..

20 30

•---Promotor se une a ra polimerasa de RNA +Operado~+

se une al represor

.: pueden distinguir los genes estructurales de los :-enes reguladores por los efectos de las mmadones. _na mutación en un gen estructural priva ella célula e la proteína particular a la cual codifica el gen. ,,n embargo, una mmación en un gen regulador .:1fluye en la expresión de rodos los genes esuuctu 11es a los cuales controla. Las consecuencias de una tutación en un gen regulador revelan el tipo de egulación. La transcripción de los genes lacZY.4 es controada por una proteína reguladora sintetizada por el :en lacl. Sucede que lacl esrá localizado al lado de los -enes estTuctura les, pero comprende una unidad de :-anscripción independiente con su propio promo'r y con su propio terminador. En principio, la el no -eccsita localizarse cerca de los genes estructurales ebido a que especifica a un producto que se dífun.:e. Puede funcionar muy bien si es transportado a .. ~tal qu ier o Lro sitio, o puede estar contenido en una .lOlécula de DNA independiente (la prueba clásica ;ara un regulador de actuación en trcms). Los genes lac son controlados por medio de re-

gulación negativa: son transcritos a menos que sean ·vagados por la proteína reguladora. Una mutadón _ue desactiva al regulador hace que los genes es.;ucturales permanezcan en la condición expresada. _:::¡ producto de lacl se denomina represor Lac, debido =que su función es impedir la expresión de los ge•es estructurales. El represor es un tetrámero de subunidades Jémicas de 38 kD cada una. Hay ~ 1O tetrámeros ~ n LLna célula de tipo silvestre. El gen regulador no ·s con trolado por la disponibilidad de la lactosa. Se =-anscribe en un RNJ\m monocísrrónico a una velo.Jdad que parece ser gobernada tan sólo por la afini;.ad de su promotor por la polim erasa de RNA. El represor funciona uniéndose a un operador ...-uyo símbolo formal es 0 1oc) localizado al inicio del 1grupamienro IacZYA . El operador se ubica entre el :-omotor (?1~<) y Jos genes estructurales {lClCZYA. ). :!tanda el represor se une al operador, impide que lapo•nerasa de RNA inicie la transcripción en el promotor. La amplía nuestra visión de la región que

El represor y la polimerasa de RNA se unen a sitios que se superponen alrededor del punto de inicio de la transcripción del operón loe.

se encu emra al principio de los genes estructurales lac. El operador se extiende desde la posldón -5 justo en sentido ascendente del punto de in ido del RNAm hasta la posición +21 localizada dentro de la unidad de transcripción; por Jo tamo, se superpone al ex tremo derecho del promoror. Se analiza la relación entre el represor y la polimerasa de RNA con mayor detalle en la sección 12 .14, La proteína represora se une al operador. y en la sección 12.16 El represor se une a tres operadores e interaCtúa con la polimerasa de RNA.

111

El operón lac puede ser inducido

Conceptos principales

,

• Las moléculas pequeñas que inducen a un operón son idénticas al sustrato en lo que se refiere a sus enzimas, o están relacionadas con él. Los galactósidos ~son los sustratos para las enzimas cod ificadas por lacZYA. En ausencia de galactósidos ~. el operón lac se expresa sólo en un nivel (basal) muy bajo. La adición de galactósidos ~ específicos induce la transcripción de los tr~s genes del operón . El RNAm loe es muy inestable; como resultado, la inducción puede revertirse con rapidez. Los mismos tipos de sistemas que permiten a los sustratos inducir a los operones que codifican enzimas metabólicas pueden ser utilizados para permitir a los productos finales reprimir a los op~rones que codifican las enzimas biosintétic.as.

Las bacterias necesitan responder con rapidez a los cambios que surgen en su ambiente. Las fluctuaciones en el abasLecimiento de los nutrientes pueden ocurrir en cualquier momento y la supervivencia depende de la capacidad de cambiar el metabolismo de un sustrato por el de otro. Sin embargo, la econo!2.5- El operónlac puede ser inducido

305

Adición del inductor

Retiro del inductor

t

•

Ntvellnducido

1

... ~

N¡vel basal

o

2

4 6 8 10 Nivel de RNAm /ac

........

Periodo --.

min

Penodo

Nivel inducido

/

Nivel basal

O

12

2

4 6 6 10 Nivel de galactosidasa ~

12

min

La adición del inductor propicia la rápida inducción del RNAm loe y es seguida después de un breve lapso por la síntesis de las enzimas; al retiro del inductor le sigue la interrupción rápida de la síntesis.

mía también es importa me: una bacteria que deslina mucha energía para satisfacer las demandas del ambiente tiende a estar en desventaja. Por lo ranro, una bacteria evita sintetizar las entimas de una ruta en ausencia del sustrato, pero está preparada para producir las enzimas si el sustrato vuelve a aparecer. La síntesis de las enzimas en respuesta a la aparición de un sustraro específico se denomina inducción. Este tipo de regulación es generalizado en las bacterias y también ocurre en las eucariotas unicelulares (como las levaduras). El sistema de la lactosa de E. coli proporciona el modelo de este tipo de mecanismo de control. Cuando las células de E. coli son cu ltivadas en ausencia de un galactósido ~ no hay necesidad de galanosidasa ~. y contienen muy pocas moléculas de la enzima, menos de cinco. Cuando se agrega un sustrato apropiado, la actividad enzimática aparece en forma muy rápida en las bacterias. En 2 a 3 min hay cierta cantidad de enzima, y pronto aparecen -5 000 moléculas de la enzima en cada bacteria. (En condiciones adecuadas, la galactosidasa ~puede represemar de 5 a 10% del rotal de proteína soluble de la bacteria.) Si se retira el sustrato del medio, la síntesis de la enzima se detiene con la misma rapidcL con que comenzó. La resume las características esenciales de la inducción. El control de la transcripción de los genes fac responde con mucha rapidez al inductor, como se muestra en la parte superior de la figura. En ausencia del inductor, el operón se trans306

CAPÍTULO 12 El Operón

cribe en un nivel b asal muy bajo. La transcripciór es estimulada en cuanto se agrega el inductor; le cantidad de RN Am lac aumenta de manera rápid;: a un nivel inducido que refleja tu1 balance entre lz síntesis y la degradación del R.l.'IAm. El RN/\m laces muy inestable y se degrada después de una vida media de apenas unos 3 min. Est.:: característica permite que Ja inducción sea revertida con rapidc¿. La transcripción cesa en cuanto s-e retira al inductOr, y en un periodo muy cono todt el RNAm lac habrá sido destruido y el contenidc celular regresará al nivel basal. La producción proteínica se observa en la parte in ferior de la figura. La traducción del RNAm k produce galactosidasa ~ (y los producros de los o tros genes /ac). Hay un rezago corto entre la apariciór del RNAm /ac y el surgimiento de las primeras mol~cu l as enzimáricas completas (la concentradón de proteína comienza a aumentar unos 2 mjn despué< del incremento del n ivel basal de RNAm). Hay ur rezago similar para alcanzar los niveles inducido• máximos de RNAm y de proteína. Cuando se retira al inductor. la síntesis de la enzima cesa casi de inmediato (a medida que el RNAm es degradado pero la galactosidasa ~ que se encuentra en la célulc es más estable que el RNAm, de tal manera que l.; actividad de la enzima permanece en el nivel inducido durante más tiempo. Este tipo de respuesta rápida a los cambios en e abastecimiento de nutrientes no sólo proporciona J¿ capacidad de metabolizar sustratos nuevos, sino que también sirve para dec;activar la síntesis endógeD.i de compuestOs que aparecen de manera súbita e!' el medio. Por ejemplo, E. colí sintetiza el aminoáddl triptófano por medio de la acción de la enzima sintetasa de triptófano. Sin embargo, si el medio en e. cual las bacterias son cultivadas proporcion a el triptófano, la producción de la enzima es interru mpid¿ de irtmcdia to. A este efecto se le llama represión Permite a la bacteria evitar que sus recursos se de_tinen a actividades sintéticas innecesarias. La inducción y la represión representan el mismo fenómeno. En un caso la bacteria ajusta su capacidad para utilizar un sustrato determinado (com• la lactosa) para el crecimiento; en el otro. ajust~ su capacidad para sintetizar un intermediario metabólico particu lar (como un aminoácido esencial El descncadenante de cualquier tipo de aj uste e_ una molécula pequeña que es el sustrato, o qutcstá relacionada al sustrato de la enzima, o que e• el producto de la actividad enzimática, respectivamente. Las moléculas pequeñas que provocan ::. producción de las enzimas capaces de metaboliza.:las se denominan inductores. Aquellas molécula que impiden la producción de enzimas capaces a~ sintcli¿arJas se Uaman correpresores.

El represor es controlado por una pequeña molécula inductora ' -.. •·ptos principales -" inductor funciona al convertir a la proteína ·epresora en una forma con menor afinidad por el -:perador. :t represor tiene dos sitios de unión, uno para el )perador y otro para el inductor. :1represor es desactivado por una interacción :lostérica en la cual la unión del inductor a su sitio :ambia las propiedades del sitio de unión al DNA. _ .:apacidad de actuar como un inducLOr o como un -represor es muy específica. Sólo sirven el susua">roducto o una mol écula muy re lacionada. Sin .bargo, en la mayor parte de los casos la actividad

·_. molécula pequeña no depende de su il-zteraccíón con :nzima diana. No obstante, para el sistema lac el

El tetrámero se une al operador

y bloquea la transcripctón

_r ,..,

r

f

r \~' l

-

Monómero

El gen /ac/ stntetrza al

monómero represor c¡ue forma al tetrámero Tetrámero

El represor mantiene al operón loe en condición inactiva al unirse al operador. La forma del represor se representa como una serie de dominios conectados según lo revela su estructura cristalina (véase más adelante) .

.:ucwr natUral es un subproducto de la enzima :Z. la alolactosa ~- 1,6, producida por la transglico-

_ción de la ligadura ~-1, 4 en la lactOsa. La a lola ca también es un sustrato de la enzima lacZ, por lo ~ no persiste en la célula. Algunos inductores se =mejan a los inductores naturales del operón lac, -'1 no pueden ser metabolizados por la enzima. El -mplo por excelencia es el isopropiltiogalactósido ?TG), uno de los numerosos tiogalactósidos que :entan esta propiedad. El lPTG no es reconocido : la gaJacrosidasa ~; de cualquier manera, es un Juctor muy eficiente de los genes Iac. A las moléculas que inducen la síntesis e nzimá· 3, pero q ue no son metabolizadas, se les denomi= inductores g ra t uitos . Son muy útiles porqu e .:'111ancccn en la célula en su forma original. (Un - iuctor real se ría metabolizado, interfiriendo así n el estudio del sistema. ) La existencia de índuc· ~es graLu itos revela un punto importante. EL sis~n

debe poseer algún componente, distinto a la enzima

INOUCTOR- •

t

El lnduCIOr transforma

1

t

1

al represor lac en una forma tnacttva que no Pllede unirse el operador

f

La pollmerasa de ANA se une e un

promotor y transcribe el ANA

El ANAm es traducido

en las tres prolelnas

1 t

La adición de-l inductor transforma al represor en una forma inactiva incapaz de unirse al operador. Esto permite a la polimerasa de RNA iniciar la transcripción.

--w, que reconozm al sustrato apropiado, y su capacidad

-a reconocer sustratos potenciales relacionados es dife:;e a la de la enzima. El componente que responde al inductor es la )teína represora codificada por lacl. Los genes es-...aurales lacZYA se transcriben en un solo RNA.m -:~anir de un promotor adyacente a lacZ que se .:uemra en c;cntido ascen dente. El estado del :-'"lresor determina si este promotor es activado o =sactivado: • La muesua que en ausencia de un inductor los genes no se transcriben. debido a que la proteína represora se encuenua en una forma activa que está unida al operador. • La muestra q ue cuando se agrega un inductor, el represor muta a una for-

ma sin afinidad menor por el operador o es convertido a una forma con menor afinidad que abandona al operador. Después inicia la transcripción en el promotor y procede a través de los gen es hasta un terminador localizado después del extremo 3' del gen lacA. Las características más importantes del circuito de control residen en las propiedades dobles del represor: puede impedir la transcripción y puede reconocer la pequeña molécu la inductora. El represor tiene dos sitios de unión; uno para e l operador y uno para el inductor. Cuando el inductor se u ne a su sitio. cambia la conformación de la pro teína de tal forma que inOuyc en la actividad del sitio de unión a l operador. La capacidad de un sitio localiza-

12.6 El represor es controlado por una pequeña molécula inductora

307

do en la proteína para controlar la actividad de otro se llama control alost érico. La inducción logra una re gulación coordinada : todos los genes se expresan (o no) al unísono. El RNAm es tl·aducido de forma secuencial desde su extremo 5'. lo cual explica porqué la inducción slempre provoca la aparición ele galactosidasa ~. de permeasa de galactósido P y de uansacetilasa de galactósido p. en ese orden. La traducdón de un RNAm común explica porqué las cantidades relativas de las tres enzimas siempre permanecen iguales en condiciones variables de inducción. La inducción provoca un cambio que ocasio · na que los genes sean transcritos. La eficacia de los inductores varía, y hay otros factores que influyen en el nivel absoluto de la transcripdón o de la o·aducción, pero la relación entre los tres genes está predeterminada por su organización. Se observa una posible paradoja en la constitución del operón . El operón de la lactosa contiene· el gen estructural (IacZ} que codifica la galactosidasa p con la activjdad necesaria para metaboUzar al azúcar; también incluye el gen (lacY) que codifica la proteína indispensable para rransponar el sustrato al interior de la célula. Sin embargo. si el operón se encuentra en un estado reprimido, ¿cómo entra el inductor a la célula para injciar el proceso de inducción? Dos características garantizan que siempre haya una cantidad mínima de proteína en la célula, sufi ciente para iniciar el proceso. Hay un nivel basal de expresión del operón: incluso cuando no es inducido, se expresa en un nivel residual (0.1% del nivel inducido). Además, cierta cantidad de inductor entra de cualquier forma por mro sistema de transporte.

afectan la expresión de todos los genes estructurales y qu~ elaboran el mapeo fuera de ellos. Se dividen en do' clases. El promotor y el operador son identificados como dianas para las pwteínas reguladoras (la polimerasa de RNA y el represor, respectivamenfe por mutaciones de actuación en cis. Ellocu~ lacJ eSe identificado como el gen que codifica la proteína represora por medio de mutaciones que eliminar. el producto de acLUación en trans. El operador fue identificado en un inicio por mutaciones constitutivas, a las que se les asignó e. símbolo or, cuyas propiedades distintivas ofrecíerox: la primera prueba de un elemento que funciona sin ser represen!ado m un producto que se difunde. Los genes estructurales contiguos con una mutación 0' se expresan en rérminos consliwtivos porqm· la mutación cambia el operador de tal manera que e. represor ya no es capaz de unirse a él. Por lo tamo, el represor no ptlede impedir que la polimerasa de RNA inicie la transcripción. El operón se transcribe en términos consütutivos, como se ilustra en la El operador puede controlen sólo los genes lac adyacentes a él. Si un segundo operón laces introducido en una bacteria en una molécula de DNA independieme, tiene su propio operador. Ninguno de los operadores recibe la influencia del otro operador. Por lo tanto, si un operón tiene un operador de tipo silvestre, será reprimido en las condiciones habituales, en tanto que un segundo operón con una mutación 0' será expresado en su forma característica. Estas propiedades definen al operador como un típico sitio de actuación en cis, cuya función depende del reconocimiento de su secuencia de DNA por algún factor de actuación en trans. El operador con-

Las mutaciones constitutivas de actuación en cis identifi can al operador Conceptos principales • Las mutaciones localizadas en el operador provocan la expresión constitutiva de los tres genes estructurales lac. • Estas mutaciones actúan en cohñguración cis y afectan sólo a aquellos genes que se encuentran en el fragmento contiguo de ONA.

Las mutaciones que tienen lugar en el circuito regulador pueden inhibi r la expresión del operón o provocar una expresión no regulada. Los mutantes que no pueden ser expresados en absoluto se llaman no inducibles. La expresión continua de un gen que no responde a la regulación se denomina expresión génka constit utiva. y los mutantes con esta propiedad se conocen como mutames constitutivos. Los componentes de un circuito regulador del operóo pueden identificarse por las mutaciones que 308

CAPÍTULO 12 El Operón

t

-

, #

1

, El represor no puede unirse 1 a un operador mutante

1

,,

#

El operón es transcr1to y traducido

Las mutaciones operadoras son constitutivas debido a que el operador es incapaz de unirse a la proteína repr~ sora; esto permite que la polimerasa de RNA tenga acceso sin restricciones al promotor. Las mutaciones 0' actúan en cis porque afectan sólo al conjunto contiguo de genes estructurales.

a los genes adyacentes a pesar de la presencia de

- s aleles del sitio en la célula. Una mutación en de estos sitios (p. ej ., la mutación 0 ' ) se describe :nanera forma l como domin ante en cis. Una mutación en un sitio de actuación en cis puede ser asignada a un grupo de complemen..:ón . (La capacidad de complementar define a los ~ es que se expresan como productos que se di"1den .) Cuando dos sitios de actuación en cis se -:uentran cerca uno del otro (p. ej., un operador y promotor) no se pueden clasificar 1as mutaciones .. una prueba de complernentación. Sólo es posi=distinguirlos por sus efec.tos sobre el feno tipo. La dom inancia en configuración cis es una ca' .:>erística de cualquier sitio físicamente contiguo a las ~

_/endas a las cuales controla. Si un sitio de control -:dona como parte de un RNAm policistrónico. mutaciones en él exhibirán exactamente el mísmo ~ón de dominancia en cisque mostrarían si Iun· !laran en el DNA. El factor determinante es que sitio de control no puede separarse en términos cos de los genes a los cuales regula. Desde el pun · de vista genético, no impona si el sitio y los genes ·.án juntos en el DNA o en el RNA.

Las mutaciones de actuación en trans identifican el gen regulador 1

.:..x-tceptos principales las mutaciones localizadas en el gen locJ·actúan en configuración trans y afectan la expresión de todos los agrupamientos lacZYA en la bacteria. Las mutaciones que eliminan la función de loe! provocan expresión constitutiva y son recesivos. las mutaciones que se encuentran en el sitio de unión al DNA del represor son constitutivas debido a que el represor no puede unirse al operador. las mutaciones que se localizan en el sitio de unión al inductor del represor le impiden ser desactivado e i iT\piden la inducibilidad. Las mutaciones de los promotores son no inducibles y de actuación en cis.

de un gen lacJ+ normal restablece el control. a pesar de la presencia del gen lacl- defectuoso. Las mutaciones que se presentan en el operón que son no inductbles se clividen en los rrusmos dos tipos de dases genéticas que los rnutantes constin.uivos: • Las mutaciones de los promotores son de actuación en cis. Si impiden que la poli merasa de RNA se una a P1o<' producen un operón no funcional debido a que no puede ser transcrito. • Las mutaciones que inhiben la capacidad del represor para unirse al inductor se descri · ben como lacJS. Son de actuación en trans. El represor queda "bloqueado" en la forma activa que reconoce al operador y que impide la transcripción. La adidón de induc· tor no tiene efecto alguno debido a que su unión es impedida o no puede propiciar el cambio alosterico y, por lo tanto, es imposible convenir al represor a la fotma con baja afinidad por el operador. E l represor mutante se une a todos los operadores lac de la célula para evitar su tra nscripción y no puede ser eliminado, a pesar de las propiedades de cualquier proteína represora de tipo silvestre que pueda estar presente, por lo que es genéticamente dominante. los dos tipos de mutaciones en el gen lacl permiten identificar los sitios activos individuales de la proteína represora. El sitio de Hnión al DNA reconoce la secuencia del operador. Es identificada por mutaciones puntuales co nstitutivas que impiden que el represor se una al DNA para bloqLtear la poli m crasa de RNA. El sitio de unión al inductor es identificado por mutaciones puntuales que imposibUitan la inducción, debido a que el inductor no puede unirse para desencadenar el cambio alostérico en el sitio de unión al DNA.

1f1J Las proteínas multiméricas tienen propiedades genéticas especiales Conceptos principales

:ranscripción constitutiva también es ocasionada ·mutaciones de tipo lacJ-, las cuales son provoca.:s por pérdida de la función (induidas las deledones -=-gen). Cuando el represor es inactivo o está ausenta transcripción puede iniciar en el promotor. La muestra que los mutantes lact expresan , . geoes estructurales todo el tiempo (constitutiva":Ole), sin importar si el inductor está presente o ausente, vide a que el represor está inactivo . .1\.rnbos tipos de mutaciones consti tu tivas pueden :inguirse en términos genéticos. Los mutantes oc , dominantes en cis, en tanto que los mutames ·"'son recesivos. Esto significa que la introducción !

1~

• Un represor activo es un tetrámero formado por subunidades idénticas. • Cuando se presentan subunidades mutantes y silvestres, una sola subunidad mutante lad'd puede desactivar a un tetrámero cuyas sub unidades restantes sean silvestres. • Las mutaciones lacJ'd ocurren en el sitio de unión al DNA. Su efecto se explica porque la actividad del represor necesita todos los sitios de unión al DNA en el tetrámero para que sea activo. Una característica importante del represor es que es rnultimérico. Las subu.n.idades del represor se asocian de manera aleatoria en la célula para formar e l 9 Las proteínas multiméricas tienen propiedades genéticas especiales

309

giro Hélice-giro-hélice Bisagra-

t

El gen /ac/- sintetiza al represor defectuoso que no se une al DNA

t

El mutanle tacl-u sintetiza a un represor oon un sitio defectuoso de unión al DNA El gen lacl de tipo silvestre sintetiza al represor normal Una subunidad "mata• envenena al tetrámero; no puede unirse al DNA de manera normal por lo que el operón se expresa

Í

hélice n

.:.~

~

Sftio de unión al Inductor

El operón es transcrito y traducido

tetrámero activo. Cuando hay dos alelos diferentes del gen lacl, las subunidades formadas por cada uno pueden asociarse para formar un hererotet:rámero, cuyas propiedades son diferentes a las del homotetrámero. Este tipo de interacción entre las subuni dades es una característica distintiva de las proteínas multiméricas y se describe como complementación interalélica. Entre algunos mutanres represores ocurre complementación n egativa, como se observa en la combinación de los genes lacJ-<1 con los genes lacf•. La mutación laci-<J sola da como resul tado la produc-

r

--Dominio nuclear 1

~

Las mutaciones que desactivan al gen /acl provocan que el operón sea expresado constitutivamente, debido a que la proteína represora mutante no puede unirse al operador.

hélice a

héllca a

La estructura de un monómero de represor l.: identifica numerosos dominios independientes. Estructura ~ presentada a partir del archivo PDB llbg de Hangli Zhar proporcionada por Kathleen S. Matthews, Rice University.

ción de un represor que no puede unirse al operad' y, por lo tanto, es constitutiva, como los alelos lac."" La mutación de tipo laci- desactiva al represor; l;"_ consecuencia, suele ser recesiva con respecto al ti~ silvestre. Sin embargo, el superíndice -d indica qc_ esta variante del tipo negativo es dominante cuaná se apa rea con un alelo de tipo silvestre. Dichas muté ciones se denominan dominantes negativa s. La explica este fenómeno. La ra zón de la dominancia es que el alelo lacl~ produc una subunidad "mala", la cual no es sólo incapaz v unirse por sf misma al DNA operador, sino que, debido a que es indispensable como parte del sitio e: unión al DNA, también es capaz, como parte de u:: tetrámero, de impedir la unión de las subunidade "buenas". Esto demuesrra que para lograr la represión es necesario el tetrámero represor complete, evez de monómeros individuales. De hecho, se pne· de invertir el argumentO para expresar que siempn: que una proteína tenga una forma negativa donrname debe funcionar como parte de un multúneR La producción de proteínas negativas dominante. se ha convenido en una técnica importante en .! genética eucariótica.

El monómero represor tiene numerosos dominios Conceptos principales Un mutante /acl"' crea un monómero que tiene un sitio dañado de unión al DNA (simbolizado por un círculo rojo). Cuando se presenta en la misma célula como un gen de tipo silvestre, los represores multiméricos son ensamblados en forma aleatoria a partir de ambos tipos de unidades. Sólo se requiere que una de las subunidades del multímero sea de tipo lacJ-d para bloquear la función del represor. Esto explica el comportamiento dominante negativo de la mutación /aci·d. 310

CAPiTULO 12 El Operón

• Una subunidad re presora individual puede dividirse en un dominio terminal N de unión al DNA, una bisagra y el núcleo de la proteína. El dominio de unión al DNA contiene dos regiones helicoidales ex cortas que se unen al surco mayor del DNA. • La región de la bisagra se inserta en el surco menor como una hélice ex corta y plegada.

~-sitio

de unión al inductor y las regiones encargadas de .: formación de los multímeros se localizan en el núcleo.

"t>presor tiene numerosos dominios. El dominio .mión al DNA ocupa Jos residuos 1-59 y seco....-: como casco. Puede dividirse del resto del mo · "!.ero, conocido como núcleo, por la tripsina. La •Jctura cristalina en la muestra una spectiva más detallada de estas regiones. El exrremo N del monómero está formado por hélices a separadas por un giro. Éste es un ele--o común de unión al DNA denominado HTH ~ ..ce-giro-hélice); las dos hélices a caben en el sur""!'layor del DNA, en donde forman contactos con es específicas (véase la sección 14. 11, El represor ...za un elemento hélice-giro-hélice para unirse al ·A}. Esta región está conectada por una bisagra a! ::rpo pri11cipal de la proteína. En la forma unida J;.JA del represor, la bisagra forma una hélice a _i..!eña (como se muestra en la figura), pero cuanel represor no está unido al DNA, esta región está -ordenada. El elemento HTH y la bisagra juntos -:-espondeo al domino de unión al DNA. El volumen del núcleo está formado por dos re:1es con estructuras similares (los dominios nu=.::res l y 2). Cada uno cuenta con una lámina~ pa- ~la de seis cadenas emparedada entre dos hélices : cada lado. El inductor se une a una hendidura .cada entre las dos regiones. En el extremo C, hay ~ hélice a que contiene dos septetos de leucina. _ .e es el dominio de oligomerización. Las hélices oligomerizacíón de cuatro monómeros se asodan _·a mantener la estructura tetramérica.

ro (centro) que se mantiene unido por un conjunto terminal e formado por cuatro hélices . Los sitios de las mutaciones se ilustran en forma de abalorios localizados en la estructura de la parte inferior. Las mmacion<'s /acJS hacen que el represor no reaccione ame el inductor, de tal manera que el operón no es indudble. Se mapean en dos grupos: en color gris se mueStran las localizadas en la hendidura de unión al inductor, y en color amarillo se muestran aquellas que afectan la interfase del dímero del domino nuclear l. El primer grupo inh.ibe el sitio de unión al inductor; el segundo grupo evita que los efectos de la unión del inductor se transmitan al sitio de unión al DNA. Las mutaciones lacl-d que afectan la oligomerización se mapean en do~ grupos. En color blanco se m uesLran las mutaciones en el dominio nuclear 2 que impiden la fo rmación del dímero. En color morado se señalan aquellas t.J bkadas en la h élice de oligomerización que impiden la formación del tetrámero a partir de los dímeros.

Hendidura de unión al inductor

--~~~ft
Núcleo hidrófobo -~~':! ~~

Oll6 dimero; forman un lell"''mero

Un represor es un tetrámero formado por dos dímeros ••'flccptos princip.1les los monómeros forman un d~mero al hacer contactos entre los dominios nucleares 1 y 2, y es posible que entre las hélices de oligomerización. los dímeros forman un tetrámero por medio de interacciones entre las hélices de oligomerización.

La muestra la estructura del núdeo .:américo (con un sistema de modelado diferente 1e la Figura 12.l2). De hecho, está formado por 5 dímeros. El cuerpo del dímero contiene una in-:-:ase laxa entre las regiones terminales N de los _nómeros nucleares, una hendidura a la cual se -e el inductor, y un núdeo hidrófobo (parte supe:1. Las regiones terminales C de cada monómero :-:esalen como hélices paralelas. (El casco se unirá ..as regiones terminales N en la parte superior.) Los -::teros juntos interactúan para formar un tetráme-

Ofigomerlzaclón

e e La estructura cristalina de la región nuclear del represor lac identifica las interacciones entre los monómeros en el tetrámero. Cada monómero es identificado por un color diferente. Las mutaciones están coloreadas de la siguiente manera: interfase del di mero • amarillo; unión al inductor = azul; oligomerización - blanco y púrpura. Fotograñas cort esía de Benjamín Wieder and Ponzy Lu, University of Pennsylvania . 12.11 Un represor es un tetrámero formado por dos dímeros

311

Con estos datos se puede deducir el esquema que se muestra en la , la cual muestra la forma en la que están organizados los monóroeros en el tetrámero. Dos monómeros forman un dímero por medio de contactos en el dominio nuclear 2 y en la hélice de oligomerización. El dímero tiene dos dominios de unión al DNA en un extremo de la estructura y a las hélices de oligomerización en el otro extremo. Después, dos dímeros forman un tetrámero mediante interacciones en la interfase de oligomerización.

Sitios de unión al DNA

Dominios nucleares

2

Oligomerización 2

El tetrámero represor está formado por dos dímeros. Éstos se mantienen unidos por medio de contactos que involucran a los dominios 1 y 2 y por la hélice de oligomerización. los dimeros están ligados en el tetrámero por la interfase de oligomerización.

Los cascos se unen a giros sucesivos en el surco mayor

Núcleo

La unión del inductor cambia la conformación en la bisagra, por lo que los cascos no embonan en el surco

La unión al DNA es regulada por un cambio alostérico en la conformación Conceptos principales • El dominio de unión al DNA de cada monómero dentro de un dímero se inserta en el surco mayor del DNA. La hélice bisagra se inserta en el surco menor del DNA operador. • Un represor activo tiene una conformación en la cual los dos dominios de unión al DNA de un dímero pueden insertarse en vueltas sucesivas de la doble hélice. • la unión del inductor interrumpe la hélice bisagra y cambia la conformación de tal manera que los dos sitios de unión al DNA no se encuentran en la geometría correcta para hacer contactos simultáneos.

Trabajos anteriores sugirieron un modelo en el cua el casco es relativamente independiente del núcleo. Puede unirse al DNA operador al formar el mismc patrón de contactos con una mitad de sitio como represor intacto. Sin embargo, su afinidad por e: DNA es numerosas órdenes de magnitud menor que la del represor intacto. La razón de la diferencia es que la forma dimérica del represor intacto permite que dos cascos entren en contacto con el operador de manera simultánea y cada uno se enlaza a una mitad de sitio. La muestra que los dos dominios de unión al DNA de una unidad dimérica hacen contacto con el DNA al insertarse en giros sucesivos del surco mayor. Esto incremenra en grar. medida la afinidad por el operador. Un elemento clave de la unión es la inserción de la hélice bisagra corta en el surco menor del DNA operador, lo que une aJ DNA por -45°. Este doblez o rienta al surco mayor para la unión del elemento Ii.TH. La unión del inductor ocasiona un cambio de conformación inmediato en la proteína represora. La unión de dos moléculas de inductor al tetrámero represor es adecuada para libera r la represión. la unión del inductor deteliora las hélices bisagra ~ cambia la oúentación de los cascos en relación cor. el núcleo, lo cual ocasiona que los dos cascos de ur: dímero ya no puedan unirse de manera simultánea al DNA. Esto elimina la ventaja del represor multimérico y reduce la afinidad por el operador.

Los fe notipos mut antes se correlacionan con la estruct ura del dominio El inductor cambia la estructura del núcleo de tal manera que la hélice bisagra se desdobla y Las regiones HTH del dímero represor ya no se encuentran en una orientación que permita la unión al DNA.

312

CAPÍTULO 12 El Operón

Concepto principal • Diferentes tipos de mutaciones ocurren en dominios distintos de la subunidad del represor.

mu taciones en el represor Lac identificaron dstencia de diferentes dominios incluso antes Je se conociera la estructura. Ahora se puede .icar de manera más caballa naturaleza de las adones gracias a la referencia de la estructura, o se resume en la ...as mutaciones recesivas de tipo laci- pueden •ir en cualquier lugar de la proteína. Eo esen- .:ualquier mutación que desactive a la proteína ' rá este fenotipo. El mapeo más detallado de =>mutaciones que se observa en la estructura .atina de la Figura 12.13 identifica los daños es.¡ficos de algunas de estas mutaciones, como las ::afectan la ol igomerización. !.a clase especia l de mutacionec; lacJ-d dominannega tivas se encuentra en el sitio de unión al --\. de la subunidad represora (véase la sección - ~. las proteínas multlméricas tienen propiedades ·éticas especia les}. Esto explica su capacidad para ecür que los tetrámeros mixtos se unan al ope- r; una reducción del número de sitios de unión .....Jnuye la afinidad específica por el operador. la .:ión de la región terminal N en la unión especí- al DNA también se demuestra por su localizacomo el sitio donde tienen lugar mUtaciones :mión fuerte". Éstas incrementan la afinidad del - -esor por el operador, en algunas ocasiones tanto ~ no puede ser liberado por el inductor. Ocurren poca frecuencia. las muradones no inducibles lacJS se mapean 3ran medida en la región del dominio nuclear 1 :: extienden desde el sitio de unión al inductor :a la bisagra. Un gru po se ubica en los aminoácique entran en contacto con el inductor, y estas ;a dones fun<.ionan al impedir la unión del induc..as mutaciones restantes se encue mran en sitios : deben participar en la transmisión del cambio .:érico de la conformación a la bisagra cuando se _ el inductor. ~

La proteína represora se une al operador !

·

~ptos

principales

..a proteína represora se une a la secuencia de DNA de :.oble cadena del operador. :'. operador es una secuencia palindrómica de 26 bp. :3da repetición invertida del operador se une al sitio ;¿ unión al ONA de una subunidad represora.

- presor se aisló en un principio mediante la pu..adón del componeme capaz de unir al inductor ._ilo IPTG. (La cantidad de represor que se en.1ra en la célula es demasiado pequeña para ob:-~ suficiente material; fue necesario utilizar una

Extremo N

Sitios de las mutaciones /acf-d } (domonante negativa: no _ puede unorse al DNA)

lacfS (dominante: no puede unirse al Inductor)

t

Extremo e

Las ubicaciones de los tres tipos de mutaciones en el represor de la lactosa se mapean en la estructura de la proteína. Los mutantes recesivos loe!- que no pueden reprimir pueden mapearse en cualquier lugar de la proteína. Los mutantes dominantes negativos lacJ·d que no pueden reprimir se mapean en el dominio de unión al DNA. Los mutantes dominantes tacP que no pueden inducir debido a que no se unen al inductor o que no pueden experimentar el cambio alostérico se mapean en el dominio nuclear 1.

mutación aceleradora[ promotora] para incrementar la transcripción lncl y para colocar a este locus lacl en una molécula de DNA presente en numerosas copias por célula. Esto da como resultado una sobreproducdón toral de lOO a 1000 veces mayor.} El represor se une al DNA de doble cadena que comíene la secuencia del operador In e de tipo silveslre. El represor no se une al DNA de unmutante OC. La actidón de IPTG libera al represor del DNA operador in vitro. l a reacción in vitro entre la proteína represora y el DNA operador, por lo tanto, exhibe las características del control inferido in vivo; de este modo, puede servir para establecer las bases de la represión. ¿Cómo reconoce el represor la secuencia específica del DNA operador? El operador tiene una característica que es común a muchos sitios de reconocimiento para las proteínas reguladoras bacterianas: es un p alíndro m o. las repeticiones invertidas se resaltan en la . Cada repeúdón puede considerarse como una mitad de sitio del operador. Se puede recurrir a los mismos métodos utilizados en el análisis de la interacción polimerasapromotor para definir los puntos con los que hace contacto el represor en el operador (véase la sección 11.14, La polimerasa de RNA se une a una cara del DNA). Las deleciones de material en cua lquiera de los lados definen los puntos terminales de la región; las mutaciones punruales constitutivas identifican 12. l oli

La proteina represora se une al operador

313

RNAm •

1

TGTT G TBTG G ~AT~GAGAGOGGATAACAATTTCACACA

ACAACACACCTTAA C ACTCGCQTATT T T -10

+10

+5

-5

1

+15

A

+20

nra r

+25

Eje de simetría

El operador loe tiene una secuencia simétrica. la secuencia se numera en relación con el sitio de inicio de la transcripción en + 1. Las flech as rosas a ambos lados identifican las dos repeticiones díadas. Los bloques verdes indican las posiciones de identidad.

Mutaciones constitutivas Bases que entran en contacto con el represor

n

~

Ág ~

~

HHi J

JH

g

~H U~

T A

~ ~HH

La unión del inductor libera

TG T TGTGTGG~ AT TGT G A G CGGATAACAATTTCACACA

ACAACACACCTTAACACTCGCC T~T T&lTTAAAQT2TGTI

tttt

t t ttttt

-5

+1

+5

+10

RNAm

t15

+20

+25

Jos pares de bases individuales que deben ser cruciales. Los experimentos en los cuales se compara el DNA unido al represor con el DNA no unido en lo que se refi ere a su susceptibilidad a la metilación o al entrecruzamiento con luz UV identifican las bases que están protegidas o que son más susceptibles cuando están asociadas a la proteína. La muestra que la región del DNA protegida de las nucleasas por el represor unido se encuentra dentro de la región de simetría. que abarca una región de 26 bp desde -5 hasta +21. El área identificada por mutaciones constitutivas es incluso más pequeña. Dentro de una región cemral. que se extiende l3 bp desde + 5 hasta+ 17, hay ocho sitios en los cuales las sustituciones de pares de bases individuales provocan consrirutividad. Esro subraya la misma afirmación hecha en wrno a las mutaciones promotoras y que se resume ames en la Figura 11.2 9. Un número pequei1o de contados específicos esen-

ciales ubicados dentro de u11a región más extensa puede encargarse de la asociación de secumcia específica del DNA con la protefna. CAPÍTULO 12 El Operón

• la unión del inductor provoca un cambio en la conformación del represor que reduce su afinidad por el DNA y lo libera del operador.

""'Eje de simetría

Las bases que hacen contacto con el represor pueden identificarse mediante entrecruzamiento químico o por medio de experimentos que permitan observar si la modificación impide la unión. Identifican posiciones en las dos cadenas del ONA que se extienden desde +1 hasta +23. Las mutaciones constitutivas ocurren en ocho posiciones en el operador entre +5 y +17.

314

al represor del operador

t

. - - - Proteg1das por el represor unido ~

-10

La sime tría de la secuen cia de DNA reOeja la simetría en la proteína. Cada una de las subunidad~ idénticas de un tetrámero represor tiene un sitio dl unión al DNA. Dos de estos sitios hacen contact con el operador de tal manera que cada repetició: invertida del operador forma el mismo parrón de contactos con un monómero represor. Esto se demuestra por la simetría en los contactos que hao: el represor con el operador (el patrón entre +1 y+~ es idéntico a aquel que se encuentra en +21 y +16 y por la concordancia de las mutaciones constitutivas en cada repetición invertida. (Sin embargo, e operador no guarda una simetría perfecta; el lad izquierdo se une con mayor fuerza al represor que el lado derecho. Se crea un operador más fuerte pouna duplicación invertida perfecta del lado izquierdo y se e li mina del par de bases central.)

Varios inductOres provocan reducciones características de la afinidad del represor por el operador ir vitro. Estos cambios se correlacionan con la eficact.; de los inductores in vivo. Esto sugiere que la inducción es el resultado de una reducción de la arracciór entre el operador y el represor. Por lo tanto, cuand el inductor entra a la célula, se une a represare libres y de hecho impide que encuentren a sus operadores. Sin embargo, si se considera un tetrámer represor que ya se encuentra unido con fue rza a operador. ¿Cómo provoca el inductor que este represor sea liberado? En la se ilustran dos modelos de 1.: acción del represor: • El modelo del equilibrio (lado izquierdrexige que el represor unido al DNA se ercuentrc en rápido equilibrio con el represo libre. El inductOr se uniría a la forma libre del represor y así rompería el equilibrio a. evitar la reasociación con el DNA. • Sin embargo, la velocidad coo la que sed-socia el represor del operador es demasiad lenta para ser compatible con este model (la vida media in vitro en ausencia del il:ductor es >15 min). Esto significa quema bien el inductor debe unirse de manera direc a la prou(na represora que forma un comple

con el operador. Como se indica en el modcl de la derecha, la unión del inductor

de~-

producir un cambio en el represor que lo haga liberar al operador. De hecho, la adición de IPTG ocasiona una desestabilización inmediata del complejo represor-operador in vitro. _2 unión del complejo represor-JPTG al ope- puede estudiarse con concentraciones muy :e la proteína en el análisis de protección/po..:.dón de la metilación. La gran canridad de ... .:na compensa la baja añoldad del complejo : -:epresor por el operador. El complejo forma ~.a mente el m ismo patrón de contactos con el - que el represor libre. Un resultado análogo _:iene con represores mutan tes cuya afinidad •. DNA operador se incrementa; éstos también ..:m el mismo patrón de contactos. =.n general, una serie de variantes de represores ~ afinidades por el operador se extienden siete __nes de magnitud hacen los mismos contactos _el DNA. Los cambios m la afinidad del represor por 'A deben ocurrir, por lo tanto, al influir en la canfor_:;¡ general de la protelna en la unión del DNA, no al o deshacer uno o algunos enlaces individuales.

El inductor se une al represor libre para alterar el equilibrio con el represor unido

El lnduclor se une de manera directa para liberar al represor del operador

1-· ¿Se une el inductor al represor libre para alterar un equilibrio (izquierda) o de manera directa al represor unido al operador (derecha)?

El represor se une a tres operadores e interactúa con la polimerasa de RNA ' .....-('ptos principales .:3da dímero localizado en un tetrámero represor puede -~rirse a un operador, de tal manera que el tetrámero :Jede unirse a dos operadores de forma simultánea . .3 represión total requiere que el represor se una a ::ro operador localizado en sentido descendente o :scendente, así como al operador en el promotor lacZ. ..a unión del represor al operador estimula La unión :e, la polimerasa de RNA al promotor, pero impide la :ranscripción.

Si los dos dímeros de un tetrámero represor se unen al DNA, el DNA que se encuentra entre los dos sitios de unión se mantiene en un lazo .

..:-ansición alostérica que se deriva de la un ión :J1ductor tiene lugar en el dimero represor. En:es, ¿por qué se necesita un tetrámero para esr cer la represión total? Cada d.únero puede unirse a una secuencia opex a. Esto le permite al represor intacto unirse _ s sitios operadores de manera simultánea. De .ho, hay dos sitios operadores más en la región _.;ia} del operón lac. El operador original. 01, se ::.ilizajusto en el inicio del gen lacZ. Tiene la afi_;¡d más fuerte por el represor. Las secuencias o::-radoras más débiles (en ocasiones denominadas _Jo-operadores) se localizan a ambos lados; 02 se .::aliza 410 bp en senlido descendente del punto ..aido en lacZ y 03 se encuentra 88 bp en sentido .:!:tdente con respecto a él en lacl.

La muestra lo que sucede cuando una proteú1a de unión al DNA puede adherirse en forma simultánea a dos sitios distintos en el DNA. El DNA que se encuentra entre los dos sitios forma un lazo desde una base en donde la proteina ha unido a los dos sitios. La longitud del lazo depende ele la distancia entre los dos sitios. Cuando el represor Lac se une de forma simultánea a 01 y a uno de los otros operadores, hace que eL DNA localizado entre ellos forme un lazo bastante cono, lo que resuinge de manera significativa la estructura del DNA. En la se muestra un modelo a escala de la unión de un represor tetramérico a dos operadores . La unión a los operadores adidonales afecta el nivel de la represión. La eliminación del operador que se encuentra en sentido descendente (02) o del

12.1b El represor se une a tres operadores e interactúa con la polimerasa de RNA

315

Cuando un tetrámero represor se une a dos operadores, el fragmento de DNA que se encuentra entre ellos forma un lazo ajustado. (la estructura azul localizada en el centro del tazo de DNA representa la CAP, la cual es otra proteína reguladora que se une a esta región). Imagen reproducida con autorización de Lewis, M., et al. 1996. Science. 271: cover. © 1996 AAAS. Fotograña cortesía de Ponzy Lu, Universíty of Pennsylvania.

operador localizado en sentido ascendente (03) reduce la eficiencia de la represión de dos a cuarro veces. Sin embargo, si se eliminan 02 y 03, la eficacia de la represión se reduce lOO veces. Esto sugiere que

la capacidad del represor para unirse a uno de los dos otros operadores, así como a O1, es importame para estabilizar la represión . Los experimentOs in vitrv con plásmidos superenrollados que condenen múltiples operadores demuestran una esLabilizadón significativa del complejo lacl-DNA. No obstante, estas moléculas de DNA en forma de lazo son liberadas con rapidez por la unión de /acl a IPTG. También se conocen los efectos directos de la unión del represor al operador (0/ ). En un principio se pensaba que la unión del represor obstruía la unión de la polimerasa de 1\NA al promotor. Ahora se sabe que estas dos proteínas pueden unirse al DNA de forma simultánea y que la unión del represor de hecho potencia la unión de la polimerasa de RNA. Sin embargo, a la enzima unida se le impide irticiar la transcripción. La constante de equilibüo de la polimerasa de RNA que se une sola al promotor laces de 1.9 x 107 M-1. La presencia del represor incrementa esta constante dos órdenes de magnitud a 2 .5 x 109 M- 1• En términos de los limites de valores de la constante de equilibrio K8 dada en la Figura 1 L20, la -proteína represora convierte de manera eficaz la formación de los complejos cerrados por la polimerasa de RNA en el promotor lac de una interacción débil a una interacción fu erre. ¿Qué significa esto para la inducción del operón? El valor más alto de la K8 significa que, cuando 316

CAPÍTULO 12 El Operón

está ocupado por un represor, el promotor es lOC veces más propenso a unirse a una polimerasa de RNA. Además, al permitir que la polimerasa de RNA se una al mismo tiempo que el represor, es posibk que la transcripción comience en cuanto tiene lugar la inducción en vez de esperar a que una polimerasa de RNAsea capturada. El represor en efecto provoca que la polimerasa de RNA sea almacenada en el promotOr. El complejo polimerasa de RNA-represor-DNA es bloquead< en el estado cerrado. Cuando se agrega el inductor, el represor es liberado y el complejo cerrado se transforma en un complejo ab ierto que inicia la transcripción. El efecto global del represor consiste en acelerar el proceso de inducción. ¿Es posible aplicar este modelo a otros sistemas? La interacción entre la polimerasa de RNA, el represor y la regíón promotora/operadora es d istinta en cada sistema, debido a que el operador no siempre se superpone en la misma región del promotor (véase la Figura 12.26). Por ejemplo, en el fago, e. operador se encuentra en la región ubicada en senLido ascendente con respecto al promotor y la unión del represor obstruye la unión de la polimerasa de RNA (véase el Capítulo 14, Estrategias de los fagos l Por lo tanto, un represor unido no interactúa con la polimerasa de RNA de la misma forma en tOdos los sistemas·.

El represor siempre está unido

al ONA Con<;eptos principales • Las proteínas que tienen gran afinidad por una secuencia específica de DNA también tienen una afinidad baja por otras secuencias del DNA. • Cada par de bases localizado en el genoma bacteriano es el inicio de un sitio de unión de baja afinidad para el represor. • El gran número de sitios de baja afinidad garantiza que toda la proteína represora esté unida al ONA. • El represor se une al operador al desplazarse desde un sitio de baja afinidad en vez de hacerlo al equilibrarse en la solución.

Es probable que tedas las proteínas con gran afintdad por una secuencia específica también posear una baja afinidad por cualquier secuenda {aleatoria) de DNA. Un gran número de sitios de baja afinidad competirán tan bien por un tetrámero represo: como un pequeño número de sitios de alta afinidad Hay sólo un sitio de alta afinidad en el genoma dt E. coli: el operador. El resto del DNA proporcioné sitios de baja afinidad. Cada par de bases del genoma comienza un nuevo sitio de baja afinidad

111m El operador compite El equilibrio de la unión del represor aJ DNA (aleatorio) se describe con la ecuación: K = A

[Represor-DNA] (Represor libre] fDNAl

La proporción de represor libre se obtiene al despejar la ecuación:

(Represor íbre] (Represor-DNA)

KA X (DNAJ

la unión del represor a sitios aleatorios se rige - Jna ecuación de equilibrio.

:tlo moviéndose un par de bases por el genoma, '!:a de fase con el operador mismo, crea un sitio -"baja afinidad.) Por lo tanto. hay 4.2 >< 106 sitios _baja afinidad. El gran número de sitios de baja afinidad signi...: que, incluso en ausencia de un sitio de unión -:-ecífico, todos, o casi todos, los represores están dos al DNA y ninguno se encuentra libre en so..:ún. La muestra cómo la ecuadón :neada para describir el equilibrio entre el re :.or libre y el represor unido al DNA puede rees_aurarse para proveer la proporción de represor

-e. Si se aplican los parámetros del sistema lac, se que: • La constante de unión de equilibrio no específica es K 11 = 2 x l 06 M- 1. • La concentración de los sitos de unión no específicos es 4 x 106 en un volumen bacteriano de 10-rs L, lo cual corresponde a una [DNA] =7 x 10-} M (una concemradón demasiado alta) . Al sustituir csros valores se obtiene: repreUbre/ un ido= LO....

~rva

r

Por lo tanto, todo el represor. excepto el 0.01 %, está al DNA (aleatorio). Puesto que hay - l O moté -

·,1

: s de represor por cada célula, esto es eq u! valen-decir que no bay proteína represora libre. Esto --e una repercusión importante en la interacción :-epresor con e l operador: significa que hay un :.::o por la partición del represor en el DNA, en la ! el siúo de alta afinidad individual del opera- :vmpite con un gran número de sitios de baja -~da d.

:::n esra competencia los valores absolutos de las .stantes de asociación para el operador y el DNA :1:orio no son importantes; lo que es importante ..a proporción de K,P (la constante de urúón a un específico) con respecto a Knsp (la constante de na cualquier secuencia de DNA aleatoria), es -_r, la especificidad.

con los sitios de baja afinidad para unirse al represor Conceptos principales • En ausencia de inductor, el operador tiene una afinidad por el represor que es 107 veces mayor que la de un sitio de baja afinidad. • El nivel de 10 tetrámeros represores por células asegura que el operador esté unido al represor 96% del tiempo. • La inducción reduce la afinidad por el operador a 10" veces la de los sitios de baja afinidad, por lo que sólo 3% de los operadores están unidos. • La inducción hace que el represor se mueva del operador a un sitio de baja afinidad por desplazamiento directo. • Estos parámetros podrían cambiarse con un incremento o reducción de la concentración efectiva de ONA in vivo.

Se pueden definir los parámetros que inOuyen en

la capacidad de una proteína reguladora de satu rar su sitio diana si se comparan las ecuaciones de equilibrio de la unión específica y de la unión no específica. Como puede deducirse de manera intuitiva, los parámetros importantes son: • El tamaño del genoma disminuye la capacidad de u11a proteína para unirse a sitios diana específicos. • La especificidad de la proteína contrarresta el efecto de la masa del DNA. • la canddad de proteína necesaria aumenta con la cantidad total de DNA en el genoma y disminuye con la especificidad. • La canridad de proteína también debe exce der de un modo razonable el número totaJ de sitios diana específicos, por lo que se es pera encontrar reguladores con n umerosas dianas en ca.ntidades mucho n¡ayores qu e los reguladores con pocas dianas. La compara los constantes de equi librio de la unión operador/represor lac con la unión represor ID NA general. A partir de estas constantes. se puede deducir cómo se divide el represor entre el operador y el resto del DNA y qué sucede con el represor cuando el inductor hace que se disocie del operador. El represor se une -10 7 veces mejor al DNA operador que a cualquier secuencia aleatoria de DNA de la misma longitud. Por lo tanto, el operador comprende un solo siúo de alra afinidad que com petirá por el represor 107 veces mejor que cualquier sitio de afinidad baja (aleatorio). ¿Cómo garan tiza esto que el represor pueda mantener un cont rol eficaz del opcrón?

12.18 El operador compite con los sitios de baja afi nidad para unirse al represor

"31 7

DNA

Represor 13

Represor + inductor 1010

Operador

2

Otro DNA

2 X 106

2 X 106

10 7

104

X

Especificidad Operadores unidos El operón es:

10

2

X

96%

3%

reprimido

inducido

El represor Lac se une con fuerza y de manera específica a su operador, pero es liberado por el inductor. Todas las constantes de equilibrio están en M-1 •

MANTENIMIENTO DE 1.A REPRESIÓN El represor está unido al operador\

Represor en exceso unido a cualquier otro\ lugar del DNA

Inductor INDUCCIÓN El represor es liberado del operador y todos los represores están unidos a sitos ' aleatorios en el DNA

•

~~--~~~~,~~ ~ ~~~~~~,~~ Retiro del inductor -

- --

- -- - - - w

ESTABLECIMIENTO DE LA REPRESIÓN ~

r

r -r-r / /

;-\..r; _r

r .._{'

-r; .. ':~

El represor regresa a la forma ;""') activa y se desplaza de un sitio (' aleatorio al operador por medio de deslizamiento o de desplazamiento directo

- ,

""

Casi todo el represor que se encuentra en la célula está unido al DNA.

Si se recurre a la especificidad, se puede calcular la distribución entre los sitios aleatorios y el operador y expresarse en términos de ocupación del operador. Si hay 10 moléculas de represor lac por célula, con una especificidad por el operador de 107, el operador estará unido al represor 96% del tiempo. La funció n de la especificidad explica dos características de la interacción operador-represor lac: • Cuando el inductOr se une al represor. la afinidad por e l operador se reduce - 1o>veces. La afinidad por las secuencias generales

318

CAPÍTULO 12 El Operón

del DNA permanece sin alteraciones. Por lo tanto, la especifiddad ahora es de sólo 10'1, la cual es insuficiente para capturar al represor contra la competencia con el exceso de 4.2 x 106 de los sitios de baja afinidad. Sólo 3% de los operadores estarían unidos en estas condiciones. • Las mutaciones que reducen 20 o 30 veces la afinidad del operador por el represor tienen el efecto suficiente para ser constitutivas. Dentro del genorna, los operadores mutantes pueden ser superados por la preponderancia de los sitios aleatorios. La ocupación del operador disminuye a -50% si la especificidad del represor se red u ce - 1O veces. La consecuencia de estas afinidades es que, en una célula no inducida, un tetrámero represor suele estar unido al operador. Todos, o casi todos, los te trámeros resta ntes están unidos de manera aleatoria a otras regiones del DNA, corno se ilustra en la . Es probable que haya muy pocos o ningún tetrámero represor libre dentro de la célula. La adición del inductor inhibe la capacidad de! represor para unirse de manera específica al ope rador. Aquellos represores unidos al operador son liberados y se unen a sitios a leatorios (de baja afinidad) . Por lo tanto, en una célula inducida, los tetrá meros está n "almacenados" en sitios aleatorios del DNA. En una célula no inducida, un tetrámero está unido al operador. mientras que las moléculas represoras restantes se unen a sitios no específicos. Por lo tanto, el efecto de la inducción es cambiar la distribución del represor en el DNA, en vez de generar represor libre. Cuando el inductor es retirado, e1 represor recupera su capacidad para unirse en forma específica a) operador y lo hace con mucha rapidez. Esto debe ínvolucrar su desplazamiento a partir de un sitio de "almacenaje" no específico en el DNA. ¿Qué mecanismo se utiliza para este desplazamiento rápido? La capacidad de unirse al operador en forma rápida no es congru ente con el tiempo que se necesitará para realizar mú ltiples ciclos de disociación y de reasodación con los sitios no específicos del DNA. La discrepancia excluye a Jos mecanismos de impactos aleatorios para encontrar al operador. Jo cua: sugiere que el represor puede moverse de manera directa desde un siúo aleatorio del DNA hasta e: operador. Esta es la misma situación que se observéo antes con la capacidad de la poli.merasa de RNA para encontrar sus promotores (véanse la Figura 11. 22 y la Figura 11.23). La misma solución es probable: e. movimiento puede lograrse si se reduce la dimensionalidad de la búsqueda al deslizarse a lo largo de: DNA o por desplazamiento directo de un sitio a otro

•roo se indica en la Figura 12.24). Una reacción desplazamienLO puede facilitarse con la presen- de más sitios de unión por tetrámero (cuatro) de que son de hecho necesarios para contactar al ·A en un momento dado (dos). Los parámetros implicados en la localización de operado r de alra afinidad en competencia con _chos sitios de baja afinidad plantean un dilema ;a el represor. En condiciones de represión, debe ::>~r una especificidad alta por el operador. Sin .:>argo, en condiciones de inducción, esta e~pe­ .:idad debe eliminarse. Por ejemplo, supóngase sible establecer una represión contundente si iera menos represores que los lO que se en.-:ntran en cada célula, y podría dificultarse la in:ctón del operón si hubiera demasiados. Es posi• ·ntroducir el sistema represor-operador /ac en el 11. Cuando el operador laces conectado a un gen mero de tirosinasa, la enzima es inducida por la jón de TPTG. Esto significa que el represor está .))Otnmdo su diana en un genoma 101 veces más ·nJe que el de E. coli. La inducción ocurre aproxidameme con la misma concemraci6n de lPTG en las bacterias. Sin embargo, se desconoce la .:emractón del represor Lac y la eficicnda con :ual se induce la diana. ?ara extrapolar in vivo a partir de la afinidad de : interacción DNA-proteína in vitro, es necesario cer la concentración efectiva de DNA in vivo. :oncemración efectiva'' difiere de la masa/volu ~ debido a numerosos factores. La concentración --;iva aurnema, por ejemplo. por el hacinamien;ol ecular, el cual ocurre cuando los cationes aleDLes neULralizan a -90% de las cargas del -. y el ácido nucleico se colapsa en estructuras .ensadas. La fuerza principal que disminuye la :emración efectiva es la inaccesibilidad del DNA ada de la oclusión o del secuestro por parte de :oteínas de unión al DNA.

Una manera de determinar la concentración efectiva es comparar la velocidad de una reacción ín vitro e in vivo que dependa de la concentración de DNA. Esto se ha realizado utilizando recombinadón imermolecular entre dos rno!éculas de DNA . Para proporcionar un control, la misma reacción es seguida como una recombinación imramolecular, es decir, los dos sitios recorobinantes son presentados en la misma molécula de DNA. Se asume que la concentración es la misma in vivo e ú1 vitro para la reacción illtramolewlar y por lo tanto cualquier diferencia en la proporción de las velocidades de rccombinadón intermolecular/inrramolecular puede atri buirse a un cambio de la concentración efectiva in vivo. Los resultados de dicha comparación sugieren que la concentración efectiva del DNA disminuye más de 1O veces in vivo. Esto podría afectar la velocidad de las rcacdones que dependen de la concentración de DNA, como la recombinación del DNA y la unión proteína-DNA. Esta situación destaca el problema que enfrentan todas las proteínas de unión al DNA para encontrar sus dianas con la velocidad suficiente y refuerza la conclusión de que la difusión no es adecuada (véase la Figura 11.22) .

La represión puede suceder

en múltiples loci Concepto principal • Un represor actuará en todos los loci que tengan una copia de su secuencia operadora diana . El represor lac actúa sólo en el operador del agru pamienLo lacZYA. Sin embargo. ñlgunos represor es controlan tos genes estructurales dispersos si se unen a más de un operador. Un ejemplo es el re· presor rrp, el cual controla tres conjuntos de genes no vinculados: • Un operador localizado en el agrupamiento de los genes estructurales trpEDBCA controla la síntesis coordinada de las enzimas que sintetizan el uiptófano a partir del ácido corísmico. • Un operador que se encuentra en otro locus conLrola el gen aroH, el cual codifica una de las tres enzimas que catalizan la reacción inicial de la rl\ta común de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos. • El gen regulador trpR es reprimido por su propio producto, el represor trp. Por lo tanto, la proteína represora actúa para reducir su propia síntesis. Este circuito es un ejemplo de comrol autógeno . Dichos circuitos \Z. •e¡ La represión puede suceder en múltiples loci

319

..-r = .,_ Reglón operadora ---+ aroH :GC0GAATGTACTAGAGAACT AGTGCA_t_LAGGl _ _C_llAI. _ _ _ I.L _::-o ::t _T_G_I _T_A_L__ CAIGC _ J:AA

--+

RNAm up

AATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGOA

----------------+ RNAm

trpR T.(2CTATCGT ACTCTTT AGCGAGT ACAACC

------------------~ RNAm El represor trp reconoce a los operadores en los tres loci. Las bases conservadas se muestran en color rojo. La localización del punto de inicio del RNAm varía, como lo indican las flechas negras.

gal

aroH

trp trpR

tac - Promotor + ~

Ubicaciones del _,...

o arador

Los operadores pueden estar en varias posiciones con respecto al promotor.

son bastante comunes en los genes reguladores y pueden ser negativos o positivos (véase la sección 12.23, La síntesis de las proteínas r es controlada por medio de reguladón autógena, y la sección 14.15, El represor manriene un circuito autógeno) . Una secuencia operadora relacionada de 21 bp está presente en cada uno de los tres lod en los cuales actúa el represor trp. La conservación de la secuencia se indica en la . Cada ope rador tiene una simetría díada apredable (pero no idéntica). Las características conservadas en los tres operadores incluyen Jos pumos importantes de contacto para el represor trp. Esro explica la manera de actuar de una proteú1a represora en numerosos loci:

cada /ocus posee una copia de una secuenda de unión al 320

CAPÍTULO 12 El Operón

DNA especifica reconocida por el represor (del mism• modo como cada promotor comparte secuendas cieconsenso con o tros promotores). La resume la variedad de relacione-entre los operadores y los promotores. Una característica notoria de los operadores dispersos reconocidos por TrpR es su presencia en diferentes localizaciones dentro del promotor en cada locus. En trpR eoperador se encuentra entre las posiciones-12 y +
El AM P cíclico es un efector que activa al factor CRP para que actúe en múltiples o pe rones Conceptos principales .. CRP es una proteína activadora que se une a una secuencia diana en un promotor. • Un dímero de CRP es activado por una sola molécula de AMP cíclico.

Hasta a hora se ha considerado al promotor com una secuencia de DNA capaz de unirse a la polimerasa de RNA, la cual inicia entonces la transcripciÓJ;

embargo, hay algunos promotores en los cuales !imerasa de RNA no puede iniciar la transcrip• sin la asistencia de una proteína auxiliar. Dichas :eínas son reguladores positivos, debido a que resencía es necesaria para aclivar la unidad de ~Kripción. Por lo general, el activador supera una ::ciencia en el promotor, por ejemplo, una mala .:-~encía de consenso localizada en - 35 o en - 1o. Uno de los activadores de actuación más amplia ~na proteína denominada activador CRP que :rola la actividad de un gran conjunto de ope~s en E. coli. La proteína es un factor de control ·'tivo cuya presencia es necesaria para iniciar la -nscripción en promotores dependientes. La CRP 3Ctiva sólo en presencia de AMP cíclico, el cual actúa

z

<)

ü

()

::1

o

~

Represor

Represor Ci) inactivo Inductor

ActlvadoT Activador inactivo activo Inductor

REPRIMIDA

INDUCIDA

REPRIMIDA

-no una pequeña molécula inductora clásica para :ontrol positivo (véase la ; parte de.:ha superior). El AMP dclico es sintetizado por la enzima ci3.Sa de ade nilato. La reacción utiliza el ATP como ~:rato e introduce una ligadura 3'-5' por medio de ,aces fosfodiéster, el cual genera la estructura de . Las mutaciones que se presentan en ~en que codifica la dclasa de adenilato (cya·¡ no ~pon den a cambios en los niveles de glucosa. El nivel de AMP cíclico se relaciona de manera .-ersa con el nivel de glucosa. La base de este cfec:-adica dentro del mismo componente del sistema ~que se. encarga del control de la absorción de la .:tosa. La forma fosforilada de la proteína IIAGlc esnula la ciclasa de adenilato. Cuando la glucosa es -:portada, la desfosforilación de llAGk conduce a un ::scenso de la actividad de la cidasa de adenilato. La muestra que la reducción del ,·el del AMP dclico hace que la proteína (tipo sil:-stre) sea incapaz de unirse a la región de control, ~ cual a su vez impide que la polímerasa de RNA .icie la trnnscripción. Por lo tamo, el efecto de la .. ucosa en la reducción de los niveles de AMP cíclies privar a los operones relevantes de un factor .e control indispensable para su expresión.

1111

El factor CRP funciona de formas diferentes en operones diana distintos

(o1ceptos principales • CRP introduce un giro de 90° en el DNA en su sitio de unión. • Los sitios de unión al CRP se encuentran en ubicaciones muy variables con respecto al promotor. • CRP interactúa con la polimerasa de RNA, pero los detalles de la interacción dependen de las ubicaciones relativas del sitio de unión al CRP y del promotor.

'../";

z <) (ñ

w a: a. w a:

1 l Represor Represor Inactivo activo Correpresor INDUCIDA

REPRIMIDA

Act1vador activo

Activado inactivo Correpresor

INDUCIDA

REPRIMIDA

Los circuitos de control son vers~tites y pueden crearse para permitir el control positivo o negativo de La inducción o de La represión.

5'

'0

~0-po~dooioo

"p -o/

w

----0

OH

3'

El AMP cíclico tiene un solo grupo fosfato conectado a las posiciones 3' y 5' del anillo de azúcar.

El factor CRP se une al DNA y los complejos de AMP cíclico-CRP-DNA pueden ser aislados en cada promotor en el cual funciona. El factor es un dímero de dos subunidades idénticas de 22.5 kD, el cual puede ser activado por una sola molécula de AMP cíclico. Un monómero de CRP contiene una región de unión al DNA y una región activadora de la transcripción. Un dímero de CRP se une a un sitio de -22 bp en un promotor reactivo. Los sitios de unión inclu yen variaciones de la secuencia de consenso que se

12. 21 El fa ctor CRP funciona de formas diferentes en operones diana distintos

321

Glucosa

~

AMPc reducido

~ CRP inactiva

CRP activa

Transcripción ausente

Al reducir el nivel de AMP cíclico, la glucosa inhibe la transcripción de los operones que requieren la actividad de la CRP.

_,.

T ransoñpción

Pentámero con un nivel alto de conservación

Pentámero menos conservado

la secuencia de consenso de la CRP contiene el pentámero bien conservado TGTGA y (en ocasiones) una inversión de esta secuencia (TCANA).

Centro de simetria diada

1

la CRP dobla el ONA >90° alrededor del centro de simetría.

muestra en la . Las ffiU[adones que impiden la acción de la CRP suelen localizarse dentro del pentámero bien conservado TGTGA, el cual paACACT

rece ser el elemento esencial en el reconocimiento. El factor CRP se une con mayor fuerza a los 322

CAPÍTULO 12 El Operón

sitios que contienen dos versiones (invertidas) de pentámero debido a que esto permite a las dos subunidades del dímero unirse al DNA. Sin embargo numerosos sirios de unión carecen del segundo pentámero y en éstos La segunda subunidad debe unirse a una secuencia diferente (si se une al DNAI La jerarquía de las afinidades de unión por la CRP ayudan a explicar porqué genes diferentes son activados por niveles distintos de AMP cíclico in vivo. La CRP introduce un gran doblez cuando se une al DNA. En el promotor lac, este punto se encuentra en el centro de la simetría díada. El doblez es bastante pronunciado, >90°, como se ilusrra er;. el modelo de la . Por lo ramo, hay ur. cambio drástico en la organización del DNA de doble hélice cuando se une la CRP. El mecanismo de doblamiento consiste en lmroducir un doblez agudo en la secuencia de consenso TGTGA. Cuandt hay repeticiones invertidas del consenso, los do~ dobleces en cada copia presentes en un palíndromo provocan el doblez genera l de 90°. Es posible que el pliegue tenga algún efecto directo sobre J.: transcripción, pero podría ser que se necesitara tar sólo para pennitir que la CRP hiciera contacto cor la polimerasa de RNA en el promotor. La acción de la CRP tiene la característica notable de que sus sitios de unión se encuentran en ub:. caciones distintas en relación con el punto de inici<' en Jos diversos operones que regu la. El pemámerc TGTGA puede encontrarse en cualquier oriemadón Los tres ejemplos que se resumen en la abarcan el intervalo de las localizaciones. • El sitio de unión a la CRP es adyacente a promotor, como en el operón lac, en el cua la región de DNA protegida por la CRP s~ centra en -61. Es posible que dos dímero• de CHP estén unidos. El patrón de unión es congruente con la presencia de CRP sobre todo en una cara del DNA, la cual es la mis· ma cara a la cual se adhiere la poli me rasa dt RNA. Esta localización ubicará una proteína justo al alcance de la otra. • En algunas ocasiones el sitio de unión ;,; la CRP se encuentra dentro del promotor como en el locus gal, en donde el sitio de unión a la CRP está centrado en la posiciór -41. Fs probable que sólo un dímero de CRr esté unido, tal vez en contactO muy cercan con la polimerasa de RNA, debido a que esitio de unión a la CRP se extiende profundamente en la región protegida en genera por la polimerasa de RNA. • En otros ope rones, el sirio de unión a la CRr se encuentra bastante lejos del promotor er. sentido ascendente. En la región ara, el sitie de unión para una sola CRP está lo más lejo·

posible del punto de inicio. centrado en la posición -92. La dependencia de la CRP se relaciona con la •ficiencia intrínseca del promotor. Ningún proilOtor dependiente de la CRP tiene una secuencia :ueoa - 35 y algunos también carecen de secuen-:ias buenas -10. De hecho, se puede afirmar que =. control efectivo provisto por la CRP sería dificil ;! el promotor tuviera regiones efectivas -35 y - lO ~ue interactuaran de manera independiente con la olimerasa de RNA. En principio hay dos formas en las cuales la ..::RP puede activar la transcripción: podría imerac:uar en forma directa con la polimerasa de Rl'{A o ~oclría actuar en el DNA para cambiar su estructura .:ie una manera tal que ayudara a la polimerasa de RNA a unirse. De hecho, la CRP tiene efectos en la ?Olim erasa de RNA y en el DNA. Los sitios de unión para la CRP en la mayor ~arte de los promotores ~e asemejan a la e (centrado en la posición -61) o a gal (centrado en la posición -4 1). La diferencia básica entre ellos es que en el primer tipo (denominado clase I) el sitio de unión .a la CRP se encuentra completamente en sentido :iScendente con respecto al promotor, mientras que m el segundo tipo (denominado clase U) el sitio je unión a la CRP se superpone al sitio de unión de la polimerasa de fu\lA. (Las interacciones en el 1romoror ara pueden ser diferentes.) En ambos tipos de promotor, el sitio de unión a .a CRP se centra en un número integral de vueltas de la doble hélice desde el punto de inicio. Esto sugjerc que la CRP está unida a la misma cara del DNA que la polimerasa de RNA. Sin embargo, la natura.eza de la interacción entre la CRP y la polimerasa .:le RNA es diferente en Jos dos tipos de promotor. Cuan do la subutúdad o: de la polirnerasa de RNA presen ta una del.eción en !:!1extremo C, la transcrip ción parece ser normal excepto porque pierde la capacidad de ser activada por la CRP. Esta última riene u na uregión acúvadora" que es necesaria para activar sus dos tipos de promotores. Esta región activadora, la cual está formada por un lazo expuesro de -10 aminoácidos, es un parche pequeño que in!eractúa de manera directa con la subunidad o: de la polimerasa de RNA para estimular a la en7jma. En los promotores de clase 1 esta interacción es sufijeme. En los promotores de clase rr se requiere una segunda interacción. la cual involucra otra región .de la CPR y la región terminal N de la subunidad o: de la polimerasa de RNA. Los experimentos qu~ se han realizado con dímeros de CRP en los cuales sólo una de las subunidades tiene una región fundonal de transcrip ~ón -activació n muestran que cuando la CRP esLá ~m ida al promotor lac. sólo es necesaria la región

- Promotor+ ._. Locall:zacíones oe la ,..

unión a fa CAP La proteína CRP puede unirse a diferentes sitio~ en relación con la polimerasa de RNA. activadora de la subunidad más cercana a l p unto de in.icio, al parecer deb ido a que ha ce contacto con la polimerasa de RNA. Esto explica que no haya una dependencia de la o rientación del sitio de unió n : la estructura dimérica de la CRP garantiza que una de las subunidades esté disponible para hacer comacto con la polimerasa de RNA, sin importar qué subuni· dad se una al DNA y en qué oriemación. El efecto ejercido sobre la unión de la polimerasa de RNA depende de las localizaciones relativas de las dos proteínas. En los promotores de clase T, en donde la CRP se une adyacente al promotor, aumenta la velocidad de la unión inicial para formar un complejo cerrado. En los promotores de clase n. en donde la CRP se une dentro del pr o m otor, aumenra la velocidad de la transidón del complejo cerrado al complejo abierto.

La t raducción puede ser regulada Conceptos p1incipales • Una proteína represora puede regular la traducción al impedir que un ribosoma se una a un codón de iniciación. • La accesibilidad a los codones de iniciación en un RNAm policistrónico puede ser controlada por medio de cambios en la estructura del RNAm los cuales ocurren como resultado de la traducción. El control de la uaducdón es una característica notoria de los operones que codifican componentes del mecanismo de la síntesis de proteínas. El operón proporciona un arreglo para la regulación coordinada de un grupo de genes estructurales. Sin embargo. controles posteriores superpuestos en el operón . como los del nivel de la traducción, pueden crear diferencias en el grado al cual se expresan los genes individuales. 12.22 La traducción puede ser regulada

323

Se utiliza un mecanismo similar para lograr el comrol de la traducción en numerosos sistemas. La función del represor la proporciona una proteína que se enlaza a una región diana del RNAm para impedir que los ribosomas reconozcan la región de la inídación. En términos formales esta situación es equivalente a la de una proteína represora que se une al DNA para evitar que la polimerasa de RNA utilice un promotor. La ilustra la forma más frecuen te de esta interacción, en la cual la proteína reguladora se une de manera directa a una secuencia que incluye al codón de iniciación AUG, lo que impide la unión del ribosoma. En la se orrecen algunos ejemplos de represores de la traducción y de sus dianas. Un ejemplo clásico es la proteína de envoltura del fa go de RNA Rl7; ésta se u ne a una horqu illa que se extiende sobre el sitio de u n ión al ribosoma en el RNAm del fago. De fo rma similar, la proteína RegA T4 se une a una secuencia de consenso que incluye al codón de iniciación AUG en numerosas moléculas tempranas de RNAm T4, y la polimerasa de DNA T4 se une a una secuencia en su propio RNAm que incluye el elemento Shine-Dalgarno indispensable para la unión de los ribosomas.

Otra forma de control de la traducción ocurre cuando la traducción de un dstrón requiere cambios en la estructura secundaria que dependen de la traducción de un cistrón precedente. Esto sucede durante la traducción de los fagos de RNA, cuyo~ dstrones siempre se expresan en un orden predeLerminado. La muestra que el fago de RNA adquiere una estructura secundaria en la cua: sólo es accesible una secuencia de inidación; la se-

Sólo un sitio da Iniciación está disponible en un principio El segundo sitio de lniciación está bloqueado

1 AUG

1

El primer sitio de Iniciación está disponible

La traducción expone el segundo sitio de iniciación

Los ríbosomas desestabilizan la estructura secundaria + Sitio de u~n regulador+

1

NNNNNNNNNNNNNNNAl "NNNNNNNNNNNNNNNN

............

+ Sitio de l.lnlón al ribosoma+

..

..

..

Una proteína reguladora puede bloquear la traducción al unirse a un sitio del RNAm que se superpone al sitio de unión al ribosoma en el codón de iniciación.

Represor

Gen diana

La estructura secundaria puede controlar la iniciación. Sólo un sitio de iniciación está disponible en los fagos de RNA. pero la traducción del primer cistrón cambia la conformación del RNA para que otro u otros sitios de iniciación estén disponibles.

Sitio de acción

Proteína de envoltura R17 replicasa R17

la horquilla que incluye el sitio de unión ribosómica

RegA T4

RNAm T4 tempranos

varias secuencias que incluyen el codón de iniciación

Polimerasa de DNA T4

polimerasa de DNA T4 secuencia Shine-Dalgarno

p32T4

gen 32

líder 5' de cadena Individual

Las proteínas que se unen a las secuencias que se encuentran en el interior de las regiones de iniciación de las moléculas de RNAm pueden funcionar como represores de la traducción. 3 24

CAPÍTULO 12 El Operón

-nda no puede ser reconocida por los ribosomas :bido a que está apareada con otras regiones del --A. Sin embargo, la traducción del primer cistrón terrumpe la estructura secundaria, lo que permi. a los ribosomas unirse al sitio de iniciación del ~uieme cistrón. En este RNAm, la estructura se_ndaria controla la traducibilidad.

rpsLrpsG fusA tufA

S1t ) EF·G EF-Tu rp/N rp/X rp/E rpsN rpsH rp/F rp/R rpsE rp/0 rpmO sec Y-X

L14 L24 LS S14 SS L6 l18 SS l30 l15

t

La síntesis de las proteínas r es controlada por medio de regulación autógena ~

u)nC!:pto principal • La traducción de un operón de proteína r puede ser controlada por un producto del operón que se une a un sitio localizado en el RNAm policistrónico.

_-aas 70 proteínas constiLuyen el apara to de la ex:-esión génica bacteriana. Las proteínas ribosó"'iicas son el componente principal, junto con las :oteínas accesorias involucradas en la síntesis prodnica. Las subunidadcs de la polimerasa de RNA y ~s factores acce:.orios integran el resto. los genes ~ Je codifican las proteínas ribosórnjcas, a los facto-~ de la síntesis proteínica y a las subunidades de .1 polirncrasa de RNA. tOdos están entremezclados organizados en un pequeño número de operones. ...l mayor pane de esras protemas están represenra.::as sólo por genes individuale!> en E. coli. Los controles coordinados garamizan que estas - roteínas sean sintetizadas en cantidades apropia:Las para las condiciones de crecimiento: cuando las .:>acrerias crecen con mayor rapidez, dedican u na :tayor proporción de sus esfuerzos a la producción 1el mecan ismo para la expresión génica. Se utiliza -n conjunto de mecanismos para controlar la ex,resión de los genes que codifican este mecanismo _ para garantizar que las proteínas sea n sime¡jzadas -:on niveles comparables que se relacionan con los '1iveles de las moléculas de RNAr. La organización de seis operones se resume en a . Cerca de la mitad de los genes de las roteínas ribosórnicas (proteínas r) mapeao en cua-ro operones que se encuemran cerca uno del otro denominados srr, spc, S lO y <X tan sólo por la primera ie las fundones que han sido identificadas en cada :aso). Los operones rif y L/1 se encuentran juntos =n otra ubicación. Cada operón codifica una variedad de funcio:es. El operón str Liene genes que codifican las pro:eínas de la subunidad rjbosómica pequeña, así ~oroo EF-Tu y EF·G. Los operones spc y SIO tienen ;enes diseminados para las proLeínas de las sub:.midades ribosómicas pequeña y grande . El ope -

Y X

1

rpsJ rpfC rpfB rpiD rp/W rp/S rp/V rpsC rpsQ rp/P rpmC

81 0 L3

L2 L4 L23 S19 L22 SS 817 L16 l29

t

1

rpsM rpsK rpsD rpoA rp/Q S13 S11 S4 a L17

t

1

rp/K

rp/A

l1i

L1

t__j rP.}_J rp/LrpoBrpoC

L10L7 ~ ~·

o

Los genes de las proteínas ribosómicas, los fac:tores de la síntesis proteínica y las subunidades de la polimerasa de RNA están esparcidos en un pequeño número de operones que se regulan de manera autónoma. El regulador se indica en color violeta; las proteínas que son reguladas se muestran sombreadas en color rosa.

rón <X tiene genes para las proLeínas de ambas subunidades ribosómicas y para la subunidad a. de la polirnerasa de RNA. Ellocus riftiene genes para las proteínas de la suburtidad ribosómica grande y para las suburtidades ~ y P' de la polirnerasa de RNA. Todas, exceptO una de las proteínas r ibosómicas, son necesarias en cantidades equimolares, las cuales deben estar coordinadas con el n ivel de RNA.r. La dispersión de los genes cuyos productOs deben ser equimolarcs y su mezcla con los genes cuyos productos se necesitan en cantidades diferentes plantean algunos problemas interesantes para la regulación coordinada. Una característica común en todos los operones descritos en la Figura 12.36 es la regulación de algunos de los genes por uno de los productOs. En cada caso, el gen que codifica el producto regulador es una de las dianas de la regulación. La regulación a u tógena ocurre siempre que una proteína (o RNA) regula su propia producción. En el caso de los operones de las proteínas r, la proteína reguladora jnhlbe la expresión de un conjumo contiguo de genes denuo del operón, por lo que éste es un ejemplo de regulación autógena negativa. En cada caso. la acumulación de la proteína inhibe la símesis posterior de sí misma y de algunos otros productos génicos. El efecto con frecuencia es ejercido en

12.21 La síntesis de las proteínas res controlada por medio de regulación autógena

325

Cuando hay RNAr disponible, las protefnas r se asocian a él. Le traducción del RNAm cont1núa

....._,

\.~~

""

l

RNAr

RNAm

---+

;:;

• •

Pro1efnas r Cuando no hay RNAr disponible, las protelnas r se acumulan. Una protefna r se une al RNAm e 1mpíde la traducción ~..;•

l La traducción de los operones de proteínas res controlada de manera autógena y responde al nivel del RNAr.

individual y continúa siendo sintetizada en presencia de sus Sitios de unión

En ausencia de DNA de cadena individual, Ja p32 se une a una región rica en A-T alrededor del codón de iniciación del RNAm e impide que los ribosomas inicien

del RNAm para inhibir la traducción de SlO y ~ los genes subsiguiemcs. La inhibición puede pr venir de un simple bloqueo del acceso al riboso~: como se ilustra antes en la Figura 12.34, o pue inhibir alguna otra etapa subsiguiente de la tradu ~ ción. En dos casos (que incluyen 54 en el operéo.), la proteína reguladora estabiliza una estrucru~ secundaria panicular en el RNAm que impide qt la reacción de iniciadón cominúe después de que sha unido la subunidad 305. El uso de las proteínas r que se unen al RN.., para establecer la regulación autógena de mane.: inmediata sugiere que esro ofTece un mecanisre pa ra vincular la síntesis de proteína r ala símesis e~ RN'Ar. Un modelo generalizado se ilustra en la . Supóngase qu e tos sitios de unión para lé. pro teínas r regu ladoras autógenas en el RNAr S<-" mucho más fu ertes que aq uellos rle las molécula de HNArn. Siempre que haya un RNAr libre disp.,nible, las prote ínas r que acaban de sintetizarse s_ asociarán a él para iniciar el ensamble del ribosorna No habrá proteína r libre para unirse al RNAm, pf' lo que su traducción continuará. Sin embargo, e...cuanto disminuye de velocidad la síntesis de RNA o se detiene, las proteínas r libres comienzan a act.mularse. Después estarán disponibles para unirse ; sus moléculas de RNAm, y reprimir así la traducció: posterior. Esre circuito garantiza que cada operó; de proteína r responda de la misma manera al nivt del RNAr: tan pronto haya un exceso de proteína:en relación con el RNAr, la síntesis proteínica ser.: reprimida .

La p32 del fago T4 es controlada por un circuito autógeno Concepto principal

El exceso de La proteína del gen 32 (p32) se une a su propio RNAm para impedir que los ri bosomas inicien la traducción.

el nivel de la traducción del RNAm policistrónico. Cada uno de los reguladores es una proteína ribosómica que se une en forma directa al RNAr. Su efectO sobre la traducción es el resulrado de su capacidad para unirse cambién a su propio RNA'm. Los sitios ubicados en el RNAm a los cuales se unen estas proteínas se superponen a la secuencia en la cual se inicia la traducción o se encuentran cerca y ral vez influyen en la accesibilidad al sitio de iniciación al inducir cambios de conformación. Por ejemplo, en el operón S 1O, la proteína L4 actúa en el inicio preciso 326

CAPÍTU LO 12 El Operón

• p32 se une a su propio RNAm para impedir la iniciación de la traducción.

La regulación autógena se ha estableado en una base cuantitativa para el gen 32 del fago T4. La proteína (p32) tiene una fundón fundamental en la recombinación genética, la reparación del DNA y la replicación, en la cual su fundón se ejerce por virtud de su capacidad de unirse al DNA de cadena individual. Las mutaciones sin sentido hacen que la proteína inacüva se produzca en demasía. Por/o tamo, cuand.: se impide la ju11ción de la proteína, se produce más de ella Este efecto ocu rre en el n ivel de la traducción; e. RNAm del gen 32 es estable y permanece así a pesar del comportamiento del producto proteínico.

e: 100

Unión a:

DNAss

Otros

RNAm p32 RN~

•O

-~

75

::;)

eí

50

~

25

'#-

o

1

1o-43

!f 10-"

Concentración (molar) proteínica _ . La proteína del gen 32 se une a varios sustratos - afinidades distintas, en el siguiente orden: DNA de cadena :'vidual, su propio RNAm y otras moléculas de RNAm. la 5n de dicha proteína a su RNAm impide que incremente el -:l de p32 a más de 10·6 M.

La presenra un modelo del circuito ::-control del gen 32. Cuando hay DNA de cadena jividual en la célula infectada por el fago, secues~ la p32. Sin embargo, en ausencia de DNA de .:dena individual, o al menos en condiciones en -' cuales hay un remanente de p32, la proteína .pide la traducción de su propio RNAm. EJ efecto mediado en forma directa por la unión de p32 al '\Ampara inhibir la iniciación de la traducción. Es • 1bable que esto OCllrra en una región rica en A-T .:e rodea al sitio de unión ribosómico. Para que el lazo de comrol funcione de maneeficiente son necesarias dos caracrer(sticas de la lión de p32 al silio del RNAm: • La afinidad de p32 por el sitio localizado en el RNArn del gen 32 debe ser signjficativa mente más baja que su afinidad por el DNA de cadena individual. La constante de equilibrio de la unión del RNA esrá, de hecho, casi dos órdenes de magnitud por debajo de la del DNA de cadena individual. • No obstante, la afinidad de la proteína p32 por e1 RNAm debe ser significativamente mayor que la afinidad por otras secuencias de RNA. Está determinada por Ja composición de las bases y por la estructura secundaria; un aspecto importante de la unión al RNAm del gen 32 es que la región reguladora Liene una secuencia extendida que carece de estructura secundaria. Utilizando las constantes de equilibrio conocilS, se puede realizar un diagrama de la unión de 32 a sus sitios diana en función de la concentración .oteínica. La muestra que en concen·aciones por debajo de 1o-6 M, la proteína p32 se .!le al DNA de cadena individual. En concenrra._,mes mayores a 10-<> M, se une al RNAm del gen ~- En concentraciones incluso mayores se une a iS otras secuencias de RNAm, con un intervalo de ·.nnidades.

Estos resultados implican que el nivel de p32 debe estar autorregulado para ser <1O 6 M, lo cual corresponde a -2 000 moléculas por bacteria. Esto corresponde apropiadamente al nivel medido de 1 000 a 2 000 moléculas/célula. Una característica del control autógeno es que cada interacción reguladora es única: una proteína actúa sólo en el RNAm enca.rgado de su propia síntesis. El fago T4 constituye un ejemplo de un regulador de la traducción más general, codificado por el gen regA, el cual reprime la expresión de numerosos genes que se transcriben durante eJ inicio de la inlección. La proteína RegA impide la traducción de las moléculas de RNAm de estos genes al competir con las subunidades 30S por los sirios de in iciación del RNAm. Su acción es una contraparte directa de la función de una proteína represora que se une a operadores múltiples.

EfD La regulación autóge na se uti liza a menudo pa ra controlar la síntesis de ensa mbles macromoleculares (oncepto principal • El precursor de los microtúbulos, la proteina tubulina libre, inhibe la traducción del RNAm de la tubulina.

La regulación autógena es un tipo frecuente de control entre las proteínas que son incorporadas en ensambles macromolcculares. La panícula ensamblada puede ser inadecuada como regulador porque es demasiado grande, muy numerosa o bastante res tringida en cuanto a su localización. Sin embargo, la necesidad de sintetizar sus componentes puede refl ejarse en el banco de subunidades precursoras libres. Si se bloquea la ruta de ensamble por cualquier motivo. las subunidades libres se acumulan yapagan la síntesis innecesaria de más componentes. Las células eucarióticas tienen un sistema común en el cual tiene lugar la regulación autógena de este tipo. La tubulina es el monómero del cual se sintetizan los mkrotúbulos, un sistema filamentoso importante de todas las células eucarióticas. La producción del RNAm de la rubuüna es controlada por el banco de tubulina libre. Cuando este banco alcanza cierta concentración, la producción de más RNAm de la tubulina se inhibe. Una vez más, el principio es el mismo: la tubulina secuestrada en su ensamble macromolccular no tiene ninguna función en la regulación, pero el nivel de precursores libres en el banco determina si se agregarán más monómeros. El sitio diana para la regulación es una secuencia corra localizada en el inicio de la región codiii-

12.25 La regulación autógena se utiliza a menudo para controlar la síntesis de ensambles macromoleculares

327

-

-=

La tubulína libre se une -

..

RN Am Proteína naciente

La tubulina es ensamblada en microtubulos

El RNAm es ! degradado

La tubulina se ensambla en microtúbulos cuando es sintetizada. La acumulación del exceso de tubulina libre induce inestabilidad en el RNAm de la tubulina al actuar en un sitio localizado en el inicio del marco de lectura en el RNAm o en la posición correspondiente en la proteína naciente.

cadora. Todavía no se conoce qué función tkne esta secuencia, pero se. ilustran dos modelos en la . La tubulina puede unirse de manera directa al RNAm ú puede unirse al polipéptido naciente que representa a esta región. Cualquiera que sea el modelo que se. aplica, el exceso de tubulina hace que el RNAm de la tubulina que se localiza en los púlísomas sea degradado, por lo que la consecuencia de la reacción es hacer inestable al RNAm de la tubulina. El control autógeno es un sis tema intrínsecamente auto -limitante, en contraste con el control extrínseco que se analizó antes. La capacidad de una proteína represora de unirse a un operador puede ser controlada por el nivel de una pequeña molécula extraña, la cual inhibe o facilita su actividad. En el caso de la regulación autógena, sin embargo, el parámet ro determinante es la conce ntración de la proteína misma.

B

Resumen

La transcrip ción es regulada por la interacción entre los factores de actuación en trans y los sitios de actuación en cis. Un factor de actuación en trans es el produclo de un gen regulador. Casi siempte es una proteína, pero también puede ser RNA. Se difunde en la célu la y en consecuencia puede actuar en cualquier gen diana apropiado. Un sitio de actuad6n en cis en el DNA (o en el RNA) es una secuencia que 328

CAPÍTULO 12 El Operón

funciona al ser reconocida in situ. No tiene funció P codificadora y puede regular sólo aquellas secuencias a las cuales es contigua fisicamente. Los gene5 bacterianos codifican proteínas cuyas funciones es· tán relacionadas, como las enzimas sucesivas de una ruta, y pueden ser organizadas en un a.grupamienu. que se transcribe en un RNAm policistrónico a par· rir de un solo promotor. El control de este promowregula la expresión de toda la ruta. La unidad de regulación, la cual contiene genes estructurales y elementos de actuación en cis1 se denomina opetón. La inidación de la transcripdón es regulada por interacciones que tienen lugar en la vecindad de promotor. La capacidad de la polimerasa de RNr para iniciar en el promotor es inhibida o act ivada por otras proteínas. Los genes que son activos a menos que sean apagados se dice que se encuemrar.. bajo control negativo. Los genes que son activo· sólo cuando son encendidos de manera específi ca se dice que están bajo control positivo. El tip de control puede determinarse por las relaciones de dominancia entre los genes de tipo süvestre y los genes mutantes que son constitutivos/no reprimido: (encendidos de forma permanente ) o no inducib le~ súperreprimidos (apagados de manera perpetua}. Una proteína represora impide que la polimerasa de RNA se una al promotor o que active !3 transcripción. El represor se une a una secuencie diana, el operador, que pot lo general se encuentra alrededor o en sentido ascendente con respecto a punto de inicio. Las secuencias operadoras son cortas y con frecuencia son palindrómicas. El represoa menudo es un homomultímero cuya simetría refleja la de su diana . La capacidad de la proteína represora para unirse a su operador es regulada por una molécula pequeña. Un inductor impide la unión de un represor un correpreso-r lo activa. La unión del inductor del corrcpresor a su sitio produce un cambio en ::: estructura del sitio de unión al DNA del represor Esta reacción alostérica ocurre en las proteínas represoras libres y de manera directa en las proteína represoras que ya se encuentran unidas al DNA. La ruta de la lactosa opera por medio de inducción, cuando un galactósido ~inductor impide qu.;: el represor se una a su operador; la transcripción la traducción del gen lacZ después producen galai:"Losidasa ~~ la enzima que cataboliza galactósidos ~ La ruta del tríptófano opera por represión; el Cl represor (triptófano) activa la proLeína represora por lo que se une al operador e impide la expresióde los genes que cocUfican las enzimas que bioslr:· Letizan el triptófano. Un represor puede controla· mú ltiples dianas con copias de una secuencia l'L consenso operadora.

Una proteína con atta afinidad por una secuendiana particular del DNA tiene menor afinidad todo el DNA. La proporción define la especiJad de la proteína. Hay muchos más sirios no ·cíficos (cualquier secuencia de DNA) que sitios na e~pecíficos en un genoma; en consecuencia, J proteína de unión al DNA como un represor Jna polimerasa de RNA es ''almacenada" en el ·A. (Es probable que no exista protefna en for..: libre, o que sea muy poca.) la especificidad por ·ecucncia diana debe ser lo suficientemente alta :-a contrarrestar el exceso de sitios no específicos n respecto a los sitios específicos. El equilibrio de · proteínas bacterianas es ajustado de tal maneque la cantidad de proteína y su especificidad ~ mitan el reconocimiento especíllco de la ciiana " condiciones "encendidas", pero permitan una eración casi completa de la diana en condiciones ·nagadas".

=-eferencias Introducción :!culo de investigació'l ~.:ob, P. and Monod, J. ( 1961 ). Gt:nctic regulatory mcchanisms in thc synthesis of proteins. J. Mol. Bio/. 3. 318-389. La regulación puede ser positiva o negativa ..ente de revisión .il\er, J. ami Reznikoll. W.. cds. (1980). Tbe Operon. 2nd cd., Wooclbm y, NY: Cold Spring Harbor Lahoratory Press.

lfll

Los genes loe son controlados por un represor

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IIJI!

El monómero represor tiene numerosos dominios

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Markiewíc-.G, P.. I
lfll

La proteína represora se une al operador

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lfiD

El represor se une a tres operadores e interactúa con la polimerasa de RNA

Arttc ·lo de invesligación Oehler, S. c 1 al. ( 1990). The thrcc opcrators ol thc la e opcron cooperare ·¡n repression. F.MBO J. 9, 973-979.

E

El operador compite con los sitios de baja afinidad para unirse al represor

~

tic.ulos de investigación Cronin. C. A., Gluba, W., aod Scrablc, H. (2001). The lac opeJaJOr-repressor system is (unctional in the mouse. Genes Drv. 15, J 506-1 517. Referencias

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m

El factor CRP funciona de formas diferentes en operones diana distintos

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330

CAPÍTULO 12 El Operón

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NA regulador ESQUEMA DEL CAPÍ TULO

.J 1imJ

Introducción • El RNA funciona como regulador al formar una región de estructura secundaria (intermolecular o intramolecular) que cambia las propiedades de una secuencia diana.

Las estructuras secundarias alternativas controlan la atenuación • la terminación de la transcripción puede atenuarse si se controla la formación de la estructura de horquilla necesaria en el RNA. • Los mecanismos más directos de la atenuación incluyen proteínas que estabilizan o que desestabilizan a la horquilla.

La terminación de los genes trp de Badllus subtilis es controlada por el triptófano y por el RNAtT•P • Una proteína terminadora denominada TRAP es activada por el triptófano para impedir la transcripción de los genes trp. • La actividad de la TRAP es inhibida (de manera indirecta) por el RNAt 1'' no cargado.

El operón triptófano de Escherichia coli es controlado por medio de atenuación • Un atenuador (terminador intrínseco) se localiza entre el promotor y el primer gen del agrupamiento trp. • la ausencia de triptófano su prime la terminación y ocasiona que la transcripción aumente 10 veces.

La atenuación puede ser controlada por la traducción • la región líder del operón trp tiene un marco de lectura abierto de 14 codones que incluye dos codones de triptófano. • la estructura de RNA localizada en el atenuador depende de la traducción de este marco de lectura. • En presencia de triptófano. el líder es traducido y el atenuador es capaz de formar la horquilla que provoca la terminación. • En ausencia de triptófano, el ribosoma se atasca en los codones de triptófano y la estructura secundaria alternativa impide la formación de la horquilla, por lo que la transcripción continlía.

El RNA antisentido puede ser utilizado para desactivar la expresión génica • los genes antisentido bloquean la expresión de sus dianas cuando son introducidos en las células eucarióticas.

Las moléculas pequeñas de RNA son capaces de regular la traducción • Un RNA regulador funciona al formar una región dúplex con un RNA diana. • la estructura dúplex puede bloquear la iniciación de la traducción, provocar la terminación de la transcripción o crear una diana para una endonucleasa.

Las bacterias contienen RNA reguladores • las moléculas de RNA reguladoras bacterianas se denominan sRNA. • ~luchas de las moléculas de sRNA están unidas a la proteína Hfq. la cual incrementa su efectividad. • El sRNA OxyS activa o reprime la expresión de más de 10 loci en el nivel postraduccionaL

Los microRNA son reguladores en numerosas eucariotas • Los genomas de los animales y de las plantas codifican numerosas moléculas cortas de RNA (de -22 bases) denominadas microRNA. • los microRNA regulan la expresión génica por medio de apareamiento de bases con secuencie~s complementarias en los RNAm diana.

IIIID La interferencia de RNA está relacionada con el silenciamiento de los genes • La interferencia de RNA desencadena la degradaciórt de los RNAm complementarios a cualquier cadena corta de dsRNA. • El dsRNA puede provocar el silencia miento de los genes hospedadores.

Resumen

Continúa en la siguiente página

331

111

Introducción

Concepto principal • El RNA funciona como regulador al formar una región de estructura secundaria (intermolecular o intramolecular) que cambia las propiedades de una secuencia diana.

El principio básico de la regulación en las bacterias consiste en que la expresión génica es controlada por un regulador que interaC[Úa con una secuencia o con una estructura específica del DNA o del RNAm en a lguna etapa anterior a la síntesis proteínica. La etapa de la expresión que es connolada puede ser la transcripción, cuando la diana de regulación es el DNA, o e l control puede ocurrir en la traducción, cuando la diana de la regulación es el RNA. Cuando el con trol sucede durante la transcripción, puede ocurri r en la iniciación o en la terminación. El regulador puede ser una proteína o un RNA. El término ''controlado" puede significar que el regulador apaga (reprime) la diana o que la enciende (que la activa). La expresión de numerosos genes puede ser controlada de manera coordinada por un solo gen regulador bajo el p rincipio de que cada diana contiene una copia de la secuencia o de la estructura a la cual reconoce el regulador. Los reguladores pueden a su vez ser regulados, más a menudo en respuesta a moléculas pequeñas cuyo abastecimiento responde a condiciones ambientales. Los reguladores pueden ser controlados por otros reguladores para formar circuitos complejos. A comLnuación se compara la forma en la que trabajan los diferentes tipos de reguladores.

ANA diana

ANA regulador

w

t V

l Un RNA regulador es un RNA pequeño con una región de cadena individual que puede aparearse con una región de cadena individual en un RNA diana. 332

CAPÍTU LO 13 RNA regulador

Los reguladores proteínicos siguen principio: alostéricos. La proteína tiene dos sitios de unión uno para una diana de ácido nudcico y el otro par. una molécula pequeña. La unión de la molécul2 pequeña a su sítio cambia la conformación de ta manera que altera la afinidad del otro sitio por eácido nucleico. La íorma en la cual sucede esto s.. conoce en detalle en el caso del represor La c. Los reguladores proreínicos a menudo son multimérico~ con una organiz<~ción simétrica que perntite que do subunidades hagan contacto con una diana palindrómica del DNA. Esto puede generar efectos dt unión cooperativos que crean una respuesta ma sensible a la regulación. La regulación por medio de l RNA uLiliza cambios en la estructura secundaria como principi rector. La capacidad de un RNA para cambiar de conformación con con secuencias reguladoras es l: alternativa del ácido nucle\co a los cambios alostéricos de la conformación proteínica. Los cambios de estructura pueden provenir de interacciones intramoleculares o intermoleculares. La fundón más frecuente de los cambios intramolcculares es que una molécula de RNA asuma la estructuras secundarias alternativas al utilizar diferentes esquema<; de apareamiento de bases. Las propiedades de las conformaciones alremativas p uede;ser diferentes. Los cambios en la estructura secundaria de un RNAm pueden modificar su capacida de ser traducido. La estructura secundaria tambié~ sirve para regular la rerminadón de la transcripciór. cuando la diferencia entre las estructuras alterna~ tivas radica en que permitan la terminación o n lo hagan. En las interacciones intennoleculares, un regulador de RNA reconoce su diana por el principi familiar de apa reamiento de bases complementarias. La muestra que el regulador sueh:: ser una molécula pequeña de RNA con estrucnm secundaria eRtensa, pero con una región (o alguna regiones} de cadena individual complementaria ~ una región de cadena única ubicada en su diana. formación de una región de doble hélice entre el regulador y la diana puede tener dos consecuencias • La formación de la estrunura de doble hélice puede ser suficiente por sí misma. Ealgunos casos, la proteína (o las proteínas puede unirse sólo a la forma de cadena ind~­ vidual de la secuencia diana y, por lo taotL la formación dúplex le impide actuar. Er otros casos, la región dúplex se transforma en la diana para la unión; por ejemplo, en e caso de las nucleasas que degradan el Rl\.-. y, por lo tanto, impiden su expresión. • La formación dúplex puede ser importan:c debido a que secuestra una región del RK....

diana que de otra manera participaría en alguna estructura secundaria alternativa.

Las estructuras secunda rias alternativas controlan la atenuación '

~ptos

principales-

terminación de la transcripción puede atenuarse si .~ controla la formación de la estructura de horquilla -~cesaria en el RNA . • )S mecanismos más directos de la atenuación incluyen :·oteínas que estabilizan o que desestabilizan a la ·orquilla. -2

:mucLUra del RNA ofrece una oportunidad para ·!'gtl lación en las procariotas y en las cucariotas . •mción más común se ejerce cuando la molécu-~ RNA puede adquirir estructuras secundarias -nativas mediante diferentes esquemas para el ·earniemo de bases intramolecular. Las propiees de las conformaciones ahernarivas pueden ser :emes. Este tipo de mecanismo puede servo.- para . ..llar la terminación de la transcripdón, cuando .•Herencia entre las estructuras alternativas radi.:-n que permitan la terminación. Otro medio de ~l rol de la conformación (y, por lo tanto, de la jón) lo ofrece la división del RNA; al retirar un ....nento de una molécula de RNA, la conformación :-esro puede alterarse. Asimismo, es posible que 3 molécula de RNA (pequeña) controle la activi... de un RNA diana al aparearse <:en él: la función Rl~A minúsculo es direaameme análoga a la de ?roteína reguladora (véase la sección 13. 7, Las léculas pequeñas de RNA son capaces de regu- la traducción). La capacidad que tiene un RNA _,ra cambiar de conformación con consecuencias ~uJadoras es la alternativa del ácido nucleico a los '71bio~ alosréricos de conformación que regulan la ~dón proteínica. Estos dos mecanismos permiten .a interacción en un sitio de la molécula para afee-~ la estructura de otro sitio. Numerosos operones son reguJados por ate-ua ción. un mecanismo que controla la capad ~j de la polimerasa de RNA de leer a través de . atenuador, el cual es un terminador intrínseco calizado al inicio de una unidad de transcripción.

=·principio de la atenuación consiste m que algún suceso ~uno conf7·ofe la formación de la horquilla necesaria .:.rala tenninación intrínseca. Si se permite la forma)n de Ia horquilla, la terminación impide que la 'Ürnerasa de RNA transcriba los genes estructu::les. Si se impide la formación de la horquilla. la 1limerasa de RNA se alarga a través del terminador

y los genes son expresados. Se utilizan diferentes mecanismos en sistemas distintos para controlar la estruaura del RNA. Las prorefnas que se unen al RNA pueden regular la atenuación para estabilizar o para desestabilizar la formación de la horquilla necesaria para la terminación. La muestra un ejemplo en el cua l una proteína impide la formación de la horquilla terminadora . La actividad de dicha proteína puede ser intrínseca o responder a una molécula pequeña de la misma manera que una proteína represora responde a un correprcsor.

La terminación de los genes trp de Bacillus subtilis es controlada por el triptófano y por el RNAtTrp Conceptos pñncipales • Una proteina terminadora denominada TRAP es activada por el triptófano para impedir la transcripción de tos genes trp. • la actividad de la TRAP es inhibida (de manera indirecta) por el RNAtr.v no cargado .

El sistema de circuitos que contro la la transcripción por medio de la terminación puede utilizar medios directos e indirectos para responder a l nivel de sustratO!. o productos de moléculas pequeñas.

Horquilla de terminación

la proteína se une para bloquear la horquilla la atenuación tiene lugar cuando se impide la formación de una horquilla terminadora en el RNA.

13.3 la terminación de los genes trp de Bacillus subtilis es controlada por el triptófano y por el RNAtrrp

333

Triptófano presente 1

...,...- ....

-.,.,...~...,....,

Triplófano presente

Gen antiTRAP Triptófano ausente RNAtTrp no cargado

- - Horquilla ausente

l

""----- Estructura alternativa

La TRAP es activada por el triptófano y se une al RNAm trp. Esto permite que se forme la horquilla de termina· ción, lo cual da como resultado la terminación de la polimerasa de RNA y la falta de expresión de los genes. En ausencia de triptófano, la TRAP no se une y el RNAm adopta una estructura que impide que se forme la horquilla de terminación.

En B. subcilis, una proteína denominada proteína atenuadora de unión al RNA en presencia de triptófano (TRAP, tryptophan RNA -binding attenuation proteín) {antes denominada M trB ) es activada por el triptófano (Trp) para unirse a una secuencia en el líder del transcrito naciente. La TRAP forma un muhímero de 11 unidades. Cada subunidad se une a un solo triprófano y a un rrinucleótido {GAG o UAG) de RNA. El RNA se enrolla en un círculo alrededor de la proteína. La muestra que el resu ltado es garantizar la disponibilidad de las regiones necesarias para formar la horquilla terminadora. Después, la terminación de la t ran scripción impide la producción de las enzimas biosintéticas de triptófano . En efecto, la TRAP es una proteína terminadora que responde al nivel de triptófano. En ausencia de TRAP, una estructura secundaria alternativa impide la formación de la horquilla terminadora. Sin embargo, la TRAP, a su vez, también es controlada por el RNAt'tr¡>. La muestra que el RNAtTrp no cargado se une al RNAm de una proreína denominada antiTRAP (AT). Ésta suprime la formación de una horquilla de renninadón en el RKAm. El RNAtTrp no cargado también incrementa la traducción del RNAm. El resultado combinado de estas dos acciones incremema la síntesis de antiTRAP, la cual se une a la TRAP y le impide reprimir al operón de triptófano. Por medio de esta serie de sucesos complejos. la ausencia de triptófano genera RNAt 334

CAPÍTULO 13 RNA regulador

antiTRAP

l

En condiciones normales {en presencia de¡-· tófano) la transcripción termina antes que el gen antiTP• Cuando no hay triptófano, el RNAtT•p se aparea con el R -antiTRAP, lo que impide la formació n de la horquilla term·· dora y provoca la expresión de antiTRAP.

no cargado, el cual provoca la síntesis de antiTR-.Éste a su vez impide la función de la TRAP, la C<provoca la expresión de los genes del triptófan0 Por lo tanto, la expresión de los genes tr¡: ~ B. subtilis es controlada por el triptófano y po; RNAtT.,, Cuando hay Lriprófano, no necesita ser~ tetizado. Esto se logra cuando el triptófano an la TRAP e inhibe así la expresión de las en zi!:4 que sintetizan elLriptófano. La presencia de RNA no cargado indica que hay escasez de triptófano RNAt no cargado activa la anriTRAP y, por lo tar. activa la transcripción de los genes trp.

El operón triptófano de Escherichia coli es controlado por medio de atenuación

Sólo se transcrlbeelllder .,.__ Uder ...._...... . . . -Región codificadora---. Terminador 1 Terminador 2 Promotor~ TRADUCCIÓN + TERMINACIÓN

, ~11ceptos principales Un atenuador (terminador intñnseco) se localiza entre

el promotor y el primer gen del agrupamiento trp. la ausencia de triptófano suprime la terminación y ocasiona que la transcripción aumente 10 veces. Horquilla de terminación

E. coli se uriliza un sistema regulador complejo !l el cual se descubrió por primera vez la aren u a n). Los cambios de la estructura secundaria que !ltrolan la atenuación son determinados por la 5ición del ribosoma en el RNAm. La _restra que la terminación requiere que el riboso.: pueda traducir un segmento líder que precede a los :l!s trp en el RNAm. Cuando el ribosoma traduce :egión líder se rorma una horquilla de termina m en el terminador l. Sin embargo, cuando se le .pide al ribosoma traducir el líder. la horquilla de =rminación no se forma y la polimerasa de RNA ·3nscribe la región codificadora. En consecuencia. este :ranismo de antiterminación depende de la posibilidad : que las circunstancias externas influyan en el movi;mto del ribosoma en la región líder. El operón trp está formado por cinco genes es~ c tura l es ordenados en una serie contigua, los .ttales codifican las tres enzimas que transforman el :ido corísmico en triptófano. La mues·a que la transcripción inicia en un promotor que oe encuentra en el extremo izquierdo del agrupaniemo. La expresión del operón trp es controlada "lr dos mecanismos independientes. La represión e la expresión la ejerce una proteína represora .:odificada por el gen trpR no ligado) que se une a ...n operador adyacente al promotor. La atenuación .:'O nu·ola el progreso de la polimerasa de RNA en el perón al regular la posibHidad de que la terminaj ón ocurra en un sitio que precede al primer gen t stru ctu ra l. La atenuación se descubrió por primera vez :uando se observó que la deleción de una secuen:ia localizada entre el operador y la región codi:!cadora trpE puede aumentar la expresión de los .senes estructurales. Este efecto es independiente i e la represión: los niveles de transcripción basal \" deprimida se incrementan. Por lo tanto, este sitio i.llfluye en los sucesos que tienen Jugar después de que la polirnerasa de RNA ha salido del promotor •a pesar de las condiciones que prevalecen en la .niciación). Entre el promotor y el gen trpE se localiza un

3tenuador (terminador .intrínseco). Éste proporciona

TRADUCCIÓN Y TERMINACIÓN AUSENTES Se ~ranscribe la reglón

Terminador 1

Promotor..,...

codttrcadora Terminador 2

__..

~ EJ'bn asoma estactonano cam b'ta 1

.

.

la estructura secundaria del RNAm

La terminación puede controlarse con los cambios en la estructura secundaria del RNA determinados por el movimiento ribosómíco.

Proteína Gen

Sintetasa de antranilato

trpE

Slntetasa de Sintetasa de triptófano indol-glicerol Cadena B Cadena A

t•pD

trpC

trpB

Líder

Atenuador

rrpA t t'

Reglón de control

~ '-•·o'"''"

pppN AUGAMGCMUUUOOGUACU:GAMCiGUIXlGV.t;GCGc;ACUUCCVGAN43~~1.8iJ.!lll.!UU 26 Péptido lfder

0

t·J 'O

MetLysAiallePheValleuLysGiyTrpTrpArgThrSer

)

Horquilla rica en G·C/cadena individual nca en U

El operón trp está formado por cinco genes estructurales contiguos precedidos por una región de control que incluye el promotor, el operador, la región codiñcadora del péptido Líder y el atenuador.

una barrera a la transcripción en los genes estntctura les. La polimerasa de RNA termina ahí. in vivo o in vitro, para producir un transcrito de b ase 140. La terminadón en el atenuador responde al n > ve! de triptófano. como se ilustra en la La terminación es eficienre en presencia de cantidades suficientes de triptófano. Sin embargo, en

13.4 El operón triptófano de Escherichia coli es controlado por medio de atenuación

335

TRANSCRIPCIÓN DE LA REGIÓN LIDER Promotor

~~

Pausa

Atenuador

trpE

la atenuación permite que casi todas las polimerasas continúen. J unto con el incremento de 70 veces en la iniciació n de la transcripción que se deriva de la liberación de la represión, esto permite un intervalo de regulación del operón de unas 700 veces.

La atenuación puede ser

controlada por la traducción Conceptos principales TRIPTÓFANO AUSENTE: LA TRANSCRIPCIÓN CONTINÚA EN El OPERÓN

~

La polimerasa experimenta elongación

l/\il

TRIPTÓFANOPRESENTE: LA TRANSCRIPCIÓN TERMINA EN ElATENUADOR

la polimerasa termina

Un atenuador controla la progresión de la polimerasa de RNA en Los genes trp. la polimerasa de RNA inicia en el promotor y después prosigue a la posición 90, en donde hace una pausa antes de seguir adelante hasta el atenuador que se encuentra en la posición 140. En ausencia de triptófano, La polimerasa de RNA continúa en Los genes estructurales (trpE comienza en +163). En presencia de triptófano hay una probabilidad de ~90% de que la terminación libere el RNA líder de la base 140.

ausencia de triptófano, la polimerasa de RNA puede continuar en los genes estructurales. La represión y la atenuación responden de la misma manera al nivel de uiprófano. Cuando éste está presente, el operón es reprimido y la mayor parte de las polimerasas de RNA que escapan del promotor termina después en el arenuador. Cuando el triptófano es retirado, la polimerasa de RNA tiene acceso libre al promotOr y también deja de ser obligada a terminar en forma anticipada. La atenuación tiene un efecto de aproximadamente lO veces sobre la transcripción. Cuando el triptófano está presente, la terminación es efectiva y el atenuador permite que sólo -10 % de las polimerasas de RNA prosigan. En ausencia de triptófano, 336

CAPÍTULO 13 RNA regulador

• la región Líder del operón trp tiene un marco de lectura abierto de 14 codones que incluye dos codones de triptófano. .. la estructura de RNA localizada en el atenuador depende de la traducción de este marco de lectura. En presencia de triptófano, el líder es t raducido y el atenuador es capaz de formar la horquilla que provoca la terminación. En ausencia de triptófano, el ribosoma se atasca en los codones de triptófano y la estructura secundaria alternativa impide la formación de La horquilla, por lo que la transcripción continúa.

¿De qué forma puede responder la terminación de la transcripción en el atenuador al nivel de trip tó(ano? La secuencia de la región líder sugiere un mecanismo. Tiene una secuencia codificadora cona que podría representar a un pép tid o líd er de 14 aminoácidos. La Figura 13.6 muestra que contiene un sitio de unión ribosómica cuyo codón AUG es seguido por una región codificadora cona que contiene dos codones sucesivos de triptófano. Cuando a la célula se le termina el triptófano, los ribosomas inician la traducdón del péptido líder. pero se detienen cuando alcanzan los codones de tríptófano. La secuencia del RNAm sugiere que esta det en ción de los ribosomas influye en la terminación en el atenuador. La secuencia líder puede escribirse en estructuras apareadas de n1anera alternativa. La capaddad del ribosoma de proseguir por la región líder controla las transiciones entre estas estructuras. La estructura determina si el RNAm puede proporcionar las características necesarias para la terminación. La ilustra estas estructuras . En la primera, la región uno se aparea con la región dos, y la región tres se aparea con la región cuatro. El apareamiento de las regiones tres y cuatro genera la horquilla que precede a la secuencia U3 : ésta es la señal esencial de la terminación intrínseca. Es probable que el RNA adquiera esta estructura en ausencia de cualquier intervención externa. Si se le impide a la región uno aparearse con la región dos. se forma una estructura diferente. En

un oe oU eA

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Las regiones tres y cuatro ESTRUCTURAS AlTERNATIVAS Las reg1ones dos y tres se se aparean para formar la la reglón dos es complementaria de las regiones uno y tres aparean; la región terminadora La reglón tres es complementaria de fas regiones dos y cuatro es de cadena individual horquílla terminadora

La región líder trp puede existir en otras conformaciones apareadas. El centro muestra las cuatro regiones que :: ~eden aparearse. La región uno es complementaria de la región dos, la cual es complementaria de la región tres, que a su ez es complementaria de la región cuatro. En el lado izquierdo se encuentra la conformación que se produce cuando la re;ión uno se aparea con la región dos y La región tres se aparea con la región cuatro. En el lado derecho está la conformación ~:quirida cuando la región dos se aparea con la región tres y deja las regiones uno y cuatro sin aparear.

·e caso, la región dos es libre de aparearse con la ;ión tres. Entonces, la región cuatro no tiene un m pañero de apareamiento disponible, por lo que bLigada a permanecer como cadena individual. ·- ::-onsccuenda, la horquilla terminadora no podrá -:narse. La muestra que la posición del ri;oma puede determinar qué estructura se forma, :al manera que la terminación es atenuada sólo ausencia de triptófano. La característica cruda} .a posición de los codones de Trp en la secuencia Jificadora del péptido líder. Cuando hay triptófano, los ribosomas son capade sintetizar el péptido líder. Aquéllos continúan :la sección líder del RNAm al codón UGA, el cual encuentra entre las regiones uno y dos. Como se .,.¡estra en la parte inferior de la figura, al progre- a este punto, los ribosomas se extienden a la ;:ón dos e impiden que se realice el apareamiento :bases. El resultado es que la región tres queda "'oible para aparearse con la región cuatro, lo - ~genera la horquilla terminadora. Por lo tanto, ::Stas condidoncs, la polimerasa de RNA termina en l:enuador. Cuando no hay triptófano, los ribosomas se de"len en los codones de Trp, los cuales son parte ~ a región uno, como se muestra en la parte su_.or de la figura. Por lo tanto. la región uno es .Jestrada dentro del ribosoma y no puede formar ·es de bases con la región dos. Esto significa que :egiones dos y tres se aparean ames de que se :!1scriba la región cuatro. Esto obliga a la región

TAIPTÓFANO AUSENTE

o A U U A

G O

u e

Trp Trp

a e A A e G G e

'U1UUUUU

e

UGG\UGGCGAACUUCCUGAAAC G ~

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~

CUAAUGAG

El ribosoma se detiene en los oodones Trp

'

TRIPTÓFANO PRESENTE

El rlbosoma avanza -+-o~

Trp Trp

U A

UGGUGGCGAAeUUCCUGAAAeGGGeAauH

1

El movimiento del ribosoma Interrumpe el apareamiento 2:3

é

~ uuuuuu

g8

gg GC e.&A El apareamiento 3:4 forma _ _ J u

la horquilla de terminación

AA

Las alternativas de la polimerasa de RNA en el atenuador dependen de La localización del ribosoma, el cual determina si las regiones tres y cuatro se pueden aparear para formar la horquilla terminadora. 1.}.5 La atenuación puede ser controlada por la traducción

L

337

bacterianos? Se usa en al menos seis operones que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos. Por lo tanto, la retroalimentación desde eJ nivel de aminoácido disponible para la síntesis proteínica (como lo representa la disponibilidad de: RNAr aminoacilado) hasta la producción de las enzimas puede ser común. El uso del ribosoma para controlar la esLn..tctu.ra secundaria del RNA en respuesta a la disponibilidad de RN'At aminoacilado establece una relaciór inversa entre la presencia de RNAt aminoacUado ~ la transcripción del operón, la cual es equivalente a la situación en la cual el RNAt aminoaciladc funciona como correpresor de la transcripción. mecanismo regulador es me
E:

En presencia de RNAt triptófano, los ribosomas traducen el péptido líder y son liberados. Esto permite la formación de la horquilla, por lo que la polimerasa termina. En ausencia de RNAt triptófano, el ribosoma es bloqueado, la horquilla de terminación no puede formarse y la polimerasa de RNA continúa.

cuatro a permanecer en forma de cadena individual. En ausencia de la horquilla terminadora, la poli merasa de RNA continúa la transcripción más allá del atenuador. El control por medio de atenuación requiere una organización cronológica precisa de los sucesos. Para que el movimienro ríbosómico determine la formación de estructuras sectmdarias allernativas que controlen la terminación, la traducción de/líder

debe ocurrir al mismo tiempo que la pofimerasa de RNA se aproxima al sitio terminador. Un episodio determi ~ nante para el control cronológico es la presencia de un síLío que ocasione que la po1imerasa de RNA haga una pausa a 90 bases a lo largo del péptido líder. La polimerasa de RNA permanece en pausa hasta que un r ibosoma traduce el péptido líder. Después, la polimerasa es liberada y se mueve hacia el sitio de atenuación. Cuando llega ahí, la estructura secundaria de La región de atenuación ha sido determinada. La reswne la función del RNAt-Trp en el control de la expresión del operón . Al proporcionar un mecanismo para detectar la in,n~ficiencia del abastecimimto de RNAt- Trp, la atenuación responde de

manera directa a la necesidad de triptófano de la célula en la síntesis proteínica. ¿Qué tan generalizado está el uso de la atenuación como mecanismo de control de los operones 338

CAPÍTULO 13 RNA regulador

liD

El RNA antisentido puede ser utilizado para desactivar la expresión génica

Concepto principal • Los genes antisentido bloquean la expresión de sus dianas cuando son introducidos en las células eucarióticas.

El apareamiento de bases es un. medio eficaz para que un RNA controle la actividad de otro. Hay numerosos casos en las procaTiotas y en las eucariotas en donde un RNA de cadena individual (por lo general bastante corto} se aparea con una regiór: complementaria de un RNAm y como resultado impide la expresión del RNAm. Uoo de los primero5 ejemplos de este efecto lo proporcionó la situación artificial en la cual los ge n es antisentido fueron introducidos en células eucarióticas. Los genes antisentido se construyen al reverti::la o rientación de un gen con respecto a su promotor, de tal manera que la cadena "antisenrido" es. transcrita, como se ilustra en la 1 • La síntesis de RNA antisentído puede desactivar un RNA

-.:en las célu las eucarióticas o en las células prouede ser necesario un exceso (quizás consi.:)le) de RNA amiscmido. ;_A qué nivel inhibe la expresión el RNA anti :!do? En principio podría impedir la transcrip- del gen auténtico, el procesamiento de su pro~o de RNA o la traducción del mensajero. Los tados de diferentes sistemas muestran que la bición depende de la formación de moléculas RNA-RNA dúplex. pero esto puede ocurrir en úcleo o en el citoplasma. En el caso de un gen sentido establemente acarreado por u n a célula :ivada, Los d úplex de RNA con sentido-RNA an ntido se forman en el núcleo. lo que impide el <esamiento no rmal o el transpone del RNA con :ido. En otro caso. la inyección de RNA en el in-or del citoplasma inhibe la traducción al formar .-\dúplex en la región 5' del RNAm. Esta técnica ofrece una metodología eficaz para :.gar los genes a voluntad; por ejemplo. la función :.m gen regulador puede inveStigarse si se intro_.:e una versión antisentido. Una extensión de esta :Uca es colocar el gen antisemido bajo el control . un promotor que está sujeto a regulación. El gen ::1a puede después ser encendido y apagado al re.ar la producción de RNA antiscntido. Esta técni;¡ermite investigar la importancia de la cronología la expre~ión del gen diana.

Las moléculas pequeñas de RNA son ca paces de regular la traducción Ülnceplos principales

Un RN A regulador funciona al formar una región dúplex con un RNA diana. La estructura dúplex puede bloquear la iniciación de la traducción, provocar la terminación de la transcripción o crear una diana para una endonucleasa.

> represores y los activadores son proteínas de ::uadón en trans, no obstante el sistema de circui- formal de una red reguladora podría construirse l ty bien al utilizar un RNA como regulador. De .echo. el modelo original del operón dejó abier~ la pregunta de si el regulador puede ser RNA o ·oteína. En efecto. resulta que la construcción de .:>léculas sintéticas de RNA antisentido imita a una

Promotor

s·

Promotor

Gen ant1senlido

"\/\/\/'V

5' "\

3'

Transcrito antisentido 3'

\\6\.. ""6 ~ "6 \VJ\.'\S'I')§~ 3' RNA-RNA dúplex

El RNA antisentido puede generarse sí se revierte La orientación de un gen con respecto a su promotor y puede asociarse con el transcrito de tipo silvestre para formar RNA dú plex.

clase de reguladores de RNA cuya importancia ha ido en aumento . Igual que una proteína reguladora. un RNA regulador pequeí1o es una molécula sintetizada de manera independiente que se difunde a un sitio diana formado por una secuencia de nucleótidos específica La diana de un RNA regulador es una secuencia de ácido nucleico de cadena individual. El RNA regulador funciona por complememariedad con su diana, en la cual puede formar una región de doble cadena. Es posible imaginar dos mecanismos generales para la acción de un RNA regulador: • La formadón de una región dúplex con el ácido nucleico diana inhibe en forma directa su capacidad para funcionar al formar o secuestrar Lln sitio específico. La ih.tsrra u na situación en la cual a una proteín a que se 1.me a un RNA de cadena individual se le impide actuar a tnvés de la formación de un dúplex. La muestra la relación opuesta, en la cual la formación de u na región de doble cadena crea un ~itio diana para una endonucleasa que destruye la djana de RNA. • La formación de una región dúplex en una parte de la molécula d iana cambia la conformación de otra región. lo que afecta de manera indirecta su función. La ilusua un ejemplo. El mecanismo es en esencia similar al uso de la eslructura secundaria en la atenuación (véase la sección 13.2, Las estructuras secundarias alternativas controlan la atenuación), excepto que las regiones que interactúan se encuentran

13.7 Las moléc u l<~s pequeñas de RNA son capaces de regular la traducción

3 39

gl5LJL_

La protefna se une a una región de cadena individual en la diana _

,

"'

Una proteína que se une a una región de cadena individual en un RN.A diana podria ser excluida por un RNA regulador que forma un dúplex e11 esta región.

Al unirse a un RNA diana para formar una región dúplex, un RNA regulador puede crear un sitio que es atacado por una nucleasa.

La estructura secundaria se forma en ausencia del regulador

El apareamiento de bases con un RNA regulador puede impedir la formación de la estructura secundaria surgida por el apareamiento de bases entre dos regiones del RNA diana. En este ejemplo, ta capacidad del extremo 3' del RNA de aparearse con el extremo 5' es inhibida por el regulador.

340

CAPÍTULO 13 RNA regulador

en moléculas di fere ntes de RNA en vez _ ser parte de la misma molécuJa de RNA.

La característica com~ín de ambos tipos de regular:: mediada por el RNA. es que los cambios en la estruct!1 secundaria de la diana controlan su actividad. Un regulador de RNA pequeño casi siemp. puede ser encendido al conrrolar la transcripción .:. su gen o ser apagado por una enzima que degra el producto de regulador de Rt'l"A. Por lo generaL imposible regular de o tra manera la actividad de " RNA regulador. De hecho, ames se pensaba que-: era posible que un RNA ruviera propiedades ale_ téricas; a diferencia de las proteínas represoras qo_ controlan los operones, un RNA por lo generaJ ~ puede responder a moléculas pequeñas con cambi;. su capacidad para reconocer su diana. El descubrimiento del ribointe rruptor comtuye u na excepción a esta regla. La .1 nsume la regulación del sistema que produce el me•= bolito GlcN6P. El genglmS codifica una enzima q•-sintetiza GlcN6P (glucosamina-6-fosfato) a partir fructosa-6-fosfato y glutamina. El RNAm contie:-una larga región 5' no traducida (untranslated regi,· UTR) antes del marco codificador. Dentro de la 1..7 hay una ribozima (una secuencia de RNA que tie~ actividad catalítica) (véase la sección 27 .4, Las rib zimas tienen varias actividades catalíticas}. En e~ caso, la actividad catalítica la proporciona una edonucleasa que divide su propio RNA. Es activa.: por la unión del mctabolito, GlcN6P, a la ribozirr :: La consecuencia es que la acumulación de GlcKC activa la ribozima, la cua l divide el RNAm, el cua· su vez evita la traducción. Éste es un análogo exacdel control alostérico de una proteína represora r el producto termina l de una r uta metabólica. Ha numerosos ejemplos de dichos ribointerruptores e-. las bacterias. Otro mecanismo regulador que compren.:. la transcripción de RNA no codificador traba _ de manera indirecta. La iniciación en un promot· diana puede ser suprimida por la transcripción otro promotor localizado en sentido ascendente él, como se muestra en la . La cau. de la inhibición es que la polimerasa de RNA q_ inicia en el pro moto!' que se encuentra en semi ascendente hace la ultra lectu ra del promotor que encuemra en semido descendente, lo cual imp' que los (acLares de transcripción y la polimera de RNA se unan a él. Este tipo de efecto se h a ~. mostrado en sistemas eucarióticos y puede depeder de la lnterrupdón de la estructura cromosóiJL en el promotor diana. El RNA que se transcribe · promotor (regulador) qu e se encuentra en sen do ascendente no tiene función codificadora. E~ puede explicar la presencia de algunos de los R, ·no codificadores en los núcleos eucarióticos; no s

'A reguladores, sino que son productos indirecws - JO sistema

regulador.

Las bacterias contienen RNA reguladores

Aibozima

ANAmg/mS

Región codificadora

3'

5'

l traducción

Cunceptos principales Las moléculas de RNA reguladoras bacterianas se denominan sRNA. Muchas de Las moléculas de sRNA están unidas a la proteína Hfq, la cual incrementa su efectividad. El sRNA OxyS activa o reprime la expresión de más de 10 loci en el nivel postraduccional.

EnzimaglmS

~ actividad enzimática Fru6P

-Q -. ~

~~---r"'

=.; las bacterias, los RNA

reguladores son molécu · q ue se conocen en conjunto como sRNA ';ort RNA, RNA cono); E. coli contiene al menos 17 -:.~A diferentes. Algun os de los sRNA son regu la res generales que afectan numerosos genes diana. =;ws funcionan por apareamien to de bases con los -=>_"\1A diana (por lo general moléculas de RNAm) -.:.:a controlar su estabilidad o su función. Un ejemplo de control de estabilidad lo ofrece el .equeño regu lador antisemido RyhB, el cual regula ~is moléculas de RNAm que codifican proteínas -'=lp1i cadas en el almacenaj e del hierro en E. coli. ::~ reg u l ad or Ryh B se a parea con cada uno de los -= ~Am diana para fo rmar regiones de doble cadena ._ ue son sustraws para la RNAasa E. Una caracterís· ca interesame del drcuito es que la ribonucleasa _fstruye el RNA regulador y el RNAm. El estrés oxidauvo proporciona un ejemplo de ~:1 sistema de control general en el cual el RNA es =-regu lador. Cuando son expuestas a especies reac_;Cis del oxígeno, las bacterias responden inducien·o genes a mioxidantes de defensa. El peróxido de -!drógen o e nciende el acrivador de la transcripción Y
GlcNSP

~cortas

División

r: _

El RNAm

es desactivado

La región 5' no traducida del RNAm de la enzima que sintetiza GlcN6P contiene una ribozima que es activada por el producto metabólico. la ribozima desactiva el RNAm al dividirlo.

Promotor regulador

Ausencia de terminadores

La iniciación en el promotor regulador hace la ultralectura del promotor diana

"-ANA no codificador La ausencia de Iniciación permite que los factores de transcripción se unan al promotor diana

=n

ANA codificador

La transcripción a partir de un promotor en sentido ascendente puede inhibir la iniciación en un promotor que se encuentra en sentido descendente a él, debido a que la lectura a través del promotor que se encuentra en sentido descendente impide que los factores de transcripción necesarios se unan a él. El RNA transcrito del promotor localizado en sentido ascendente no tiene función codificadora. 13.8 Las bacterias contienen RNA reguladores

341

Adición de H 20 2

Tipo Mutante silvestre oxyR

\ RNAm oxyR

ANA oxyS (109 nts)

•

Los geles del lado izquierdo muestran que el RNA oxyS es inducido en un mutante constitutivo oxyR. Los geles del lado derecho muestran que el RNA oxyS es inducido en un minuto a partir de la adición de peróxido de hidrógeno a un cultivo de tipo silvestre. Rep roducida de Ce//, vol. 90, Altuvia, S., et al., A small stable RNA ... , pp. 44- 53. Copyright 1997, con autorización de Elsevier. Fotograña cortesía de Gisela Storz, National Institutes of Health.

dónde iniciación del RNAm Fll1A. El apareamiento de bases entre RNA OxyS y RNA FlhA impide que el ribosoma se w1a al codón de iniciación y, por lo tamo. reprime la traducción. Asimismo, hay una segunda interacción de apareamiento que comprende una secuencia localizada dentro de la reglón codificadora de FlhA. Otra diana de o>.yS es rpoS, el gen que codifica un factor alternativo (el cual activa una respuesta de estrés general). Al inhibir la producción del factor cr. oxyS garantiza que la respuesta específica al estrés oxidalivo no desencadene la respuesta apropiada para otras condiciones de estrés . El gen rpoS también es regulado por otros sRNA (el DsrA y el RprA} los cuales lo aclivan. Esros tres sRNA parecen ser los reguladores globales que coordinan las respuestas a vatias condiciones ambientales. las acciones de los tres sRNA son asistidas po; una proteína de unión al RNA denominada Hfq. Esta proteína fue identificada en un principio como un factor hospedador bacteriano indispensable para la replicación del bacteriófago de RNA QP. Está rela cionado con las proteínas Sm de las eucarioras que se unen a muchos de los snRNA (small nuclear RNA RNA nucleares pequeños) que tienen funcione~ reguladoras en la expresión génica (véase la sección 26.5, Los snRNA son necesarios para el corre y empalme). Las mutaciones de este gen tienen numerosos efectos, los cuales la identifican como una protefna pleiouópica. Hfq se une a muchas de la~ molécu las de sRNA de E. coli e incremema la efectividad del RNA OxyS al potenciar su capacidad de unirse a sus RNAm diana. Es probable que el efect(1 de la proteína Hfq esté mediado por la provocación d<:. un pequeño cambio en la estructura secundaria del RNA OxyS que mejora la exposición de las secuendas de cadena individual que se aparean con los RNA.m diana.

RNAmf/hA s· UUUGCGGUGCUUUCCUGGAAGMCAAA"'L: .,H,.......... 3' AGGACCU

3'

Los microRNA son reguladores en numerosas eucariotas 5'

Concepcos plincípales El RNA oxyS inhibe la traducción del RNAm flhA por el

apareamiento de bases con una secuencia localizada justo en sentido ascendente del codón de iníciación AUG.

síón génica a n.iveles postraduccionales. Tiene más de 1O loci diana; en algunos de ellos activa la expresión; en otros la repríme. · muestra el mecanismo de represión de una diana, el RNAm FlhA. Tres estructuras tallo-lazo sobresalen en la estructura secundaria del RNAm OxyS y el lazo que se encue11tra cerca del extremo 3' es complementa· rio a una secuenda que precede justamente al co342

CAPÍTULO 13 RNA regulador

• Los genomas de los animales y de las plantas codifican numerosas moléculas cortas de RNA (de -22 bases) denominadas microRNA. • Los microRNA regulan la expresión génica por medio de apareamiento de bases con secuencias complementarias en los RNAm diana.

Los RNA muy pequeños son reguladores de gene• en numerosas eucariotas . El primer ejemplo se descubrió en el nemaLOdo Caenorhabditis elegans coro' resultado de la interacción entre el gen regulado-

-= y su gen diana. linl4. La

ilustra el 1ponamiemo de este sistema regulador. El gen -na línl4 regula el desarrollo larvario. La expre\1 de linl4 es controlada por el gen lin4, el cual 'fica un transcrito pequeño de 22 nucleóúdos. ., iranscritos del gen lin4 son complementarios a ..3 secuencia de 10 bases que se repite siete veces 1a región no traducida 3' de lin14. La expresión . . !n4 reprime la expresión de fin 14 después de la .,scripción, sobre tOdo debido a que la reacción 3pareamiento de base~ entre los dos R.l'iA pro ..a la degradación del RNAm. Este sistema es en ~icular interesante por la im plicación del extre3' como un sitio de regu lación. El RNA lin4 es un ejemplo de un microRNA :RNA). Hay -80 genes en el genoma de C. elegans :codi fican moléculas de miRNA con una longide 21 a 24 nucleótidos. Tienen patrones varia- de expresión durante el desarrollo y tienden a :eguladores de la expresión génica. Muchos de miRNA de C. elegans está n contenidos en una ·.cula ribonucleoproteínica extensa (de 15S). Muchos de Jos miRNA de C. elegans tienen hoJgos en los mamíferos, por lo que el mecanismo . Je ser p ropagado. También se encuentran en .,lamas. De las 16 moléc\.llas de miRNA que se -tentran en Arabidopsis. ocbo están por comple·onservadas en el arroz, lo cual sugiere que se ""~ropa gado la conservación de este mecanismo _,.Jador. El vints SV40 codifica moléculas de miRNA que - complementarias a los RNAm producidos du:e el periodo temprano de la infección vírica. Los .::t..'M son transcritos después en el ciclo vírico, =-:.zan apareamiento de bases con los RNAm tem;os y provocan su degradación en este punto del vital, cuando dejan de ser necesarios. El mecanismo de la prod ucción de los miRNA Ílién se ha conservado de maoera generaUzaEn el ejemplo de lin4, el gen es copiado en un "15critO que forma una región de doble cadena _-se conviene en diana para una nucleasa deno .=ada Dicer. Ésta tiene actividad helicasa termjnal .:=: cual le permite desenrollar la región de doble _';,"na, y dos dominios de nucleasa que están rela"Jados con la ribonucleasa lli bacteriana. En las ·cas, en los gusanos y en las plantas se encuen- enzimas relacionadas. La divjsión del transcrito _al genera el miRNA aetivo. La interferencia de - ::ividad enzimárica bloquea la producción de los .:'...\'A y provoca defectos del desarrollo. !:n las plantas se ha descritO otro paso en la :nación de los miRNA; en ellas. la ribosa del :..eótido terminal 3' es me tilada por la enzima :;Ltrans"ferasa HEN I . La metilación estabiliza el .?...'lA.

~lin14

~

/VVVVV\.

~

Al__

IVVV\

~ lin4 codifica un ANA que desactiva /ln14

ii&J~

\.:6\:lA(I

l

~

lill'T

/VVVVV\.

'

/V\/V\1\fo. Proterna ausente

El RNA lin4 regula la expresión de linl4 cuando se une a la región no traducida 3'.

E

La interferencia de RNA está relacionada con el silenciamiento de los genes

Conceptos principales • La interferencia de RNA desencadena la degradación de los RNAm complementarios a cualquier cadena corta de dsRNA. • El dsRNA puede provocar el silenciamiento de los genes hospedadores.

La regulación de los RNAm por los miRNA es emulada por el fenómeno de interferencia del RNA (RNA inter[erence, RNAi). Este fenómeno se descubrió cuando se observó que los RNA con sentido y los RNA antisenrido pueden inhibir la expresión génica con la misma eficacia. La razón es que las preparaciones de cualquier tipo de RNA de cadena individual (al parecer) están de hecho contaminadas por pequeñas cantidades de RNA de doble cadena (doub/e stranded RNA, dsRNA) . Las investigaciones con un sistema in vitro muestran que el dsRNA es degradado por medio de la división dependjcnte de ATP para formar oligonucleórídos de 21 a 23 bases. El RNA corto en ocasiones se denomina RNA corto interferente (short

13.10 La interferencia de RNA está relacionada con el silenciamiento de los genes

343

El siRNA que media la interferencia del RNA se genera cuando se divide el dsRNA en fragmentos más pequeños. La reacción de división tiene lugar a una distancia de 21 a 23 nucleótidos a partir del extremo 3'. El producto de siRNA tiene bases sobresalientes en sus extremos 3'.

La nucleasa divide el dsRNA en siRNA dsRNA

./ A.A'"A"'A.A7\.'n..

~

siRNA ~~

El siR NA se aparea con el RNAm RNAm "

f'

..,V \ , ,._

Helicasa ~

f\~AJV\/\. La nucleasa divide el RNAm

La RNAi se genera cuando un dsR NA es dividido en frag mentos que dirigen la división del RNAm correspondiente.

interfering RNA, siRNA). La muestra que el mecanismo de división comprende la realización de eones en relación a cada extremo 3' de un dsRNA largo para generar fragmentos de siRNA con extremos cortos sobresalientes 3' (de dos bases). La misma enzima (el Dicer) que genera los miRNA se encarga de la división. La RNAi ocurre después de la transcripción cuando un siRNA induce la degradación de un RNAm complementario. La sugiere que el siRNA puede proporcionar un molde que lleva a una nucleasa a degradar moléculas de RNAm que son complementarias a una o a ambas cadenas, quizá por medio de un proceso en el cua l el RNAm se aparea con los fragmentos. Es probable que se 344

CAPÍTULO 13 RNA regulador

necesite una helicasa que ayude en la reacción dt apareamiento. El siRNA dirige la división del RNAr. en la milad del segmento aparcado. Estas reaccionetienen lugar dentro de un complejo ribonudeopro teínico denominado RISC (RNA-induced silencin: compiex, complejo de silenciamiento inducido pO' RNA) . La!. proteínas de la familia Argonauta so. componentes de este complejo y son indispensable_ para la reacción de la división. La metilación de ·: ribosa 3' puede ser necesaria para que el miRNA se¿ incorporado al complejo. Todavía hay incertidumbre con respecto a si t: complejo rus e silencia la expresión génica (véase :.: sección 31.1, La heterocromatina depende de in ter· acciones con las histonas). La actividad de la poi'· merasa de RNA es necesaria para la interferencia de RNA, pero no queda claro si es directa (debido a qu. forma transcritas que son necesarios) o indirem (porque participa en la unión del RNA im erferem [RNAi] a los transcritos o debido a que separa la cadenas de DNA durante la transcripción, lo qu. perm ite una interacción con el RNAi) . La RNAi se ha convenido en una técnica efica: para eliminar la expresión de un gen diana especffico en las células de los invertebrados, sobre todo eC. elegans y en Drosophila melanogaster. Sin embarg( la técnica ha tenido escasa aplicación en las célula de los mamíferos, los cuales tienen una respuest¡ más generalizada al dsRNA que consiste en apagc. la síntesis proteínica y degradar el RNAm. La muestra que esto sucede debido a dos reacch nes. El dsRNA activa la enzima PKR, la cual desactiva el factor de iniciación de la traducción eiF2a a fos!orilarlo. También activa la ciclasa de oligoaden.lato 2'5', cuyo producto activa la RNAasa L, la cua degrada todos los RNAm . No obstante, resulta qt:.: estas reacciones necesitan dsRNA cuya lon gitud e mayor a 26 nucleótidos. Si se introduce dsRNA m a corro (de 21 o 23 nucleótidos) a las cél ulas de lo mamíferos, desencadena la degradadón específic de los RNA complementarios tal como sucede co la técnica de RNAi en los gusanos y en las mosca. Con este avance, parece probable que la RNAi st transforme en el mecanismo universal de elecciópara desactivar la expresión de un gen específico. Como ejemplo del progreso que se ha realizad con dicha técnica, ha sido posible utilizar la RN.-... para un análisis sistemático de la expresión géniG en C. elegans. Los fenotipos de pérdida de la (unció~ pueden ser generados al alimentar gusanos con bacterias que expresan un dsRNA que es homólogo · un gen diana. Al hacer una genoteca de bacteri¿ en la cual cada bacteria expresa un dsRNA que C1.rresponde a un gen distinto, los gusanos han sid tamizados por los efectos de la desactivación de mayor pane de los genes (86%).

La interferencia del RNA se relaciona con prosos naturales en los cuales la expresión génica es endada. Las plantas y los hongos exhiben silenamien to de RNA (algunas veces denominado endamiento génico postranscripcional). en el cual dsRNA inhibe la expresión de un gen. La fuente - ás común de RNA es un virus en replicadón. Esre ecanismo pudo haber evolucionado como defensa mra infecciones víricas. Cuando un virus infecta 'la célula vegetal, la formación de dsRNA desenca_:na la supres1ón de la expresión del genoma de la anta. El silenciamiemo de RNA liene, además, .: característica notable de que no está limüado a la !lula en la cual ocurre la infección vírica: puede 5eminarse por tOda la planta de forma sistémica . 1 parecer, la propagación de la señal comprende . paso de RNA o de fragmentos de RNA. Puede .:-querir alguna de las mismas características qu e =stán implicadas en el desplazamiento del virus ":!ismo. Es posible que el silenciamiento de RNA nvolucre una amplificación de la señal por un proeso de síntesis de RNA depenctiente de RNA en el -"Ial una polimerasa novedosa ulili'la siRNA como ::-bador para simetizar más RNA en un molde de -)!A complementario. Un proceso relacionado es el fenómeno de la co:upresión. en el cual la introducción de un trans=-¿n hace que el gen endógeno correspondiente sea O:enciado. Esto se ha descrito de manera amplia :1las plan ras. El efecto es que el transgén debe for< ar las copias de RNA anliscntido y de RNA con senJo, que inhiben la expresión del gen endógeno. El silenciamiento sucede por mectio de inter-ciones RNA-RNA. También es posible que el "RNA inhiba la expresión génica al interactuar con .: DNA. Si una copia de DNA de una secuencia de -)lA viroide es insertada en el genoma de una plan.a, se metil a Cl.lando el RNA vjroide se replica. Esto 1giere que la secuencia de RNA podría estar indu ..endo la metilación de la secuencia de DNA. En las -~lulas de las plantas se ba detectado una dirección ...rnilar de la metilación del DNA que corresponde .: las secuencias represemadas en el dsRNA. La me!ación del DNA está asocíada a la represión de la ~nscripción, por lo que ésta podría ser otra forma .e silenciar los genes representados en el dsRNA r éase la sección 24. 18, La expresión génica está ~saciada a la desmetilación). No se sabe nada sobre ::mecanismo.

Resumen expresión génica puede experimentar una repositiva por pane de los [actores que ac-lvan un gen o negativa por parte de los factores

..1

~ulación

1

dsRNA>26 nucleólidos

-; ~

l !

,,

-·

siRNA se dlnge al RNAm complementario

PKR

2',5'AS

RNAm degradado

eiF2a 1'

RNAasa L

X La slntesis proteínica ......-"-n ..i'"'" no puede iniciarse íV Degradación de todo el RNAm

El dsRNA inhibe la síntesis proteínica, desencadena la degradación de todos los RNAm en las células de los mamíferos y también tiene efectos específicos de secuencia.

qlle reprimen un gen. El primer nivel de conrrol. y el más frecuente, tiene lugar en la iniciación de la Lranscripción, pero la terminación de la transcripción también puede ser controlada. La traducdón puede ser regida por medio de reguladores que interactúan con el RNAm. Los productos reguladores pueden ser proteínas. las cuales son controladas a menudo por interacciones alosréricas en respuesta al ambiente, o moléculas de RNA, las cuales funcionan al aparearse con el RNA diana para cambiar su estructura secundaria. Las redes reguladoras pue den crearse al ligar reguladores de tal manera que la producción, o la actividad, de un regulador es controlada por oLro. La arenuación es un mecanismo que se sustenta en la regulación de la terminación para controlar la transcripción a través de los operones bacterianos. Se utiliza a menudo en los operones que codifican las enzimas implicadas en la biosímesis de un aminoácido. El RNAm policistrónico del operón comienza con una secuencia que puede for mar estructuras secundarias alternativas. Una de las esrrucruras tiene una horquilla que constituye un terminador intrínseco localizado en sentido ascendente con respecto a los genes estructurales; la esuucrura alternativa cart::ce de la horquilla. Varios tipos de imeracción determinan si se forma la horquilla. Una interacción sucede cuando una proteína se une al RNAm para impedir la formación de la estructura alternativa. En el operón crp de 8 . subtilis la TRAP tiene esta función; es controlada por el antiTRAP cuya producción es controlada a su vez por el nivel de R.NArrrp aminoacilac.lo sin carga. En los operones U .l l Resumen

345

trp (y el1 otros operones) de E. coli. la elección de la estructura que se forma es controlada por el progreso de la traducción a través de una secuencia líder cona que incluye los codones del aminoácido, o de los aminoácidos, que son el producw del sistema. En p resencia de RNAt aminoacilado que porra dicho aminoácido (o dichos aminoácidos), los ribosomas traducen el péplido líder, el cual permite que se forme una estructura secW1daria que respalda la terminación. En ausencia de este RNAt aminoacilado el ribosoma se detiene, lo cual da como resultado una estructura secundaria nueva en la cual la horquilla indispensable para la terminación no puede Iormarse. El abastecimiento del RNAt aminoacilado, por lo tanto, controla (de manera inversa) la biosíntesis de los aminoácidos. Los RNA reguladores peque1i.os se encuentran en las bactexias y en las eucariotas. E. coli tiene -17 especies de sRNA. El sRNA oxyS controla unos 10 loci diana en el nivel postraduccional; algunos de ellos son reprimidos en tanto que otros son activados. la represión es provocada cuando el sRNA se une a un RNAm diana para formar una regíón dúplex que incluye el siLio de unión al ribosoma. Los microRNA tienen una longitud de -22 bases y se producen en numerosas eucariotas por medio de la división de un transcrito más largo. FW1cionan al realizar apareamiento de bases con los RNAm diana para formar regiones dúplex que son susceptibles a la división mediada por las endonudeasas. La degradación del RNAm impide su expresión. La técnica de la interferencia del RNA se ha convertido en el método de elección para desactivar los genes e ucarióticos. Dicha técnica utiliza la introducción de secuencias cortas de dsRNA con una cadena complementaria al RNA diana y funciona al inducir la degradación de las dianas. Este método puede estar relacionado con un sistema de defensa natura l de las p lan tas denominado silenciamiento de RNA.

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El operón triptójono de Escherichio co/i es controla: por medio de atenuación

CAPÍTULO 13 RNA regulador

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strategias de los fagos ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción El desarrollo lítico se divide en dos periodos • El ciclo infeccioso de un fago se divide en periodo temprano (antes de la replicación) y periodo tardío (después del comienzo de la replicación). • Una infección por fagos genera un banco de genomas fágicos descendientes que se replican y se recombinan.

El desarrollo lítico es controlado por una cascada • Los genes tempranos transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora después de la infección incluyen, o comprenden, reguladores necesarios para la expresión del conjunto intermedio de genes fágicos. • El conjunto intermedio de genes incluye reguladores para transcribir los genes tardíos. • Esto da como resultado la expresión ordenada de los grupos de genes durante la infección fágica .

La cascada Lítica es controlada por dos tipos de sucesos reguladores • Las proteínas reguladoras utilizadas en las cascadas de los fagos pueden facilitar la iniciación en promotores nuevos (de fagos) o provocar la ultralectura de los terminadores de la transcripción por parte de la polimerasa hospedadora.

Los geno mas de los fagos T4 y T7 presentan agrupación funcional • Los genes im plicados en funciones relacionadas a menudo están agrupados. • los fagos T4 y T7 son ejemplos de casos en los que se presentan cascadas reguladoras en las cuales la infección por fagos se divide en tres periodos.

Los genes A. tempranos inmediatos y tempranos retrasados son indispensables para la Lisogenia y para el ciclo Lítico • El fago l. tiene dos genes tempranos inmediatos, N y ero, los cuales son transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora. • El gen N es necesario para expresar los genes tempranos retrasados. • Tres de los genes tempranos retrasados son reguladores. • la lisogenia necesita los genes tempranos retrasados cll y ciii. • El ciclo lítico requiere el gen temprano inmediato ero y el gen temprano retrasado a.

EL ciclo lítico depende de La antiterminación pN es un factor de antiterminación que permite a la polimerasa de RNA continuar la transcripción más allá de los extremos de los dos genes tempranos inmediatos.

• pQ es el producto de un gen temprano retrasado y es un antiterminador que permite a la polimerasa de RNA transcribir a los genes tardlos. • El DNA A forma un circulo después de la infección; como resultado, los genes tardíos constituyen una sola unidad de transcripción.

la lisogenia la mantiene una proteína represora • Los mutantes con mutaciones en el gen el son incapaces de mantener la lisogenia, El gen el codifica una protefna represora que actúa en los operadores O, y o. para bloquear la transcripción de los genes tempranos inmediatos. • Los genes tempranos inmediatos activan una cascada reguladora; como resultado, su represión impide que el ciclo litico prosiga.

EL represor y sus operadores definen La región de inmunidad • Numerosos fagos de tipo A tienen diferentes regiones de inmunidad. • Un fago lísog~nico confiere inmunidad contra infecciones posteriores por cualquier otro fago con la misma región de inmunidad.

La forma de unión al DNA del represor es un dímero Un monómero represor tiene dos dominios dfstintos. El dominio terminal N contiene el sitio de unión al ONA El dominio terminal C se dimeriza. • La unión al operador requiere la forma dimérica para que los dos dominios de unión al ONA puedan establecer contacto con el operador de manera simultánea. La división del represor entre los dos dominios reduce la afinidad por el operador e induce un ciclo lftico.

El represor utiliza un elemento hélice-giro-hélice para unirse al DNA Cada región de unión al ONA localizada en el represor contacta a una mitad de sitio en el ONA. El sitio de unión al DNA del reoresor incluye dos ·regiones cortas de hélice IX que embonan en giros sucesivos del surco mayor del DNA. Un sitio de unión al DNA es una secuencia (en parte) palindrómica de 17 bp.

La hélice de reconocimiento determina La especificidad por el DNA • La secuencia de aminoácidos de la hélice de reconocimiento hace contactos con bases particulares en la secuencia operadora a la cual reconoce.

Continúa en la siguiente página

349

cll actúa de manera directa en el promotor y ciTI protege a eH de la degradación. • La transcripción a partir del P~[ provoca la slntesis d6 represor e incluso bloquea la transcripción del gen cr.:

Los dímeros represores se unen en colaboración al operador • La unión del represor a un operador incrementa la afinidad de unión de un segundo dlmero represor al operador adyacente. • la afinidad es 10 veces mayor por 0 11 y por 0.1 que por otros operaoores, por lo que la unión sucede primero en ellos. • la colaboración permite al represor uni~e a los sitios 01/02 en concentraciones más bajas.

1BE1

• El promotor Pat tiene secuencias atf picas en - 1O y en -35. • la polimerasa de RNA se une al promotor sólo en presencia de cll. • el! se une a secuencias cercanas a la región -35.

la Lisogenia requiere numerosos sucesos

El represor en 0~2 interactúa con la polimerasa de RNA en el PR~, • la región de unión al ONA del represor en OR2 contacta

• cll y clll provocan que se establezca la síntesis del represor y también desencadenan la inhibición de la transcripción de los genes tardíos. • El establecimiento del represor apaga la expresión de los genes tempranos inmediatos y retrasados. • El rep1esor activa el circuito de mantenimiento para;. propia sf ntesis. El DNA 1.. se integra al genoma bacteriano en la etapa final del establecimiento de la lisogenia.

~la

polimerasa de RNA y estabiliza su unión al P..... Esta es la base del control autógeno del mantenimiento del represor.

El represor mantiene un circuito autógeno • La union del represor a Ol bloquea la transcripción del ge(l N del P. • la unión del represor a O~ bloquea la transcripción de ero, pero es indispensable para la trar¡scripción de el. Por lo tanto, la unión del represor al operador bloquea la entrada al ciclo lítico al tiempo que facilita su propia síntesis.

EL represor Cro es necesario para La infección lítica • Cro se une a los mismos operadores que el represor. pero con afinidades distintas. • Cuando Cro se une al sitio 01 3. impide que la polimerasa de RNA se una a P•., y bloquea el mantemmiento del represor. • Cuando Cro se une a otros operadores en O~ o en o,, impide que la polimerasa de RNA exprese a los genes tempranos inmediatos, lo cual bloquea (de forma indirecta) el establecimiento del represor.

Las interacciones de colaboración incrementan la sensibilidad de la regulación • los díme ros represores unidos a 011 y a 012 interactúan con los dímeros unidos a a.l ya a.2 para formar octámeros. • la formación del octámero aproxima a 0 13 a Ot3' lo que permite interacciones entre los dímeros unidos a dichas regiones. • Estas interacciones de colaboración incrementan la sensibilidad de la regulación.

en

los genes y ciiJ son necesarios para establecer la lisogenia • los productos de tos genes tempranos retrasados cli y clli son necesarios para que la polimerasa de RNA inicie la transcripción en el promotor P~·

Introducción Algunos fagos Licncn una sola esrrategia de supervivencia. Al infectar un solo hospedador susceptible, subvierten sus funciones con e l fin de producir una progenie de fagos más numerosa. Como resultado de esta infección lítica, la bacteria hospedadora muere. En el ciclo ürico característico. el DNA (o el RNA) del fago enrra a la bacteria hospedadora, sus genes se transcriben en un orden predeterminado, el material genético del fago se replica y los componemes proteínicos del fago se producen. Por úlrimo, la bacteria hospedadora se rompe (se lisa) para liberar las panículas ensambladas de la progenie por el proceso de lis is. Otros fagos tienen una existencia doble. Pueden perpetuarse mediante el mismo tipo de ciclo lítico utilizando una estrategia abierta para producir el mayor número de copias tan rápido como sea posi-

350

CAPÍTULO 14 Estrategias de los fagos

Un mal promotor requiere proteína cii

II3PD

¿Qué determina el balance entre la lisogenia _ el ciclo lítico? • la etapa temprana retrasada cuando Cro y el represo• est~n siendo expresados es común en la lisogenia y = el ciclo btico. • El evento cñtico ocurre si cll provoca la síntesis suficiente de represor para superar la acción de Cro.

Resumen

ble. No obstante, también tienen otra forma de e~i~ tencia en la cual e l genorna del fago está presente e· la bacteria dt un modo latente que se conoce coa profago . Esla forma de propagación se denomin~

liso genia. En u na bacteria lisogénica. el profago se inser.o en el genoma bacteriano y se hereda de la misn:manera que los genes bacterianos. El proceso por , cual se transforma de un gcnoma independiente" fago en un profago que es pane lineal del genol!'~ bacteriano se describe como integración. Debitl que posee un profago, una bacteria lisogénica tier inmunidad contra iniecciones provocadas por fag del núsmo tipo. La inmunidad la establece un so. profago integrado, por lo que. en generaL un genv roa bacteriano contiene sólo una copia de un profag de cualquier tipo particular. Entre las formas de existencia lítica y lisogénk ocurren transiciones. La muestra qu

Jo un fago producido por un ciclo lítico entra a :ueva célula bacteriana hospedadora, repite el itico o emra en estado lísogénico. El resultado 1de de las condiciones de la infección y del ge- 1 del fago y del genotipo de la bacteria. ..;n profago es liberado de las restricciones de "genia por medio de un proceso denominado u cción. Primero el DNA del fago es liberado .::-omosoma bacteriano por escisión; después el -.libre continúa por la rUla lítica. ~s otras formas de propagarse de estos fagos . determinadas por la regu lación de la rrans.::ón. La lisogenia se mantiene por la interacción .n fago represor con un operador. El ciclo lítico .íere una cascada de controles de la transcrip-

de la inmunidad por plásmidos es diferente a la de la inmunidad lisogénica. (Se aborda el control de la perpetuación de los plásmJdos en el Capítulo 15, El replicón .) La resume los tipos de unidades genéticas que pueden propagarse en las bacterias como genomas independientes. Los fagos líticos pueden tener gcnomas de cualquier tipo de ácido nucleico; se transfieren entre las células por libe-

-· La transición entre los dos estilos de vida se ·;por el establecim iento de la represión (de ciclo _ a lisogenia) o por la liberación de la represión .Jcción de fago lisogénico a fago lítico). Otro tipo de existencia en las bacterias lo re· = eman los p lásmidos. Éstos son unidades au· mas que exislcn en la célula como genomas ~racromosómicos . Los plásmidos son moléculas __ lares de DNA que se autorreplican y que se . tltienen en la célula en un número de copias es~ y característico, es decir, el número permanece -~ta nte de una generación a la otra. Algunos plásmidos también tienen otros estilos :cta. Pueden existir en estado extracromosómico nomo o pueden estar insertados en el cromo-:a bacteriano; en este último caso, son rrans"lados como parte del cromosoma de la misma ~,era que cualquier otra secuencia. Dichas unida:.e conocen como episomas. pero en ocasiones érminos "plásmido" y "episoma" se utilizan de ..:'1era indistinta. En cuanto a los fagos lisogénicos. los plásmidos s ep.isomas mantienen una posesión egoísta de ~ ')aeteria y con frecuencia hacen in1posible que se .3blezca otro elemento del mismo tipo. Este efecto -·bién se denomina inmunidad, aunque la base

y

....

DNAdellag<{")

ONAb~no

' CICLO LfTICO ~

LISOGENIA

u

....

... •••.1

... . V

:e1 DNA del lago es integrado al genoma': : :~cteriano; la bactena tiene un final teU~: :

u •: '

La progenfe del lago es liberada '-.... de la bactena llsada

........

•• La bacteria lisogénica es

f',

.

,.

\

~

'• • •'

; inmune a infecciones , • posteriores

.

INOUCCION

u

.......

El DNA del lago es liberado y entra al ciclo lítico

El desarrollo lítico comprende la reprodu cción de las partículas del fago con la destrucción de la bacteria hospedadora, pero la existencia lisogénica permite que elgenoma del fago sea transportado como parte de la información genética bacteriana.

Tipo de unidad

Estructura genómica

Forma de propagación

Consecuencias

Fago lítico

Infecta a un hospedador susceptible Secuencia lineal en el cromosoma hospedador

Suele matar al hospedador

Fago lisogénico

DNA o ANA ds o ss lineal o circular dsDNA

Plásmido

Circulo de dsDNA

Se reolica en un número definido de copias Puede ser transmisible

Episoma

Cfrculo de dsDNA

Circulo libre o lineal integrado Puede transferirse al DNA hospedador

fiGUII

.. .

~

Inmunidad contra la infecc1ón Inmunidad contra plásmidos del mismo grupo

En tas bacterias hay numerosos tipos de unidades genéticas independientes.

¡ 4, 1 Introducción

351

ración de partículas infecciosas. Los fagos lisogénicos tienen genomas de DNA de doble cadena, igual que los ptásmidus y que los episomas. Algunos plásmidos y episomas se transfieren entre las células por un proceso de conjugación (que comprende el contacto directo enlre la célula receptora y lacé lula donadora). Una característica del proceso de transferencia en ambos casos es que en ocasiones algunos genes bacterianos hospedadores son uansferidos con el DNA del fago o del plásmido, por lo que estos sucesos tienen una función importante al permitir el intercambio de información genética entre las bacterias.

El desa rrollo lítico se divide en dos periodos Conceptos principales El ciclo infeccioso de un fago se divide en periodo temprano (antes de la replicación) y periodo tardío (después del comienzo de la replicación). • Una infección por fagos genera un banco de genomas fágicos descendientes que se replican y se recombinan.

Los genomas de los fagos son pequeños por necesidad. Como sucede con todos los virus, están restringidos por la necesidad de empaquetar el ácido nucleico en el interior de una envoltura de proteína. Esta limilación diera muchas de las estrategias víricas de reproducción. Por lo general, un virus toma control del mecanismo de la célula hospedadora, el cual luego replica y expresa los genes del fago en vez de los genes bacterianos. En la mayor pane de los casos, el fago incl uye genes cuya función es garantizar la replicación preferencial del DNA del fago. Estos genes rienen que ver con la iniciación de la replicación e incluso pueden con tener una m 1eva polimerasa de DNA. Se int roducen los <.:ambios en la capacidad de la célula hospedadora para desempeñar la transcripción. Involucran el remplazo de la polimerasa de RNA o la modificación de su capacidad de iniciación o de terminación. El resultado siempre es el mismo : las moléculas de RNAm del fago se transcriben de manera preferente. En cuanto a la síntesis proteínica, en su mayor parte el Iago se satisface utilizando el mecanismo del hospedador y redirige las actividades de éste, sobre todo al remplazar el RNAm bacteriano por el RNAm del fago. El desarrollo lítico se logra a través de una ruta en la cual los genes del fago se expresan en un orden panicular. Esto garantiza que haya la cantidad correcta de cada componente en el tiempo adecua do. El ciclo puede dividirse en las dos partes gene" raJes que se ilustran en la 352

CAPÍTULO 14 Estrategia$ oe los fagos

Parttcula del lago

~

,A

Infección El lago se adhiere a una bacteria

EIDNAes inyectado al interior de ta bacteria Desarrollo temprano Se fabrican las enzimas necesarias para la síntesis del DNA Comienza la replicación Desarrollo tardlo Se fabrican los genomas, las cabezas y las colas El DNAes empacado en las cabezas; se adhieren las colas Lisis La célula se rompe para liberar la progenie del lago

El desarrollo litico tiene lugar cuando Sce pro: cen geno mas del fago y partículas proteínicas que son ens~ ­ blados en los fagos de la progenie.

• La infección temprana describe el perh que abarca desde la entrada del DNA ha el inicio de su replicación. • La infección tardía define el período 4 transcurre desde el inicio de la replicad hasLa la etapa final, que consiste en la i de la célula bacteriana para liberar la prc= nie del fago. La fase temprana esLá dedicada a la produce de las enzimas implicadas en la reproducción DNA. Éstas incluyen las enzimas que participan . la síntesis del DNA, en la recornbinación y, aces, en la modificación. Sus actividades provoc: la acumulación de un banco de genomas fágic En eslc banco, los genomas se están replicand recombinando de manera continua, por lo que

episodios de un solo ciclo lítico involucran a una pobLa_de geno mas de fagos. Durante la fase tardía se sintetizan los comr nemes proteínicos de las partículas fágk as. A m nudo son necesarias numerosas proteinas dislirpaxa formar las estructuras de la cabeza y de la o•

a que la mayor pane del genoma del fago con~

en funciones tardias. Además de las proteínas las "proteínas de ensamblaje" son in:>nsables para ayudar a construir la panícula . .que no se incorporen a ella. Mientras los com::ntes estructurales se están ensamblando en ca: y colas, la replicación del DNA ha alcanzado .::·a máxima. Luego, Jos genomas se insertan en .:abezas de proteína vacías, se agregan las colas .:élula hospedadora se lisa para permitir la libe n de las nuevas panículas víricas. ~ cturales,

los genes de los lagos son transcritos por la pohmerasa de RNA hospedadora

Tipos de productos génicos Gen(es) reguladO((es): polimerasa de RNA, factor a o factor de antiterminación

el producto temprano provoca la transcripción de los genes intermedios

El desarrollo lítico es controlado por una cascada

.. , ~

1 --~~.:eptos principales ...:>s genes tempranos transcritos por la poli merasa de ='lA hospedadora después de la infección incluyen, o :!>mprenden, reguladores necesarios para la expresión :el conjunto intermedio de genes fágicos. :t conjunto intermedio de genes incluye reguladores :ara transcribir los genes tardíos. :Sto da como resultado la expresión ordenada de los ;-upos de genes durante la infección fágica.

Gen(es) regulador(es): factor cr o factor de antlterminación Genes estructurales: enzimas de replicación, etc. el producto intermedio provoca la

1:·:"'',.'" '''" '"" ..,~, ' t ~ ,;;~~

y

4F 1'I"V :ganización del mapa genécico del fago a menu la secuencia del desarrollo lítico. El con:o del operón se lleva a una clase de extremo, en . .;.al los genes que codifican proteínas con tunes relacionadas son agrupados para permitir su rrol con la máxima economía. Esto permite que -..na del desarrollo lítico sea controlada con un 'Jeño número de interruptores reguladores. El ciclo lit ico se encuentra bajo co ntrol positivo, .al manera que cada grupo de genes del fago ~rte expresarse sólo cuando se proporciona la se adecuada. La muesrra que los genes =J!adores funcionan en una ca scada, en la cual ;en que se expresa en una etapa es indispensable -.: la síntesis de los genes que se expresan en la _ieme etapa. :a primera etapa de la expresión génica tiene :: valerse del mecanismo de transcripción de la .jla hospedadora. En generaL sólo se expresan ~~nos genes en esta etapa. Sus promotores son - stinguibles de los de los genes hospedadores . nombre de esta dase de genes depende del fago. .a mayor parte de los casos, se conocen como ~" es tempranos. En el (ago A., se les llama get emprano s inmediatos. A pesar del nombre, "'Sdtuyen sólo un conjunto prelim inar de genes _ representan apenas la parte inicial del periodo ..prano. En ocasiones se dedican de manera ex- ~iva a controlar la transición al siguiente periodo. ~eOeja

...

Genes estructurales: componentes del lago

El desarrollo lítico del fago avanza oor una cascada reguladora, en la cual un producto génico es necesario en cada etapa para la expresión de los genes de la siguiente etapa .

En rodos los casos. uno de estos genes siempre codifica una protefna indispensable para la transcripción de la siguiente clase de genes. Esta segunda clase de genes se conoce como el grupo de genes tempranos r etrasados o intermedios. Su expresión suele comenzar en cuanto esrá disponible la prote ina reguladora codificada por un gen temprano, o por más de uno. De acuerdo con la natlJraleza del circu ito de controL el conjunto inicial de genes tempranos puede continuar expre· sándose en esta etapa o no hacerlo. Si el control tiene lugar en la iniciación, los dos sucesos son in dependientes (véase la ) y los genes tempranos pueden ser desactivados cuando se transcri ben los genes intermedios. Si el control sucede en la terminación, los genel> tempranos deben seguir expresándose (véase la ). A menudo, la expresión de Jos genes hospedadores disminuye. En conjunto, los dos grupos de genes tempranos representan todas las [unciones requeridas por el fago, excepto aquellas necesarias para el ensamblaje de la envolmra y para la lisis de la célula. Cuando la replicación de l DNA del fago comienza, es el momento indicado para que los genes 1 .

El desarrollo litico es controlado por una cascada

353

SIGUIENTE INICIACIÓN

El control en la iniciación utiliza unidades de transcripción independientes, cada una con su propio promotor y con su propio terminador, las cuales producen moléculas de RNAm independientes. Las unidades de transcripción no necesitan localizarse cerca una de la otra.

-

Reglón 1emprana -

- Reg1on siguiente+ Terminador

ANTITERMINACIÓN

El control en la terminación requiere unidades adyacentes, de modo que la transcripción pueda leer desde el primer gen hasta el interior del siguiente gen. Esto produce un solo RNAm que contiene ambos conjuntos de genes.

t ardíos sean expresados. Su transcripción en esta etapa por lo general se organiza al incrustar un gen regulador más demro del conjunto de genes previo (temprano retrasado o intermedio). Este regulador puede ser otro factor de amiterminación (como en A) o puede ser otro factor cr (como en SPO l ). Una infección lítica a menudo se divide en tres etapas, como se muestra en la Figura 14.4. La primera etapa consiste en la transcripción de los genes tempranos por la polimerasa de RNA hospedadora (en ocasiones los reguladores son los únicos productos 354

CAPÍTULO 14 Estrategias de los fagos

presentes en esta etapa). La segunda etapa consü en la transcripción de los genes bajo la dirección regulador producido en la primera etapa (lama. parte de esws genes codifican enz.imas indisper... bies para la replicación del DNA del fago). La eta final consiste en la transcripción de los genes ~ codifican los componentes del fago bajo la direcc de un regulador sintetizado en la segunda etapa. El uso de estos conh·oles sucesivos, en los cuales ce conjunto de genes contiene un regulador que es necesc para la expresión del siguiente conjunto, crea una case.; en la cual Los grupos de genes son activados (y en oca: nes desactivados) en momentos determinados. Los med: utilizados para construir cada cascada fágica son ~ ferentes, pero los resultados son similares, come rnuescra en las secciones siguientes.

Bit La cascada lítica es controladc por dos tipos de sucesos reguladores (onc~plo

prin(ipat

• Las proteínas reguladoras utilizadas en las cascadas dE los fagos pueden facilitar la iniciación en promotores nuevos (de fagos) o provocar la ultra lectura de los terminadores de la transcripción por parte de la polimerasa hospedadora.

En cada etapa de la expresión fágica, uno o más C! los genes activos es un regulador indispensable pa · la etapa siguieme. El regulador puede adquirir forma de una polimerasa nueva, de un factor cr q<. redirige la especificidad de la poli merasa de RXhospedadora (véase la sección 11.18, Los factores pueden organizarse en cascadas) o de un factor t. antiterminación que le permite leer un nuevo grup de genes (véase la secci6nll.23, La antiterrninaci(i.es un evento regulador). En las dos figuras que ' mencionan a continuadón se compara el uso del il:.· tercambio en la iniciación o en la terminación pa~¡ controlar la expresión génica. Un mecanismo para el reconocimiento de pn moro res fágicos nuevos consiste en remplazar el fa.:tor cr de la enzima hospedadora por otro factor qu . redirija su especificidad en la iniciación (véase :.; Figura 11.31 ). Otro mecanismo consiste en sintet;zar una polimerasa de RNA fágica nueva. En amb~ casos, la característica fundamental que distingue a. nuevo conjunto de genes es que poseen promotor: diferentes a los reconocidos en un principio por la polinr~­ rasa de RNA hospedadora.I.a Figura 14.5 muestra ql! ~ los dos conjuntos de transcritos son independiente:. en consecuencia, la expresión de los genes tempranos puede cesar después de que se haya producid la pollmerasa o el factor cr nuevos.

La antiterminación constituye un mecanismo emativo para que los lagos controlen el cambio ~enes tempranos a la siguiente etapa de expre ~. El uso de la antitcrminadón depende de una .:anizaóón particular de genes. La Figura 14.6 -estra que Jos genes tempranos se ubican al lado vs genes que deben expresarse después. pero · n separados de ellos por sitios terminadores. Si

zptde la temlinacíón en estos sitios, la polimerasa hace .Eralectura y llega hasta los genes que se encuentran ::otro lado. Por lo tamo, eo la amiterminación ,,iS1nos promotores cominúan siendo reconocidos ·la polimerasa de RNA. Como resultado, los genuevos se expresan sólo al extender la cadena RNA para formar moléculas que contienen las "'Jeucias de los genes tempranos en eJ extremo 5' · secuencias de los genes nuevos en el extremo ~os dos tipos de secuencias permanecen ligados orlo tanto, la expresión de los genes tempranos ~Jnúa de manera inevitable. El gen regulador que controla el cambio de la resión temprana inmediata a temprana retrasaen el fago A. es identificado por me
.:tales el producto de u11 gen temprano debe ser creado d fago para expresar el siguiente conju.mo de genes. .::-mplear los factores a o las proteínas de anti;ninación con diferentes especificidades, puede .suuirse una cascada para la expresión génica.

Los genomas de Los fagos T4 y T7 presentan agrupación funcional ::nceptos ptincipales los genes implicados en funciones relacionadas a menudo están agrupados. Los fagos T4 y T7 son ejemplos de casos en los que se presentan cascadas reguladoras en las cuales la infección por fagos se divide en tres periodos.

genoma tlcl fago T7 tiene tres clases de genes, - a uno de los cuales consticuye un grupo de loci ..acentes. Como se muestra en la , los 'les de clase I son de tipo temprano jnmediato y :--expresados por la polimcrasa de RNA hospeda-a en cuanto entra e l DNA del fago a la célula.

5 genes

Clase 11

Clase 111

7 genes

13 genes

Pohmerasa de RNA tnterferenc•a del ' ' ' ' : ' ' • ' • ' ' ' ••

.

y

SlnleSls de ONA

Ltsozoma

y Cabezas y cOlas Maduración del DNA

El fago T7 contiene tres clases de genes que se expresan de forma secuencial. El genoma mide -38 kb.

Entre los productos de estos genes se encuentran una polimerasa de RNA fágica y las enzimas que interfieren coo la expresión génica del hospedador. La polirnerasa de R.NA fágica se encarga de la e>rpresión de los genes de clase D (lo!. cua les intervienen sobre todo en las funciones de la síntesis de DNA) y de los genes de dase rn (los cuales tienen que ver con el ensamble de la panícula fágica madura). El fago T4 tiene uno de los genomas fágicos más largos (165 kb), el cual está organizado en agrupamientos funcionales extensos de genes. La presenta su mapa genético. Los genes ~senciales están numerados: una mu1ación en cualquiera de estos loci impide que se complete el ciclo lítico. Los genes no esenciales se indican con abreviaturas de tres letras. {Se definen como no e::senciales conforme a las condiciones habituales de la infección. En reali · dad no se entiende porqué se incluyen tantos genes no esenciales, pero al parecer confieren una ventaja selectiva en algunos de los hábitat del fago T4. En genomas [ágicos más pequeños. la mayor parte o lodos los genes son esenciales.) Hay tres fases de expresión gén.ica. En la se muestra un resumen de las [unciones de los genes expresados en cada etapa. Los genes tempranos los transcribe la polimerasa de RNA hospedadora. Los genes intermedios también son transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora, pero también se necesitan dos productos fágicos codificados. MotA y AsiA. Los promotores intermedios carecen de secuencia de consenso en la posición - 30 y en cambio tienen una secuencia de unión para el producto MotA. La protefna fágica es un activador que compensa la deficiencia del promotor al ayudar en la unión de la polimcrasa de RNA hospedadora. {Este mecanismo es similar al utilizado por el fago A., el cual se üusrra después en la rigura 14.30). Los genes tempranos e intermedios representan casi todas las funciones tlel fago implicadas en la síntesis de DNA, la modificación de la esrrucrura celular y la transcripción y traducción de los genes del fago.

14.5 los genomas de los fagos T4 y T7 presentan agrupación funcional

355

RNA tardfo 55 RNA tardlo 45 42 43 62 44 polimerasa de DNA. etc. cabeza 40

sa ot

lk cinasa de timldina denV endonucleasa V /p/1, /p/1/ protefnas internas e lisozima 57 fibra de la coJa 1 clnasa de dNMP 3 terminador de la lámina 2 conclusión de la cabeza 50 conclusión de la cabeza 65 conclusión de la cabeza 80 5 conector de la plataforma

40

41

primase de DNA topoisomerasa 3S riJA, r/IB topolsomerasa 52

o kb

6 7 8 9 10 12 cuña de la plataforma

160

38 37 36 35 34 fibras de la cola

3 H 16 17 waccabeza

120

33 Id ANA tardfo slntetasa de dTMP ligasa de DNA 30 plataforma 54 48 27 51 26 26 conector de la plataforma

78 1ámina 19 cola 20676821222324 hoc inh cabeza

El mapa del fago T4 es circular. Hay un agrupamiento extenso de los genes que codifican los componente.> procesos del fago, como la replicación del DNA, pero también hay dispersión de los genes que codifican una variedad de fun: enzimáticas, entre otras. Los genes esenciales se indican con números. Los genes no esenciales están representados con le~: el mapa se muestran sólo algunos genes representativos del fago T4.

Los dos genes esenciales demro de la categoría de la "transcripción" ejercen una función reguladora: sus productos son necesalios para la expresión de los genes tardíos. La infección por el fago T4 depende de una relación mecánica entre la replicación y la expresión de los genes tardíos . Sólo el DNA que está siendo replicado en forma activa puede utilizarse como molde para la transcripción de los genes tardíos. La conexión se genera al introducir un factor cr nuevo y también al hacer otras modificaciones en la polimerasa de RNA hospedadora. de modo que sea activa sólo con un molde de DNA en replicación. Este víncu lo establece una correlación entre la síntesis de los componentes proteínicos del fago y el número de genomas disponibles para el empaqueramienLo .

Los genes 'A tempranos inmediatos y tempranos retrasados son indispensables

para la lisogenia y para el ciclo lítico Conceptos principales

El fago A. t iene dos genes tempranos inmediatos, N y ero, los cuales son transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora. El gen N es necesario para expresar los genes tempranos retrasados. Tres de los genes tempranos retrasados son reguladores, • La lisogenia necesita los genes tempranos retrasados cll y clll.

356

CAPÍTULO 14 Estrategias de los fagos

El ciclo lítico requiere el gen temprano inmediato cr el gen temprano retrasado Q.

Una de las cascadas más intrincadas se obsen:: el fago A.. La cascada para el desarrollo lítico d~o cho es bastante sencilla, con dos reguladores controlan las etapas sucesivas del desarrollo embargo, el circuito del ciclo lítico está entrela ~ con el circu ito utilizado para establecer la lisog · como se resume en la Cuando el DNA del fago A. entra a una nueY.:. lula hospedadora, las rutas lítica y Jisogénica in. · de la misma manera. Ambas requieren la expre de los genes tempranos inmediatos y temprana... trasados, pero después divergen: el desarrollo ~ continúa si Jos genes tardíos son expresados, lisogenia tiene lugar si se establece la síntesis represor. El fago A. tiene sólo dos genes temprano mediatos, los cuales transcribe de manera indediente la polimerasa de RNA hospedadora: • El gen N codifica el factor de antiten:r ci6n cuya acción en los sitios nutpermittproceda la transcripción en los genes :. pranos retrasados (véase la sección l. : La amiterminación requiere sitios que independientes de los terminadores). • El gen ero tiene dos funciones: imph. síntesis del represor (una acción neceo.. · si procede el ciclo lítico) y desactiva b presión de los genes tempranos inmedu (los cuales no son necesarios después ~ ciclo lítico}.

CASCADA LÍTICA ETAPAS TEMPRANA E INTERMEDIA SÍNTESIS DE DNA Replicación 17 genes esenciales 7 genes no esenciales Modificación 3 genes no esenciales ~ECUASORES

DE DNA

Rompimiento del DNA hospedador 2 genes esenciales 5 genes no esenciales de nucleótidos 3 genes esenciales 1O genes no esenciales

~>tabollsmo

:=STRUCTUAA CELULAR 1clones de la membrana 12 genes no esenciales

Lisls 2 genes no esenciales EXPRESIÓN GÉNICA

ESTABLECIMIENTO

L••• ••••••• ••• •• :~~~~~~~~?

r FASETARDfA ENSAMBLE DE LA CABEZA Cabeza y cuello 2 genes esenciales 1 gen no esencial Componentes de la cápside 7 genes esenciales 1 gen no esencial Ensamble de la cápside 5 genes esenciales 4 genes no esenciales Empaque del DNA 3 genes esenciales 2 genes no esenciales ENSAMBLE DE LA COLA Componentes de la plataforma 13 genes esenciales Ensamble de la plataforma 5 genes esenciales 2 genes no esenciales

Traducción

Tubo y lámina

'2 genes no esenciales

4 genes esenciales

Transcripción 2 genes esenciales 5 genes no esenciales

Fibras de la cola 7 genes esenciales 1 gen no esencial

la cascada lítica del fago T4 se divide en dos

-:s: las funciones tempranas se relacionan con la sínte.sis y !. :'esión del DNA; las funciones tardías tienen que ver con =--sambte de la partícula.

:..os genes tempranos retrasados incluyen dos .:s de replicación (indispensables para la infeclítica), siete genes de recombinación (algun os JCad.os en la recombinación durante la infección : y dos necesarios para integrar el DNA A en el .osoma bacteriano para la lisogenia) y tres ge :-eguladores. Los reguladores tienen funciones ,..arias: • Los reguladores el/ y clll son necesarios para establecer la síntesis del represor. • El regulador Q es un factor de antiterminadón que permite que la polímerasa de RNA hospedadora transcriba los genes tardíos. Por lo tanto, los genes tempranos retrasados olen dos propósiws: algunos son necesarios para d fago entre en lisogcnia y los demás tienen que :on el control del orden del ciclo lítico.

represión

Tempranos inmediatos ero= regulador negativo N = antiterminador

:

.... . represión :

y

Tempranos retrasados el/, el// reguladores

7 genes de recombmación 2 genes de replicación Q antitenninador

·activación · ·'' ' ·>

••• ... .. .....

represor e(•,

. v Tardros 10 genes de la cabeza 11 genes de la cola 2 genes de lisis

MANTENIMIENTO LISOGÉNICO

PROGENIE DEL FAGO la cascada lítica del fago A. está entrelazada con el circuito de la lisogenia.

El ciclo lítico depende de la antitermi nación Conceptos principales • pN es un factor de antiterminación que permite a la polimerasa de RNA continuar la transcripción después de tos extremos de los dos genes tempranos inmediatos. • pQ es el producto de un gen temprano retrasado y es un antiterminador que permite a la polimerasa de RNA transcribir los genes tardíos. • El DNA A. forma un círculo después de la infección; como resultado, los genes tardíos constituyen una sola unidad de transcripción .

Para desenredar las dos rutas, se considerará primero sólo el ciclo lítico. La muestra el mapa del DNA del fago A. Un grupo de genes que intervienen en la regulación es rodeado por los genes necesarios para la recombinación y para la replicación. Los genes que codifican los componentes estructurales del fago están agrupados. Todos los genes necesarios para el ciclo lítico se expresan en transcritos policistrónicos a partir de los tres promotores. 14.7 El ciclo lítico depende de la antiterminación

357

Promotores del ciclo lítico Genes de la cabeza Genes de la cola Recombinación Regulación Repllcación Lisis AWBCNu3DEFl ZUVGTHMLK/J att int xisC'J.~ye/11 N el ero el/O P QSR 11

Indispensables para: lisogenia el// mantiene o// llsogenia y lisis N activa los tempranos retrasados lisogenia el es un represor lisogénico lisis oro apaga el represor lisogenia el/ enciende el represor lisis Q activa los tardíos El mapa del fago /, muestra el agrupamiento de funciones relacionadas. El genoma mide 48 514 bp.

f.. tiene unidades de 1ranscripción a la derecha y a la

izquierda ~Unidad de transcripción -

a la izquierda ~Retrasada · ,._Inmediata -

Promotores Terminadores

PL

VJ\; Vl\l.J\.t.:\Ylfv~/i\.IJ\FIWVI IL1

N

PR

ero

'Rl

• Inmediata ~ • Retrasada._ _ Unidad de transcripción + derecha

Etapa temprana inmediata: sólo N y ero son transcritos RNAmN

El fago A. tiene dos unidades de t ranscri pción temprana. En la unidad "que se dirige a la izquierda", la cadena "superior'' se transcribe hacia la izquierda; en la unidad ''que se dirige a la derecha", la cadena "inferior" se transcribe hacia la derecha. los genes N y ero son los elementos tempranos inmediatos y están separados de los genes tempranos retrasa· dos por los terminadores. La sí ntesis de la proteína N permite que la poli me rasa de RNA deje atrás a los terminadores tu a la izquierda y a los t R1 a la derecha.

La muestra que los dos genes Lempranos inmediatos, N y ero, son transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora. El gen N se transcribe hacia la izq uierda y el gen ero hacia la derecha. Cada transcritO es terminado en el extremo del 358

CAPÍTULO 14 Estrat egias de los fagos

gen. El regulador pN permite que la transcripdór continúe en los genes tempranos retrasados. Es ur factor de antiLerminadón que suprime el uso eL los terminadores ll y tR (véase la sección 11.25, Le_ factores de terminación y de antiterminación interactúan con la polimerasa de RNA}. En presend.; del regulador pN, la transcripción con tinúa hacia k izquierda del gen N dentro de los genes de recorP-· binación y hacia la derecha del gen ero dentro de ll ' genes de replicación. El mapa que se muestra en la Figura 14. 1 muestra la organización del DNA A. como exisie en la particula del fago . No obstante, poco despue~ de la infección los extremos del DNA se unen pa:-¿ formar un círculo. La muestra el verdadero estado del DNA A. durante la infección. L•. genes tardíos están soldados en un solo grupo, ~ cual contiene los genes de lisis S-R a partir del extremo derecho del DNA 1íneal y los genes de la cabeu y de la cola A-Ja partir del extremo izquierdo. Los genes tardíos se expresan como una so-: unidad de transcripción, comenzando desde un pr<"motor PR, que se encuentra entre Q y S. El promot, • tardío se utiliza de manera constitutiva. Sin emba:go, en ausenda del producto del gen Q (el cual es eúltimo gen hacia la derecha de la unidad remprar:¿ retrasada), la transcripción tardía termina en un s·Lio t R3 . El transcrito que surge de este episodio (L terminación tiene una longitud de 194 bases; se : · conoce como RNA 6S. Cuando pQ queda d ispor~ · ble, suprime la terminación en tR 3 y el RNA 6S ~ extiende, lo cual da como resultado la expresión a los genes tardíos. La transcripción de los genes tardíos no pare . terminar en un sitio específico, sino que contim;.por todos los genes tardíos hasta la región que •.:o encuentra después. Un episodio similar tiene luga en la transcripción temprana retrasada hada la i: quierda, la cual continúa más allá de las funcion~

11J

La Lisogenia la mantiene una proteína represora

Conceptos princí pales Tl[j

¡¡

• los mutantes con mutaciones en el gen el son incapaces de mantener la lisogenia. • EL gen el codifica una protefna represora que actíia en los operadores OLy para bloquear la transcripción de los genes tempranos inmediatos. • Los genes tempranos inmediatos activan una cascada reguladora; como resultado, su represión impide que el ciclo lítico prosiga.

La polimerasa deRNA hospedadora transcribe N y ero desde PL yPR

o.

Terr~pr

"'a c:lr.:.s.. \'la

pN permite la transcripción desae los m1smos promotores para continuar después de N y de ero

La transcripción inicia en PR• (entre O y S) y pQ le permite continuar por todos los genes tardfos

El DNA A. forma un círculo durante la infección, .: :al manera que el agrupamiento de genes tardíos está i ntac~, una unidad de transcripción.

e recombinación. Es probable qu e la transcripción

cada dirección termine ames de que las polim e _-as choquen entre sí.

Al analizar la cascada lítica del fago A, se ve que el programa completo es puesto en movimiento por la iniciación de la transcripción en los dos promotores P1 y PR pa ra los genes tempranos inmediatos N y ero. El fago A utiliza la antitcrminación para proceder a la siguiente etapa de expresión (temprana retrasa da); por lo tanto, los mismos dos promotores siguen utilizándose durante el periodo temprano. El mapa expandido de la región reguladora que se ilustra en la muestra que los promotores Pl y PR se encuentran a ambos lados del gen el. A cada promotor se asocia un operador (OL y OR) al cual se une la proteína represora para impedir que la polimerasa de RNA inicie la transcripción. La secuencia de cada operador se superpone al promotor que controla y debido a que esto ocurre con tanta frecuencia estas secuencias se describen como las regiones de comrol PL/ OL y PRIOR. Como resultado de la naturaleza secuencial de la cascada lítica. las regiones de control constituyen un sitio de presión en el cual puede controlarse la entrada a todo el ciclo. Al denegar el acceso de la polimerasa de RNA a estos promotores. una proteína represora impide que el genoma del fago entre al ciclo lítico. El represor funciona de la misma forma que los represores de los operones bacterianos: se une a operad ores específicos.

/ RI

Elementos de actuación en eis el/ Genes

PR,A PfliOR nutR Pp_e el//

el

N

,/'...i' Regulador Antiterminador positivo

'

".J

Represor

·\.~ .. 1 Antirrepresor

j

Regulador Funciones positivo

+ - - Región de inmunidad- - + La región reguladora de A. contiene un agrupamiento de funciones de actuación en trans y elementos de actuación en ds.

14,8 La lisogenia la mantiene una prot eína represora

359

Mutante e

las placas son claras

Los fagos }., silvestres pueden distinguirse de los mutantes virulentos por sus tipos de placas. Reproducida de Virology, vol. 1, Kariser, D., pp. 423-443. Copyright 1955. Con autorización de Elsevier. Fotografías cortesía de Dale Kaiser, Stanford University School of Medicine.

La proteína represora es codificada por el gen

el. Los fagos con mutaciones en es re gen no pueden mantcn<.:r la lisogenia, pero siempre entran al ciclo lítico . Desde el aislamiento original de l a proteína represora, su descripción ha demostrado cómo ésta manliene el estado lisogénico y proporciona inmunidad a un Usógeno contra infecciones por nuevos genomas del fago A.. Cuando se infecta un cultivo bacteriano con un fago, las células se lisan y generan regiones que pueden observarse en una caja de cultivo como áreas diminutas de aclaramiento denominadas placas. En los fagos silvestres las placas son turbias o están nubladas porque contienen algunas células que han establecido la lisogenia en vez de ser lisadas. El efecto de una mutadóu el es impedir la lisogenia, de modo que las placas sólo contienen células lisadas. Como resultado, u na infección de estas características genera sólo placas claras, y rres genes (el, cll y cfll) se nombraron por su implicación en este fenotipo . La compara las placas silvestres y mutantes. El gen el se transcribe desde el promotor PRM que se encuentra en s u eXLYemo derecho. (El su bíndice "RM " significa repressor maintenance, manteni miento del represor.) La transcripción termina en el extremo izquierdo del gen. El RNAm comienza en el codón de iniciación AUG; debido a la ausencia del sitio de un ión de ribosomas hab itual. el RNAm se traduce en forma ineficiente y produce un nivel muy bajo de pro¡eína represora .

1111

El represor y sus operadores definen la región de inm unidad

Conceptos principales Numerosos fagos de tipo ;>...tienen diferentes regiones de inmunidad. • Un fago lisogénico confiere inmunidad contra infecciones posteriores por cualquier otro fago con La misma región de inmunidad.

360

CAPÍTULO 14 Estrategias de los fagos

La presencia del represor explica el fe nómeno de la inmunidad . Si un segundo DNA de fago ')..,entra a la célula lisogénica, la proteína represora sintetizada a partir del genoma de l profago residente de inme· diaLO se unirá al at y alaR en el genoma nuevo. Estr impide que el segundo fago entre al ciclo lítico. Los operadores se identificaron en un principi( como dianas para la acción represora por medio de. mutaciones virulentas (A.vír). Estas mutadones impiden que el represor se una al at o al OR, con e: resultado de que el fago enrra de manera inevitablr a la ruta lítica cuando infecta a una nueva bacteria hospedadora. Nótese que los mutantes 'Avir puedecrecer en lisógenos debido a que las mutaciones virulentas en el OL y en el OR permiten que el fag entrante ign ore al represor residente y, por lo tantl entre al clclo lírico. Las mutaciones virulentas en lo· fagos son equivalentes a las mutaciones constitutivas del operador en los operones bacterianos. El profago es inducido a entrar al ciclo Lític cuando se rompe el circuito lisogénico. Esto tien{: lugar cuando el represor es desactivado (véase k sección 14.10, La fo rma de unión al DNA del represor es un dímero). La ausencia de represor permit. que la polimerasa de RNA se una al Pl y al PR, co;lo que se inicia el ciclo lírico como se muestra en!: parte inferior de la Figura 14.26. La naturaleza autógena del circuito de mantenimiento del represor crea una respuesta sensible La presencia de un represor es indispensable para s_ propia síntesis; por Jo tanto, la expresión del gen , _. se detiene en cuanto se desrruye el represor exister:te. En consecuencia, no se sintetiza ningún represt para remplazar a las moléculas que han sido daliadas. Esto le permite al ciclo lítico comenzar sin interferencia del circuito que mantiene la lisogenia. La región que in cluye los operadores izquierdc }' derecho, el gen el y el gen ero determina la inmu~ nidad del fago. Cualquier fago que posea esta regió.,... tendrá el mismo tipo de inmunidad debido a qu'=

especifica a la proteína represora y a los sitios en los cu.m'C" actúa el represor. En consecuencia, a ésta se le denorruna región inmu nitaria (como se señala en la Figura 14.14). Cada uno de los cuatro fagos Lambdoide
La forma de unión al DNA del represor es un dímero i:.:)nceptos principales Un monómero represor tiene dos dominios distintos. :L dominio terminal N contiene el sitio de unión al DNA. a dominio terminal e se dimeriza. _a unión al operador requiere la forma dimérica :>ara que los dos dominios de unión al DNA puedan establecer contacto con el operador de manera simultánea. ..a división del represor entre los dos dominios reduce ll! afinidad por el operador e induce un ciclo lítico.

subunidad represora es un polipéptido de 27 kD "" dos dominios distintos, los cuales se ilustran en • El dominio term inal N, que abarca del residuo 1 al 92, proporciona el sitio de unión al operador. • El dominio termina l C, formado por los residuos 132-236. se encarga de la formación de dímeros. Los dos dominios están unidos por un conector .W residuos. Cuando el represor es digerido por a proteasa, cada dominio es liberado como un _;mento separado. Cada dominio es capaz de ejercer su función con :~pendenda del OtrO. El [ragmento tetminaJ e pue~ mnar oligómeros. El fragmento terminal N puede - ~se a los operadores, aunque con menor afinidad -:: el represor intacto. Por lo tanto, la informadón .spensable para establecer contacto específico con ='::fA está contenida dentro del dominio terminal .,ero la efidencia del proceso mejora con la adhe_, del dominio terminal C. La estructura dimérica del represor es crucial en el ~ienimiento de la lisogenia. La inducción de un :ago lisogénico a entrar al cido lítico la provoca ~visión de la subunidad represora ubicada en la - ón conectora, localizada entre los residuos 11 l : 3. (Ésta es la contraparte del cambio alostérico .a conformación que ocurre cuando una pequemolécula inductora desactiva al represor de un ..:-~ón bacteriano, una capacidad que no tiene el resor lisogénico.) La inducción ocurre bajo cier:::ondiciones adversas, como la exposición de las __erias lisogénicas a radiación UV, lo que conduce ~ desactivación proteolítica del represor. En el estado intacto, la dimedzación de los doios terminales e garantiza que cuando el re:iOr se une al DNA, sus dos dominios terminales contacten de manera simultánea. NóLese. sin • argo, que la división libera los dominios ter-

e 236 132

Dimerización

e

Conector

92 11

e

Unión al DNA

N

N

N

Las regiones terminal Ny terminal edel represor forman dominios independientes. Los dominios terminales C se asocian para formar dlmeros; los dominios terminales N se une al DNA.

Los monómeros se encuentran en equilibrio con los dlmeros, los cuales se unen al DNA LISOGENIA

La división de los monómeros altera el equilibrio, por lo que los dlmeros se disocian INDUCCIÓN

División _ _ .

......

... ...

Los dímeros represores se unen al operador. La afinidad de los dominios terminales Npor el DNA es controlada por la dimerización de los dominios terminales C.

minales C de los dominios terminales N. Como se ilustra en la , esto significa que los dominios terminales N ya no pueden formar dímeros, lo cual altera el equilibrio enrre monómeros y dímeros. Como resultado, el represor se disoda del DNA, lo cual permite que inicie la infecdón lítica. (Ono parámetro relevante es la pérdida de efectos cooperativos entre los dímeros adyacentes.) 14.10 La forma de unión al DNA del represor es un dímero

361

El balance entre la lisogenia y el ciclo lítico depende de la concentración de molécuJas de represor. El represor imacto está presente en una célula lisogénica a una concentración sufidente para garantizar que los operadores estén ocupados. No obstame, si el represor es clivido, esta concentradón será inadecuada, debido a la baja afinidad del domino terminal N (separado) por el operador. Una concentración muy alta de represor hará imposible inducir el ciclo lítico de esta manera; un njvel muy bajo, por supuesto, imposibilitará el mantenimiento de la lisogenia.

1111 El represor utiliza un elemento hélice-giro-hé lice para um rse al DNA Conceptos principales • Cada región de unión al DNA localizada en el represor contacta a una mitad de sitio en el DNA. • El sitio de unión al DNA del represor incluye dos regiones cortas de hélice a que embonan en giros sucesivos del surco mayor del DNA. • Un sitio de unión al DNA es una secuencia (en parte) palindrómica de 17 bp.

TACCTCTGGCGGTGATA ATGGAGACCGCCACTAT ~ El operador es una secuencia de 17 bp que tiene un eje de simetria en el par de bases central. Cada mitad de sitio se marca en color azul claro. Los pares de bases que son idénticos en cada mitad del operador están coloreados en azul oscuro.

Se desconoce la estructura del dominio terminal

Un dímero represor es la unidad que se une al DN.Reconoce una secuencia de 17 bp que exhibe s , met ría parcial con respecto a un eje formado pe el par de bases central. La muestra u: ejemplo de un sitio de unión. Las secuencias que ~­ encuentran a ambos lados del par de bases cenm en ocasiones se denominan "mitades de sitio". ca~ ­ región terminal N individual contacta a una mita de sitio. Numerosas proteínas de unión al DNA ql. regulan la transcripción bacteriana comparten ü modo similar de sujeción del DNA, en el cual : dominio activo contiene dos regiones cortas de he· Jice a que hacen contacto con el DNA. (Algunc factores de transcripción de las células eucariótiu urUizan un elemento similar; véase la sección 25.1Los homeodominos se unen a dianas relacionad~ en el DNA.) El dominio terminal N del represor A. contie: numerosos fragmentos de hélice a, los cuales esta organizados como se ilustra en el diagrama de ~ . Dos de las regiones helicoidales se e:cargan de la tmión al DNA. El modelo h élice-gireh é lice para el contacto con el DNA se ilustra eo . En cada monómero, la hélice a 3 es formada por nueve aminoácidos, cada uno de ! cuales forma un ángulo con la región hélice a 2, _ siete aminoácidos, que la precede. En el dímero, _:;. dos regiones de hélice o: yuxtapuestas están sepa::-.:· das una distancia de 34 Á, lo cual les permite cabe~ en surcos mayores sucesivos del DNA. Las region~ de hélice 2 forman un ángulo que las coloca a m vés de l surco. La un ión simétrica del dímero al si• significa que cada dominio terminal N del díme: hace contacto con un conjunto similar de bases ... su mitad de sitio.

e

El domino terminal N esta formado por cinco hélices CY.

Mitad de -sitio

Los dominios terminales N de los represores de A, contienen cinco fragmentos de hélice a; las hélices 2 y 3 se unen al DNA. 3 62

CAPÍTULO 14 Estrategias de los fagos

Miladdesllio

En el modelo de dos hélices para la uniá- · DNA, la hélice 3 de cada monómero yace en el surco mayo- ~ La misma cara del DNA, y la hélice 2 atraviesa el surco.

La hélice de reconocimiento determina la especificidad por el DNA :;_,repto principal secuencia de aminoácidos de la hélice de reconocimiento hace contactos con bases particulares en la secuencia operadora a la cual reconoce.

La

_;..., formas relacionadas de los motivos helicoidales .mpleados en el elemento hélice-giro-hélice del !esor A. se encuentran en numerosas proteínas de ón al DNA, como la proteína recepwra de AMP .ico (cyc/ic AMP receptor protein, CRP), el represor .; muchos otros receptOres de Jos Jagos, AJ com- -~ la capacidad de unión al DNA de estas proteí). se pueden definir las funcio nes de cada h élice: • Los contactos entre la hélice 3 y e l DNA se basan en pu entes de hidrógeno q ue se realizan entre las cadenas de aminoácidos y las posiciones expuestas de los pare!. de bases. Esta hé lice se encarga de reconocer la secuencia específica de DNA diana y, por lo tamo, también se le conoce como hé lice

de reconocimie n to. • Los contactos que se establecen entre la h élice 2 y el DNA adquieren la forma de puemes de hidrógeno que se conectan al esqueleto de rosfato. Estas interacciones son necesarias para la unión pero no controlan la especificidad del reconocimiento de la diana. Además de estos comacws, una gran parte de toda la energía de la interacción con el DNA la proporcionan las interacciones iónicas con el esqueleto de fosfato. ¿Qué sucede si se manipula la secuen cia codifiJOt a para constr uir una n ueva proteína al susti·ta hélice de reconocimienlo en un represor con ecuen cia correspondiente de un represor qu e ·elacione de cerca? La especificad de la proteína dda es la de su nueva hélice de reconocirnjenro.

:tcuencia de aminoácidos de este cipo de región deina las especificidades de secuencia de las proteínas ...:iduales y puede acwar en conjunto con el resto de la :tJa polipeprídica. muestra los detalles de la unión de dos proteínas que se unen a secu encias J~A similares. El represor A y la proteína ero Lie- una organización similar en el elemento hélice· hélice, aunque sus especificidades individuales é el DNA no son idénticas: • Cada proteína utiliza interacciones simila res emre Jos aminoácidos hidrófobos para m antener las relaciones entre Ja hélice 2 y

la hélice 3: el represor tiene u na conexión Ala-Val y Cro tiene una asociación Ala-Ile . • Los aminoácidos que se encuentran en Ja hélice 3 del represor forman contacros con bases específicas en el operador. Tres aminoácidos localizados en el represor reconocen tres bases del DNA; los aminoácidos que se encuentran en estas posiciones, y rambién en otras posiciones de la prmeína Cro, reconocen cinco (o quizá seis) bases en el DNA. Otros dos aminoácidos que participan en el re conocimiento específico son idénticos en el represor y en Cro (Gin y Ser en el extremo N de la hélice), en tanto que los otros contactos son diferentes (Ala en el represor frente a Lis y el Asn adicional en Cro) . Además, una Tn·o en la hélice 2 de Cro entra en contacto directo con el DNA. Las interacciones que se mu estran en la Figura 14.2 1 represeman la mtión a la secuen cia de DNA que cada proteina reconoce con mayor firmeza. Las secuencias que se muestran en la par te inferior de la figura con los puntos de comacro en color azul difieren en tres de los nueve pares de bases. El uso de contactO!. superpuestos, pero no idénticos, entre Jos aminoácidos y las bases muestra cómo hélices de reconocimiento relacionadas reconocen secuencias de DNA relacionadas. Esto le permite al represor y a la proteína ero reconocer el mismo conjunto de secuencias, pero con afinidades relativas diferentes por miembros determinados del grupo. Las bases contactadas por la hélice 3 del represor o de Cro se encuentran en una cara del DNA, como puede observarse por las posiciones indicadas en el diagrama helicoidal de la Figura 14.21. Nótese, sin embargo, que el represor hace un contacto más

CRO·OR3

REPRESOR OR 1 'lo

'lo

y..e"'/.cJb

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'VIl <$"u•' 'J

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\]" \\'t

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'

Hélice 3

La

:J ~A

TATCTCTI ATAGGGAAC

Dos proteínas que utilizan la estructura de doble hélice para establecer contacto con el DNA reconocen a los operadores A. con afinidades determinadas por la secuencia de aminoácidos de la hélice 3.

14.12 La hélice de reconocimiento determina la especificidad por el DNA

363

Brazo de hélice f

3

{¡'-'

r_:_,

.r 5

Una vista posterior muestra que el volumen del represor entra en contacto con una cara del DNA, pero sus brazos terminales N rodean el ONA y alcanzan la otra cara.

con la otra cara del. DNA. Al retirar los últimos seis aminoáddos terminales N (los cuales sobresalen de la hélice l ) se eliminan algunos de los contactOs. Esta observación fundamenra la idea de que el volumen del dominio Lerminal N entra en conracto con una cara del DNA, micmras que los últimos seis aminoác~dos terminales N forman un "brazon que se exliende alrededor del DNA por la parte posterior. La muestra una vista desde la parte posterior. Los residuos de lisina que se encuentran en el brazo hacen contacto con los residuos de G localizados en el surco mayor y también con el esqueleto de fosfato . La imeracción emre el brazo y el DNA contribuye de manera imponame a la unión al DNA; la afinidad de un represor sin brazo por el DNA disminuye -1 000 veces. Las bases que no son contactadas en forma directa por la proTeína represora pueden tener un efectO importante en la unión. El represor del fago 434 se une al DNA por medio de un elemento hélicegiro-hélice y la estructura cristalina muestra que las hélices 3 están colocadas en cada mitad de sitio para contactar a los cinco pares de bases externos, pero no a los dos imernos. Sin embargo, los operadores con pares de bases A-Ten las posiciones jnrernas se unen al represor 434 con mayor fuerza que los operadores con pares de bases G-C en las mismac; posiciones. La razón es que la unión del represor 434 tuerce ligeramente al DNA en el centro del operador, lo cual amplía el ángulo entre las dos mitades de sitio del DNA ~3e. Es probable que esto se requiera para permitir que cada monómero del dímero represor haga contactos óptimos con el DNA. Los pares de bases A-T permiten que esta torsión suceda con mayor facilidad que los pares G-C, lo cual afecta la afinidad del operador por el represor.

E

Los dímeros represores se unen en colaboración al operador

Conceptos principales • la unión del represor a un operador incrementa la afinidad de unión de un segundo dímero represor al operador adyacente.

364

• La afinidad es 10 veces mayor por Ol1 y por Oal que por otros operadores, por lo que la unión sucede primero en ellos. La colaboración permite al represor unirse a los sitios 01/02 en concentraciones mas bajas.

CAPÍTULO 14 Estrategias de los fagos

Cada operador contiene tres sitios de unión al repr. sor. Como puede observarse en la ,1 seis sirios de unión al represor individuales no s• idénticos, pero todos se adaptan a una secuencia " consenso. Los sitios de unión localizados en cae. operador están separados por espaciadores de 3 7 bp ricos en pares de bases A-T. Los sitios de ca~. operador están numerados, de tal manera que el oestá formado por una serie de sitios de unión O " OR2-0R3, m.ientras que el o~. está formado por la se"' 0Ll - OL2-0l..3. En cada caso, el sitio 1 se cn cucm~ más cerca del punto de inicio de la Lranscripción en promotor y los sitios 2 y 3 se encuentran más lejos e: sentido ascendente. De acuerdo con la triplicación de los sitios _ unión en cada operado r ¿cómo dedde el represor L donde iniciar la unión? En cada operador. el siti(l tiene mayor afinidad (unas 10 veces superior) q\. los otros sitios por el represor. Por lo tamo, el repn-sor siempre !>e une primero al Oll y al OR l.

El represor A. se une a sitios subsiguientes dentm _ coda operador de manera colaboradora. La presencia

V_

un dímero en el sitio 1 incrementa en gran mecti~..: la afinidad con la cual un segundo dímero puev unirse al sitio 2. Cuando Jos sitios 1 y 2 están OCUJ'IC dos, esta interacción no se extiende al sitio 3. En 12 concentracione) habirualcs de represor observada en cada lisógeno, los sitios 1 y 2 de cada operad' están ocupados, pero el si tio 3 está libre. Si el sitio 1 es desacrivado (debido a una mut.dón), el represor se tme con fines de colaboracit a los sitios 2 y 3. Es decir, la unión al sitio 2 ayuda ono dímero a unirse al sitio 3. Esra interacción oc._rre de manera directa entre los dímeros represor y no por un cambio de conformación en el DKEl dominio terminal C se encarga tanto de la intt"> acción colaboradora enrre los dímeros, como de formaci ón del dímero entre subunidades. La muestra que involucra a ambas subunidacL de cada dímero, es decir, cada subunidad contac: a su contraparte en el otro dímero y se forma u-_ estructura tetramérica. Una consecuencia de la unión colaboradora ~ el incrememo de la afinidad efectiva del repres por el operadm en concemraciones fisiológicas. Es. permite la presencia de una concentración men de represor para lograr la ocupación del operadC'Ésta es una co nsideración importante en un sisterr en el cual la liberación de la represión tiene come

-

S1tio de union de la pol1merasa de RNA PRM - - -

~-:5Ina represora

-reo Ser Met NH2 1\CACGAGUAppp "' o\mdect

--.TGTGCTCATACGTTAAATCTATCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCGTGCGTGTTGACTATnTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC -~CACGAGTATGCAATTTAGATAGTGGCGTTCCCTATTTATAGATTGTGGCACGCACAACTGATAAAATGGAGACCGCCACTATTACCAACG

pppAUG -

RNAmde ero Sitio de unión de la pollmerasa de RNA PR- - +

CAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATCA GTCTATTGGTAGACGCCACTATTTA ATAGAGACCGCCACAACTGTATTTATGGTGJICCGCCACTATGACTCGTGTAGT pppAUCA RNAmdeN

-

Sit1o de unión de la pollmerasa de RNA PL----.

Cada operador contiene tres sitios de unión al represor y se superpone al promotor al cual se une la polimerasa de Se ha invertido la orientación de 01 con respecto a lo habitual para facilitar la comparación con 01 •

El represor en OR2 interactúa con la polimerasa de RN A en el P RM Conceptos pñncipales • la región de unión al DNA del represor en OR2 contacta a la polimerasa de RNA y estabiliza su unión al PR,..

• Ésta es la base del control autógeno del mantenimiento del represor. Cuando los dos dímeros represores de A. se unen :Jlaboraci6n, cada una de las subunidades de un dímero :~ ~ontacto con una subunidad del otro dímero.

=ncias irreversibles. En un operón que coctifica :imas metabólicas, la imposibilidad de reprimir 5Ólo permitirá la síntesis innecesaria de enzimas. embargo, la incapacidad de reprimir al profago rovocará la inducción del fago y la lisis de la .IIa. Por las secuencias ilustradas en la Figura 14.23, uedc observar que 0 1 1 y ORl se encuentran más _en os en el centro de los sitios de unión de la :.merasa de RNA de P1 y de PR. respectivamente. -,o tanto, la ocupación de 0 1 1-0L2 y de OR1-0R2 .;uea en términos físicos el acceso de la polime~ de RNA a los promotores correspondientes.

En la transcripción de el, se observa una relación difereme entre OR y el promotor PPM' El sitio de unión de la polimerasa de RNA es adyacente a OR2. Esto explica la manera en la que el represor regula de forma autógena su propia smtesis. Cuando dos dímeros están unidos a O"R I-OR2. el dímero que se encuentra en OR2 interactúa con la polimerasa de RNA (véase la Figura 14.26 de la sección 14.15, El represor mantiene un circuito autógeno). Este efecto reside en el dominio amino terminal del represor. Las mutaciones que eliminan el control positivo se mapean en el gen el. los miembros de una clase interesante de mutames mantienen la capacidad de unirse al operador para reprimir la transcripción, pero no pueden estimular a la polimerasa de RNA para que transcriba desde PR....,. Se mapean entre un

14."4 El represor en OR2 interactúa con la polimerasa de RNA en el PR"'

365

dio de una interacción electrostática con una regi básica en la polimerasa de RNA. La ubicación de estas "mULaciones de com: positivo" en el represor se indica en la Se encuentran en un sitio localizado en el repres que esrá cerca de un grupo fosfato del DNA, el et también está cerca de la polimerasa de RNA. F lo tamo, el grupo de aminoácidos del represor q participa en el control positivo se encuentra en t..:' posición que le permite entrar en contacto cor polimerasa. El principio importante es que las in Las mutaciones de control positivo identifican una región minúscula de la hélice 2 que interactúa de manera directa con la polimerasa de RNA.

..................

LISOGENIA •

•• 1

•••• 1

••••• •

••• •

dfmero represor

..

t monómero represor

.. ..

OLIPL

RNAmdeN

..

la pollmerasa de El represor tmpíde ANA se une a Pm., que la polimerasa de y 1ranscrtbe el ANA se una a PR CICLO LÍTICO

t

La pallmerasa de RNA inicia en Pt. ANAm deCro

La lisogenia se mantiene por medio de un circuito autógeno (sección superior). Si este circuito es interrumpido, el ciclo lítico comienza (sección inferior).

pequeño grupo de aminoácidos que se localizan en el exterior de la hélice 2 o en la vuelta que se encuentra entre la hélice 2 y la hélice 3. Las mutadones reducen la carga nega(iva de la región; por el contrario, las mutaciones que incrementan la carga negativa intensifican la activación de la polimerasa de RNA. Esto sugiere que el grupo de aminoácidos constituye una ''zona ácida" que funciona por me366

CAPÍTULO 14 Estrategias de los fagos

El sitio diana de la polirnerasa de RNA que co tacta el represor está en la subunidad cr70, der.· de la región q ue h ace co ntacto con la región del promotor. La in teracción entre el represor' polimerasa es indispensable para q ue la polimer.; efectúe la rransición de un complejo cerrado a complejo abierto (véase también la Figura 14. 31 Esto explica la manera como los niveles bajos_ represor regulan en forma positiva su propia sín-sis. Siempre que haya suficiente represor para ller· a On2, la polimerasa de RNA continuará transCi' hiendo al gen el de PRM'

El represor mantiene un circuito autógeno

RNAmdecl

El represor omplde que la palimeresa de ANA se una a PL

acciones proteína-proteína pueden liberar energía qlh aprovecha para ayudar a iniciar la transcripción.

Conceptos principales • La unión del represor a gen N del PL.

ol bloquea la transcripción de

• La unión del represor a O~ bloquea la transcripción de ero, pero es indispensable para la transcripción de el. • Por lo tanto, la unión del represor al operador bloquez la entrada al ciclo litico al tiempo que faci lita su pro¡:-, síntesis.

El represo r se une de manera independiente a dos operadores. Tiene una sola función en OL2, pt tiene funciones dobles en OR. Éstas se ilustran er región superior de la En Ov el represor tiene el mismo tipo de efe.:que se analizó en muchos otros sistemas: imp que la polimerasa de RNA inicie la transcripc' en PL. Esto detiene la expresión del gen N. P utilizado en todos los episodios de transcripción los genes tempranos a la izquierda; como resulta.. esta acción impide la expresión de toda la unidad transcripción temprana a la izquierda. Por lo La

el ciclo lítico es bloqueado antes de que pueda prosegz. las fases posteriores a la etapa iemprana. En OR 1, la unión del represor impide el uso PR. De este modo, ero y los otros genes tempra.r a la derecha no pueden ser expresados. (Más a

e se analizará porqué es importante impedir la de ero durante el mantenimiento de la

r~sión

;o;!nia.) 5in embargo, la presencia del represor en OR L orro efecto. El promotor de la síntesis del re"'l r, PRM' es adyacente al operador ORa la dere- Resulta que la polimerasa de RNA P'tede iniciar

Ot1

ro:

N

--+

_;nera eficiente en P RM sólo cuando el represor está ·:-a OR. El represor actúa como una proteína

- _¡adora positiva necesaria para la transoipción ~en el (véase la sección 14. 14, El represor en :. ~ meractúa con la polimerasa de RNA en dPRM). "!71resor es el producto del gen el; por lo tanto, esta .Jcción crea un circuito autógeno positivo, en el cual


-Jpia síntesis continua. ::.a na turale:t.a de este circuito de control explica :aracteríslicas biológicas de la existencia lisogé-<.. La lisogenia es estable debido a que el circuito .ontrol garantiza que siempre que el nivel de -esor sea adecuado, habrá una expresión conti: del gen el. El resultado es que o~. y OR perma ...en ocupados de manera indefinida. Al reprimir ~-cada lítica completa. esta acción mantiene el .Jgo en su estado inerte.

Las interacciones de colaboración incrementan la sensibilidad de la regulación ~ellos

principales

.')S dímeros represores unidos a OLl y a OL2 interactúan :on los dímeros unidos a OR1 y a OR2 para formar :,ctámeros. La formación del octámero aproxima Ol3 a OR3' y permite ~>teraccion.es entre dímeros unidos a dichas regiones. S-tas interacciones de colaboración incrementan la 5ensibilidad de la regulación.

interacciones de colaboración entre los dímeros

:esores tienen lugar en el operador izqu ierdo y d operador derecho, por lo que su condición -nal cuando están ocupados por el represor es t : dímeros en los silios de unión l y 2. En efec:ada operador tiene un tetrámero de represor. embargo, éste no es el fin de la historia. Los tetrámeros interactúan entre sí para formar un _·mero. La interacción ocurre entre los dominios - .inales C. los cuales pueden formar un octámero .o una estructura cristalina. la muestra la cüstribución de los re: ores en los sitios operadores que están ocupados J.n lisógeno. Los represores están ocupando OL 1, - ORl y OR2, y el represor ubicado en el último de

En el estado lisogénico, los represores unidos a OL1 y a 012 interactúan con aquellos unidos a Dal y a OR2. La polimerasa de RNA se une a P~, (el cual se superpone a OR3) e interactúa con el represor unido a OR2.

OL3

OL2

OL1

.J:!...

"' ...., ... r "'

OL3 y 0«3 se aproximan por la formación del octámero represor y un incremento de la concentración de represor permite que los dímeros se unan a estos sitios e interactúen.

estos sirios está interactuando con la polimerasa de RNA, la cual está iniciando la transcripción en PRM" La interacción entre los dos operadores riene múltiples consecuencias. Estabiliza la unión del represor. lo que permite al represor ocupar operadores en concentraciones más bajas. La unión a OR2 estabiliza la unión de la polimerasa de RNA en PRM' lo cual permite que concentraciones bajas de represor estimu len de forma autógena su propia producción. El DNA localizado entre los sitios OL y OR (es decir. el gen el) forma un lazo extenso. el cual se man tiene unido por el octámero represor. El octámero aproxima a los siti os OL3 y OR3. En consecuencia, dos dímeros represores pueden unirse a estas sitios e interactuar entre sí, como se muestra en la . La ocupación de Oa3 impide que la polimerasa de RNA se una a PRl>' y, por lo tanto, desactiva la expresión del represor . Esto muestra de qué manera la expresión del gen el se hace en extremo sensible a la concentración del represor. En las concentraciones más bajas, forma el octámero y activa a la polimerasa de RNA

14.16 Las interacciones de colaboración incrementan la sensibilidad de la regulación

367

en una regulación autógena positiva. Un incremen to de la concentración permite la unión a OL3 y a On3 y desacüva la transcripción en una tegulactón autógena negativa. El umbral de los niveles de represor necesarios para cada uno de estos episoclios se reduce por las interacciones de colaboración. lo cual hace a todo el sistema regulador mucho más sensible. Cualquier cambio en el nivel de represor desencadena la respuesta reguladora apropiada para restaurar el nivellisogénico. El nivel global de represor se ha reducido (unas tres veces con respecto a l nivel que sería necesario si no hubiera efectos de colaboración) y como resultado hay menos represor que tiene que ser eliminado cuando se hace necesario para inducir al fago. Esto incrementa la eficiencia de la inducción.

Los genes cii y ciii son necesarios para establecer la lisogenia (onceptos principale.s

• Los productos de los genes tempranos retrasados cii y clli son indispensables para que la polimerasa de RNA inicie la transcripción en el promotor Pw cll actúa de manera dí recta en el proniotor y ciii protege a di de la degradación. La transcripción a partir del PRE provoca la síntesis del represor e incluso bloquea la transcripción del gen ero.

El circuito de conrrol para mantener la llsogenia plantea una paradoja. !.a presencía de la proteína represora es indispensable para su propia síntesis. Esto explica cómo se perpetúa la condición lisogénica. Alwra bien. ¿cómo comienza la síntesis del represor en primer lugar? Cuando un DNA A entra a una nueva célula hospedadora, la polimerasa de RNA es i'ncapaz de

t

t

""' -... el

Proteína Cll

Polimerasa de RN~ /.

--

... ~

PAMPfiOR ero

PAE

La síntesis del represor se establece por la acción de La proteína cii y de la polimerasa de RNA en PR< para iniciar la transcripción que se extiende desde la cadena antisentido de ero hasta el gen el.

368

CAPÍTULO 14 Estrategias de los fag os

transcribir el gen el debido a que no hay represor que le ayude a unirse a P'Rf-.1• Sin embargo, esta misma ausencia de represor significa que Pt y PR están disponibles. Por lo tanto, el primer suceso después dt: que el DNA A. infecta una bacteria tiene lugar cuando los genes N y ero se transcriben. Después, pN permite que se extienda la transcripción. Esto permite que. clli (y otros genes) sean transcritos e n el lado izquierdo, mientras que el! (y otros genes) son transcritos en el lado dered1o (véase la Figura 14.14). Los genes el! y clll comparten con el la propiedad de que las mutaciones en ellos dan lugar <> placas claras. No obstante, hay una diferencia. Los mutanres el no pueden establecer ni mantener la Jisogcnia. Los mutantes e]{ y eJTf tienen ciertas dificultades para establecer la lisogenia, pero una vez que se ha establecido, son capaces de mantenerla por medio del circuito amógeno el. Esto implica que los genes el! y elll S<)n reguladores posüivos cuyos productOs son necesarios para un sistema alternativo para la símesis de represor. El sistema es necesario sólo para iniciar la expresión de el y superar la incapacidad del circuito autógeno de comenzar la síntesis de novo, No son necesarios pa ta la expresión continua. La proteína cli actúa de manera directa en la expresión génica. Entre los genes ero y ell se localiza otro promotor denominado PRE" (El subíndice "RE' significa repressor establishment, establecimiento de! represor.) Este promotor puede ser reconocido por la polimerasa de RNA sólo en presencia de la protefna en, cuya acción se ilustra e n la La proteína dl es en extremo inestable in vivo, debido a que es degradada coroo resultado de !a actividad de una proteína hospedadora denominada HflA. La función de cUI es proteger a ciT contra esta degradación. La transcripción a panír de PRE facilita la lisogenia de dos m aneras. Su efecto directo consiste en la u·aducción de el en la proteína represora. Un efecto ·indirecto consiste en que la transcripción prosigue por el gen ero en la dirección "incorrecta'' . De es1e modo, la región 5' del RNA corresponde a un transcrito antisentido de ero; de hecho, se l1ibrída con el RNAm ero auténtico, el cual inhibe su traducción. Esto es importante porque la expresión de ero es necesaria para entrar al ciclo lítico (véase la sección 14.20, El represor ero es necesario para la infección lltica). La región codificadora el en el n·anscrito Pnese traduce de manera muy eficiente, en contraste con la traducción débil del transcrito PRM " De hecho, ei represor es sintetizado con una eficacia unas siete a ocho veces mayor con la expresión a partir de PR: que de PRM" Esto hace evidente el hecho de que ei

·.mscrito PRe tiene un sitio eficiente de unión al bosoma, mientras que el transcrito PRM carece de :io de unión al ribosoma y en realidad comienza n el codón de iniciación AUG.

..,_ _.,. Unión de Cll sola Unión conjunta de Cll y pollmerasa

Un mal promotor requiere proteína cii

- -_¿--·

-50 -40 -30 -20 -10 , ~10

Conceptos principales El promotor PR 1 tiene secuencias atípicas en -10 y en

Punto de inicio

- 35.

la polimerasa de RNA se une al promotor sólo en presencia de cll. di se une a secuencias cercanas a la región -35 .

:::promotor PRE se aj usta mal a la secuencia de con;::'USO localizada en la posidón -10 y carece de una ~cue ncia de consenso en - 35. Esta deficiencia exilca su dependencia de cll. In virro, el promotor no c~ede ser transcrito por la polimerasa de RNA sola, ero puede ser traducido cuando se agrega cU. El :-guiador se une a una región que se extiende más menos desde -25 hasta -45. Cuando se agrega po•nerasa de RNA se protege una región más, la cual -: extiende desde - 12 hasta + 13. Como se resume :tia , las dos proteínas se unen a sitios Jperpuestos. La imponanda de las regiones -35 y - 10 para - fundón del promotor. a pesar de la carenda de cmejanza con el consenso, la indica la existencia _,e las mutaciones cy. Estas mutaciones tienen efecs similares a los de las mutaciones cll y cllf en la >hibición del establecimiento de la lisogenia; no Jstante, actúan en cis en vez de hacerlo en trans. .e clasifican en dos grupos, cyL y cyR, los cuales se caJizan en las posiciones de consenso - 10 y - 35. Las mutaciones cyL se localizan alrededor de -:o y es probable que impidan que la polimerasa e RNA reconozca al promotor. Las mutaciones cyR se localizan alrededor de -35 y se dividen en dos tipos, uno que alecta la ~nión de la polimerasa de RNA y otro que afecta .;. unión de la proteína cU. Las mutaciones localiza-~s en el centro de la región no afectan la unión de -:I; al parecer impiden la unión de la polimerasa e RNA. A ambos lados de esta región, las mutacio.es que se presentan en repeticiones teuaméricas - lrtas, TIGC, evitan la unión de ciT. Cada base del ·-:rrámero está separada lO bp (una vuelta de hé.:e) de su homólogo en el otro tetrámero, por lo ~.!e cuando cii reconoce los dos tetrámeros, ésta se =ncuentra en una cara de la doble hélice. El control positivo de un promotor implica que :1a proteína accesoria ha incrementado la eficiena con la cual una polimcrasa de RNA inicia la

Secuencia habitual en-35 TTGACA

Secuencia habitual en -10 TATAAT

GCAACGCAAACAAACGTGCTTGGTATACATTOATAAAGGAATCTA CGTTGCGTTTGTTTGCACGAACCATATGfAAGTATTTCCTTAGAT

.. -

Mutaciones cyR

Mutaciones cyl

• unión de la polimerasa afecta la unión de cll

unión de la polimerasa

La polimerasa de RNA se une a P.E sólo en presencia de el!, que entra en contacto con la región localizada en la posición -35.

Promotor

REGULADOR Un16n de la polimerasa Conversión cerrado-abierto (constante de (constante de equilibrio, K8 ) velocidad, k2) represor

ningún efecto

Cll

tOO;(

1tx

1oox

la regulación positiva puede inftuir en la polimerasa de RNA en cualquier etapa del inicio de la transcripción.

transcripción. La indica que una o las dos etapas de la interacción entre el promotor y la polimerasa pueden ser el objetivo de la regulación. La unión inicial para formar un compleJo cerrado o convertirlo en un complejo abierto puede intensificarse.

La lisogenia requiere numerosos sucesos Conceptos principales " el! y ciii provocan que se establezca la síntesis del

represor y también desencadenan la inhibición de la transcripción de los genes tardlos. El establecimiento del represor apaga la expresión de los genes tempranos inmediatos y retrasados. • El represor activa el circuito de mantenimiento para su propia síntesis. El DNA A. se integra al genoma bacteriano en la etapa final del establecimiento de La lisogenia.

lo\, • tJ La lisogenia requiere numerosos sucesos

369

t e/11

l

IL

N

'\.cv;)..0..h\..

ETAPA TEMPRANA INMEDIATA

t

el

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N y ero son transcritos

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IR

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ETAPA TEMPRANA RETRASADA

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el

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r !!SfJi:h\.f' ero~

el/

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ESTABLECIMIENTO DE LA LISOGENIA 1

t

cll actúa en PRE: el es transcrito 1

el

m

N produce antiterminación; el/y el// son transcritos

~"5:.~'-r.!<Jl\.~

r..._r.:v.J rv:, (. ero ~

el/

MANTENIMIENTO DE LA LISOGENIA PL/OL ·,r. : i:fAJE.C:~

-

f

el

t

':\_CU1J:tr

PRM '

- _, .'\:~

PRI OR

El represor se une a Ol y a OR: el es transcrito desde P AM

Para establecer la lisogenia se requiere una cascada. pero este circuito es desactivado después y es remplazado por el circuito autógeno de mantenimiento del represor.

Ahora se puede ver cómo se establece la lisogenia durante una infección. La recapitula las etapas tempranas y muestra lo que sucede como resultado de la expresión de los genes clll y cll. La presencia de cll permite que Pru; se aproveche para extender el transcrito a través de el. La proteína represora se sintetiza en grandes cantidades a partir de este transcrito y de inmediato se une a ol y a OR. Al inhibir en forma directa la transcripción a partir de Pt y PR. la unión del represor apaga la ex presión de todos los genes del fago . Esto detiene la 3 70

CAPÍTULO 14 Estrategias de los fagos

síntesis de cll y de ciii, las cuales son inestables; ~ e degradan con rapidez, lo cual ocasiona que PRE y: no pueda ser utilizado. Así, la síntesis del represor¿ través del circuito de establecimiento se detiene. No obsta nte, ahora el represor está presente er OR. Éste activa el circuitO de mantenimiento para k expresión de P¡¡M· El represor continúa siendo sintetizado, aunque al nivel más bajo típico de la funció:r de P RM. Por lo tanto, el circuito de establecimiem inicia la síntesis de represor en un nivel altO. Lueg<. el represor desactiva todas las demás funciones a

no que acüva el circuito de mante nimiento, el _ íunciona en el nivel bajo adecuildo para man· ~;la lisogenia. En este momento no se abordarán con detalle _emás funciones indispensables para establecer -Jgenia. pero se subrayará de manera breve que '\A A. infeccioso debe ser insertado en el genoma ::eriano (véase la sección 19.17. La recombina- especializada comprende sitios espeáficos) . La .,_:dóo necesita el producto del gen mt, el cual se !'esa desde su propio promotor P1, en el cual ram- es necec;aria la proteína dl . La secuencia de P¡ •be homolog(a con la de PRE en el sitio de unión JI (aunque no en la región -10). La~ funciones __ esarias para establecer el circuito de controlli.,.l!nico se encuentran, por lo ramo, bajo el mismo NA del fago al genoma bacteriano. En conse :ncia. el est.a blecim iemo de la Jisogenia está bajo control q1.1e garantiza que todos los episodios Jispensables rengan lugar en sincronía. Con énfasis en la cualidad [ruculenta de lacas _..Ja imricada de A, ahora se sabe que cll facilüa la genia de otra forma indirecta. Respalda la transpdón a partir de un promotor denominado P •nii·CY .:ual se localiza en el gen Q. Este transcrito es una crsión amisemido de la región Q, y se híbrida con RNAm Q para impedir la traducción de la proteína cuya sfntesis es esencial para e1 desarrollo lítico. r lo tantO, los mismos mecanismos que facilitan e: modo directo la lisogenia aJ provocar la transcrip5n del gen represor el también ayudan de manera -ctirecta a la lisogenia al inhibir la expresión de los _enes ero (véase ames) y Q, los genes reguladores ecesarios para la ruta lítica antagónica.

El represor Cro es necesario para la infección lítica Conceptos prinripale.s Cro se une a los mismos operadores que el represor, pero con afinidades distintas. ~ Cuando Cro se une al sitio OR3' impide que la polimerasa de RNA se una a PKM y bloquea el mantenimiento del represor. • Cuando Cro se une a otros operadores en OR o en OL, impide que la polimerasa de RNA exprese los genes tempranos inmediatos. lo cual bloquea (de forma indirecta) el establecimiento del represor.

Lambda tiene como alternativas entrar en lisogcnia o comenzar una infección líttca. La lisogen ia se inicia cuando se establece un circuito de mantenimiento autógeno que inhibe la cascada lítica com-

pleta al ejercer presión en dos puntos. El programa para el establecimiento de la lisogenia pasa por algunos de los mismos episodio~ necesarios para la cascada lítica (es necesaria la expresión de los gene~ tempranos retrasados a través de la expresión del gen N). Ahora surge u n problema. ¿Cómo entra e: Iago al <:1clo Lítico? La influencia clave en el ciclo lítico es la función del gen ero, el cual codifica orro represor. Cro sr encarga de evitar la sí11tesis de la proteína represora; esta acción elimina la posibilidad de establecer la lisogenia. Los mutames ero suelen establecer la lisogenia en vez de entrar a la ruLa lítica, debido a que carecen de la capaddad de desviar Jos sucesos y alejarlos de 1a expresión del represor . Cro forma un dímero pequeño (la subunidad es de 9 l
:4.20 El represor Cro es necesario para la infección lítica

3 71

ETAPA TEM PRANA INMEDIATA

t '-

N yero son transcritos

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ETAPA T EMPRANA RETRASADA PRE

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el/ y e/11 son

transcritos

~

CONTINUACIÓN DE LA ETAPA TEMPRANA RETRASADA

t

Cro se une a - OL yaOR

ETAPA DE EXPRESIÓN TARDfA

el/

Cro reprime a el y a todos los genes tempranos; pQ 1 activa la expresión f tardía

PR'

La cascada lítica necesita la proteína Cro, la cual impide de manera directa el mantenimiento del repre.sor a través de PRM' así como la desactivación de la expresión de los genes tempranos retrasados, lo que impide de manera indirecta el establecimiento del represor.

La afinidad de Cro por OR3 es mayor que su afinidad por OR2 o que por ORl. Por lo tanto, se une primero a OR3. Esto inhibe la unión de la polimerasa de RNA a PRM' Como resultado. la primera acción de Cro es impedir la participación del circuito de mantenimiento de la lisogenia. Después Cro se une a 0 112 o a ORl. Su afinidad por estos sitios es similar y no hay efecto de colaboración. Su presencia en cualquier sitio es suficiente para impedir que la polimerasa de RNA utilice PR. Esto a su vez detiene la elaboración de los produc3 72

CAPÍTULO 14 Estrategias de los fagos

tos tempranos (incluso Cro). Como resu ltado de l.: inestabilidad de cll, se inhibe cualquier uso de Pa= Así, las dos acciones de Cro juntas bloquean toda la producción del represor. En cuanto al ciclo lítico, Cro inhibe la expresión de los genes tempranos (aunque no la elimine por completo). Su efecto incompleto lo explica Sü afinidad por ORl y por OR2, la cual es unas och• veces menor que la del represor. Este efecto de Crc no ocurre hasta que los genes tempranos se har: vuelto más o menos superfluos, debido a la presen-

de pQ; en este momento. el fago ha comenzado expresión de los genes tardíos y se concentra en la ducción de la progenie del fago.

Cro y el represor se expresan en la etapa temprana retrasada El represor actúa sobre

Oly sobre 0 11

¿Qué determina el balance entre la lisogenia y el ciclo lítico?

t

: ~Eptos pñncipales

c/11

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..a etapa temprana retrasada cuando Cro y el represor

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cll actúa enPRE

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PfiOR CIO

:stán siendo expresados es frecuente en la lisogenia y en el ciclo lítico. :l episodio determinante ocurre si cii provoca la síntesis suficiente de represor para superar la acción de Cro.

, programas de la rUla lisogénica y de la ruta :a se relacionan tan de cerca que es imposible .decir el destino de un genoma fágico individual '!ldo entra a una nueva bacteria hospedadora ¿Se "lverá el antagonismo entre el represor y ero al ablecer el circuito de mantenimiento autógeno e se muestra en la Figura 14.32, o al desactivar mesis del represor y entrar a la elapa tardía del .arroUo que se muestra en la Figura 14.33? En ambos casos se sigue la misma ruta hasta "'lamento de la decisión. Las dos rutas implican expresión de los genes tempranos inmediatos ~ extensión en Jos genes tempranos retrasados. __ jiferencia entre ellos radica en la pregunta de tn obtendrá la ocupación de los dos operadores, ·epresor o Cro. La fase temprana durante la cual se toma la de)n tiene una duración limitada en ambos casos. importar cual ruta siga el fago, la expresión de os los genes tempranos será interrumpida, dado -: P~, y PR son reprimidos y, como consecuencia a desaparición de cii y de clli, la producción del resor a través de PRr. cesará. La pregunta dctcrm.iname es si a la interrupción .a transcripción desde PRI le sigue la aclivación de y el establecimiento de la lisogenia. o si Pn.va es ..:.:~paz de activarse y el regulador pQ obliga al fago ~esarrollo lítico. La muestra la etapa ~cial, en la cual el represor y Cro están siendo :eti7..ados. El episodio inicial en el establecimiento de la -genia es la unión del represor a o.. 1 o a ORl. La . Sn en los primeros sitios es seguida con rapidez , la unión colaboradora de más dímeros represoa OL2 y a OR2. Este suceso desactiva la síntesis de - e inicia la síntesis del represor a través del P~~>..,1 • El episodio inicial en la entrada al ciclo lítico es .!rúón de Croa OR3. Esto detiene el inicio en PRM circuito de mantenimiento lisogénico . Después,

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el/

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Cro actúa sobre OL y sobre o,.

la lfsogenla requiere que el represor ocupe o~. y OA

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El ciclo Htico r equiere que Cro ocupe OL y 0 11 c/11

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la etapa determinante cuando se decide entre lisogenia y lisis tiene lugar durante la expresión de los genes tempranos retrasados. Si el! provoca la síntesis suficiente de represor, habrá lisogenia porque el represor ocupa los operadores. Oe otro modo, Clo ocupa los operadores, lo cual da como resultado la expresión del ciclo lítico.

ero debe unirse a ORlo a OR2, y a 0 1.1 o a OL2. para inhibir la expresión de los genes tempranos. La suspensión de la producción de clT y de cm cond uce a la interrupción de la síntesis del represor desde P1!E . El establecimiento del represor se desactiva cu ando las proteínas inestables cUy cTII son degradadas. La influencia determinante sobre el cambio entre lisogenja y ciclo lltico la ejerce la proteína cll. Si ésta está aniva, la síntesis del represor desde el promotor de establecimiento es eficaz, y como resultado, el represor logra ocupar los operadores. Si cii está inactiva, el establecimiento del represor fracasa y ero se une a los operadores. Los niveles de proteína el! bajo cualquier circunstancia panicular determinan el resultado de una infección. Las mutaciones que incrementan la estabilidad de cii aumentan la frecuenda de la lisogenización. Dichas mutaciones ocurren en el gen en o en otros genes. La causa de la inestabilidad de cTI es su susceptibilidad a la degradación por las proteasas hospedadoras. Su nivel en la célula lo determina clll y las funciones hospedadoras.

1-'.ll ¿Qué determina el balance entre la lisogenia y el ciclo lítico?

3 73

El e tecto de la proteína ciD de A es secundario: ayuda a proteger a cll contra la degradación. La presencia de ciii no garantiza la supervivencia de cii; sin embargo, en ausencia de clll, di es desactivada casi siempre. Los productos génicos del hospedador aCLúan en esta ruta. Las mutaciones en los genes hospedadores hflA y hflB incrementan la lísogenia (hfl significa higl! frequent)' lysogenizacion, lisogenizadón de alta frecuencia). Las mutaciones estabilizan la proteína dl porque desactivan la proreasa o las pro· teasas hospedadoras que la degradan. La influencia de la célu la hospedadora sobre el nivel de cii ofrece una ruta para que la bacteria interfiera en el proceso de las decisiones. Por ejemplo. las proteasas b.ospedadoras que degradan a en se activan por crecimiento en un medio rico. De esta manera . A. tiende a \isar las célu las que crecen de manera adecuada, pero es más probable que entre en lisogenia en las células sometidas a escasez de n utrientes (las cuales carecen de los componentes necesarios para un crecimiento lítico eficiente) .

E

Resumen

Los fagos tienen un ciclo de vida lírico, en el cual a la infección de una célu la hospedadora le sigue la producción de un gran número de partículas fágicas. la lisis de la célula y la liberación de los virus. Algunos fagos también pueden existir en forma lisogénica. en la cual el gcnoma del fago se integra al cromosoma bacteriano y ~e hereda de esta forma latente, e inerte. como c ualqu ier otro gen bacteriano. En general. la infección litica se divide en tres fases . En la primera un pequeño nümero de genes del fago es transcri to por la polimerasa de RNA del hospedador. Uno o más de estos genes es un regLIIador que com rola la expresión del grupo de genes que están activados en la segunda fase. El parrón se repite en la segu nda etapa, cuando un gen, o más, constiLUye un regulador necesario para La expresión de los genes de la tercera fase . Los genes de las dos primeras etapas codifican las enzimas indispensables para reproducir el DNA del fago; los genes de la última fase codifican los componentes esrructu· ralcs de la panícula fágíca. Es común que los genes muy tempranos estén apagados durante las etapas posteriores. En el fago A, los genes están organizados en grupos cuya expresión es controlada por episodios reguladores ind ividuales. El gen temprano inmediato N codifica un antiterminador que permite la tran scripción de los grupos a la izquierda y a la derecha de los genes tempranos retrasados a partir de l os promotores tempranos Pa y Pt. El gen temprano 3 74

CAPÍTU LO 14 Estrategias de los fagos

retrasado Q Llene una función de antiterminac simHar que permite la transcripción de todos genes tardíos desde el promotor PR.• Se reprime ciclo lítico y se mantiene el es tado lisogé nico la expresión del gen el cuyo producto es una ¡; teína represora que actúa en los operadores e o~. para impedir el uso de los p romotores PR ) respectivamente. El genoma de un fago lisogér:::. expresa sólo el gen el desde su promotor, P R.\!. transcripción desde esre promotor comprende t regulación autógena positiva, en la cual t'l reprt:: unido a OR activa la polimerasa de RNA:en PRM. Cada operador está formado por tres sitio~ unión para el represor. Cada siüo es pa lindrórr.. y está forma do por m itades de sirio simétricas. :. represor funciona como un d ímero. Cada mitad sitio de unión es contactada por un monómero :-presor. El dominio terminal N del represor contk un elemento hélice-giro-hélice que entra en coma to con el DNA. la hélice 3 es la hélice de reconc miento y se encaiga de hacer comactos espeátil. con los pares de bases localizados en el operad La hélice 2 interviene en el posicionamiento dt hélice 3; también panidpa en el contacw de la:limerasa de RNA en PRM. El dominio terminal e necesario para la dimerización. La inducción es pvocada por la división entre los dominios termin""' C y N, la cual impide que las region es de uniór DNA funcionen de forma dimérica, Jo que red~ su afinidad por el DNA e imposibilita el mame... miemo de la lisogenia. La unión represor-operad es de colaboración, de tal manera que una vez q un dímero se ha unido al primer sitio, un segun dímero se une con mayor facilida d al sitio ad cent<:. El elemento hélice-giro-h élice es utilizado potras proteínas de unión al DNA, como la protel Cro del Cago A.. Esta última se une a los mismos or radores, pero tiene una afinidad d iferente por _ sitios operadores individuales, que está determina· por la secu encia de la hélice 3. Cro se une den: .. nera individual a los sitios operadores, comenzar.~ con OR3, en una forma que no es de colaboradoEs indispensable para cominuar por el ciclo lítk Su unión a OR3 impide primero la síntes is del T.;: presor desde p'AA\' y luego su unión a 01<2 y a e evita la expresión continua de los genes tem pranl un efecto también observado en su unión a Ot : a Ot2. El establecimiento de la sfmesis del represor:'. quiere el uso del promotor P11 F., el cual es activa por el producto del gen cll. El producto del gen, · es necesario para estabil izar el producto cll y prot~ gerlo conlra la degradación. Al apagar la expresic de cll y de cill, la proteína Cro impide la lisoge11;.;.

.iesactivar todas las transcripciones excepto la de propio gen, el represor impide el ciclo lítico. En -~infección particular, la dedsión entre lisis y Ii_enia depend~ de la ocupadón de los operadores .: el represor o por Cro. La estabilidad de la pro!!a cll en la célula infectada es un determinante -mordial del resultado.

=ferencias La cascada lítica es controlada por dos tipos de sucesos reguladores - :ulo de revisión .enblau, J., Noclwell, J. R., and Mason, S. W. (1993). Transcriptional antitcrrnination. Nature '364, 401-406. Los genes A tempranos inmediatos y tempranos retrasados son indispensables para la lisogenia y para el ciclo lítico de revisión ·hne, M . (2004). Tlle Genetic S1VItch · Phaye Lambda Revisited. Cold Sprlng Harbor. NY· Cold Spring Harbar

-·~e

Press.

La lisogenia la mantiene una protelna represora - :~los de investigación - ,lla. V.. Chadwick, P.. and Pta~hne. M. ( 1970). Active form of rwo coliphage repressors. Nature 227, 41-44. -~me, M. ( 1967). lsolation tlf the lambda phage repressor. Proc. Natl. Mad SCI USA 5 7, 306-313 . hne, M. ( 1967) . Specific binding of the lambda phage repressor tu lambda DNA. Nalltrt 214. 232-234. El represor y sus operadores definen la región de inmunidad -te de revisión .dm<~n, D. l. and Gottesman. M. ( 1982). Lambda 11. Cambridge, ¡\1A. Cell Press, La forma de unión al DNA del represor es un dímero - :ulo de invesligactón <J, C. O. and Lcwis, M. (1982). Thc operator·binding domain or lambda repressor: structure and DNA recognition. Nature 298, 441-447.

E

la hélice de reconocimiento determina la especificidad por el DNA

Ar iculos de · 'Ve~tigac i ón Brennan, R. G. et al. ( 1990). Prorein-DNA conformational changcs in thc crysLal structure ot a lambda Crooperator complcx. Proc Natl Acad. Sci USA 87, 8165-8169.

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m

los dímeros represores se unen en colaboración al operador

1\rtículos dt> investigación Bell. C. E., Frescura, P.. Hochschild, A.• and Lewis. M. (2000). Crystal structure ollhe lambda repressor C-tcrminal dornain provides a modef for COOj)Crativ.e operaror bindlng. Ce/1 1O1, 801-811 . Johnson, A. D., Mcyc1. B. J., and l'tashne, M. ( 1979). lnteractions bclwecn DNA-bound repressors govern regulation by thc phagc lambda reprcssor. Proc. Nat/. Acad. Sci USA 76, 5061-5065.

m

El represor en OR2 interactúa con la polimerasa de RNA en el P-'4

Ar' tculos de i vestigación Hochschild. A., Jrwin. N.. and Ptashne. M. (1981). Reptessor structurc and tbe mechanism of positive control. Ce/l32, 319-325 . Lt, M., Moyle, H., and Susskind, M. M. ( 1994). Target of rhe rranscrijHional activation function of phage lambda el protcin. SCience 263, 75- 77.

m

Las interacciones de colaboración incrementan la sensibilidad de la regulación

fuente de revisión Ptashne, M. (2004). The Generic Switch: Phage Lambda Revisiud Cold Spring Harbor. NY: Cold Sprlng Jlarbor Prcss.

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El represor utiliza un elemento hélice-giro-hélice para unirse al DNA _..;ulo de investigaci0'1 _.;er. R. T. et ¡¡l. ( 1982). Homology among DNA-binding proteins suggests use of a conserved super-secondary structurc Nature 298. 447-451

Referencias

375

El replicón ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción los replicones pueden ser lineales o circulares Una regiór¡ replicada aparece como un e>jo dentro del DNA no replicado En el O"'gen htoa una horquilla de replicación y después se dPspla7a de torma secue<1cial por e! Dt.A. La rephcacion es untdu'l'ccional cuando se crea U"a sola horquilla de rep~rcadón en or origen. La replicación es bidirt>ccional cuando !..n origen C'l!a dos horquillas de u~pllcaoon oue se desplazan en d~recciMcs opuestas.

Es posible elaborar el mapa de los orígenes con autorradiograña y electroforesis • El dPsplazamicrlo de ta horquilla de replicación puede detectlrsf' por medio de autorradiogralia utili zando pu.sos radioac~vos.

Las horquillas de rephcacrón crean estrJct-.ras e~ forma de Yque a te•an la mtgracíón electtoforetica de los fragnentos de ONA.

¿Regula la metilacion del origen a la iniciación? on'C contiene 11 repeticiones ~:¡~ que están met•ladas en la adc11ina e11 ambas cadenas

la replicación produce UNA hemimetilado, el cual es incapaz de iniciar la replicación. Hay Ull retraso dP 13 mi n antes de que las repeticiones ~~;~_sean JIH!lilddas de nuevo.

los ongenes pueden ser secuestrados después de La replicación SeqA se ..me al ONA iemímet'lado y es recesa•ia :>ara el retraso de la replicac·on. SeaA puede interactuar con OnaA. Puesto quto los orlgenes est.art tte'llimetilados. se u1en .. 1a memora r:a cetuldr y en ocasiones 10 están a dlsposlcló" de las metilasas. la naturaleza de la conellión entre el origen y la membrana aúu 110 es clara.

Cada cromosoma eucariótico contiene numerosos replicones los re;Jiicones Pucanotlcos tienen una longitud de 40 a lOO leo.

Un cromosoma se divrde en ~umerosos replicones. los replicones indivtduali~s se ac:ivar e'l momento\ carattermcos d~rante ,a fase S. Los patrones de acrlvació~ regional suJjieren oue los replicones cercanos entres' so., activados al mismo tfempo.

376

En las levaduras pueden aislarse los orígenes replicación los oñgenes de S. cereviSioe son secuencias cortas ri tientn una secuencia esencial de 11 bp. El ORC es ur complejo de seis proteínas que se une a

A· que

.4RS.

El factor de competencia controla la replicac eucariótica El factor de competenoa es indisoensable para la 111' de la repl cacion en cada origen. Estci p•Psente er t>l nücleo antes de la replicación, p~ desactivado o destruido por WJ replicación. la inidarión de otro ciclo de replicación es posible • de~pues de aue el fac:or de competencia entra de nL núcleo de~puh de la mitosis.

El factor de competencia está formado por prote\nar. MCM • El ORC e~ un complejo de proteínas que esta asoc1a ongenes de las le11aduras durarte lodo el ciclo celll.S Cdc6 es una pooleina inestable que se sintetiza s61o • Cdc6 se unP al ORC y permite la unión de las procelr

MCM. • Cuandu ta replicación se intcia, las proteínas Cdc6} MCM so•1 dcsplaladds. La degradación de Cdc6 impic.. reinidacion. Algunas protelnas MCI4 ~e encuentran en el nilcleo el ciclo, pero otras pueden entrar sólo después de 'a mitosrs.

OIIID Los lazos D mantienen a los oñgenes mitocondriales Las m1tocondrias uti 1zan diferentes secuencias de para tnicia r la rep.JCadón de cada cadena del ONA. • La repucac•ón de la cadena H i<1icia en un tazo O ..a replicctcinn de .a cadena L inicia cuando su orig~­ expuesto por el movimiento de la primera horquilla rcp!itcttlón.

Resumen

Introducción uen~ un :.olo cromu.¡nm{l (como en Las u v.uios (como en las t>ucanota~). el ge-

..élula OU!c;)

.omplcto debe !>{'r replicado preoc;ameme una cada divic;ión celular ¿De qué mJnt:ra se vincu,¡~udio de la re1Jii<:atión <.On d rielo celular? _ utilizan clos conceptos ~encr;lle~ pnra com, 1 esto do de rcplicadüu cnn la condidón del "Lular: • lA iwcwaón de lt1 rep/i(dW;II dt l DNA obliga a la ctenor Ocsdr e te punto de vi,ta, ll numero de descendientes que genera una céluJa está determinado pur una serie de deci<:iones en cu,m 10 a inki,or o no la replicadón dtd DN /\. F.)tcl se controla en la etapa de la ini ci<~ción. Una va r¡11e la rrplfmdon rw comenzado. continúolzasta cJt4e SP lwya duplicado el genomn comp!No. • Si la rcplil:adó11 pro,igue, no ~e puede permitu que ocurra la divbion comiguicnte hasta que la replicación haya c;ido comp1etadil Dt· hecho la conclusion de la replicacton puede desencadenar la dt" i!>tOn celulrH. Orc;p11ec;, los genomas duplicados son ~egr~Mado~ NI c..aúa et·lula hija. La utudad de segrcgadón es el cromosoma. • las procarima!>. 1.1 illici tit'ne lugar un solo ~e rcplicadon se denomma replicón. Cada re., se acliva" una '>ola vc7.. )Oio una, en cada ddo ~r. El replican se define por poseer los elcmcn1os nrrot m·n·-.arios para la replicación. Tie11e un :.~n en el cual se inicia la n~plkadcm . Asimismo. e tener un término en e-1 cual se detiene la reión. -ualquicr !>t::cuencia adherida a un origen o. ammo~ má~ precisos, no !.t parada de un ori!')ua un t<.'nnmo se replica como pane de ese .:ón. El ongen es un sitio dt· ac1uauón co us. 1 ck alntar <;Óio a la molcwla de 0).A en la reside.

1La l.'oncepcion original del r~plicon (en las procanot.Jsjlo vi'>ualitaha como una umdad que poseía el origut J el gen que cod1fiCil la proteina regula dora. Sm embargo. t·n la auualidad. en los cromosomas t'Ucanolicos, el Lérmino · replicón· se aplica en gen<'rcr {Odili{ddd..., en cualquier otra parte.) El genoma rle una célt:la prOl•ll iot1ca CC'IIJo;úwye un solo n plicon· por Jo tanto, las unidades de replicación y de segrl·gaci6n coinciden L1 u11ciacion en 11n '>010 ong<.•n prOtnUt'\'C la repJiCc\CIOn del genoma completo. w1n ve7 en cada diviston relular. Cada baucria haploide contiene un ~olo cromosoma, por lo que este tipo dt- nmtrol dt' n ·plit:aciótl .,e denomina de una sola co pia . Lils bil<.tf:' ti.:ts rueden COntC' II Cf n t ~ .. itt[Om1adón ge-netica en Id forma de plásmidos. Un pltismida e~ un _qmm1u~ t7!110110mn dt ONII G1rntlm t(llt co11.W tuve w1 replrcón mcl~pr11dlmh' (véase la figura JIJ .2). 1!1 repü-

cón de un pl,hmido puede ~l·r l0111rolt~do ror una sola copia '" que stgnif1ca que se replica una sola vez cada Vt'Z QUt' ;e replka t•l ti omo'>orna bacteriano, o purde estar bajo comrol de copias mú l tip l es. cuando e!>ttl presente: ell uu numt·ro de copias rnayor que el cromosoma baCLeJiano. (.ada lago o D:'-:A dt- lo' virw. filfnhien ron,títuye un replicón y, por lo Lanto. es capaz. de imdar numero~as veces dura me un l·tclu iule<.< ioso. Qui1.i una mejor manera de tnnc;¡derar un replicón procariótico. por lo tamu, ser.1 tnvt nir la definición: cu,1fqt11er moleLLtla de DNA qu,•<(lttrt.?IIL'lln origen pued~ ser repli.-adtt de fonna 11utonvma m la Ldula . En la n.·plic,ocion se observa tma cliferencia fun damental t'll l bacterianos y eucarióticos. Cada cromosoma eucariótico comitme un gra n!l tí lnt:ro tlr rt[lliwnv~: por lo tan LO, la unldacl de segregación Incluye muchas uni dades dt• rcp lkacióll. F.~ tu agrl'ga ot rd tlin1ensi6n al problenM del comrnl : todos los replicones que se CJ1tllentran en un cromosoma dt•hrll <;er activados dmante un ciclo cclular. Sin ~mt'targo. no <;e activan de manerhton debe ser acti' ado en un periodo bastante prolongado y ,·ada tmo debt set ortm1d,1 no más d( una l't:Z m rada ~1clo celular. AlgWla señal debe distinguir entre los replicones replicado-. y luc; 110 rcpli( ado~ rara garantizar que los replicone<; no se aCiiven una segunda ocasión. Numerosos replicones ~on dt 11vaclos de manera independiente. por lo que debe exlstü otra señaJ que indil(Ut' t'lltloutt:nlu t'll d t ual 'e ha wrnplclado el proceso de la replicación de todos los teplicones Ahur., ~t· ha comt·u:.radu a r~un i r información sobre la construcción de los repli cone~ individuales, peru tuda vía !.t' lit: nt· poca inrormctuün ~obre la re1~. 1 lnlroducción

37 7

1nci6n que n.bre entre ellos. No se sabe si el patrón de repllcacióll el. el mhmo en cada ciclo celular ¿Se utilizan o;iemprc todos los orígenes o algunos son silcnll''> t n a lgunas ocasiones? ¿Los orígene~ siempre st: activan en el rni'>mO orden? Si hay diferentes ripoc; de- orígenes. ¿qué los distingue? F.n contra te con los cromosomas nucleares. los cuales son com rolados por una sola copia, el DNA de las nutocondnas y de los cloroplasLos puede ser regulado mác. como plasmidos que exisren en cop1a~ mulliplcs pot bacteria. Hay numerosas copias de cada DNJ\ de loe; mganelos pOl célula y el control de su n:plitaüón dcbl' relacionarse con el ddo celular. En 1odos estos sistema~. la cuesüón fundamental es rlellni1 las c;ecuencias que fu.ncionan como orígent:s y drrcrmínar cómo son reconocidas por las prou:-ínas adecuados del mecanismo ue replicación. Sl' ccmtiCIIZi'l pur considera r la construcción básica rle los re¡.¡licones y las diversas fo rmas que adqui~.;rt>n; Jespué-; de la consideración del origen, ~e plantea la pregunta de cómo la replicación del genoma o;c coordina con la división bacteriana y que se ~ncarga dr \~'g regar los genornas a la bacteria hija.

Los replicones pueden ser lineales o circu lares Conceptos principales Una región replicada aparece como un ojo dentro del DNA no replicado. En el origen inicia una horqui\la de replicación y despues se desplaza de forma secuencial por el DNA. La replicación es unidireccional cuando se crea una sola horquilla de replicación en un origen. • La replicación es bidireccional cuando un origen crea dos horquillas de replicación que se desplazan en direcciones opuestas.

ONAno replicado

Ojo de replicación

Una molecula de ONA comprometida en la rep caciñn tiene dos tipo<; de regiones. La nntt•stra t)Ul' ~uando se observa el O ·A en TCL ccJdón mcdiJnte miaoscopia electrónica. la regi rcplitada dparne como un ojo de repU cadt. tkntro del D\A no replicado. La región no rer cada conslSll' en el dúplex progenitor; éste se al en Id regwn replicada en donde se han formado

doc; dúplex lujo~. E:l ~ilio donde tiene lugar la replicación c;c .. nomina hor quilla de replicación len ocasioi también se k coruxc romo punto de crecimie to ). Una horqurllt1 de rtplicacion se desplaza de for .tPcutmcutl por 1!1 DNA desde su punJo de inicro en 1'1 ge11. 1.;) ori¡.!cn putdc aprovecharse para comen.: 1(1 replkaci6 n unidireccional o la rel)licadt. hidireccional. OJ ti.po de c¡Ji:wd io está determina por la lormnción de una o de dos h orquillas d<:> ret' cndón t!tJ t:l origen. En la replicación unidlr<'cdot una horquilla de replicadón abandona e l orige.¡ continúa por t•l DNA En la replicadón biuirecc nc1l, ~" lunndtt dos horquillas de replicación; ésta al<'¡an tlel ongen en direcciones opuestas. La aparicrón del ojo de replicación no disí' gue l'nln? replicación unidirecdonal y bidirecl naL Como se ilustra en la • el ojo pu representar rualquicra de las dos esrructuras. S genera por rnc-din uc repücación unidirecdona

REPLICACION UNIDIRECCIONAL

DNAno replicado

Aspecto

REPLICACIÓN BIDIRECCIONAL ORIGEN

Horquilla de rephcacion ..,._

Horquillada

_,..

repr~Cación

Estructura molerular

El DNA replicado se observa como un ojo de replicación flanqueado por DNA no replici!do. 378

CAPÍl ULO 15 El replicón

Los replicones pueden ser unidirecciona ~ bidireccionales, según la formación de una o de dos horq_ de replicaclon en el origen.

!"Cpre" ·nta un ongen fijo }' una horquilla de cadón movible. !:>i se ~enera por replkación bi~til.lllal.

t.•l ujn tl'prl·~ t·nta un pdr de horquillas ephcacwn En CUJiqu1e1 ca~o. el avance de la ladón expande: el OJU ha,t.l que tc.rmina por

car LOdo d n·plicón. Cuando un replicnn es ciJ culat. la presenda de ~O forma la t'SITU\:1\lf
Es posi ble elaborar el mapa de los orígenes con autorradiografía y electroforesis Conceptos principal~ • El desplazamiento de 1.:~ horqui.la de rephcación puede detectarse por med1o de autorradiografia utiüzando putsos radioactivos.

las horquillas de replicación crean estructuras en forma de Yque alleran la migración electroforética de los fragmentos de DNA.

Estructura de repfteac•On 11

----

Apanencta de la estructura 6 por med•o de m•croscop1a electrón•ca

Un OJO de rept!cac16n forma una estructu-a

=' A circular.

e err

la can tidad de horquilla~ de repllcaCtótl que hay en un ojo tic n.:pl il .1< ión put.•til' Llt'lc•ru¡indl'sc dt: dos formas. La clt:ccion dl.'l rn~.:todn c!C'per1de de qu e el DNA sea una molt.>nda delinitla o una región no identificada tk un ¡.¡t·nomil r elu iM. Con 11na lltlllécula lineal deflniJa se puecie uti hzar microscopia electrónica pJra medir !a distancia entre cadJ l"\ln·nw del njo ~ el e'lrcmo dt•l DKA ) luego tOmpa1ar las poc;iclones de lo~ exnemos de los OJOS en ta., molécuiJs qu~ tienen OJOS t.fe diferentes tamaiiu~ S1 1" replicatidn l.!> unidlrectronal sólo uno de lv~ exlremo.. se moveta: el orro es el origen liJO. S1 la rephca<"JÓn t·~ bidírecdonal. ambo!> se desplazaran· el or1gen es el punto medio enrre ellos. Con rernones no dd'tntdas de genomas exren sus !>t' puedt·n utilíl'ar du!i pul-.o~ de radioactividad sucesivos para etiquetar el d~~plazamiemo de las horquillas de &t•plil.tuón i un pttl~otiene una eti quera más inten"a que ~1 otro. pueJen cU.stinguirse por las imensidJde!i rdariva!> del etiquetamiem o.

Rt=PLICACIÓN UNIDIRECCIONAL

REPLICACIÓN BIDIRECCIONAL

Et•Queta oe dens1dad pesaaa (mcorporaoa pnmero)

El ojo de replicación se agranda a medtda que norquillas de replicación prostgu~:n po1 el replicón. Nót~se

hace mas gtande que l.'l ~egmento no replicado. dos lado~ del ojo pueden definirse porque ambos tie'len -.isma longitud. Fotografía cortcsra de Bcrnard Hirt, Swiss -ritute for Experimental Canccr Research (15REC).

Et•c¡ueta oe densidad l•gera (lllCorporada en segJndo lugar) S•n ettqueta (invtSible en la autorradrograha)

~e. Hojo .. se

Pueden utilizarse diferentes densidades de eticuetamiento rad•oactwo para distinguir entre la replicación unidireccional y la replicación bidireccional.

l!U Es posible ela borar el mapa de los ortgene~ r.on ilttlntrildiog!afia y electroforesis

3 79

Y simple

Y doble

ButbLija

Burbuja asimétrica

--< >--< --o- --o-< >--< -o- -o -< >-< -o- __._ -< __._ >< e:>

El tamaño del fragmento se duplica durante la replicación

U~oro,

~~~

•.---...-r.t:'r.l

~~~~

dlmenstón exagera la contribución de la forma de tres dimensiones

1~ 2 kb

2 kb

\ C)

2kb

1 kb

1 kb

1 kb

1kb

--

-

La primera dimensión separada por masa___.

La posición del origen y el número de horquillas en replicación determinan la forma de un fragmento de restncción en replicación, la cual puede deducirse por su ruta electroforética (línea continua) . La linea punteada muestra la ruta det DNA lineal.

DNA

DNA

me!liado

hemimetilado

1111

GAT C CTA G G AT e CT AG

Metllasa Dam

Replicación

GA TC C TA G ~

la replicación del DNA melilado origina DNA nemimetilado, el cual mantiene su estado en los sitios GATC hasta que la metilasa Dam restaura la condición metilada por completo.

Éslas pueden visualizarse por medio de a u torradiografía. La muesrra que la replicación unidireccion al hace que a una etiqueta le siga la otra en un exrrerno del ojo. La replicación bidirecdonaJ product> un patrón (simétrico} en ambos extremos del ojo. Este pauóu se observa por lo general en los replicones de los cromosomas ettcarióticos. Un método más redente para elaborar el mapa de los orígenes con mayor resolución se vale de los efecros que úenen los cambios de la forma del DNA sobre la m igración electroforé tica . La ilusu:a la técnica de mapeo bicümensional. en la cual los fragmenros de restricción del DNA en repUcaciótt son sometidos a electroJoresis en una

380

CAPÍTULO 15 El replicón

primera d imensión que los separa por masa y e una segunda dimensión en donde el movirnlen• es determinado sobre todo por la morfología. l diferentes tipos de moléculas en replicación sigut rutas características. medidas por su desviación a la linea q ue seguhía lJna molécula lineal de D.l\ del doble de ramaii.o. Una simple esrructura Y, en la cual una horqui se desp laza por un fragmento lineaL sigue una n. continua . Cuando las nes ramas tienen t1na misf" longitud ocurre un punto de inncxión y la estn JUra se desvía más del DNA hneaJ. Consideracioranálogas determ inan las rutas de las esnucturas
¿Regula la metilación del origen la iniciación?

Conceptos principales

• oriC contiene 11 repeticiones ~~¡~ que están metilada: en la adenina en ambas cadenas. la replicación produce DNA hemimeti lado, el cual es incapaz de iniciar la replicación. Hay un retraso de 13 min antes de que las repeticiont. ~Z~ sean metiladas de nuevo. ¿Qué caracterísúca de un origen bactet·iano (o p;:. 1nido) garant[7-.a que sea utilizado para ini.ciar la plicación sólo una vez en cada ciclo? ¿La iuidac se asoda a algún cambio que marca el origen de manera que un origen replicado pueda distinguf de un origen no repJicado? Algunas secuencias que se uülizan para ~ propósito están incluidas en et origen. oriC con: ne ll copias de la secuencia g~¡~, la cual es t.. diana de metiladón en la posición N° de la aden; por la meLilasa Dam. La reacción se ilustra er: Antes de la replicad6n, el siúo diana palind. mico es metilado en las adeninas de ambas cade1 La repUcación in sena las bases normales (no mt

as) en la'> radt>nas hija'> F-.w genera DNA he."'letilnd o. en el Ulal una ca de na c~ra meúlada 1tra nt>. 1•or Jo tanto. lcJ r~plicaoon wnviene JOS diana Dam de metil.lllo<. por completo a 'lJetilados . ..Cual "" la conc;e, t c.: 11n.1 de 1.1 replirauón? La ~.1dad qut IICrll' un pl,hrrudu con base en criC .pli<:<use en E ..~11 dm11 dependt> de su estae mct ladón. el pl.l!>rnJdo esta metilado se "le a una ..uta ronda dt! n:pltc;JCiOn y después '"oducros hemuut•tilados s~ acumulan. como se Por lo tanto. tan origen ::1be rn 1.1 metiladn no puede usar'c para imcíar un rielo "plic.Jcit>n. -=:sro sugit'H' do:;

explicddon~); la iniciacion e requerir la ntt•tilildon completa de los silios .,:¡ Dar n en el origen iJ pul'de se r inhibida por la :metilant3n de estos ~iLios. La ultima posibilidad -,_e ser[.;¡ corrt'll" porque un url¡.¡en de DNA no _ado put•clc tuncimMI de manera eAcicme. ...st, los ,,n¡.¡t.:m•s hemirut'lllados no pueden inilt nuevo hd">I.J que la metiiJc;a Dam los haya ~lornlJdo ~n oligl'IH'' lllt'tlladoc; por wrnpleto. tios GATC localizados en Ll 011gen permanecen rnetiJadn<; -1 3 lllln despue.. eh: la replicacion argo pt>riodo no ec; h.tbitu.U porque t'!J lo~ sirios :e ríp11..us lll CHcJiqUlcr •1lln luga1 dl"l genoma. --,e!IIJcion COffill'fl/,1 ue inmediato (<1.5 mini Jés dt· 1.1 rt phtarion 01 ra re~Jón actüa como d promotor dl'l gen .tna.Jl tantbit!n muesua reante' dt que comtttln' 1.1 remetilac10n -=1 prommor dt.·l gen dlla1l l'Stara reprimido '1Lras t~te hemuneulado. lo cual rt'duce el arvel proltllhl DnaA Por lo tantO, el ongen está e y la prodrtuiún ue !el pnllelllJ inícladora crue'í reprimida durrliH<: este periodo.

Los orígenes pueden ser secuestrados después de la replicación ' Wnct>ptos principale~ 5eqA se une al DNA hemimetilado y es necesaria para é retraso de la replicacion. 5eqA puede int~ractuar con OnaA. ~esto que los orig~nes e~tára hemimetilados, s~ nen a 'J membrana telul.lr y en ocasiones :10 ~ta1 a '.:1spos1cion de Las met1laws. .a naturaleza de la conex1on entre el oñgen y La ~embrana aun no t!S clara.

se deb~ el r~rraso dt la remetiladón en oriC dnaA? La explita<JÓil mas probdbie es que esta!>

... 11e

... ones son '\l'lllt'Stradas t•n una lorma en la cual inaccesibles J I,J 111 enlaso1 Dar n.

~~

Repllcae~on ~f)\:!J

!

~/

Metrtasa Dam

Ongenacllvo

Or1genes 1nactrvos

!

~ Ongenactlvo

Solo los origenes mctilados pot completo pueden iniciar la replitctcibn; tos orlgenes hijos hemimetilados no pueden utilizarse de nLtcvo hasta qoe hayan rccupe1ado su estado de metilación completa.

Un cirLUIIo tn,argado dl· wntrolar la r<::utitizalion de k1s otigenr' ~.:'>identificado por rnutadone!> en el gen lftl l. Los mutan"~' reducen t•l retraso de la rcJ aenlacion rn l,,.¡c_ y en d11aA. C'f)mo resultado, iniCJn 'it·q;\ no uent- especifiddad por la secueiH ia (lt'tC ~· paret t' probable que ésta sea etlnlerida por la pmte:>at1tl DnaA. bto explicaría las ínteraccíonr~ gt!nénca~ entre J~qA y drwA. LJ hemintl'litación de Id:, ~~cuencías GATC del nr igrn t·~ indis ¡wn~allle para ~u d~ocíadó n con la mernbra 11.1 ibilidad es que la ac;odanon a la memhmna tt:nga que ver en el control de la dll" ltlstro de lm ungenes, o dtr<'Cla por la rnlul>iuon de la n•atciun por pane dt> algún lOtnponente en la membrana . Lac; propini,Hfes tlt> la rr .'ll"ción de la membrana sugH!ren cue mcluye componemt'::. que regulan la re:plicaonn Un lnh1bador ob!>et vado ttl esta fracdón n,rnpirt> crm la pro rema Dn.1A Lste inhi!Jidor puede llllpt'dü la llllci.1dt>n dt' la rqJiilJdon sólo si es

15.5 los odgenes pueden ser secuestrados despue!> de la replicación

381

GATC III NNNNN.bol CTAG NII!NtHlNrt

GATO NNNNN-NN CTAG NNNNNNN

G A TC NNN N NN N CT AG NNNN.NNN

El inhibidor unado a la membrana se adhtere al DNA hemtmetilado

El ONA es metitaoo

de nuevo y ~bera aJ tntllbtdor

Ona A se une a onC

Un lnhibidor unído a la membrana se adhiere al DNA hernirnelilado en el origeu y puede f-uncionar al impedi1 la unión de DnaA. [s liberado cuando el DNA es rnetilado de nuevo.

agregado ancec; que la proteina DnaA a un sistema

m vuro hlO '-llgit'n· t'l motlc'o que se mue'iLra ~n la . en el cual el inhibidor reconoce de ma-

nera t•specíth.•, t'l L>NA hemimerilado e impide que 'e lllltl la pmtetna DnaA Cuando el D::-fA e<; medIado de nuevo. el inhibidor es liberado y la proteína

Dn ver wn el cumrol de la replicación. La extcn..tón complera del sistema udliz.ado para cootJolar In teioiciadón no es clara, pero es po~tbll.' q11t: partit'ipt•n numerosos mecanismos: el '>ecuc~tro r!$ico del origen. el retraso de la remetiladon. la inhibición ele la unión de la proteína DnaA y la n: p r<.>silln d" 1.'1 lt'.tn~nipci6n Jet gen dnnA. No c., cvidcmc cuál de esws episodios ocasiona los demás, y si sus cfccws en la iniciación son directo~ o i ndi rtt'lo~ .

Aún 'e Jebe resolver el rema cenual de cuál caracu:rí,tica Lil'ne t' I encargo [undamemal de sincronit.ar Jo, o;u(.esos. Una posibilidad es que la adhesión a la membrana ocurre en la iniciación y que sea nele~ario ell'll'ianthk ck alguna estructura extensa para hherar e l DNA El periodo de secuestro parece aumentar con la longuud del dclo celular, lu cual sugiere qut' rdl<.'ja de mdnera indirecta el reloj que control,, la reinidauón. Como unico imegrame del mecanismo d~ replltaciCJn indi,pcn ablc
CAPITULO Eí El replicón

ciación, pero que cu,mdo se combinen logren resultado e~pt'rado. Algunas muLadunes en eJ g_ dnall provol,111 rc•plicaci<ín asincrónica. Jo cual s gtcre que Dn.aA podna ser el "titulador· o el "relo que mide d número de orígenes en relación con mac;J celular 1a .,obrepruducdou de DnaA da Jug· a n·sulr<.~d<'' c.ouO~tti\'Cl~. loo; cuales pueden vari ctcc;de no tener mngun efecto hasta causar que miciación suceda en una masa reducida. Ha c;ido dutctl iJentificilr ICls componemes pr teínicos que median la adbc~jó n .a lc.1 membrana. t indido di..' que ésta es una lundón de la proteú nnaA lo wn.,tit u y<.' su respuec;ta a los fosfolipid É~to<; ladlitan el inretcambio de ATP con el A-:.unldo u la pro1c1na DnaA. Se desconoce la tundr que tic·ne esto en el e<.mtroJ de la acuvidad Je Dm. (la cual req u ien~ ATP), pero la reat:cí6n implica q es pwbabk que Dnal\ ln tc racnk con la rnembra.=. ¡;Sto c,igll iiicnríu quí' ntáo; r!C' un episodio Lienc q Vt'l t•n la a~odacion a la membrana. Quizá un gen ht·rninwtilauo e'ité unido al inhibidor asocia a la nwmhra11.1, pero cuando el origen se me tila r complctn, el inhibidor es desplazado por la protel!' DnaA ,1.,odada a la rneml>rana . e;¡ OnaA \ '!o t•l miciaclor que desencadena un _ do de rcplttaoon. el -;ucec;o pnncipal seria su ac mulacH)n etl el origen en un nivel critico. No hvanactom•s oclicas en la expre~ión o en la concctración globJJ d~ la. proteína DnaA. lo cual sugie' qut' los sucesos 1<.1cale., deben ser los responsabl PaJa qut> ~ea auiva en la iniciación de la replicaár DnaA cJd,t> l.'tlWlliJ'arsc en e c1ué 'omrola la croooloE. de la reaotvadón dl· l¡¡ prmcína DnaA. Otro factor que controla la disponibilidad DnaA en el origen es la competenda por unirla ntroo; m ios del DNA. En panicular, uo Jocus den minado dnt tiene una gran concenrradón de siL de union a la prolt!Ína DnaA. Se le une unas oc veces más DnnA que al origen. La delcción dehan• que la íniuat ron tKurra con mayor frecueno E!)to rt•duc.c dt· rnarwra Significativa la cantidad DnaA tli-;pnntble p.ua el origen, pero no se sabe a cxactiLud qué funcion pueda tener en el conrrol la c•onología de la iniciación.

Cada cromosoma eucariótico contiene numerosos replicones :~o, principales

replicones eucarióticos lienen una long1tud de 40 a kb. cromosoma se divide en numerosos replicones. , replicones individuales se activar en momentos ~cter1sticos durante La fase S. ~ patrones de actwadón regional sugieren que los _~ tcones cercanos entJe st son activados al mismo •"lpO.

""'células eucarióticas la replicacion del DNA :onlina d.:~ a una parte del ciclo u•lul¡¡r. La fase le durar unas cuamas lwras L·n 1111.1 célula euku ~upt'rior. Lareplicacion de lo gran camidad =-~J\ rorntttiu o t'rt un cromosomc1 etrcariórico .!ra al dividirlo en numcro<>o~ r<'plkoncs indh.ti-~. Solo Jlgunos de estos repliconec; panicipan .: replil at ion t.'n un momemo dado de la fase S. .1recer cada replicón es acttvado L'fl un ruomen'lCcífico durilDre la tase ~ aunque lo.:; datos que ~obre t'l tema no so u c.ku~h os . El inicio de la fase S lo ~eñala la ant\ ación de • rimeros replicones. En las poca~ horas "iguien.os episodios de iniciacion tH·n~n lugar en oum eones de manera ordenada ..'Vlucho ele lo que .abe ~olm las propieJadc:~ dt.> los replicones injuales proviene de ~studto~ aulllrrJdtvgráficos rccurn·n en general a los upos de prorocolos ~.rado' en la Figura 1 5 5 y en la figura 15.6. Los eones cromosómico~ suelen rno ..trar rcplicaáón rcccional ¿QuP tan grande es t:l rt'pltcOn promedio y ·mos hay en el genoma? Utld dtlicultad para ~'cribir la unidad lndiv)dual es q ue los replicones ·acenLL''- pttedcn fus i on ar~t' y formar ojos repUvS extemo~. como ~e ilmtra rn lA .rtetodolo~ta utilizada en general para t.Ji,tinguir :re loc; n·plitonc~ individuale~ y los ojos fusioJos consi5te en uttlizar fragmento~ tk D\'A en cuate:. puedan obsen·ar~e numcrosm replicones -:'vos, lapturado5 al parecer en una etapa en la aJ todos han iniciado casi al mi... mo til'tnpo, pero .es ue qtll. se reunan las horquillas de las unidas adyao.:nte!>. En grupos de repliconec; activo!>. l'l t.tmaño proedio tk la unidad se miJe por la distancia que 'Y entre lo-. ongcnes (l'~ decir enue l1JS puntos edios de lo~ replicones ad\ accmec;) la velocidad n la cual )l' dc!>pla7a la horquilla de replicaáón ~cde estimarc;e a partir de la di'ilíUiltcl máxima que .:corren los ra!ltros autc~trad1ográficor, durante un eriodo dttcrmmado.

' Para medir el tamaño del replicón Sl' necesita U1l fragmento de

O~A

en el cual los replicones adyacentes esten activos.

Los replicones mdl\·tduakc; rlc los g~:nomas eucanouco'> suu relau' amente ptm embargo. pueden Vdrldl m a~ d~ lO -veces en longitud dentro de un genoma. la velocidad dt· rep1kadón es de - 2 000 bp/mtn. 1,, cual es muchn mt•nor que la del desplazamktllo dl' la 11on¡mlla de replicacion bacteriana t 50 000 bp1 m in) Por la 'elocidao de repht:auon c-. 1 "idl'nte que el genoma lk un manufero podria replicarse en cerca de l h sttodos los rcpliconc·s lutKionaran de manera !li.mulranea. Sin embargo, la fa'it' <; dura m.:i!. de 6 h en una C('llll.t 'nrrrática típica, lo cual implica que no más del JSoctc-n dl'l DNA. Parece mas prohable que la horquilla de replicación contimk dc~c.le '>ll ougen hasta qul' cncucnm: una 15,6 Cada cromosoma eucc1ri6tico col1tione numerosos 1epliwnes

383

<..ualquitr ,t·gmento de DNA que tenga un origen ddK l'qclr en condidoiiCS Je replicarse; por lo tar· lO, aunque lo" plac.tnidos son muy poco frecuemecn las eucariora.... puede -;er posible consLru.irlos pl medio dr una manqmlaoón apropiada in 1-irro. Es; "" ha logrado t'n Ja, t' \ aduras. aunque no en la

Las ho•quillas de replicación se organizan en loro~

dent•o delnudeo. las células fueror etiquetadas con Brdll. l1 segmento zquie•do de la figura se tFió con yoduro de pmpidio para idenlíficat la masa de ONA. El derecho se tiño con un anticue•po contrc1 BrdU para identificar el DNA en replica· ción. Foluqralla co1tes111 de Anthony D. Mills ard Ron Laskey, Hutchinsun/MRC Rcsearrh Center, Universtty cf Cambridge.

h01quillc1 tlllt' .warn e hMía ella desde el rr:pl icó •~ ad· yaccnt(' Yo ~e h,¡ mencionado el posible problema topológtco dl' unir 1'1 DNA que acaba de r;imetizarsc:: l'll 1-t ut'!On d~ la~ hnrq1.t la< de replicaoón. 1 a p1t·d!'pum.i6n de los rep ·eones vednos a t•.,taJ activo~ de '' .Hterd ~· mu l:anea podría expli<.ar ~ po la pte~encla de conunlec; ~re !f.or~.ale~ • en los cuale> n~ ~IUI'U., de :ep .cune) son- nic:ados de rnodn "'1MS o mt>n<.'" tooroinaéo, al contrario oc un ml"<.cl'lhnto t' l" el c~.:a O) rt>phmnes ir:dividt;ales .,un act.' ado-. l 1111 por uno en áreas dispersa' del gt•nonla Dos ca1 actcristic a e, t·struc:urales s-.tgieren la po:>il.>iliddil dl na organización a gran escala. Rcgiones ba~:illltl' l'Xlt'll'as del nomosoma pueden definir-.t cnmo dt teplicación •cmprana· o "de replicación lill dí"", lo cual implica que hay poca djsemhlill ión de repla:ones e¡ ue• 'e activan en mornentos tem.pratto ~

o tardtm. La visualizacil'ln de las h01qui· lla::. de lepllcacic..lH po r tllcdio de etiquetél n'lit>nt.o con prl.'c..'I IN I\"l'~ de D:-..A id~·1 r tfka de 100 a 300 "focos" en ''ez dt• un.: tiut'lón t111iforme; es ¡.> roba bie que c.·.,dctlorn que se mtH.'Stm en la con1e11· gJ -:> 300 llw q11illa' de :·eplicacion. Los tocos podnan H'JHe~cnta• t'>nucltt 'tl' fi ..,.:; a rravés de las etJale'i debl' mnve1se e DNA en -epllcacién~.

En las levaduras pueden aislarse los orígenes de replicación Conceptos p•íncipales

• los orígenes de S. cerevisiof> son sccue01cias cort3s ricas t>n A l que tlt'n<•n una secuencia esencial de ! : bo. • El ORCes un complejo de seis pwre-nas que se une a

una ARS.

384

CAPlTULO 15 El replic611

eucaricna' c;upcuorés. Tos mutantt'., dl S urewsure puéden ser "LTai' (urmadoo, • 1.11 ' " fenotipo silvt'stre con la adidón .. ONA que mmsportt' una copia silvestre del gen. Jescubrirnit·nto de los ongenes de las levaduras tu· lugar cu<mdo ~e ob~t'rvó que algunos fragmemo!. DNA dt' las kvatluras (cuando forman un órcu. 'IO l1 'apacec; de tran~lormar las células defectutl · con mucha eticir t1ua . EstO'í t:ragmemos pueden ' brevivit' <' 11 la c~lt.t la en c:sta U11 lr11gme tllO 1ransforn1ecu~ncia t.le n·plicación .:tLttónoma). Los elemer ARS c.e derivan de ongt>nes de replicación. Cn lo:> caso-. en los que los clcmemos AR. han m~:~¡wado de mJilt'ra ,¡c;temát.ica en regil crmnosomicas l"\lt:n,as. pJlece que sólo algt.. de ellos l n realidad s~: aprovechan para inid:rephcadón. 1 O'-' otru<, <.on silenciosos o quizá 'ie potd [recuenda. Si es verdad que al!_!'tient'n pwt'ldbihdades variables ck se: lizddos. IJlllptll"O podna baber temtinales fijas e. los n·phcont:~. l:n ec,w laso. una región dada d ctomosoma pnflna c;er replicada desde orígent' into'> ('11 ctc.os ceJulnn:~ dikremes. Un eknwrn o ARS csra1ormado por una re _ rica l'll t\-T que co m ien~ '>tlioc; discretos en lo~ les lao.; mmc1cinne~ ..~rectan el funcionamiem orlgc.:n. Lcl l'W1 1posición dt l>ascs. más que la sec ri.t, puede ser impon
.Jcen C(lll ongene~

cionamlen 1o dl'l origen e~ inhil>ido por coro: por muldrlnnec, en una 1egión "nuclear" de -

denominada dominio A, [a cual comiene t...numtta de cnnsenso de 11 hp fom1ada por pa..~ hac;t''> A-T. Lstt1 'e< ucntla de consenso (en oca.. de11ominacla A(~. 4R~ .-omorsltS stquem:e. sect _ c.k Clmc;enso de: .a \R<;) es t,1 única homo l ogí~ los e•emc:nros ARS conocttlos l.tt'> mutaCJOt1t'' en trt!'í elementos adyaü:" numt:rados B 1 a B 3. disminuyen la fuu áón ~en U11 011gen nuede funcionar de manera con dCJc; demen1n' R tualcsquiera. siempre y e haya 1.1 11 clcnu~mo A lunoonal. (las copias lt·t tac; del CIJn.st:n)O nudea t. que !>Uelen conf en lidnnec; 9/ l L se ubican cerca de, 0

.!
Fase G1 temprana

ORC

1/VA{JY/'\9 Cdc6

.

~···

Después de la replicación, el factor de competencia : que se encuentra en el núcleo es inactivo: el factor de competencia del citoplasma no puede entrar al n(scleo

//V/VIVA

~

,fi\OVNA"\

Qn _.x:

V

FaseS

,NJ'N,

J

La disolución de la membrana nuclear durante la mitosis permite que el factor de competencia se asocie al material nuclear

Fase G2

9VNNA!J

.........................

'Y/:\_

ORC 1

ORC

\!l'\!JY.JfYA.

la división celular genera núcleos hijos competentes para respaldar la replicación

El factor de competencia que se encuentra en -Jcleo es desactivado después de la replicación. Un nuevo :stecimiento de factor de competencia puede entrar sólo ...: -Jo se rompe la membrana nuclear en la mitosis.

erdese que el ORC es un complejo de 400 kD _e se une a la ARS de S. cerevisiae (véase la sección "" - ,En las levaduras pueden aislarse los orígenes o: replicación). El origen (ARS) está formado por secuencia de consenso A y por t-res elementos \'éase la Figura 15.12). El ORC de seis proteí-~ (de las cuales todas son codificadas por genes .cnciales) se une a la secuencia A y al elemento ·acente B l. Se necesita ATP para la unión, pero ! :C no es hidrolizado hasta alguna etapa posterior. ~actor de transcripción ABFl se une al elemento - ~- esto ayuda a La iniciación, pero son los sucesos _e tü::nen Jugar en los elementos A y B 1 los que en -.alidad provocan la iniciación. La mayor parte de orígenes están ubicados en las regiones que se -:cucotran entre lbs genes, lo cual indica que quizá -.: importante para que la estructura de la cromatí..; local esté en una condición no transcrita. La carac1erís tica sobresaliente es qu e el ORC -manece unido al orlgen en todo el ciclo celu ~ No obstante, los cambios ocurren en el patrón ;; protección del DNA como resultado de la unión.

Las proteínas del origen controlan la susceptibilidad a la iniciación.

de onas proreí;1as al complejo ORC-origen. La resume el ciclo de los sucesos que tienen Jugar en el oi:igen. Al final del ciclo celular, el ORC está unido a AEl y genera un patrón de protecdón in vivo similar al que se observa cuando se une al DNA libre in vitro. En términos básicos, la re¡:,rión que atraviesa A-B l está protegida contra la DNAasa, pero bay un sitio b.i.persensible en el centro de Bl. Durante Gl es te patrón cambia, más notablememe por la pérdida del sitio hipersensible. Esto se debe a la unión de la proteína Cdc6 al ORC. En las l evadu ra~, Cdc6 es una proteína muy inestable, con una vida media de menos de 5 min. Se sintetiza durante Gl y suele unirse al ORC entre la salida de la rnitosis y la etapa Gl tardía. Su rápida degradación significa que no hay proteína disponible. después e o el ciclo. En las células de los mamíferos, se controla de rnanera djsti.nta; está fosforilada durante la fase S y como resultado es exportada desde el núcleo. La proteína Cdc6 propordona la conexión entre el ORC y un complejo de proteínas que partidpa en la competencia y en la inidadón. Cdc6 riene actividad ATPasa indispensable para que respalde la iniciación . 15 .9 El factor de competencia está formado por proteínas MCM

387

Cienos mutames de levaduras nospermüen conocer el sistema que controla la disponibilidad Jel facwr de competencia. Las mutaciones que se presernan en el factor de wmpetencia pueden impedir la iniciación de la replicació n. Así es como las mutaciones actúan en la$ proteínas dt mantenirnienLo del miniuomosoma (minirhromosome mnintenance, MCM} 2, 3 y 5. Las mutaciones qu.e ocurren en el sistema que desactiva el factor de competen cia después del inicio tle la. replkación debe n permitir la acumulación de cantidades excesivas de DNA. porque la preseudc. conth1ua de factor de compewncia permiTe que suceda la replicación. Dichas mutaciones se observan en lo" genes que codifican los componentes del sistema de ubiquirjnación encargado de la degradación de cienas proteínas. EsLo sugiere que el factor de competencia puede ser destruido después del irúcio del ciclo de rl"pJicación. Las proLefnas MCM2. 3 y 5 son necesarias para la replicadón y enrran al núc:leo sólo duranlc la mitosis. En las células animales se encuentran homólogos, en donde MCM3 esta unida al material cromosómico ames de la replicación, pero es liberada después de la replicación. El compJej o MCM2, 3, 5 de la célula animal permanece en el nl'1rleo durame el ciclo celular, lo cual sugiere que puede ser un compoHente del factor de competencia. Otro componente, capaz de emrar sólo en la miwsis, puede requerirse para que el complejo MCM2 . 3, S se asocie al material c.ror.wsómico. En las levad u ras, la presencia de Cdc6 en el origen permite que las proreínas MCM se uuan a l complejo. Su presencia es indispensable para que ocurra la inidación en e l o1·1gen. En consecuencla 1 el origen entra a la fase S como un com plejo de prerrepllcación, e l cual contiene e l ORC y las prott>Ínas Cdc6 y MCM. Cuando ocurre la iniciación, Cdc6 y MCM son desplazadas )' e l origen regrt>sa al estado de complejo de posreplicación, el cual contiene sólo el ORC. ta proteína Cdc6 f'S degradada con rapidez duranre la fase S; por lo ranto, no está disponible para respaldar la recarga de las proteínas MCM y, en consecuencia, el origen no puede ser udli.zado para un segundo ciclo de inicia < ión durante la fase S. Si Cdc6 está disponible para unirse al origen dura ni(" la fase G2 (por expresi6n eetópica), las proteínas MCM no se unen hasTa la sigui e nte fasf' G 1, lo cual sugietc que hay LLn mecanismo secundario que garantiza que se asocien a los oríge11es ~óto en el mom<:ntu adecuado. Ésta podlia ser otra parte del comrol de la competencia. Al menos en S. crrevisiae, e~te cout.rol no parece ejercerse en el nivel de la entrada al núcleo, pero ésta puede ser una diferencia enrre las levaduras y las céh..da<; animales. Las prot e ínas MCM2-7 consthuyen un complejo de seis 388

CAPÍTULO 15 El 1eplicó11

miembros en forma de anillo alrededor del D. Algtwas de las proreínas del ORC tienen simili . des co11 las proteínas de replicación que cargan DNA con la polLmerasa de DNA. Rs posible q el ORC uLilice la hidrólisis de ATP para cargar DNA con el anillo MCM. En los ex1ractos de Xe> ¡>tts, la replicación puede iniciarse si el ORC es tlim nado después de que ha cargado las proteínas CG~ y MCM. Esto muestra que la función principal ü ORC es identificar e:l origen a las prmeínas CdcrMCM que comrolan la tniciadótl y la competeno. Las proteínas MCM son indispensables para elongación y para la iJ1idadón. y continúan func nando en la horquilla de replicación. Su panidp ción exaCta en la elongación no es clara, pero u:posibilidad es que contribuyan a la actlvidad de helicasa que desenrolla e l DNA. OLra posibilidad qut' anúctl como Utta defensa avauzacla que aa t:n la cromatina para permitir que una helicasa ; rúe en el DNA.

Los lazos D mantienen Los orígenes mitocondriales Conceptos principales • Las mitocondrias ulilizan diferentes secuencias de origen para iniciar la replicación de cada cadena del DNA

• La replicación de la cadena Hinicia en un lazo D. La replicación de ta cadena Linicia cuando su origeh queda expuesto por el movimiento de la primera horq11illa de replicación .

Los orígentéS de los replicones en los cromosorr eucarióticos y procarióticos son estructuras esta cas: están formadas por secuencias de DNA que s recono!:"idas en su lmma dúplex y son ut ilizad _ para mi dar la replicación en el momenw adccuac La iniciación requiere la sepa rari6n de las cader_ del DNA y el comienzo de la síntesis bidirecc nal del DNA. En las mitocondrias se observa umganización difereme. La replicación comienza en un origen específ ~ localizado en elDNA dúplex circular. Sin embar~ en UJl inicio sólo una de las dos cadenas proge1 oras (la cadena Fl en el DNA mirocondr.ial de ~ mamíferos) sirve wmo molde para la síntesis de u: cadena nueva. La síntesis continúa sólo una dista:cia corta y desplaza a la cadena compañera origin (L) , la cual permanece como cadena individU' como se ilustra en la . La condición esta región da origen a su nombre, lazo de desplr..:

miento, o laz.o D. Las po li mcrasas de DNA no pueden irúciar símesis, sino que requieren uo exrremo 3' con ac

lnyocctón del nuc1e0 al ovocito El DNA en el núcleo ~ene

una densidad

ligera L...

Jj El :>NA so replica en presci1C4a do precursores posados

-

La replicacoo

semiCOnservadora genera D'IA de densidad híbrida

HL

Permeablll7aclón de la envoltura nuclear

El segundo ciclo de replic-.ación genera DNA pesado y DNA hlbndo

U•• nu .eo myectado en un ovocito oe Xeno· pus puede replicarse soto und vez a menos que la membrana nuclear sea pcr01eabilllada para permitir cicles subsigutentcs de replicacion.

por la pn·~cnctd de 1111 reprc~or que impida la repüca · dón repelida en los ongenes que han sido utihzado!l. Las pregtltllas rrudalt:s con respecto a la naturaleza ~te e~ll' sl~ Lt' lltd tegul<~dor son: ¿c.:ómo determina el sistema si un origen pdrt icular ha sido replicado? y ¿qué cnllt iHJIH:ntcs l) roreinicos intervienen? <;e l1a n>nondo ttn ptlco la naturaleza de Jos componentes ptotemicos al utiltzar un sistema en t:l~.ual un D A sustrato experimenta un solo ciclo de rcplic.1cton Loe; O\·ocitm de Xmopustienen todo!> Jo~ componentes necesarios para replicar el D~A (('n l.:~o; pttiiH'ra' hora~ posteriores a La fertiliz.1ción realizan 11 ctdns dt' di\.i'>tÓn sin la expresión dt: glnes nuevos) \ pueden replicar el DNA en un núdeo qul· t•<; lllyrct.ldo al ovocito. I.a resume las caractettcaicac; de t''ite ""'tema. Cuando un espermatozoide o nudeo en imetla-.e "~ mrecrauu a un U\'Ociro. su D~A se replica c;l'l lo l111d vcJ. 1<''1(' cpic;odio puede rastrearse con una etiqueta d~ densidad. del mismo modo que en t•l t'Xpt·rilla>ntn úriginal en e que se definió la re· pli actól1 ~enticons en la 386

CAPÍTULO 15 E.l reolicón

Figura 1. 12) Si t•n ti ovociru se bloquea La síntesis de protctnas. la 11lemhrana alrededor del marerial inyc:crado permanece intacta y el DNA no puede repltcar~e de nuevo. Nn obstame, en presencia de srnu~sis protemica. la membrana nuclear se rompE dd nHsmo 111odo t·orno lo hana en una división ce· lular normal. \' en esLe caso pueden ocurrir cido~ sub!lii<(Utt>Oit'> dt replicación. El mismo resultad pu~de log•ar-.c con agente'> qut: pcrmt:abiticen 1.: membrana ll\JC-Iear. Esto sugiere que el núcleo con· ltl'rlt una ptotttna (o proteinas) indispensable pare. la reJ'llkación que se con-;ume de alguna manet:: por 1111 rielo de replicad6n, por lo que aunque hay¡¡ md~ ptorema l'l1 el ci loplasma del ovodto, ésta s6l puede entrar al núcleo si la membrana oudear rutn iW- Pn principio e l ~is telT\J ptJede ser llevad aún 11\d ~ lejos ~ i Sl" desa1-roll a in vz'lro un extract qtte resp fanor. El factor localizaü t'l1 el ciroplasma puede acceder al material nudc· o;ólo en la ntito~ic; c;ubsiguicnre cuando se rompa ·envoltura nuclear. Este siqema regulador cumr do., prnpúc.itns. Al eh minar un wmponente necesa:de)pues de la rcpllc-alión. in1pide que ocurra más _ un aclo de replicación. También constituye un la. de retroalimemadon que hcKe que la iniciadón de replicacion dependa del pao;o por la división celul<'

Bll

El facto r de competencia est formado por proteínas MCM

Conceptos principales

• El ORC es un complejo de proteínas que está asociado a los orígenes de las levaduras durante todo el ciclo celular. Cdc6 es una proteína inestabl..e que se sintetiza sólo e-Gl. Cdc6 se une al ORC y permite la unión de las protein;,_ MCM. Cuando la replicación se inida, las proteínas Cdc6 y MCM son cesplarada!.. la degradación de Cdc6 impíd~:

la reinimti6n. Algunas proteinas MCM se encuentran en el núcleo durante el ciclo, pero otras pueden entrar sólo despu de la mitosis.

El episodio lundamental en el control de la n::cacion í.''.t Jil act uanón del ORC en el origen. -

o.lad cebadora (véase la sección 18.8, La actividad es necesaria para comenzar la síntesis de . \A). La replicación en el origen de la caúcna H mida cuando la polimerasa de RtxA transcribe .., cebador. Los exrremos 3' son generados en el bador por medio de una endonucleasa que diJ e el híbrido de DNA-Rt A en m1merosos sitios cretos. La endonucleasa es espedfica para la es· --::crura niple formada por el híbrido de D:-JA· BN A as la cadena 1nclividuaJ de DKA desp:azada. Des •és, la polimerasa de DNA extiende el extremo 3' in terior del DNA. En las miwcondrias de los marniferos se encuen· a UJl solo La·w Den forma de una abertura de 500 600 bases. La cadena corte~ que mantiene ellaz.o _ es inestable y se volrea; a m en udo es degradada y 'ltetiza.da de nuevo para rnan1ener la abenura del 1plex en esle sitio. Algunas moléculas de DNA mi·
·ue sirve para iniciar la síntesis de DNA utilizando una ·.rdena com(1 molde. La aben ura del dúplex no siem" re conduce a la in.ídadón de la replicación en la tra cadena. En el caso de la replicación del DNA '1litocondriat los orígenes para replicar las cadenas .::omplementarias se encuentran en localizaciones jiferentes. Loe; orígenes que facil itan la replica· ::ión ele sólo una cadena también se enct1enLran en _a rom1a de replicación del drculo rod<mle (véase la

El cebador de ANA inicia

Inicio de la srntesls de ANA

la replicación en el origen en la cadena H

1 Cadena H 3' 1-- ANA dividido

Cadena l

-

El DNA es sintetizado

1

La síntesis de una cadena L nueva crea un lazo O al d~splazar a la cadena progenitora

' El lazo D se expande

l

Cuando la cadena desplazada pasa al origen en la cadena L, Inicia la slntesls de la nueva cadena H La conclusión de

~Origen de la cadena L

la cadena L nueva libera \os genomas hijos

1

\

La conclusión El genoma liberado es genera un c1rculo duplex parcialmente replicado

La conclusión genera un círculo

dúplex

Se sellan las separaciones de las cadenas nuevas

'

El lazo O montiene una abertura en el DNA mitocondrial de los mamíferos, la cua\ separa los orígenes para la replicación de cada cadena. sección 16.4, Lo5 círculos rodantt'~ prouucen mulú· meros de un replicón).

fD11

Res umen

El cromosoma completo se replica una vez en cada ciclo de d.ivish1n celular. La iniciación de la replicación obliga a la célula a experimentar un ciclo de división; la conclusión de la replicación puede desencadenar el proceso de división en sí. El cro mosoma bacteriano está formado por w1 solo replicón, pero un cromosoma eucarióüco se divide 15. 11 Resumen

389

c11 numerosos replicones que [uncionan duranlt' el prolongddO pc·nocto de la fase S. El problema de re· pllcM loe; exrremos de un replicón lineal se resuelve ~n una vat irdad tlt> formas. con mayor frecuenda al convertí! el repUcon en una forma drcular. Alguno) vin•' tienen prot<:ma!> espedales que reconocen los exrremos Los cromoo;oma" cucariórtcos confrontan este prohlcma en sus replíconec; terminales. El ori~t·n míntmc' de 1:: coli está formado por -.245 bp e tnicia la rephlaoón de forma bidireccional. (ualquu:-r molécula d~ DXA con esta secuenda puede replilar,c en F mil. Dos horquillas de replicaci6n duandoncm d origen y se desplazan alrededor del CIOI11tiSUllla, c1l flilrl'<"f'r hasta que se enruentran,

nLmque se han iclenti.lkado las secul!llcias ter que harín n que lal- llorc..¡uUias rerminaran después; de e-nrcmLr la replicación l>acteria n.t. r o~ origt'IICS !acUitan la replicadón bidireccional y tal vez"' u1ilicc11 t'll un l)rden prcde~erminado durante la fase S. Los ongencs de S. caevisille tienen una setlll'ncia nuclear de consenso formada por 11 pare'> de ha,ec;, en su mayor parre A-T. Despuéc; de la dl\ tsión celular. los núcleos del~ ce! u la' t•ucariouca'> llenen un factor de competeocta indispensable pJra m ietar la replicación. Su destrucdun Jesput's de la iniciaaón de la replicadón impide que ocurran udo~ de replicaaón posteriores c:n las levauuras. el faaor de mmperenáa no puede !>t:f ímpurtddo aiHlll'rlor d~l núdeo desde el dtOplasma y puede ser remplazacio sólo cuando la membrana ntfdl'ul se r0mpe dmante la mitosis. En ltt~ lt'vndu ras, el origen es reconoddo porlas protdnas del ORC. l il~ cua les perm anecen unida:. duran !<' el ciclo celular en las levad uras. La p roteína Cdtó e~tá disponibk !>ólo t>n la rase S. En las levaduras es sintetizada durante la fa~e S y se degrada wu rapitle7 . L:n los células animales se o;imetiza de manera rnntimJ,\, pero l'S exportada desde el núcleo durante la fase S. La pre,enda de Cdcó permite que lac; protl'in,t'i MCM se unan al origen. Las proteínas MCa\ll son indispensables para la inidación. La act..iun dl' lil!. proteína~ Ldc6 y MCM constituyen la lunoóu d~ rompctcncia.

Referencias

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"''"t ""·

ILII

Es pos'ble l?l..lborar el mapa de los oñgenes con autorradiograffa y electroforesis

Artic11\o de investigacion Huhl"rmdll, J .u1d R1g~~. A. O. ti <J68). On tbe mechanicof DNA rcphcauoo m mammalian dli'omo<:omes 1 ,'>4,•/ Ht.,l. l~. 327-l-1 l .

IIJI

Cada cromosoma eucariotico contiene numerosos replicones

Arll< ulo de

rev•~lc10

Fangman w L and Brcwcr. 8 1, !199l).ActlvatJOnol

1eplt\olflon !lrtj¡ln\ whhin yc-ast Rc>v Cr/1 Billl, 7. 375 -402. A1l11.ulo de

chromo~om1:'S, A/11/lt

invec,tlg~tt.iun

Blumcnlhnl, A. 9., Ktit:¡¡sre1n. fl. J,, and Hoguess. D. S ( 1~'1711 ) Tht> ll111l!> of DNA rcplícatlon in D melaHOEJ4 Quant. Rwl. l. 205-.223

chromosmnes. Cold '\prm,q lfar/IClr ~.vmp

En las levaduras pueden aislarse los oñgenes de replicación A1 lUios tle revlSlUII Bcll 'i P and Duna A 12002) o:-.A replicarlon m c.'llkcH)'Ollt tt'JI\ Allllll Ri!l' 8¡o;llem. 11. 333-374. DePamphJ1~ M l tl99ll Eukaryoric O'IA repliratíon: anatomy ol an unKJO. Amw. Rtv Bro-:hm:. 62. Gilbw, D. M. (20011 Ma!dng sense of eukaryodc- ONA rtplicatlon 01 rgim Som.t 294, 96- tOO.

Jarob. F., Drt:nncl !; .md CU1111. r~ula•lon

Los replicone~ pueden ser lineales o circulares

19~3 .

lnhoduc:c10n

o d•

lliJ

n~el

CAPITULO 1S El replic.ón

28, 329- 148

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lE

Los lazos O mantienen los orígenes mitocondriales

Articulo5 dto re•tJs'6n ClaYton. :> r1 1181) Re!>phlC!tJon ul anlm.ll nutorhoudrial D~A .

í.d/21\ n93-70S

Clavton D.. A (1
Sh.1dcl. C.

<, ilncJ U.1yton. O t\ (l
bó, 409-435

ni reph<,JIIon orígins Sdmct19
Referencias

391

Replicones extracromosómicos ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción Los extremos del DNA lineal representan un problema para la replicación • Para replicar la cadena de DNA con un extremo 5' se necesitan arreglos especiales.

Las proteínas terminales permiten la iniciación en los extremos de los DNA víricos .. Una protefna terminal se une al extremo 5' del DNA y proporciona un nucleótido oe citidina con un extremo 3"-0H que ceba a la replicación.

Los círculos rodantes producen multímeros de un replicón • Un circulo rodante genera multímeros de las cadenas de la secuencia original.

Los círculos rodantes se utilizan para replicar tos genomas de los fagos • La protefna cpX A es una relaxasa de actuación en ds que genera drculos de cadena individual a partir de la cola producida por la replicación por círculos rodantes.

liD El plásmido Fes transferido por conj ugación entre bacterias • Un factor F libre es un replicón que se mantie ne en et nivel de un plásmido por cromosoma bacteriano. • Un factor F puede integrarse al cromosoma bacteriano, en cuyo caso, su propio sistema de replicación es suprimido. El facto r F codifica a pili específicos que se forman en la superficie de la bacteria. • Un pilus F permite que una bacteria F positiva contacte a una bacteria F negativa y se inicie la conjugación.

..

La conjugación transfiere ONA de cadena individual •

• • • •

392

La transferencia de un factor F inicia cuando la replicación por clrculos rodantes empieza en oriT. El extremo 5' inicia la transferencia en la bacteria receptora. El DNA transferido se hace bicatenario en la bacteria receptora. Cuando un factor F está libre, la conjugación "infecta" a la bacteria receptora con una copia del factor F. Cuando se integra un factor F, la conjugación provoca la transferencia del cromosoma bacteriano hasta que el proceso es interrumpido por rotura (aleatoria) del contacto entre el donador y la bacteria receptora.

El plásmido bacteriano Ti provoca la enfermeda: de agalla de Crown en las plantas • La infección por la bacteria A. tumefaciens puede transformar las células de las plantas en tumores. • El agente infeccioso es un plásmido transportado por ta bacteria. • El pl~smido también porta genes para sintetizar y metabolizar las opinas (derivados de la arginina) que utiliza la célula tumoral.

El T-DNA porta los genes necesarios para la infección • Parte del DNA del plásmido Ti se transfiere al núcleo de .: célula de la planta. • Los genes vir del plásmido Ti se localizan fuera de la región transferida y son necesarios para el proceso de transferencia. • Los genes vir son inducidos por compuestos fenólicos liberados por las plantas en respuesta a lesiones. • La proteína de membrana VirA se autofosforila en la histidina cuando se une a un inductor. • La protelna VirA activa a la proteína VirG al transferirle :; grupo fosfato. VirA-VirG es uno oe los numerosos sistemas bacteriano> de dos componentes que utilizan un regulador de fosfohistidina.

La transferencia del T-ONA es semejante a la conjugación bacteriana • El T-ONA se genera cuando una hendidura en la frontera derecha crea un cebador para la slntesis de una nueva cadena de ONA. la cadena individual preexistente que es desplazada po· la nueva síntesis es transferida al núcleo de la célula dé planta. La transferencia termina cuando la síntesis de DNA llega ?: una hendidura en la frontera izquierda. • El T-ONA es transferido como un complejo de DNA de cadena individual con la proteína de unión a la cadena individual VirE2. • El T-ONA de cadena individual es transformado en DNA bicatenario e integrado al genoma de la planta. • Se desconoce el mecanismo de integración. El T-ONA p..-ser utilizado para transferir genes al interior del nüclec : una célula vegetal.

1mD1 Resumen

Introducción ..a bacteria puede ser el hospedador de unidades ~éticas de replicación independiente, además de su ~osoroa. Estos genomas extracromosórnicos son Jos tipos, plásmidos y bacteriófagos (fagos). AJgunlásrnidos y todos los fagos tienen la capaddad de .tsferirse de una bacteria donadora a un receptor -:m proceso infeccioso. Una distinción imponame ~e ellos es que los plásmidos existen sólo como gemas de DNA libres, mientras que los bacreriófagos ::.virus que empacan un genoma de ácido nudeico - una eovolrura de proteína y son liberados de la .:teria al fina l de un ciclo infeccioso. Los pl ásmidos son moléculas circulares de 'A autorreplicames que se mantienen en la célula un número de copias estable y característico, es dr, que se mantiene constante de generació n en :neración. Los plásmidos de copia indjvidual man:nen la misma cantidad respecto del cromosoma oaaeriano hospedador, uno por cada unidad bacte ..:na, y como el cromosoma hospedador, se basan - un mecanismo específico para ser segregados r manera equivalente en cada división bacteria ~- De los plásmidos de copias múltiples hay varias 1r urudad bacreriana y pueden ser segregados a las .::cterias hijas de forma estocástica (es decir, hay fidentes copias para que cada célula hija siempre Jquiera algunas en una distribución aleatoria). Los plásmjdos y los fagos se definen por su capadad para residir en las bacterias como unidades ge~ticas independientes. No obstanre, algunos plás'lidos y cienos lagos también pueden existir como cuencias en el genoma bacteriano. cuyo caso, la "'lisma secuencia que constituye al plásrnido indeendiente u al genoma del fago se encuentra dentro d cromosoma y es heredada como cualquier otro ~e n bacteriano. Se dice que los fagos que forman :;.ane del cromosoma bacteriano exhiben lisogenia, · n tanto que los plásm idos con capacidad de com"~ortarse de esa manera se denominan e pisomas. ~us fagos y los episomas utilizan procesos relacio"1ados para insertarse en el cromosoma bacterian o • ser escindidos de él. - Una similitud entre los fagos lisogénicos, los 1lásmidos y los episoma) es que mantienen una po5esión egoísta de su bacteria y con frecuencia impi Jen que orro elemento del mismo tipo se establezca. Este efecto se denomina inmun idad , aunque la :>ase molecular de la inmunidad por plásmidos es diferente tle la lisogénica y es consecuencia del sis~ema de control de la replicación. En la Figura J 4.2 se resumen los tipos de unidades genéticas que pueden ser propagadas en las bacterias como genomas independientes. Los fagos ~ít icos pueden tener genomas de cualquier tipo de

ácido nucleico y se transfieren entre las células por la liberación de partículas infecciosas. Los fagos lisogénicos lienen genomas de DNA de doble cade na, igual que los plásmidos y los cp1somas. Algunos plásmidos se transfieren entre las células mediante un proceso de conjugación (con contacto directo entre las células donadoras y receptoras). Una característica del proceso de transferencia en ambos casos es que ocasionalmente algunos genes hospedadores bacterianos son transferidos con el DNA del plásm.ido o con el fago, de modo que la función de estos eventos es permitir el jntercambio de informa dón genética entre las bacterias . La característica fundamenta l en la determinación del comportamiento de cada tipo de unidad radica en cómo se utiliza su origen. En un cromosoma bacteriano o cucariótico, un origen permite iniciar un solo evento de rep licación Qt le abarca el replicón, sin embargo. los replicones también pue den ser utilizados para fomentar otras formas de replicación. La alternativa más común es utilizada por las pequeñas unidades de replicación independiente de los virus. El objetivo de un ciclo de replicación vírica es producir muchas copias del genoma vírico antes de que la célula hospedadora sea lisada para liberarlas. Algunos virus se replican de la misma forma que un genoma hospedador, con un evento de inicíadón que da lugar a la producdón de copias duplicadas, cada una de las cuales vuelve a repli carse después, y as( sucesivamente. Otros uLilizan una forma de replicación en la cual se producen numerosas copias a manera de matriz en tándem después de un solo evento de iniciación. Los episomas activan un evento sjmilar cuando el DNA de un plásmido integrado deja de ser inene e inida un ciclo de replicación. Muchos replicones procariólicos son circulares, característica necesaria para las formas de replicaci ón que producen múltiples copias en tándem. Sin embargo, algunos replicones extracromosómicos son lineales, en cuyo caso se ríene que considerar la capacidad de replicar el exrremo del replicón. (Obviamente, los cromosomas eucarióticos son lineales, de modo que en los replicones existe el mismo p roblema en cada extremo, aunque dichos replicones tienen un sistema especial para resolverlo.)

Los extre mos del DNA lineal representan un problema para la replicación Concepto principal • Para replicar la cadena de DNA con un extremo 5' se necesitan arreglos especiales.

lb ¿ Los extremos del ONA lineal representan un problema para la replicación

393

3'

5' "-

¿Córno Inicia una cadena nueva en el extremo?

La replicación podría salir del extremo 3' de una cadena lineal recién sintetizada, pero ¿podría iniciar en el extremo 5'?

Ninguno de los replicones anali zados hasta ahora tiene un extremo lineal, todos son circulares (como en los genomas de 8. coli o de las mitocondrias) o forman parte de unidades más largas de segregación (como en Jos cromosomas eucarió Licos), pero sí hay replicones lineales, en algunos casos como unidades extracromosómkas individuales y, por supuesto, en los extremos de los cromosomas eucarióticos. La capaddad de todas las polimerasas conocidas de los ácidos nudeicos, DNA o RNA, para proceder sólo en dirección 5'- 3'. constituye problema para sintetizar e l DNA en el extremo de un replicón lineal. Considérense las dos cadenas progenito¡;as ilustradas en la , . .. ; la cadena inferior no tiene problema, puede actuar como molde para sintetizar una cadena hija que llega directameme al extremo, donde presumiblemente se desprende la polimerasa . Sin embargo, para sintetizar un complemento en el extremo de la cadena superior, la síntesis debe comenzar jusro en la última base, de lo contrario, esta cadena se hará más corta en los ciclos sucesivos de replicación. Se desconoce si la iniciación jusro en el extremo del DNA lineal es posible, en general se piensa que una polimerasa se une a u11 sitio que rodea a la posi ción en la cual debe incorporarse una base, de modo que debe emplearse un mecanismo especial para la replicación de los extremos de los replicones lineales. Es posible imaginar numerosas soluciones para dar cabida a la necesidad de copiar un término: • El problema puede ser evadido transformando un replicón lineal en una molécula circular o multimérica, mecanismos utiliza dos por fagos como T4 o A. (véase la sección 16.4, Los círculos rodantes producen rnultímeros de un replicón.). • El DNA puede formar una estructura inusual, por ejemplo, al crear una horquilla en el tétmino, de manera que no hay un extremo libre. La formación de una ligadura cruzada está implicada en la replicadón del DNA mitocondriallineal de Paramecium. 394

CAPÍTULO 16 Replicones extracromosómicos

• El extremo puede ser variable y no deteminado con precisión. Los cromosomas e carióticos suelen adoptar esta solución, e la cual cambia el número de copias de uunidad corta repetitiva, localizada en el er tremo del DNA (véase la sección 28.18, L relómeros son sintetizados por una enzir:- _ ribonucleoproteíníca). Un mecanismo pa agregar o eliminar unidades hace inneces..;. ria la replicación hasta el exrremo. • Una proteína puede intervenir para hace posible la iniciación en el exn:emo. Numen sos ácidos n ucleicos víricos tienen proteír..¿ ligadas de manera covalente a la base termin: 5'. Los ejemplos mejor caracterizados srel DNA del adenovirus y el del fago q>2 además del RNA del poliovi.rus.

Las proteínas terminales permiten La iniciación en los extremos de los DNA víricos Conc:eplO principal • Una proteína terminal se une al extremo 5' del DNA y proporciona un nucleótido de citidina con un extremo 3'-0H que ceba a la replicación.

El DNA del adenovirus y e! del fago <¡)29 son ejerr.plos de iniciación en un extremo lineal, que de hecho se replican desde los do5 extremos utilizando e mecanismo de desplazaJUiento de cadena que s..: ilustra en la ' . En cualquiera de los extremos pueden tener lugar de manera independieme los mismos eventos. La síntesis de w1a cadena nue, va emp ieza en un extremo y desplaza a la cade1:! homóloga que previa.meme estalla apareada con e dúplex. Cuando la horquílla de replicación llega éi.. otro extremo de la molécula, la cadena desplazada se libera como una cadena individual libre, event\ que requiere de la formación de un origen dúplei por apareamiento de bases entre algunas secuencias complementarias cortas de los extremos de ¡¿ molécula. En varios virus que utilizan dichos mecanismos hay una proteína adherida de forma covalente a cada extremo 5'. En el caso de los adenovirus, una prote ína terminal está ligada con el DNA víricv maduro mediante un enlace fosfodiéster con la serina, como se indica en la ¿Cómo supera la adhesión de la pro[eína el problema de la iniciación? La proteína terminal tiene dos actividades, t ransportar la citidina que propordona el cebador y estar asociada con la polimerasc. de DNA. De hecho, la ligadura de w1a proteína terminal a un nucleótido es llevada a cabo por la poli-

O 1 3'

OH

1

DNA del adenovirus

~ Los términos se aparean para formar un origen dúplex

El fosfato terminal 5' de cada extremo del DNA del adenovirus está ligado de manera covalente a una serina de la proteína de unión al Ad de 55 kD.

s· 3'

Proteína terminal

dCTP

5' -C-OH

3··~~Wu~~~~~~-.~~~AwY s·

La replicación del DNA del adenovirus se inicia ¿:¡aradamente en ambos extremos de la molécula y procede : ·desplazamiento de la cadena. ~erasa

de DNA en presencia del DNA del adenovi-s. fenómeno que sugiere el modelo ilustrado en la . El complejo formado por la polimerasa e DNA y la proteína terminaL que porta el nu_eótido e cebador, se une al extremo del DNA del . Jenovirus. El extremo 3'-0H bbre del nucleótido : se utiliza para cebar la reacción de la elongación .ediante la polimerasa de DNA. lo cual genera una .Jeva cadena cuyo extremo 5' se liga de manera .'lvalente con el nucleótido e iniciador. (De hecho, :. reacción implica el desplazamiento de la proteí-a del DNA y no una nueva unión. El extremo 5' . el DNA del adenovirus está unido a la proteína ::rminal utilizada en el ciclo previo de replicación. _.a proteína terminal antigua es desplazada por la -Jeva en cada nuevo ciclo de replicadón.) La proteína terminal se une a la región que se caliza entre los pares de bases 9 y 18 desde el ex:emo del DNA. La región adyacente, localizada en-

• •• • PPPA

-Ser·C·OH 3'-HO·GpTpApGpT·--·-·--

La proteína terminal del adenovirus se une al extremo 5' del DNA y proporciona un extremo C-OH para cebar la síntesis de una nueva cadena de ONA.

tre las posiciones 17 y 48, es esencial para Ja unión de una proteína hospedadora, el factor nuclear I, que también es necesario para la reacdón de ini-

16.3 Las proteínas terminales permiten la iniciación en los extremos de los DNA víricos

395

ciación. Por consiguiente, el complejo de iniciación puede formarse entre las posidones 9 y 48, distancia fija a partir del extremo del DNA.

Los círculos rodantes producen multímeros de un replicón Concepto principal • Un círculo rodante genera multímeros de cadena individual de la secuencia original.

Las estructuras generadas por el replicón dependen de la reacción que se produzca entre el molde y la horquilla de replicación. Las condicionantes fundamentales son si el molde es circu lar o lineal y si la horquilla de replicación está comprometida con la síntesis de las dos cadenas del DNA o sólo de una.

El molde es DNA dúplex circular

La iniciación ocurre en una cadena

/" \

~ 3'-0H ,./

5

, p - - Hendidura en el origen

El alargamiento de la cadena creciente desplaza a la cadena antigua

l {

~ - --Cadena creciente

·~-·"'t

La replicación de una sola cadena permite gene rar copias de algu nas moléculas circulares. Una ht. ctidura abre una cadena y posteriormente el extret+ 3'-0H generado por la hendidura es ampliado p la poUmerasa de DNA. La cadena recién sintetiza.: desplaza a la cadena progenitora original. Los evetos resultantes se describen en la Este tipo de estructura se denomina círcu rodante porque puede considerarse que el pul\_ de crecimiento rueda en romo a la cadena ci.rc lar que funciona como molde; en principio pod.hacerlo indefinidamente. Conforme se desplaza, horquilla de replicación extiende la cadena ex ter y desplaza al compañero anterior. Véase la micr grafía electrónica de la El material recién sintetizado está ligado de m.: nera covaleme al material original, de modo que cadena desplazada contiene al genoma original c.. su extremo 5'. La unidad original va seguida de cua quier número de copias del genoma sintetizadas p revoluciones continuas del molde. Cada revollldL desplaza al material sintetizado en el ciclo previo. El círculo rodante tiene varios usos in vivo; e la se muestran algunas de las rutas ulizadas para replicar el DNA. La división de una unidad de cola genera u:: copia del replicón circular origina l en forma linee La estructura lineal p uede mantenerse como cadtna individual o ser transformada en un dúplex p medio de la síntesis de la cadena complemenra::: (cuya secuencia es idéntica a la de la cadena mol,, del cú-culo ro dan te original). El círculo rodame proporciona el medio pa_. amplificar el replicón (la unidad} originaL mee.? nismo que se utiliza para generar DNA ribosónlic {DNAr) amplificado en el ovodto de Xenopus. L genes del RNA ribosómico (RNAr} se organizan e·

Cadena desplazada Después de una revolución, la cadena desplazada llega a la longitud de una unidad

~

"=-

La elongación continua genera una cadena desplazada de múltiples unidades ...-~.

El círculo rodante genera una cola multimérica de cadena individual. 396

CAPÍTULO 16 Replicones extracromosómicos

En las imágenes por microscopía electrónica, ~­ círculo rodante se ve como una molécula circular de cola line¿ Cortesía de Ross B. Inman, Institute of Molecular Viroloc Bock Laboratory and Department of Biochemistry, Univers'~ of Wisconsin, Madison, Wisconsin, USA.

genoma como un gran número de repeticiones ":lntiguas. Una sola unidad repeliliva del genoma se .;ansforma en un círculo rodante. La cola desplaza:a, que contiene numerosas unidades, se conviene il DNA dúplex; posteriormente se separa del círcu de manera que Jos dos extremos pueden unirse ..ara generar un gran círculo de DNAr amplificado, orlo tanto, el material amplificado consta de gran Jmero de unidades repetitivas idénticas.

Los círculos rodantes se utilizan para replicar los genomas de los fagos Concepto principal La proteína q>X A es una relaxasa de actuación en cis que genera drculos de cadena individual a partir de la cola producida por la replicación por círculos rodantes.

a replicación por medio de círculos rodanres es 1múo entre los bacteriófagos. Los genomas uniHios pueden ser separados de la cola desplazada generar monómeros que es posible empacar en J.róculas de fagos o urili7ar para ciclos de replica..:Jón posteriores. En la se muestra una

perspectiva más detallada de un ciclo de replicación fágico centrado en el círculo rodante. El fago q>X 174 está formado por un DNA drcular de cadena individual conocido como cadena positiva (+); por otra pane, se sintetiza una cadena complementaria denominada cadena negativa(-). Por esta acción se genera el círculo dúplex que aparece en la parte superior de la figura, el cual es replicado posteriormente por un mecanismo de círculo rodanle. El círculo dúplex se transforma en una estrucrura cerrada de manera covaleme, la cual se superenrolla. Una proteína codificada por el genoma del fago, la proteína A, hace una hendidura en la cadena (+}del DNA dúplex en un sitio específico que define el origen de la replicación. Después de que se forma

:··. . ~Q

La proteína A hace una hendidura en el origen y se une al extremo 5'

:

Cadena-

.. .: La replicaciónCadena.,. del círculo rodante desplaza

•

: a la cadena negativa

Cadena individual multlmérica

Dúplex multlmérico

La horquilla de replicación rebasa el origen; : la proteína A hace una hendidura en el DNA : y se une a un extremo 5' nuevo

'

Unidad de cadena individual

: La cadena positiva liberada forma un círculo • covalente Cadena individual circular

.

,/ Dúplex circular El destino de la cola desplazada determina el tipo La división de . ·a unidad genera monómeros, que pueden ser convertidos en ~-ructuras dúplex o circulares. La división de los multímeros ~::1era una serie de copias repetidas en tándem de la unidad ""ginal. Nótese que la conversión a cadena doble podría ocurrir :·:es de que la cadena se desprenda del círculo rodante. -~ omductos generados por los círculos rodantes.

El RF del DNA de cpX174 es un molde para sintetizar círculos víricos de cadena individual. La proteína A permanece unida al mismo genoma en un número indefinido de revoluciones, haciendo una hendidura en el origen en la cadena vírica (+) y transfiriéndose al extremo 5' nuevo en cada ciclo. Al mismo tiempo, la cadena vírica liberada adquiere una forma circular.

1~. 5 Los círculos rodant es se utilizan para replicar los genomas de los fagos

397

la hendidura en el origen, la proteína A se manriene coneclada con el extremo S' que genera, mientras que el3' es extendido por la polimerasa de DNA La estruct ura del DNA tiene una funci ón importante en esta reacción, pues sólo puede ser hendido cucmdo esré superenrollado negativamente (p. e.i ., enrollado en su eje espacial en sentido opuesto a la dirección de la doble hélice; véase la sección 19.12. El superenrollamiento afecta a la estructura de l DNA). La proteú1a A es susceptible de unirse a un fragmento decámero de cadena individual de DNA que rodea al sitio de hendidura, lo cual sugiere que el superenrollamiento es necesario para facilitar la formación de una región de cadena individual que proporciona a la protema A su sitio de unión. (Una actividad emdmática en la cual la proteína divide al DNA dúplex y se une a w1 extremo 5' liberado se denomina, en ocasiones, r elaxas a .) La hendí dura genera un extremo 3 '- OH y uno 5' - fosiaro (adherido de manera covalenre a la proteína A), los cuales tienen un papel que desempeñar en la replicación de
CAPÍTULO 16 Replicones extracromosómicos

"antiguo"; después se liga a la cadena desplazada

en un círculo. Una vez formada la estructura circular, la cadena (+) desplazada puede tener dos destinos. Durante la fase de replicación de la infección vírica puede ser utilizada como molde pa ra sintetizar la cadena (-) complementaria; el círculo dúplex puede ser utilizado después como círculo rodante para generar más progenie. Por otra parte, durante la morfogénesis del fa go, la cadena ( +) desplazada se empaqueta en el virión fágico.

ELplásmido F es transferido por conj ugación entre bacterias Conceptos principales • Un factor F libre es un replicón que se mantiene en el nivel de un plásmido por cromosoma bacteriano. • Un factor F puede integrarse al cromosoma bacteriano, en cuyo caso, su propio sistema de replicación es suprimido. • El factor F codifica a pili específicos que se forman en la superficie de la bacteria. • Un pilus F permite que una bacteria F positiva contacte a una bacteria F negativa y se inicie la conjugación.

Otro ejemplo de conexión entre la replicación y le propagación de una unidad genética es la conjugación bacteriana, en la cual el genoma de un p lásmido o un cromosoma hospedador es transferido de: u na bacteria a otra. La conjugación depende del p lásmido F, qut constituye un ejemplo clásico de episoma, element• que puede existir como plásmido circular libre o se· integrado al cromosoma bacteriar10 como secuend;: lineal (co mo un b<\cteriófago lisogénico). El plásmido Fes una gran molécula de DNA circular con un:: longitud de -lOO kb. El factor F puede integrarse en numerosos sititr del cromosoma de E. coli, a menudo por eventos dt recornbinación q ue involucran a cierras secuencia(denominadas secuencias IS; véase la sección 2l. 5 Los transposones provocan la reestructúración de DNA) presentes en el crmnosoma hospedador y e!"! el plásmido F. En su forma libre (de plásmído), e plásmido F utiliza a su propio origen de replicació~ (oriV) y a su prop io sistema de control, y se mantiene una copia por cada cromosoma bacterian\. Cuando se integra a éste, dicho sistema es suprimid y el DNA F se replica como pane del cromosoma. La -presencia del plásmido F, libre o imegradC' tiene consecuencias importantes para la bacter1 ~ hospedadora ~ Las bacterias F positivas son suscep-

bles de conjuga rse (o aparearse) con las bacterias

= negativas. La conjugación implica un contacto ~::me

la bacteria donadora (P positiva) y la bactereceptora (F negativa), el cual va segu,ido de la -ansferencia del factor P. Si el factor F existe en ~rma de plásmido libre en la bacteria donadora, es :ansferido como plásmido y el proceso infeccioso . ~ansforma al receptor F negativo en F positivo. Por :! contrario, si el factor F está presente en forma ~negrada en el donador, el proceso de transferencia :.ambién puede provocar qu e una parte o todo el .:;omosoma bacteriano sea transferido. Numerosos plásmidos Tienen sistemas de conjugación que ope:an de foTma similar, sin embargo, el factor F fue el nrimero en ser descubierto y preva lece como paraligma de este tipo de transferencia genética. . Para la conjugación se necesita una región ::-xtensa (de -33 kb) del plásmido F denominada región de transferencia, la cual contiene -40 ;;enes necesarios para la transm isión del DNA; su organización se resume en la . Los geaes se llaman locus tra y locus trb, y la mayor parte se expresa de forma coordinada, como parte de una sola unidad de transcripción de 32 kb (la unidad :raY-I}. traM y traJ se expresan separadamenre. traJ es un regulador que enciende a traM y a n·aY-1. En ,a cadena opuesta, finP es un regulador que codifica a un peque!l.o RNA antisentido que apaga a traJ. Su actividad requiere de la expresión de otro gen, finO. Sólo cuatro de los genes tra de la unidad de transcripción mayor están implicados directamente en la transferencia del DNA casi todos tienen que ver con las propiedades de la superficie de la célula bacteriana y con el mantenim iento de contactos entre las bacterias en proceso de apareamiento . Las bacterias F positivas poseen apéndices de superficie denominados pili (singular pilus) que son codificados por el factor F. El gen traA codifica a la subunidad proteínica individual, la pilina, que es polimerizada en elpilus. Cuando menos 12 genes tm son necesarios para la mad iricación y el ensamblaje de la pilina en el pilus. Los pili F son estructuras similares a cabellos, de 2 a 3 pm de largo, que sobresalen de la superficie bacteriana. Una cél ula F positiva típica tiene dos o tres pili. Las subunidades de pilina se polimerizan en un cilindro hueco de -8 nm de diámetro, con un agujero axial de 2 nm. El apareamien to se inicia cuando la punta del pílus F entra en contacto con la superficie de la céh.lla receptora . En la se m uestra un ejemplo de células de E. co/i que han empezado a aparearse. Una célula donadora no contacta a otras células que portan el factor F porque los genes traS y traT codifican a proteínas de "exclusión de superficie'' que convierten a la célula en un receptor deficiente en dichos contactos, lo cual restringe efi~a

RegiOn reguladora

Genes de transferehcta

• • ••,• •, TraY Formación de la hendidura y desenrollado del DNA Tral

• TraJ • : :

~

,

: :

Pillna

L~.:~l

Exclusión eje superficie ¿Canal?

___________l___l ~.

oriT traMJ YALEKBPVR CW U N trbCDE traF trbB traH G STO

1/Z

íinP

la región tro del plásmido F contiene los genes necesarios para la conjugación bacteriana.

El contacto inicial de las bacterias en proceso de apareamiento tiene lugar cuando los pili F del donador contactan a la bacteria receptora. Imagen cortesía de Ron Skurray, School of Biological Sciences, University of Sydney.

ciemememe el apareamiento entre células donadoras y células F negativas. (La presencia de pili F tiene consecuencias secundarias, proporcionan los sitios a los cuales se adhieren los Iagos de RNA y algunos de DNA de cadena individual, de modo que las bac· terias F positivas son susceptibles de infección por estos fagos, mientras que las bactérias F negativas son resistentes.) El contacto inicial enne las células donadoras y las receptoras se i.nterrumpe fácilmente, sin embargo, otros genes lta estabilizan dicha asociación, lo cual aproxima a las células en p roceso de apareamíemo. Los pili F son esenciales para que se inicie el apareamiento, pero se retraen o desensamblan como parte del proceso por el cual las células en apareamíemo se acercan una a otra. Debe haber un ca nal de t ransferencia del DNA, sin embargo, el pilus no parece proporcionarlo. TraD es una proteína de membrana interna en las bacterias f+ necesaria para el transporte del DNA que puede proporcionar el canal o ser parte de él

!6.6 El p~ásmido Fes transferido por conjugación entre bacterias

399

La conjugación t ransfiere DNA de cadena individual Concepto> principales • La transferencia de un factor F inicia cuando la replicación por círculos rodantes empieza en oriT. El extremo 5' inicia la transferencia en la bacteria receptora. El DNA transferido se hace bicatenario en la bacteria receptora. • Cuando un factor F está libre, la conjugación "infecta" a la bacteria receptora con una copia del factor F. • Cuando se integra un factor F. la conjugación provoca La transferencia del cromosoma bacteriano hasta que el proceso es interrumpido por rotura (aleatoria) del contacto entre el donador y la bacteria receptora.

DONADOR TraY/1 crea una hendidura en oriT del DNA oriT

RECEPTOR

3'

ts·

El multrmero TraY/1 migra en torno al círculo, desenrollando eiDNA 5'

La cadena individual entra al receptor

Se sintetizan cadenas complementarias

~

Se cierra la hendfdura del donador

V ~

El receptor forma el circulo

ü la transferencia del DNA ocurre cuando el factor F es hendido en oriT y una cadena individual es conducida por el extremo 5' al interior del receptor. Sólo un tramo de la unidad es transferido. La cadena individual que permanece en el donador y la cadena transferida al interior del receptor son sintetizadas con una cadena complementaria. 400

CAPÍTULO 16 Replicones extracromosómicos

La rransferencía del factor F inicia en un sitio llamado oriT, u origen de la transferencia. que se localiz¿ en uno de los extremos de la región de transferencia. El proceso puede in icia rse cuando TraM ident' fica que se ha formado una pareja; a continua ciór. TraY se une en las cercan ías de oriT e induce :: unión de Tral. Esta última proteína es una relaxasa, como la proteína A de X rnuesrra la fo rma en que se genera Dl\.de cadena individual p or replicación). En la se mu estra que el extremo 5' liberado muesn: el camino al interior de la bacteria receptora, en !~ cual se sinte tiza un complemento de la cadena ü:dividual tran sferida, qu e como resultado de ello, stransforma en F positiva. En la bacteria donadora debe sintetizarse un: cade na complementaria para remplazar a la que ha sido transferida. Si esto sucede de forma concom tame con el proceso de transferencia, el estado dr' plásmido F será semejante al círculo rodante de :...; Figura 16.5 (y no generará las region es exten sa de cadena individual que se muestran en la Figur:: 16.1 1). En generaL el DNA en proceso de conjugc:dón aparece como un circulo rodame, sin embargt la replicación como tal no es necesaria para p roporcionar la energía de conducción, además de que 1~ transferencia de la cadena individual es independiente de la síntesis de DNA. Una sola unidad dt.. factor Fes transferida a la bacteria recepto ra, lo cua implica que el proceso termina con alguna característica (no identificada) desp ués de una revoluciór al cabo de lo cual se resta ura la integridad covalenh: del plásmido F. Cuando Ll n plásm ido F integrado in icia la con jugación, la orienta ción de la transferencia es al~ a ­ da de la regió n de transferencia, hacia el interior dé' cromosoma bacteriano. En la se mue~ ­ tra que el DNA bacteriano es transferido siguiendo~ una cona secuencia líder de DNA F y que el proces continúa hasta que es interrumpido por la roture: de los contacLOs formados emre las bacterias que s-c aparean. Se necesiran -lOO minutos para transfertel cromosoma bacteriano completo, y en condidc · nes normales, el contacto suele romperse antes de la culminación de la transferencia. El DNA donador que entra a un a bacteria receptora se torna bicatenario y puede recombinarse cor. el cromosoma receptor. (Nótese que so n necesa riCI, dos eventos recombinantes pa ra in sertar el DI\.' donador.) Así pues. la conj ugación p roporciona ur. medio de intercambio de material gen ético enrrt

~aerias

(a diferencia de su crecimiemo asexual ha· ·ual). Una cepa de F.. coli con un factor F integrado ~spalda dicha recombinación con bastante frccuena (respecto de las cepas que carecen de factores F 1egrados); estas cepas se definen como Hfr (high :.Juency recombinarion, de recombinación de alta ~cuencia ) . Cada posición de integración para el :ctor P origina una cepa diferente de Hfr, con un atrón característico de transferencia de marcadores .!Cterianos a un cromosoma receptor. El contacto entre las bacterias en proceso de mjugación suele romperse antes de que haya .rminado la transferencia del DNA, de modo que 3 probabilidad de que una región del cromosoma aCLcriano sea transferida, dej)ende de su distancia . el oriT. Los genes bacterianos localizados cerca del trio de integración de F (en dirección de la transfe·encia) entran primero a la bacteria receptora y se :-:1cuemran con frecuencias m ucho mayores que los .)Calizados más lejos y que entran desp ués. Esto da ...1gar a un gradiente de frecuencias de transferencia en torno al cromosoma. que declina a partir de la ~osición de integración de F. Las posiciones de los marcadores localizadas en el cromosoma donador pueden ser analizadas en función del tiempo que tarda la transferencia, lo cual da lugar a la descripción estándar del cromosoma de E. coli como un mapa dividido en l 00 minutos. El mapa se refiere a los tiempos de transferencia de una cepa específica de Hfr; el punro de inicio del gradiente de transferencia es diferente en cada una porque depende del sitio en el cual el factor F se ha integrado al genoma bao.eriano.

E

El plásmido bacteriano Ti provoca la enfermedad de agalla de Crown en las plantas

Conceptos principales • La infección por la bacteria A. tumefociens puede transformar las células de las plantas en tumores. El agente infeccioso es un plásmido transportado por la bacteria. El plásmido también porta genes para sintetizar y metabolizar las opinas (derivados de la arginina) que utiliza la célula tumoral.

La mayoría de los eventos en que el DNA es reestructurado o amplificado tienen lugar dentro de w1 genoma, sin embargo. la interacción entre las bacterias y ciertas plantas implica la tran~fereoda de DNA del genoma bacteriano al genoma de la planta. La enfermedad d e agalla de Crow n , que se muestra en la , puede ser inducida en la mayoría

BACTERIA OONADORA FACTOR F on7

BACTERIA RECEPTORA

reg10n Ira

El factor F es hendido en on7

, , 5 3

L

•

~ Cromosoma de E. coli ·:

.•.::.::: . ....

f

::.

.

3'

.•. .. .. ······.~~~~~~~:~~~· .............. •

u

El extremo 5' dinge a la cadena IndiVIdUal al ínlerlor del recepior

5'

Las cadenas Individuales son transtormadas en cadenas dobles en ambas baotenas

-~.·: ..l! ·.·... ·•·.... ·...::: ::;...·: ~::

~

El ONA del donador se re<:omlllna con el genoma.. del ¡eceptor r

la transferencia del DNA cromosómico ocurre cuando un factor F integrado es hendido en oriT. la transferencia del DNA se inicia con una secuencia corta de ONA F y continúa hasta que lo impide la pérdida de contacto entre las bacterias.

de la~ plantas dicotiledóneas por la bacteria de tierra Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria es un parásito que hace un cambio genético en la célula euca· riótica hospedadora, con consecuencias tanto para el parásito como para el hospedador, pues mejora las condiciones de supervivencia de aquél y provoca que la célula de la planta crezca como un tumor. Las agrobacterias son necesarias para inducir la formación del tumor, pero las células de éste no requieren de la presencia cominua de las bacter1as. Igual que en los tumores animales. las células de las plantas han adqUirido un estado en el cual nuevos mecanismos rigen el crecimiento y la diferenciación; la transformación dentro de la célula es provocada por la expresión de la información genética transferida de la bacteria. El principio de inducción tumoral de Agrobaderium reside en el plásmido Ti perpetuado como un replicón independiente en la bacteria. El plásmido transporta a genes implicados en varias actividades

\6 P. El plásmido bacteriano Ti provoca la enfermedad de agalla de Crown en las plantas

401

Un Agrobocterium que porta un plásmido Ti de nopalina induce la formación de un teratoma, en el cual se desarrollan estructuras diferenciadas. Imagen cortesía de la sucesión de Jeff Schell. Reproducida con autorización de Max Planck Institute for Plant Breeding Research, Cologne.

Locus

Functon

Plásmido1l

Vlf

transferencia del DNA a fa planta inducción de brotes inducción de raíces

tooas todas todas

slntesís de nopalina catabolismo de nopatina síntesis de octopina catabolismo de octopina

nopalina nopahna o elopina octopina

genes de transferencia bacteriana genes de incompatibilidad origen de la replicación

todas

shr

rot nos

noc ocs

oce Ira In e

ortV

todas todas

Los plásmidos Ti transportan a genes implicados en las funciones de las bacterias y las plantas.

de las bactt!rias y de las cél ulas vegetales, inclu idas las necesarias para generar el es tado transformado. y un conjunto de genes implicados en la síntesis o la utilización de las opinas (derivados novedosos de la arginina}. Los plásmidos Ti (y por tamo las Agrobacceria en que residen} pueden dividirse en cuatro grupos, según el tipo de opinas que producen: • Los plásmidos de nopalin a portan genes para la síntesis de ésta en los tumores y para utilizarla en la bacteria. Los tumores de nopaJi na pueden diferenciarse en brotes con estructuras anormales. Se les ha denominado tera t omas. por su analogía con cienos lumores de los mamíferos que retienen la capacidad de diferenciarse en estructuras embrionarias tempranas. 402,

CAPÍTULO 16 Replicones extracromosómicos

• Los plásmidos de octopina son similares a los de nopalina, pero la opina peninente n~ es la misma. Sin embargo. los trunores de octopina en general no están diferenciado! y no forman brotes de teratoma. • Los plásmidos de agropina ponan gene: para el metabolismo de ésta; los rumore~ no se diferencian, su desarrollo es pobre • mueren pronto. • Los plásmidos Ri pueden inducir la enfermedad de raíces vellosas en algunas planta< y la de aga lla de Crown en otras. Sus gene.• son de tipo agropina y pueden tener segmentos deri vados de los plásmídos de nopalina y de octopina. Los tipos de genes que transporta el plásmido T se resume n en la . Los genes utilizado~ en la bacteria codifican la replicación y la incompatibilidad del plásmido, la transferencia entre bacterias, la sensibilidad a los fagos y la síntesis de otro< compuestos. algunos de los cuales son tóxicos para otras bacterias de tierra. Los genes utilizados en las células de las plantas codi fican la transfe rencia de: DNA al interior de la planra, la inducción de estade; transformado y la inducción de brotes y raíces. La especiÍicidad de los genes de las opinas depen · de del tipo de plásmido. Los genes necesarios para la síntesis de las opinas están vinculados con otros cuyos productos catabolizan a la misma opina, de modo que cada cepa de Agrobaccerium provoca que las célulru tumorales de agalla de Crown sinteticen opinas útiles para la supervivencia del parásitO. Las opinas pueden ser urilizadas como única fuente de nitrógeno e: de carbono de la cepa de Agrobacterium inductora. E_ principio es que la célula vegetal transformada sintetiza a las opi nas que la bacteria puede utilizar.

El T-DNA porta los genes necesarios para la infección Concepto~

principales

• Parte del DNA del plásmido Ti se transfiere al núcleo de la célula de la planta. • Los genes vir del plásmido Ti se localizan fuera de la región transferida y son necesarios para el proceso de transferencia. • los genes vir son inducidos por compuestos fenólicos liberados por las plantas en respuesta a lesiones. La proteína de membrana VirA se autofosforila en la histidina cuando se une a un inductor. la proteína VirA activa a la proteína VirG al transferirte el grupo fosfato. • VirA-VirG es uno de los numerosos sistemas bacterianos de dos componentes que utilizan un regulador de fosfoh istidina.

2 interacción entre Agrobacrerium y una célula vege..._ se ilustra en la . La bacteria no entra - a célula de la planta, sino que transfiere parte del ásmido Ti al núcleo de la célula vegetal. La perdón ·
Célula de la planta

Agrobacteoum

~Piásm1doTí

v-T-ONA

: La bacteria transt1ere : el T-ONA a la planta

···············> Las células de la planta desarrollan un tumor

El tumor sintetiza opinas en las cuales ~ ••• puede crecer la bacteria

El T-ONA es transferido a partir de un Agrobacterium que transporta un plásmido Ti al interior de una célula de la planta, donde se integra al genoma nuclear y ejerce funciones que transforman a la célula hospedadora .

~

~h~

PlásmidoTI de nopalina Vir

Tra

OriV

lnc

los plásmidos Ti de nopalina y de octopina transoortan una variedad de genes, incluidas las regiones Tcon funciones que se traslapan.

. Cada locus se transcribe como una sola unidad, si bien algunos incluyen más de un marco de lec[llra abierto. El proceso de lransformación puede dividirse cuando menos en dos etapas: • Agrobaclerium entra en contaclO con una célula vegetal y son inducidos los genes vir. • Los productos génicos vír dan lugar a que el T-DNA sea transferido al núcleo de la célula de la planta, donde se integra al genoma. 16.9 El T-DNA porta los genes necesarios para la infección

403

Locus

VIrA

vírB

virG

Proteínas VirA

VirBH1 VirG

Nivel basal baJO

bajo

Nivel inducido

alto

Localización mem. mem. Función

vire

virO

virE

Acetosiringona

VirC1·2 Vir01,02 VirE2 VirA (sensor)

alto

alto

alto

alto

cito.

cito.

núcleo

núcleo

receptor de acetils1ringona

• • • • • •,...

e

~

•

induce la transcripción de otros genes v/r

El estímulo activa la autofosforilación

Los fosfatos son transferidos al efector

.................... , .... ...... . . ..

~

implicado en la conjugación

y

'1

se une al DNAde sobre marcha

~ la nucleasa 02 hace una hendidura en eiT·DNA

'1

protefna de unió con el ssDNA

VirG (efector)

La región vir del plásmido Ti tiene seis loci responsables de transferir el T-ONA a una planta infectada.

La proteína tosforilada

activa la transcripción

o 11

C-CH3

El sistema de dos componentes de VirA-V'": responde a señales fenólicas al activar la transcripción de ~;,.. nes diana.

Véase el ejemplo de la OH

La acetosiringona (4-acetil-2,6-dimetoxifenol) es producida por N. tabacum en respuesta a lesiones; i nduce la transferencia del T-DNA de Agrobocterium.

Los genes vir se clasifican en dos grupos que corresponden a estas etapas. virA y virG son reguladores que responden a cambios de la planta al indudr los otros genes, de modo que, en ellos, las mutaciones producen mutantes avirulemos que no pueden expresar a los genes vir restantes. Los genes virB, C, D y E codifican a proteínas implicadas en la transferencia del DNA. Las mUtaciones en virB y virD producen muta mes avirulemos en todas las plantas, si bien sus efectos en virC y en virE varían en función del tipo de planta hospedadora. virA y virG se expresan constitutivamente (en un nivel bastante bajo). Las señales a las cuales res· ponden provienen de compuestos fenólicos generados por las plantas como respuesta a las lesiones.

404

CAPÍTULO 16 Replicones extracromosórnicos

. Nicotiana tabc;-

cum (planra del tabaco) genera las moléculas aceto·

siringona e hidroxiacetosiringona a. La exposicióa estos compuestos activa al gen virA, que actúa er el virG, que a su vez induce la expresión de novo d:: virB, C, D y E. Esra reacción explica porqué la infección por A9robacterium ocurre sólo en las p lanta lesionadas. VirA y VirG son ejemplo de un sistema bacteria· no clásico en el cual la estimuladón de una proteím sensora da lugar a la autofosforilación y transferer.cia del fosfato a la segunda proteína. La relación St: ilustra en la . El sistema VirA-VirG se asemeja al EnvZ-OmpR que responde a la osmolaridad. La secuencia de virA está relacionada cor la de envZ, en tamo que las de virG y ompR está:estrechamentc relacionadas, lo cual sugiere que la proteínas efectoras funcionan de manera simílar. VirA forma un homodímero localizado en 1:: membrana interna que puede responder a compuestos fenólicos en el espacio periplásmico. La exposición a estos compuestas provoca qu'é· VirA se

~utofosforile en la histidina, y más tarde, el grupo .osfato es transferido a un residuo de Asp en VirG. El roducro VirG fosforilado se une a Jos promotores de os genes virB, C, D y E para activar la transcripción. :uando virG es activado, su transcripción es indu :i.da desde un nuevo punto de inicio, diferente del ..:.rilizado por la expresión constitutiva, lo cual resulta ~n el incremento de la cantidad de proteína VirG. De los loci vir restantes, virO es el mejor cmac:erizado; tiene cuatro marcos de lectura abiertos. )os de las proteínas codi'ficadas en virD, Vi:rD l y v'irD2, proporcionan una endonucleasa que inicia el proceso de transferencia al hacer una hendidura en un sitio específico del T-DNA.

E

La transferen cia del T-ONA es semejante a la conjugación bacteriana

TGGCAGGATATATIGNNTGTAAAC

TGACAGGATATATIGNNGGTAAAC

Repeticlóll izquierda

Plásm1d0 Tí

•

•

!

•••

Repetición derecha

Transferencia e integración del T-ONA "

l t

PlásmidoTi

.•• ~

••••

••

ONA de la planta 1 La unión se encuentra a <1 00 bp de la repetición izquierda

r

ONA de la planta Se mantienen 1 a 2 bp de la repeticrón derecha

El T-ONA tiene repeticiones casi idénticas de 25 bp en cada extremo del plásmido Ti. La repetición de la derecha permite la transferencia e integración al genoma de una planta. El T-ONA que se integra al genoma de una planta tiene una unión precisa que retiene 1 o 2 bp de la repetición de la derecha, pero la unión de la izquierda varía y puede estar a una distancia de hasta 100 bp de la ·epetición de la izquierda.

Conceptos principales • El T-ONA se genera cuando una hendidura en la frontera derecha crea un cebador para la si ntesis de una nueva cadena de ONA. • la cadena individual preexistente que es desplazada por la nueva síntesis es transferida al núcleo de la célula de la planta. • La transferencia termina cuando la síntesis de ONA llega a una hendidura en la frontera izquierda. • El T-ONA es transferido como un complejo de ONA de cadena individual con la proteína de unión a la cadena individual VirE2. • El T-ONA de cadena individual es transformado en ONA bicatenario e integrado al genoma de La planta. • Se desconoce el mecanismo de integración. El T-ONA puede ser utilizado para transferir genes al interior del núcleo de una célula vegetal.

!

!

1

Segunda hendidura

De hecho, el proceso de transferencia selecciona a la región T para entrar a la planta. En la se muestra que el T-DNA de un plásmido de nopalina es delimitado de las regiones Danqueantes del plásmido Ti por repeticiones de 25 bp, las cuales l'li.fieren en sólo dos posiciones emre el extremo izquierdo y el derecho. Cuando el T-DNA es integrado al genoma de una planta, la unión derecha está bien definida, la cual retiene 1 o 2 bp de la repetición de~echa. la unión izquierda es variable; la frontera del T-DNA en el genoma de la planta puede localizarse en la repetición de 25 bp o en alguno de los sitios de una serie que cubre una longitud de -100 bp en el T-DNA. En ocasiones, en un solo sitio se integran copias múltiples de T-DNA en tándem. En la se ilustra un modelo para la transferencia. En la repetición de 25 bp del lado derecho se forma una hendidura que proporciona

= T-ONA

1liberado !

Hacia el núcleo de la célula de la planta

El T-ONA se genera por desplazamiento cuando su síntesis empieza en una hendidura formada en la repetición de la derecha y termina con una hendidura ubicada en la repetición de la izquierda.

un extremo cebador para la síntesis de un DNA de cadena individuaL La síntesis de la cadena nueva desplaza a la antigua, la cual se uliüza en el proceso

16.10 la transferencia del T-ONA es semejante a la conjugación bacteriana

405

de transferencia, La transferenda termina cuando la síntesis de DNA llega a una hendidura en la repetición del lado izquierdo. Este modelo explica la razón de que la repetición derecha sea esencial y represente la polaridad del proceso. Si no se produce una hendidura en la repetición del lado izquierdo, la transferencia podría rebasar al plásmido Ti. El proceso de transferencia irnplica la producción de una sola molécula de DNA de cadena individual en la bacteria infecciosa, la cual es tra nsferida como un complejo formado por DNA y una proteína que suele llamarse complejo T. El DNA es cubierto por la proteína de unión a la cadena individual VirE2, la cual tiene una señal de localízación nuclear y es responsable del transporte del T-DNA al interior del núdeo de la célula de la planta. Una sola molécula de la subunidad D2 de la endonucleasa permanece unida al extremo 5'. El operón virB codifica a 11 product os implicados en la reacción de transferencia. Fuera del T -DNA, pero justo al lado del borde derecho, se encuentra otra secuencia corta, denominada de sobremarcha, la cual estimula en gran medida el proceso de transferencia. Dicha secuencia funciona como potenciador, debe encontrarse en la misma molécula de DNA, pero hace más eficiente la transferencia, .incluso si está separada del borde por muchos miles de pares de bases. VirCl y posiblemente virC2 podrían actuar en la secuencia de sobremarch.a. Los plásm idos de octopina poseen un patrón más complejo de T-DNA integrado que los plásmidos de nopalina, además de que el patrón de las cadenas T también es más complejo, y pueden encontrarse muchas especies discretas que corresponden a elementos de T-DNA, lo cua1 sugiere que el de ocwpina liene numerosas secuencias que proporcionan dianas para la realización de hendiduras o la terminación de la síntesis de DNA. Este modelo de transferencia del T-DNA se asemeja bastante a los eventos implicados en la conjugación bacteriana, en los cuales el cromosoma de B. coli es transferido de una célula a otra en forma de cadena indivjdual. Los genes del operón virE son homólogos a los genes (ra de ciertos plásmidos bacteüanos implicados en la conjugación (véase la sección 16.7, La conjugación transfiere DNA de cadena individual) pero una diferencia es que la transferencia del T-DNA suele estar limitada por la frontera de la repetición del lado izquierdo, mientras que la transferencia del DNA bacteriano es indefinida. No se sabe cómo se integra el DNA transferido al genoma de la planta. En alguna etapa, la cadena recién generada debe ser transformada en DNA dúplex. Los círculos de T-DNA de las células de las plantas infectadas parecen ser generados por recom406

CAPÍTULO 16 Replicones extracromosómicos

binación en tre las repeticiones izquierda y derech¿ de 25 bp, pero no se sabe si son intermediarias; e probable que el evenlo real implique una rccomb:~ nación no homóloga, debido a que no hay homok gía entre el T-DNA y los sitios de integración. ¿Se integra el DNA al ge noma de la planta corn unidad integral? ¿Cuántas copias son integradas¿Qué sitios del DNA de la planta están disponible pata la integración? ¿Los genes que se encuentra-:: en el T-DNA son regu lados exclusivamente por fun· dones del segmento integrado? Estas preguntas so• fundamentales para definir el proceso por medio de cual el plásmido Ti transforma una célula de un.: planta en un tumor. ¿Cuál es la estructw·a del sitio d iana? Las secuencias que nanquean al T-DNA integrado tie:r.den a ser ricas en pares de bases A-T (característicc que exhiben los sirios diana de algunos elernentoo_ transpon ibles). Las reestructuraciones de secuencü que ocurren en los extremos del T-DNA integrad dificultan el análisis de la estructura; se de~ conoce ) el proceso de integración genera en el DNA secuencias nuevas comparables con las repeticiones dian¿ creadas en la transposición. El T-DNA se expresa en este sitio de integración. La región contiene numerosas unidades de transcripción, cada tma de las cuales probablemente contenga un gen expresado a panit de un solo promotOr cuyas funciones se relacionan con el estad•_ de la célula de la planta, el mamenimienro de sus propiedades tumorigénicas, el comrol de la formación de brotes y tallos, y en la supresión de la diferenciación en otros tejidos; ninguno de estos gen~ es necesario para la transferencia de l T-DNA. El plásmido Ti presenta una interesante organización de funciones. Fue ra de la región T, pone; genes necesarios para iniciar la oncogénesis, de lm cuales, cuando menos algunos están involucrado9 en la transferencia del T-DNA, y sería interesru1H:' saber si orros funcionan en la célula de la plante. para influir en su comportamiento de esta etapa. Por otra pane, fuera de la región T se encuentran l o~ genes que permiten a Agrobacleríum cataboliza:Ja opina que producirá la célula de la planta. En Je región T hay genes que controlan el estado transformado de la planta, así como a los genes que pro· vocan la síntesis de las opinas que beneficiarán a: Agrobaclerium que originalmente proporcionó el IDNA. / Desde un punto de vista práctico, la capacidad de Agrobacteriurn para transferir el T-DNA al genoma de la planta hace posible Ja introducción de genes nuevos en las plantas. l a transferencialintegraciór:: y las funciones oncogénicas son indepenclienres, de modo que es posible diseñar plásmidos Ti nuevos er los cuales dichas funciones hayan sido remplazada~

.er otros genes cuyo electo en la planta nos gustaría aluar. La existenda de un sistema natural para -cmsmitir genes al genoma de la planta facilitaría ~ormemen tc la ingeniería genética de las plantas.

Resumen := círculo rodame es una alternativa de replicadón ~las moléculas circulares de DNA en las cuales un !igen es hendido para proporcionar un extremo ~bador. Desde cs1c extremo se simetiza una cadena ~ DNA que desplazíl a la cadena compañera ori, nal, la cual es extraída en forma de cola. Muchos . ~nomas se producen por revoluciones continuas d círculo . Los círculos rodante!> permiten replicar a lgunos .,;gos. La proteína A que hace una hendidura en el :igen e haya sintetizado una cadena comple . y después vuelve a hacer una hendidura en el igen, con lo cual libera a la cadena desplazada y :npieza otro ciclo de replicación. Los árculos rodames también son caracterís.::os de la conjugación bacteriana, la cual ocurre ;~ando un plásmido Fes transferido de un donador una célula receptora después de la iniciación del nracto entre las células por medio de los pili F. - !l plásmido P libre infecta a células nuevas por .::¡e mcdjo; un factor F integrado crea una cepa de .~r que podría transferir DNA cromosómico. En la _ njugación, la replicación permite sintetiznr los •mplememos de la cadena que permanece en el nadar y de la que es transferidJ al receptor, pero ' proporciona la fuerza motriz. las agrobacterias inducen la formación de tu- ores en las plantas lesionadas . Las células lasti· ·,adas secretan compuestos fenólicos que activan a 5 gene~ vir que pona el plásrrúdo Ti de la bacteria. _.Js productos de dichos gene!> hacen que una mo ;;Wla de DNA de cadena individual de la región :1 T-DNA del plásmído sea transferida al núcleo de · célula de la planta. La transferencia se inicia en 1a fromera del T-DNA, pero termina en diferentes

sitios. La cadena individual es convertida en una cadena doble e integrada al genoma de la planta. Los genes que están en el T-DNA transforman a la célula de la planta y hacen que produzcan opinas específicas (derivados de la arginina). Los genes del plásmido Ti permiten que las A9robacteria metaboJicen las opinas producidas por la célula transformada de la planta. El T-DNA ha sido utilizado para desarrollar vectores de transferencia de genes a las <:"élulas de las plantas.

~eferencia s Los circulas rodantes producen multímeros de un replicón Artícul:> d!' Gilben,

inv~~tig.lción

w. and Drcssler,

rolling circle model.

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lriJ

El plásmido Fes transferido por conjugación entre bacterias

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Referencias

40 7

La replicación bacteriana está conectada con el ciclo celular ESQUEMA DEL CAPÍTULO

111:1 Introducción

Los genes min regulan la localización del septo • La ubicación del septo es controlada por minC, -0 y -E. • El número y la localización de los septos depende de la proporción de MinE/MinC,D. • El septo se forma en donde MinE puede formar un anillo. • A concentraciones normales, MinC/0 permite la formación de un anillo central, pero impide que se formen anillos adicionales de MinE en los polos.

La replicación está conectada con el ciclo celular

•

• • •

El tiempo de duplicación de E. coli puede fluctuar en un rango de hasta 10 veces. dependiendo de las condiciones de crecimiento. El cromosoma bacteriano tarda 40 min en replicarse (a temperatura normal). La culminación del ciclo de replicación desencadena una división bacteriana 20 min después. Si el tiempo de duplicación es menor a 60 min, se inicia un ciclo de replicación antes de la división resultante del ciclo de replicación previo. Por lo tanto, las altas velocidades de crecimiento producen cromosomas de horquillas múltiples. Un ciclo de replicación es iniciado en una proporción constante de masa/número de origenes cromosómicos. Hay un origen por célula unitaria de 1.7 ¡.¡m de longitud.

La segregación cromosómica puede requerir de recombinación específica de sitio • El sistema de recombinación especifica de sitio Xer actúa en una secuencia diana ubicada cerca del término del cromosoma para recrear monómeros si un evento de recombinación generalizada ha transformado al cromosoma bacteriano en un dímero.

La partición implica la separación de los cromosomas

IDO EL septo divide una bacteria en bacterias hijas

• Los orígenes de los replicones pueden estar adheridos a la membrana interna de la bacteria. • Los cromosomas realizan movimientos abruptos del centro a las posiciones que se encuentran a v. y a ''• de la longitud total de la célula.

que contienen cada una un cromosoma • La formación del septo inicia en el anillo localizado en torno a la célula donde se modifica .a estructura de la envoltura. Nuevos anillos son iniciados a media distancia entre el septo y los extremos de la bacteria. • Cuando la bacteria se divide. cada hija posee un anillo en la porción central. • La formación del septo empieza cuando la célula llega a una longitud predeterminada. • El septo está formado por los mismos peptidoglucanos que constituyen la envoltura bacteriana.

Los plásmidos de una sola copia tienen un sistema de partición Los plasmidos de una sola copia existen a razón de una copia de plásmido por cada origen de cromosoma bacteriano. Los plásmidos de copias múltiples existen en más de una copia de plásmido por cada origen de cromosoma bacteriano. • La recombinación homóloga entre los plasmidos circulares genera dímeros y multimeros superiores. Los plásmidos tienen sistemas de recombinación específic.: de sitio que llevan a cabo la recombinación intramolecular para regenerar monómeros. Los sistemas de partición garantizan que los plásmidos duplicados sean segregados a células hijas distintas producidas por una división.

Las mutaciones de la división o la segregación modifican la forma de la célula • los mutantes fts forman filamentos largos debido a que el septo no se forma y no divide a la bacteria hija. • Las minicélulas se forman en los mutantes que producen demasiados septos; son pequeñas y carecen oe DNA. • Las células anucleadas de tamaño normal son generadas por mutantes de partición en los cuales los cromosomas duplicados no logran separarse.

El producto FtsZ es necesario para la formación del septo • El producto de ft.sl es necesario para la formación del septo en sitios preexistentes • ftsZ es una GTPasa que forma un anillo en el interior de la envoltura bacteriana y que está conectada con otros componentes del citoesqu.eleto.

408

fmm

La incompatibilidad de Los plásmidos depende de. replicón • Los pl~smidos que se encuentran en un solo grupo de compatibilidad tienen origenes regulados por un sistema::.: control común.

El sistema de compatibilidad ColEl es controlado por un regulador de RNA • la replicación de ColEl exige que la transcripción pa~e por el origen, donde el transcrito es dividido por la RNAasa H para generar un ext remo cebador. • El RNA r regulador es un RNA corto antisentido qtJe se aparea con el transcrito e impide la división que genera et extremo ceba.dor. • La proteína Rom potencia el apaream iento entre el RNA I y el transcrito.

Introducción _:; forma de controlar y vincular la replicadón con ciclo celular constituye una diferencia importante .Hre procariotas y eucariotas. En las segundas, aplica Jo siguiente: • los cromosomas residen en el núcleo • cada cromosoma esrá formado por numerosos replicones • la replicadón requiere de la coordinación de estos replicones para reproducir el DNA durante un periodo discreto del ciclo celular • la decisióu de realizar o no la replicación depende de una ruta compleja que regula el ciclo celular y • los cromosomas duplicados son segregados a las células hijas durante la mitOsis por un mecanismo especial. En la se muestra que en las bacerias, la repHcación es activada en un solo origen :uando la masa celula r se incrementa más allá del .1mbral y la segregación de los cromosomas hijos -[ene lugar cuando se garanüza que se encuentren _n lados op uestos del septo que crece para dividir a bacteria en dos. ¿Cómo sabe la célula cuándo iniciar el ciclo de :eplicación? El evento de iniciación ocurre en una !'toporcíón constante de masa celular respecto del 'lúmero de orígenes cromosómicos. Las células que .:recen más rápido son más grandes y poseen un Júmero mucho mayor de orígenes. El crecimiento de E. cofi puede describirse en función de la célu la unitaria, una entidad de l. 7 11m de largo. Una bacteria contiene un origen por célula unitaria; una .:élula con dos orígenes q ue crece rápidamente, Lie::le una longitud de !.7 a 3.4 pm . ¿Cómo se LiLUla la masa celular? Una proteína .nidadora podría ser sintetLzada continuamente du::ame todo el ciclo celular y la acumulación de una .:anudad crírica activaría la iniciación, lo cual explica porqué se necesita la síntesis proteínica para el e ven:o de iniciación. Otra posibilidad es que una proteína inhibidora pudiera ser sintetizada en un pumo fijo y diluida por debajo de un nivel efectivo por el incremento del volumen celular.

lim ¿Cómo se replican y segregan las mitocondrias? • La replicación y la segregación del DNAmt a las mitocondrias hijas son eventos estocásticos. • La segregació n mitocondrial a las células hijas también es un evento estocástico.

i11D Resumen

Algunos de los eventos de la partición de los cromosomas hijos son consecuenda de la morfología circular del cromosoma bacteriano. Se dice que los cromosomé\S circulares están encadenados cuando uno pasa a través de otro, conectándolos; para separarlos son necesarias las topoisomerasas. Un tipo de estructura alterno se forma cuando ocurre un evento de recombinación, una sola recombinación entre dos monómeros los convierte en un solo dímero. Esto se resuelve po r un sistema de recombinación especializado que recrea los monómeros independientes. En esencia, el proceso de partición es manejado por sistemas enzimáticos que actúan directamente en secuencias discretas de DNA.

Una célula unitaria tiene un cromosoma circular

La replicación inicia cuando ta célula rebasa un tamano crftico La replicación genera cromosomas hijos encadenados Los cromosomas hijos se separan

El septo divide a la célula

Las células hijas se separan

•

La replicación inicia en el origen bacteriano cuando una célula rebasa un umbral critico de tamatio. La culminacíón de la replicación produce cromosomas hijos que pueden ser ligados por recombinación o encadenados y que se separan y desplazan a lados opuestos del septo antes de que la bacteria se divida en dos.

t 7. 1 Introducción

409

1f11

La replicación está conectada con el ciclo celular

Conceptos principales • El tiempo de duplicación de E. coli puede fluctuar en un rango de hasta 10 veces. dependiendo de las condiciones de crecimiento. • El cromosoma bacteriano tarda 40 min en replicarse (a temperatura normal). • La culminación del ciclo de replicación desencadena una división bacteriana 20 min después. • Si el tiempo de duplicación es menor a 60 min, se inicia un ciclo de replicación antes de la división resultante del ciclo de replicación previo. • Por lo tanto, las altas velocidades de crecimiento producen cromosomas de horquillas múltiples. • Un ciclo de replicación es iniciado en una proporción constante de masa/número de orígenes cromosómicos. Hay un origen por célula unitaria de 1.7 IJ m de longitud. Las bacterias rienen dos vínculos entre la replicación y el crecimiento celular: • La frecuencia de la inidación de los ciclos de replicación está ajustada para corresponder con la velocidad a la cual La célula está creciendo. • La culminación de un ciclo de replicación está conectada a la división de la célula. La velocidad del crecimiento bacteriano se evalúa mediante el tiempo de d u plicación, que es el

Término

Origen

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Divisi:- " ' 3510 ~

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3rerminación

El intervalo fijo de 60 min entre la iniciación de la replicación y la división celular produce cromosomas con horquillas múltiples en las células que crecen rápidamente. Nótese que sólo se muestran las horquillas de replicación que se desplazan en una dirección; de hecho, el cromosoma es replicado simétricamente por dos conjuntos de horquillas que se mueven en direcciones opuestas en cromosomas circulares.

410

periodo necesario para que el número de célulasduplique. Enrre más corto sea. mayor será la ve cidad de crecimiento. Las células de E. coli puedecrecer a tasas que oscilan entre 18 y 180 min. ~ cromosoma bacteriano es un replicón individual. t.. modo que la frecuencia de los ciclos de replicaciL es controlada por el número de eventos de iniciación en el origen único. El ciclo de replicación puec ser definido en función de dos constantes: • e es el tiempo fijo. -40 min, necesario par.; replicar el cromosoma bacteriano complet Esta duración corresponde a una velocidc. de desplazamiento de la horquilla de rep:icación de -so 000 bp/minuto. (La velocida_ de la símcsis de DNA es más o menos invariable a temperatura constante, procede .; la misma velocidad a menos que el abastecimiento de los precursores constituya ur.lim itante, y hasta que ello suceda. ) • Des el tiempo fijo, -20 m in, que rranscurr. enue la culminación de un ciclo de replicación y la división de La célula con la cual es¡~ conec1ado. Este periodo puede represem;:;el tiempo necesario para ensamblar los con:.ponemes requeridos para la división. (Se puede considerar que las constantes e y D representan la velocidad máxima a La cual la bacterL puede llevar a cabo estos procesos; dichas constante se aplican en todas las velocidades de crecirrúent. cuyo tiempo de duplicación se encuentra entre 1~ y 60 min, si bien las dos fases constantes se alargar. cuando el ciclo celular ocupa >60 min.) Un deJo de replicación cromosómica debe seiniciado en un tiempo fijo de e+ D =60 mio antt!de w1a división celular. En las bacterias que se dividen a una frecuencia mayor de 60 min, un ciclo dl replicación debe ser iniciado ames del final del cick de división precedente; podría decirse que una célula ha nacido preñada con la siguiente generación. Considérese un ejemplo de células que se dividen cada 35 min. El ciclo de replicación conectado e una división debió haberse iniciado 25 min antes de la división precedente, situación que se ilustra en le . en la cual se muestra al complementl cromosómico de una célula bacteriana a intervalo;:. de 5 min durame el ciclo. En la división (35/ 0 min), la célula recibe ur cromosoma parcialmente replicado. La horquilla dt replicación sigue avanzando. A los 1O m in. cuan· do esta horquilla de replicación Hantigua" aún Ul ba llegado a término, la iniciación ocune en ambo~ orígenes del cromosoma parcialmente replicado. E. inicio de estas "nuevas" horquillas de replicación da lugar a un cromosoma de horquillas múltiples A los 15 min, esto es, 20 min antes de la siguiente división, la antigua horquilla de replicaciór

CAPÍTULO 17 La replicación bacteriana está conectada con el ciclo celular

.;;a a término. Su llegada permite que los dos erosornas hijos se separen; cada uno de ellos ya ha o replicado parcialmente por las nuevas horquí35 de replicación (las cuales ahora son las únicas rquillas de replicación) y siguen avanzando. En el pumo de división. los dos cromosomas =rdalmente replicados se segregan, con lo cual se -crea el punto en que se inició. La horquilla de ~p ücación indivJdual se torna HaotiguaH. termina r 15 min y 20 después tiene lugar una división. ::observa que el evento de iniciación ocurre 125 /;s .:los celulares ames del evento de división con el Jal está asociado. El principio genera l del vínculo entre la inicia(m y el ciclo celular es que, conforme se acelera crecimiento de las célu las (el cido se acorta), el "··ento de iniciación ocurre a un número mayor de ...dos antes de la división relacionada. de modo que ay más cromosomas en la bacteria individual. Esta dación puede verse como la respuesta de la célula :su incapacidad p
El septo divide a una bacteria en bacterias hijas que contienen cada una un cromosoma

de la célula y constituye el sitio en que las dos células hijas finalmente se separan por completo. Dos preguntas relacionadas señalan la función del septo en la división: ¿Qué determina la ubicación en la cual se forma? ¿Qué garanliza que los cromosomas hijos se encuentren en lados opuestos a él? La formación del scpto va precedida por la orga nización del a nillo p erisep tal. que en E. coli o en Salmonella typhinwrium se observa como una zona en la cual se modifica la estructura de la envoltura, de manera que la membrana interna se conecta más estrechamente con la pared celular y la capa de la membrana externa. Como sugiere su nombre, el anillo rodea a la célula. En la se resume

su desarrollo. La formación del anWo empie-za en el cem ro en una célula nueva. Coniorme la célula crece, ocurren dos eventos, se rorma un septo en la mitad de la célula cuya posición es definida por el anillo, y se rorman aniUos nuevos a ambos lados del anillo inidal. Estos nuevos anillos son desplazados del centro y se trasladan a lo largo de la célula a posiciones ubicadas a un cuarto y tres cuanos de la longitud de la célula, que serán las posiciones centrales de ésta después de la división siguiente. El desplazamien to del anillo periseptal a la posición correcta puede ser el evento eructa! que garantice la divísión de la

Conceptc•s principales

• la formación del septo inicia en el anillo localizado en torno a la célula donde se modifica la estructura de la envoltura.

..

-.

Se generan nuevos anillos

• Nuevos anillos son iniciados a media distancia entre el septo y los extremos de la bacteria. Cuando la bacteria se divide, cada hija posee un anillo en la porción central.

Los aníllos nuevos se desplazan hacia los polos

• l a formación del septo empieza cuando la célula llega a una longitud predeterminada.

Los anillos nuevos dejan de moverse

• EL septo está formado por los mismos peptidoglucanos que constituyen la envoltura bacteriana.

:.a segregación cromosómka de las bacterias es :?specialmenre interesante debido a que el DNA está :rrtplicado en el mecanismo de la partición. lo cual .::ontrasta con las células eucarióticas, en las cuales !a segregación se logra mediante el complejo me.:anismo de la milosis. El mecanismo bacteriano es bastante preciso. pero las células anucleadas constimyen <0.03% de una población bacteriana. La división de una bacteria en dos células hijas 5e logra por la formación de un septo, estructura fo rmada en el centro de la célula a manera de una invaginación de la envoltura circundante. El septo forma una barrera impenetrable entre las dos partes

La célula empieza con un anillo en el centro

El anillo central se transforma en un septo

- - - - • • La célula se divide La vista lateral muestra que el anlllo abarca la circunferencia de la célula El cone transversal muestra que el anillo conecta a las membranas

Membrana externa Pared celular Membrana interna

La duplicación y el desplazamiento del anillo periseptal dan origen a la formación de un septo que divide a la célula.

17.3 El septo divide a una bacteria en bacteri as hijas que contienen cada una un cromosoma

411

Orfgenes de los cromosomas en proceso de repl icación adheridos a la membrana Cromosomas hijos adheridos a la envoltura

El septo crece entre los cromosomas

El septo divide a la célula

Cromosomas distribuidos en las células hijas

La adhesión del DNA bacteriano a la membrana podría proporcionar un mecanismo para la segregación.

célula en células hijas de dimensiones equivalentes. (Se desconoce el mecanismo de desplazamiento.) La formaci ón del septo empieza cuando la célula alcanza una longitud fija (2L) y la distancia emre los nuevos aniUos siempre será L. No sabemos cómo mide la célu la la longitud, pero el parámetro perlinente parece se.r la distancia lineal como tal (no el área ni el volumen). El septo consta de los mismos componentes que la envoltura celular, una capa rígida de peptidoglucano en el periplasma, entre la membrana interna y la membrana externa. El peptidoglucano está formado por polimerización de unidades disacárido-tripéptído o disacárido-pentapéptido en una reacción que implica conexiones entre ambos tipos de subunidades (transpeptidación y transglicosilación). La rorma de variJla de la bacteria se mantiene merced a un par de elemen tos, PBP2 y RodA, que son proteínas que interactúan y son codificadas por el mismo operón. RodA es un miembro de la familia SEDS (por sus siglas en inglés, forma, elongadón, división y esporulación [shape, elongation, division and sporulation]), presente en rodas las bacterias, que tiene una pared celular de peptidoglucano. Cada proteína SEDS funciona con una rranspeptidasa que cataliza la formación de los enlaces cruzados del peptidoglucano. La PBP2 (proteína de unión a la penicilina 2, penicillin-bindin.g protein 2) es la transpeplidasa que interacrúa con RodA. Las mutaciones del gen de cualquiera de las dos proteínas provocan que la bacreria pierda su forma alargada y se ror412

ne redonda, demostración del importante principio que asevera que la forma y la rigidez pueden ser determinadas por la simple extensión de la estruclllra poJimética. Otra enzima es responsable de generar al peptídoglucano en el septo (véase la sección 17.5 El producto FtsZ es necesario para la formación de: scpto). Al principio, el septo se forma con una capa doble de pepridoglucano y la proteína EnvA es necesaria para dividir los enlaces covalentes formado~ entre las capas, de modo que las células hijas puedan. separarse. El comportamiento del anillo periscptal sugiere que el mecanismo uUlizado para medir la posición se relaciona con la envoltura celular. Es plausible suponer que la envoltura podría también ser urilizada para garantiza r la segregación de los cromosomas. Un enlace directo entre el DNA y la membrana podría explicar la segregación . Si los cromosomas hijos están adhe1idos a la membrana, se separarían t se físicamente al formarse el septo. En la muestra que la formación de un septo podría segregar a los cromosomas en las diferentes cél ulas hijas si los orígenes están conectados con sitios que se encuentran a ambos lados del anillo periseptal.

Las mutaciones de la división o la segregación modifican la forma de la célula Conceptos principales • Los mutantes fts forman fi lamentos largos debido a que el septo no se forma y no divide a la bacteria hija. • Las minicétulas se forman en los mutantes que producen demasiados septos; son pequeñas y carecen de DNA. • las células anucleadas de tamaño normal son generadas por mutantes de partición en los cvales los cromosomas duplicados no logran separarse.

Una dificultad para aislar a los mutames que afectan la división celular es que, en las funciones críticas, las mutadones pueden ser letales o pleiotrópicas. Por ejemplo, sí la formación del anillo tiene lugar en un sitio esencial para el crecimiento general de la envoltura, sería difícil distinguir entre las mutaciones que interfieren específicamente con la formación del anillo y las que inhiben el crecimiento general de la envoltura. La mayoría de las mutaciones del mecanismo de división han sido identíficadas como mutantes condicionales (en cuya división inciden condiciones no permisibles; habitualmente son sensibles a la temperatura) . Las mutaciones que afectan a la división celular o a la segregación de los uomosomas provocan cambios fenotípicos

CAPÍTULO 17 La replicación bacteriana está conectada con el ciclo celular

Panel superior: células de tipo silvestre. Panel la falla de la división celular a temperaturas no per-;;ibles genera filamentos multinucleares. Imágenes cortesía -.:Sota Hiraga, Kyoto University. ·_~rior:

llamados por su filamentación sensible a la temperatura. temperature sensitive filamenta tion) que identifican los defectos que yacen en el proceso de división mismo. • Las mjnicé lulas se crean cuando el septo se forma con demasiada frecuencia o en un lugar no adecuado, de modo que a una de las células hijas le falta un cromosoma . La minicélula es bastante pequeña y carece de DNA. pero por orra parre parece morfológicamente normal. Las células anucleadas se forman cuando la segregación es aberrante, y como las minicélulas, carecen de cromosoma, pero como la formación del septo es normal, su tamaño no sufre modificaciones. Este fenotipo es provocado por los mutanres par. de panidón (así llamados por sus defectos en la segregación cromosómica).

El producto FtsZ es necesario para la formación del septo Conceptos principales • El producto de ftsl es necesario para la formación del septo en sitios preexistentes. • FtsZ es una GTPasa que forma un anillo en el interior de la envoltura bacteriana y que está conectada con otros componentes del citoesqueleto.

E. coli genera células anucleadas cuando la se;-egación cromosómica falla . Las células con cromosomas se íen de azul. a diferencia de las células hijas que carecen de ·:~mosomas. Este campo muestra células del mutante mukB; : .ede observarse la división normal y la anormal. Imagen cor-~ía de Sota Hiraga, Kyoto University.

~ombrosos.

En las y se ilustran opuestas de falla en el proceso de :visión y de falla en la segregación: • Los filamentos largos se forman al inhibirse la formación del septo, pero la replicación cromosómica no resulta afectada. La bacteria sigu e creciendo. incluso sigue segregando a sus cromosomas hijos. pero no se forma el septO. Así pues, la célula consiste en una estructura filamentosa bastante larga con los nucleoides (cromosomas bacterianos) distri· bu idos regularmente a lo largo de la misma. Este fenotipo es el de los muta mes fts (así

'S consecuencias

El gen ftsZ tiene un papel fundamemal en la di visión; sus mutaciones bloquean la formación del septo y generan filamentos. La expresión excesiva induce la formación de minicélulas al incrementarse el ní1mero de eventos de formación septal por masa de célula unitaria. Los mutantes ftsZ actúan en etapas que van del desplazamiento de los anillos perisepta lcs a la morfogéncsis septal, de modo que un FtsZ es un producto necesario para la utilización de los sitios preexistentes para la formación del sepro. pero en sí. no afecta la formación de los anillos periseptales o su localización. FtsZ funciona en una de las primeras etapas de la formación del scpto. AJ principio del ciclo de división se locali.la en todo el citoplasma. y conforme se alarga la célula y empieza a constreñirse en el centro. se localizará en un anillo en wrno a la circunferencia. En ocasiones, a la estructura se le llama aniUo Z. En la se muestra que se encuemra en la posición del anillo central de la Figura 17.3. La formación de este aniJio es el paso que limita la velocidad de formación del septo. En un ciclo de división celular típico. se forma en el centro de la célula de 1 a 5 min después de la división, perdura durante 15 min y después se constriñe para dividir a la célula en dos. 17 5 El producto FtsZ es necesario para la fo rmación del septo

413

La inmunofluorescenc1a con un anticuerpo contra FtsZ muestra que se localiza en el centro de la célula. Imagen cortesía de William Margolin, University of Texas Medica! School at Houston .

La estructura de FtsZ es semejante a la de la tubulina, lo cual sugiere qlJe el ensamble del anillo puede parecerse a la formación de los microtúbulos de las células eucarióticas. FtsZ tiene actividad GTPasa y la división por GTP se utiliza para respaldar la oligomeri:lación de sus monómeros en la estructura anular. El anillo Z es una estructura dinámica en la cual hay un intercambio continuo de subunidades con acervo citoplásmico. Otras dos proteínas necesarias para la división, ZipA y FtsA, inleractúan directamente y de forma independiente con FtsZ. ZipA es una proreú1a integral de membrana localizada en la membrana interna de las bacterias que proporciona los medios para ligar a FtsZ con la membrana. Esta ú ltima es una proteína citosólica, pero suele estar asociada con la membrana. El anillo z puede formarse en ausencia de ZipA o de FtsA. pero no si ambas están ausentes, lo cual sugiere que sus funciones se traslapan con la estabilización del anillo Z y quizá con la vinculación con la membrana. Los productos de muchos otros genes fts se unen al anillo Z en un orden definido después de que la proteína FtsA ha sido incorporada, todas son proteínas transmembrana . A la estructura final suele llamársele anillo septal. y está formado por un complejo multiproteíníco que se presume tiene la capacidad de constreñir la melUbrana. Uno de los últim os componentes en ser incorporado al anillo septal es FtsW, una proteína que pertenece a la familia SED$. ftsW se expresa como parte de un operón con ftsl. el cual codifica a una transpeptidasa (también conocida como PBP3 [proteína de unión a la penicilina 3, penicillin-binding prote in 3 j ), proteína u nida a la membrana cuyo sitio catalítico se encuentra en el periplasma . FtsW es responsable de incorporar a Ftsl en el anillo septal, Jo cual sugiere un modelo para la formación del septo en el que la actividad transpeptidasa provoca que el peplidoglucano crezca hacia adentro, empujando así a la membrana interna y jalando a la externa. FtsZ es el principal componente del citoesqueleto para la formación del septo; es común en las bacterias y también se encuentra en los cloroplas-

414

La inmunofluorescencia con anticuerpos com-:: las proteínas FtsZl y FtsZ2 de Arabidopsis muestra que se L:calizan en el punto medio del cloroplasto (panel superior). _: imagen de campo brillante (panel inferior) muestra el esqueré del cloroplasto con mayor claridad. Fotografías cortesía de 1<2therine Osteryoung, Michigan State University.

tos. En la se muestra la locaJizadón a los homólogos de las plantas en un anillo, en e punto medio del cloroplasto. Los cloroplastos tam bién tienen otros genes relacionados con los de . división bacteriana. Aparentemente se ha conse> vado el mecanismo de división, y coincide con l• orígenes evolutivos comunes de las bacterias los cloroplastos. Las mitocondrias, que también comparten t: origen evolutivo con las bacterias, usualmente e¿ recen de FtsZ; en cambio. uúlizan una variante¿ la proteína dinamina involucrada en el estrang~ !amiento de las vesículas desde las membranas d_ citoplasma cucariótico, la cual funciona desde _ exterior del organelo, comprimiendo la membrar para generar una constricción. Así pues. la característica común en la divisir de las bacterias, los cloroplastos y las mitocondriz es el uso de una proteína citoesquelética que forrr; _ un anillo en romo al organelo y jala o empuja a membrana para formar w1a constricción.

CAPÍTULO 17 La replicación bacteriana está conectada con el ciclo celular

liD Los genes min regulan

Anillos

la localización del septo

1\

O:onceptos principales

1

• La ubicación del septo es controlada por minC, -D y -E.

• El número y la localización de los septos depende de la proporción de MinE/MinC.D. • El septo se forma en donde MinE puede formar un anillo. • A concentraciones normales, MinC/D permite la

forma ción de un anillo central. pero impide que se formen anillos adicionales de MinE en los polos.

=..as minicélulas mutantes proporcionan informa::ión respectO de la localización del septo. La mu~d ón original de las minicélu las se e ncuentra en d locus minB, cuya deleción genera minicélulas al oermitir que tenga lugar la sepa ración en los polos (o en vez de) a mitad de la célula; esto sugiere que a célula posee la capacidad de iniciar la formación _el septo a la mitad o en los polos, y que la función ,el locus minB de úpo silvestre es suprimir la for'"'1ación de septos en estos últimos. En función de '15 eventos ilustrados en la Figura 17 .3, esto implica .. ue una célula recién nacida tiene sitios potenciaes de formación de septos asociados con el anillo •.:ntral y con los polos. Uno de los polos se formó .el scpto de la división previa. mienuas que el ouo -epresema al septo de la división anrerior a ella. Juizá los polos retienen remanentes de los anillos ..e los cuales fueron derivados y estos remanentes '"~uedcn nuclear la [ormación del septo. Ellocus minB está formado por tres genes, minC, :inD y minE cuyas funciones se resumen en la . Los prodtlctos de minCy de minD forman ·n inhibidor de la división. MinD es necesaria para ctivar a MinC, que impide que FtsZ se polimerice -D el anillo Z. La expresión de MinCD en ausencia de MinE, o .a expresión excesiva incluso en presencia de MinE, ~ rovoca una inhibición generalizada de la división. ~~ resultado es que la células crecen como filamen--,s largos, sin septo. La expresión de MinE en nieles comparables a M1nCD confina la inhibición a ..iS regiones polares, restaurando así el crecirrúemo ,ormal. MinE protege de la inhibición a los sitios de -:titad de la célula. La expresión excesiva de MinE nduce la formación de minicélulas porque el exceso e la misma contrarresta la inhibición en los polos a miLad de la célula, permitiendo que se formen Js septos en ambas ubicaciones. El determinante de la formación de los septos c::n el sitio adecuado (a mitad de la célula) es, por lo ..anto, la proporción de MinCD respecto de MinE.

J~Septo Polos denvados del seplo ~e. la división anterior a la uluma Polos denvados del septo de la última d1vislón

r

)

~

1

(

Capacidad de formación del seplo

Formación del septo

lnnlb<dor MlnCO

Capacidad de formación del septo MinC/ D es un inhibidor de la división cuya acción se limita a los sitios polares por MinE.

El nivel silvestre impide la formación de septos en los polos. pero la permite a mitad de la célula. Los efecros de MinC/D y de MinE están relacionados inversamemc; la ausencia de MinCD o el exceso de MinE provoca la formación indiscriminada de septos, creándose minicélulas; asimismo, una gran cantiJad de MinCD o la ausencia de MinE inhibe los sitios de mitad de la célula y los de los polos. lo cual resu lla en filamentación . MinE forma un aailJo en la posición septal, pero su acumulación suprime la acción de MinCD en las cercarúas, permitiendo así la formación del anillo septal (el cual incluye FtsZ y ZipA). Curiosamente, para la formación del an illo MínE, se necesita MinD.

La segregación cromosómica puede requerir de recombinación especifica de sitio Concepto principal • El sistema de recombinación específica del sitio Xer actúa en una secuencia diana ubicada cerca del término del cromosoma para recrear monómeros si un evento de recombinación generaUzada ha transformado al cromosoma bacteriano en un dímero .

17.1 la segregación cromosómica puede requerir de recombinación específica de sitio

415

1

Cfrculo dimérico

e

R•oombiMOóO

ce""'" moooméOoos

)

J

La recombinación intermolecular fusiona monómeros para formar dímeros, en tanto que la recombinación intramolecular libera unidades individuales de los oligómero~.

La célula llene un solo cromosoma circular

Emp1eza la replicación b¡direcc1onal

La replicación se mueve en tomo al cromosoma

/

Sin recomblnación Los cromosomas hijos se alejan

Los cromosomas hijos se segregan

Recombinaclón general El movimiento es constreñido

La recombinación específica de sitio libera a los cromosomas X

Los cromosomas hijos se segregan

Un cromosoma circular se replica para producir dos hijos monoméricos que se segregan a las células hijas. Sin embargo, un evento de recombinación generalizada crea una sola molécula dimérica que puede separarse en dos monómeros por una recombinación especifica de sitio.

416

Las IntJ ltiples copias de un plásmido en una bacteri: constan de las mismas secuencias de DNA, de mod• que son capaces de rccombinarse. En la se demuesLran las consecuencias. Un solo evenr( de recombinación intermolecular entre dos círculos genera un círculo dimérico, y la recombinaciÓL posterior puede generar formas multiméricas superiores. Un evento de tales características reduce e número de unidades físicamente separadas. Er el caso extremo de un plásmido de una sola copia recién replicado, la formación de un dímero por recombinación significa que la célula sólo tiene una unidad para segregar y, por lo tanto, el plásmidc> debe ser eliminado inevitablemente de una célula

hija. Para contrarrestar este efecto, los plásmidos suelen 1cner sistemas de recombinación específica de sitio que acLúan en secuencias paniculares para promover una recombinación intramolecula:quc restablece la condición monomérica . Los mismos eventos pueden ocurrir con el cromosoma bacteriano. En la se muestra la forma en que afectan a su segregación. Si no ha\ recombinacíón, no hay problema, y los cromosoma~ hijos pueden segregarse a las células hijas. pero en caso de recombinación homóloga entre los cromosomas hijos producidos por un ciclo de replicación se producirá un dímero. Si ha ocurrido un evento de replicación de estas características, los cromosomas hijos no podrán separarse, en cuyo caso se requiere de un segundo evento de recombiuacíónpara Lograr la resolución de la misma forma que un dímero de plásmido. La mayor parte de las bacterias con cromosomas circulares cucma con el sisrema de recombinación específica de sitio Xcr. En E. coli está [ormado por dos recombinasas, XerC y XerD, las cuales acrúan en un sitio diana de 28 bp, denominado dif, qu e se localiza en la región terminal del cromosoma. El uso del sistema Xer se relaciona con la d iv isión celular de manera interesante. Los evemos destacados se muestran en la . XerC puede unirse a un par de secuencias d1[y formar una unjón Holliday. El complejo puede formarse poco después de que la horquilla de replicación pase po r la secuencia di[, lo cual explica la forma en que las dos copias de la c;ecuencia diana pueden encontrar otra de f01ma consisteme. Sin embargo. la resolución de la unión para producir recombinames. ocurre sólo en presencia de FtsK. una proteína localizada en el septo que es necesaria para la segregación de los cromosomas y la división celular. Además, la secuencia diana d1[ debe localizarse en una región de -30 kb, pero si es desplazada fuera de ésta, n o podrá respaldar la reacción . Así pues, hay una recombinación específica de sirio disponible cuando la secuencia terminal

CAPÍTU LO 17 La replicación bacteriana está conectada con el ciclo celular

del cromosoma está cerca del septO. No obstante, :a bacteria desea tener una recombinación sólo cuando ya ha renido lugar un evento de recombi:lación para generar un dímero (¡de otra manera la :ecombinación espeáfica de sitio crearía el dímero!) ¿Cómo sabe el sistema si un cromosoma hijo existe en forma de monómeros independientes o ha sido recombinado en un dímero? La respuesta puede ser que la segregación de :os cromosomas empieza poco después de la replicación. Si no ha habido recombinadón, los dos cromosomas se alejan uno del otro. Sin embargo, la ca ;¡acidad de las secuencias pertinentes para apanarse !.UJ.a de otra, puede ser constreñida si se ha formado

Los cromosomas son ligados en el sitio de recombinación

cg

1 t

0 -d" ~

un dímero, lo cual las fuerza a permanecer cerca del :>epto, donde están expuestas al sistema Xer. Las bacterias con sistema Xer siempre tienen un homólogo de FtsK y viceversa, lo cual sugiere que el sistema ha evolucionado de manera tal, que la resolución esrá conectada al sepro. FtsK es tma proteína :ransmembrana extensa cuyo dominio terminal N está asociado con la membrana y hace que ésta se localice en el septo. Su dominio terminal e tiene dos funciones, provocar que Xer separe a un dímero en los monómeros, además de una actividad ATPasa que puede utilizar para transferirse a lo largo del DNA in viera, que podría utilizarse para bombear el DNA a través del septo, de la misma forma en que SpolllE transporta al DNA del compartimiento madre a la pre-espora durante la esporulación. (Véase !a sección 17.8, La partición implica a la separadón ie los cromosomas.)

La partición implica la separa ción de los cromosomas Conceptos principales Los orígenes de los replicones pueden estar adheridos a la membrana i nterna de La bacteria . Los cromosomas realizan movimientos abruptos del centro a las posiciones que se encuentran a 1/4 y a lf~ de la longitud total de la célula.

La partición es el proceso por el cual Jos dos cromo.;omas hijos se ubican uno a cada lado de la posición en que se forma el septo, y para que sea adecuada, se necesitan dos tipos de eventos: • Los dos cromosomas hljos deben ser libera dos uno del otro para que puedan segregarse después de la terminadón, para lo cual es necesario eJ desenrollado de las regiones del DN A enrolladas una con otra cerca del término. La mayor parte de las mutaciones incide en el mapeo de los genes que codifi -

La recomblnasa Xer forma 1 una unión en d/1 ~

..

~ ú

FtsK es necesaria para la

~,":,

o 1

Un evento de recombinación crea dos cromosomas ligados. Xer crea una unión Holliday en el sitio dif, pero puede separarla sólo en presencia de FtsK.

can a las topoisomerasas con capaddad para pasar de una cadena de DNA a otra. Las m utaciones impiden que los cromosomas hijos se segreguen, con el resultado de que el DNA se localice en una sola masa extensa, a mitad de la célula. Posteriormente, con la formación del septo se libera una célula anucleada y una que incluye ambos crom osomas hijos, indicio de que la bacteria debe ser capaz de desenrollar sus cromosomas de forma topológica para poder segregados en diferentes células hijas. • Las mutaciones que afectan el proceso de partición son raras, pero suelen encontrarse dos clases; las mutadones de actuación en cis deben ocurrir en las secuencias de DNA que fungen como diana para el proceso de partición, en tanto que las mutaciones de actuación en trans se presentarán en los genes que cocüfican a las proteínas que provocan la segregación, los cuales pueden incluir proteínas que se unen al DNA o a actividades que controlan la localización en ! t.f. La partición implica la separación de los cromosomas

417

la envoltu ra. a las cuales puede adherirse el DNA. Amhos tipos de mutaciones han sido enconrrados en los sistemas responsables de la partición de los plásmidos, pero en el cromosoma bacteriano sólo se han encontrado las funciones de acwación en trans. Por otra parte, las mutaciones en los sistemas de recombinación específica de sitio de plásmidos incrementan la pérdida del plásmido (de bido a que la célula en proceso de división tiene sólo un dímero para la panición, y no dos monómeros). de modo que su fenotipo es similar al de los mutantes de partición. La forma original del modelo de segregación cromosómica que se muestra en la Figura 17.8 su giere que la cnvolLura crece por inserción de material entre los sitios de adhesión de los dos cromosomas, apartándolos. De hecho. la pared celular y la membrana crecen de forma heterogénea en toda la superficie celular. Más aún, los cromosomas replicados son Cilpaces de moverse abruptamente a sus posiciones finales localizadas a un cuano y a tres cuartos de la longitud rotal de la célula. Si se inhibe la síntesis proteínica antes de la terminación de la replicación, los cromosomas no pueden segregarse y permanecen cerca de la mitad de la célula. Sin embargo, cuando a la síntesis proteínica se le permite reiniciar, los cromosomas se mueven a las posiciones ubicadas en uno y tres cuartos de la longitud en ausencia de cualquier elongación posterior de la envoltura, lo cual sugiere que un proceso activo. es decir, que requiere de la síntesi!> proteínica, puede desplazar a los cromosomas a ubicadones específicas. La segregación es interrumpida por mutaciones de clase nwk, las cuales originan una progenie anudeada cada vez con mayor frecuencia y los dos cromosomas hijos permanecen en el mismo lado del sepro. en vez de segregarse. Las mutaciones que suceden en los genes muk no son letales y permiten identificar a los componentes del mecanismo que

Nucleoide progenitor

Hijo

Hljo condensado

condensado ReplicaciÓn

""

El ONA de un solo nucleoide progenitor se descondensa durante la replicación. El mukB es un componente esencial del mecanismo que condensa de nuevo los nucleoides hijos.

418

segrega a los cromosomas. El gen muk.A es idénrk al de una proteína de membrana externa conoC1da (/o/C), cuyo producto podría estar implicado cv:la adhesión del nomosoma a la envoltura. El ge:mukB codifica a una proteína globular extensa (18 kD) que tiene el mismo tipo general de organizaáéque los dos grupos de proteínas de mantenirnier.to estructural de los cromosomas (SMC, sm.wur.. maintenance of chromosomes) involucrados en la cordensación y el mantenimiento de la unión de h.. cromosomas eucarióticos (véase la secdón 31.6, Lo condensación de los cromosomas es provocada pl.'las condensinas). En unas bacterias también ha; sido encontradas protefnas de tipo SMC. El conocimiento de la función de MukB se derivó del descubrimien 1o de que a lgunas mutacione en mukB pueden ser suprimidas por mutaciones e·topA, gen que codíAca a la topoisomerasa l. Muk2 forma un complejo con otras dos proteínas, MukE y MukF, de modo que se considera que el complejr. MukBEF es un aná logo de la condensina para la condensinas eucarióticas. Uti liza un mecanismo dt superenrollamiento para condensar al cromosoma Un defecto de esta función es la causa de la incapa· cidad para segregar apropiadamente, el cual puede compensarse al impedir que las topoisomerasas relajen los superenrollados negativos; el incremente resultante en la densidad del superenrollado ayude: a restaurar el estado de condensación apropiado • por lo tanto, permite la segregación. Todavía se desconoce cómo se posicionan lo5 genomas en la célula, pero el proceso puede estarelacionado con la condensadón. En la se muestra un modelo actual. El genoma progenitor está en el centro, y debe ser descondensado para atravesar el mecanismo de replicación. Los cromosomas hijos emergen <.le la replicación, son desenrollados por las topoisomerasas y después. en un estado no condensado, pasan a Muk.BEF. de modc que formen masas no condensadas en posicione< que llegarán a ser los ccmros de las células hijas. Durame aJi.os se ha sospechado que existe ur vínculo físico enlrc el DNA de las bacterias y la membrana, pero las evidencias siguen siendo ambiguas_ El DNA bacteriano suele encontrarse en fracciones de membrana, las cuales tienden a ser abundantes en marcadores genéticos cerca del origen. la horquilla de replicación y el término. Las proteínas presentes en dichas fracciones de membrana pueder. ser afectadas por mlHaciones que imerfieren cor el inicio de la replicación. El sitio de crecimiemc podría ser una estructura de la membrana a la cua: debe adherirse el origen para la iniciadón. Durante la esporu lación en Bacillus subtilis, ur cromosoma hijo debe ser segregado en el peque-

CAPÍTULO 17 La replicación bacteriana esta conectada con el ciclo celular

compartimiento de la pre-espora (véase la fig. _Al). Se tra1a de un proce~o inusual que implica ':ransferencia del cromosoma a través del septo .dente. Uno de los genes de esporulación. spoJIIE, .necesario para el proceso. La proteína SpoillE se :aliza en el septo y probablemente tiene una fun n de [ranslocadón que bombea el DNA a través . companimiemo de la pre-espora.

Los plásmidos de una sola copia tienen un sistema de partición :()nceptos principales

•

• •

•

Los plásmidos de una sola copia existen a razón de una copia de plásmido por cada origen de cromosoma bacteriano. Los plásmidos de copias múltiples existen en más de una copia de plásmido por cada origen de cromosoma bacteriano. La recombinación homóloga entre los plásmidos circulares genera dímeros y multímeros superiores. Los plásmidos tienen sistemas de recombinación específica de sitio que llevan a cabo la recombinación intramolecular para regenerar monómeros. los sistemas de partición garantizan que Los plásmídos duplicados sean segregados a células hijas distintas producidas por una división.

::: ripo de sistema que utiliza un plásmido para ga·.mtizar que se distribuya entre las dos células hias en la división depende del tipo de sistema de ~cplicación. Cada tipo de plásmido conserva en su .ospedador bacteriano un númer o de copias ca·acrerístico: • Los sistemas de control de una sola copia son semejantes al del cromosoma bacteriano y resulran en una replicación por división celu lar. Un plásmido de una sola copia conserva de marrera efectiva la paridad con el cromosoma bacteriano. • Los sistemas de control de copias múltiples permiren varios eventos de iniciación por ciclo celular, lo cual resulta en numerosas copias del plásmido por bacteria, siempre un número característico (típicamente de 10 a 20) por cromosoma bacteriano. El número de copias se debe principalmente al :ipo de mecanismo de control de la replicación. El sistema responsable de iniciar la replicación determina cuantos orígenes puede haber en la bacteria. Cada plásmido está formado por un solo replicón, je modo que el número de orígenes es igual al número de moléculas de plásmido.

Los plásmidos de una sola copia cuentan con un sistema para el control de la replicadón cuyas consecuencias son similares a las del sistema de replicación que gobierna al cromosoma bacteriano . Un origen individual puede ser replicado una sola vez y los orígenes hijos son segregados a las diferentes células hijas. Los plásmidos de copias múltiples tienen un sistema de replicación que permite que exista un acervo de orígenes. Si el número es suficientemente grande (en la práctica, más de 10 por bacteria), no se necesita un sistema de segregación activa. pues incluso una distribución estadística de los plásmidos respecto de las células hijas resultaría en la pérdida de plásmidos a frecuencias de <10 6 • Los plásmidos se mantienen en las poblaciones bacterianas con rangos de pérdida muy bajos (típicamente
~

parA

parB

parS

"\p_

6 ¿_to "\ r

Un sistema de segregación común está formado por los genes parA y parB y por el sitio diana parS.

17.9 Los plásmidos de una sola copia tienen un sistema de partición

419

Stlio

de unión

~

IHFa

aiiHF

El complejo de partición se forma cuando el IHF se une al DNA en parS y lo dobla para que ParB pueda unirse a los sitios que se encuentran a ambos lados. El complejo es iniciado por un heterodímero de IHF y un dímero de ParB y después se unen más dímeros de ParB. par·B) y un elemento de actuación en cis (parS) localizados j usto en flujo descendeme respecto de los dos genes. ParA es una ATPasa que se une a ParB, y ésta, a su vez. con el sitio parS del DNA. Una deleción en cualquiera de lo!> tres loci impide la partición adecuada del plásmido. Se han caracterizados sistemas de este tipo en los plásmidos F. P 1 y R 1. A pesar de sus similitudes generales, no hay homología de secuencia significativa emre los genes correspondientes ni entre los sitios de actuación en ds. La función de parS en el plásmido equivale a la del centrómero en una célula eucariótica. Su unión con la proLeína ParB crea una estructura que segrega las copias del plásmido a células hijas opuesras. Una proteína bacteriana, IHF, también se une con este sirio para integrarse a la esrructura. El complejo formado por ParB e lfiF con parS se denomina complejo de partición. parS es una secuencia de 34 bp que contiene el sitio de unión con IHF y eslá fl anqueada en ambos lados por secuencias denominadas boxA y boxl3, un idas por ParB. 11-IF es el facwr hospedador de íntegTación (integration host factor), así llamado por la función en la cual se de:,cubrió (formando una estructura implicada en la integración de; DNA del fago 'A al cromosoma hospedador). IHF es un heterodímero con capacidad para formar una estructura grande en la cual envuelve el DNA en la superficie. La función del IIIF es doblar el DNA para que ParB pueda unirse simultáneamente a los sitios boxA y boxB separados. como se indica en la La formación del complejo se inicia cuando pm·S es unida por un heterodímero de IHF con un dímero de ParB, lo cual permite que más dímeros de ParB se unan de forma cooperativa. La interacción de ParA con la estructura del complejo de partición es esencial, pero transitoria. EL complejo proteína-DNA que se ensambla en el lHF du rante la inLegración del fago A. se une a dos

420

moléculas de DNA para permitirles recombin art(véase la secd6n 19.19. La recombinadón delfa= ), ocurre en un intasoma). La función del compil de partición es diferente, garantizar que dos mo' t culas de DNA se segreguen separadas una de or:.; Aún se desconoce de qué manera la formación
CAPÍTU LO 17 La replicación bacteriana está conectada con el ciclo celular

N

Ciclo celular de un plásmido El plásmido ,-::r.:: crea al __,.. ' ' Asesino' l) asesino y ~~~~ al antldotct Anhdoto

Ciclo celular de plásmidos incompatibles

__...

l La célula crece y f el olásmido se replica

La pérdida del plasmido deja a un asestno y a un antrdoto

o Asesino

La célula crece pero los plásmidos no se replican porque ya hay dos orígenes

o ~ La célula se divide

El antfdoto es degradado

l t

~

La célula se divide

)

J

Cada célula tiene una copia del mismo plásmido

El asesino destruye a la célula

Los plásmidos incompatibles se han distribuido en células diferentes

Dos pl~smidos son incompatibles (pertenecen al mismo grupo de compatibilidad) si sus orígenes no se diferencian en la etapa de iniciación. El mismo modelo podría aplicarse a la segregación.

Asesino

Los plásmidos podrían asegurar que las bacteas no sobrevivan sin ellos al sintetizar a un asesino de larga "ida y a un antídoto de vida corta.

.:-:>nsiste en proteínas asesinas y bloqueadoras. El .ásmido Rl tiene un asesino que es el RNAm para ..~na proteína tóxica; el antídoto es un RNA antisen:do pequeño que impide la expresión del RNAm.

La incom patibilidad de los plásmidos depen de del replicón Concepto principal los plásmidos que se encuentran en un solo grupo de compatibilidad tienen orígenes regulados por un sistema de control común . ~1 fenómeno de la incompatibilidad de los plásmidos :-stá relacionado con la regulación del número de _opias del mismo y con la segregación. Un grupo de compatibilida d se define como un conjunto de Jásmidos cuyos miembros son incapaces de coexis:!r en la misma célula bacteriana. La razón de esta ncompalibilidad es que no es posible distinguir uno .lel otro en algun<1 etapa esencial para el manteni1liento del plásm.ido; esto sería aplicable en la repli .::ación y segregación del DNA.

El modelo de control negativo para la incompa tibilidad de los plásmidos se deriva de la idea de que el número de copias logra controlarse al sintetizar un represor que mide la concentración de orígenes. (Formalmente, es el mismo que el modelo de titulación para la replicación reguladora del cromosoma bacteria no.) La introducción de un nuevo origen como segundo plásmido del mismo grupo de compatibilidad imita el resultado de la replicación del plásmjdo residente, de modo que habrá dos orígenes. Por tanto, se impide cualquier replicación posterior hasta que los dos plásm idos hayan sido segregados a células cliferentcs para crear el número correcto de copias previas a la replicación, como se ilustra en la El efecto sería similar si el sistema de segregación de los productos a las células hijas no pudiera distinguir entre dos plásmidos. Por ejemplo, si dos plásmidos rienen los mismos sitios de partición de actuación en cis, la competencia entre ellos aseguraría que fueran segregados a células diferentes, y no podrían sobrevivir en la misma línea. La presencia de un miembro de un grupo de compatibilidad no afecta directamente la supervivencia de un plásmido pertenecieme a un grupo diferente. Sólo un replicón de un grupo de compatibilidad dado (plásmido de una sola copia) puede ser mantenido en la bacteria, pero no interactúa con los replicones de otros grupos de compatibilidad.

_7.10 La incompatibilidad de los plásmidos depende del re plicón

421

El sistema de compatibilidad ColEl es controlado por un regulador de RNA Conceptos principales • la replicación de ColEl exige que la transcripción pase por el origen, donde el transcrito es dividido por La RNAasa H para generar un extremo cebador. • El RNA 1 regulador es un RNA corto antisentido que se aparea con el transcrito e impide La división que genera el extremo cebador. • la proteína Rom potencia el apareamiento entre el RNA I y et transcrito.

El número de copias y el sistema de incompatibilidad mej or caracterizados son los del plásmido ColE 1, plásmido de copias múltiples que se mantiene en un nivel estable de -20 copias por cada célula de E. coli. El sistema para conservar el número de copias depende del mecanismo para iniciar la replicación en el origen ColEl, como se ilustra en la La replicación empieza con la transcripción de un RNA que inida 555 bp de flujo ascendente del origen. La transcripción continúa a través del ori-

La RNAasa H divide al ANA

/JM~~"\.

gen. La enzima RNAasa H (cuyo nombre refleja st. especificidad por un sustrato de RNA hibridado co:DNA) divide al transcrito en el origen, lo cual genera un extremo 3'-0H que se utiliza como ''cebador· en el cual inicia la síntesis de DNA (el uso de Jo, cebadores se dic;cute con mayor detalle en la secciór 18.8, La imprimación es necesaria para iniciar la síntesis de DNA ). EIRNA cebador forma un hlbrid• persistente con el DNA. El apareamiento entre e RNA y el DNA ocurre justo en flujo ascendente a partir del origen (más o menos en la posición -20 y también más lejos, en flujo ascendente (cerca dela posición -265). Dos sistemas reguladores ejercen sus efectos er el cebador de RNA. uno invo lucra la síntesis de ur RNA complementario al cebador y el otro implica : una proteína cod ificada por un locus cercano. La especie regu ladora de RNA I es unamolécuit:. de - 180 bases cocUficada por la cadena opuesta a l¿ específica del cebador de RNA. La relación entre e RNA cebador y el RNA 1se ilustra en la 1 La molécula de RNA 1 inicia en la primera región • termina cerca del sitio en que inicia el RNA cebado:de modo que el RNA 1 es complementario de la región terminal 5' del RNA cebador. El apareamiem de bases entre las dos moléculas de RNA comro:z la disponibilidad del RNA cebador para iniciar ur ciclo de replicación. Una molécula de RNA, como el RNA l. qu~: funciona gracias a su complementariedad con otro Rl'l"A codificado en la misma región, se denomir. · contra transcrito. Este tipo de mecanismo, por s~.;­ puesto, es otro ejemplo del uso del RNA antisentid (véase la sección 13.7, Las moléculas pequeñas d~ RNA son capaces de regular la traducción). Las mutaciones que reducen o ehminan la compatibilidad entre plásrnidos pueden obtenerse al seleccionar a plásmjdos del mismo grupo por su capacidaJ para coexistir. Las mutaciones de incompatibilidad eColEl se mapean en la región de superposición entre el RN A I y el RNA cebador. Esta región se represen:.: en dos RNA distintos, de tal manera que uno o amba-= podrían estar involucrados en el efecto. Cuando el RNAr es agregado a un sistema parc; replicar DNA ColEl in vitro, inhibe la formación RNA cebador activo, pero la presencia de RNA 1 n

ce

1

Híbrido de RNA-DNA persistente

ñ~VIY/M(r:;;~\.

Origen

1

fA

Empieza la stntesis deDNA

la replicación del DNA ColE1 se inicia al dividir el RNA cebador para generar un extremo 3'-0H. EL cebador forma un híbrido persistente en la región de origen. 422

La secuencia del RNA I es complementaria ü: la región 5' del RNA cebador.

CAPiTULO 17 La replicación bacteriana está conectada con el ciclo celular

.hibe la iniciación ni la elongación de la sínresis d R.t'I'A cebador, lo cual sugiere que el RNA I im' de que la RNAasa H genere al extremo 3' del RNA :bador. Este cfeclo se basa en el apareamiento de ..ases entre el RNA I y el RNA cebador. las dos moléculas de RNA lienen la misma es-uctura secundaria potencial en esta región, con ·es horquillas dúplex que terminan en lazos de :.dena individual. Las mutaciones que reducen la .compaúbilidad se localizan en dichos lazos, lo cual ·giere que el paso inicial del apareamiento deba :5 entre el RNA 1 y el RNA cebador es un contacto 1tre los lazos no apareados. ¿De qué manera el apareamiento con el RNA l .1pidc la división para formar el RNA cebador? En se iluslra un modelo. En ausencia --= RNA J, e l RNA cebador forma su propia estruc_ra secundaria (que involucra lazos y tallos). Sin ~bargo, cuando el RNA l esLá presente, las dos ¡jlécu las se aparean y forman una estructura de ,b]e cadena a todo lo largo del RNA I. la nueva ::itruclura secundaria impide la formación del cebalr, probablemente porque afecta la capaddad del ~~A para formar el híbrido persistente.

-- .. SIN APAREAMIENTO

Cebador de ANA

~ División

APAREAMIENTO RNAI

sm.n

El modelo se asemeja al mecanismo implicado en la atenuación de la transcripción, en el cual Jos apareamientos allernalivos de una secuenda de RNA permiten o impiden la formadón de la estructura secundaria necesaria para la terminación por la polimerasa de IU\A (véase la secdón 13.2, Las estructuras secundarias alternas controlan la atenuación). La a cción del RNA 1 es ejercida por su capacidad para afectar a region es distantes del precursor del cebador. Formalmeme, el modelo equivale a postular un circuito de control que implica dos espedes de RNA. Un precursor de un RNA cebador de gran lamaño es un regulador positivo, necesario para iniciar la replicación. El RNA I pequeño es un regulador negativo susceptible de inhibir la acción del regulador positivo. Por su capacidad para actuar en cualquier plásmido presente en la célu la, elRNAlproporciona un represor que impide que funcione el DNA recientemente inducido, función análoga a la del represor lisogénico de A. (véase la secdón 14.9, El represor y sus operadores definen la región de inmunidad) . En vez de una protema represora que se une al DNA nuevo, un RNA une al precursor recién sintetizado al cebador de RNA . La unión entre el RNA J y elRNA cebador p uede ser influida por la proteína Rom. la cual es codificada por un gen que se encuentra en flujo descendente respecto del origen. la protema Rom potenda la unión entre los transcritos de RNA 1 y de RNA cebador de >200 bases. El resultado es la inhibición de la formación del cebador. ¿Cómo afectan las mutaciones de los Rl'l"A a la incompatibilidad? En la se muestra una

Inicia el apareamiento de bases El ANA 1actúa en cualquier cebador de ANA codificado por su pfopiOgenoma

111111 111

'X"A r"l

Tipo 1

-+

Tipo 11

írf II[ U!. -+ :tr'Jl.

La transcnpción conti¡"úa

~

~

El ANA 1con secuenc1a diferente no puede actuar en el cebador de ANA

Tipo 1+ t1po 11

-+

1

División

ANA dúplex

El apareamiento de bases con el RNA I pue-= cambiar la estructura secundaria de la secuencia del RNA :.:ador y, por lo tanto, impedir la división para generar un ~.-.remo 3'-0H.

Las mutaciones de ta región que codifica al RNA I y at precursor del cebador no necesitan incidir en su capacidad para aparearse; sin embargo, pueden impedir el apareamiento con el RNA complementario codificado por un plásmido diferente.

11.11 El sistema de compatibilidad ColEl es controlado por un regulador de RNA

423

situación en que una célula contiene dos tipos de secuencia RNA I/RNA cebador. El RNA r y el RNA cebador creados a pa rtir de un tfpo de genoma pueden interactuar, pero e1 RNA I de un genoma no in teractúa con el RNA cebador del o Lro gcnoma. Esta situación se originaría cuando una mutación en la región com.ún al RNA I y al RNA cebador ocurriera en una ubicación implicada en e l apareamien to de bases entre ellos. Cada RNA I seglliría apareándose con el RNA del cebador codificado por el mismo plásmido, pero podría ser incapaz de aparearse con el RNA cebador codificado por el otro, lo cual provocaría que el plásmido original y el mutante se comportaran como miembros de grupos de compatibilidad diferentes .

¿Cómo se rep lican y segrega n

las mitocondrias?

Una mitocondria se divide al desarrollar u :anillo en torno al organelo que lo estrangula par¿ dividirlo .en dos mitades. En principio, el mecani.smc es similar al implicado en la división de las bacterias El mecanismo que se utiliza en las mi tocondrias dt> las célu las vegetaJes es similar al de las bacterias ~ utiliza un homólogo de la proteína bacteriana Fts;:: (véase la sección 17 .5, El producto FtsZ es necesru·i• para la formación del septo). El mecanismo molecula r es d iferente en las mitocondrias de las células animales, y Utiliza la proteína dinarnina, implicad¿ en la formación de vesículas membranosas. Un organelo indivjdual puede tener más de una copia de su genoma. Se desconoce si hay un mecanismo de particiórpara segregar las moléculas de DNAmt del imerio: de la mitocondria, o si son simplemente heredada:. por las m itocondrias hijas, según la mitad de la mi tocondria en que se encuentren. En la

Conceptos principales • La replicación y la segregación del DNAmt a las mitocondrias hijas son eventos estocásticos. La segregación mitocondrial a las·células hijas también es un evento estocástico.

Las mitocondrias deben duplicarse durante el ciclo celular y segregarse a las células hijas, se entiende una parte de la mecánica de este proceso, pero no su regulación. En cada etapa de la duplicación de las mitocondrias, replicación y segregación del DNA para duplicar las m itocondrias, así como a segregación de los organelos a las células hijas, el proceso parece ser estocástico, regido por una distribución a leatOria de cada copia. En este caso, la teoría de la dist ribución es análoga a la de los plásmidos bacterianos de copias múltiples, con la misma conclusión de que > 1O copias son necesarias para garantizar que cada célula hUa adquiera al menos una copia (véase la sección 17. 9, Los plásmidos de una sola copia tienen un sistema de partidón) . Cuando hay moléculas de DNAmt con variaciones alélicas (por herencia de progenitores di stintos o por mutaciones), la distribución estocástica puede generar células con sólo uno de los alelos. La replicación del DNAmt puede ser estocástica porque no hay un control por el cual se repliqu en copias específicas, de manera que en un ciclo, algunas moléculas de DNAmt pueden replicarse más veces que otras. El número total de copias del genoma puede ser comrolado por titulación de masa en una forma similar a las bacterias (véase la sección 17 .2, la replicadón está conectada con el ciclo celu lar).

424

Nucleoides de DNAmt

El ONA mitocondrial se replica al i ncrementars~ el número de genomas respecto de la masa mitocondrial, per: sin garantizar que cada genoma se replique el mismo nú mero ~ veces, lo cual puede provocar cambios en la representaciór de los aletos de Las mitocondñas hijas.

CAPÍTULO 17 La replicación bacteriana está conectada con el ciclo celular

muestra que la combinación de los mecanismos y de segregación puede resultar en la :. ignación eswcásrica del DNA en cada una de las 1pias, es decir. que la distribución de uno de los =tnomas mitocondnales a la mitocondria hija no epende de ~us orígenes progenitores. La asignación de las rn.itocondrias a las células 'ijas también parece ser aleatoria. De hecho, fue la bservación de la variación somática en las plantas 3 que sugirió inicialmente la e'Cisrencia de genes .;.~e podrían perderse de una de las células bijas orque no se heredaban según las leyes de Mendel véase la Fig. 4.15). En algunas situaciones, una miwcondria tiene 3lelos de ambos progenitores, lo cual tiene dos conJicionames: que ambos paóres proporcionen a lelos :ll cigoto (que por supuesto no es el caso cuando hay 1erencla materna. Véase la sección 4. 9, los organe.os contienen DNA), y que los aletos progenitores ;e encuentren en la misma mitocondrla. Para ello, .as m.iwcondrias de los progenitores deben haberse :usionado. EJ tamaño de una mitocondria podría no definirse con precisión. De hecho, hay una interro.same sin resolver respecto de que una mitocondria individual represente a una copia única y discreta .:lel organelo o se encuentre en un flujo dinámico en que puede fu sionarse con otras müocondrias. Se sabe que las mitocondria~ pueden fusionarse en las levaduras debido a que después de que se han apareado dos cepas haploides de levaduras para producir una cepa diploide, pueden ocurrir eventos de recombinación entre las moléculas de DNAmr. lo cual implica que los dos DNAmt deben haber estado expuestos uno al otro en el mismo compartimiento mitocondrial. Se han hecho intentos de evaluación de la incide ncia de eventos similares en células animales en pos de una co mplementación entre alelas después de q ue dos células se han fusionado, pero los resultad os no son contundentes. !

~replicación

E

Resumen

Para replicar al cromosoma de E. coli se necesita un tiempo fijo de 40 min, además de que deben uanscurrir o tros 20 ante~ de que la célula pueda dividirse. Cuando la~ células se dividen en menos de 60 min, se inicia un cido de replicación ames del final del ciclo de división precedente, lo cual da lugar a cromosomas con horquillas múltiples. El evento de iniciación depende de la titulación de la masa celular, probablemente al acumular una proteína iniciadora. la iniciación puede tener lugar en la membrana de la célula debido a que el origen tiene relación con la membrana durante un periodo cono posterior a la iniciación.

El septo que tU vide a la célula o ·ece en una ubicación definida por a l anillo periseptal preexistente; un locus de tres genes (minC, D y E) codifica a los productos que regulan e luso del anillo periseptal de la mitad de la célula o los sitios polares derivados de anillos previos para la formación del septo . El que no se forme un septo, genera filamentos multinuclcares; un exceso en la formación de sepLOs genera minicélulas anucleadas. Muchas proreínas transmembrana imeranúan para formar el septo. ZipA se localiza en la membrana interna de la bacteria y se une a FtsZ, que es una proteína tipo tubulina que puede polimerizarse en una estructura fUamemosa denominada ani llo Z. FtsA es una proteína citosólica que se une a FtsZ. Muchos otros productos fts, todos proteínas transmembrana. se unen al anillo Z en un proceso ordenado que genera un anillo septal. Las últimas proteínas que se unen SEDS FtsW, y la rranspeptidasa ftsl (PBP3), las cuales funcionan en conjunto pa ra producir los peptidoglucanos del septo. los cloroplasws utilizan un mecanismo de división relacionado que tiene una proteína tipo FtsZ, a diferencia de las mitocondrias, que utilizan un proceso diferente en el cual la membrana es constreñida por una proteína del tipo de la dinamina. Los plásmidos y las bacterias tienen sistemas de rccombinación específica de sitio que regeneran pares de monómeros al separar a dímeros creados por rerombinación general. El sistema Xer actúa en una secuencia cüana locali7.ada en la región del término del cromosoma. El sistema se activa sólo en presencia de la proteína FtsK del septo, lo cual puede garanlii'ar que actúe sólo cuando un dímero necesite ser separado. La partición implica la interacción de la proteína ParB con el sitio diana pnrS pa ra construir una estructura que incluya la protdna IHF. Este complejo de partición garantiza que los cromosom as replicados se segreguen a céhtlas hijas distintas. El mecanismo de segregación puede implicar el desplazamiento del DNA, posiblemente por la acción de MukB en la condensación de cromosomas en masa en diferentes ubicaciones conforme emergen de la replicación. Los plásmidos tienen una variedad de sistemas que garantizan la partición, o que colaboran para que tenga lugar, y un plásrnido individual puede portar sistemas de muchos tipos. El nl'unero de copias de un plásmido describe si se presenta en el mismo nivcJ que el cromosoma bacteriano (uno por célula unitaria) o en canudades mayores. La incompatibilidad de los plásmidos puede ser consecuencia de los mecanismos implicados en la replicación o la partición (para plásmidos de una sola copia). Dos p lásmidos que comparten el mismo sistema de con17 . l Resumen

425

rrol para la replicación son incompatibles, deb ido a que el número de evemos de replicación garanliza que haya un solo plásmido para cada genoma bacteriano.

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1111

¿Cómo se replican y segregan las mitocondrias?

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Referencias

427

eplicación del DNA ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción Las polimerasas de DNA son enzimas que sintetizan DNA El ONA se sintetiza por replicación semiconservadora y en reacciones de reparación. • Una bacteria o una célula eucariótica tiene varias polimerasas de DNA diferentes. • Una polimerasa de DNA bacteriana realiza replicación semiconservadora; las otras intervienen en reacciones de reparación. • los núcleos eucarióticos, las mitocondrias y los doroplastos tienen una polimerasa de ONA individual necesaria para la replicación, así como otras polimerasas de ONA que participan en actividades auxiliares o de reparación.

Las polimerasas de DNA tienen varias actividades de nucleasa • la polimerasa de DNA 1 tiene una actividad exonucleasa 5'-3' individual que puede combinarse con la síntesis de

DNA para rea lizar el desplazamiento de hendidura.

Las polimerasas de DNA contro lan la fidelidad de la replicación • Las polimerasas de DNA a menudo tienen actividad exonucleasa 3'-5' que es utilizada para escindir bases apareadas de ma nera incorrecta. • la fidelidad de la replicación mejora con la corrección en un factor de -100.

Las polimerasas de DNA tienen una estructura común Muchas polimerasas de DNA tienen una gran hendid:Jra compuesta por tres dominios que se asemejan a una mano. • El DNA yace en la •palma de la mano•, en un surco creado por los "dedos· y el ·pulgar•.

La actividad cebadora es necesaria para iniciar La síntesis de DNA • Todas las polimerasas de ONA requieren un extremo cebador 3'-0H para iniciar la síntesis de DNA. • El extremo cebador puede ser proporcionado por un cebador de RNA, por una hendidura en el DNA o por una proteína cebadora. Para la replicación del DNA, una polimerasa de RNA especial Uamada primasa sintetiza una cadena de RNA que proporciona el extremo cebador. E. coll tiene dos tipos de reacciones cebadoras, las cuales ocurren en el origen bacteriano (otiC} y en el origen q>X174. • La actividad cebadora de la replicación en el DNA de doble cadena siempre requiere una replicasa, una SSB, y una primasa. • OnaB es la replicasa que desenroUa el DNA para La replicación en E. co/i,

La holoenzima polimerasa de DNA tiene tres subcomplejos • La replicasa de E. coli polimerasa de ONA III es un complejo de 900 kO con una estructura dimérica. • Cada unidad monomérica tiene un núcleo catalitíco, una subunidad de dimerización y un componente de procesividad. Un cargador de pinza coloca las subunidades de procesividad en el DNA, en donde forman una pinza circular alrededor del ácido nucleico. • Un núcleo catalftico está asociado a cada una de las cadenas de molde.

La pinza controla la asociación de la enzima central con el DNA

• la replicasa del ONA avanza en forma continua cuardo sintetiza la cadena líder (en sentido S'-3'), pero sintetiza la cadena retrasada al formar pequeños fragmentos que se unen unos a otros después.

El núcleo en la cadena líder es procesivo debido a que su pinza lo mantiene en el DNA. • La pinza asociada al núcleo en la cadena retrasada se disocia al final de cada fragmento de Olcazaki y se ensambla de nuevo para el siguiente fragmento. • la helicasa OnaB se encarga de interactuar con la primasa OnaG para iniciar cada fragmento de Okazaki.

El modelo
Coordinación de la síntesis de la cadena líder y de La cadena retrasada

• La replicación requiere que una helicasa separe las cadenas

• Se requieren diferentes unidades enzimáticas para sintetizar las cadenas líderes y retrasadas. • En f. coli, ambas unidades contienen la misma .subunidad catalítica (DnaE).

La síntesis de DNA es semidiscontinua

de DNA con la energía que proviene de la nidrólisis de ATP. • Una proteína de unión a la cadena individual es necesaria para mantener las cadenas separadas.

428

• La combinación de helicasa, SSB y proteína A separa un dúplex de q>Xl74 en un círculo de cadena individual y una cadena individual lineal.

•

mm

. •

origen

Cada fragmento de Okazaki inicia con un cebador y se detiene antes del siguiente fragmento. La polimerasa de DNA I elimina el cebador y lo remplaza ¡:on DNA en una acción semejante al desplazamiento de hendidura. La ligasa de DNA realiza el enlace que conecta el extremo 3' dt! un fragmento de Okazaki al inicio 5' del siguiente fragmento.

• •

• •

mm

Polimerasas de ONA eucarióticas independientes realizan la iniciación y la elongación

• • •

mm

mE Creación de las horquillas de replicación en el

Los fragmentos de Okazaki están unidos por La Ligasa

•

mD1

En otros organismos pueden necesitarse diferentes subunidades catalíticas para cada cadena.

•

• •

•

.

de replicación El fago T4 proporciona su propio mecanismo de replicación. que está formado por una polimerasa de DNA, po r el gen 32 SSB, por una helicasa, por una primasa y por proteínas accesorias que Incrementan la velocidad y la procesivídad.

Introducci ón La replicación de l DNA dúplex es un proceso complejo que comprende un conglomerado de actividades enzimáricas. Diferenres actividades tienen lugar en las etapas de iniciación. elongación. y Lerminación. • La iniciación ünplica el reconocimiento de un origen por un complejo de proteínas. Antes de que la síntesis de DNA empiece, las cadenas progenitoras deben separarse y (de manera transitoria) estabilizarse en el estado de una sola cadena. Después de esta etapa, la síntesis de las cadenas hijas puede inidarse en la horquilla de replicación. • La elongación la realiza orro complejo de proteínas. El replis om a existe sólo como un complejo de pro teínas asociado a la esrrucltlra particular que asume el ONA en la horquilla de replicación. No existe como una unidad independjeme (p. ej., como un r ibosoma). A meclida que el replisoma se mueve por el DNA, las cadenas progenitoras se descn roll<m y las cadenas hijas son sintetizadas. • AJ fina l del replicón.. las reacciones de unión o de terminación son indispensab les. Después de la terminación. los cromosomas

El principio general de la iniciación bacteriana es que el origen es reconocido en un inicio por una proteína que forma un gran complejo con el DNA. Una región corta de ONA enriquecida con A-Tes desnaturalizada • DnaB se une al complejo y crea la horquilla de replicación.

El primosoma es necesario para reiniciar La replicación

El fago T4 proporciona su propio mecanismo

•

Sucesos comunes en el cebamiento de la replicación en el origen

•

Una horquilla de replicación tiene un complejo formado por polimerasa de DNA Ct./primasa y dos complejos de polimerasa de DNA li o E. El complejo polímerasa de DNA cxjplimasa inicia la síntesis de las dos cadenas del DNA. la poli merasa de DNA li alarga la cadena llder y una segunda polimerasa de ONA li. o polimerasa de DNA e. alarga la cadena retrasada.

La iniciación en oriC requíére él ensamble secuencial de un gran complejo de proteínas. OnaA se une a secuencias cortas repetitivas y forma un complejo oligomélico que desnaturaliza el DNA. Seis manó meros de Dnat se unen a cada hexámero de OnaB, y este complejo se une al origen. Un hexámero de DnaB forma la horquilla de replicación. La girasa y la SSB también son nea!sarias.

•

msm.

La iniciación de la replicación de q>X requiere que el complejo del primosoma desplace a la SSB del origen. Un¡¡ horquilla de replicación se detiene cuando llega al DNA dañado. Después que el daño ha sido reparado, el primosoma es indispensable para reiniciar la replicación. La proteína Tus se une a los sitios ter y detiene el desenroUa miento del DNA mediado por DnaB. lo cual ocasiona que la re plicación termine.

Resumen

duplicados deben separarse uno del otro. lo cual requiere la manipulación de la estructura compleja del DNA. la incapacidad para replicar el DNA es letal para el crecimiento de la célula. Por lo tanto, los murantes afectados en la repücadón sólo pueden obtenerse como le tales condicionales. Éstos son capaces de lograr la repllcación bajo condiciones permisivas (provistas por la temperatura normal de incubación), pero son defectuosos en condiciones no p e rmisivas (temperaturas mayores de 42°C). Una serie extensa de dichos rnutanres sensibles a la temperatura en E. coli permite identificar un conju:Oto de loci llamados genes dna. Los mutantes dna permiten distinguir dos etapas de replicación por su comportamiento cuando la temperatura se incrementa: • La clase mayor de mutantes de detención rápida interrumpe la replicación en cuanw

aumenta la temperatura. Presentan defectos en los componentes del mecanismo de replicación, por lo general en las enzimas necesarias para la elongación (pero también irtcluyen defectos en el suministro de precursores esenciales) . • La dase 1nás pequeña de mutante s de d e tención lenta concluye11 el ciclo de Ieplicación actual, pero no pueden iniciar otro. j8., 1 Introducción

429

Tienen defectos en Jos episodios comprendidos en el inicio de un ciclo de replicación en el origen. Un análisis importante utilizado para identificar los componemes del mecanismo de replicación se llama análisis de complementación in vitro. Se prepara un sistema para la replicación in vitro a partir de un mutan te dna y se pone en marcha en condiciones en las cuales el producto génico mutante es inacti vo . Se evalúa la capacidad de los extractos de células de tipo silvestre para restaurar la actividad. La proteína codificada por ellocus dna puede purificarse si se identifica el componente activo del extracto. Cada utio de los componentes de l mecanismo de replicación bacteriana queda ahora en condiciones de ser estudiado in vitro como producto bioquímicamente puro, y es implicado in vivo por mutaciones en sus genes. Los sistemas de replicación eucariótica están altamente purificados y en general tienen componentes análogos a las proteínas bacte rianas, pero eso no significa que hayan alcanzado la etapa en la que cada uno de los componentes ha sido identificado.

1 La replicación semiconservadora sintetiza dos cadenas nuevas de DNA.

5' 3'

La síntesis reparadora remplaza un fragmento corto de una cadena de DNA que contiene una base dañada. 430

CAPÍTULO 18 Replicación del DNA

111

Las polimerasas de DNA son enzimas que sintetizan DNA

Conceptos principales • El DNA se sintetiza por re plicación semiconservadora y en reacciones de reparación. • Una bacteria o una célula eucariótica tiene varias polimerasas de DNA diferentes. • Una polimerasa de DNA bacteriana realiza replicación semiconservadora; las otras intervienen en reacciones de reparación. • Los núcleos eucarióticos, las mitocondrias y los cloroplastos tienen una polimerasa de DNA individual

necesaria para la replicación, así como otras polimerasas de DNA que participan en actividades auxiliares o de reparación.

Existen dos tipos básicos de síntesis de DNA. La muestra el resultado de la replicación semiconservadora . Las dos cadenas del dúplex progenitor son separadas y cada una sirve como molde para la síntesis de una nueva cadena. El dúplex progenitor es remplazado por dos dúplex hijos, cada uno de los cuales Liene una cadena progenitora y una cadena recién sintetizada. La muestra las consecuencias de una reacción de reparación. Una cadena de DNA ha sido dañada. Es escindida y se sintetiza nuevo material para remplazada. Una enzima que puede sintetizar una nueva cadena de DNA a partir de una cadena molde se denomina polimerasa de DNA. Las células procarióticas y eucarióticas contienen actividades múltiples de polimerasa de DNA. Sólo algunas de estas enzimas en realidad experimentan la replicación; aquellas que lo hacen en ocasiones se denominan replicasas de DNA. Las demás enzimas desempeñan funciones subsidiarias en la replicación o participan en la síntesis reparadora. Todas las polimerasas de DNA procarióticas y eucarióticas comparten el mismo tipo fundamental de actividad sintética. Cada una puede eXLender una cadena de DNA al agregar nudeótidos, uno a la vez, a un extremo 3'-0H, como se ilustra en la . La elección del nucleórido que será agregado a la cadena depende del apareamiento de bases con la cadena molde. Algunas polimerasas de DNA funcionan como enzimas independientes, pero otras (sobre todo las replicasas) son incorporadas en ensambles de proteínas más extensos. La subunidad sinretizadora de DNA es sólo una de varias funciones de la replicasa, la cual por lo general tiene muchas otras actividades relacionadas con el desenrollamiento del DNA, el inicio de la síntesis de nuevas cadenas, etc.

Enzima

El molde tiene un extremo 3'-QH libre 5' 3

,

e,

P

P P P

OH

3'

PPPPPPPPPPPS'

S'PPP

3'

PI'PPPO~

e

potB

111

poiC

replicasa

IV

dinB

replicación translesión

V

umuD'2C

replicación translestón

Sólo una polimerasa de DNA es la replicasa. Las otras participan en la reparación del DNA dañado y reinician las horquillas de replicación varadas o eluden el daño en el DNA.

PPPPPPPPPPPS'

11? 2

11

OH 3'

Un dlfosfato es liberado cuando se agrega el nucleótido a la cadena ~ PP

s·

Función enzima importante de reparación reinicio de la repficación

po/A

El nucleótido entrante tiene tres grupos fosfato en la posic1ón 5'

5'

Gen

a. P- .f.. 4"oH

El DNA es sintetizado al agregar nucleótidos al extremo 3'-0H de la cadena creciente, de tal manera que la cadena nueva crece en dirección 5'-+3'. El precursor para la síntesis de DNA es un nudeósido trifosfatado, el cual pierde los dos grupos fosfato terminales en la reacción.

La resume las polimerasas de DNA que se han definido en E. coli. La polimerasa de DNA III. una proteína con múltiples subunidades, es la rcplicasa encargada de la síntesis de novo de cadenas nuevas de D A. La polimerasa de DNA 1 (codificada por po/A) panicipa en la reparación del DNA dañado y, en una función subsidiaria, en la replicación semicons~rvadora. La polímera sa de DNA II es indispensable para el reinicio de una horquilla de replicación cuando su progreso es bloqueado por daño en e l DNA. Las polimerasas de DNA IV y V permiren que la replicación pase por alto cil'xtos tipos de daño. Cuando se evalúa lc1 capacidad de los extractos de E. coli para sintetizar DNA, la acLividad enzimática predominante es la de la polimerasa de DNA l. Su actividad es wl que impide detectarlas actividades de las enzimas que en realidad se encargan de la replicación del DNA. Para desarrollar sistemas in virro en los cuales la replicación pueda estudiarse, los extractos se preparan a panir de células con mutaciones en po/A. Algunos fagos codifican polimerasas de D.NA. Emre éstos se encuentran los fagos T4, T5, T7, y SPO l. Todas las enzimas poseen actividades sintéticas 5'-3' y actividades de corrección de exonuclcasa 3'- 5' (véase la sección 18.3. Las polimerasas de DNA tienen varias actividades de nucleasa). En cada caso, una mutación en el gen que codifica un solo poli-

péptido del fago impide que éste se desarrolle. Cada polimerasa del fago se asocia a otras proteínas, del propio fago o del hospedador, para hacer la enzima intacta. Varias clases de polimcrasas de DNA eucarióticas han sido identificadas. Las polimerasas de DNA 8 y € son indispensables para la replicación nuclear; 1a polimerasa de DNA a tiene que ver con el proceso de ceba miento (iniciación) de la replicación. Otras polimerasas de DNA intervienen en la reparadón del DNA nuclear dañado (~e incluso E) o la replicación del DNA mitocondrial (y).

11!1 Las polimerasas de DNA tienen varias actividades de nucleasa Concepto pñncipal • La polimerasa de DNA 1 tiene una actividad exonucleasa 5'-3' individual que puede combinarse con la síntesis de DNA para realizar el desplazamiento de hendidura.

Las replicasas a menudo tienen actividades de nucleasa además de la capacidad para sintetizar DNA. Una actividad de exonucleasa 3'- 5' se utiliza por lo general para recortar bases que han sido agregadas al DNA de manera incorrecta. Esto ofrece un sistema de "corrección" para el control de errores (véase la sección 18.4, Las polimerasas de DNA controlan la fidelidad de la replicación). la primera enzima sintetizadora de DNA que se describió fue la polimerasa de DNA J. que es un polipéprido único de 103 kD. La cadena puede dividirse en dos panes por tratamiento proteolítico. Dos tercios de la proteína ~e encuentran en el extremo C y contienen el ~itio acrivo de La polimerasa; el tercio restante de la proteína está en el extremo N y contiene La exonuclcasa de corrección. El producto más grande de la división (de 68 k.D) se llama fragmento Klenow. Se utiliza en reacciones

1S.3 Las polimerasas de DNA tienen varias actividades de nucleasa

431

Las polimerasas de DNA controlan la fidelidad de la replicación La hendidura genera los grupos 3'-0H y 5'-P

~ 5'

OH P

="11'1~"PP"'!"9''F!"~I!"F'

Conceptos principales • 3'

La síntesis de DNA extiende el extremo 3'; la cadena antigua es degradada

El desplazamiento de hendidura remplaza una parte de la cadena preexistente de DNA dúplex con material recién sintetizado.

sintéticas in vitrv. Contiene la polimerasa y las acLividades de exonucleasa 3'- 5'. Los sitios activos están separados de la proteína -30 Á, lo cual indica que existe una separación espacial enue la base que se agrega y la que se elimina. El fragmento pequeño (de 35 kD) posee activi dad exonucleolítica 5'-3' que desprende pequeños grupos de nucleótidos, hasla -lO bases a la ve'Z.. Esta actividad se coordina con la aclividad sintética/correctOra. Proporciona polimerasa de DN A I con una habilidad exclusiva para iniciar la replicación in vitro en una hendidura en el DNA. (Ninguna otra polímerasa de DNA tiene esta capacidad.) En el sitio donde se ha roto un enlace fosfodiéster en un DNA de doble cadena, la enzima extiende el extremo 3'-0H. A medida que se sintetiza el nuevo segmento de DNA, desplaza la cadena homóloga existente en el dúplex. Este proceso de desplazamiento de h endidura se ilustra en la . La cadena desplazada es degr~dada por la actividad exonucleolílica 5'-3' de la enzima. Las propiedades del DNA no se altexan, excepto que un segmento de una cadena ha sido remplazado con material recién sintetizado y la posición de la mella ha sido desplazada a lo largo del dúplex. Esto tiene un gran uso práctico; el desplazamiento de henclidura ha constituido una técnica importante para 'introducir nucleótidos con marcas raclioactivas en el DNA in vilro. La acción 5'- 3' sintética/3'- 5' exonucleolítica es probable que sea utilizada in vivo sobre todo para rellenar regíbncs cortas de cadena individual en el DNA de doble cadena. Estas regiones emergen durante la replicación y cuando las bases dañadas son eliminadas del DNA. 432

CAPÍTULO 18 Replicación del DNA

• Las polimerasas de DNA a menudo tienen actividad exonucleasa 3'- 5' que se utiliza para escindir bases apareadas de manera incorrecta . • La fidelidad de la re plicación mejora con la corrección en un factor de -100.

La fidelidad de la replicación plantea el mismo problema que se observa cuando se tiene en cuenta, por ejemplo, la precisión de la traducción. Se basa en la especificidad del apareamiento de bases. Sin embargo, cuando se consideran las interacciones comprendidas en el aparearruento de bases, se espera que ocurran errores con una frecuencia de -l0-3 por pares de bases replicadas. La tasa acLuaJ en las bacterias parece ser de -1 o-s a 1o-JO_ Esto corresponde a -1 un error por genoma por LOOO ciclos de replicación bacteriana, o -1 o-6 por gen por generación. Se pueden dividir los errores que la polimerasa de DNA cornete durante la replicación en dos clases: • Los cambios del marco de lectura ocurren cuando un nucleótido extra es insertado u omitido. La fidelidad con rcspecw al cambio del marco de lectura se altera con la procesividad de la enzima: la tendencia a permanecer en un solo molde en vez de disociarse y reasociarse. EstO es en panicular importante para la replicación de un fragmento homopoliméríco (p. ej., una secuencia larga de dT,?iAn, en la cual "el deslizamiento de la replicación" puede cambiar la longitud del segmento homopolimérico. Como regla general, un incremento de la procesivídad redLlCe la probabilidad de tales episodios. En las polimerasas de DNA multiméricas, la procesividad suele aumentar por una subunidad particular que no es necesaria para la actividad catalítica per se. • Las sustituciones ocun·cn cuando se incorpora un nudeótido equivocado (apareado de manera errónea) . El nivel de error lo determina la eficiencia de la corrección, en donde la enzima explora los pares de bases que acaban de formarse y elimina el nucleótido si está apareado de forma errónea. Todas las enzimas bacterianas poseen actividad exonucleolítica 3'-5' que procede en dirección inversa a la síntesis de DNA. Esto proporciona la

función de corrección ilustrada en el esquema de la . En el paso de la elongación de la cadena, un nucleótido precursor entra en la posición localizada al final de la cadena creciente. Se forma un enlace. La enzima se desplaza un par de bases y entonces está lista para que entre el siguiente nucleótido precursor. No obstante, si ocurre un error la enzima miliza la actividad exonucleolírica para. escindir la (dtima base que fue agregada. Diferentes polimerasas de DNA manejan la relación entre las actividades de polimerización y de corrección de disLintas maneras. En algunos casos las actividades son parte de la misma subunidad, pero en otros están contenidas en diferentes subunidades. Cada polimerasa de DNA tiene una tasa de error característica que se reduce por su actividad correctora. la corrección suele disminuir la tasa de error de la replicación de -1 o-5 a - J0- 7 por par de bases replicado. Los sistemas que reconocen los errores y los corrigen después de la replicación eliminan entonces algunos de los errores y llevan la tasa global a 1 0 3 veces.

1111

La enzima a_grega una base a la cadena

creciente

5' 3'

... J. OH3'

.... J. La enzima se desplaza si la base nueva es correcta OH 3'

La base es hídrolízada y expulsada si es

incorrecta

Las polimerasas de ONA bacterianas exploran el par de bases en el extremo de la cadena creciente y escinden elnucleótido agregado en caso de un desajuste.

Las polimerasas de DNA tienen una estructura común

Conceptos principale$ • Muchas polimerasas de ONA tienen una gran hendidura compuesta por tre$ dominios que se asemejan a una mano. • El ONA yace en la "palma de la mano'', en un surco creado por los "dedos" y el "pulgar".

La muestra que todas las polimerasas de DNA comparten algunos rasgos estructurales comunes. La estructura de la enzima puede dividirse en varios dominios independientes, los cuales se descri ben por la analogía con una mano derecha humana. El DNA se une a una extensa hendidura compuesta por tres dominios. El dominio de la ''palma" tiene importantes elementos de secuencias conservadas,

\~ La organización común de las polimerasas de DNA tiene una palma que contiene el sitio catalítico, un pulgar que se une al DNA y que es importante en la procesividad, un dominio de exonudeasa con su propio sitio activo y un dominio terminal N.

secuencias que forman el sitio catalítico aclivo. Los "dedos" inLervienen en la colocación correcta del molde en el sitio activo. El "pulgar" se une al DNA a medida que sale de la enzima y es importante en la procesividad. Las regiones conservadas más im18.:> Las polimerasas de DNA tienen una estructura común

433

La estructura cristalina de la polimerasa de DNA del fago T7 muestra que la cadena molde da un giro agudo que la expone al nucleótido entrante. Fotografía cortesía de Charles Richardson and Thomas Ellenberger'; Washington University School of Medicine.

portantes de cada uno de estos tres dominios con vergen para formar una superfkie contínua en el sitio catalítico. La acTividad exonucleasa reside en un dominio independiente con su propio sitio cata lítico. El dominio terminal N se extiende dentro del dominio de la nucleasa. Las polimerasas de DNA se dividen en cinco familias con base en la homología de sus secuencias; la palma está bien conservada entre ellas, pero el pulgar y Jos dedos ofrecen elementos análogos de estructura secundaria de diferentes secue ncias. La reacción catalítica en una polimerasa de DNA ocurre en un sitio activo en e l cual un nucleótido trifosfatado se aparea con una cadena individual de DNA (no apareada) . El DNA yace a través de la palm,a de la mano en un surco creado por el pulgar y los dedos. La mues tra la estructura cristalina de la enzima T7 formando un complejo con el DNA (en la forma de un cebador asociado a una cadena de molde) y un nudeótido entrante que está apunto de ser agregado al cebador. El DNA se encuentra en la forma B dúplex clásica hasta los dos últimos pares de bases en el extremo 3' del cebador, las cuales se encuentran en la forma A más abierta. Una vuelta aguda en el DNA expone la base molde alnucleótido entrante. El extremo 3' del cebador (al cual se agregan las bases) es anclado por los dedos y por la palma. Al DNA lo mantienen en su posición los contactos que se forman sobre todo con el esqueleto de fosfodiésteres de la cadena (lo que permite que la polímerasa funcione con DNA de cualquier secuencia). En las estructuras de las polimerasas de DNA de esta familia que están formando complejos sólo con el DNA (es dedr, que carecen del nucleótido entran-

434

CAPÍTU LO 18 Replicación del ONA

te), la orientación de los dedos y del pulgar en relación con la palma de la mano es más abierta, con la hélice O (0, 01, 02; véase la Figura 18.8) girada hacia afuera de la palma. Esto sugiere que el giro hada adentro de la hélice O ocurre para capturar el nucleó1.ido entrante y crear el sitio activo caral.ítico. Cuando un nudeótido se une, e l dominio de los dedos gira 60° hacia la palma de la mano y las pumas de los dedos se mueven 30 Á. El dominio del pulgar también gira hacia la palma 8°. Estos cambios son cíclicos: se revierten cuando el nudeót\do es incorporado a la cadena de DNA, la cual después se transfiere a través de la enzima para recrear un sitio vacío. La actividad exonucleasa se encarga de eliminar las bases a.pareadas de manera errónea. No obstante, el sitio catalítico del dominio de exonucleasa se encuentra lejos del sitio acrivo del dominio caralítico. La enzima alterna entre las modalidades de polimerización y e dición, según lo determine la competencia entre Jos dos sitios activos por el extre· rno cebador 3' del DNA. Los aminoácidos en el sitio activo entran en contactO con l a base enrrante de tal manera que la estructura de la enzima es afectada por una base apareada en forma errónea. Cuando una base mal apareada ocupa el sitio catalítico, los dedos no pueden girar hacia la palma. Esto deja el extremo 3' lihre para unirse al sitlo activo en el dominio de exon udeasa, lo cual se logra por un giro del DN A en la esu·uctura de la enzima.

liD

La sí ntesis de DNA es semidiscontinua

Concepto principal • La replicasa del DNA avanza en forma continua cuando sintetiza la cadena Líder (en sentido 5'-3'), pero sintetiza la cadena retrasada al fo rmar pequeños fragmentos que se unen unos a ot ros después.

La estructura antípara lela de las dos cadenas del DNA dúplex plantea un prob lema para la replica ción. A medida que la horquílla avanza, las cadenas rujas deben ser sintetizadas en las dos cadenas individuales progeniwras expuestas. La horquilla se mueve en dirección 5'-3' en una cadena y en djrección 3'-5' en la otra. No obstante, los ácidos nudeícos se sintetizan sólo a partir de un extremo 5' hacia un extremo 3'. El problema se resuelve con la síntesis de la cadena que crece en general de 3'-5' en una serie de pequeii.os fragmentos, cada uno de los cuales se sintetiza en realidad en la dirección "opuesta'', es decir, con la polaridad convencional 5'-3'. Considérese la región que se encuentra irunedial amente detrás de la horquilla de replicación, como se ilustra en la . Los sucesos se describen

Síntesis de la cadena líder Nucleótidos agregados de manera continua al extremo 3' 1

.,~5'3'

5' 3' 5' -J..I.olo..W.OW..-.1...!.-~IooL__._

_..:..:,_......JL..Ao..-' L---~--~--~---J-----.----

Fragmento anterior Último fragmento Cadena individual DNA progenitor Sín tesis de la cadena retrasada

La cadena líder se sintetiza de forma continua, mientras que la cadena retrasada se sintetiza de manera discontinua.

en términos de las propiedades diterentes de cada de las cadenas que acaban de simetizarse : • En Ja cad ena líder la síntesis de DNA puede proceder en forma continua en dirección 5'-3' él medida que el dúplex progenitor es desenro!Jado. • En la cadena r etrasa d a un [ragmento de cadena indjvidual de DNA progenitor debe ser expuesto y después un segmento es sintetizado en dirección inversa (e n relación con el movimiento de la horquilla). Una serie de estos fragmentos se sintetiza, cada uno en dirección 5'-3'; y después son unidos para crear una cadena retrasada intacta. La replicadón ruscontinua puede ser rastreada por el destino de una marca raruoactiva muy bre ve. La eliqueta entra al DNA recién simerizado en forma de fragmentos corros, que sedimentan en los límites de 7S a l l S, lo cual corresponde a tma longitud de -1 000 a 2 000 bases. Estos fr agmentos de Okazaki se encuentran en e l DNA en proceso de replicación en las procariotas y en las eucariotas . Después de largos pe riodos de íncubación, la marca entra a segmenros más largos de DNA. La transidón es resu ltado de la fom1ación de enlaces covalentes en tre los fragmentos de Okazaki. La cadena retrasada debe ser sintetizada en forma de fragmentos de Okazaki. Durante mucho tiempo no quedaba claro si la cadena líder se sintetizaba de la misma forma o de manera continua. Todo el DNA recién sinteüzado se encuemra como fragmentos conos en E. coli. Visto de un modo superficial, esto sugiere que ambas cadenas se sintetizan de manera discontinua. Sin embargo, resulta que no roda la población de los fragmentos representa fragmenros de Okazaki auténticos, algunos soo seudofragmen tos que han sido generados por rompimiento en una cadena de DNA que de hecho fue sintetizada como una cadena continua. La fuente de esta rotura es la incorporadón de algunos uracilos dentro del DNA en lugar de Limina. Cuando el uracilo es elimina lUla

do por un sistema de reparación, la cadena líder se rompe hasta que una limina es insertada. Por lo r.amo, la cadena retrasada se sintetiza de manera discontinua y la cadena líder se sinte t iza de forma continua. Esto se llama re plicación semidis continua.

El modelo
A medida que avanza la horq u illa de replicació n, desenrolla e l DNA dúplex. Una de las cadenas molde es convertida de inmediato en DNA dúplex a medida que la cadena líder hija es simetizada. La otra permanece en forma individual hasta que se ha expuesw la longitud suficiente para iniciar la síntesis de un fragmento de Okazaki de la cadena retrasada en la dirección contraria. Por lo tanto, la generación y el mantenimiento de un DNA de cadena individual es un aspecto crucial de la replicación. Se requieren dos tipos de función para convenir el DNA de doble cadena en cadenas individuales: • Una helicasa es una enzima que separa las cadenas ele DNA y que por lo general ut iliza la hidrólisis del ATP para proporcionar la energía necesaria. • Una proteína de unión a la cadena individual (SSB, single-strand binding protein) se

18.7 El modelo
435

Cadena+ La helicasa rodea una sola cadena

La helícasa se une al DNA dúplex

Los pares de bases se

Una helicasa hexamérica se desplaza a lo largo de una cadena de ONA. Es probable que cambie de conforma· ción cuando se une al dúplex, utilice hidrólisis de ATP para separar las cadenas y después regrese a la conforma ción que tenía cuando estaba unida sólo a una cadena individual.

une al DNA de cadena individual e impide que se vuelva a [ormar el dúplex. La SSB se une como un monómero, pero por lo general de una rorma colaboradora en la cual la unión de otros monómeros al complejo existente se incrementa. Las helicasas separan las cadenas de un áddo nucleico dúplex en una variedad de situadones, que oscilan desde la separación de las cadenas en el sitio de crecimiento de una horquilla de replicación haSta la calálisis de la migración de las uniones Holliday (de recombinadón) a lo largo del DNA. Hay 12 helicasas diferentes en E. co/i. Una helicasa casi siempre es multimérica. Una forma común de belicasa es un hcxámero. Éste por lo general se transfiere a lo largo del DNA ulilizaodo su estructura muJtimérica para proporcionar múltiples sitios de unión al DNA. La muestra un modelo esquemático generalizado para la acción de una helicasa hexamérica. Es probable que tenga una conformación que se una al DNA dúplt>x y otra que se una al DNA de cadena individual. La alternancia entre ellas conduce el motor que disgrega al dúplex y requiere la hidrólisis de ATP; en general se hidroliza un ATP por cada par de bases que es desenrollado. Una helicasa suele iniciar el desenrollamiemo en una región de cadena individual adyacente a un dúplex. Puede funcionar con una polaridad panicular y prefiere el DNA de cadena individual con un extremo 3' (he Jicasa 3'- 5') o con un extremo 5' (helicasa 5'-3'). La conversión del DNA de doble cadena
CAPÍTULO 18 Replicación del DNA

- --

Proteína SSB

Proteína Rep

+

El DNA <¡>Xl74 puede separarse en cadenas in· dividuales por los efectos combinados de tres funciones: formación de hendidura con una proteína A, desenrollamiento por Rep y estabilización de la cadena individual por SSB.

La reacción puede ocurrir en ausencia de la síntesis de DNA cuando las tres proteínas apropiadas son provistas in vitro. La proteína A fágica mella la cadena viral(+) en el origen de replicación. En la presencia de dos proteínas hospedadoras (Rep y SSB) y de ATP, el DNA mellado se desenrolla. La proteína Rep proporciona una heücasa que separa las cadenas; la SSB las atrapa en forma de cadena individual. La SSB de E. co/i es un tetrámero de 74 kD que se une en colaboración al DNA de cadena individual. La imponancia de la forma colaboradora de unión es que la unión de una molécula proteínica hace mucho más fácil la unión de otra. Entonct:s, una vez que ha empezado la reacción de unión en una molécula de DNA particular, se extiende con rapidez hasta que todo el DNA de cadena individual está cubierto por la proteína SSB. Nótese que esta proteína no es una proteína que desenrolla el DNA; su función es estabilizar el DNA que ya se encuentra en forma de cadena individual.

En circunstancias normales in vivo, las reacciones de desenrollamiento, recubrimiento y replicadón proceden en tándem. la SSB se une al DNA a medida que avanza la horquilla de replicación, manteniendo las dos cadenas progenitOras separadas para que se encuentren en la condición apropiada para actuar como moldes. La SSB se necesita en camidades estequiométricas en la horquilla de replicación. Se requiere en más de una etapa de la replicación; los mutames ssb tienen un fenotipo de detención rápida y son defectuosos en la reparaeón, en la recombinación y en la replicación (algunos fagos usan diferenres proteínas SSB, sobre todo T4; esto demuestra que pueden existir interacciones es-

pecíficas entre los componentes del mecarúsmo de re-

Molde de cadena individual Una polimerasa de DNA requiere un extremo 3'- OH para iniciar la replicación.

Las polímerasas de DNA no pueden iniciar la sfntesfs de DNA en moléculas de DNA dúplex o de cadena Individual sfn un cebador

plicación y las SSB, véase la sección l8.14, El fago T4 proporciona su propio mecanjsmo de replicación) . 5'

lfi!IIP.I llliiil

La actividad . cebadora . .. es necesana para 1n1c1ar la síntesis de DNA

3'

3'

5'

o 5' ..

Conceptos principales

5'

• Todas las polimerasas de DNA requieren un extremo cebador 3'-OH para iniciar la síntesis de DNA. • El extremo cebador puede ser proporcionado por un cebador de RNA. por una hendidura en el DNA o por una proteína cebadora. • Para la replicación del DNA, una polimerasa de RNA especial llamada primasa sintetiza una cadena de RNA que proporciona el extremo cebador. • E. co/i tiene dos ti pos de reacciones cebadoras, Las cuales ocurren en el origen bacteriano (oriC) y en el origen cpX17 4. • La actividad cebadora de la replicación en el DNA de doble cadena siempre requiere una replicasa, una SSB, y una primasa. • DnaB es la replicasa que desenrolla el DNA para la replicación en E. coli.

Una característica común en wdas las polimerasas de DNA es que no pueden iniciar la síntesis de una cadena de DNA de novo. la muestra las características necesarias para la iniciación. La síntesis de la cadena nueva puede iniciar sólo desde un exuemo 3'-0H preexistente y la cadena molde debe ser convenida en una cadena individual. El extremo 3'-0H se denomina ceb ador. Éste puede adoptar varias rormas. Los tipos de reacciones de cebamiento se resumen en la • Una secuencia de RNA se sintetiza en el molde, de modo que el extremo 3'-0H libre de la cadena de RNA se extiende por la

3'

El cebador de ANA es sintetizado (o proporcionado por apareamiento de bases) 3'

....---..

3' 5'

5'

~

3'

5' El DNA dúplex es mellado para proporcionar un extremo libre para la polimerasa de ONA Hendidura

3'

5'

3'

5'

. :: 1 Hay muchos métodos que propordonan el extremo 3'-0H que necesita la polimerasa de DNA para inidar la síntesis de DNA.

polimerasa de DNA. Esto suele utilizarse en la replicación del DNA celular y por algunos virus (véase la Figura 17.18 de la sección

18.8 La actividad cebadora es necesaria para iniciar la síntesis de DNA

43 7

17.11, El sistema de compatibilidad ColEl es controlado por un regulador de RN A). • Un RNA preformado se aparea con el molde, lo que permite que su extremo 3' -OH sirva para cebar la síntesis de DNA. Este mecanismo es usado por los retrovirus para cebar la transcripción inversa del RNA (véase la Figura 22.6 en la sección 22.4, El DNA viral se genera por transcripción inversa}. • Un extremo cebador se genera dentro del DNA dúplex. El mecanismo más común es la introducción de una hendidura, utilizada para iniciar la replicación del círculo rodanre (véase la Figura 16.5). En este caso, la cadena prccxistcme es desplazada por la nueva síntesis. (Nótese la diferencia con respecto al des¡Jlazamknta de hendidura que se muestra en la Figu ra 18.5, en el cual la poli.mera.sa de DNA 1 de manera simullánea sinteliz.a y degrada DNA desde una hendidura} . • Una proteína ceba la reacción en forma directa al presentar un nucleótido a la polimerasa

Helicasa OnaB 5'-3' hehcasa (5'-3')

S'

AOP

SSB prolelna de unión a la cadena individual (-SO/horquilla)

PriA (sólo ~X) reconoce el sitio de ensamblaje del primosoma y desplaza a la SSB

Primasa OnaG sintetiza ANA

-

3'-0H

La iniciación requiere numerosas actividades enzimáticas, como helicasas, proteínas de unión a la cadena individual y la sintesis del cebador. 438

CAPÍTULO 18 Replicación del DNA

de DNA. Esta reacción es utilizada por ciertos virus. (Véase la Figura 16.4 en la sección 16.2, Los extremos del DNA lineal rep resentan un problema para la replicación.) La actividad cebadora es indispensable para proporcionar extremos 3'-0H que inicien la síntesis de las cadenas de DNA en la cadena líder y en la cadena retrasada. La cadena líder requ iere sólo uno de estos episodios de iniciación, el cual ocurre en el origen. No obstante, debe haber una serie de sucesos de iniciación en la cadena rerrasada porque cada fragmento de Oka7akí requiere su propio inicio de novo. Cada fragmento de Okazaki empieza con una secuencia cebadora de RN A de -lO bases de largo que proporciona e l extremo 3'- 0H para la extensión mediada por la polimcrasa de DNA. Se req uiere una pr imasa pru:a caLalizar la reacción cebadora. la proporciona una actividad esp~cial de polimerasa de RNA, el p rodu cto del gen dnaG. La enzima es un polipépcido individ ual de 60 kD (mu cho más pequeño que la polime rasa de RNA). La primasa es una polimerasa de RNA que se utiliza sólo en circunstancias específicas, es decir, para sinteti7.ar fragmentos conos de RNA que sirven de cebadores para la síntesis de DNA. La primasa DnaG se asocia en forma rransitolia al complejo de replicación y en general sintetiza un cebador de 11 o de 12 bases. Los cebadores comienzan con la secuencia pppAG colocada aliado contrario de la secuencia 3'-GTC-5' en el molde. Algunos sistemas utilizan elementos alternativos a la primasa de DnaG. En los ejemplos de los dos fagos M 13 y G4, los cuales se u tilizaron en los primeros rrabajos sobre la replicación, surgió una di['erencia interesante. El cebamiemo en G4 usa DnaG, en tanto que el cebarniento en M 1 3 utiliza polimerasa de RNA bacteriana.. Estos fagos tien en otra característica poco común: el si rio de ceba miento está indicado por una región de esn·u ctura secu nda1ia. Existen dos tipos de reacciones de cebamiento en E. coli: • El sistema oriC, llamado así por el origen bacteriano, comprende en téTminos generales la asociación de la prirnasa DnaG con el complejo proteínico en la horqu illa de replicación. • El sistema
Los ripos de actividades comprendidas en la reacción de iniciación se resumen en la Aunque otros replicones en B. coli pueden tener alternativas para algunas de estas proteínas particulares, se necesitan los mismos tipos generales de actividad en cada caso. Una helicasa es indispensa ble para generar cadenas individuales, una proteína de unión a la cadena individual es necesaria para mantener el estado de cadena individual y la primasa sintetiza el cebador de RNA. DnaB es el componente centraJ en los replicones
es el componente activo del punto de crecimiemo. En los replicones oriC, DnaB es en un inicio cargado al origen como parte de tm gran comp lejo (véase la sección 18.15, Creación de las horquill as de replicación en el origen). Forma el punto de crecimiemo en el cual las cadenas de DNA se separan a medida que avanza la horquilla de replicación. Es parte del complejo de la polimerasa de DNA e interactúa con la primasa de DnaG paca iniciar la síntesis de cada fragmento de Okazaki en la cadena retrasada.

E1J

La holoenzima polimerasa de DNA tiene tres subcomplejos

• Hay dos copias de la pinza, que se en carga de mantener los nt'lcleos catalíticos sobre sus cadenas molde. Cada pinza está formada por un homodímcro de las subunidades ~ que se unen alrededor del DNA y garantiza la procesívidad. • El complejo y es un grupo de cinco proteínas que forman el cargador de pinza; éste coloca la pinza en el DNA. En la se muestra un modelo para el ensamble de la polimerasa de DNA 111. La holoenzima se ensambla en el DNA en tres etapas: • Primero el cargador de pinza usa la hidrólisis del ATP para unir las subunidades p al

complejo molde -cebador. • La unión al DNA cambia la conformación del sitio en Pque se une al cargador de pinza, y como resultado ahora tiene mayor afi nidad por el núcleo ele l a polimerasa. Esto permite al núcleo de la polimerasa unirse y éste es el medio por el cual el núcleo de la polimerasa es llevado al DNA.

El cargador de pinza rompe ATP para cargar el DNA lh con la pinza Cargador de pinza{ 5

Conceptos principales • La replicasa de E. coli polimerasa de DNA III es un complejo de 900 kD con una estructura dimérica. • cada unidad monomérica tiene un núcleo catalítico, una subunidad de dimerización y un componente de procesividad. • Un cargador de pinza coloca las subunidades de procesividad en el DNA, en donde forman una pinza circular alrededor del ácido nucleico. • Un núcleo catalítico está asociado a cada una de las cadenas de molde.

Ahora se puede relacionar la estructura de la subunidad de la polimerasa de DNA IH de E. colí con las actividades requeridas para la síntesis de DNA y proponer un modelo para su acción. La holoenzima es un complejo de 900 kD que contiene 10 proteínas organizadas en cuatro tipos de subcomplejos: • Existen dos copias del núcleo catalítico. Cada núcleo catalítico contiene la subuni dad ex (la actividad de polimerasa de DNA) , la subunidad e (la exonucleasa de corrección 3'-5') y la subunidad e (la cual estimula a la exonudeasa). • Hay dos copias de la subunidad de dimerización, 1 , que unen a los dos núcleos catalíticos.

ATP- + ADP +P

~

Pinza

Enzima central{

:

~

-+

~ *' ~

tt

tau + segundo núcleo se une para formar un dímero simétrico Sfntesis de la cadena líder

a

e

e Las subunidades -r mantienen la estructura diméríca

La holoenzima polimerasa de DNA III se ensambla en etapas y genera un complejo enzimático que sintetiza el DNA de las dos cadenas nuevas. lB 9 La holoenzima polimerasa de DNA tiene tres subcomplejos

439

• Un dímero 1' se une al núcleo de la polimerasa y proporciona una función de dimerización que une un segundo núcleo de polimerasa (asociado a otra pin1.a p) . La holoenzima es asimétrica porque sólo tiene un cargador de pinza. Éste se encarga de agregar un par de dímeros Pa cada cadena progenitora de DNA. Cada uno de los complejos nucleares de la holaenzima sintetiza una de las cadenas nuevas de DNA. El cargador de pinza es también necesario para descargar el complejo ~ del DNA; como resultado, los dos núcleos lienen diferentes habilidades para disociarse del DNA. EstO corresponde a la necesidad de sintetizar una cadena líder continua (en donde la polimerasa permanece asociada al molde) y una cadena retrasada discon Li nua (en donde la poliroerasa se disocia y re asocia de manera repetida) . El cargador de pinza está asociado al núcleo de la polimerasa que sintetiza la cadena retrasada y tiene una función clave en la capacidad para sintetizar fragmentos de Okazaki individuales.

La pinza co ntrola la asociación de la enzima central con el DNA Conceptos princípales

• El núcleo en la cadena líder es procesivo debido a que su pinza lo mantiene en el DNA. • La pinza asociada al núcleo en la cadena retrasada se disocia al final de cada fragmento de Okazaki y se ensambla de nuevo para el siguiente fragmento. • La helicasa DnaB se encarga de interactuar con la primasa DnaG para iniciar cada fragmento de Okazaki.

El dímero Phace a la holoenzima altam ente procesiva. La subunidad ~ está u nida con fuerza al DNA, pero se puede deslizar a lo largo de una molécula dúplex. La estructura cristalina de ~ muestra que crea un dímero en forma de anillo. El modelo que se muestra en la muestra el anillo ~ en relación con una doble hélice de DNA. El anillo tiene un diámetro externo de 80 Á y una cavidad interna de 35 Á, casi el doble del diámetro de La doble hélice de DNA (20 Á). El espado entre el anillo proLcínico y el DNA se llena de agua. Cada una de las subunidadcs ~tiene tres domi.nJos globulares con una organización similar {aunque sus secuencias son diferentes). Como resultado, el dímero tiene una simetría séxtuple que se refleja en 12 hélices a que se alinean en el interior del anillo. El dímero rodea el dúplex y da origen a la "pinza deslizante" que le permite a la holoenzima 440

CAPÍTU LO 18 Replicación del DNA

La subunidad p de la holoenzima polimerasa de DNA Ili está formada por un dímero, en donde la cabeza de un monómero se une a la cola del otro (las dos subunidades se muestran en color rojo y en color naranja), que forma un anillo que rodea por completo a un DNA dúplex (se ilustra en el centro). Reimpresión de Cell, vol. 69, Kong, X. P., et al., pp. 425-437. Copyright 1992, con autorización de Elsevier. Fotografías cortesía de John Kuriyan, University of California, Berkeley.

deslizarse por el DNA. La estructura explica la alta procesividad, no hay manera de que la enzima se desprenda. Las hélices a. localizadas en el interior tienen algunas cargas positivas que pueden interactuar con el DNA a través de las moléculas de agua intermediarias. La pinza proteínica no hace contacto directo con el DNA, por lo que puede "patinar" por el DNA, formando y rompiendo contactos por medio de las moléculas de agua. ¿De qué Iorma aborda la pinza al DNA? La pinza es un círculo de subunidades que rodea al DNA; por lo tanto, su ensamblaje o eliminación requiere un proceso dependiente de energía por parte del cargador de pinza. El cargador de pinza y es una estructura pemamérica circular que se une a una forma abierta del anillo ~inductor para cargarlo al DNA. En efecto, el anillo es abierto en una de las interfases entre las dos subunidades ~por medio de la subunidad del cargador de pinza. Éste se une en la parte superior de una pinza circular ceiTada, con su sitio de ATPasa yuxtapuesro a la pinza, y utiliza la hidrólisis de ATP para proporcionar la energía

o

necesaria para abrir el anillo de la pinza e inserta DNA demro de la cavidad central. La relación entre la pinza ~y el cargador de pinza y es un paradigma para sistemas similares utilizados por las replicasas de DNA que van desde los bacteriófagos hasta las células animales. La pinza es un heterómero (o puede ser un dímero o un rrímero) que forma un anillo alrededor del DNA con un conjunto de 12 hélices ex que forman una simetría séxtuple para la estructura en su conjunto. El cargador de pinza tiene algunas s1.1bunidades que hidrolizan ATP para proporcionar energía a la reacción. El prinápio básico que establece el modelo de la polimerasa dimérica afirma que. mientras una subunidad de polimcrasa simetiza la cadena lider de manera continua, la otra inicia y termina en forma cíclica los fragmentos de Oka'l.aki de la cadena re! ra sada dentro de un lazo exten so de cadena individual formado por su cadena de molde. La muestra un modelo genérico de la operación de tal replicasa. La horquiUa de replicación es creada por una helicasa (la cual forma por Lo general un anillo hexamérico) que transfiere en dirección 5'-3' en un molde para la cadena retrasada. la helicasa se conccm a dos subunidades cataliticas de polimerasas de DNA. cada una de las cuales está asociada a una pinza deslizante. Se puede describir este modelo de la polimerasa de DNA lTI en términos de los componentes individuales del complejo enlimático, como se ilustra en la . Un núcleo catalítico está asociado a cada cadena molde del DNA. La holoenzima se desplaza de manera continua por el molde para la cadena líder; el molde para la cadena retrasada es •empujado". lo que crea un lazo en el DNA. DnaB crea el punw de desemollamienro y se transfiere a lo largo del DNA hacia ''adelante". DnaB entra en contactocon la(s) subunldad(es) 't del cargador de pinza. Esto establece una conexión d\n.:cta entre el complejo helicasa-prímasa y los núcleos catalíticos. Esta unión tiene dos efectos. Uno es que incrementa la velocidad de la síntesis de DNA al aumentar 10 veces la velocidad del movimiento del núcleo de la polimerasa de DNA. El ~egundo es que impide que la polimerasa de la cadena líder se desprenda, es decir, incrementa su procesividad. La síntesis de la cadena líder crea un lazo de DNA de cadena individual que proporciona el molde para la síntesis de la cadena retrasada, y esle lazo se agranda a medida que el punto de desenroUamiento avanza. Después de la iniciación de un fragmento de Okazaki el complejo nucleru de la cadena retrasada jala el molde de cadena individual a través de la pinza Pmientras sintetiza la cadena m.1eva. El molde de cadena individual se debe extender a todo Jo largo de a l menos un fragmento de Okazaki antes de que

la polimerasa re1rasada complete un fragmento y esté lista para empezar el siguiente. ¿Qué pasa cuando el fragmento de Okazaki se completa? Todos los componentes del mecanismo de replicación funcionan de manera procesiva (es decir, permanecen asodados al DNA), excepto por la primasa y por la pinza ~- La muestra que se disocian cuando la síntesi.s de cada fragmento concluye y se libera el lazo. Una pinza ~nueva es entonces reclutada por el cargador de p inza para iniciar el próximo fragmento de Okazaki. La poli merasa de la cadena retrasada se transfiere de u na pinta pala siguiente en cada ciclo, sin disociarse del

complejo de replicación. ¿Qué se encarga de reconocer los sirios para iniciar la síntesis de los fragmentos de Okazaki? En los replicones oriC. la conexión entre el cebamiento y la horquilla de replicación la proporcionan las propiedades dobles del producto DnaB: es la helicasa que propulsa la horquilla de replicación e interactúa con la primasa DnaG en un sitio apropiado. Después de la síntesis del cebador. se libera la primasa. La longitud del RNA cebador es de:: apenas unas ocho a 14 bases. Al parecer, la polimerasa de DN A IU se encarga del desplazamiento de la primasa.

La hehcasa desenrolla

~ e,~NA

1

r

. . Fragmento de Okazakl prev1o

-=

El conector une a la helicasa a \: dos unidades de \ polimerasa Sub unidades catalflicas de la po11merasa de DNA La pinza deslizante rodea al DNA

r

Las puntas de las flechas indican el 3'5' extremo 3'

Cargador de p1nza

La helicasa en proceso de formación de la horquilla de replicación está conectada a dos subunidades catalíticas de la polimerasa de DNA, cada una de las cuales es mantenida en el ONA por una pinza deslizante. La polimerasa que sintetiza la cadena líder se desplaza de forma continua. La polimerasa que sintetiza la cadena retrasada se disocia al final de un fragmento de Okazaki y después se reasocia con un cebador ubicado en el lazo molde de cadena individual para sintetizar el siguiente fragmento.

8.10 La pinza controla La asociación de la enzima central con el ONA

441

-

Cadena lfder

/~

Cadena relrasai::!aSSB

Extremo 5' del fragmento de Okazaki anterior

3'

5'

3'

5'

Cada núcleo catalítico de Pol III sintetiza una cadena hija. DnaB se encarga del movimiento hacía adelante en la horquilla de replicación .

Coordinación de La síntesis de la cadena líder y de la cadena retrasada Conceptos principales • Se requieren diferentes unidades enzimáticas para sintetizar las cadenas líderes y retrasadas. • En E. coli, ambas unidades contienen la misma subunidad catalítica (DnaE). • En otros organismos pueden necesitarse diferentes subunidades catalíticas pa(a cada cadena.

Cada cadena de DNA nueva es sintetizada por una unidad catalítica individual. La muestra que el comportamiento de estas dos unidades es diferente porque las nuevas cadenas de DNA están creciendo en direcciones comrarias. Una unidad enzimática se desplaza con el punto de desenrollamiento y sintetiza la cadena líder en forma continua. La otra unidad se mueve hada "atrás'' en relación con el DNA, a lo largo de la cadena individual expuesta. Sólo segmentos corros de molde están 442

CAPÍTULO 18 Re plicación del DNA

expuestos en un momento dado. Cuando la síntesis de un fragmento de Okazaki ha concluido, es necesario que la síntesis del siguiente fragmento de Okazaki comience en una nueva localización más o menos en la vecindad del punto de crecimiento de la cadena líder, Esto requiere una translocación relativa al DNA de la unidad enzimática que está sintetizando la cadena retrasada. Con el término "unidad enzimáticaHse evita el problema de si la polimerasa de DNA que sintetiza la cadena líder es el mismo tipo de enzima que la polimerasa de DNA que sintetiza la cadena retrasada. En el caso mejor conocido, E. coli, existe un solo tipo de subunidad catalítica de polimerasa de DNA usada en la replicación, la proteú1a DnaE. La replicasa activa es un dímero y cada mirad del dímero contiene DnaE como subunidad catalítica. La DnaE redbe el apoyo de ouas proteínas (que difieren entre las cadenas líder y retrasada). Sin embargo, el u so de un solo tipo de subunidad catalítica puede ser atíp ico . En la bacte1ia Bacillus subtilis hay dos subw1idades catalíticas diferentes. PolC es la homóloga de DnaE de E. coli y se encarga de la síntesis de la cadena líder. Una proteína relacionada, DnaE8 5, es la subunidad catalíüca que sintetiza la cadena retrasada. Las polimerasas de DNA eucarióticas tienen la misma estructura general, y diferentes unidades enzimáticas sintetizan las cadenas líder y retrasada, pero no se sabe con certeza si se utilizan los mismos tipos, o tipos disümos, de subunidades cata líticas (véase la sección 18.13, Polimerasas de DNA eucarióticas independientes realizan la iniciación y la elongación). Un problema importaJ1le del modo discontinuo de replicación su rge del uso de diferentes unidades enzimáticas para simetizar cada cadena de DNA nueva: ¿cómo se coordina la síntesis de la cadena retrasada con la sú1tesis de la cadena líder? A medida que el replisoma se desplaza por la cadena de DNA y desenrolla las cadenas progenitoras, una unidad enzímática extiende la cadena líder. De manera periódica, la acti vidad primosoma inicia un fragmento de Okazaki en la cadena retrasada y la otra unidad enzimática debe, entonces, moverse en la dirección contraria para sintetizar el DNA. La propone dos tipos de modelos para Jo que le sucede a esta unidad enzimática cuando completa la síntesis de un fragmento de Okazaki. El mismo complejo puede reutilizarse para la síntesis de fragmentos de Okazaki sucesivos. Otra posibilidad es que el complejo podría disociarse del molde, por lo que tendría que ensamblarse un nuevo complejo para alargar el siguiente fragmento de Okazaki. En la sección 18.1 O, La pinza controJ a la asociación de la enzima central con el DNA, se ve que es el primer modelo el que se aplica.

EE1S

Los fragmentos de Okazaki están unidos por la ligasa

1 Inicio del fragmento de Okazakl

Conceptos principales • Cada fragmento de Okazaki inicia con un cebador y se detiene antes del siguiente fragmento. • la polimerasa de DNA I elimina el cebador y lo remplaza con DNA en una acción semejante al desplazamiento de hendidura. • La ligasa de DNA realiza el enlace que conecta el extremo 3' de un fragmento de Okazaki al inicio 5' del siguiente fragmento.

Ahora se conoce mejor lo que ocurre en la unión de los fragmentos de OkazakC como se ilustra en la . El orden completo de los sucesos es incierto, pero debe involucrar la síntesis del cebador de RNA, su extensión con el DNA, la eliminación del cebador de RNA, su sustitución por un fragmento de DNA y la tmión covalente de los frag mentos de Okazaki adyacentes. La figura indica que la sfntesis de un fragmento de Okazaki termina justo ames del inicio del cebador de RNA del fragmento precedente. Cuando el cebador es eliminado, se forma un espacio. Este espado se llena con la polimerasa de DNA I; los mutantes po/A no consiguen unir sus fragmentos de Okazaki de manera apropiada. La actividad exonucleasa 5'-3' elimina el cebador de RNA al tiempo que lo remplaza con una secuencia de DNA extendida desde el extremo 3'-0H del siguiente fragmen to de Okazaki. EstO equivale al desplazamiento de hendidura, excepto que el DNA nuevo remplaza un fragmento de RNA en vez de un tramo de DNA. En los sistemas de los mamíferos (en donde la polimerasa de DNA no tiene una actividad exonudeasa 5'-3'), los fragmentos de Okazald se conectan por un proceso de dos pasos. La síntesis de un fragmento de Okazaki desplaza al cebador de RNA del fragmento anterior en la forma de un "alerón ''. La muestra que la enzima FENl divide la base del alerón. En esta reacción FENl fundo na como una cndonucleasa, pero también es una enzima con actividad de 5'-3' exonucleasa. En las reacciones de reparación del DNA. FEN l puede realizar la división cerca de un nucleótido desplazado y luego usar su actividad exonucleasa para eliminar el material adyacente. La imposibilidad de eliminar un alerón con rapidez puede tener consecuencias importantes en regiones de secuencias repetidas. Las repetidones directas pueden ser desplazadas y alineadas en forma incorrecta con el molde; las secuencias palindrómicas pueden formar horquillas. Estas estructuras pueden cambiar el nómero de repeticiones (véase

2. Terminación del lragmento de Okazaki

t

\

~ DnaB

DnaG 3''

Po

Pollll~

la

(.

3'5'

t

5'

3"5'

4. La pinza ll se asocia

3. La pinza ~ se disocia

t

l

3'

3'5'

3'5'

3'5'

El núcleo de La polimerasa y la pinza p se disocian cuando concluye la síntesis del fragmento de Okazakí y se reasocian al inicio.

La enzima líder realiza la elongación de manera contínua

u_

1

1

La enzima retrasada comienza fragmentos nuevos Las polimerasas de la cadena líder y de la cadena retrasada se mueven de manera independiente.

la Figura 6.28). l a importancia general de FEN I radica en que impide que los alerones del DNA generen esLructuras que pueden provocar deleciones o duplicaciones del genoma. Una vez que el RNA ha sido retirado y rem plazado, los fragmentos de Okazaki cercanos deben unirse. El extremo 3'- 0H de un fragmento es adyacente al extremo 5'-fosfaro del fragmento anterior. La responsabilidad de sellar esta hendidura recae en la enzima ligasa de D NA. Las ligasas están presentes en las procariotas y en las eucariotas. En los murames lig- persisten los fragmentos desconectados porque son incapaces de unir los rragmentos de Okazaki. Las ligasas de E. coli y de T4 comparten la propiedad de poder sellar las hendiduras que tie nen 18.12 Los fragmentos de Okazaki están unidos por la ligasa

443

La misma subunidad catalítica es reutilizada

Se utiliza una subunidad catatitlca diferente

El modelo para la acción de la polimerasa de la cadena retrasada, que aparece en la parte superior de la figura, muestra que cuando una unidad enzimática completa un fragmento de Okazaki, se desplaza a una posición nueva para sintetizar el siguiente fragmento. El modelo inferior muestra que la polimerasa de la cadena retrasada se disocia cuando completa un fragmento de Okazakí y una nueva unidad enzimática se asocia al DNA para sintetizar el siguiente fragmento de Okazaki.

extremos 3'-0H y 5'-fosfato, como se muestra en la . Ambas enzimas emprenden una reacción de dos pasos en la que participa un complejo AMP-enzima. (Las enzimas de E. coli y de T4 utilizan cofactores diferentes. La enzima de E. coli utiliza el NAD [nicolinamida adenina dinucleótido] como cofactor, en tanto que la enzima de T4 utiliza ATP.) El AMP del complejo enzirnático se une al fosfato 5' de la hend idura y después se forma un enlace fosfodiésrer con el grupo terminal3'-0H ele la hendidura, con lo que se libera la enzima y el AMP.

Polimerasas de DNA eucarióticas independientes realizan la iniciación y la elongación (onceptos principales • Una horquilla de replicación tiene un complejo formado por polimerasa de DNA ajprimasa y dos complejos de polimerasa de DNA ó o e. • El complejo polímerasa de DNA ajprimasa inicia la síntesis de las dos cadenas del DNA. • La polimerasa de DNA oalarga la cadena líder y una segunda polimerasa de DNA ó, o polimerasa de DNA E, alarga la cadena retrasada.

Las células eucarióticas tienen un gran número de polimerasas de DNA. Éstas pueden dividirse a grandes rasgos en aquellas indispensables para la replicación serniconservadora y aquellas que intervie444

CAPÍTULO 18 Replicación del DNA

nen en la síntesis de material para reparar el DNA dañado. La replicación del DNA nuclear requiere las poJilnerasas de DNA a, oyc. Las polimerasas de DNA nuclear remanentes participan en la símesis de fragmentos nuevos de DNA para remplazar el material dañado. La muestra que todas las replicasas nucleares son enzimas heterotetraméricas grandes. En cada caso, una de las subunldades se encarga de la catálisis y las demás están relacionadas con fundones auxiliares, como la actividad cebadora, la p:rocesividad o la corrección. Todas estas enzimas replican DNA con alta fidelidad, igual que la enzima mitocond rial un poco menos compleja. Las polimerasas reparadoras tienen estructuraS mucho más sencillas, las cuales a menudo consisten en una sola subunidad monomérica (aunque puede funcionar en el contexto de un complejo de otras enzimas reparadoras). De las enzimas que participan en la reparación, sólo la polimerasa de DNA ~ tiene una fidelidad cercana a la de las repHcasas: todas las demás úenen tasas de error mucho mayores. Toda la síntesis del DNA miwcondrial, incluidas las reacdones de reparación, de recomb inación y de replicación, la realiza la polimerasa de DNA y. Cada una de las tres replicasas de DNA nudear tiene una !unción distinta: • La polímerasa de DNA a inicia la síntesis de cadenas nuevas. • Las polimeTasa de DNA alarga l.a cadena líder. • La polimerasa de DNA e puede intervenir en la síntesis de la cadena retrasada, pero también tiene otras funciones. La polimerasa de DNA ex es poco común porque riene la capacidad de iniciar una cadena nueva. Se utiliza para iniciar tan.ro la cadena líder como la cadena retrasada. La enzima existe como un complejo formado por una subunidad catalítica de 180 k.D, que está asociada a la subunidad B que p;JTece ser necesaria para el ensamble, y por dos proteínas más pequeñas que proporcionan una actividadprimasa. Por su capacidad doble de cebar y extender las cadenas, en ocasion es se le denomina primasa pol a. La enzima primasa/ pol a se une al complejo de iniciación en el origen y sintetiza una cadena cona formada por - l O bases de RNA seguidas de 20 a 30 bases de DNA (algunas veces llamada íDNA). Luego es remplazada por una enzima que extenderá 1a cadena. En la cadena líder, ésta es la polimerasa de DNA o. A este suceso se le denomina intercambio de pol. Comprende interacciones entre numerosos componentes del complejo de iniciación. La potirnerasa de DNA es una enzima muy procesiva que sinteü7a de manera continua la cadena líder. Su procesividad se debe a su imeraccióx: con otras dos proteínas, RF-C y PCNA.

o

o

Las funciones de RF-C y del PCNA son análogas a las de la unidad ~ de procesividad y del cargador de piouqde E. colí (véase la sección 18.10, La pinza controla la asociadón de la enzima central con el DNA). RF-C es un cargador de pinza que cataliza una carga del PCNA al DNA. Se une al extremo 3' de la cadena iDNA y utiliza la hidrólisis de ATP para abrir el anillo de PCNA de tal forma que pueda crear la esrructura circular alrededor del DNA. la procesividad de la polimerasa de DNA 8 la mantiene el PCNA, que amarra a la polimerasa de DNA 8 al molde. (la proteína PCNA es llamada antígeno nuclear de células en proliferación [por sus siglas en inglés: proliferating cell nuclear antigm] por razones históricas.) La estructura crislalina del PCNA separece mucho a la subunidad ~de E. coli: un trímero Íorma un anillo que rodea al DNA. La secuencia y la organización de las subunidades son d ife rentes a las de la pinza dimérica ~; sin embargo, es probable que la función sea similar. Se tiene menos certeza sobre lo que sucede en la cadena retrasada. Una posibilidad es que la polimerasa de DNA 8 también alargue la cadena retrasada. Tiene capacidad para formar dímeros, lo que sugiere un modelo análogo al comportamiento de la replicasa de E. coli (véase la sección 18.9, La holoenzima polimerasa de DNA tiene tres subcomplejos). Sin embargo. hay algunos incticios de que la polimerasa de DNA t puede alargar la cadena retrasada, aunque también ha sido identificada con otras funciones. Un modelo general sugiere que la horquilla de replicación contiene un complejo de polimerasa de DNA cx-primasa y otros dos complejos de polimerasas de DNA. Una es la polimerasa de DNA 8 y la otra es una segunda polimerasa de DNA 8 o puede ser una poli merasa de DNA t. Los dos complejos de polimerasa de DNA 8-t actúan de la misma manera que los dos complejos de poli merasa de DNA ID en eJ replisoma de li. coli: uno sintetiza la cadena líder y el otro sintetiza los fragmentos de Okazaki en la cadena retrasada. La exonucleasa MF l elimina los cebadores de RNA de los fragmentos de Okazaki. La enzima ligasa de DNA I se requiere de manera específica para sellar las hendiduras entre los fragmentos de Okazaki concluidos.

IE!II

El fago ! 4 propo:ciona su prop10 mecamsmo de replicación

Concepto principal • El fago T4 proporciona su propio mecanismo de replicación, formado por una polimerasa de DNA, el gen 32 SSB, una helicasa, una primasa y por proteinas accesorias que incrementan la velocidad y la procesividad.

18. t

La poli merasa de DNA 1

1 utiliza el desplazamiento de

+

hendidura para remplazar al cebador de ANA con DNA

La sintesis de los fragmentos de Okazaki requiere cebamiento, extensión, eliminación del RNA, rellenado de los espacios y ligamiento de la hendidura.

Cuando un fago T4 infecta una célula de E. coli, aporta numerosas funciones propias que remplazan o que potencian las funciones del hospedador. El fago depende poco de la expresión de las funciones del h ospedador. La degradación del DNA del hospedador es importante para la liberación de nucleótidos que son reutilizados en la síntesis del DNA del fago. {El DNA del fago difiere en la composición de bases del DNA celular en que uüliza hidroximetilcirosina en lugar de la citosina acostumbrada.) Las funciones codificadas por el fago implicadas en la síntesis de DNA en la célula infectada pueden identificarse por medio de mutaciones que impiden la producción de fagos maduros. Las funciones esenciales del fago se identifican por medio de mutaciones letales condicionales, que se dividen en tres clases fenotípicas: • Aquellas en las cuales no hay síntesis de DNA en absoluto identifican genes cuyos productos son componentes del mecanismo de replicación o participan en la provisión de precursores (en especial hidroximen lciwsina). El fago T4 proporciona su propio mecanismo de replicación

445

Cebador de ANA

Cebador deRNA

Enzima~ AMP

0

l

Enzima + NAD Enzima-AMP

•


Adenina-Ribosa·O·P-0

-o-F>-o-

P

e~r~\i.jri -oJo 'p• á'o

La ligasa sella el espacio

FENl es una exojendonucleasa que reconoce la estructura que se crea cuando una cadena de DNA es desplazada de un dúplex como un "alerón". En La replicación hace una división en La base del alerón para eliminar el cebador de RNA.

• Aquellas en las cuales el comienzo de la síntesis de DNA se retrasa tienen que ver con la iniciación de la replicación. • Aquellas en las que la síntesis de DNA comienza pero después se interrumpe incluyen funciones reguladoras, la ligasa de DNA y algunas de las enzimas relacionadas con la degradación del DNA del hospedador. • También existen genes no esenciales relacionados con la replicación, como aquellos involucrados en la glucosilación de la hidroximetilcitosina en el DNA. La síntesis del DNA del fago T4 es catalizada por un agregado multienzimático ensamblado con los productos de un pequeño grupo de genes esenciales. La proteína del gen 32 (gp3 2) es una proteína muy colaboradora de unión al DNA de cadena individual, que se necesita en cantidades estequiométricas. Fue el primer ejemplo de este tipo que se describió. La geometría de la horquilla de replicación de T4 puede requerir de manera específica la proteína codificada por el fago, porque la SSB de E. colino puede sustituirla. La proteína gp32 forma un complejo con la polimerasa de DNA de T4; esta 446

CAPÍTULO 18 Replicación del DNA

La Ligasa de DNA sella las hendiduras que se encuentran entre nucleótidos próximos al emplear un intermediario enzima-AMP.

interacción podría ser importante en la construcción de la horquilla de replicación. El sistema de T4 utiliza un episodio de cebamiento de RNA similar al de su hospedador. Con un DNA de cadena individual de T4 como molde, los productos de los genes 41 y 61 actúan juntos para sintetizar cebadores pequeños. Su comportamiento es análogo al de DnaB y DnaG en E. coli. La proteína del gen 41 es la contraparte de la proteína DnaB. Es una helicasa hexamérica que utiliza la hidrólisis del GTP con el fin de proporcionar energía para desenrollar al DNA. El complejo p4llp6l se desplaza en forma procesiva en dirección 5'- 3' en la síntesis de la cadena retrasada e inicia de manera periódica los fragmentos de Okazak.i. Otra proteína, el producto del gen 59, carga al DNA con el complejo p41/p61 ; es necesaria para desplazar la proteína p32 y penni tir que la helicasa se ensamble en el DNA. La proteína del gen 61 se necesita en cantidades mucho menores que la mayor parte de las proteínas de replicación de T4. Existen desde lO copias de gp61 por célula. (Esto ha impedido su caracterización. Se requiere en cantidades tan pequeñas que en un principio no se identificó como un componente indispensable, debido a que la preparación de gp32 estaba contaminada con esta proteína, y ejercía su función.) La proteína del gen 61 tiene actividad de primasa, la cual es análoga a la del producto DnaG de E. coli. La primasa reconoce la secuencia molde

Polimerasa Función deDNA Replicasas de alla fidelidad Replicación nuclear ct

Estructura

8

Tetrámero de 250 kD

E

'f

~

'1

!>

Replicación mltocondrial Reparación de alta fidelidad Reparactón de escisión de bases Reparación de baja iidelídad Puente de dimero de timina Reparac16n de daño de bases Necesaria para la meiosls Delación '1 sustitución de bases

Tetrámero de 350 kD

Función

E. colí

Hela/SV40

FagoT4

Heticasa Carga helicasa/primasa Mantenimiento de la cadena individual Actividad cebadora

OnaB DnaC SSB

Antígeno T AntígenoT RPA

41 59 32

DnaG

Pota/primasa

61

PCNA RFC

45

Pinza deslizante ~ Carga de la pinza (ATPasa) Complejo'YS

Tetrámero de 350 kD Dfmero de 200 kD

Catálisis Dimerización de la hotoenzima

Monómero de 39 kD

Eliminación del RNA ligamiento

Núcleo Poi /JI Pol6 ¿? Poli

Ugasa

MF1 Ligasa 1

44/62 43

43 43 Ligasa T4

Funciones similares son necesarias en todas las horquillas de replicación.

Hetelómero Monómero Monomero Monómero

Los productos de los genes 44 y 62 forman un [uerte complejo que tiene actividad de ATPasa. Son el equivalente al complejo de pinza y su función es cargar a p45 sobre el DNA. Cuatro moléculas de ATP-son hidroUzadas cuando se carga el DNA con la pinza p45 y con la polimerasa de DNA p43. La e5tructura global del replisoma es muy similar a la de E. coli. Está formada por dos complejos de holoenzimas acoplados, uno que sintetiza la cadena líder y el otro que sintetiza la cadena retrasada. En este caso, la dimerizadón comprende una interacción directa entre las subunidades de la polimerasa de DNA p43, y p32 Liene una función en la coord.inadón de las acciones de las dos unidades de pollmerasa de DNA. Hasta ahora se ha examinado la replicación del DNA en lo que se refiere a Ja progresión de la horquilla de replicación. La necesidad de otras fu n ciones la demuestran los mutames de retraso de la síntesis del DNA y los de detención de la síntesis del DNA. Tres de los cuatro genes de los mutantes de retraso de la síntesis del DNA son el 39, el 52 y el 60, los cuales codifican las tres subunidades de la ropoisomerasa TI de T4, una actividad necesaria para eliminar supercnroUamientos en el molde (véase la sección 19 .13, Las topoisomerasas relajan o introducen superenrollamientos en el DNA). La función esencial de esta enzima sugiere que el DNA de T4 no permanece en forma lineal, sino que más bien se constriñe topológicamente durante alguna etapa de la replicación. La topoisomerasa podría necesitarse para que la rotación del DNA dejara atrás la horquilla de replicación. La comparación del mecanismo del fago T4 con el mecanismo de E. coli sugiere que la replicación del DNA plantea una serie de problemas que se resuelven de formas análogas en diferentes sistemas. Ahora se pueden comparar las actividades enzimáticas y estructurales observadas en la horquilla de

yo

Las células eucarióticas tienen muchas poli merasas de DNA. las enzimas replicativas operan con alta fidelidad. Excepto por la enzima todas las enzimas de reparación tienen baja fidelidad. Las enzimas replicativas tienen estructuras extensas, con subunidades independientes para actividades distintas. Las enzimas de reparación tienen estructuras mucho más sencillas.

p,

3'-TIG-5' y sintetiza pentarribonucleótidos cebadores que tienen la secuencia general pppApCpNpNpNp. Si está presente el mecanismo de replicación completo, estos cebadores se extienden y forman cadenas de DNA. La polimerasa de DNA del gen 43 tiene la actividad sintética 5'-3' habitual, que está asociada a la acUvidad correctora de cxonucleasa 3'-5'. Cataliza la sin tesis de DN A y elimina a los cebadores. Cuando la polimerasa de DNA de T4 utiliza un DNA de cadena individual como molde, su velocidad de progreso es desigual. La enzima se mueve con rapidez por las regiones de cadena individual, pero lo hace con m1Jcho más lentitud por las regíones que tlenen una estruc.tura secundaria con apareamiento de bases entre las cadenas. Las proteínas accesorias ayudan a la polimerasa de DNA a pasar por estas barricadas y mantenga as1 su velocidad. Las tres proteú1as restantes se conocen como "prot.eínas accesorias de la polímerasa". I ncre mentan la afinidad de la polimerasa de DNA por el DNA y también aumentan la procesividad y la velocidad. El producto del gen 45 es un trúnero que actúa como una pinza deslizante. La estructura del trímero se parece ala del dímero~ de E. coli, en que forma un círculo alrededor del DNA que sostiene la subunJdad de la polimerasa de DNA con mayor fu.erza en el molde .

1&. _4 El fago T4 proporciona su propio mecanismo de replicación

447

replicación en F.. coli, en T4 y en las células HeLa (humanas). La resume las funciones y las asigna a proteínas individuales. Se pueden i.merpretar las propiedades conoddas de las proteínas de los complejos de replicación en términos de funciones similares que comprenden las reacciones de desenrollamienLO, de cebamiento, de catálisis y de formación de sello<;. Los componentes de cada sistema interactúan de maneras restringidas, como lo demuestra el hecho de que el fago T4 requiere sus propias hclicasa, primasa, pinza, etc., y por el hecho de que las proteínas bacterianas no pueden sustituir a sus contrapartes fágicas.

Creación de las horquillas de replicación en el origen

llama la atención por ser la única involucrada de manera exclusiva en la iniciación treme a la elongación. DnaB y DnaC proporcionan la "maquinaria" de iniciación en el origen. La primera etapa en la formación del complejo es la urúón de la proteína DnaA a oriC. La reacción comprende la acción en dos tipos de secuencias: las repeticiones de 9 bp y las repeticiones de 13 bp. Juntas, estas dos últimas secuencias definen los límites del origen mínimo de 245 bp, como se indica en la . Un origen es activado por la secuencia de episodios que se resumen en la , en la cual, a la unión de DnaA Le sigue la asociación con las otras proteínas.

Las cuatro secuencias de consenso de 9 bp sobre el lado derecho de oriC proporcionan los <>itios de

Conceptos principales La iniciación en oriC requiere el ensamble secuencial de un gran complejo de proteínas. DnaA se une a secuencias cortas repetitivas y forma un complejo oligomérico que desnaturaliza al DNA. • Seis monómeros de DnaC se unen a cada hexámero de DnaB, y este com piejo se une al origen . Un hex~mero de DnaB forma la horquilla de replicación. La girasa y la SSB también son necesarias.

Para comenzar un ciclo de replicación de un DNA dúplex se necesiLan varias actividades sucesivas: • Las dos cadenas de DNA deben pasar por su separación inicial. Es decir, en efecto, sufrir una desnaturalinción en una región corta. • Un punto de desenrollamiento comienza a desplazarse por el DNA; esto indica la ge neración de la horquilla de replicación, la cual contim1a m oviéndose dura m e la elongación. • Los primeros nucleótidos ele la nueva cadena deben ser sintetizados para formar el ce bador. Esta acción se necesita una vez en la cadena líder, pero se repite en el comienzo de cada fragmemo de Okazaki en la cadena retrasada. Por lo tanto, algunos de los sucesos que son in dispensables para la iniciación ocurren sólo en el origen; otros se repiren con la iniciación de cada frag mento de Okazaki durante la fase de elongación. Se han utilizado plásrrudos que ponan la secuencia oriC de E. coli para desarrollar un sistema sin células para la replicación. In virro, la iniciación de la replicación en oriC empieza con la formación de un complejo que requiere seis proteínas: DnaA, DnaB, DnaC, HU, girasa y SSB. De las seis proteínas comprendidas en el precebamiento, la proreína DnaA 448

CAPÍTULO 18 Replicación del DNA

L

M R

repelicio• nes de 13 bp

2

3

4

repeticiones de 9 bp 245 bp- - - - - •

El origen mínimo se define por ta distancia que hay entre los miembros externos de las repeticiones de 13 bp y de 9 bp.

Los monómeros de DnaAse unen a las repetiCiones de 9bp DnaA se une e las repeticiones de 13 bp

Las cadenas del DNA se separan en las repeticiones de 13bp

OnaB y OnaC se unen al complejo y forman norqUIIIas de replicación

El precebamiento comprende la formación de un complejo por asociación secuencial de proteínas, lo cual provoca la separación de las cadenas del DNA.

esfera con un radio de 6 nm. La formación de un complejo en oriC es detectable por la presencia de un gran glóbulo proteínico que se observa en la 1 . Cuando la replicación comienza, una burbuja de replicación se hace visible al lado del glóbulo. La región de la separación de la cadena en el complejo abierto tiene el tamaño suficiente para que se puedan unir ambos hexámeros de DnaB, lo cual inicia las dos horquillas de replicación. A medida que se une DnaB, desplaza a DnaA de las repetídones de 13 bp y extiende la longitud de la región abierta. Después utiliza su acüvidad de helicasapara extender la región de desenroUamjemo. Cada DnaB

activa una primasa de DnaG (en un caso para iniciar

El complejo en oriC puede apreciarse con microscopia electrónica. Los dos complejos se visualizaron con anticuerpos contra la proteína DnaB. Fotografía superior reproducida de Funnel, B. E., et al. J. Biol. Chem. 1987. 262: 10327-10334. Copyright 1987 by American Society for Biochemistry & Molecular Biology. Fotografía cortesía de Barbara E. funnell, University of Toronto. Fotografía inferior reproducida de Barker, T. A., et al. J. Bio/. Chem. 1987. 262: 6877-6885. Copyright 1987 by American Sodety for 8iochemistry & Molecular Biology. Fotografía cortesía de Barbara E- Funnetl, Universíty of Toronto. unión iniciales para DnaA. Ésta se une en colaboración para formar un núcleo central alrededor del cual el DNA de oriC forma una envoltura. Después. Dn aA actúa sobre tres repeticiones, en tándem. de l3 bp rica.s en A-T, que se encuemran en e l lad o izquierdo de oriC. En presencia de ATP, DnaA desnaturaliza las cadenas del DNA en cada uno de estos sitios para formar un complejo abierto. Las tres repeticiones de 13 bp deben ser desnaturalizadas para que la reacción prosiga a la siguiente etapa. En general. de dos a cuatro monómeros de DnaA se unen al origen y reclutan dos complejos de "precebamiento" de DnaB-DnaC para unüse, por lo que hay uno para cada una de las dos horquillas de replicación (bidireccionales). Cada complejo de DnaB-DnaC está formado por seis monómeros de DnaC unidos al hexámero de DnaB . Cada complejo de DnaB-DnaC transfiere un hexámero de DnaB a una cadena opuesta de DNA. DnaC hidroliza ATP para liberar a DnaB. El complejo de precebamiento genera un agregado proteínico de 480 kD, que corresponde a una

la cadena líder y en el otro para iniciar el primer fragmento de Okazaki de la cadena retrasada). Dos proteínas más son necesarias para apoyar la reacdón de desenrollamiento. La girasa proporciona un eslabón giratorio que permite que una cadena gire alrededor de la otra (una reacción que se analiza con más detalle en la sección 19 .15, La giras a funciona por inversión del enrollamiento); sin esta reacción, el desenrollamiento generaría tensión por torsión en el DNA. La proteína SSB estabiliza al DNA de cadena individual a medida que se va formando. La longitud del DNA dúplex que por Jo general se desenrolla para iniciar la replicación es tal vez <60 bp. La proteína HU es una proteína general de unión al DNA en E. coli. Su presencia no es indispensable para iniciar la replicación in vitro, pero estimula la reacción. La HU tiene la capacidad de plegar el DNA y tiene que ver con la construcción de la estructura que conduce a la formación del complejo abierto. La entrada de energía en forma de ATP es necesaria en numerosas etapas para la reacción de precebamiento y para el desenrollam iento del DNA. La acción helicasa de DnaB depende de la hidrólisis de ATP y la acción rotatoria de la girasa también consume ATP. Este último también se necesita para la acción de la primasa y para activar la polimerasa de DNA Ul. Después de la generación de la horquilla de replicación, como se indica en la Figura 18.28, tiene lugar la reacción de cebamiemo para generar una cadena iíder. Se sabe que para la actividad cebadora se utiliza la síntesis de RNA, pero los detalles de la reacción se desconocen. Algunas mutaciones en dnaA pueden ser suprimidas por mutaciones en la po1imerasa de RNA. lo cual sugiere que DnaA podría participar en un paso de iniciación que requiere La síntesis de RNA in vivo. La polimerasa de RNA podría necesirarse para leer el origen desde las unidades de transcripción adyacentes; al terminar en sitios ubicados en el ori lB. • Creación de las horquillas de re plicación en el origen

449

gen, podría proporcionar los extremos 3'-0H que ceban a la polimerasa de DNA m. (Un ejemplo lo constituye el uso de lazos D en los orígenes rnitocondriales, como se analiza en la sección 15.10, Los lazos D mantienen los orígenes mitocondriales.) Una alternativa es que el acto de la transcripción estuviera asociado a un cambio estructural que ayude a la iniciación. Esta última idea es respaldada por observaciones que sustentan que la transcripción no tiene que pasar por el origen; es eficaz hasta a 200 bp de distancia del origen y puede usar cualquiera de las dos cadenas del DNA como molde in vitro. El episodio de la transcripción se relaciona de manera inversa con la necesidad d.e superenroUarrúento in vitro. lo cua l sugiere que actúa cambiando la estructura local del DNA para facilüar la desnaturalización del DNA.

Sucesos comunes en el cebamiento de la replicación en el origen Conceptos principales • El principio general de la iniciación bacteriana es que el origen es reconocido en un inicio por una proteína que forma un gran complejo con el DNA. • Una región corta de DNA enriquecida con A-Tes desnaturalizada. DnaB se une al complejo y crea la horquilla de replicación.

Otro sistema para investigar las interacciones en el origen lo proporciona el fago A.. En la se muestra un mapa de la región . la iniciación de la replicación en el origen de/.. requiere Nla activa-

La transcripción debe iniciar aquí Para que la replicación inicie aquf

La iniciación de la transcripción en PR es necesaria para activar el origen del DNA de A..

ción", con el inicio de la transcripción a partir de PR. Tgual que en los sucesos en oriC, esto no significa que el RNA proporcione un cebador para la cadena líder. Analogías emre estos sistemas sugieren que la síntesis de RNA podría participar en la estimulación de algún cambio estructural en la región. La iniciación ¡·equiere los productos de los genes O y P del fago. así como numerosas funciones del 450

CAPÍTULO 18 Replicación del DNA

Sitios de unión para la proterna O de 18 bp

Región rica en A·T

El origen de A. para la replicación comprende _ regiones. Los episodios tempranos son catalizados por la prote'-; la cual se une a una serie de cuatro sitios y después el DNA es de::· turalizado en la región cercana rica en A-T. El DNA se dibuja corr~ dúplex recto; sin embargo, en realidad está plegado en el erige-

hospedador. La proteína O del fago se une a l origen de A., la proteína P fág ica interactúa con la proteína O y con proteínas bacterianas. El origen se encuentra dentro del gen O, de modo que la proteína actúa cerca de su sitio de síntesis. Las variantes del fago llamadas l..dv consisten en genomas más corros que portan wda la información necesaria para la replicación, pero carecen de funciones infecciosas. El DNA l..dv sobrevive en la bacteria como un plásmido y puede ser replicado i11 vitro por un sistema formado por las proteínas O y P codificadas por el fago junto con las funciones de replicación bacterianas. Las proteínas de /..O y P forman un complejo junto con DnaB en el origen de /~, ori'A. El origen está formado por dos regiones, como se il ustra en la : una región que comprende una serie de cuatro sitios de unión para la proteína O está próxima a una región rica en A-T. La primera etapa en la iniciación es la unión de O para generar una esLructura casi esférica con un diámetro de -11 nm, una estructura llamada en ocasiones O-soma. Éste contiene -100 bp o 60 k O de DNA. Hay cuatro sitios de unión de 18 bp para la proteína O, de -34 k.D. Cada sirio es palindrómico y es probable que se una a un dímero O simétrico. Las secuencias de DNA de Jos sitios de unión a O parecen estar plegados, y la unión de la proteína O induce un plegamiento mayor. Si el DNA está superenrollado, la unión de la proteína O provoca un cambio estrucrural en el origen. La región rica en A-T contigua a los sitios de unión se hace susceptible a la nucleasa Sl, una enzima que reconoce de manera específica al DNA no apareado. Esto sugiere que junto al complejo de proteínas O ocurre una reacción de desnaturalización.

La [unción de la proteína O es análoga a la de DnaA en on·c: prepara al origen para la unión de DnaB. Lambda proporciona su propia proteína P que sustituye a DnaC }' lleva a DnaB al origen. Cuando se agregan la proteína P de A y las proteínas Dna B bacterianas, el complejo se hace más grande y simétrico. Incluye más DNA (un rotal de -L60 bp), así como algunas ouas proteínas. La proteína P de A tiene una función especial; inhibe la acción de helicasa de DnaB. El movimiento de la horquilla de replicación se desencadena cuando la proteína P es liberada del complejo. Este episodio precede al cebamiento y a la sfmesis de DNA. Algunas proteínas son esenciales para la replicación sin que participen de manera directa en la síntesis de DNA. Las proteínas Dna K y DnaJ son ejemplos interesantes. La proteína DnaK es un cha perón y está relacionada con una proteína de estrés común de las eucariotas. Su capacidad para interactuar con otras proteínas de un modo dependiente de la conformadón es importante en muchas actividades celulares, como la replicación. La función de Dnak y DnaJ puede ser desensamblar el complejo de precebamiemo: al causar la liberación de la proteína P, permiten el comienzo de la replicación. Las reacciones de iniciación en oriC y en oríA son similares. Comprenden las mismas etapas y se basan en componentes comunes. El primer paso es el reconocimiento del origen por una proteína que se une para formar un complejo con el DNA (DnaA para oriC y la proteína O para ori/...). Una región cona de DNA rica en A-Tes desnaruralizada . Después DnaB es cargada; esto requiere funciones distintas en onC y en oríA (no obstame, se requieren otras proteínas para esta etapa en otros orígenes). Cuando la helicasa DnaB se une al complejo, se crea una horquilla de replicación. Por último, se sintetiza un cebador de RNA, después de lo cual comienza la replicación. El uso de oriC y orí'A ofrece un modelo general para la activación de los orígenes. Una serie similar de episodios ocurre en el origen del virus SV40 en las células de los mamíferos. Dos bexámeros de amígeno T, una proteína codificada por el virus, se unen a una serie de sitios repetidos en el DNA. En presencia de ATP, ocurren cambios en la estructura del DNA, que culminan en una reacción de desnaturaUzadón. En el caso de SV40, la región desnaLUra lizada es bastante cona y no es rica en A-T, pero tiene una composición atípica en la cual una cadena está formada casi de manera exclusiva de pirimidinas y la otra de purinas. Cerca de este sitio se encuentra orra región esencial. Consiste en pares de bases A-T. en los cuales el DNA está plegado; el DNA es entonces desenrollado por la unión del antígeno T. Una diferencia interesante con t'l sistema de las

procariotas es que el antígeno T posee la actividad helicasa necesaria para extender el desenrolla mi en to. de modo que no se requiere un equivalente de la proteína DnaB.

liD

El primosoma es necesario para reiniciar la replicación

Conceptos principales • La iniciación de la replicación de q>X requiere que el complejo del primosoma desplace a la SSB del origen. • Una horquilla de replicación se detiene cuando llega al DNA dañado. • Después que el daño ha sido reparado, el primosoma es indispensable para reiniciar la replicación. • La proteína Tus se une a los sitios ter y detiene el desenrollamiento del DNA mediado por DnaB, lo cual ocasiona que la replicación termine.

En trabajos anteriores sobre la replicación se hizo amplio uso del fago Xl74 no constituye por sí mismo un sustrato para el mecanismo de rep licación porque el DNA desnudo no proporciona un molde apropiado. No obstante, una vez queJa forma de cadena individual ha sido cubierta con la SSB, la rep)jcación puede proseguir. Un primosoma se ensambla en un (mico sitio del DNA de cadena individual Lamado sitio de ensamblaje (primosome assembly site, pas). El pas es el equivalente de un o rigen para la síntesis de la cadena complementaria de 1 <¡>X l7 4. El primosoma está formado por seis proteínas: priA, PriB, PriC, DnaT, DnaB y DnaC. El suceso clave en la localización del primosoma es la habilidad de PriA de desplazar a la proteína SSB del DNA de cadena de individual. El primosoma se forma en un inicio en el pas sobre el DNA del X. La (unción de PriA consiste en carga r la protcí.na DnaB para formar una horquilla de replicación. Skmpre ha sido desconcertante que los orígenes de <¡>X deban usar una estructura compleja que no es necesaria para replicar el cromosoma bacteriano ¿Por qué la bacteria proporciona este complejo? La respuesta se encuentra en el destino de las horquillas de replicación varadas. La compara una horquilla de replicadón que avanza

•a,J7

El primosoma es necesario para reiniciar la replicación

451

La horquilla de replicación avanza en el DNA normal

La replicación se interrumpe por una base dañada o por una hendidura en el DNA.

con lo que sucede cuando existe un daño en una base en el DNA o una hendidura en una de las cadenas. En ambos casos la sínresis de DNA se detien e y la horquilla de replicación queda varada o se deteriora. No está claro si los componentes de la horquilla permanecen asociados al DNA o se desensamblan. Que una horquilla de replicación quede varada parece ser bastante común; las estimaciones de la fxecuencia de este suceso en E. coli sugieren que de 18 a 50% de las bacterias confrontan un problema durante un ciclo de replicación. La sil u ación se resuelve con un episodio de recombinación que escinde y remplaza el daño o proporciona un dtlplex nuevo para sustituir la región que contiene la rotura en la doble cadena (véase la Figura 20.20 en la sección 20.8, Sistemas de reparación por recombinación en E. coli) . El principio del episodio de reparación es aprovechar la redundancia de información incorporada entre las dos cadenas de DNA. La muestra los episodios fundamentales de dichos sucesos de reparación. En términos básicos, la información del DNA dúplex h ijo no dañado se utiliza para reparar la secuencia dañada. Esto crea una unión de recombinación típica que resuelven !os mismos sistemas que llevan a cabo la rccombinación homóloga . De hecho, algunos opinan que la importancia ptincipal de estos sistemas para la célula radica en la reparación del DNA dañado en las horquillas de replicación varadas. 452

CAPÍTULO 18 Replicación del DNA

Cuando la replicación se detiene en el DNA dañado, la secuencia afectada es escindida y la cadena complementaria (recién sintetizada) del otro dúplex hijo se entrecruza para reparar la abertura. Ahora puede reanudarse la replicación y llenarse los espacios.

Después que el daño ha sido reparado, la horquilla de replicación debe ser reiniciada . La muestra que esto puede lograrse mediante el ensamblaje del primosoma, que en efecto recarga el DnaB para que la acción de helicasa pueda conti nuar. La reactivación de la horquilla de rep licación es una reacción frecuente (y, por lo tanto, imponantc). Es posible que se requiera en la mayor parte de los ciclos de replicación cromosómica. Es inhibida por las mutaciones en cualquiera de los sistemas de recuperación que remplazan el DNA dañado o en los componentes del primosoma. Las horquillas de replicadón deben parar y desensamblarst! en la terminación de la replicación. ¿Cómo se logra esto? Las secuencias que detienen el movimiento de las horquillas de replicación se han identificado como elementos ter del cromosoma de E. coli (véase la ) o secuencias equivalentes e n algunos plásmidos. La característica común de estos elementos es una secuencia de consenso de 23 bp que constituye el sirio de unión para el producto del

Las horquillas se encuentran AATTAGr...¡ TTAArc..¡7: 'o)).. "~c-1 G;.

J

"~e -1'"1.

'9~0_.,.

El mecanismo de replicación es desactivado

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N~,. y

El dai'lo es reparado y el primosoma se une

r '1 ' La replicación se reanuda

l.. ~Tfi ~. 1 L 1lt r El primosoma es necesaño para reiniciar una horquilla de replicación varada después de que el DNA ha sido reparado.

gen tus, una proteína de 36 kD que es indispensable para la terminación. Tus se une a la secuencia de consenso, en donde ejerce una actividad de contra-helicasa e inhibe el desenrollamiento del DNA mediado por DnaB. la cadena líder continúa sintetizándose justo hasta el elemento ter, en tanto que la cadena retrasada más cercana es iniciada de 50 a 100 bp anres de alcanzar al elemento ter. El resultado de esta inhibición es detener el movimiento de la horquilla de replicación y (al parecer) causar un dcsensamblaje del mecanismo de permite recordar que replicación. La Tus detiene el movimiento de la h orqu illa de replicación sólo en una dirección. La estructu ra cristalina de un complejo Tus-ter muestra que la proteína Tus se une al DNA en forma asimétrica; las hélices a de la proteína sobresalen alrededor de la doble hélice en el extremo que bloquea a la horquilla de terminación. Al parecer, una horquilla que avanza en la direcdón contraria puede desplazar a Tus y de esta manera continuar. Una dificultad para entender el funcionamiento del sistema in vivo es que parece ser prescindible, debido a que las mutadones en los sitios ter o en tus no son lera les.

E

Resumen

La síntesis de DNA ocurre por replicación semidiscontinua, en la cual la cadena líder del DNA que

Horquilla de replicación 2

Origen

Horquilla de replicación 1

los extremos de la replicación en E. co/i se localizan más allá del sitio donde las horquillas de replicación se encuentran.

DNA accesible

DNA bloqueado

La replicación

La replicación termina

prosigue

X• DnaB

'..A

Tus se une a ter en forma asimétrica y bloquea la replicación sólo en una dirección. crece en dirección S'-3 ' se extiende en forma continua; en contraste, la cadena retrasada que crece por lo general en la dLrccción contraria, 3'-5', es creada con fragmentos corros de Okazaki, cada uno sintetizado en dirección 5'-3'. La cadena líder y cada fragmento de Okazaki de la cadena retrasada inician con un cebador de RNA que es extendido por la polimerasa de DNA. Las bacterias y las eucariotas poseen más de una actividad de polimerasa de DNA. La polimerasa de DNA lll sintetiza tanto la cadena líder como la cadena retrasada en E. coli. Se requieren muchas proteínas para la acción de la polimerasa de DNA lii y varias constituyen parte del replisoma dentro del cual funciona. El replisoma contiene un dímero asimétrico de polimerasa de DNA lll; cada cadena nueva de DNA es sintetizada por un complejo nuclear dHereme que contiene una subunidad catalítica (a).la procesividad del complejo nuclear se conserva por la pinza p, la cual forma un anillo alrededor del DNA. El DNA 18.18 Resumen

453

es cargado con la pinza por el complejo cargador de pinza. Los pares cargador de pinza/pinza con características e!.tructurales similares se observan de manera generalizada en los sistemas de replicación de las procariotas y de las eucariotas. El modelo de formación de lazos para la horquilla de replicación propone que, conforme una mitad del dímero avanza para sintetizar la cadena Hder, la otra mitad del dímero jala el DNA como un solo lazo que proporciona el molde para la cadena retrasada. La transición entre la culminación de un fragmento de Okazaki y el inicio del siguiente requiere que la subunidad catalítica de la cadena retrasada se disocie del DNA y después se una de nuevo a una pim.a ~en el sitio de cebamiemo para e l siguiente fragmenro de Okazaki. Dna 13 proporciona la actividad de helicasa en la horquilla de replicación; esto depende de la división de ATP. Dnal3 puede funcionar por sí sola en los replicones oriC y proporcionar la actividad de primosoma al interactuar en forma periódica con DnaG, que proporciona la primasa que sintet iza el RNA. El fago T4 codifica un mecartismo de replicación formado por siete proteínas: polimerasa de DNA, helicasa, proteína de unión a la cadena individual. elementos con aCtividades cebadoras y proteínas accesorias. En otros sistemas de replicación se necesitan funciones si.milares, incluido el sistema de células Hela que replica el DNA de SV40. Enzimas diferentes (poümerasa de DNA a y polirnerasa de DNA Ó) inician y alargan las cadenas nuevas de DNA. La actividad cebadora q>X también requiere DnaB, DnaC y DnaT. PriA es el componente que define el sirio de ensamble del prim osoma (pas) para los replicones q>X; desplaza a SSB del DNA en una acción que comprende la rotura de ATP. PriB y PriC son otros componentes del prirnosoma. La importancia del primoso.ma pa ra la célula bacteriana es que se utiliza para reiniciar la replicación en las horquillas que quedan varadas cuando encuentran DNA dañado. El modo común de activación del origen impUca una desnaturalización inicial limitada de la doble hélice, seguida por un dcscnrollamienro más general para crear las cadenas individuales. Varias proteínas actúan de [orma secuencial en el origen de E. co/i. la replicación se inicia en oriC en E. coli cuando DnaA se une a una serie de repeticiones de 9 bp. Esto es seguido por la unión a una serie de repeticiones de l3 bp, en donde utiliza la hidrólisis del ATP para generar la energía necesaria para separar las cadenas del DNA. El complejo de precebamienw de DnaC-DnaB desplaza a DnaA. DnaC es liberada en una reacción que depende de la hidrólisis de ATP; DnaB es unida por la enzima replicasa, y la replicación es iniciada por dos horquillas que corren 454

CAPÍ TULO 18 Replicación del DNA

en direcciones contrarias. Sucesos similares tienen lugar en el origen de A., donde las proteínas fágicas O y P son las comrapanes de las proteínas bacterianas DnaA y DnaC, respectivamente. En la repUcadón de SV40, muchas de estas acüvidades se combinan en las funciones del amígeno T. La disponibilidad de DnaA en el origen es un componente importante del sistema que determina cuándo deben iniciar los ciclos de replicación. Después de la iniciación de la replicación, DnaA hidroliza su ATP bajo los estímulos de la pinza deslizante p, lo que genera una forma inactiva de la p roteína. Además, oriC debe competir con el sitio dat por la unión de DnaA. En el origen de B. coli hay numerosos sitios que son metilados por la merUasa Dam, como los sitios de unión de 13 bp para DnaA. El origen permanece hem imetilado y se en cu entra en u n estado secuestrado durante -1 O m in después de la iniciación de un ciclo de replicación. Durante este periodo está asociado a la membr ana y la reiniciación de la replicación es reprimida. la proteína SeqA interviene en el secuesuo y puede interacruar con DnaA.

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lllll

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IIIJ

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UD

IIIJ

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EIID

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lE

Polimerasas de ONA eucarióticas independientes realizan la iniciación y la elongación

Los fragmentos de Okazaki están unidos por la ligasa

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Recombinación homóloga y especifica de sitio ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción Ocurre recombinación homóloga entre cromosomas en sinapsís • Los cromosomas deben entrar en sinapsis (aparearse) para que se formen tos quiasmas, donde ti ene lugar el entrecruzamiento. • Se pueden correlacionar las etapas de la meiosis con los sucesos moleculares que ocurren en el DNA.

• Si se bloquea la recombinación, el complejo sinaptonémico no puede formarse.

IW El apareamiento y la fo rmación del complejo sinaptonémico son independientes • Pueden ocurrir mutaciones durante el apareamiento cromosómico o la formación del complejo sinaptonémico sin afectar el otro proceso.

Ulil Las secuencias chi estimulan el sistema RecBCD

Rotura y reunión afectan el DNA heterodúplex

bacteriano

• El suceso clave de la recombinadón entre dos moléculas de DNA dúplex es el intercambio de cadenas únicas. • Cuando una sola cadena de una estructura dúplex desplaza a su contraparte en la otra. crea una estructura ramificada. • El intercambio genera una cadena de DNA heterodúplex constituida por una cadena de cada progenitor. • Se necesitan dos intercambios (redprocos) para generar una molécula articulada. • la molécula articulada se resuelve en dos moléculas dúplex independientes mediante una hendidura en dos de las cadenas que se conectan. • El que se formen recombinantes depende de que las cadenas participantes en el intercambio original, o el otro par, presenten muescas durante la resolución.

• El complejo RecBCD tiene actividades de nucleasa y helicasa. Se une al DNA en sentido descendente respecto de una secuencia chr, desenrolla la cadena dúplex y degrada una cadena de 3' a 5' conforme se desplaza hacia el sitio chi. • El sitio chi desencadena la pérdida de la subunidad RecD y la actividad de nucleasa.

Las roturas de la doble cadena inician La recombinación • La recombinación se inicia con una rotura de la doble cadena en una cadena de DNA dúplex (receptora) . • La actividad de la exonucleasa genera extremos 3' de cadena única c¡ue invaden la otra cadena dúplex (donadora). • La slntesis nueva de DNA sustituye el material que ha sido degradado. Esto genera una molécula de articulación recombinante donde las dos cadenas de DNA dúplex están conectadas por DNA heterodúplex.

Los cromosomas en recombinación se conectan por el complejo sinaptonémico Durante la primera parte de la meiosis, los cromosomas homólogos se aparean en el complejo sinaptonémico. • La masa de cromatina de cada cromosoma homólogo está separada de la otra por un complejo proteináceo.

El complejo sinaptonémico se forma después de roturas de la doble cadena

mi Las proteínas de transferencia de cadenas catalizan la asimilación de una sola cadena • la RecA forma filamentos con el ONA de una o dos cadenas y cataliza la capacidad de un DNA de una sota cadena con un extremo libre 3' de desplazar a su contraparte en una estructura dúplex de DNA.

DJijJ

El sistema Ruv resuelve las uniones Holliday • El complejo Ruv actúa sobre uniones recombinantes. • l a RuvA reconoce la estructura de la unión y la RuvB es una helicasa que catal!za la migración de ramas. • La RuvC escinde uniones para generar productos intermedios de recombinación.

iml La conversión génica contribuye a la recombinación interalélica • El DNA heterodúplex creado por recombinación puede tener secuencias con apareamiento erróneo, donde los aletos recombinantes no son idénticos. • Los sistemas de reparación pueden retirar aparea mientos erróneos si cambia una de las cadenas, de modo que su secuencia sea complementaria a la otra.

mJ6 El superenrollamiento afecta la estructura del DNA • Ocurre superenro
• Las roturas de la doble cadena que inician la recombinación ocurren antes de que se forme el complejo sinaptonémico. Continúo en la siguiente página

457

• Cualquier molécula de ONA cerrada tiene un número de enlace que corresponde a la suma del número de contorsiones y del número de torcimientos. • Los plegamientos se pueden repartir entre el número de contorsiones y el nCímero de torcimientos, de manera que un cambio en la estructura de la doble hélice puede compensar una modificación de su enrollamiento en el espacio. • El número de enlace puede modificarse sólo con la rotura y la formación de enlaces en el ONA.

ll!lm las levaduras pueden cambiar loci silentes y activos por el tipo de apareamiento • Ellocus MAT del tipo de apareamiento en levaduras porta el genotipo MATa o MATa. • Las levaduras con el alelo dominante HO cambian su tipo de apareamiento con una frecuencia de -10·•. • El alelo en MAT se denomina cartucho activo. • Hay también dos cartuchos silentes, HMLa y HMRa. • Ocurre cambio si MATa es sustituido por HMLa o MATo es sustituido por HMRa.

IDO Las topoisomerasas relajan o introducen

El locus MAT codifica proteínas reguladoras

superhélices en el DNA

• En células haploides de tipo a., MATa. activa los genes requeridos para especificar las funciones o. indispensables para el apareamiento y desactiva los requeridos para el tipo de apareamiento a. • E.n las células de tipo a no se requiere MATa. • En células diploides, los productos de al y a2 cooperan para reprimir genes específicos de células haploides.

• Las topoisomerasas cambian el número de enlace cuando rompen enlaces en el ONA, modifican la conformación de la doble 11élíce en el espacio y vuelven a formar los enlaces. Las enzimas de tipo 1 actúan al romper una cadena Onica de DNA; las de tipo 1I causan roturas de dos cadenas.

IDD

Las topoisomerasas rompen y resellan cadenas • Las topoisomerasas de tipo 1 actúan al formar un

IIi:Jfa Se reprimen los cartuchos silentes en HML y HMR

enlace covalente con uno de los extremos rotos. mover una cadena alrededor de la otra y, después, transferir el extremo de enlace al otro extremo roto. Los enlaces se conservan y, en consecuencia. no se requiere aporte de energla.

• Los elementos silenciadores reprimen HML y HMR • Los loci requeridos para mantener el silenciamiento incluyen SIRJ-4, RAP1 y los genes de la histona H4. • Se necesita la unión de ORC (complejo de reconocimiento del origen} a los silenciadores para lz desactivación.

La girasa funciona por la inversión de hélice • La girasa de E. coli es una topoisomerasa de ripo H que utiliza la hidrólisis oe ATP para proveer la energía necesaria a fin de introducir superhélices negativas en el ONA.

~

• El cambio del tipo de apareamiento se inicia por una rotura de la doble cadena hecha en ellocus MAT por .; endonucleasa HO.

lliiiTt La recombinación especializada involucra sitios específicos • La recombir'lación especializada comprende una reacción entre sitios específicos que no tienen que ser homólogos. • El fago A se integra al cromosoma bacteriano por recombinación entre un sitio del fago y el sitio ott en el cromosoma de E. coli. • El fago se escinde del cromosoma por recombi nación entre los sitios en el extremo del profago lineal. • El gen int del fago ''codifica una integrasa que cataliza la reacción de integración.

La recombinación específica de sitio comprende rotura y reunión

11i11iJ

• Se hacen escisiones a intervalos de 7 bp en los genes ottB y attP y los extremos se unen en forma cruzada. La recombinacíón específica de sitio simula la

activídad de la topoisomerasa • las integrasas tienen relación con las topoisomerasas y la reacción de recombinación se parece a la acción de la topoisomerasa, excepto que las cadenas con hendidura de estructuras dúplex diferentes se sellan juntas. • La reacción conserva la energía al utilizar una tirosina catalltica en la enzima para romper un enlace fosfodiéster y enlazarse con el extremo 3' roto. • Dos unidades enzimtiticas se unen a cada sitio de recombinación y los dos dímeros hacen sinapsis para formar un complejo donde ocurren las reacciones de transferencia.

lml

La recombinación A. ocurre en un intasoma • La integración A tiene lugar en un gran complejo oue también incluye a la oroteína IHF del hospedador. • La reacción de escisión requiere Int y Xis y reconoce los extremos de ONA del profago como sustratos.

458

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y específica de sitio

El tocus MAT receptor inicia la transposición unidireccional

IIm La regulación de la expresión de HO controla el cambio • La endonucleasa HO se sintetiza en células madre haploides, de manera que un episodio de cambio haCE que ambas cadenas hijas tengan el nuevo tipo de apareamiento.

lml

Resumen

Introducci ón ...z evolución no podría haber ocurrido sin recom~nación genética. Si no fuese posible intercambiar .'laterial emre los cromosomas (homólogos), el conen.ido de cada cromosoma individual estaría fijo e manera irrecuperable en sus alelos paniculares. ::.~ando se presentasen mutaciones no sería posible ~parar los cambios favorables y desfavorables. La "~ngitud de la diana para el daño por mutadón au'"!entaría de manera eficaz desde el gen hasta el cro"'10soma. Al final, un cromosoma acumularía tantas -:1utaciones deletéreas que dejaría de funcionar. Por la mezcla de los genes, la recombinación ermlte separar mutaciones favorables y desfavo·¡¡blcs y probarlas como un idades individuales en ~ ue vos ensamblajes. Constituye un medio de es:ape y dispersión de alelas favorables y pretende eliminar un ale lo desfavorable sin afectar a todos os demás genes con los que está vinculado. Ésta es .a base de la selección natural. La Iecombinación tiene lugar entre secuencias ::-n correspondencia precisa, de manera que no se ~grega o pierde un par de bases de los cromosomas *ecombinantes. Tres Lipos de recombinación com_rtarten la característica de que el proceso comprende .aitercamuio físico de material entre DNA dúplex: • La recombinación que comprende una reacción entre secuencias homólogas de DNA se denomina recom binadón h omóloga o generalizada. En las eucariotas se presenta en la meiosis, por lo general tanto en machos (durante la espermatogénesis) como en hembras (durante la oogénesis). Hay que recordar que su cede en la eLapa de "cuatro cadenas" de la meiosis y afecta sólo a dos de las cuatro (véase sección 2.7, Ocurre recombinación por intercambio físico de DNA). • Otro tipo de suceso apoya la recombinación entre pares especílicos de secuencias, descrito por primera vez entre eucariotas donde la recombinación esp ecializada , también conocida como recombina ción específjca de ciclo, se enea rga de la integración de genomas de fago al cromosoma bacteriano. El episodio de recombinación comprende secuendas específicas del DNA del fago y el bacteriano, que incluyen un segmento corto con homología. Las enzimas participantes en el suceso actúan sólo en el par de secuencias diana panicular en una reacción intermolecular. Algunas reacciones intramoleculares relacionadas se encargan de regenerar dos cromosomas circulares monoméricos durante la división bacteriana, cuando se generó

un dímero por recombi.nación generalizada. Esta última clase también incluye episodios de recombinación que invierten regiones específicas del cromoso ma bacteriano. • Un tipo diferente de suceso permite insenar una secuencia del DNA en otra sin depender de la homología de secuencia. La t ransposició n constituye un mectio por el que cienos elementos pasan de una locaüzación cromosómica a otra. Los mecanismos involucrados en la transposición dependen de la rotura y reunión de cadenas de DNA y, por ranto, se relacionan con el proceso de recombinación (véase el Capítulo 2 L Transposones, y Capítulo 22, Retro virus y retroposones). • En circunstancias especia les, se utiliza la reestructuración génica para controlar la expresión, que puede crear nuevos genes ind ispensables para la expresión en circunstancias paniculares, como en el caso de las in munoglobu linas. La reestructuración puede también encargarse de cambiar la expresión de un gen preexistente en otro, como en el ejemplo del tipo de apareamien to de las levaduras, donde la secuencia en un locus activo puede ser sustituida por una secuencia de un locus silente. Ambos tipos de recsrrucmración comparten similitudes mecánicas con la transposición; de hecho, se pueden considerar como casos de transposición dirigidos de manera espedal. • Los virus RNA utilizan otro tipo de recombinación, donde la polimerasa cambia de un molde a otro mientras sintetiza RNA. Como resultado, la molécula recién sintetizada conjunta información de secuencias de dos progenitores diferentes. Ese tipo de mecanismo de recombioadón se llama selección d e copias y se aborda de manera sucinta en la sección 22.4, El DNA vírico es generado por transcripción inversa. Considérense la naturaleza y las consecuencias de las reacciones de recombinación generalizada y especializada. En la se ilustra que la recombinación generalizada rieoe lugar entre dos cadenas dúplex de DNA homólogas y puede presentarse en cualquier punto de su longitud. Los dos cromosomas se cortan en sitios equivalentes y, después, cada uno se une al otro para generar recombinantes recíprocos. El entrecruzamiento (marcado por la X) es el sitio donde una cadena se une a la otra. No cambia la organización global del DNA; los productos tienen la misma estr uctura que sus predecesores y tanto progenilores como productos son homólogos. 19.1 fntroducción

459

Lugar1

1 \

oo Se puede usar la recombi nación especifica : sitio para generar dos círculos monoméricos a partir de _círculo dimérico.

Lugar 3 ==:::::::::-----#~~

·! Puede ocurrir recombinación generalizada en cualquier punto de las longitudes de dos DNA homólogos.

X

La recombinación especializada ocurre sólo e- tre silios específicos. Los resultados dependen de :.; localizaciones de los dos sitios de recombinación. ~ la se muestra que una recombinacil intermolecular entre un DNA circular y uno line2 inserta al primero en el segundo. En la se muestra que una recombinación intramolecu.¡¡: entre dos sitios de un DNA circular libera dos D~ circulares, más pequeños. La recombinación especializada se usa a menudo para hacer cambios corr éstos en la organización del DNA. El cambio en :.: organización es una consecuencia de las localizacil) nes de los sitios recombinantes. Se cuenta con ur.gran cantidad de infom1ación acerca de las enzim.: que realizan la recombinación especializada y tien.. relación con las topoisomerasas, que cambian el superenrollamiemo del DNA en el espacio.

DB

Ocurre recombinación homóloga entre cromosomas . . en s1 naps1s

Conceptos principales • Los cromosomas deben entrar en sinapsis (aparearse) para formar quiasmas, donde tiene lugar el entrecruzamiento. • Se pueden correlacionar las etapas de la meiosis con los sucesos moleculares que ocurren en el DNA.

Ocurre recombinación específica de sitio entre dos secuencias específicas (identificadas en color verde). Las otras secuencias en los dos DNA recombinantes no son homólogas. 460

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y específi ca de sitio

La recombinación homóloga es una reacción entre dos cadenas dúplex de DNA. Su característica deter· mínante es que las enzimas encargadas pueden usa: cua lquier par de secuencias homólogas como sus-

-aw (aunque algunos tipos de secuencia tal vez se ean favorecidos con respecto a otros). La frecuen__a de recombinación no es constante en todo el :cnoma, pero influyen en ella los efectos globales y ·aJes. la frecuencia global puede ser diferente en ocitos y espermawzoidcs; la recombinación ocurre :on el doble de frecuencia en mujeres y varones. : emro del genoma, su frecuencia depende de la _.;rructura cromosómica; por ejemplo. el entrecru ..:miento se suprime en la vecindad de las regiones Jndensada e inactiva de la heterocromatina . Ocurre recombinación durante la prolongada -:ofase de la meiosis. En la se compara .. progreso visible de Jos cromosomas por las cinco ::apas de la profase meiótica con las interacdones ..,olecu lares comprendidas en el intercambio de 1aterial entre cadenas dúplex de DNA. El inicio de la meiosis lo marca el sitio donde los .::omosomas ind ividuales se vuelven visibles. Cada .mo de estos cromosomas se replicó antes y consta e dos cromátidas hermanas, cada una con una ca:ena dúplex de DNA. Los cromosomas homólogos e acercan entre sí, empiezan a aparearse en una o -;,ás regiones y forman bivalentes. El apareamien- ~ se extiende basta que toda la longitud de cada ~omosoma está en aposición con su homólogo. El _roceso se denomina sinapsi s o apareamiento :romosómico . Cuando concluye el proceso, Jos :-omosomas tienen relación lateral en forma de un : omplejo sinaptonémico. el cual tiene una es :ructura característica en cada especie, si bien varían ::~ ucho los detalles entre las especies. La recombinación entre cromosomas comprcn:e un intercambio físico de las partes, por lo general :-epresenrado corno rotura y re unión, donde dos :::-omátidas no hermanas (cada una con una cadena -Úplex de DNA) han sido rotas y después unidas =ntre sí. Cuando los cromosomas empiezan a sepa·arse, se pu ede observar que se mantienen unidos .n sitios bien definidos llamados quiasmas. El nú-::-tero y la distribución de los quiasmas simulan las :lracterísticas del entrecruzamiento genético. En el .:.nálisis usual se afirma que un quiasma representa ). Los =-proceso de entrecruzamiento ( ~:.~iasmas se mantienen visibles cuando los cromo_'lmas se condensan y las cuatro cromátidas se ha:en evidentes. ¿Cuál es la base molecular de estos sucesos? ::.ada cromálida hermana contiene una sola cadena :e DNA dúplex, de modo que cada bivalente cons...; de cuatro moléculas dúplex de DNA. La recom:'!nactón requiere un mecanismo que permita a la cadena dúplex de DNA <.le una cromálida hermana meractuar con la correspondiente de su contrapar-~ en el otro cromosoma. Debe ser posible que esta

Interacciones moleculares

~

1

Los cromosomas condensados se tornan visibles, a menudo umdos a fa envollura nuclear

'VVV"-"f" Gada cromosoma \./\fv'\..1"\_rv se ha replicado y consta de dos \."VJ\h\.fiVA// cromátidas \./?VlVA/A/A// hermanas.

'-'· Los cromosomas lnietan el apareamiento en una o va r~as regtones limitadas

r ·a~

u .o

El complejo sinaptonémlco se extiende por toda fa longitud de los cromosomas apareados ~pi "

Los cromosomas se separan, pero permanecen juntos en los quiasmas

V'V.V'I..'VV

vv:'v

1

"'ro

t.ao.o,· .•

\.IV Se intercambian

VA/J\J/ llV1V/

cadenas únicas

..., v\.'V.VV -'Sirlt.aci., '-r'-~:t ·"-"-/\/ Se E!Xtiende fa reg•on de cadenas ~I/ intercambiadas

- -¡; - - -

vN

V A/A/JVA/A//

Los cromosomas se condensan, se desprenden de fa envoltura; los quiasmas persisten. Las cuatro cromattdas se tornan vtsibles

·...r-..r'-r"-'V'\.!

.WI.Iaill

....,...._,...._'\.r\/\..1'

\.Cv"-'''lTVA/1 'VlVNJvA.IJVJ

La recombinación tiene lugar durante la primera profase de la meiosis. Las etapas de la profase se definen por el aspecto de los cromosomas, cada uno constituido por dos réplicas (cromátidas hermanas), si bien el estado duplicado se hace visible sólo al final. Las interacciones moleculares en cualquier episodio de entrecruzamiento individual comprenden dos de los cuatro DNA dúplex.

reacción ocurra entre cualquier par de secuencias correspondientes de las dos moléculas en una forma muy específica. que permlta el intercambio de material con precisión en el ámbito de pares de bases individuales. Se sabe de sólo un mecanismo para que los ácidos nucleicos se reconozcan entre sí con base en la secuencia: la complememariedad entre cadenas únicas. la Figura 19.5 muestra un modelo general de la participación de cadenas únicas en la recombinación. El primer paso para la provisión de cadenas únicas es hacer una rotura en cada cadena dúplex del DNA. Una o ambas de ese par de cadenas pueden entonces liberarse. Si (al menos) una cadena desplaza a la correspondiente en el otro par, las dos molécu las dúplex se conectarán de manera específica en secuencias correspondientes. Si el ínter-

19. 2 Ocurren recombinaciones homólogas entre cromosomas en sinapsis

461

Rotura y reunión afectan el DNA heterodúplex Conceptos principales

Productos Intermedios de la fecombinación

Recombinantes

La recombinación im plica apareamiento entre cadenas complementarias de los dos DNA progenitores.

cambio de cadenas se extiende, puede haber una conexión más amplia entre las cadenas dúplex . Si se intercambian ambas cadenas y Juego se corran. es posible conectar las moléculas dúplex progenitoras mediante el entrecruzamiento que corresponda a las de¡11andas de una rotura y reunión. No se pueden correlacionar de manera r iguro sa estos sucesos moleculares en tal unión con los cambios que se observan en el ámbito de los cromo somas. No hay infonnadón detallada acerca de Jos sucesos moleculares involucrados en la recombinación en células eucariólicas superiores (en las que se ha observado más de cerca 1a meiosis). En fecha reciente, n o obstante, el atslamiemo de mutantes en las levaduras ha permitido correlacionar algunos de los pasos moleculares con etapas aproximadas de la meiosis. Se dispone de información detallada del proceso de recombinación en las bacterias, donde se sabe que las actividades moleculares pueden causar intercambio genético entre moléculas dúplex. Sin embargo, la reacción bacteriana comprende una interacdón entre las regiones restringidas del genoma, más que un apareamiento íntegro de los genomas. La sinapsis de los cromosomas eucarió ricos sigue siendo la etapa más difícil de explicar en el ámbito molecular. 462

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y específica de sitio

• El suceso clave de la recombínación entre dos moléculas de DNA dúplex es el intercambio de cadenas únicas. • Cuando una sola cadena de una estructura dúplex desplaza a su contraparte en la otra, crea una estructura ramificada. • El intercambio genera un segmento de DNA heterodúplex, constituida por una cadena de cacla progenitor. • Se necesitan dos intercambios (recíprocos) para generar una molécula articulada. • La molécula articulada se resuelve en dos moléculas dúplex independientes mediante una hendidura en dos de las cadenas que se conectan. • El que se formen recombinantes depende de que las cadenas participantes en el intercambio original, o el otro par, presenten hendiduras durante la resolución.

El acto de conectar dos moléculas dúp!ex de DN.es el meollo del proceso de recombinadón. El análisis molecular de la recombinación, por tanto, ~ inicia con la expansión del concepto del uso de apareamiento de bases entre caden as únicas complem entarias. Es conveniente imaginar la reacciór de recombinación en términos de intercambios de una sola cadena (aunque se verá que en la realidaC no tiene que ser así como se inicia), debido a que la~ propiedades de las moléculas creadas en esa forma son medulares para comprender Jos procesos involucrados e~1la recombinación. En la se ilustra un proceso que se inicia con la rotura de Jos puntos correspondiente~ de dos cadenas homólogas de DNA apareadas. La rotura permite el movimiento de los extremos libres creados por las hendiduras. Cada cadena deja a Sl contraparte y se cruza para aparearse con su complemento en la otra cadena d(Iplex. El intercambio recíproco crea una conexiór. entre las dos cadenas dúplex de DNA. El par de cadenas dúplex conectado se llama m olécula articulada . El sitio donde una cadena individual de DNA se cruza de una cadena dúplex a la otra se Uama articulación recombinante. En el sitio de recombinación, cada cadena dúplex tiene una región conslituida por una cadena de cada una de las m oléculas de DNA progenitoras. región que se denomina DNA híbrid o o DNA h e-

terodúplex. Una característica importante de una articulación recombinanre es su capacidad de desplazarse

los DNA dúplex se aparean

..&.O.I.....,.;.¡,¡,...._.LLLI....._..~

las cadenas homólogas son asiento de hendiduras Las cadenas rotas se intercambian entre las dúplex

Se sellan las hendiduras

11 l!

Se hacen segundas / hendiduras en la misma cadena

M I•11m m•rrmn Se sellan las hendiduras

1

'

1

1

Se hacen segundas hendiduras en la otra cadena

~~~

Los gcnomas no son rec:omiJ•nantes, poro cor tienen un.a reg ón holerodü;Jie¡¡

Se QAI'll!r~n oenomas recomb n.. nles rer:!proco~

La recombinación entre dos DNA dúplex aparea:l s podría comprender el intercambio recíproco de una sola :<:dena, migración de ramas y hendiduras.

'> r la cadena dúplex. Esta movilidad se denomina -:Ugración de rama. En la se ilustra la -:tigración de una cadena única en una dúplex. El unto de ramificación puede emigrar en cualquier _!rección a medida que una cadena desplaza a la ;:ra.

La migración de rama es importante por moteóricos y prácticos. A manera de principio, .onfiere una propiedad dinámica a las estructuras ·t:combinames. Como característica práctica, su :xistencia indica que no puede establecerse el punto _e ramificación con el examen de una molécula in :rro (porque la rama podría haber emigrado desde . Je se aisló la molécula). \'OS

Puede ocurrir migraci 6n de ramas en cualquier dirección cuando una cadena no apareada desplaza a una apareada.

La migración de rama podría permitir que el punto de entrecruzamiento en el intermedio de la recombinación se mueva en cualquier dirección. La velocidad de migración es incierta pero, como se observa in vitro, tal vez sea insuficiente para respaldar la formación de regiones extensas de DNA heterodúplex en condiciones naturales. Cualquier migración extensa de rama in vivo debe, por tanto, ser catalízada por una enzima de recombinación. I.a molécula articulada formada por el intercambio de cadenas debe resolverse en dos moléculas dúplex separadas. La resolución requiere un par de hendiduras más. Se puede visualizar el resultado con la mayor facilidad si se observa la molécula articulada en un plano como la unión Holliday, la se ilustra en la . y que representa la estructura de la Figura 19.6 con una cadena dúplex girada con relación a la otra. El resultado de la reacción depende de qué par de cadenas tiene la hendidura. Si se hacen Jas hendiduras en el par de cadenas que en un principio no las tenían (el par que no inició el intercambio de cadenas}, las cuatro cadenas originales habrán sido motivo de hendidura. Esto libera moléculas de DNA recombinantes con empalme. I.a cadena de DNA dúplex de un progenitor se enlaza de manera covalente a la del otro medianle un segmento de DNA heterodúplex. Ha habido un episodio de recombinación convencional entre marcadores localizados a cada lado de la región heterodllplcx . !~.

Rotura y reunión afectan el DNA heterodúplex

463

1 La relación muestra la + estructura de la unión Holllday

cia es bastante más larga que los -1 O bp requeridos para el vínculo entre regiones complementarias de cadena única, lo que sugiere que la recombinaciót! impone demandas que rebasan la hibridación de las complementarias como ta les.

Bll Las roturas de la doble cadena inician la recombinación Conceptos principales • La recombinación se inicia con una rotura de la doble cadena en una cadena de DNA dúplex (receptora).

~ las hendiduras en otras cadenas fíberan recombinantes de escisión

Las hendiduras conUolan los resultados Las hendiduras en las mismas cadenas liberan recombiriantes en parches

... "/... La resolución de una unión Holliday puede generar cadenas dúplex progenitoras o recombinantes, dependiendo de cuáles sean asiento de una hendidura. Ambos tipos de producto tienen una región de DNA heterodúplex.

Si las mismas dos cadenas involucradas en las hendiduras originales son objeto de hendiduras otra vez, las dos cadenas a
CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y específica de sitio

• La actividad de la exonucleasa genera extremos 3' de cadena única que invaden la otra cadena dúplex (donadora). • La síntesis nueva de DNA sustituye el material que ha sido degradado. Esto genera una molécula de articulación recombinante donde las dos cadenas de DNA dú plex están conectadas por DNA heterodúplex.

El modelo general de la Figura 19.4 muestra que se puede hacer una rotura en una cadena dúplex ii fin de generar un sitio a partir del cual se pueda r desenrollar cadenas únicas que participen en el intercambio génico. Ambas cadenas de una est!'ucmra dúplex deben romperse para lograr un intercambil génico. La Figura 19.6 muestra el modelo donde ocunen roturas sucesivas individuales en cadena~ únicas. El intercambio génico, sin embargo, se inida en realidad por una r otura de la doble cadena (dou.ble-strand break, DSB ). lJl modelo se ilustra er la La recombinación la inicia una endonuclease que escinde una de las cadenas dúplex del DNA progenitor, ''receptor". El corre crece hasta tornarse en una brecha por la acción de la exonucleasa La exonucleasa corta una cadena a cada lado de la rotura y genera extremos 3' de una sola cadena. Uno de los extremos 3' libres invade entonces une: región homóloga en la otra cadena dúplex de DN.-. ("donador"), lo que se denomina invasión por unz cadena única, La formación de DN A heterodúple,;;,; genera una hélice D, donde se desplaza una cadene. dúplex del DNA donador. El hélice D se extiende por la síntesis del DNA de reparación, utilizando e extremo 3' libre como molde para generar DNA de doble cadena. En un momento dado, el hélice D alcanza e. tamaño suficiente para corresponder a la longin:c total de la bred1a en la cromátida recepto ¡;a. Cuand.., la cadena única expulsada alcanza el lado distal:te de la brecha, las secuencias complementarias d~:. una sola cadena se hibridan. Ahora hay un D.t\'.,...

heterodúplex a cada lado de la brecha y ésta está representada por el hélice D de una sola cadena. La inregridad dúplex de la región con brecha se puede restablecer con la síntesis de reparación utilizando el extremo 3' en el lado izquierdo de la brecha como cebador. En formal global, la brecha ha sido reparada por dos rondas individuales de síntesis de cadenas únicas de DNA. La migración de ramas convierte esta estructUra en una molécula con dos articulaciones recombinantes que deben resolverse por corte. Si ambas aniculaciones se resuelven en la mis!Tla forma, se liberarán las moléculas originales sin entrecruzamientos, cada una con una región de

:nformación genética alterada que es vestigio del episodio de intercambio. Si las dos articulaciones se resuelven en formas contrarias tiene lugar un entrecruzamien Lo géníco. La estructura de la molécula con dos articulaciones antes de su re5oludón ilustra una diferencia determinante cnL re e1 modelo de rotura de doble cadena y aqueUos que comprenden sólo intercambios de una cadena. • Después de la rotura de la doble cadena se ha formado DNA heterodúplex en cada extremo de la región que interviene en el intercambio. Ent re los dos segmentos heterodúplex se encuentra la región correspondiente a la brecha que ahora tiene la secuencia del DNA donador en ambas moléculas (Figura 19.9). Así, la estructura de las secuencias heterodúplex es asimétrica y parte de una molécula se ha convenido a la secuencia de la otra (motivo por el que la cromátida de inicio se llama receptora). • Después del intercambio recíproco de una sola cadena, cada DNA dúplex tiene material hctcrodúplcx que cubre la región desde su sitio inicial de imercambio hasta la rama emigrante (Figura 19.6). En variantes del modelo de intercambio de una sola cadena, donde el DNA se degrada y resimeriza, la cromátida de inicio es la donadora de informadón genética. El modelo de rorura de doble cadena no djsminuye la importancia de la formación del DNA heterodúplex, que sigue siendo el único método posible por el que dos moléculas dúplex pueden interactuar. ~o obstante, cambiar la responsabilidad de iniciar la recombinadón de roturas de cadena única a las de cadena doble influye en la manera de percibir la capaddad de la célula de actuar sobre el DNA. La participación de las roturas de doble cadena al principio parece sorprendente. Una vez. que se ha hecho tma rotura a uavés de una molécula del DNA no hay retorno. Compárense los sucesos de

Rotura de doble cadena hecha en el receplor

La rotura crece hasta formar una brecha con extremos 3' El extremo 3' migra a otra cadena dúplex

La sfntesis desde el extremo 3' desplaza a una cadena en la brecha La cadena desplazada

migra a otra cadena dúplex Ocurre slntesls de DNA desde otro extremo 3'

lllllllltroc ¡ni!!

La brecha es suslltulda por la secuencia donadora La migración reciproca genera un doble entrecruzamiento

f'

La recombinaci6n se inicia con la rotura de una doble cadena, seguida de la formación de extremos 3' de una sola cadena, uno de los cuales emigra a una cadena dúplex homóloga.

las Figuras 19.6 y 19.9. En ningún punto conlleva pérdida de información el modelo de intercambio de una sola cadena. No obstame, en el modelo de rotura de doble cadena, la escisión inicial es seguida de inmediato por pérdida de la información. Cualquier error en la recuperación de la información podría ser letal. Por otro lado, la capacidad misma de recuperar la información perdida por resíntesis a partir de otra cadena dúplex constituye una red imponanre de seguridad para la célula.

Los cromoso mas en reco mbi nación se conectan por el complejo sinaptonémico Conceptos príucip,lles • Durante la primera parte de la meiosis, los cromosomas homólogos se aparean en el complejo sinaptonémico. • La masa de cromatina de cada cromosoma homólogo está separada de la otra por un complejo proteináceo.

Una paradoja básica en la recombinadón es que los cromosomas progenitores nunca parecen tener uo conracto bastante c:crcano para que ocurra la re combinación del DNA. Los cromosomas entran a la meiosis en forma de pares replicados (cromátidas

t9.5 Los cromosomas en recombinación se conectan por el complejo sinaptonémico

465

El complejo sinaptonémico ubica a los cromosomas en yuxtaposición. Reproducida de D. von Wetrstein. 1971. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 68: 851-855. Fotografía por cortesía de D. von

Wettstein, Washington State University.

Hélice de DNA dúplex más proternas'\

d~

Eje ___. cohes1nas

Las proternas zip conectan pares ___.. homólogos

O\JOO(}P000QOO

}

Cromátidas hl'!rmanas

}

Cromálldas hermanas

Elemento lateral 1 Elemento central Elemento lateral

Cada par de cromátidas hermanas tiene un eje formado por cohesinas. Las hélices de la cromatina se proyectan desde el eje. El complejo sinaptonémico se forma con el enlace de los ejes a través de protelnas zip.

hermanas), visibles como masa de cromatina. Se aparean para formar el complejo sjnaptonémico y se ha supuesto durante muchos años que ello representa alguna etapa involucrada en la recombinación, tal vez un preámbulo necesario para el intercambio de D~A. El punro de visra más redeme es que el complejo sinaptonémico es una consecuenda más que una causa de la recombinación, pero aún se tiene que definir cómo la estructura del complejo sinaptonémico se relaciona con los comanos entre moléculas de DNA. La sinapsis se inida cuando cada cromosoma {par de cron"'átidas hermanas) se condensa alrededor de una esLructura llamada elemento axial, 466

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y específica de sítío

que al parecer es proreináceo. A continuación. se ali nean los elememos axiales de cromosomas correspondiemes y se forma el complejo sinaptonémico como estructura tripartita, donde los elementos axiales. ahora llamados elementos laterales, estár separados entre sí por un e lem ento central. En la se muestra un ejemplo. En esta etapa cada cromosoma parece una masa de cromatina unida limiLada por un elemento la teral. Los dos ele1nemos laterales están sepa rado~ entre sí por un elemento central fino, pero denso El triplere de cadenas densas paralelas yace en un solo plano que se encorva y gira sobre su eje. La distancia entre los cromosom as homólogos es considerable en términos moleculares, de más de 20r nm (el diámetro del DNA es de 2 nm). Así, ur problema importante para comprender la participa ción del complejo es que si bien a linea cromos oma ~ homólogos, está bastante lejos de poner en contact~ moléculas homólogas de DNA . El único vínculo visible entre los dos lados de· complejo sinapLOnérnico lo constituyen estructuras esféricas o cilíndricas que se obsel'Van en hongo· e insecros. Yacen a través del complejo y se denominan nodos o nódulos de recombinación; se preseman con la misma frecuencia y distribuci6que los quiasmas. Su nombre refleja la esperanza de que pudiesen demostrar que son los sitios de ~~ recombinación. A partir de muraciones que afecran la formadón del complejo sinaptonémico se pueden rela cionar los tipos de proteínas que participan en s._ esuuctura. En la se ilusLra u na vist¡, molecular del complejo sinaptonémico. Sus caracLerísticas es rrucruralcs distintivas se deben a do~ grupos de proteínas: • Las cohesi nas forman un solo eje lineal para cada par de cromálidas hermanas desde: donde se extienden hélices de cromatin.: EsLO eq u ivale al elcmenlo lateral de la Figura 19.1O. (Las cohesinas pertenecen a ur grupo general de proteínas que interviener: en la conexión de cromátidas hermanas, dt:' modo que se segreguen en forma apropiad.: en la mitosis de la meiosis.) • Los elementos laterales se conectan medianle filamcmos transversos que equivalen a elemento cemral de la Figura 19.lO, constituidos por proteínas Zip. Las mutaciones en las proteínas necesarias par.: que se formen los elementos laterales se encuenua: en los genes que codifican las cohesinas. Las cohesinas que se utilizan en la meiosis incluyen Smc3;(que también se utiliza en la m itosis) y Rec8p (qut es específica de la meiosis y se relaciona con la cabesi na mi Lólica Scc 1p). Las cohesinas parecen unirs

: s\tios específicos a lo largo de los cromosomas du·ame la mitOsis y la meiosis. Es probable que rengan Jna participación estructural en la segregación de os cromosomas. En la meiosis, a veces se requiere a formación de elementos laterales para las etapas .nás avanzadas de la recombinación, porque si bien o::stas mutaciones no impiden la formación de ro:uras de doble cadena, bloquean la formación de íecombinames. La mutación z¡pf permite que se formen y ali_,een los elementos laterales, pero no que presenten 'inapsis estrecha. El dominio terminal N de la pro•eína Zip 1 se localiza en el elemento centraL pero el dom inio terminal C se localiza en los elementos .arerales. Otras dos proteínas, Zip2 y Zip3, también )e ubican con Zip l. El gntpo de proteínas Zip forma filamentos transvecsos que conc.:cran los elementos laterales de los pares de cromáridas hermanas.

El complejo sinaptonémico se forma después de rot uras de doble cadena

Escisión reverSible

5' Spo1

5'

Spo1

1

Disociación del complelo

s·/ i\./A.f}\ Retiro de Spo 11 seguido por ataque de nucteasa

5'/A~ 3'

l 3'

.,::Y;P ..

5'

La Spoll se une en forma covalente a los extremos 5' de las roturas de cadena doble.

Conceptos principales • las roturas de la doble cadena que inician la recombinación ocurren antes de que se forme el complejo sinaptonémico. Si se bloquea la recombinación, el complejo sinaptonémico no puede formarse.

Hay pruebas sólidas en levaduras de que las roturas de la doble cadena inician la recombinación ta m o en la forma homóloga como en la específica de sitio. En un inicio se pensó que las roturas de la doble cadena tenían que ve r con el cambio del tipo de apareamiento, que comprende la sustitución de una secuencia por otra (véase la sección 19 .23, La transposición unidireccional es iniciada por eJ locus MAT receptor). También ocurren roturas de doble cadena en las primeras etapas de la meiosis, en sitios que constituyen puntos calientes (puntos de referencia) para la recombinación. Sus localizaciones no son específicas de secuenda. Tienden a presentarse en regiones promororas y. en generaL a coincidir con regiones más accesibles de la cromaúna. La frecuencia de recombinación desciende en un gradiente a uno o ambos lados del punto calieme. El punto caliente identifica el sitio donde se inicia la recombinación y el gradiente refleja la probabilidad de que se puedan esparcir los sucesos de la recombinación a panir de él. Ahora se puede interpretar la participación de las roturas de doble cadena en términos moleculares. Los extremos romos creados por la rotura de

la doble cadena se convierten con rapidez a ambos lados en extremos 3' largos de cadenas únicas, como se muestra en el modelo de la Figura 19.9. Una mutación de las levaduras (rad50) que bloquea la conversión del extremo de flujo en una protrusión de una sola cadena tiene defecros en la recombinadón. Esto sugiere que las roturas de doble cadena son indispensables para la recombinación. El gradiente está determinado por la probabilidad cada vez menor de que se genere una región de una sola cadena a medida que aumenta la distancia con el sitio de la rotura de la doble cadena. En los mutantes rad50, los exuemos S' de las roturas de la doble <:adena se conectan con la proteína Spo 1 1, que es homóloga de las subunidades catalíticas de u na familia de topoisomerasas de tip o II. EstO sugiere que Spoll tal vez sea una enzima similar a la topoisomerasa que genera roturas de la doble cadena. En la se muestra el modelo de esra reacción que sugiere que Spoll interactúa de manera reversible con el DNA; la rotura se convierte en una estructura permanente por la interacción con otra proteína que disocia el complejo Spoll. Al retiro de Spo ll le sigue, entonces, la acción de la nucleasa. Se requieren al menos Olras nueve proteínas para procesar las roturas de la doble cadena. Se necesita un grupo de proteínas para convenir la rotura de la doble cadena en extremos 3'-0H prorruyentes de una sola cadena. Luego, otro grupo permire que los extremos de una cadena única invadan el DNA dúplex homólogo.

19 6 El complejo sinaptonémico se forma después de roturas de doble cadena

467

Productos sin Moléculas entrecruzamiento recombinantes

.........

Sucesos moleculares Tiempo (minutos)

t t

Roturas de doble cadena Moléculas articuladas DesapaAparecen recen Persisten

20

40

........

60

80

100 1 20 140 160 180 200 220

Sucesos cítológicostTermina la Se forman Se forman los Se disocian lo~ replicación elementos complejos complejos del DNA axiales sinaptonémicos sínaptonémíco Etapa de la meiosis

Leptoteno

Cigoteno

Paquiteno

Diploteno

las roturas de cadena doble aparecen cuando se forman y desaparecen elementos axiales durante la expansión de los complejos sinaptonémicos. Aparecen moléculas articu ladas y persisten hasta que se detectan recombinan tes de DNA en el extremo del paquiteno.

La correlación emre la recombinación y la formación del complejo sinaptonémico está bien establecida y estudios recientes han demostrado que todas las mutaciones que anu lan el apareamiento cromosómico en el género Drosophila o en levaduras también impiden la recombinadón. El sistema para generar las roturas de doble cadena que inician la recombinadón suele conservarse. Los homólogos Spo l l se han idemificado en varias eucariotas su periores y una mutación en e l gen de Drosophila bloquea roda recombinación meiótica. Hay pocos sistemas donde es posible comparar los sucesos moleculares y citológicos en la recombinación, pero en fecha reciente se ha avanzado en los análisis de la meiosis en Saccharomyces cerevisiae. En la se resume la sincronización relativa de los sucesos. Aparecen rotutas de dobk cadena y luego desaparecen en un periodo de 60 min. Las primeras moléculas a1·ticuladas que son intermediarias puta tivas de la recombinaciónaparecenpoco después de que desaparecen las roturas de la doble cadena. La secuencia de sucesos sugiere que las roturas de la doble cadena, las reacciones individuales de aparea miento y la formación de estructuras recombinames tienen lugar de manera sucesiva en el mismo sitio cromosóm.ico. Las roturas de la doble cadena aparecen durante el periodo en que se forman los elementos axiales y desaparecen en el momento en que los cromosomas apareados se convierten en complejos sinaptonémi cos, Esta sincronización relativa de sucesos sugiere que la formación del complejo sinapwnémico es resultado del inicio de la recombinación a través 468

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga

y específica de sitio

de la introducción de roturas de doble cadena y ~_ conversión en intermediarios posteriores de la recombinación. Esta idea se sustenta en la observa · ción de que la mutante rad50 no puede conven elementos a~iales en complejos sinaplonémicos, : que refuta la opinión habitual de que el comple·· sinaptonémico representa en la meiosis la necesida : de que el apareamiento cromosómico preceda a Jc. sucesos moleculares de la recombinación . Ha sido dificil determinar si ocu rre recombinc.ción en la etapa de la sinapsis, porque la recomb:nación se valora por la aparición de recombinamerlespués de concluir la meiosis. No obstante, cuand se valora la aparición de recombinantes en levaduras, directamente en témúnos de la producción eL:: moléculas de DNA que contienen sitios de restricdó: diagnósticos, se ha podido demostrar que los recombinantes aparecen al final de la etapa de paquiten · Esto indica con claridad que el episoctio de recom· binación concluye después de la formación de l0:o complejos sinaptonémicos. Así, el complejo sinaptonémico se forma después de las roturas de doble cadena que inician !:; recombinación y persiste hasta la formaci.ón de m oléculas recombinantes. No parece ser necesario pan la recombinación en sL porque algunos mutant~ que carecen de un complejo sinapronémico norma: pueden generar recombinames. Sin embargo, la5 mutaciones que suprimen la recombinacíón tampoco pueden estructurar un complejo sinaptonémicc Esto sugiere que el complejo sinaptonémico se forma como consecuencia de la recombinación, después del apareamiento de los cromosomas, y que e5 indispensable para etapas posteriores de la meiosis

Desde que ~e propuso eJ modelo de recombinadón a través de la estructura Holliday, se ha su:luesto que la resolución de esa estrunura da origen a productos sin emrecruzarrúento (con un segmento :esidual de DNA híbrido) o a emrecruzamienros (re:ombinames), de acuerdo con las cadenas que par· :icipen en la resolución (véase le~ Figura 19.8). Las mediciones redentes del tiempo de producción de moléculas con y sin entrecruzamiento, no obstante, sugieren que tal vez esto no sea cieno. Los entre cruzamientos no aparecen hasta basta me después de ,1ue aparecen por primera vez las moléculas articuladas, en tamo la ausencia de emrecruzamiemos se observa casi de manera simultánea con esas moléculas (véase la Figura 19.13 ). Sin embargo, si ambos tipos de productos provinieran del mismo proceso de resolución, se esperaría que aparecieran al mismo tiempo. La discrepancia en la sincronización sugiere que los entrecruzamientos se prodtJcen como se pensó antes, por resolución de moléculas articuladas, pero que podría haber alguna orra vía para la aparición de all~encid de enrrecruzamiemos.

El apareamiento y la formación del complejo sinaptonémico son ·j ndependientes Concepto ¡mncipal • Pueden ocurrir mutaciones durante el apareamiento cromosómico o la formación del complejo sinaptonémico sin afectar el otro proceso.

Se pueden distinguir el proceso de apareamiento y el de formación del complejo sinaptOnémico por los efectos de dos mutaciones, cada una de las cuales bloquea uno de los procesos sin afectar el otro. La mutación zip2 permite que los cromosomas se apareen. pero no que formen complejos sinaptonémicos. Así, el. reconocimiento enrre homólogos es independiente de la recombinación o la formación del complejo sinapronémico. La e~pecificidad del vínculo entre cromosomas homólogos la comrola el gen hop2 en S. cerevisiae. En los mutantes de hop2 se forman cantidades normales de complejos sinaptonémico) en la meiosis, pero los complejos individuales conrienen cromosomas no homólogos, lo que sugiere que la formación de comp.lcjos sinaptonémicos como tal es independiente de la homología (y, por tanto, no puede basarse en comparaciones extensas de secuencias de DNA). La función habitual de Hop2 es impedir la imeracdón de cromosomas no homólogos. Se forman roturas de dobJe cadena en los cromosomas con apareamiento erróneo en Jos com plejos sinaptonémicos de los mutantcs hop2, pero

no se reparan. Esta indica que si la formación del complejo smaptonérrúco requiere roturas de doble cadena, no necesita ninguna reacción extensa de estas roturas con el DNA homólogo. No se sabe Jo que en general ocurre durante el paquiteno, antes de que se observen la.s recombi nantes del DNA. Tal vez este periodo se ocupa con los pasos subsiguientes de rec:ombinación, que comprenden la extensión del intercambio de cadenas, la símesis de DNA y la resolución. En la siguiente etapa de la meiosis (diploteno), los cromosomas desmiembran el complejo sinaptonémico; los quiasmas se hacen visibles, entonces, como puntos donde los cromosomas están conectados. Se cree que esto indica la aparición de un in tercambio genético, pero se desconoce la naturaleza molecular del quiasma. Es posible que represente el residuo de un intercambio conclllido o la conexión entre cromosomas homólogos donde aún no se ha resuelto un im~rcarnbio genético . Más adelante en la meiosis, los quiasmas se desplazan hada los extremos de los cromosomas. Esta flexibilidad sugiere que representan algún residuo del episodio de rccombinación más que constituir el intermediario real. Los episodios de recombinación ocurren en sitios bien definidos en los cromosomas meióticos. pero no se puede aún correlacionar su aparición con las estructuras bien definidas que se han observado, esto es, nódulos de recombinación y quiasmas. Los discernimientos de las bases mol<::culares de la formación de estructuras discontinuas, sin embargo, son provisws por la identificación de las proreínas involucradas en la recombinación de las levaduras, que pueden localizarse en sitios bien definidos. !stos incluyen MSH4 (que tiene reladón con proteínas bacterianas involucradas en la reparación de apareamientos erróneos) y Dmcl y Rad5 J (q ue son homólogas ele la proteína RecAde E. coli). Aún no se establecen las funciones exactas de estas protemas en la recombinación . Los episodios de la recombinaclón están sujetos a un control general. Sólo una mínima pane de las interacciones en reaüdad maduran como enuecruzarrúemos, pero se distribuyen de manera tal que, en general, cada par de homólogos requiere sólo uno a dos emrecruzamientos y, sin embargo, la probabilidad de O emrecruzarnientos para un par homólogos es muy baja (<0.1 %). Este proceso tal vez sea resultado de un control d e entrecruzamiento único, porque la no aleatoriedad de IQS enrrecru zamientos suele desaparecer en cienos mutantes. Es más, es necesaria la aparición de recombinación para el avance en la meiosjs y hay un sistema de "punto de revisión" que bloquea la meiosis si no ha ocurrido recombinación. (El bloqueo se levanta cu<1ndo se ha concluido con buenos resultados la

19.1 El apareamiento y la formación del complejo sinaptonémico son independiente5

469

recombinación; este sistema constituye una salvaguarda que ga ran tiza que las células no traten de segregar sus cromosomas hasta que haya ocunido la recombinación.)

E

Las secuencias chi estimulan el sistema RecBCD bacteriano

Conceptos principales • El complejo RecBCD tiene actividades de nudeasa y helicasa. • Se une al DNA en sentido descendente respecto de una secuencia chi, desenrolla la cadena dúplex y degrada una cadena de 3' a 5' conforme se desplaza hacia el sitio chi. El sitio chi desencadena la pérdida de la subunidad RecD y la actividad de nudeasa.

La naturalct.a de los episodios comprendidos en el intercambio de secuencias entre moléculas de DNA fue descrita por primera vez en sistemas bacterianos. Ahí, la reacción de reconocimiento es pane inseparable del mecanismo de recombinación e involucra regiones restringidas de moléculas del DNA más que cromosomas íntegros. No obsraote, el orden general de los episodios moleculares es similar: una cadena única de una molécula rota interactúa con su contraparte dúplex; la región de apareamiento se extiende; y una endonucleasa resuelve las conuaparrcs dúplex. Se conocen las enzimas que participan en cada etapa, aunque es probable que sólo constituyan algunos de los componentes requeridos para la rccombinación. Las enzimas bacterianas que intervienen en la recombínndón se identificaron por la aparición de mutaciones rec-en sus genes. El fenotipo de los mutantes rec es la imposibilidad de llevar a cabo la recombinación generali7.ada. Se han identificado de lO a 20 loci. Las bacterias no suelen intercambiar grandes canridades de DNA dúplex. pero debe haber varias vías para iniciar la recombinación en las procariotas. En algunos casos, el DNA puede estar disponible con extremos 3' libres de una sola cadena: el DNA puede ser provisto en forma de una cadena única (como en la conjugación; véase la sección 16.1 O, En la conjugación se transfiere DNA de una sola cadena); se pueden generar brechas de cadena (mica con daño por irradiación; o se pueden generar colas de cadena única por genomas de fagos en proceso de replicación por un círcu lo rodante. Sin embargo, en circunstancias que comprenden dos moléculas dúplex (como en la recombinación durame la meiosis en eucariotas), deben generarse regiones de una sola cadena y extremos 3'. 470

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y espe.cífica de sitio

Se descubrió un mecanismo para la generacié de extremos adecuados como resu1tado de la exi tencia de cierto!> pumas calientes que estimulan rccombinación. Estos puntos, que se dcscubrien en el fago A. en forma de mutantes llamados e·· tienen cambios de pares de bases únicos que creó secuencias que estimulan la recombinación. Est ~itios conducen a la función de Olras proteínas qu intervienen en la recombinación. Dichos sirios comparten una secuencia no sim~· trica de 8 bp constante: 5' GCTGGTGG 3' 3' CGACCACC S'

La secuencia clli ocurre de manera natural en,

DNA de E. coli cerca de una vez cada 5 a 1O kb. ~ aust•ncia del DNA A. de tipo silvestre y también ó otros elementos genéticos muestra q ue no es indi<.pensable para la recombinación. Una secuencia chi estimula la recombinación e su vecindad genera l, es decir, dentto de una distar . cia de hasta 1O kb respecto del sitio. Un sit.io chi ~ puede activar con una rowra de la doble cade11: a varios l supenur de ese sitio en forma de una sola cadena lo que hace que la enzima entre en pausa. Después escinde la cadena superior del DNA en una posición entre cuano y seis bases a la derecha de chi. E! rcconocimiemo del sitio chi hace que la subunidad

mllllli Ullll ¡11111h

La RecBCDse desenrolla y degrada el DNA La subunidad RecD transloca 5'-3'

La RecBCD escinde una cadena única en chl

t

.-

~ ·'tl"'(f{ ,

La RecD se disocia

la idea de que el intercambio de cadenas emre moléculas dúplex de DNA participa en la formación del complejo sinaptonétuico y da Jugar a la posibilidad de que la sinapsis de los cromosomas tenga relación con la reacción de asimilación de cadenas en las bacterias. La RecA en bacterias tiene dos tipos bastante diferentes de actividad: puede estimular la reacción de proteasa en la respuesta SOS (véase la sección 20.10, La RecA desencadena el sistema SOS) y puede facilitar el apareamiento de bases entre una sola cadena de DNA y su complemento en una molécula dúplex. Ambas actividades son estimuladas por el DNA de cadena (mica en presencia de ATP.

La actividad de manejo del DNA de RecA perLa RecBC conlinúacomo ~ hellcasa r , ., La subunidad RecB transloca 3'-5'

La nucleasa RecBCD se acerca a una secuencia :,¡desde un lado y degrada el DNA a medida que avanza; en el :·tia chi hace un corte endonucleolítico, pierde RecD y conserva :5lo la actividad de helicasa.

-ecD se disocie o se desactive, en cuyo momento la :-nzima pierde su actividad de nucleasa. No obstan'e, sigue funcionando como belicasa (ahora sólo con 3 subunidad RecB para impulsar la translocación) a .erca de la mitad de la velocidad anterior. El resul:ado global de esta interacción es generar un DNA .:e cadena única con un extremo 3' en la secuencia _1i. Éste es un sustrato de la recombinación.

Las proteínas de transferencia de cadenas catalizan la asimilación de una sola cadena Conceptos principales • La RecA forma filamentos con el DNA de una o dos cadenas y cataliza la capacidad de un DNA de una sola cadena con un extremo 3' libre de desplazar a su contraparte en una cadena dúplex de DNA. ~a

proteína RecA de E. coli ft1e el primer ejemplo una proteína de transferencia de DNA que se Jcscubrió. Es el paradigma de un grupo que incluye arias otras proteínas bacterianas y arcaicas (Rad5l =t1 S. cerevisine) y la prOLeína de eucariotas superiores Dmcl. El análisis de los mutantes rad51 de las leva.1u ra1. muestra que esta clase de proteína desempe1a una función esencial en la recombinación. Acu 'Tl ulan roturas de doble cadena y no logran formar .:umplcjos sinapLOnémicos normales. Esto refuerza j<.'

mite que una sola cadena desplace a su homóloga en una molécula d(lplex por una reacción qu e se denomina captación o a similación de una sola cadena. La reacción de desplazamiento pnede ocurrir entre moléculas de DNA en varias configuraciones y cumple con tres condiciones generales. • Una de las moléculas de DNA debe tener una región de una sola cadena. • Una de las moléculas debe tener un extremo 3' libre. • La región de una sola cadena y el extremo 3' deben localizarse dentro de una zona que es complementaria enue las moléculas. La reacción se ilustra en Ja . Cuando una cadena lineal sola invade a una dúplex, desplaza a su comrapane original hacia su complementaria. La reacción puede seguirse con más facilidad con el marcado del donador o el receptor en una molécula circular. La reacción procede de 5' a 3' a lo largo de la cadena cuya contraparte está siendo desplazada y sustituida, esto es, la reacción comprende un intercambio donde (al menos) una de las cadenas de intercambio tiene un extremo 3' libre. La asimilación de una sola cadena tien e una posible relación con el inicio de la recombinación. Todos los modelos requieren un intermediario don de una o ambas cadenas se cruzan de una molécula dúplex a otra (véanse las Figuras 19.6 y 19.9). La RecA podría cataJizar esta etapa de la reacción. En el contexto bacteriano, la RecA actúa sobre sustratos generados por RecBCD. El desenrollado y la escisión mediados por RecBCD pueden servir para generar extremos que inicien la formación de articulaciones heterodúplex. La RecA puede tomar la cadena única con el extremo 3' que se libera cuando RecBCD corta en chi, usarla para reacdonar con una secuencia dúplex homóloga y crear así una molécula de aniculadón . Todas las proteínas bac-terianas y arcaicas de la familia de RecA pueden agregarse en filamentos largos con el DNA de caden11 única o dúplex. Hay

llj.9 Las proteínas de transferencia de cadenas catalizan la asimilación de una sola cadena

4 71

La RecA facilita la asimilación de cadenas únicas invasoras en el DNA dúplex, siempre y cuando una de las cadenas reactivas tenga un extremo libre.

seis monómeros de RecA por giro del filamento, que tiene una estructura helicoidal con un surco profundo que contiene el DNA. la estequiometría de la unión es de tres nucleótidos (o pares debases) por monómero de RecA. El DNA se mantiene en una forma extendida l . 5 veces en relación con el DNA B dúplex, lo que hace que ocurra un giro cada 18.6 nucleótidos (o pares de bases). Cuando el DNA dúplex se une, entra en contacto con RecA a u·avés de su surco menor y deja el surco mayor accesible para una posible reacción con una segunda molécula de DNA. La interacción entre dos moléculas de DNA tiene lugar dentro de estos filamentos. Cuando una sola cadena se asimila a una dúplex, el primer paso es que RecA se una a la cadena única dentro de un filamento. Después se incoq)ora la cadena dúplex, tal vez formando algún tipo de estructura de tres cadenas. En este sistema, la sinapsi.s antecede al intercambio físico de materia L porque la reacción de apareamiento puede ocurrir incluso en ausencia de extremos libres, cuando es imposible el intercambio de cadenas. Se requiere un extremo libre 3' para el intercambio de cadenas. La reacción tiene lugar dentro del filamento y RecA se mantiene unida a la cadena que en un principio era única, de modo que al fina l de la reacción RecA se encuentra unida a la molécula dúplex. Todas las proteínas en esta familía pueden facilitar el proceso básico de intercambio de cadenas sin necesidad de energía. No obstante, la RecA aumenta su aaividad con el uso de hidrólisis por ATP. Se hidrolizan grandes cantidades de ATP durante la reacción. El ATP puede actuar mediante un efecto alostérico sobre la conformación de RecA. Cuando está unido a ATP, el sitio de unión de RecA al DNA tiene una alta afinidad por e l DNA; esto es indispen472

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y específica de sitio

sable para unirse al DNA y para la reacción de apareamiento. La hidrólisis del ATP conviene el sitio d:: unión en uno de baja afinidad, el cual se necesir¿ para liberar el DNA hctcrodúplex. Se puede dividir la reacción que cata.liza RecAentre DNA de una sola cadena y dúplex en tres Jases: • una fase presináptica lema, donde RecA se pt'-limeriza sobre el DNA de una sola cadena; • una reacción de apareamiento rápido entT:: el DNA de u na sola cadena y su complementario en la cadena dúplex para produce una articulación heterodúplex; y • un desplazamiento lento de una cadena desde la estructura doble para producir una región larga de DN A heterodúplex. La presencia de SSB estimula la reacción al asegurar que el sustrato carece de estructura secundatia Todavfa no se sabe con certeza de qué manera SSB ~ RecA pueden actuar ambas sobre el rnismú segmento de DNA. Al igual que SSB, se requiere RecAen canlidades esrequiométricas, lo que sugiere que st.: acdón sobre la asim ilación de cadenas comprende unirse de manera colaboradora al DNA para formar una esrrucrura relacionada con el filamento. Cuando una molécula de una sola cadena reacciona con un DNA dúplex, la molécula dúplex se desenrolla en la región de la articulación recombinante. La región in icial de DNA heterodúplex tal vez n i siquiera se encuentre en la forma de doble hélice convencional, sino que consista en dos cadena~ relacionadas en forma lateral. Una región de este tipo se conoce como articulación paranémica (en comparación con la relación plectonémica, de entretejido usual de cadenas en una doble hélice). Una articulación paranémica es inestable; para que la reacción siga avanzando necesita convenirse a la forma de doble hélice. Esta reacción es equivalente

fi\.f\.rv/ WJWJ\..VA.'IV:VV/

l

La cadena libre enicia el entercambio

~1,

J \."J\:.1. \';f. \{i\:17\'/J\:.CVVJV# La cadena desplazada se aparea con la complementaria

1

\.l~f'\.'A!!_lj\YM

VN~/

~ ,..,,...•. Concluye el inlercambio de cadenas

\:/}\/)\fi\.;.li\;l}\1)\:."

\/iVNi\:.INJ\fl\:/1 El intercambio de cadenas mediado por RecA .!ntre el DNA parcial y completamente dúplex genera una mo..écula articular con la misma estructura que un producto inter11edio de la recombinación.

al retiro de suptrhélices negativas y en ocasiones requiere una enzima que resuelva el problema de desenrollado/reenrollado mediante romras transitorias 4ue permitan a las cadenas girar sobre sí mismas. Todas las reacciones que se han analizado hasta ahora constituyen só lo una parte del episodio de recombinación potencial: la invasión de una molécula dúplex por una única. Dos moléculas dúplex pue Jen imeracruar entre sí bajo el patrocinio de RecA, siempre que una de eUas tenga -una región de una mla cadena de al menos 50 bases. La región de una sola cadena puede adoptar la forma de una cola sobre una molécula üneal o de una brecha en una molécula circular. La reacdón entre una molécula pardalmente dúplex y una por completo dúplex conduce al intercambio de cadenas. En la se incluye un ejemplo. La asimilación se inicia en un extremo de la molécula lineal, donde la cadena única invasora desplaza a su homóloga de la cadena dúplex en la forma acostumbrada. No obstante, cuando la

reacdón alcanza la región que es dúplex en ambas moléculas, la cadena invasora se separa de su compañera, que después se aparea con la otra cadena desplazada. En esta etapa la molécula tiene una estructuia indistinguible de la articulación recombinante incluida en la Figura 19.8. La reacción impulsada in vítro por RccA puede genera r urúones Holliday, lo que sugiere que la enzima puede mediar la transferenda recíproca de cadenas. Se sabe menos acerca de la geomeuía de los productos intermedios de cuatro cadenas unidos por RecA, pero al parecer dos moléculas dúplex pueden yacer lado a lado en una forma compatible con los requerimientos de la reacción de intercambio. Las reacciones bioquímicas descritas in vitro dejan abiertas muchas posibilidades para las funciones de las proteínas de transferencia de cadenas in vivo. Su participación la desencadena la disponibiHdad de un extremo 3' de una sola cadena. En las bacterias, esto con roda probabilidad se genera cuando RecBCD procesa una rotura de doble cadena para originar un extremo de una sola cade na. Una de las principales circunstancias en las que se invoca esto puede ser cuando un triplctc de replicación se detiene en un sitio dañado del DNA (véase la sección 20.9, La recombinación es un mecanismo importante para la recuperadón después de errores en la replicación). La introducción de DNA durante la conjugación, cuando se requiere RecA para la recombinación con el cromosoma hospedador, se relaciona más de cerca con la recombinación convencional. En las levaduras, las roturas de la doble cadena pueden generarse por daño al DNA o como parte del proceso normal de recombinación. En cualquier caso, al procesamiento de la rotura para generar un extremo 3' de cadena única le sigue la descarga de la cadena única en un filamentO con Rad51 y luego la búsqueda de secuencias dúplex complementarias. Esto se puede usar tanto en reacciones de reparación como de recombinación.

ID

El sistema Ruv resuelve las unio nes Holliday

Conceptos principales • El complejo Ruv actúa sobre uniones recombinantes. • La RuvA reconoce la estructura de la unión y la RuvB es una helicasa que cataliza la migración de ramas. • La RuvC escinde uniones para generar productos intermedios de recombinación.

Uno de los pasos más determjnantes en la recombinación es la resolución de la unión HoJJiday, la Hl 10 El sistema Ruv resuelve las uniones Holtiday

4 73

El tetrámero RuvA hace contacto con las cuatro cadenas(

!f."r El hexámero RuvB se une como anillo alrededor del ONA

Migración de rama

La RuvAB es un complejo asimétrico, el cual estimula la migración de ramas de una unión Hollíday.

Brecha generada por la replicación del DNA dañado

Segundo intercambio de cadena

Polímerasa de DNA La brecha se llena por la sintesis de DNA

RuvA,B Migración de rama

Ruvc Se escinde la unión Hollíday

Las enzimas bacterianas pueden catalízar todas las etapas de la recombinación en la vía de reparación después de La producción de moléculas sustrato de DNA adecuadas.

cual determina si hay una n:combinación recíproca o una reversión de la estructura que deja sólo un segmento corto de DNA híbrido (véanse las Figuras 19.6 y 19.8). La migración de ramas desde el sitio de inlercambio (véase la :l?igura 19.7) determina la longitud de la región de DNA híbrido (con o sin recombinación). Las proteínas que intervienen en la estabilización y resolución de las uniones Holliday se han identificado como los producws de los genes mven E. colí. RuvA y RuvB aumentan la formación de estructuras heterodúplex. La RuvA reconoce la 474

CAPÍTULO 19 Recombínación homóloga y específica de sitio

estructura de la unión Holliday. La RuvA se une a las cuaLro cadenas del DNA en el punto de entrecruzamiento y forma dos tetrámeros que ubican al DNA como en un emparedado. La Ruv es una helicasa hex:américa con acliVidad de trifosfatasa de adenosina que constituye el motor para la migración de ramas. Los anillos hexaméricos de RuvB se unen alrededor de cada cadena dúplex de DNA en sentido ascendente respecto del punto de entrecruzamiento. En la se muestra un esquema del complejo. El complejo RuvAB puede hacer que la rama emigre a una velocidad de hasta lO a 20 bp/s. Otra helicasa, la RecG, provee una actividad similar. La RuvAB desplaza a RecA del DNA durante su acción. Las actividades de RuvAB y RecG pueden incidir ambas sobre uniones Hollíday, pero si las dos presentan mutación, la E. coli tiene una aclividad recomb inante por completo defectuosa , El tercer gen, ruvC, codifica una endonucleasa que reconoce de manera específica las uniones Holliday. Puede fragmentar las uniones in vilro para resolver productos intermedios de recombinación. Una secuencia tetranucleotídica común provee un punto caliente para que RuvC resuelva la unión Holliday. El tetranucleótido (ATIG) es asimétrico y, por tanto, puede dirigir la resolución con respecto a qué par de las cadenas tiene hendidura. Esto determina si el resultado es la formación de un parche recombinante (sin recombinación global) o la formación de un recombinante por corte y empalme (recombinación entre marcadores flanco). Las estructuras cristalinas de RuvC y otras enzimas de resoludón de unión muestran que hay poca similitud estructural en el grupo. a pesar de tener la misma función. Todo esto sugiere que la recombinación utilizc un complejo "resolvasoma" que incluye enzimas que calalizan la migración de ramas, así como actividades de resolución de unión. Es posible que las células de los mamiferos contengan un complejo similar. Ahora se pueden señalar las etapas de la recombiJlación en E. coli en términos de proteínas indivise muestran Jos sucesos duales. En la que tienen lugar cuando se usa la recombinaciórpara reparar una brecha en una cadena dúplex mediante la recuperadón de rnareriaJ de la oLTa cadena dúplex. La principal desventaja cuando se aplicar estas conclusiones a la recombinación en eucariot~ es que la recornbinación bacteriana en general comprende la interacción entre un fragmento de DNA y un cromosoma completo. Ocurre como reacciór: de reparación estimulada por el daño al DNA, per no equivale por completo a la recombinación entre genomas durante la meiosis. No obstante, participar actividades moleculares similares en la manipulación del DNA.

Se describió otro sisrema de resolvasas en levafuras y mamíferos. Las mutanres mus81 en S. cere:Siae tienen recombinadón defectuosa. La Mus81 ~ 5 un compuesto de endo nucleasa que resuelve las nioncs Holliday en estructuras dúplex . La resolvaa es importante tamo en la meiosis como para el ·einido de horquillas de replicación varadas (véase 3 sección 20. 9, La recombinación es un mecanismo mporranre para la recuperación después de errores 1e replicación}.

La conversi ón génica contribuye a la recom binación interalélica

Proporción

parental 4:4

[ DNA hfbrido

~~~=

-+ Persiste hlbrrdo

-~~;¡;;¡;¡;::¡un

Ambos hfbrldos se convierten

o

o Q

Segregación posmeiótica 3:5

Conversión del gen 2:6

a rojo

Con<eptos principales • El DNA heterodúplex creado por recombinación puede tener secuencias con apareamiento erróneo, donde los aletos recombinantes no son idénticos. Los sistemas de reparación pueden retirar apareamientos erróneos si cambian una de las cadenas, de modo que su secuencia sea complementaria a la otra. participación del DNA heterodúplex explica las :aracterísticas de la recombinación entre aletos; de ; echo, la recombinación alélica estimuló el perfec.:-iona miemo del modelo heterodúplex. Cuando se - escubrió la recombinación entre alelos, !o natural Je pensar que ocurría por el mismo mecanismo de J recombinación recíproca, que involucra loci más istantes. Es decir, un episodio de rotura y reunión .!ldividual tiene lugar en d locus para generar un ar recíproco de cromosomas recombinanres. Sin ·mbargo, en las partes cercanas de un solo gen, la vrmación del propio DNA heterodúplex suele en:arga rse del SLJceso de recombi nación . Los episodios de recombinación individuales 1ueden estud iarse en los hongos del grupo de asco'liccros porque los productos de llna sola meiosis se -na.nliencn juntos en una gran célula llamada asea o, menos a menudo, tétrada). Es todavía mejor ,ue en algunos hongos los cuatro núcleos haploides reducidos por la mciosis se dispongan en un alelo ·neaJ (en la actualidad ocurre una mitosis después .:.e la producción de estos cuatro núcleos, lo que da rigen a una serie lineal de ocho núcleos haploides} . ~n la se muestra que cada uno de estos -:úcleos representa, en efecto, el carácter genético Je uno de los ocho segmentos de los cuatro cromoomas producidos por la meiosis. La meiosis en un organismo heterocigoto que ;eneraría cuatro copias de cada alelo, lo que se oberva en la mayor parte de las especies. No obstante, ay a lgunas esporas con relaoones anormales. que =e explican por la formació n y corrección de DNA _a

Sin recombinaclon

La formación de esporas en los ascomicetos permite la determinación de la constitución genética de cada una de las cadenas de DNA involucradas en la meiosis. heterodüplex en la región donde los alelas clifieren. la figura ilustra un e pisodio de recombinadón donde una longitud de DNA híbrido se presenta en uno de los cuatro cro mosomas meióticos, un posible resultado de la recombinación iniciada por la rotura de la doble cadena . Supónga~e que dos alelos difieren por un solo punto de mmación. Cuando ocurre intercambio de cadenas para generar el DNA heterodúplex, las dos de este último tendrán apareamiento erróneo en el sitio de la mutación. As1, cada cadena de DNA porta diferente información genética . Si no se hace ningún cambio en la secuencia, las cadenas se separan en la siguiente replicación y dan origen cada una a una dúplex que perpetúa su información. Este suceso se denomina segregación posmeiót i<:a, porque refleja la separación de las cad.:nas del DNA después de la meiosis. Su importancia es que demuestra de manera djrecla la existencia de l DNA heterodúplex en a lelos recombinames. Orro efecto se observa cuando se revisa la recombinación entre a lelos: los porcentajes de a lelos difieren de la relación irúcial de 4:4. Este efecto se llama con vers ió n génica . Describe una transferencia no recíproca de información de una cromálida a otra. La co nversión génica es resultado del intercambio de cadenas entre moléculas de DNA. y el cambio en la secuencia puede tener cualquiera de dos causas en el ámbito molecular: • Como se indica con el modelo de rorura de doble cadena en la Figura 19. 9, una cadena dúplex de DNA puede acwar como donadora de información genética, que sustituye en forn1a ctirecta las secuencias correspondien-

19.11 La conversión génica contribuye a la recombinación interalélica

475

tes en la cadena dúplex receptora por un proceso de generación de brechas, intercambio de cadenas y llenado de la brecha. • Como parte del proceso de intercambio se genera DNA heterodúplex cuando una sola cadena de una dúplex se aparea con su complementaria en la otra cadena dúplex. Los sistemas de reparación reconocen pares de bases con apareamientO erróneo con el DNA heterodúplcx y pueden, entonces, escindir y sustituir una de las cadenas para restablecer la complcmentariedad. Tal suceso convierte la cadena de DNA representante de un alelo en una secuencia del otro alelo. La conversión génica no depende del entrecruzamien to, pero se correlaciona con él. Una gran proporción de las aseas aberrantes m uestra la recombinación genética entre dos marcadores a cada lado de un sitio de conversión génica interalélica. Esto es exactameme Jo que podría prededrse si las relaciones aberrantes fueran resultado del inicio del proceso de recombinación, como se muestra en la Figura 19.6, pero con una probabilidad casi equivalente de resolver la estructura con o sin recombinación (como se indica en la Figura 19.8). El efecto es que los cromosomas micóticos inician el emrecruzamiento casi con el doble de la frecuencia que se esperaría respecto de la correspondiente de la rccombinadón enrre genes distantes. Se observan varias tendencias cuando se revisa la recombinación en el ámbitO molecular. Cualquier dirección de la conversión génica puede tener la misma probabilidad, o los efectos específicos de a lelos pueden propiciar una preferencia por una dirección. Los gradientes de recombinación pueden alejarse de los pumos calientes. Boy se sabe que los puntos calientes represeman sitios donde se inician las roturas de la ca dena doble y que el g radien te se correlaciona con el grado hasta el cual una brech a en el punto caliente aumenta y origina extremos largos de cadena única (véase la sección l 9.6. El complejo sinaptonémico se forma después de las roturas de la doble cadena). Las secuencias de los inregrames de agrupa dones génicas ofrecen un poco de informadón sobre el grado de conversión génica_ Por lo general, los productos de un episodio de recombinadón se separarán y no podrán analizarse las secuencias del DNA. No obstante, cuando un cromosoma porta dos genes (no alélicos) que tienen relación, pueden recombinarse mediante un episodio de "emrecru zaluiemo no equivalente ~ (véase la sección 6.7, El entrecruzamiento no equivalente reestructura gru pos de genes). Todo lo que se necesita observar por ahora es que se puede formar un DNA hete rodúplex entre dos genes alélicos. La conversión génica con476

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y específi ca de sitio

El DNA lineal está extendido (a), un DNA ci·cular se mantiene extendido si es relajado (no superenrolladc (b ), pero el DNA superenrollado tiene una forma condens~­ da con torsión (e). fotografías por cortesía de Nirupam Re_ Choudhury, International Centre for Genetic Engineering ar: Biotechnology (ICGEB).

vierte, en efecto, uno de los genes no alélicos en ;z secuencia del ouo. La presencia de más de un gen en el mism cromosoma constituye un vestigio que permi:-:: rastrear estos sucesos. Por ejemplo, si se formar.: un DNA heterodúplex y hubiera conversión génic= sobre parte de un gen, esa parte podría tener um secuencia idéntica a la del otro gen, o muy relaciCInada, en tanto la porción restante mostraría má
E

El superenrollamiento afecta la estructura del DNA

Concepto$ principales • Ocurre superenroltamiento sólo en un DNA cerrado, sin ningún extremo libre. • Un DNA cerrado puede ser una molécula circular de DNA, o una lineal donde ambos extremos se anclan a una estructura proteínica. • Cualquier molécula de DNA cerrado tiene un número de enlace, que corresponde a la suma del número de contorsiones y del número de torcimientos.

• Los plegamientos se pueden repartir entre el número de contorsiones y el número de torcimientos, de manera que un cambio en la estructura de la doble hélice puede compensar una modificación de su enrollamiento en el espacio. • El número de enlace puede modificarse sólo con la rotura y la formación de uniones en el DNA.

_a oscilación de las dos cadenas del DNA enrre sí :n la estructura de la doble hélice permite cambiar •.a estructura sí se influye en su conformación en eL ~spacío. Si los dos extremos de la molécula de DNA están fijos. se puede enrollar la doble hélice alredcior de sí misma en el espacio, lo que se denomina superen rollamiento . Se puede imaginar el efecto como el de una liga que se enrolla sobre sí misma. El ejemplo más simple de un DNA sin exrremos lib res éS el de la molécula circular. El efecto del superen:-ollamienro puede observarse cuando se compara el DNA circular no superenrollado que yace plano en la , <.:on la molécula circular superenrollada que forma torsiones y. portante. está más condensada. Las consecuendas del superenroJlamiento dependen de que el DNA gire en tomo a sí mismo en el '"llismo sentido que las dos cadenas dentro de la doble héli<.:e (como las manecillas del reloj) o en el sen
Podría visualizarse la estructura del DNA en términos de un extremo libre que permitiese a las cadenas girar sobre el eje de la doble hélice para desenrollarse. No obstante, dada la longitud de la doble hélice, esta acción implicaría la separadón de las cadenas en un grado considerable de fragmemadones, lo que parece poco probable en los confines de la célula. Se logra un resullado similar si se coloca un aparaw para controlar la rotación del extremo libre. Sin embargo, el efecto Liene que transmitirse por una distancia considerable, lo que implica, de nuevo, la rotación de una longitud inmoderada de material.

Considérense los electos de separar las dos ca· denas en una molécula cuyos extremos no están en libertad de girar. Cuando dos cadenas entretejidas se jalan para separarlas de un extremo, se incrementa el enrollamicnto de una en torno a la otra en una mayor distancia de la molécula. El problema puede superarse si se introduce una hendidura transitoria en una cadena. Un extremo libre interno permite que la cadena con hendidura gire alrededor de la cade11a integra, después de lo cual se puede sellar dicha hendidura . Cada vez que se repite la reacdón de hendidura y sellado se libera un giro de la su perhélice.

Rotación cerca de un extremo libre

-~~

~

La separación de cadenas se compensa con el superenrollamiento positivo

Producción de hendidura, rotación y ligadura Hendidura

~

Se puede lograr la separación de las cadenas de una hélice de DNA doble en varias formas. 19.12 El superenrollamiento afecta la estructura del DNA

477

Se puede definir una molécula de DNA cerrada por su número de e nlaces, el número de veces que una cadena cruza sobre la orra en el espacio. Las moléculas de DNA cerradas de secuencia idéntica pueden tener cüferentes números de enlaces, lo que refleja diferentes grados de superenrollam.ienlo. Las moléculas de DNA que son iguales, excepto por sus números de enlaces, se denominan isómeros t opológicos. El nlimero de enlaces está constituido por dos componentes: el número de torcimientos (W) y el número de contorsiones (T). El núme ro d e cont orsiones, T, es una pro piedad de la estructura misma de doble hélice que representa la rotación de una cadena alrededor de la otra. Corresponde al número total de giros de la cadena dúplex y está determinada por el número de pares de bases por giro. Para un DNA circular cerrado relajado, que yace plano, eJ giro corresponde al número total de pares de bases dividido entre el número de pares de bases por giro. El número de torcim.ie ntos, W, representa el giro del eje de la cadena dúplex en el espado. Corresponde al concepto intuitivo det·superenrollam.iento, pero no tiene exactamente la misma definición cuantitativa o medición. Para una molécula relajada W = O, y el número de enlace equivale al giro. A menudo interesa el cambio en el número de enlace, t.L, expresado en la ecuación t.L == t.W + t.T

La ecuación señala que cualquier cambio del número total de revoluCiones de una cadena de DNA

alrededor de la otra se puede expresar como la suma de modificaciones en el enrollamiento del eje de la cadena dúplex en el espacio (~ W) y las de tos giros de la doble hélice misma (t.T). En una molécula de DNA libre, W y T pueden ajustarse con libertad y es probable que cualqule.r & (cambio en el número de enlace) se exprese por un cambio en W, es decir, por una variación en el superenrollamiento. Un decremento en el número de enlace, esto es, un cambio - t.L corresponde a la introducción de alguna combinación de superenrollamiento negativo, subenrollamiento, o ambos. Un aumento en el número de enlace, determinado como cambio de +AL, corresponde a una reducción en el superenrollamiento negativo o subernollamiento. Se. puede describir el cambio en el esrado de cualquier DNA por ]a diferencia específica de en lace, cr = t.LIL 0, donde L0 es el número de enla ce cuando el DNA está relajarlo. Si todo el cambio en el rnímero de enlace se debe a la modificación en W (esto es ~T =0), la diferencia específica de enlace equivale a la densidad del superenrollamiento" En e(ecto, puede asumirse que cr definida en términos 478

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y específica de sitio

de &/L6 corresponde a la densjdad de la superhélice siempre y cuando la estructura de la doble hélice misma se mantenga constante. La característica determinante del uso del número de enlace es que este parámetro es una propiedad invariable de cualquier molécula de DNA individual cerrado. El número de enlace no puede cambiar por alguna deformación diferenre de aquella que implique la rotura y reunión de cadenas. Una molécula circular con un número de enlace panicular puede expresar el número en términos de diferentes combinaciones de T y W, pero no puede cambiar su suma en. tanto las cadenas no se rompan . (De hecho, la partición de L entre T y W impide la asignación de valores fijos a los últimos parámetro: para una molécula de DNA en solución.) El número de enlace se relaciona con los sucesos em.imáticos reales por los que se hacen cambios en la topología del DNA. El número de enlace de una molécula cerrada partícula~: puede cambiar sólo si se ro(Open uoa o dos cadenas, utilizando e. extremo libre para girar una al rededo~: de la otra~ reuniendo los extremos rotos. Cuando una enzima realiza tal acción, el número de enlace debe cambiar por un entero; este valor puede deTerminarse como una característica de la reacción. Emonces se podrán analizar los efectos de este cambio en términos de t.W y t.T.

Las topoisomerasas relajan o introducen superhéUces en el DNA Conct-ptos principales • Las topoisomerasas cambian el n(tmero de enlace cuando rompen enlaces en el DNA. modifican la conformación de la doble hélice en el espacio y vuelven a forma r los enlaces. • Las enzimas de tipo I actúan al romper una cadena única de DNA; las de tipo Il causan roturas ele dos cadenas.

Los cambios en la topología del DNA pueden oca~ sionarse en varias formas. La muestra algunos ejemplos. Para iniciar la replicaci6r. o transcripción deben desenrollarse las dos cadena$ de DNA. En el caso de la replicación, las dos cadenas se separan de manera permanente y cada una forma una cadena dúplex co~1 la lúja recién sintetizada. En el caso de la transcripción, el movimientc de la polimerasa de RNA crea una región de superenrollam.iemo positivo al frente y una de superenrollamlento negativo detrás de la enzima. Esto debt: resolverse ames de que las superhélices positivas

Las cadenas deben separarse para fa replicación

La transcrípclón crea superenrollamlento positivo

la estructura topológica del DNA cambia du· rante la replicación y la transcripción. La separación de las cadenas requiere que se desenrolle un giro del DNA. La transcripción crea superhélices positivas adelante de la potimerasa de RNA. La replicación de un molde circular produce dos moldes hijos encadenados.

impidan el movimiento de la enzima (véase la sección 11.15, El superenrollamiemo es una caracte-

rística importante de la transcripción). Cuando se replica una molécu la de DNA circular, los productos vinculados pueden estar encadenados, de modo que uno pasa a través del otro. Deben separarse en orden para que las moléculas hijas se segreguen en células hijas independientes. Ot.ra siruadón donde el superenrollamiemo es importante es el plegamiento del DNA en una cadena denucleosomas del núcleo eucariótico (véase la sección 29.6, La periodicidad del DNA cambia en el nucleosoma). Todas las situaciones se resuelven con las acciones de las topoisomerasas. Las topoisomerasas del DN/\ son enzimas que catalizan cambios en la topología del DNA con la rolura transitoria de una o ambas cadenas, donde las cadenas que no se Tompieron pasan a través de la brecha que después se sella. Los extremos que se generan con la rotura nunca están libres, sino que, en su lugar, son manipulados de manera exclusiva dentro de los confines de la enzima; de hecho, tienen enlace covalente con ella. Las topoisomerasas actúan sobre el DNA sin importar su secuencia, pero algunas enzimas involucradas en la recombinación específica de sitio actúan del mismo modo y también cumplen con la definición de topoisomerasas

(véase la sección 19.18, La recombinación específica de sitio simula la aCtividad de ropoisomerasa). Las topoisomerasas se dividen en dos clases, de acuerdo con la naturaleza de los mecanismos que emplean. Las topo isom e rasas d e t ip o I actúan hacien do una rotura Lransitoria en una cadena de DNA. Las t opoisomer asas de t ipo Il act.Jan cuando introducen una rotura transitoria de la doble cadena. Las topoisomerasas en geneTal varían con respecto a los tipos de cambio topológico que introducen. Algunas topoisomerasas pueden relajar (retirar) sólo superhelices negativas del DNA; ouas pueden relajar superhélices negativas y positivas. Las enzimas que pueden iotrodudr superhélices negativas se denominan girasas; aquellas que pueden introdudr superhélices positivas se denominan girasas inversas. Hay cuatro topoisomerasas en E. coli: las topoisomerasas I, ID y TV y la girasa de DNA. Las topoiso:nerasas 1 y III del DNA son enzimas de tipo l. La girasa y la topoisomerasa rv del DNA son enzimas de tipo TI. Cada una de las cuatro enzimas es importante en una o más de las situaciones descritas en la Figura 19.22: • El nivel global de superenrollamienro negativo en el nucleoide bacteriano es resulLado de un equilibrio entre la introducción de superhélices por la girasa y su relajación por las ropoisomerasas I y IV. Éste es un aspecto crucial de la estructura del nucleoide (véase la sección 28.4, El genoma bacteriano está superenrollado) y afecta el inicio de la transo-ipción en ciertos promotores (véase la sección lJ .15, El superenrollamiemo es una característica importante de la transcripción). • las mismas enzimas participan en la resolución de los problemas creados por la transcripdón; la girasa convierte las superhélices positivas que se generan delante de la polimerasa de RNA en superhéJ ices negativas, y las topoisomerasas Iy IV retiran las superhélices negativas que quedan detrás de la enzin1a. De manera similar, pero más compleja, ocurren efectos durante la replicación y las em.imas tienen actl.ladones sjmilares para enfrentarlos. • A medida que avanza la replicación, las cadenas dobles hijas pueden torcerse una alrededor de la otra, en una etapa conocida como precatenación. Las estructuras de la precatenación se retiran por la acción ele la topoisomerasa IV, que también desencadena cualquier genoma encadenado que queda al tér:mino de la replicadón. Las I unciones de la topoisomerasa m se superponen de manera parcial con las de la topoisomerasa IV.

19.13 Las topoisomerasas relajan o introducen superhélices en el DNA

479

1111

Las topoisomerasas rom pen y resellan cadenas

Concepto principal

Unen Hacen cadenas hendiduras en separadas una cadena y aseguran los extremos

t

Hacen pasar Se sella la hendidura la cadena intacta a través de la brecha

3'·0H 5'-P·

'

Las topoisomerasas bacterianas de tipo I reco· nocen segmentos parcialmente desenrollados de DNA y pasan una cadena a través de una rotura hecha en la otra. Las enzimas en eucariotas siguen los mismos principios, si bien la división detallada de sus fun · ciones puede ser diferente. No muestran similitud de secuencias o estructurales con las enzimas procaríóticas. Casi todas las eucariotas contienen una sola enzima topoísomerasa L que se requiere tanto para el movimiento del triplere de replicación como para relajar las superhélices generadas por la tramcripción. Se requiere una enzima topoisomerasa ll para desenlazar 1os cromosomas después de la replicación. Se ha señalado a otras topoisomerasas individuales en las actividades de recombinadón y reparación.

480

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y especifica de sitio

• Las topoisomerasas de tipo I actúan al formar un enlace covalente con uno de los extremos rotos, mover una cadena alrededor de la otra y, después, transferir el extremo de enlace al otro extremo roto. los enlaces se conservan y, en consecuencia, no se requiere aporte de energía. La acción que comparten todas las topoisomerasas es enlazar un extremo de cada cadena rora a una molécula de tirosina en la en.zima. Una enzima de tipo I se une a una sola cadena rota; una enzima de tipo II se u ne a un extremo de cada cadena rota. Las topoisomerasas se subdividen en grupos A y B, si el enlace se hace con un fosfaw 5' o un fosfato 3'. El uso del enlace transitorio fosfodiéster-tirosina sugiere un mecanism o para la acción de la enzima; transfiere un enlace fosfocliésrer del DNA a la proteína, manipula la estructura de una o ambas cadenas de DNA y, después, reúne los enlaces en la cadena miginal. Las enzimas de E. coli son todas de tipo A y utilizan enlaces con el 5' fosfato. Éste es el patrón general para las bacterias, donde casi no hay topoisom erasas de tipo B. Los cuatro posibles tipos de topoisomerasas (lA, lB, IIA y HB) se encuentran en eucariotas. En la se incluye un modelo para la acción de la topoisomerasa IA. La enzima se une a una región donde el DNA dúplex se separa en sus cadenas constitutivas ~ La enzima rompe entonces una cadena, jala la otra hacia la brecha y luego sella la brecha. La transferencia de enlaces del ácido nudeico a la proteína explica cómo la enzima puede actuar sin necesitar de ningún aporte de energía. No ba habido hidrólisis irreversible de enlaces; su energía se ha conservado dura me las reacciones de transferencia. El modelo está respaldado por la estructura cristalina de la enzima. La reacción cambia el número de enlace en pasos de una unidad. Cada vez que una cadena pasa por la rotura en la otra hay un ~L de+ l. La figura ilustra la actividad enzimáLica en términos del movimiento de las cadenas individuales. En una molécula superenrollada libre, la posibilidad de intercambio de W y T debería permitir que el cambio de número de enlace tuviera lugar por un cambio de +1 en ~W, es decir, un giro menos del superenrollamiento negativo. La reacción es equivalente a la rotación ilustrada en la parte inferior de la Figura 19.21. con la restricción de que la enzima limita la reacción

Las cadenas dúplex de DNA son puestas en aposición

~

La cadena dúplex no rota se hace pasar a través de los extremos de la rotura

Se sella la rotura y la enzima libera el DNA

ligaclura /liberadón, cuando los extremos se reúnen y se liberan las cadenas dúplex de DNA. Éste es el motivo por el que inhibir la actividad de la enzima uifosfacasa de adenosína produce un "complejo susceptible de escisión " que contiene DNA roto. Una consecuencia formal de la transferencia de dos cadenas es que el nümero de enlace siempre cambia en múltiplos de dos. La actividad de topoisomerasa ll también permite, en ocasiones, introducir o resolver círculos dúplex encadenados y moléculas anudadas. Es probable que la reacción Iepresente un reconocimiento inespecífico del DNA dúplex, donde

la enzima se une a cualqu ier segmento de dos cadenas que cruce entre ambas. La hidrólisis de ATP se puede usar para impulsar a la enzima a pasar por los cambios de conformación que proveen la fuerza indispensable para empujar una cadena dúplex de DNA a través de esa rotura hed1a en la otra. Como resultado de La topología del DNA superenrollado, la relación de los segmenros cruzados permite retirar superhélices de los drculos con superenrollamiento positivo o negativo.

La girasa funciona por La inversión de hélice Concepto principal

las topoisomerasas de tipo II pueden pasar un DNA dúplex por una rotura de cadena doble en otra dúplex.

a un paso de cadena individual por episodio. (Por el conrrario, la introducción de una hendidura en tma molécula superenrollada permire la rotación de 1a cadena libre para aliviar tOda la tensión con las rOladones múhiples.) La topoísomerasa de tipo I también puede pasar un segmento de un DNA de una cadena a [ravés de otro. Esta reacdón de p aso d e un a sola cadena puede introdudr nudos en el DNA y encadenar dos moléculas circulares, de manera que se conecten como eslabones. No se comprenden los usos (si los hay) que estas reacciones rienen in vivo . Las topoisomerasas de tipo I1 en general relajan tanto superhélices negativas como positivas. La reacción requiere ATP, con hidrólisis de t.ma molécula por ~Cada episodio catalítico. Como se ilustra en , la reacción es mediada por la rotura de una cadena doble dentro de un DNA doble. La doble cadena es escindida, con un peldaii.o de cuatro bases entre los extremos, y cada subunidad de la enzima dimérica se une a un extremo rotO que hace protrusión. Después se hace pasar otra región dúplex por la rotura. Se utiliza el ATP en el siguiente paso de re-

• la girasa de E. coli es una topoisomerasa de tipo II que usa la hidrólisis del ATP para proveer la energía necesaria a fin de introducir superhélices negativas en el DNA.

La girasa de DNA bacteriana es una topoisomerasa de tipo IT que üende a introducir superhétices negativas en una molécula circular cerrada, relajada. La girasa de DNA se une al DNA circular dúplex y lo superenrolla de manera progresiva y catalítica, al tiempo que continúa introducíendo superhélices a la misma molécula de DNA. Una molécula de girasa de DNA puede introducir - lOO superhé lices por minuto . La forma supcrenrollada de l DNA tiene una energía libre más alta que la forma relajada, y la energía necesaria para la conversión se obtiene de la hidrólisis del ATP. En ausencia de ATP, la girasa puede relajar superhélices negativas, no así las posit ivas, aunque a una velocidad >1 Oveces menor que la usada para introducir superhélices. La girasa de DNA en E. co/i es un tetrá mero constituido por dos tipos de subunidad, cada una de las cuales es diana de antibióticos (el usado con más frecuencia es el ácido nalidíxico, que actúa sobre GyrA, y la novobiocina, que actúa sobre GyrB). Los fármacos inhiben la replicación, lo que sugiere 19;1 S la girasa funciona por la inversión de hélice

481

C) ¡

QCX) (+)

Estabiliza el nodo positivo con giros compensadores

(-)

t

ceo t 000 (-)

Rompe un segmento

posterior

Resella la rotura en el lado frontal

(-)

------------------~

La girasa de ONA puede introducir superhélices negativas en el DNA dúplex al invertir una superhélice positiva.

que la girasa de DNA es necesaria para que proceda la síntesis de DNA. Las mutaciones que confieren resistencia a los antibióticos idenrifican tos loci que coctifican las subunidades. La girasa se une a su sustrato de DNA alrededor del exterior del tetrámero de proteínas. La girasa protege -140 bp de DNA de la digestión por parte de la nucleasa del micrococos. En la se ilustra el modelo de inversión d e signo de la acción de la girasa. La enzima se une al DNA en una con figuración cruzada y eq uivale a una superhélice pos itiva. Ello induce una superhélice negativa de compensación en el DNA no unido . La enzima rompe, entonces, la doble cadena en el cruce de la superhélice positiva, pasa a través de la otra cadena dúplex y sella la rotura . La reacción invierte de manera directa el signo de la superhélice: se ha convertido de +l güo a -1 giro. Así. el número de enlace ha cambiado por 6L = -2, lo que cumple con la demanda de que todos los episodios con un paso de doble cadena deben cambiar el número de enlace por un múltiplo de dos. La girasa libera, después, uno de los segmentos de cruce de la superhélice unida (ahora negativa); esto pem1ite que los giros negativos se redistribuyan por el DNA (corno un cambio en T, W, o ambas) y el ciclo vuelve a iniciarse . El mismo tipo de manipulación topológica se encarga de los encadenamientos y el anudado. 482

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y específica de sitio

Al liberar la superhélice invertida, la conlormación de la girasa cambia. Para que la enzima inide otro ciclo de supereruollamiento debe restablecerse su confotmación original, proceso que se denomina reca mbio e n zirná tico. Se cree que lo impulsa la hidrólisis del ATP, porque la susútución del ATP por un análogo que no puede hidrolizarse permite que la girasa introdu7ca sólo una inversión (- 2 superhélices) por sustrato. Así, la enzima no necesita ATP para La reacdón de superenrollamiento, pero sí para realizar un segundo ciclo. La novohiocina interfiere con las reacciones dependientes de ATP de la girasa al impedir que el ATP se una a la subunidad B. La reacdón de relajación independiente del ATP es inhibida por el ácido na lidíxico, lo que implica a la sub unidad A en la reacción de rotura y re unión. El tratamiento de la girasa con ácido nalidíxico permite alDNA recupera rse en fo.rma de fragmenLos genera dos por u na escisión por etapas a través de la cadena dúplex. Todos Jos extremos poseen un grupo 3'-0H libre y una extensión de una sola cadena de cuatro bases en el extremo s· unida en forma covaleme a la subunidad A. El enlace covalente conserva la energía del enlace fosfato; ésta se puede usar para impulsar la reacción de sellado, que explica porqué la girasa puede presentar relajación sin ATP. Los sitios de escisión son bastante específicos y se presentan cerca de una vez cada 100 bp.

lE

La recombinación especializada involucra sitios específicos

Conceptos principales • La recombinación especializada comprende una reacción entre sitios específicos que no tienen que ser homólogos. • El fago 'A. se integra at cromosoma bacteriano por recombinación entre un sitio del fago y et sitio att en el cromosoma de E. co/i. • El fago se escinde del cromosoma por recombínación entre los sitios en el extremo del profago lineal. • El gen int del fago A. codifica una integrasa que cataliza la reacción de integración.

La recombinación especializada implica una reacción entre dos sitios específicos. Las longitudes de los sitios diana son cortas y por lo general de l 4 a 50 bp. En algunos casos los dos sitios tienen la ntisma secuencia, pero en otros no son homólogos. l¿ reacción se usa para insertar un fago libre de DNA en el cromosoma bactetiano o extirpar un fago de DNA integrado del cromosoma, y en ese caso las dos secuencias recombinantes son diferentes entre

sí. También se usa antes de la división para generar cromosomas drculares monoméricos a partir de un dímero, que se ha creado por un suceso de recombi:lación generalizada (véase la sección 17. 7, la segregadón cromosómica puede requerir recombinación espedfica de sitio). En este caso las secuendas de recombinación son idénticas. las enzimas que catali7an la recombjnación específica de sitio en general se denominan recombinasas y hasta ahonl se conocen más de 1 OO. las que panidpan en la integración del fago o se relacionan con estas emlmas también se conocen como Camilla Je inregrasas, de la que son miembros importantes el prototipo lnt del fago A., el Cre del fago Pl y la enzima FLP de las kvaduras (que cata liza una inversión cromosómica) . El Iago A. ilustra el modelo clásico de r ecombinadó n específica de sitio. la conversión del DNA A. en sus diferentes formas de vida implica dos tipos de sucesos. El patrón de la expresión génica es regulado como se describe en el Capítulo 14, Estrategias de los fagos. La situación física del DNA es diferente en los estados lisogénico y litico: • En el estilo de vida lítico, el DNA A. se encuentra como molécula circular independjente en la bacteria infectada. • En el estado lisogénico, el DNA del fago es pane integral del cromosoma bacteriano (Uamado profago). La transición entre estos estados implica una recombinadón específica del sitio: • Para ingresar al estado üsogénico. el DNA Hbre debe insertarse en el DNA del hospedador, proceso llamado integración. • Para liberarse de la Jisogenia hacia el ciclo lítico, el DNA del profago debe Uberarse desde el cromosoma, lo que se llama escisión . la integración y la escisión ocurre n por la recombinación en loci espt:cífi.cos en los DNA bacteriano y de fago, llamados sitios de unión (att). El sitio de unión en e l cromosoma de la bacteria se llama atf en ta genética bacteriana. El locus se define por mutaciones que impiden la integración del A.; es ocupado por el profago A. en cepas lisogénicas. Cuando el sitio atf- sufre deleción en el cromosoma de B. coli, un fago A. infecrante puede establecer lisogenia por integración en ono punto, aunque la eficacia de la reacción es menor de O. 1% de la fre cuencia de integración en atf. Esta integración ineficaz tiene lugar en s itios de unión secu ndaria, que simulan secuencias att auténticas. Para describir las reacciones de integración, escisión o ambas, el sitio de unión bacteriana (atl~) se llama auB, constituido por los componemes de secuencia BOB '.El sitio de unión del fago allP consta de los componentes POP'. En la se

esquemari2a la reacción de recombinación entre estas dos sitios. La secuencia O es común a atlB y attP. Se denomina secuencia central y es asiento del episodio de recombinación. las regiones flanco B, B ·y P, P' se conocen como brazos; cada una tiene diferente secuencia. El DNA del fago es circular por lo que el suceso de recombinación lo inserta en el cromosoma bacteriano como secuencia lineal. El profago está limitado por dos nuevos ciclos att: los productos de recombinación llamados attL y atrR. Una consecuencia importante de la consrltudón de los ciclos atl es que las reacciones de integración y escisión no involucran al mismo par de secuencias reactivas. La imegraciún requiere el reconocimiemo entre attPy attB, en tantO la escisión requiere el reconocimiento enlre auL y attR. El carácter direccional de la .recombinación espedfica de sitio es controlado por la identidad de los sitios recombinantes. El episodio de recombinación es reversible, pero prevalecen condiciones diversas para cada dirección de la reacción. Ésta es una característica importante en la vida del fago, porque ofrece un medio para asegurar que un suceso de integración no se revierra de manera inmediata por una escisión y viceversa. La dífcrencia en los pares de sitios que reaccionan en la integración y la escisión se refleja por una discrepancia en las proteínas que median las dos reacciones . • La integración (attB x attP) requiere el producto del gen int del Cago que codifica una

F

~o

tlo DNA attP POP'

BOB'

DNA bacteriano

attB

La integración requiere lnt e IHF

~1 La escisión requiere t lnt, Xis e IHF

t

_ _ __.B¡¡.;OP' attL

Profago

POB' attR

El ONA del fago circular se convierte en un profago integrado por una recombinación reciproca entre attP y attB; el profago se escinde por la recombinación recíproca entre attL y attR. 19.16 la recombinación especializada implica sitios especificas

483

enzima imegrasa, así como ltna proreína bacteriana llamada factor de integración del hospedador (IHF). • La esdsión (attL >< attR) requ iere el producto del gen xis del fago además de InL y IHF. Por lo tanto, se requieren Int y IHF para ambas reacciones. El xis tiene una participación importante en el control de la dirección; se requiere para la escisión, pero jnhibe la integración. Un sistema s imilar. pero con requerimientos algo más sencillos para los componentes de secuencia y proteínico se encuentran en el bacteriófago Pl. La recombinasa Cre codificada por el fago cataliza una recombinación entre dos secuencias diana. A diferencia del fago A., para el que las secuencias de recombinadón son diferentes, en el fago P 1 son idénticas. Cada una consta de una secuencia de 34 bp de longitud llamada loxP. La recombinasa Cre es suficiente para la reacción; no se requieren proteínas accesorias. Como resultado de su simplicidad y eficacia, lo que ahora se conoce como sistema Cre/ lox se ha adaptado para su uso en cé lulas eucarióticas, donde se ha convertido en una de las técnicas estándar para llevar a cabo la recombinación específica de sitio.

E

La recombinaci ón específica de sitio comprende rotura y reunión

Concepto principal • Se hacen escisiones a intervalos de 7 bp en los genes attB y attP y los extremos se unen en forma cruzada.

Los sitios ait tienen distintos requerimientos de se cuencia y el attP es mucho más grande que actB. La función de attP requiere un segmentO de 240 bp, en tamo que la función de attB la puede ejercer el fragmento de 23 bp que se extiende de -11 a +11. donde hay sólo 4 bp a cada lado de la porción central. La disparidad en sus tamaños sugiere que attP y attB tienen diferentes participaciones en la recombinación, donde attP ofrece la información adicional necesalia para disringuirla de attB. ¿Prosigue la reacción por un mecanismo concertado donde se cortan e imercambian de manera simultánea las cadenas en attP y attB? O, ¿se inrercambian las cadenas, un par a la vez, donde el prLmero genera una unión Holliday y el segundo ciclo de hendidura y ligadura ocurre para liberar la estructura? Las alternativas se incluyen en la La reacción de recombinación se ha detenido en etapas intermedias mediante el uso de "sustratos suicidas", donde la secuencia central presenta hen-

484

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y específica de sitio

attP

atta

Intercambio de secuencias Corte conce1iado

1 \

\ 1 ¿Avanza la recombinación entre attP y atE por el intercambio secuencial o el corte concertado?

diduras, lo que interfiere con el proceso de recombinaci6n y permite identificar las moléculas donde comenzó dicho proceso pero no ha concluido. La ~ estructuras de estos productos intermedios sugierer que pueden ocurrir intercambios de cadenas única~ de manera secuencial. muesrra El modelo ilustrado en la que si los sitios attP y attB son cada uno asiento d~: la misma escisión escalonada, podrían disponerst de los extremos complementarios de una sola cadena para hibridación cruzada. La distancia entre lm puntos de entrecruzamiento A. es de 7 bp, y la reacción genera extremos 3'-fosfato y 5'-0H. La reacción se muestra, para fines de simplicidad, como generadora de superposición de extremos de una sola cadena que se hibridan, pero que en real idad ocurre por un proceso similar a la recombinación Uustradá en la Figura 19.6. Las cadenas correspondientes d.: cada estructura dúplex se cortan en la misma posición. se intercambian los extremos 3' libres entre cadenas dúplex, la rama emigra una distancia debp a lo largo de la región de hornologia y, después la estructura se resuelve con el corte del otro par de cadenas correspondientes.

La recombinación específica de sitio simula la actividad de la topoisomerasa Conceptos principales • Las integrasas tienen relación con las topoisomerasas y la reacción de recombinación se parece a la acción de la topoisomerasa, excepto que las cadenas con hendidura de estructuras dúplex diferentes se sellan juntas.

Los DNA de fago y bacteriano se alinean

Las escisiones escalonadas llevan a un apareamiento cruzado

-

DNA de lago

GCTTTTTTATAC T AA CG AAAA AA T AT G ATT

GCTTTTT TA T ACT AA

--.0.0 A AA-A AATA T G A rr¡DNA bacteriano

Las uniones recombinantes se sellan para generar un DNA de profago integrado

GCT TT TTT AT ACTAA - , CGAAAAAA T AT GA T.,.;-- - -

G C T TT T T TATAC T AA C GAA AA AA T A. TGA

Las escisiones escalonadas en la secuencia central común de ottP y ottB permiten la reunión cruzada para generar uniones recombinantes recíprocas.

• La reacción conserva La energía al utilizar una tirosina catalítica en La enzima para romper un enlace fosfodiéster y enlazarse con el extremo 3' roto. Dos unidades enzimáticas se unen a cada sitio de recombinación y los dos dímeros hacen sinapsis para formar un complejo donde ocurren las reacciones de transferencia.

Las integrasas utilizan un mecanismo similar al de las ropoisomerasas de tipo l, donde se hace una ro tura en una cadena de DNA a la vez. La cliferenda es que La recombinasa vuelve a unir los extremos en forma cruzada, en tanto la topoisomerasa realiza la rotura, manipula los extremos y después vuelve a uni r los extremos originales. El principio básico del sistema es que se requieren cuatro moléculas de la recombinasa para cortar cada una de las cuatro cade nas de las dos dúplex que están recombinándose. La muestra la naturaleza de la reacción catalizada por una integrasa. La enzima es una proteína monomérica que tiene un sirio activo capaz de conar y ligar el DNA. La reacdón comprende el ataque de una tirosina en un enlace losfodiéster. El extremo 3' de la cadena de DNA se enlaza mediante una unión fosfodiéster con una tirosina en la enzima, lo que deja un extremo 5' h idroxilo libre. Dos unidades cnzimáticas se unen a cada uno de los sitios de recombinadón. En ellos, sólo una de

las unidades ataca al DNA. l.a simetría del sistema asegura que se rompan las cadenas complementarias en cada sitio de recombinación. El extremo 5'-0H en cada sitio ataca al enlace 3'-fosfotirosina en el otro sitio, lo que genera una unión Holliday. la estruclllra se resuelve cuando las otras dos unidades enzimáticas (que no habían pa rticipado en el primer ciclo de rowra y reunión) actúan sobre otro pa r de cadenas complementarias. Las intcracciqncs sucesivas logran un intercambio conserva dor de cadenas, dond e n o hay delecioncs o adiciones de nucleó ridos en el si tio de intercambio y tampoco se necesita un aporte de energía. El enlace 3' fosfotirosina transitorio entre la proteína y el DNA conserva la eJ1ergía del enlace fosfodiéster roto. La muestra la reacción intermedia con base en la estructura cristalina. (Fue posible el atrapamiento del producto intermedio mediante un "'sustrato suicida", que consta de una cadena dúplex de DNA sintética donde falta un enlace fosfodiéster, de manera que el ataque de la enzima no genera un extremo 5'-0H libre). La estructura del com plejo Cre-lox muestra dos moléculas de Cre, cada una unida por una longitud de 15 bp al DNA. El DNA es doblado casi 100° en el centro de simetría. Dos de esos complejos se ensamblan en forma amiparalela para constituir una estructura de proteína tetramérica unida a dos moléculas de DNA en la sin apsis. El intercambio de cadenas tiene lugar en

19.18 La recombinación específica de sitio simula la actividad de la topoisomerasa

485

1. Dos subunidades enzimáticas se unen a cada DNA dúplex Tir 3'

Tir

5' 3'

Ttr Tlr

..... 5' 3' 5'

2 . Cada cadena doble se escinde en una cadena para generar un enlace P-Tir y un extremo -OH

5'

Tir

HO

3"""~

5'

3'

Tir

Tlr

- 5'

5'

3'

3,._,

Tir

- 5'

Un complejo de recombinación en sinapsis de

3 . Cada hidroxilo ataca el enlace Tir-tosfato en la otra cadena doble

5'

Tir

3~

5'

3'

Tir Tir

3"

E

5'

4. Las reacciones se repiten en las otras subunidades para unir las otras cadenas

5' 3'=

5' 3"""

-

Tir

1

r Tlr

_ 3' F"' 5'

Tir

\:=

Tir

3' 5'

las integrasas catalizan la recombinación por un mecanismo similar al de las topoisomerasas. Se hacen cortes escalonados en el ONA y el extremo 3' fosfato se enlaza de manera covalente con una tirosina en la enzima. El grupo hidroxilo libre de cada cadena ataca, entonces, el enlace P-Tir de la otra cadena . El primer intercambio que se muestra en la figura genera una estructura Holliday. La estructura se resuelve cuando se repite el proceso con el otro par de cadenas.

una cavidad cenu·al de la estructura de la proteina que contiene las seis bases centrales de la región de en rrecruzamiento. La tirosina que se encarga de escindir el DNA en cualquier sitio mirad panicular es provista por la subunidad enzimática que se une a dicho sitio . Éste es el llamado corte en configuración cis, válido también para la integrasa Int y la recombi.nasa XerD. No obstante, la recombinasa FLP produce escisión en configuración trans. lo que i.mpUca un mecanismo donde la subunidad enzimática que proporciona la tirosina no corresponde a la subunidad unida a ese silio mirad, sino más bien se trata de una de las otras subunidades. 486

de enzimas unido en cada sitio mitad. Dos de los cuatro sitios activos están en uso y actúan sobre cadenas complementarias de los dos sitios de DNA.

-= 5' 3'

Tlr

loxA tiene un tetrámero de recombinasas Cre, con un monómero

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y específica de sitio

La recombinación 'A ocurre en un intasoma

Conceptos princi pale~ • La integración A. tiene lugar en un gran complejo que también incluye a la proteína 1HF del hospedador. • La reacción de escisión requiere Int y Xis y reconoce los extremos de DNA del profago como sustratos.

A diferencia del sistema de recombinación Crellox que requiere sólo la enzima y los dos sitios de recombinación, la recombinación del Cago A ocurre en una gran estructura y tiene diferentes componentes para cada dirección de la reacción (integración versus escisión). Se requiere una proteína del hospedador llama da lHF para la integración y escisión. La IHF es una proteína de 20 kD con dos subunidades diferentes que son codificadas por Jos genes himA y himD. La JHF no es una proteína esencial en E. coli y no se requiere para la recombinación bacteriana homóloga. Es una de las varias proteínas con capacidad de cubrir con DNA una superficie. las mutaciones en los genes him impiden la recombinación A espe cífica de sitio y pueden suprimirse con mutacione5 en 'Aim, lo que sugiere que IHF e Int interactúan. Se puede lograr la re combinación específica de sitio por Int y IHF in vitro. La reacción in vitro requiere superenrrollamienw en attP, no así en attB. Cuando se realiza la reacción in vitro entre dos moléculas de DNA superenro llado, casi todo el superen.rollamiemo se conserva en los productos . Así, no pu ede haber productos

Porción central ·140·120·100·80 ·60·40 ·20 1 ,. ' ~~

~

~

lnt

IHF

r '

~

~ ~

" .

. ~

~

20 40 60 80

~

CAGCTTTT_A_ GTCGAAAA

TAAGTTG ATTCAAC

t Sitio de unión de In!

r

~

1

Sitio de unión de lnt

La lnt y la IHF se unen a diferentes sitios en attP. Las secuencias de reconocimiento de Int en la región central incluyen los sitios de corte.

intermedios libres donde podría haber rotación de las cadenas. Ésle fue uno de los primeros indicios de que la reacción prosigue a través de una unión Holliday. Hoy se sabe que las reacciones proceden por el mecanismo habitual de esta clase de enzimas, el cual tiene relación con el mecanismo de la topoisomerasa 1 (véase la sección 19.18, La recombinación especifica de sitio simula la actividad de la topoisomerasa). La Int tiene dos diferentes modos de unión. El dominio termina l C actúa como la recombinasa Cre. Se une a sitios invertidos en la secuencia central y se coloca para realizar las reacciones de escisión y ligadura de cada cadena en las posiciones Uustra · das en la . El dominio terminal N se une a sitlos en los brazos de attP que tienen una diferente secuencia de consenso. Esta unión se encarga de la agregación de subunidades al intasoma. Es probable que los dos dominios se unan de manera simultánea al DNA, lo que acerca los brazos de attP a la porción cemral. La lHF une las secuencias de -20 bp en attP. Los sitios de unión están cercanos a aquellos donde se adhiere Tnt. Xis se une a dos sitios cercanos entre sí en attP, de manera que la región protegida se extiende sobre 30 a 40 bp. Juntos, lnt, Xis e IHF cubren casi LOdo el attP. La unión de Xis cambia la organización del DNA, de manera que se torna inerte como sustrato para la reacdón de integración . Cuando Int e IHF se unen a allP generan un complejo donde todos los sitios de unión se llevan juntos hacia la superficie de una proteína. Se requiere supcrenrollamiento de attP para la formación de este intasorna. Los únicos sitios de unión en attB son los dos Inr en la parte central. No obstante, Int no se une de manera directa a attB en forma de DNA libre. El intasoma es el intermecliario que

Múltiples copias de la proteína Int pueden organizar a attP en un intasoma, el cual inicia la recombinación especifica de sitio al reconocer attB en el DNA libre.

captura a atcB, como se inclica esquemáticamente en la De acuerdo con este modelo. el reconocimiento inicial entre attP y attB no depende de manera directa de la homología del DNA, sino que en su lugar, está determinada por la capacidad de las proteínas Int de reconocer ambas secuencias att. Los dos sitios att se unen, emonces, en una orientación predeterminada por la estructura del intasoma. La homología de secuencia se vuelve importante en esta etapa, cuando se requiere para la reacción de intercambio de cadenas. La asimetría de las reacciones de integración y escisión se muestra por el hecho de que Int puede formar un complejo similar con attR sólo si se agrega Xis. Este complejo puede aparearse con un complejo condensado que Int forma en attL. No se necesita IHF para esa reacción. Una diferencia significativa entre las reacciones de integración/escisión A. y de recombinación catalizadas por Cre o Flp es que las reacciones catalizadas por Int unen las secuencias reguladoras en los brazos de los sitios diana, doblando el DNA y permitiendo interacciones entre los süios brazo y central, que llevan cada reacción a su conclusión. Es por esto que cada reacdón A. es irreversible, en tanto la recombinadón catalizada 19.19 La recombinación A. ocurre en un intasoma

487

por Cre o Flp es reversible. Las estru cturas cristali nas de los tetrámeros A.-Tnt muesuan que, al igual que otras recombinasas, el tetrámero tiene dos subunidades activas y dos inactivas que cambian sus lundones durante la recombinación. Las interacciones alostéricas desencadenadas por la unión al brazo controlan ]as transiciones estructurales en el tetrámero qlle impulsan la reacción. Gran parte de la complejidad de la recombinación especifica de sit.io puede deberse a la necesidad de regular la reacción, de manera que la integración ocurra de manera preference cuando un virus ingresa al estado lisogénico, en tanto se prefiere la escisión cuando el profago está emrando al ~ltio lítico. Mediante el control de Las cantidades de lnt y Xis. ocurrirá la reacción apropiada.

E

Las levaduras pueden cambiar loci si lentes y activos por el tipo de apareamiento

Conceptos principales • El locus MAT del tipo de apareamiento en levaduras porta el genotipo MATa o MATa.. • Las levaduras con el alelo dominante HO cambian su tipo de apareamiento con una frecuencia de -10· 6• • EL alelo en MAT se denomina cartucho activo. • Hay también dos ca1tuchos silentes, HMLa. y HMRa. • Ocurre cambio si MATa es sustituido por HMLa. o MATo. es sustituido por HMRa. La levadura S. cerevisiae puede propagarse en estado haploide o diploide . La conversión entre esos estados ocurre por apareamiento (fusión de células haploides para formar una diptoide) y esporulación (mciosis de diploides para producír esporas haploides). La posibilidad de panicipar en estas actividades la determina el tipo de apareamiento de la cepa. que puede ser a o a . las células haploides de ri.po a pueden aparearse sólo con las células haploides de tipo a para generar células diploides de tipo a/a. Las células ctiploides pueden presentar esporulación para regenerar esporas haploidcs de cualquiera de esos tipos . La conducta de apareamiento está detertnilJada por la información genética presente en ellocus MAT. Las células que ponan el alelo !VLATa en este locus son de tipo a ; de manera similar, las células que portan el alelo MATa. son de tipo a. El reconocimiento entre células con un tipo de apareamiento opuesto se logra mediante la secreción de fetomonas: las células a seo·etan el factor po lipéptido pcqueiio a; las células a secretan el factor a. Una célula de un tipo de apareamiento porta un recep tor de superficie para la feromona del tipo opuesto. 488

CAPÍTULO 19 Recombinaci6n homóloga y específica de sitio

Cuando una célula a y una célula a se encuentran. sus feromonas actúan en sus receptores para detener a las células en la fase G l del ciclo celular y surgen varios cambios morfológicos. Cuando el apaream iento se logra, a la detención del ciclo celular le sigue la fusión ce lular y nuclear para producir una célula diploide a/a. El apareamiento es un proceso simétrico que se inicia con la interacción de ferornonas secretadas por un Lipo celular con el receptor que porta el otrc• ripo celular. Los únicos genes que se requieren de manera exclusiva para la vía de respuesta en uro tipo de apareamiento particular son los que codifican los receptores. La interaccion factor a-receptor o factor a-receptor activa la misma vía de respuesta. Las mutaciones que eliminan pasos en la vía comúu tienen los mismos efectos en ambos tipos celu lares. La vía consta de una cascada de transducción de señal que conduce a la síntesis de productos que hacen los cambios necesarios en la morfología celular y la expresión g~nica para que renga lugar e! apareamiento. Gran parte de la ín[ormactón acerca de la vía del tipo de apareamiento en las levaduras se deduj o a partir de las propiedades de las mutaciones que elimu1an la capacidad de las células a, rx, o ambas. de aparearse. Los genes identificados por tales mutaciones se llaman STE (por estéril). Las mutaciones en !os genes para las feromonas o los receptores son específicas de los tipos de apareamiento individuales. en tanto las mutaciones en los otros genes STE eliminan el apareamiento en ambas célu las, a y eL Esta situación se explica por el hecho de que los episodios que siguen a la interacción del factor con el receptOr son idénticos para ambos tipos. Algunas cepas de levaduras tienen la capacidad notoria de cambiar los tipos de apareamiento. Estas cepasponan un aleloHO dominante y cambian con frecuencia su tipo de apare<~micnto . .hasta una vez en cada generación. Las cepas con el a lelo recesiv0 HO tienen Uli tipo de apareamiento estable que está sujeto a cambios con una frecuencia de - 1Q'-9. La presenda de HO hace que cambie el genotipo de la población de levaduras . Sin importar el tipo inicial de apareamiento, en unas cuantas gene rado· nes hay un gran número de células con ambos tipos de apareamiento, que conducen a la formación de cliploides MA TaiMA Taque constiruyen la población. La producción de diploides estables a panír de una población ha.ploide puede considerarse la razón de ser del cambio. La existencia del cambio sugiere que todas las células tienen la información porenciéil necesaria para ser Nf.ATa o MATa. pew expresan sólo un lipo. ¿De dónde procede la información para cambiar los tipos de apareamiento? Se necesitan dos loci para

= cambio. Se requiere HMLcx para el cambio que ...a lugar al tipo MATcx; se necesita HMRa para el :ambio que origina el tipo MATa . Estos lod yacen -:n el mismo cromosoma que pona MAT. El HML ~stá bastante a la izquierda, el HMR está bastante =la derecha. El modelo de cartuch o para el tipo de apareactienro se ilusua en la . Propone que :AT tiene un cartucho activo para los tipos a o a . "\.mbos, HML y HMR. tienen cartuchos silentes. En ;eneral, HMT. porta un canucho a, en tamo HMR <ma uno a . Todos los cartuchos contienen infor-:lación que codifica el tipo de apareamiento, pero el ..:arrucho activo sólo se expresa en MAT. El cambio _ente en HML o HMR tiene nutación, el cambio introduce un alelo mutante en ~~ locus MAT. La copia mutanre en HML o HMR per'"'1anece durante un número indefinido de cambios. :omo en la transposición replicativa, el elemento ~ona dor genera una nueva copia en el sito recepwr ~ entras se mantiene a sí mismo intacto. El cambio del lipo de apareamiemo es un su:eso djrigido, donde hay un solo recepLOr (MA7) ero dos donadores potenciales (HML y HMR). El :ambio suele comprender la sustitución de MATa ""1()r la copia de HMLcx o la de MATa por la copia de i.\1Ra . En 80 a 90% de los cambios, el alelo MAT :-s sustiwido por uno del tipo comrario, lo que está Jeterminado por el fenotipo de las células. Las cé!.!las con un fenolipo a eligen de manera preferente ~ fiML como donador; las células con el fenotipo ex refieren elegir a HMR. Varios grupos de genes participan en el establej miemo y cambio de tipo de apa reamiento. Adenás de los genes que determinan de manera directa :1tipo de apareamiento, incluyen los indispensables ·ara reprimir cartuchos silentes, cambiar el tipo de _pareamicnto o ejecutar las funciones involucradas :-n el apareamiemo. Cuando se comparan las secuencias de los car.Jchos sitemes (MHLo. y HA1R.a ) con las de los dos ·' pos de cartucho activo (MATa y MATa), se pue...en definir las secuencias que determinan el tipo .e aparcamiento. En la se resume la rganización de Jos loci del tipo de apareamiento. :ada carrucha contiene secuencias en común que . anquean una región central que ctifiere en los tipos

Cartucho silente Cartucho activo Cartucho silente HMLa.

1

-

HMRa

MATa

t

Frecuente

Ocurre cambio del tipo de apareamiento cuando un cartucho a sustltuye a un cartucho a

! HMLa.

HMRa

MATa.

t

!

Frecuente Ocurre cambio del tipo de apareamiento cuando un cartucho a sustituye a un cartucho a

HMLu.

HMRa

t

Raro

T

No ocurre ningún cambio del tipo de apareamiento cuando un cartucho del mismo tipo sustituye al cartucho activo M.ATa HMRa

!

HMLa

Ocurren cambios en el tipo de apareamiento cuando cartuchos silentes sustituyen a cartuchos activos de genotipo opuesto; cuando ocurren transposiciones entre cartuchos iguales, el tipo de apareamiento se mantiene inalterado.

los cartuchos InactiVos no sintetizan ANA

Ya

HMLtt.

HMRa

Los cartuchos activos sintetizan productos específicos del tipo de apareamiento MATo.

Yo.

RNAm CJ.2

~~~~~--

RNAm al MATa

Ya

RNAma1

500

1000

1500

2000

bp

Los cartuchos silentes tienen las mismas secuencias que los cartuchos activos correspondientes, excepto por la ausencia de las secuencias de flanco extremas en HMRa. Sólo la región Y cambia entre los ti pos a y o:.

19.20 las levaduras pueden cambiar locí silentes

y activos por el tipo de apareamiento

489

a y a (llamados Ya o Ya). A cada lado de esta región,

las secuendas flanqueadoras son casi idénticas, aunque más cortas en HMR. El cartucho activo enMAT se transctibc desde un promotor en la región Y.

E

El locus MAT codifica proteínas regu ladoras

Conceptos principales • En células haploides de tipo ex, el MATa activa tos genes requeridos para especificar las funciones ex indispensables para el apareamiento y desactiva los genes requeridos para el tipo de apareamiento a. • En las células de ti po a, no se requiere MATa . • En células diploides, los productos de al y CJ2 cooperan para reprimir genes espedficos de células haploides.

La fu nción básica del locus MATes controlar la expresión de los genes de feromonas y recep tores, así como otras funciones comprendidas en el apareamiento. El MATa codifica dos proteínas, al y a2. El MATa codifica una sola proteína, a l. Las proteínas a y a controlan de manera direcra la transcripción de varios genes diana; actúan por regulación positiva y negativa. Lo hacen de manera independiente en las células haploides y de manera conjunta en las diploides. Sus interacciones se resumen en el cuadro del lado derecho en la , en términos de tres grupos de genes diana: • Los genes específicos a se expresan de manera constitutiva en células a; están reprimidos en las células a. Los genes específicos

WWElilalll.L

~

a incluyen el gen estructural del factOr c. STE2, que codifica el recepror del factor Así, el fenotipo a se vincula con la dispc ción para reconocer la feromona produc por el tipo de apareamiento opuesto. • Las funcione!~ específicas a se inducen : células a, pero no se expresan en las céln a . Incluyen el gen estructural del facto; y el gen del reccpwr del factor a, STE3. =. nuevo, la expresión de la feromona de tipo se vincula con la expresión del recepi de la feromona del tipo contrario. • Las funciones haploides específicas inclu~'~ los genes indispensables para la transcr. ción de la feromona y los genes receptor:el gen HOque partidpa en el cambio y RJ,.: un represor de la esporu lación. Se expre~ de manera constitutiva en ambos tipos _ célu las haploides, pero están reprim idas e las diploides a /r:x. Como resultado, las fl:ciones específicas a y a también se manñ:: nen sin expresión en células diploides. Ahora se revisarán las funciones de los regul.: dores y sus dianas desde la perspectiva de las fudones de MA T expresadas en células de Jevadur.: haploides y diploides, como se señala en el esquec: del lado izquierdo de la Figura 19.35. Los tipos apareamiento a y a son regulados por diferente mecanismos: • En células haploides a , las funciones u apareamiento se expresan de manera cor.: tilutiva. Las funciones de Jos productos . . · MATa en la célula a (si las hay) se desconr

~

genes a Se desconocen sus funciones

t

MATa

HMLO'

..

e;;

.g e:

~

é

2'

al

.__)

no expresado

t

~ ~

lcr:..

reprimido

•

HMLa

lndúee functones de apareamiento ~

dlploide no expresado

constilutlvas

f!;

t

•

HMLa

e~presado

Cl)

Reprime al genes espec!flcos a 2 haploides

Cl:;

constitutivo no

haplold( HMRa

l

Q:

a

genes a funciones hapfoides

HMRa

L.

a2 a haploldE Reprime funciones de apareamiento a

,,.,mido

!'"''"'""

constitutivas

En las células diploides las proteínas al y o.2 colaboran para reprimir las funciones específicas haploides. En las células haploides a las funciones de apareamiento son constitutivas. En las haploides ex, la proteína cx2 reprime funcio nes de apareamiento a, en tanto que la protefna cxl induce funciones de apareamiento ex. 490

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y específica de sitio

cen. Pueden requerirse sólo para reprio1ir las funciones de células haploides en las células diploides. • En las células haploides a, el producto al activa genes específicos a cuyos productos son necesarios para el apareamiento de tipo a. El producto a2 reprime los genes encargados de producir el tipo de apareamiento a mediante la unión a u.na secu.encia de operador localizada en sentido ascendente respecto de los genes diana. • En células diploides, los productos a l y a2 cooperan para reprimir genes haploides específicos. Se combinan para reconocer una secuencia de operador diferente de la diana para sólo a2. La posibilidad de que las proteínas a2, a l y al regulen la rranscripción depende de algunas interacciones interesantes de las proteínas entre sí y con otras. El patrón del control génico en las células a, a y diploides se resume en la Una proteína llamada factor de transcripción del receptor de (eromonas (PRTF) (que es inespeáfica del tipo de apareamiento) participa en muchas de estas interacciones. La PRTF se une a una secuenda de consenso cona llamada caja P. La función de PRTF en la regu la ción génica puede ser bastante amplia, ya que se encuentran cajas P en una diversidad de ubicaciones. En aJgunos de estos sitios se requiere una caja P para activar aJ gen; en otros

loci, se necesita PRTF para la represión. Sus efectos pueden, por tanto, depender de otras proteínas que se unen en sitios cercanos a la caja P. Sólo PRTF puede activar los genes específicos de a, lo que es adecuado para asegurar su expresión en una célula haploide a. Los genes específicos a se reprimen en una célula a haploide por la acción combinada de la prmema a2 y PRTF. la proteína a2 contiene dos dominios. El dominio terminal C se une a elementos palindrómicos corros en los extremos de una secuenda de consenso operador de 32 bp. Sin embargo, la unión de este fragmento al DNA no causa represión. El dominio terminal N se necesita para la represión y se encarga de hacer contacto con PRTF. El sitio de unlón para PRTF es una caja P en el centro del operador. De hecho, a y PRTF se unen de manera colaboradora al operador. La expresión de genes a específicos requiere otra pequeña proteína llamada activador o:l, que tiene 175 aminoácidos de longitud. Las secuencias que actúan en configuración cis, que confiere transcripción a específica, tienen 26 bp de longitud y pueden ctividirse en dos panes. Las primeras 16 bp forman la caja P, donde se une PRTF; la secuencia adyacente de 10 bp forma el sitio de unión para o:l. El factor al se une sólo cuando PRTF está presente para unirse a la caja P. )l'inguna protema sola puede unirse a su caja blanco, pero jumas se pueden unir aJ DNA, al parecer como resultado de interacciones entre proteínas. ~[hl[i;(l¡i ~

¡..genes a especfficos

haploide a

genes a especfficos Genes desactivados: PRTF no puede unirse sin a1 PF!TF

PRTF activa a los genes de manera constitutiva PATF PATF CCATGTAATIACCCAAAAAGGAAATTTACATGG

TTTCCTAATTAGTNCNTCAATONCAG

a2 + PRTF reprimen genes específicos a N N

a'1 + PRTF activan genes diana

haploide a

a2

e

a2

e

PRTF PRTF

PRTF PRTF

CCATGTAATTACCCAAAAAGGAAATTTACATGG

a1

TTTCCTAATTAGTNCNTCAATGNCAG

a2 + a1 reprimen genes haploides especificas

...... diploíde ola

a2

a'1

"J a2

CCATGTNANTNNTACATGG

Las combinaciones de PRTF, al, o.1 y o.2, activan o reprimen grupos específicos de genes que corresponden al tipo de apareamiento de la célula.

l9.2l Ellocus MAT codifica proteínas reguladoras

491

Los genes específicos a. se desactivan en forma predeterminada en células haploides a porque en ausencia de la proteína a.2. el PRTF no puede unirse para activarlos. La proteína a.2 puede también colaborar con la proteína al. La combinación de estas proteínas reconoce a un operador diferente. El operador comparte las secuencias palindrómicas externas, y sólo a2 reconoce la secuenda, pero es más cono porque la secuencia entre ellas es difereme. La combinación al / a2 reprime los genes con este segmento en las células diploides. La principal reflexión que se deriva de estos resu ltados es que el fenotipo de cada tipo de célula (a o a haploide, o a / 0- diploide) está determinado por la combinación de proteínas a y a. que se expresan. Un aspecto es la distinción entre los fenotipos l1aploide y diploide; otro es la distinción entre los renotipos a y a haploide. Este último se extiende a la expresión de los genes correspondienres al tipo de apareamiento apropiado y la determinación de la dirección del cambio de tipo de apareamlenw (véase la Figura l 9.33). Las células MATa anivan un potenciador de recombína
Se reprimen los cartuchos silentes en HML y HMR Conceptos principales Los elementos silenciadores reprimen HML y HMR. • Los loci requeridos para mantener el silenciamiento incluyen SIR1-4, RAP1 y los genes de la histona H4. • Se necesita la unión de ORC (com plejo de reconocimiento del origen) a tos silenciadores para la desactivación.

El 11)apa de transcripción en el Figura 19.34 revela una característica intrigante: la transcripción de lvfATa o MATa se inicia dentro de la región Y. Sólo ellocus MAT se expresa; sin embargo. la mi!:.ma regjón Y está preseme en el carrucho correspondiente no transcrito (HML o HMR). lo que implica que la regulación de la expresión no se acompaña del reconodmiemo directo de algún sirio superpuesto al promotor. Un sitio fuera de los cartuchos debe distinguir HML y HMR de MAT.

El anáHsis de deleción muesrra que se necesitan los sitios a cada lado de HML y HMR para detener su expresión y se llaman silen ciadores . Los sitios del lado izquierdo de cada cartucho se llaman silencia492

CAPÍTULO 19 R.ecombinación homóloga y especifica de sitio

dores E y los del lado derecho silenciadores l. Est1 : sitios de control pueden funcionar a cierta distan e!: (hasLa 2.5 kb de un promotOr) y en cualquier orier.tación; actúan como potenciadores negativos (h' potenciadores son elementos distantes del promou : que activan la transcripción; véase la sección 24.15 Los potenciadores comienen elementos bidimensit nales que ayudan a la irticiación} . ¿Se puede encontrar la base del control de ·~ actividad del cartucho si se idenrifican los genes qu~. se encargan de mantener los cartuchos silentes? Se esperaría que los productos de esros genes actuase' sobre los silenciadores. Un análisis conveniente parz la mutación en tales genes lo proporciona el hech de que cuando una mutación permite a los cartuchos que en general están silentes en HML y HM. expresarse, se producen tanto funciones a como a de manera que las célttlas acrüan como diploidt:' MATa/MATa. Las mutaciones en varios locl suprimen el silencianúenro y llevan a la expresión de 1-IML y H.MF. Los primeros en descubrirse fueron los cuarro loeSIR (reguladores de la información silenres[si/ent i~­ formatíoll regulart,rsJ). Los cuatro loci de SIR de tip• silvestre son indispensables para mantener aHML ~ HMR en estado de represión. La mmación en cualquiera de estos loci para dar un alelo sir- tiene d0. efectos. Tan ro HML como JJMR se pueden transcribir, y ambos cartuchos silentes se vuelven diana. de reposición por cambio. De este modo. el misml episodio regulador sirve para reprimir un carluch, silente y para impedir que sea receptor de reposi· ción para ouo cartucho. Otros loci requeridos para el silendamiento incluyen RAPl (que también se necesita para mantener la heterocromatina telomé rica en su estadt inerte) y los genes que codifican la hisrona H4. La~ deleciones del extremo N de la h iswna H4 o la<mu Laciones puntHonnes individuales activan lo!cartuchos s ilentes. Los e·fectos de estas mutacione.-. pueden contrarrestarse con la introducción de nuevas mutaciones en S!RJ o la sobreexpresión de SIRl lo que sugiere que hay una interacción especifica entre H4 y las proteínas SIR. El modelo general sugerido por esws resultados es que las proteínas SIR actúan sobre la estructura de la cromatina para prevenir la expresión génica Las mutaciones en las proteínas SIR tienen los mismos efectos en los genes que se han desactivadc... debido a la proximidad de la heterocromatina telomérica, por lo que parece probable que las proteÍnél$ SfR participen. en general, en la interacción con 1~ histonas para formar estructuras hererocromáücas (inertes) (véase la secci6n 31.3, La heterocromatina depende de interacciones con histonas).

E ORC se une a ars

!

Concepto pñncipal • El cambio del tipo de apareamiento se inicia por una rotura de la doble cadena hecha en el locus MAT por la endonucleasa HO.

·w Sir1 se une a ORC

l

o El complejo de silenciamiento se une a Sir1

El locus MAT receptor inicia la transposición unidireccional

l

o

El silenciamiento en HMR depende de reclutu Sirl.

Hay una conexión interesante entre la represión en los silenciadores y la replicación del DNA. Cada silenciador contiene una secuencia ARS (un origen de la replicación). la ARS se une al ORX (complejo de reconocimiento del origen) que participa en ei inicio de la replicación. Las mULacione~ en los genes ORC impiden el silenciamiento. lo que indica que se requiere la unión de la proteína ORC al sileodador para el silenciamiemo. Hay dos tipos diferentes de conexión entre el silenciador y el aparato de replicación: • es necesaria la presencia de Sirl y • se requiere replicación. Si se localiza una proteína Sirl en el silenciador (mediante el enlace con orra proteína unida ahí), ya no se requiere la unión de ORC. Esto significa que la participación de ORC es tan sólo para llevar al interior a Sir!; no se necesita para iniciar la replicación. Como se ilustra en la . la función de ORC pudiese, por tamo, consistir e11 proveer un centro de inicio a partir del cual se pueda dispersar el efecto del silenciamiento. La ORC provee la estructura a la cual se une Sirl y ésta recluta, entonces, a las otras protemas SIR. Esto es difereme de su función en la repücación. Sin embargo, el paso por la fase S es necesario para que se establezca el silendamiemo. Esto no requiere que la iniciación tenga lugar en el ARS del silenciador. El decto podría depender del paso de la horquilla de replicación por el silenciador, tal vez para permitir que la cstrucmra de la cromatina cambie.

Se logra un cambio del tipo de apareamiento con una conversión génica donde el sitio receptor (MA1) adquiere la secuencia de tipo donador (HML o HMR). Los sitios necesarios para la transposición se han identificado por mutaciones en MAT que impiden el cambio. La namraleza unidireccional del proceso la indica la falta de mutaciones en HML o J-IM R. Las mutaciones identifican un ciclo en el límite derecho de Yen MAT que es crucial para el suceso de cambio. La naturaleza dell[mitc se demuestra cuando se analizan las localizaciones de estas mutaciones puntiformes con relación al sWo de cambio (lo que se hace revisando los resultados de los cambios muy poco frecuentes que ocurren a pesar de la muración). Algunas mutaciones yacen dentro de la región que es sustituida (y, por tanto, desaparecen de MAT después de un cambio), en tanto que otras yacen apenas afuera de la región sustituida (y, por tamo, continúan impidiendo el cambio ). De este modo, se necesitan secuencias dentro y fuera de la región sustituida para el episodio de cambio. El cambio se inicia con una rotura de la doble cadena cerca del limite Y-Z, que coincide con un sitio que es sensible al ataque por una desoxirribonudeasa (una característica común de los sitios cromosómicos que panicipan en el inicio de la transcripción o recombinación) . Se reconoce por una endonucleasa codificada en el locus HO . La endonudeasa HO produce la rotura de doble cadena escalonada apenas por la derecha dellúnite Y. La escisión genera extremos de una sola cadena de cuatro bases, que se ejemplifican en la . La nucleasa no ataca loci MATmutames que no pueden cambiar. El análisis de la deleción muestra que se requiere casi toda la secuenda de 24 bp que rodea al sitio de unión Y, o toda, para la escisión in vitro. El sitio de reconocimiento es relativamente grande para una nudeasa y se presenta sólo en los tres cartuchos del tipo de apareamiento. Sólo el locus.MAT, no así el HML o los loci HMR. es diana de la endonudeasa. Parece posible que los mismos mecanismos que mantienen a los cartuchos silentes sin transcribir también los mantengan inaccesibles a la endonucleasa RO. Tal inaccesibilídad asegura que el cambio sea unidireccional.

19.23 ELLocus MAT receptor inicia La transposición unidireccional

493

Región Y

TTTCAGCTTTCCGCAACAGTATA AAAGTCGAAAGGCGTTGTCATAT

Endonucleasa HO

.TTTCAGCTTTCCGCAACA AAAGTCGAAAGGCG

L

GTATA TTGTCATAT

la endonucleasa HO escinde MAT apenas a la derecha de la región Y, lo que genera extremos pegajosos con un colgajo de cuatro bases.

Receptor MAT

¡ Corte eo el llm;le \

Apareamiento con el donador~ Donador

La regulación de la expresión de HO controla el cambio HMRoHML

Degradación de MAT

\

Síntesis de DNA nuevo\ El DNA receptor ha cambiado el tipo de apareamiento

El DNA donador no cambia Se inicia la sustitución del cartucho con una rotura de doble cadena en ellocus receptor (MAl), que puede comprender el apareamiento de cualquier lado de la región Y con ellocus donador {HMR o HML).

494

La reacción desencadenada por la escisión s= ilustra en la . en términos de la reacciógeneral entre las regiones receptora y donadora. Etérminos de las interacciones de las cadenas ind·. viduales de DNA. sigue el esquema de recombinación a través de una rotura de doble cadena que: incluye en la Figura 19.9, y las etapas siguientes= cone inicial requieren las enzimas involucradas ela recombinación general. Las mutadones en algLnos de estos genes impiden el cambio. Supóngase que el extremo libre de MATinvad:: el locus HML o HMR y se aparca con la región d; homología en el lado derecho. La región Y de MAse degrada hasta exponer una región con homolv gía en el lado izquierdo. En ese punto, una MAT se aparea con HML o HMR en ambos lados. izquierd. y derecho. La región Y de HML o HMR se copia pan sustituir la región pcrdlda de MAT (que podría extenderse y rebasar los límites del mismo i'). Los loe apareados se separan (el orden de los sucesos podrí2 ser difereme). Al igual que en e l modelo de rotura de doble cadena para la recombinación, el proceso lo inida MA T, ellocus que se va a remplazar. En ese sentidc la descripción de HML y HMR como loci donadore< se refiere a su función final, pero no al mecanism. del proceso. Como en la transposición replicativa el sitio donador no se afecta, pero ocurre un cambü:> de secuencia en el receptor. A diferencia de la transposición, ellocus receptor sufre una sustitución mch que una adición de material.

CAPÍTULO 19 Recombinación homóloga y específica de sitio

Concepto principal • La endonucleasa HO se sintetiza en células madre haploides, de manera que un episodio de cambio hace que ambas cadenas hijas tengan el nuevo tipo de apareamiento.

La producción de la endonudeasa HO es regulada en el ámbito de la transcripción génica. Hay tre~ sistemas de control distintos: • El HO está bajo el control del tipo de apareamiento. No se sintetiza en células diploide> MATal!vfATo.. Tal vez el motivo sea que nc hay necesidad de cambio cuando an1bos alelos MAT se expresan de cualquier forma. • El HOse transcribe en las células originales. pero no en las hijas. • La transcripción de HO también responde a~ ciclo celular. El gen se expresa sólo al término de la fase G l de una célula original.

La sincronización de la producción de la nucleasa explica la relación entre cambio y linaje celular. La muestra que el cambio se derena sólo en los produc10s de una división; ambas células hijas tienen el mismo tipo de apareamiento, que cambia con respecto al de la que les dio origen. El motivo es que la restricción de la expresión de HO a la fase G 1 asegura que el tipo de apareamiento cambie antes de que se replique el locus MAT, con el resultado de que wda la progenie tiene el nuevo tipo de apareamiento. Los sitios de acdón en configuración ds que connotan la transcripción de HO residen a 1500 bp en sentido ascendente con respccLo del gen. El patrón general de control consiste en qne la represión en sólo uno de muchos sitios que responden a varios circuitos reguladores p uede impedir la transcripción de HO . En la se resumen los Lipos de sitios que parlicipa11. El control del tipo de apareamiento se asemeja al de otros genes haploides específicos. La transcripción la impide (en las células diploides) el represor al/a.2. Hay lO sitios de unión para el represor en la región en sentido ascendente, que varían en su conformidad con respecta a la secuencia de consenso. No se sabe cuáles y cuántos de ellos se requieren para la represión haploide específica. El control de la transcripción de HO implica la interacción de una serie de episodios de activación y represión. Se requieren los genes SWIJ-5 para la transcripdón de HO. Actúan al impedir que los productos de los genes SINI-6 repriman HO. Los genes SWT se descubrieron primero como mutantes incapaces de cambiar; los genes SIN se descubrieron después por su capacidad de liberar los bloqueos ocasionados por mutaciones particulares de SWI. Las interacciones SWJ-SIN participan tanto en el control del ciclo celular como en la restricción de la expresión en las células originales. Algunos de los genes SWiy SIN no se encargan de manera específica del tipo de apareamiemo, sino que son regu !adores globales de la transcripción cuyas funciones son indispensables para la expresión de muchos loci que incluyen el complejo de remodelado de cromatina SWl/SNF que contiene Swil ,2,3 y los loci SINl-4, que codifican proteínas cromosómicas o cromatina en los reguladores. Su panicípación en la expresión del tipo de aparea miento es incidental. El regulador urea] " es, por tanto, la proteína Swi, que contrarresta el sistema de represión general de manera específica en el locus HO. El control del ciclo celular es conferido por nueve copias de una secuencia octanucleotí<.lica llamada URS2. Una copia de la secuencia de consenso puede

u

Ocurre cambio en una c:x original, ambas h1jas / son a Las células no pueden cambiar otra • a vez en la primera generación / 'después del último camb1o "'Ocurre cambio en una a original. ambas hijas son c:x /

a

a

..-

ex '"

a

' a ,

a

'

a

a

Ocurre cambio sólo en las células originales; ambas células hijas tienen un nuevo tipo de apareamiento. Una célula hija debe pasar por un ciclo entero antes de convertirse en una célula madura y poder cambiar de nuevo.

Represión en dlploides Represor a1/ cx2

\/}\.~J.'

..tJ \:JJ\ U

Expresión específica de G1 Represor Sin6

Control del ciclo celular cdc28

URS2

Activador Swi4,6 UR$2

Represión específica de hija Aclivador Swi5

v Jj

URS1

--+

Represor Acllvador Ash1 Swi5

~' ~\1 URS1

Los tres sistemas reguladores actúan sobre la transcripción del gen HO, la cual ocurre sólo cuando se elimina toda represión.

conferir control del ciclo celular a un gen al que esté unida. Un gen vinculado con esta secuencia es reprimido, excepto durante un periodo transitorio hacia el final de la fase G l. Los activad ores que liberan la represión en URS2 son Swi4 y Swi6. Su actividad depende de la función del regulador del ciclo celular Cdc28. que ejecuta la decisión que lleva a las células a dividirse. La diana para la expresión de la restricción en generaciones alternas es el actlvador Swí5 (que antagoniza a un sistema de represión general ejercido 19.24 La regulación de la expresión de HO controla el cambio

495

por Sin3,4). En los rnutames que carecen de estas funciones. HOse rranscribc muy bien en cél ulas originales e hijas. Este sistema actúa sobre los elememos de URSI en la región lejana en sentido ascendente. La SWJ5 no es en sí misma el regulador de la especificidad de las células originales. pero es amagonizado por Ashlp. un represor que se acumula de manera preferente en las células hijas al final de la ana(ast:. Las mutaciones en ASHl permiten a las células hijas cambiar el tipo de apareamiento. La localización de Ash lp depende del transporte de su RNAm desde la célula original a través de filamentos de actina hacia la yema hija (véase la sección 7.16, El RNA.m puede localizarse de manera específica). Su presencia impide que SW15 anive el gen HO. Actúa al unirse a muchas copias de una secuen cia de consenso que se distribuyen en las regiones reguladoras URSJ y URS2. Cuando la célula hija crece para convenirse en una célula madura, la concentración dé Ashlp se diluye y entonces es posible expresar de nuevo el gen HO.

Resumen La recomhinación comprende el intercambio lísico de partes entre las moléculas de DN A correspondientes, lo que origina un DNA dúplex donde dos regiones de origen opuesto se coneGan por un segmento de DNA híbrido (heterodúplex}, en el cual una cadena e!> derivada de cada progenitor
CAPÍTULO 19 R.ecombinación homóloga y específica de sitio

La recombinación en las levaduras la inicia Spoll, una emJma similar a la topoisomerasa que se enlaza con los extremos S'libres del DNA. La DSB se procesa, en tonces, con la generación de DNA de cadena única que puede hibridarse con su complemenlaria en el otro cromosoma. Las mutaciones de las levaduras que bloquean la formación del complejo sinaptonémico muestran que se requiere recombinución para su formación. La formación del complejo sinaptonémico puede iniciarse con las roturas de la doble cadena y puede persistir hasta que concluya la recombinación. Las mutacio nes en los componentes del complejo sinaptonémico bloquean su formación, pero no impiden el apareamiento cromosómico, de manera que el reconocimiento de homólogos es independiente de la reco mbinaci ón y la formación del complejo sinaptonémico. Las pro teínas Rec y Ruv de E. coli pueden llevar a cabo el conjunto completo de acciones requeridas para la recombin ación. La nudeasa RecBCD genera una región de una sola cadena con un extrem< libre. La enzima se une al DNA en u n lado de la secuencia chi y después se desplala hacia la secuencia clli, desenrollando el DNA a medida q ue avanza. Se hace una rotura de una sola cadena en la secuencia chi. Las secuencias chi proveen puntos calientes para la recombinación. La cadena única aporta un sustrato para RecA. que tiene la capacidad de hacer sinapsis de moléculas de DNA homólogos al facilitar una reacción donde una cadena única de una molécula invade a una dúplex de la otra molécula Se forma DNA heterodúplex por desplazamiento de una de las cadenas originales de la dúplex. Estas acciones crean una unjón de recombinación que re suelven las proteínas Ruv. Las RuvA y RuvB actúan en u na hete rodúp lex y Ru vC escinde las uniones Holliday. La recombiJ1ación. a semejanza de la replicación y (tal vez) de la tra nscripción, requiere manipulación topológica del DNA. Las topoisomerasas pueden relajar (O introducir} superhélices en el DNA y son indispensables para desenmarañar las molécu · las de DNA que se han encadenado por recombinación o replicación. Las topoisomerasas de tipo : causan una rotura en una cadena del DNA dúplex: las topoisomerasas de üpo li hacen roturas de d o~ cadenas. La enzima se enla7a con el DNA por una unión de la tirosina al extremo 5' fosfato (enzima• de tipo A) o al extremo de 3' fosfato (enzimas de tipo B). Las enzimas involucradas en la recombinaciór específica de sitio 1ienen acciones relacionadas cor las de las topoisomerasas. En esta clase general de recombinasas, aquellas dedicadas a la integración de Jagos forman la subclase de integrasas. El sislema

Crellox utiliza dos moléculas de Crc para unirse a .:ada sirio lox, de manera q ue el complejo recornbi nante es un tetrámero. 'tste es uno de los sistemas estándar para insertar el DNA en un genoma extra ño. La integración del fago A. requiere las proteínas rm del fago y la lHF del hosp<'dador e implica una rotura y reunión precisas en ausencia de síntesis de DNA. La reacción implica envolver con la secuencia •1ttP del DNA del fago la estructura de nucieoproteína del inta!iorna, que contiene varias copias de lnt e IHF; se une, entonces. la secue ncia allB del hospedador y ocun.: la recombinación. La reacción en dirección inversa requiere la proteína Xis del fago. Algunas imegrasas funcionan por escisión en configuración cis, donde una tírosina que reaccio na con el DNA en un sitio m itad es provista por la subunldad de enzima unida a ese sitio mitad; otras funcionan por escisión en conÍigu ra ción trans, para Jo que una subu nidad proteínica diferente provee la tirosina. La levadura S. cerevisiae puede propagarse en es tado haploide o diploide. La conversión entre estos estados ocu rre por apareamiento (fusión de células baploides para producir una diploide) y esporulación (la rnciosis de células diploides para dar esporas haploides). La posibilidad de panicipar en estas actividades la determina el tipo de apareamiento de la cepa. El tipo de apareamiento lo determina la secuencia del locus MAT y puede cambiar por un episodio de recombinación, que sustituye una secuencia diferente en este locus. El suceso de recombinación se inicia con una rotura de ~a doble cadena, como un suceso de recombinación homóloga, pero Luego los pasos subsecuentes aseguran una reposición unidireccional de la secuencia en el locu s MAT. La reposició n es regulada de manera que MATa suele ser sustituida por la secue ncia de HMLa., en tanto MATCJ.. suele ser sustituida por la secuencia de HMRa. La endonucleasa HO desencadena la reacción cuando reconoce un sitio diana único en MAT. La l iO es r egu lada en el ámbito de la transcripción por un sistema que asegura su expresión en células originales pero no en sus hijas, con la consecuencia de que toda la progenie tiene el mismo tipo de aparcamiento (nuevo).

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E

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·stemas de reparac;ón ESQUEMA DEL CAPÍTULO (codificada por dinB) pueden sintetizar un complemento de la cadena dañada. • El ONA sintetizado por la polimerasa de reparación de DNA a menudo tiene errores en su secuencia. • Los genes mutadores pueden identificar proteínas que afectan la fidelidad de la replicación, donde el cambio de secuencia causa una mayor tasa de mutaciones espontáneas.

Introducción Los sistemas de reparación corrigen el daño del

DNA • Los sistemas de reparación reconocen las secuencias de ONA que no cumplen con los pares de bases estándar. • Los sistemas de escisión retiran una cadena de ONA del sitio dañado y después la sustituyen. • Los sistemas de reparación por recombinación utilizan la recombinadón para sustituir la región de doble cadena que ha sido dañada. • Todos estos sistemas son susceptibles de introducir errores durante el proceso de reparación. La fotorreactivación es un sistema de reparación no mutagénico que actúa de manera específica en dímeros de pirimidinas.

Control de la dirección de la reparación de apareamientos erróneos Los genes mut codifican un sistema de reparación de apareamientos erróneos que se encarga de las bases mal apareadas. . . Hay una tendencia en la selección de qué cadenas sustitu1r en los apareamientos erróneos. • Por Lo general. se sustituye la cadena que carece de · ·1ado. metilación en un segmento GATC CTAG hem1meu • Este sistema de reparación se usa para eliminar errores en una cadena de ONA recién sintetizada. En los apareamientos erróneos G-Ty C-T, se retira de preferencia la T.

Sistemas de reparación por escisión en E. coli • El sistema Uvr hace incisiones a -12 bases de distancia de ambos lados del ONA dañado, retira el ONA entre ellas y vuelve a sintetizar el DNA nuevo.

Vías de reparación por escisión en células de mamíferos

Sistemas de reparación por recombinación en E. co/i

• La reparación por escisión en los mamíferos se desencadena con la eliminación directa de una base dañada del DNA. • El retiro de las bases desencadena la eliminación y sustitución de un segmento de polinucleótidos. • La naturaleza de la reacción de la eliminación de las bases determina cuál de las dos vias de reparación por escisión se activa. • La vfa polli/t sustituye un segmento largo de polinuc\eótidos; la vía polP sustituye un segmento corto.

Los genes rec de E. coli codifican el principal sistema de recuperación. • El principal sistema de recuperación actúa cuando la replicación deja una brecha en una cadena recién sintetizada que se encuentra frente a una secuencia dañada. • Se utiliza la cadena (mica de otro segmento dúplex para sustituir la brecha. Se retira entonces la secuencia dañada y se presenta una nueva slntesis.

La recombinación es un mecanismo importante de recuperación ante errores de replicación

Las metilasas y las glucosilasas "lanzan" las bases • Las glucosilasas reconocen y retiran de manera directa del DNA las bases alquiladas y el uracilo. • Los di meros de pirimidina se revierten por la rotura de los enlaces covalentes entre ellos. • Las metilasas agregan un grupo metilo a la citosina. Todos estos tipos de enzimas actúan al lanzar la base fuera de la doble hélice donde, de acuerdo con la reacción, es retirada o modificada y regresada a la hélice.

Reparación susceptible de error y fenotipos mutadores El ONA dañado que no ha sido reparado causa que la polimerasa 1H de DNA se detenga durante la replicación. Las poli me rasas V (codificada por umuCD) o rv del DNA

• Una horquilla de replicación puede quedarse varada cuando encuentra un sitio dañado o una hendidura en el DNA. • Una horquilla varada puede revertirse por el apareamiento entre las dos cadenas reci~n sintetizadas. Una horquilla varada puede reiniciar la reparación del daño y utilizar una helicasa para poder avanzar. La estructura de la horquiUa varaoa es la misma que la unión Holliday y puede convertirse en una cadena dúplex y DSB por la acción de las resolvasas. ~

La proteína RecA desencadena el sistema SOS • El daño al DNA causa que la protelna RecA desencadene la respuesta SOS, que consta de genes que codifican muchas enzimas de reparación.

Continúa en la siguiente página

499

• la RecA impulsa la actividad dE? escisión propia de lexA. La LexA reprime el sistema SOS; su escisión propia activa esos gE?nE?s.

las células eucariótícas tienen sistemas de reparación conservados Las mutaciones RAD en levaduras, identificadas por fenotipos sensibles a la radiación, ocurren en genes que codifican sistemas de reparación. La xerodermia pigmentosa (XP) es una enfermedad humana causada por mutaciones en cualquiera de varios genes de reparación. • Un complejo de protel:1as, que incluyen productos XP y el Factor de transcripción TF,,•• provee un mecanismo de reparación por escisión en los seres humanos. • Los genes con actividad transcripcional se reparan de manera preferente.

Introducción Cualquier episodio que introduzca una desviación de la estrucwra habitual de doble hélice del DNA representa una amenaza para la constitución gené-

Reparación por escisión de nucleótidos: 2B genes.

Reparación por escisión del apareamiento erróneo:

um _..

11 genes.

¡ ~1

m

Unión de eX1remos no hOmólogos: crnco genes.

___. ~

Subunrdades catahticas de polimerasas de DNA: 16genes.

Los genes de reparación se pueden clasificar en v!as que utilizan mecanismos diferentes para revertir el daño al DNA o pasarlo por alto.

500

CAPÍTULO 20 Sistemas de reparación

fliiD Un sistema común repara las roturas de L:: doble cadena • La via NHE.J puede ligar extremos romos de DNA dúplex. Las mutaciones en la vía NHE.J causan enfermea.:: en los seres humanos.

Resumen

tica de la célula. Las lesiones del DNA dismint. al mínimo gracias a los sistemas que reconoc corrigen el daño. El sistema de reparadón ~ complejo como el aparato de replicación mism que indica su importancia para la supervivenc-· la célula. Cuando un sistema de reparación reP un cambio ocurrido al DNA, no hay consecuer._ No obstante, puede haber una mutación cuanc consigue hacerlo. La tasa medida de mutadone fleja un equilibrio entre el número de sucesl daño que ocurre en el DNA y el número de los se han corregido {o corregido mal). Los sistemas de reparación a menudo rec cen una variedad de distorsiones en el DNA e señales para actuar y es posible que una célula 1.~ varios sistemas capaces de corregir un daño al t la importancia de la reparación del DNA en lac carioras lo indica la identificación de > 130 g... de reparación en el genoma humano . Se pue dividir los sistemas de reparación en varios : generales, como se resumen en la • Algunas enzimas revierten de manera d la tipos específicos de daño al DNA. • Hay vías para la reparación por escisió bases o nucleótidos, y del apaream: ... erróneo, todas las cua les actúan med!.= el retiro y la sustitución de material. • Hay sistemas que usan la recombina ... para obtener una copia no dañada qt. utiliza luego para sustitUir una secuL~ dúplex dañada. • Una vía de unión de extremos no hon· gos vuelve a unir extremos de cadena ... ro ros. • Varias polimerasas de DNA direrentesden rcsintctizar segmentos de DNA de titución. La reparación directa sucede muy pocas ve.. comprende la reversión o el simple reLi ro de~

'1lento dañado. Es un buen ejemplo la fotorreactidón de dímeros de pírimldina, donde los enlaces . va lentes lesivos son revertidos por una enzima ~pendiente de la luz. Este sistema está muy generalizado en la natraleza y ocurre en todos los mamíferos, e.xcepw >S pla<:entados, y parece muy linponante en las :amas. En Escherichia coli depende del producto de .n gen único (phr) que codifica u na enzima llamada ' tOligasa. Los apareamientos erróneos entre cadenas de !'{A constituye11 una de las principales dianas de los temas de reparación. La reparación de apareamien_•s erróneos se logra mediante la búsqueda de bases ~1 aposición mal apareadas en el DNA. Los aparealientos erróneos que surgen durante la replicación ._ corrigen al distinguir entre las cadenas "nuevas" "antig11as" y corregir de preferencia la cadena que . caba de simetizarse. Otros sistemas abordan apa~amientos erróneos generados por conversiones de .ases, como en el caso de la desaminaclón . La im "'l rlancia de estos sistemas queda de manifiesto por .. hecho de que el cáncer en poblaciones humanas s consecuencia de la mutación de genes relacíoados con los que participan en la reparación de -!)areamientos erróneos en las levaduras. Los aparcamientos erróneos suelen corregirse _on la reparación por escisión; ésta la Inicia una enzila de reconocimiento que detecta una base dailada ::al o un cambio en la vía espacial del DNA. Hay dos pos de sistemas de reparación por escisión. • Los sistemas de reparación por escisión de bases retiran de manera directa la base dañada y [a susütu yen en el DNA. Un buen ejemplo es la glucosilasa de uracilo del DNA, que retira macHos mal apareados con guaninas (véase la sección 20.5, Las metilasas y glucosilasas usan el alet eo de bases). • Los sistemas de reparación por escisión de nucleótidos retiran una secuencia que incluya la, o las, bases dañadas; después se sintetiza una nueva cadena de DNA para sustituir el material eliminado. En la se resumen los principa les episodios del funcionamiento de tal sistema. EstOs sisremas son comunes. Algunos reconocen el daño general del DNA; otros actúan sobre tipos específicos de bases dañadas. A menudo hay múltiples sistemas de reparación por escisión en un solo tipo celular. En los sistemas de recombinación-reparación se ~· anejan situaciones donde el daño persiste en una .,olécula h ija y se ha forzado la replicadón para pa· 3t por altO el sitio, lo que por lo genera l crea una recha en la cadena hija. Un sistema de recupera~ ón utiliza la recombinación para obtener otra copia

dt> la secuencia a partir de una fuente no dañada; Juego la copia se utíliza para reparar la brecha. Una característica importante de la recombina· ción y reparación es la necesidad de abordar roturas de doble cadena (DSB) . Las DSB inician entrecruzamiemos en recombinadón homóloga. También pueden crearse por problemas en la replicación, donde tal vez desencadenen el uso de sistemas de reparación por recombinadón. Cuando se crean DSB por daño ambiental (p. ej., el causado por la radiación) o son producto del aconam.iento de telómeros, pueden causar mutaciones. Un sistema para corregir DSB puede unir extremos de DNA no homólogos . Las mutaciones que afectan la capacidad de las células de 5. coli de contribuir a la reparación del DNA emran en grupos que corresponden a varias vías ele reparación (que no tienen que ser indepen dientes). Las principCJies vías conocidas son el sistema uvr de reparación por escisión, el sistema de reparación de apareamientos erróneos dirigido por metilos, y las vías de recombinación recE y recF así como las de reparación-recombinación. Las activi dades enzimálicas comprendidas en estOs sistemas son de endonudeasas y exonucleasas (importan tes para reli.rar el DNA dañado), resolvasas (endonucleasas que actúan de manera específica sobre uniones recombinante s), helicasas para desenrollar el DNA y polimerasas de DNA para sintetizar nuevo DNA. Algunas de es tas actividades enzimáricas son exclusivas de delerminadas vías de reparación, en tanto otras panicipan en múltiples vías. El aparato de replicación presta mucha atención al conrrol de calidad. Las polimerasas de DNA utilizan la corrección de lectura para verificar la secuencia de la cadena hija y eliminar errores. Algunos de los sistemas de reparación son menos precisos cuando sintetizan DNA para sustituir un material dañadc. Por este motivo, a dichos sistemas se les conoce históricamen te como sistemas susceptibles de error.

El DNA es dañado

Se elimina el daño

Se sintetiza DNA de reposición

En la reparación por escisión se sustituye de manera directa el DNA dañado y luego sintetiza de nuevo un segmento de reposición para sustituir la cadena dañada. 20.1 Introducción

501

Los sistemas de reparación corrigen el daño del DNA Conceptos prín1'ipales • Los sistemas de reparación reconocen las secuencias de DNA que no cumplen con los pares de bases estándar. • los sistemas de escisión retiran una cadena de DNA del sitio dañado y después la sustituyen. • los sistemas de reparación por recombinación utilizan la recombinación para sustituir la región de doble cadena que ha sido dañada. • Todos estos sistemas son susceptibles de introducir errores durante el proceso de reparación. • La fotorreactivación es un sistema de reparación no mutágeno que actúa de manera específica en dímeros de pirimidinas.

Los tipos de daño que desencadenan sistemas de reparación se pueden dividir en dos clases generales: • Los cambios de una sola base afectan la secuencia del DNA, pero no su estructura glo-

Naturaleza de la mutación Citosina Uracilo H H

e \Y \1 'N/

_,.

Consecuencias U-G sustituye a C-G

O 11

N

DesaminaciC'n . ,

N)~o

-

N

l N)~o Se corrige por sustitución de UconC

La desaminación de la citosina crea un par de bases U-G. Se retira de preferencia el uracilo del par con apareamiento erróneo.

Naturaleza de la mutación Citosina H H 'N'"

AN l .. )~~~ón_f

Consecuencias Un par de purinas Adenina distorsiona la H,N)l cadena dúplex

:t.:

Errores de la N

N

y¡·

)

A G

\N

Se corrige por retiro de A o G en la cadena recién sintetizada

Un error de replicación crea un par con apareamiento erróneo, que tal vez se corregiría con la sustitución de una base; si no se corrige, la mutación se fija en una cadena dúplex hija.

502

CAPÍTULO 20 Sistemas de reparación

Naturaleza de la mutación

o

CH 3 u

C'

N I Timina

N"""""'o o

N

1

bal. No afectan la transcripción o replicc.: cuando se separan las cadenas dúple) DNA. Así, estos cambios ejercen sus ( tos lesivos en generaciones futuras poconsecuencias del cambio en la secue~ del DNA. La causa de este tipo de efec la conversión de una base en otra qu aparea mal con su contraparte. Los cam de una sola base pueden ocurrir com'sultado de la muración de una base in o por errores de replicación. La muestra que la desaminación de la cit~ para producir uracilo (en forma espomá o por un mutágeno químico) crea un paG con apareamiento erróneo. La muestra que es posible que un error de plicación cause la inserción de una ade:en lugar de una cirosina para crear ur: A-G. Tal vez haya consecuencias similc: de la adidón covalente de un pequeño=-po a una base que modifica su capacidac apareamiento. Estos cambios pueden c.: sar una distorsión estructural muy pequ~­ (como en el caso de un par U-G) o una " dificadón bastante significativa (como ecaso de un par A-G), pero la caracten· ca común es que el apareamiento errór persiste sólo hasta la siguiente replicac Por lo tanto, sólo se dispone de poco tier.para reparar el daño antes de que se fije · replicación. • Las distorsiones estructurales pue.... constituir un impedimento físico para la · plicación o transcripción. La introducciór. enlaces covalentes entre las bases de una dena de DNA o en cadenas opuestas int la replicación y la transcripción. En la se muestra un ejemplo de irradiac

Consecuencia.s El dfmero de ti mina distorsi0na lE: cadena dúple-

3

C'CH u N

Timina

~~ __,.. Radiación ultravioleta

Se corrige por escisión

La irradiación ultravioleta causa la formació- · dímeros entre timinas cercanas. El dímero bloquea la re¡:.~­ ción y la t ranscripción.

ultravioleta (UV) donde se introducen enlaces covalentcs entre dos bases de timina cercanas, lo que da lugar a un dímero de pirimidina intracatenario. La muestra que puede haber consecuencias similares si se añade un agregado voluminoso o una base que distorsiona la estructma de la doble hélice. Como se muestra en la , una hendidura en una sola cadena o el retiro de una base impiden que una cadena sirva como molde apropiado para la síntesis ele RNA o DNA. La característica común de todos esws cambios es que el segmento de agregación dañado se mantiene en el DNA y continua causando problemas estructurales, induce mutaciones, o ambas cosas, hasta que se retira. Cuando se eliminan los sistemas de reparación, - -células se vuelven en extremo sensibles a la irra3ción ultravioleta. La introducción de daño induio por UV ha constituido una prueba importante ara los sistemas de reparación, por lo que cuando : valoran sus actividades y eficacias relativas debe _.::Ol·darse que el énfasis podría ser diferente si se esdiaran otros segmentos de agregación dañados.

:

1

Naturaleza de la mutación Guanina Metilguanina yH3

9 --+ o ~N Alquilación(-/'N

'N~~NH2 1

Consecuencias

Sistemas de reparación por escisión en E. coli Concepto principal El sistema Uvr hace escisiones a -12 bases de distancia de ambos lados del DNA dañado, retira el DNA entre ellas y vuelve a sintetizar el DNA nuevo.

Los sistemas de reparación por escisión varían en su especificidad, pero comparten las mismas características generales. Cada sistema retira bases dañadas o mal aparcadas del DNA y luego sintetiza una nueva cadena de DNA para sustituirlas. El principa l tipo de vía para la reparación me-

diante la escisión se ilustra en la En el paso de la incisión, una endonucleasa reconoce la estructura del sitio dañado y con a la cadena de DNA a ambos lados . En el paso de la escisión, una S'- 3' exonucleasa retira un segmento de la cadena dañada.

Daño La base mutante se aparea en forma errónea o distorsiona la estructura

El grupo metilo

distorsiona la doble hélice

~~NH2 1

La endonucleasa escinde ambos lados de la base dañada Se corrige por desalquilación

La metilación de una base distorsiona la doble Hice y causa apareamiento erróneo en la replicación. La es-·EUa señala el grupo metilo.

Naturaleza de la mutación

H,N,.H

Consecuencias

La exonucteasa retira el DNA entre las hendiduras

la polimerasa sintetiza el DNA de reposición

No hay purina

Adenina ¡ 0 N

'\¡~)

Despurinación

\Y - \S

~

la ligasa sella la hendidura Se corrige por inserción

La despuri nación retira una base del DNA y blo•• ea la replicación y la transcripción.

En la reparación por escisión se retira un segmento de DNA que incluye las bases dañadas y se sustituye.

20.3 Sistemas de reparación por escisión en E. coli

503

Deformación del DNA

UvrA uvrB

UvrA reconoce el dafio y se une con "'\rVV'VJ\/)\/)\fA// UvrB UvrC UvrB ~

Se libera UvrA;

~/ seuneUvrC

UvrD desenrolla la '\:/NN..Jv..rrJVJ\.IA./N/ región y libera el segmento dañado El sistema Uvr actúa por etapas donde UvrAB reconoce el daño, UvrBC hace una hendidura en el DNA y UvrO desenrolla la región marcada.

En e l paso de la síntesis, la región de cadena única resultame sirve como molde para que una polimerasa de DNA sintetice una secuencia en sustitución de la extirpada. (La síntesis de una nueva cadena podría vincularse con el retiro de la antigua en una acción coordinada.) Por último, la ligasa de DNA une de manera covalente el extremo 3' de la nueva cadena al DNA original. El sistema de reparación por escisión uvr incluye rres genes, uvrA, -By -C. que codifican los componentes de una endonudeasa de reparación. Sus funciones en las diversas etapas se indkan en la . Primero. ta combinación UvrAB reconoce dímeros pirimidínicos y otras alteraciones voluminosas. A continuación. la UvrA se disocia (lo que requiere triCosfato de adenosina [ATPl) y la UvrC se une a UvrB. La combinación UvrBC hace una incisión a cada lado, una a siete nucleótidos del extremo 5' del sitio daflado y la otra alejada de tres a cuatro nucleótidos del sitio 3', lo que también requiere ATP. La UvrB es una helicasa que ayuda a desenrollar el DNA para permirir la liberación de la cadena única entre los dos cortes. La enzima que corta la cadena dañada de DJ>;A es la polimerasa de DNA I. Es posible que la enzima involucrada en la síntesis de reparación también sea la polimerasa I de DNA (aunque las polimerasas I1 y ITI de DNA pueden suslituirla). Los episodios son en esencia los mismos. si bien su orden es diferente en lo que 504

CAPÍTULO 20 Sistemas de reparación

se refiere a la vía de reparación eucariótica muestra en la Figura 20.23. Casi todos los sucesos de reparación por es._ en E. coli corresponde a la reparación por me-... UvrABC. En la mayor parte de los casos (99. longitud promedio del DNA sustituido es de- · :. deóúdos. (Por ese motivo, esta reparación a me se describe como en parche cono). El l% re_de los casos implica la reposición de segmem DNA, en su mayor parte de -l 500 nucle de JongiLud. pero llegan a extenderse hasta > nucleótidos (a veces denominada reparacir parche largo). No se sabe porqué algunos SL desencadenan la forma de parche largo en l u~a, la de parche corto. Otras proteínas pueden dirigir el comple~ hacia sitios dañados. El daño del DNA puede dir la rranscripción, pero la situación la resueJy ~ proteína llamada Mfd, que desplaza a la polirr".:. de RNA y recluta al complejo Uvr (véase la:= ra 24.19 en la sección 24.12, Una conexión _transcripción y reparación).

, . Vías de reparación por escis·: en células de mamíferos Conceptos pnncipales • La reparación por escisión en los mamiferos se desencadena con la eliminación directa de una ba:c dañada del ONA. El retiro de las bases desencadena la eliminación~ sustitución de un segmento de polinudeótidos. • La naturaleza de la reacción de retiro de bases determina cuál de las dos vías de reparación por escisión se activa. • La vía pol8/e sustituye un segmento largo de p o li:-~­ cleótidos; la vía polP sustituye un segmento corte. El principio general de la reparación por esdsio~ las células de mamíferos es similar al de las t-: rias. No obstante, el proceso por lo general se~ en una forma diferente, con el retiro de una dañada individual. Esto sirve como desencade:-..:para activar las en-zimas que cortan un fragm~ del DNA que incluye el sitio dañado y lo su yen. Las enzimas que retiran bases del DNA se lli ~ glucosilasas y liasas. En la se mt. que una glucosilasa escinde el enlace entre la dañada o mal apareada y la de desoxirribos: la se muestra que algunas glucosson también liasas que pueden adelantar la rea una etapa más con el uso de un grupo amino

s·\

O-~o~ ·o· e\

Uracilo

r:

~

No

HN ~

0~..0 o

~ Q

C>P,O o

Glucosílasa

_..NH

1 o

'

Baoo fallaote

co

Acción de liasa

.

' \)/ o

1Traducción

f de la hendidura

Sustitución del nucleótido

+1

' 3'

Una glucosilasa retira una base del DNA me·:e la escisión del enlace con la desoxirribosa.

Vía de parche largo

Vía de parche corto

El retiro de las bases por la actividad de la glucosilasa o la liasa desencadena vías de reparación por escisión en los mamíferos.

Una glucosilasa hidroliza el enlace entre la la desoxirribosa (con H10), pero una liasa continúa _ ·eacción al abrir el anillo del azúcar (con NHz). 42 y

:;a atacar el anillo de la dcsoxirribosa. Por lo gene., a esto le sigue una reacción que introduce una ndidura en la cadena polinucleotídica. La muestra que la forma exacta ~ ia vía depende de que la base dañada se retire por · acción de una glucosilasa o una liasa.

A la acción de la glucosilasa le sigue la de la endonucleasa APEl, que corta la cadena polinucleotíd.ica en el lado 5'. Esto, a su vez, atrae un complejo de replicación que incluye la poUmerasa 8/c. del DNA y componentes auxiliares, que llevan a cabo un proceso de traducción de la hendidura que se extiende de dos a 1O nucleótidos. El material desplazado es retirado por la endonucleasa FEN l. La enzima ligasa- l sella la cadena, lo que corresponde a la llamada vía de parche largo. Cuando en el retiro inicial hay una acción de Liasa, la endonudeasa APEl se combina con la polimerasa ~de DNA para sustituir un solo nucleótido. La hendidura se sella entonces por la acción de la ligasa de XRCCl/Jigasa-3. A esto se le llama vía de parche corto. 20.4 Vías de reparación por escisión en células de mamíferos

505

Las metilasas y las glucosilasas "lanzan" las bases ConC('ptO$ pñncipales Las glucosilasas reconocen y retiran de manera directa del DNA las bases alquiladas y el uracilo. • Los dímeros de pirimidinas se revierten por la rotura de los enlaces covalentes entre ellos. Las metilasas agregan un grupo metilo a la citosina. Todos estos tipos de enzima actúan al lanzar la base fuera de (a doble hélice donde, de acuerdo con la reacción, es retirada o modificada y regresada a la hélice.

Varias enzimas que retiran o modifican bases individuales en el DNA utilizan una reacción notoria donde una base es "lanzada" fuera de la doble bélice. Este tipo de interacción se demostró por primera vez en las Lransferasas de metilos, enzimas que añaden u n grupo metilo a la citosina en el DNA. La metilasa lanza por completo fuera de la hélice a la citosise muestra que entra na diana. En la a una cavidad en la enzima, donde es modificada. Después, regresa a su posición normal dentro de la hélice. Todo esto ocurre sin apone de una fuente energética externa. Una de las reacciones más frecuentes donde se retira una base de manera directa del DNA es la catalizada por la glucosilasa de uradlo-DNA. Por lo general, el uracilo se encuentra en el DNA debido a una desaminación (espontánea) de la citosina, que la glucosilasa reconoce y retira. La reacción es similar a la de la metilasa. El uracilo es lanzado fuera

Una metilasa "lanza" la citosina diana fuera de la doble hélice para modificarla. Fotografía por cortesía de Sanjay Kumar, New England Biolabs. 506

CAPÍTULO 20 Sistemas de reparación

de la hélice y hacia el sitio activo de la gluco_ Otras glucosilasas y liasas, como las que recoP bases dañadas en el DNA de los mamíferos, acde manera similar. Las bases activadas (por lo general aq ~ donde se ha agregado un grupo metilo) se re· por un mecanismo similar. Una enzima hur- _ única, la glucosilasa del alquil -adenilo DNA (_., reconoce y retira una variedad de sustratos al¡;· dos que incluyen 3-metiladenina, 7-meúlguae hipoxantina. En contraste con este mecanismo, la 1-r adenina es corregida por una enzima que t:• un mecanismo de oxigenación (codificado en 5: por el gen alkB, que tiene homólogos muy ciis" sos en la naturaleza, incluidos tres genes huma!' El grupo metilo es oxidado para formar un g.r CH,OH, y después. la überadón del segmento R(fo;maldehído) restablece la estructura de la a.. na. Un avance muy interesante es el descubrim: de que la emjma bacteriana, y una de las enz... humanas, también pueden reparar la misma _ dañada en el RNA. En el caso de la enzima hu~.:: la principal diana puede ser el RNA ribosómico ~ es el primer episodio de reparadón conocido 1. RNA como diana. Otra enzima que ..lanza" bases es la fotor que revierte los enlaces entre dímeros de piri.rm {véase la Figura 20.5). El dímero de pirimidií" lanzado al interior de una cavidad en la enz. Cerca de esta cavidad se encuentra un sitio ~ vo que contiene un donador de electrones, qt:.~ provee para romper los enlaces. La energía pareacción proviene de la luz dentro de la longitt_ onda visible. La característica que comparten estas enz..:es el lanzamiento de la base diana al interiola estructura enzlmática. La endonucleasa V ó, utiliza una variación de este esquema, ahora ~ brado T4-pdg (glucosilasa del dímero de piri:nas) para reflejar su forma de acción. Lanza la adenina complementaria de la timina en el sitio ~ dímero de pirimidinas. Por lo tanto, en este ~­ la diana para la acción catalítica de la enzima ~ _ siendo el DNA dúplex, y la enzima utiliza ellamiemo como un mecanismo indirecto para or.: . acceso a su diana. Después de que se retira una base del DNA ne lugar una escisión de la columna fosfodiésreuna endonucleasa, la síntesis de DNA por una limerasa de DNA para Llenar la brecha y la liga_ por una Jigasa para restablecer la integridad de:; dena polinucleotíclica, como se describe para·· de reparación por escisión en los mamíferos • la seccíón 20.4. Vías de reparación por esdsif células de mamíferos).

Reparación susceptible de error y fenotipos mutado res i L.:!nceptos pnncipales

a DNA dañado que no ha sido reparado hace que ia polimerasa ill de ONA se detenga durante la replicación. La polimerasa Vde DNA (codificada por umuCD) o la polimerasa IV de DNA (codificada por dinB) pueden sintetizar un complemento de la cadena dañada. El DNA sintetizado por la polimerasa de reparación de !JNA a menudo tiene errores en su secuencia. Es posible que las proteínas que afectan la fidelidad de .a replicación sean identificadas por genes mutadores, en los que la mutación ocasiona una mayor tasa de mutaciones espontáneas. existencia de sistemas de reparación que partien la síntesis del DNA hace surgir la interro'""le de si su control de calidad es comparable con .!e la replicación del DNA . Hasta donde se sabe, . todos Jos sistemas, incluido el de reparación por .:".sión controlado por ttvr, no difieren de manelignificaliva en la frecuencia de errores respecto .a replicación del DNA. Sin embargo, en B. colí ..rre síntesis de DNA s u sceptible de errores en :tas circunstancias. La característica de susceptibilidad de error se ervó por primera vez cuando se encontró que ·eparación del DNA dañado del fago A. se acom:.aba de la inducción de mutaciones cuando se '""Oducfa el fago en las células que ames se habfan : :Hado con UV . .Esto sugiere que la radiación UV hospedador activó funciones que generan muuoes. La respuesta mutagénka también actúa en =~A del hospedador bacteriano. ..:.Cuál es la verdadera actividad susceptible de ·r? Es una polimerasa de DNA que inserta bases rrectas, que representan muraciones, cuando - por cualquier sirio donde no puede introdudr es de bases complementarios en la cadena hija. :unciones involucradas en esta vía susceptible cror se identifican por las mutaciones en los es umuD y umuC, que suprimen la mutagéne-~ducida por uv. Esto i.n1plica que las proteínas -C y UmuD causan mutaciones que tienen lugar -ués de la irradiación UV. Los genes constituyen erón umuDC cuya expresión es inducida por el - del DNA . Sus productos forman un complejo D',C que consta de dos subunidades de una .cína truncada UmuD y una subunidad UmuC. ~:nuD es escindida por RecA, la cual es activada :1 daño del DNA (véase la secdón 20.10, La -.desencadena el sistema SOS). 30

El complejo UmuD' ,C tiene a ctividad de polimerasa de DNA. Se llama polimerasa v de DNA y se encarga de la síntesis del nuevo DNA para sustituir secuencias que han sido dañadas por la luz UV. Esta es la única enzima en E. co/i que puede pasar por alto lo~ dímeros de pirimidinas habituales producidos por luz UV (u o tros productos voluminosos). La actividad de la polimerasa es susct:ptible de error. La mutación de u mue o umu D dcsat1 iva a la enzima, lo que hace letal la irradiación UV. Algunos plás· rnídos ponan genes llamados mucA y mucB que son homólogos de wnuD y wmtC y cuya introducCión a una baCleria aumenta su resistencia a la eliminación por UV y la suscepLibilidad a la mutagénesis . ¿Cómo gana acceso al DNA una polimerasa de DNA alternativa? Cuando la replicasa (polimerasa JII de DNA) encuentra un bloqueo, como un dúnero de timidinas, se detiene. Después es desplazada de la horquilla de replicación y sustituida por lapolimerasa V de DN A. De hecho, la polimerasa V de DNA utili7a las mismas proteínas auxiliares que la polirnerasa mde DNA. La misma situadón es válida para la polimerasa IV de DNA, producto de dinB. que es otra enzima que actúa sobre el DNA dañado . Las polimerasas rv y V de DNA son parte de una familia más grande, que incluye las polimerasas de DNA eucarióticas cuyos miembros participan en la reparación del DNA dañado (véase la sección 20.11, Las células eucarióticas tienen sistemas de reparación conservados).

Contro l de la dirección de la reparación de apareamientos erróneos Conceptos princ1pales • Los genes mut codifican un sistema de reparación de apareamientos erróneos que se encarga de las bases mal apareadas. • Hay una tendencia en la selección de qué cadenas sustituir en los apareamientos erróneos. • Por lo general, se sustituye la cadena que carece de mutilación en un segmento GATC hemimetilado. CTAG • Este sistema de reparación se usa para eliminar errores en una cadena de ONA recién sintetizada. En los apareamientos erróneos de G·T y C-T se retira de preferencia la T.

Los genes cuyos productos participan en el control de la fidelidad de JJ síntesis del DNA durante la replicadón o reparación pueden idenlificarse por las mutaciones que tienen un fenotipo mutador. Un mmanre de mutador tiene una mayor frecuencia de mutación espománea. Cuando se identifica en un

20 1 Control de la direcc.ión de la reparación de apareamientos el'róneos

507

.......

.'

.

MutT hidroliza el 8-oxo·dGTP

dGTP

--+


dG

Hidrólisis MutM retira G=O que se aparea con e .

G

e

--+

Replicación

~

G

e

l

MutM

__.

e

Glucosllasa

__. Inserción

G

e

de G

t---La MutY retira A que está apareada con G=O. O MutY O n--o+ll G G

-..uOG

A Glucosilasa

Inserción e de e

El retiro preferente de bases en pares que tienen guanina oxidada está diseñado para disminuir al mínimo las mutaciones.

prindpio a un gen por el fenm ipo mu ladar, se le des cribe como mut; no obstante, a menudo se observa más tarde que un gen mut equivale a una actividad de replicación o reparación conocida. Los tipos generales de actividades identificadas por los genes mut se dividen en dos grupos: • El grupo principal consta de componentes de sistemas de reparación de apareamientos erróneos. Cuando no se elimina un par de bases dañado o mal apareado ames de la replicación puede indudrse una mutación. Las funciones de este grupo incluyen la metilasa dam, que identifica la diana para reparadón, y las enzimas que participan de manera di· recta o indirecta en la eliminación de tipos particulares de daño (mutH, -S, ·L, - Y). • Un grupo más pequeño, tipificado por dnaQ (que codifica una subunidad de la polimerasa m de DNA), se encarga de la precisión de la síntesis del nuevo DNA. Cuando se retira una distorsión estructural del DNA, se restablece la secuencia del tipo silvestre. En casi tOdos los casos. la distorsión se debe a la crea· ción de una base que no se encuentra de manera natural en el DNA y que, por tanto, es reconocida y retirada por el sistema de reparación. Surge un prob lema si la diana para la reparación es una asociación mal apareada de bases (normales) que se crea cuando una tenía mmadón. El sistema de reparación no tiene medios intrínsecos para conocer cuál es la base de tipo silvestre y cuál la mutante. Todo lo que detecta es un par de bases mal apareadas, cualquiera de las cuales puede proveer la diana para la reparación por escisión. 508

CAPÍTULO 20 Sistemas de reparación

Si se retira la base mutada, la secuencia de silvestre se restablece. No obstante, si sucede q retiró la base original (de tipo silvesrre), la l"''· secuencia (mutante) se torna fija . Sin embar::. menudo la dirección de la reparación por ese no es aleatoria, sino gue en su lugar tiene una dencia ta l que puede llevar al res tablecimien~ la secuencia de tipo silvestre. Se toman algunas precauciones para gu' · reparación en la d irección correcta. Por eje.c para casos como la desam.inat ión de la 5-metil.... sina para obtener tinlina, hay un sistema esr que restablece la secuencia aprop iada (véase· bién la sección l. l 5. Muchos puntos calientes resultado de bases modificadas). La desam in.; genera un par G-T y el sistema que actúa sobTe ~ pares tiende a corregirlos a pares G-C (en vez dl res A·T}. El sistema que se encarga de esta rea( incluye MmL, los producws S que retiran las los apareamientos erróneos G-T y C· T. El sistema mutT, M, Y se enca rga de las ca cuencias del daño oxidativo. Un tipo ímportA de daño químico lo ocasiona la oxidación de G produce 8-oxo -G. En la se mue que el sistema actúa en tres niveles. la proteína.\ hidroliza al precursor dal'í.ado (8 -oxo-dGTP). lo . evita que se incorpore al ONA. Cuando la guaestá oxidada en el DNA, su contraparte es la cito) y MutM retiTa de manera prderente la 8-oxo-C los pares 8-oxo-G-C. La guanina oxidada se aperna! con A y, por ello. cuando persiste la 8 -oxo-G replica, genera tu1 par 8-oxo-G-A. La MutY elin· la A de estos pares. MutM y MmY son glucosi!: que retiran de manera directa una base del DN.que crea un sitio apurínico al que reconoce una donucleasa cuya acción desencadena la participa del sistema de reparación por escisión. Cuando ocurre11 errores de apareamient(l rante la replicación en E. coli, es posible d i stin~ . la cadena original del DNA. En cuamo rermii;z replicación del DNA rnetilado, sólo la cadena genilora original porta grupos metilo. CuaoJ cadena que acaba de sintetizarse eslá espera la inrroducciÓJl de grupos metilos se pueden di guir las dos cadenas. Esto constituye la base de un sistema par. corrección de errores de replicadón . El gen : codifica una me tilasa cuya diana es la adenil'c la secuencia g~J¿ (véase Ja Figura 15.7). El es . hernimetilado permite disting uir orígenes con repl icación. Un sistema de reparación relacior ~ con la replicación usa los mismos sitios diana, La muestra que el DNA que .:: tiene pares de bases unidos en forma erróne: repara de manera preferente mediante la ese'

Me Et dfmero MutS se une al

apareamiento erróneo

V/vJoJADv'AilVA/A/A/7~/

Replicación

~

1 El dfmero Mutl se une al MutS

El error de replicacrón genera apareamiento erróneo A·C Me GAJE:..

CTAG

GATC

\..lT\.0'\..Qvt\/lVTVA/A/NJV~V/

!

C

La adenina no metilada hace blanco en la cadena para reparacrón

MutS se transloca a

GATC

MutH se une al complejo

en la secuencia GATC

lJi.te-. CTAG

La cadena no metrlada se fragmenta

CTAG Metilación de Dam

l

CTAG Me

T La sfntesis de DNA cornge el

El MutS reconoce un apareamiento erróneo y lo transloca a un sitio GATC. la MutH escinde la cadena no metilada en el GATC. Las endonucleasas fragmentan la cadena desde GATC hasta el sitio de apareamiento erróneo.

error

T

Las secuencias GATC son dianas para la meti;sa Dam después de la replicación. Durante el periodo anterior • esta metilación, la cadena no metilada es la diana para la ~~aración de bases con apareamiento erróneo.

la cadena que carece de metilación. La escisión es amplia; se pueden reparar de preferencia s apareamientos erróneos de hasta > 1 kb alredeJr de un sitio GATC. El resultado es que la cadena .cién sintetizada se corrige hacia la secuencia de la wdena progenitora . Las mutames de dan-r en E coli muestran una .;yor tasa de mutaciones espontáneas. Este siste..; de reparación, por tanto, ayuda a disminuir el .mero de mutaciones causadas por errores en la ~licación. Consta de varias proteínas codificadas r genes mut. la proteína MutS se une al par mal areado y se agrega MutL. La MutS puede utilizar ::. sitios de unión al DNA, como se ilustra en la . En el primero se reconocen de ma ··a específica apaream ien tos erróneos. El segundo es específico para la secuencia o estructura y se ~liza para translocación junto con el DNA hasta comrar una secuencia GATC. Se utiliza hidrólisis _ ATP para impulsar la translocación. La MutS se .~ al sitio de apareamiento erróneo y al DNA a edida que se transloca y, como resultado, crea un ~.ice en el DNA. ~stanre

El reconocimiento de la secuencia GATC origina que la endonuclcasa MutH se u na a MutSL. Luego, la endonucle::asa fragmenta la cadena no metilada . Esta cadena es después escindida del sitio GATC hacia el sitio de apareamiento erróneo. La escisión puede ocurrir en dirección 5'-3' (con uso de RecJ o exonudcasa VII), o 3'- 5' (con uso de exonucleasa I), y es asistida por la helicasa UvrD. La polimerasa m de DNA sime tL~a la nueva cadena de DNA. El sistema de reparación MSH de Sacharomyces cerevisiae es homólogo del sistema mut en E. co/i. La Msh2 es el bastidor para el aparato que recono ce apareamientos erróneos. Las proteínas Msh3 y Msh6 proveen factores de especificidad. El complejo Msh2·Msh3 es hélices con apareamiento erróneo de dos a cuatro nucleótidos. y el complejo Msh2-Msh6 se une a apareamientos erróneos de una sola base. inserciones o delectones. Después se requieren otras proteínas para el proceso mismo de reparación. También se encuentran homólogos del sistema MutSL en células de eucario tas superiores. Además de la reparación de apareamientos erróneos de pares de bases ún icos, se encargan de la de apa reamientos erróneos que surgen corno resultado de deslizamientos en la replicación . En una región como un microsatéUte, donde una secuencia muy corra se repite varias veces, la realineación entre la cadena hija recién sintetizada y su molde puede llevar a "tanamudeosH donde la polimerasa de DNA

?.O .., Control de la dirección de la reparación de apareamientos erróneos

509

TCAGTGTGTGTGT AGTCACACACACA CA AC El deslizamiento de la replicación genera una hélice de una sola cadena

Daño Las bases en una cadena de DNA están dañadas

la replicación genera una copia con una brecha frente al daño y una copia normal

,MutS se une al apareamiento erróneo 1

Se une MutL

Recuperación Se repara la brecha cuando se recupera una secuencia de una copia normal

El apareamiento erróneo lo retira una exonucleasa, una helicasa, una polimerasa de DNA y una ligasa El sistema MutS/MutL inicia la reparación de apareamientos erróneos producidos por el deslizamiento de la replicación.

se desliza hacia atrás y sintetiza unidades de repetición adicionales. Estas unidades en la cadena hija se expulsan como una hélice de cadena única desde la doble hélice (véase la Figura 6.28). Los homólogos del sistema MutSL las reparan, como se muestra en la La importru1cia del sistema MutSL para la reparación de apareamientos erróneos queda de manifiesto por la elevada tasa con la que se encuentra que es de· fectuoso en los cánceres humanos. La pérdida de este sistema lleva a un mayor ú1dice de mutaciones.

Sistemas de reparación por recombinación en E. col7' Conceptos principales • Los genes rec de E. coli codifican el principal sistema de recuperación. El principal sistema de recuperación actúa cuando la replicación deja una brecha en una cadena recién sintetizada que se encuentra frente a una secuencia dañada.

• Se utiliza la cadena única de otro segmento dúplex para sustituir la brecha. Se retira entonces la secuencia dañada y se presenta una nueva síntesis.

510

CAPÍTULO 20 Sistemas de reparación

Se repara la brecha en una copia normal

Un sistema de recuperación de E. coli L:: :: una cadena normal para sustituir la brecha dejada en ur:: dena que acaba de sintetizarse frente a un sitio de dar: reparado.

Los sistemas de reparación por recombinación _ lizan actividades que se superponen con las e,prendidas en la recombinación genética. A n también se denominan de ''reparación por repL ción" porque actúan después de la replicación. 7¿_ sistemas son eficaces para abordar los defectos p: ducidos en cadenas hijas dúplex por la replicacdc un molde que contiene bases dañadas. En la se incluye un ejemplo. El reinicio de horquillas de replicación varadas podría tener ... función importante en los sistemas de reparar por recombinación (véase la sección 18.17, Es ne sario el primosoma para reiniciar la replicación Considérese una distorsión estructural, coun dímero de pirimidinas, en una cadena de t. doble hélice. Cuando se replica el DNA, el dún~­ impide que el sitio dañado actúe como molde. _ replicación se ve fot7..ada a pasar por alto ese sitio ~ probable que la polimerasa de DNA avance hast2 di mero de pirimJdinas, o cerca, y Juego cesa la sin·sis de la cadena hija correspondiente. La replicac se reinicia a distancia más adelante. Queda una b: cha sustancia l en la cadena recién sintetizada.

Las cadenas dúplex hijas resultantes tienen na · uralezas diferentes. Una posee la cadena progeni.ora que contiene el segmento dañado frente a una adena de síntesis reciente con una brecha larga. El tro duplicado tiene la cadena progenitora sin daño, ~ue se ha copiado en una cadena complementaria .1orma l. El sistema de recuperación saca ventaja de -a cadena hija normal. La brecha opuesta al siúo dañado en la primera cadena dúplex se llena mediame la sustracción ie la cadena única homóloga de DNA de la duplex 1ormal. Después de este intercambio de una sola t:adena, la forma dúplex receptora tiene una cadena 1rogenitora (dañada) frente a una de tipo silvestre. :...a forma dúplex donadora tiene una cadena pro_.enitora nom1al frente a una brecha; emoncesJ la - rechapuede llenarse mectiante la síntesis de reparadón en la forma habitual, lo que genera una cadena _úplex normal. Así, el daño se confina a la distorsión riginal (si bien los mismos episodios de reparación o ecombinación deben repetirse después de cada ciclo je repli cación hasta que el daño se remedie con un :stema de reparación por escisión). La principal vía de reparación por recombina'iÓn de B. coli se identifica por los genes rec (véanse ...as Figuras 19. 13 a 19.15) . En E. coli con una repara:~ón por escisión deficiente, la mutación del gen recA J prirne en esencia todos los recursos de reparación recuperación restantes. Los in tentos por replicar . DNA en células uvr recA- producen (ragmentos e DNA cuyo tamaño corresponde a la distancia eserada entre los d.úneros de timinas. Este resu ltado -nplica que Jos dímeros conslituyen un obstáculo : tal para la replicación cuando RecA no ftmciona. lo . ue explica porqué la bacteria con la doble mutación o pu ede tolerar más de uno a dos clfmeros en su :enoma (en comparación con la capacidad de una .gaeria de tipo silvestre de manejar hasta 50). Una vía rec imp lica a los genes recBC y está bien escrita; la otra involucra a recP y no está tan .en definida. Cumplen funciones diferentes in vivo. _¿ vía RecBC participa en el reinicio de las horgui~ de replicación varadas (véase la sección 20.9, ...z recombinación es un importante mecanismo ara recuperarse de errores de la replicación) . La a RecP participa en la reparación de brechas de la ...zdena hija que quedan después de la replicación ás allá de un dímero de pi rimidinas. Las vías RecBC y RecF fundonan ambas antes -e la intervención de RecA (aunque en diferentes rmas). Conducen al vínculo de RecAcon un DNA -= cadena única. La capacidad de RecA de intercam:n cadenas únicas le permite llevar a cabo el paso .x recuperación de la Figura 20.18. A continuación, .';actividades de nuclcasa y polimerasa concluyen · actividad de reparación.

La vía RecF contiene un conjunto de tres genes:

recF, recO y recR. Las proteínas forman dos tipos de complejos, RecOR y RecOF. Facilitan la formación de fi lamentos RecA en el DNA de cadena única. Una de sus funciones es permitir que los filamentos se ensamblen a pesar de la presencia del SSB, que es inhibitoria. Se cree q ue funcionan en las brechas; sin embargo, la reacción in vitro requiere un extremo 5' libre. Las designaciones de genes ele reparación y recombinación se basan en los genotipos de las nm" tantes, pero a veces u na mutación aislada en un conjunto de circunstancias y denominada locus uvr parece esrar aislada en otro conjunto de cirnwstancias como locus rec. Esta incenidumbre es imponante. Aún no se define cuántas funciones pertenecen a cada vía o cómo interactúan ambas. Las vías uvry rec no son por completo indepenctientes porque las mu tantes de uvr muestran menor eficacia en la repara ción por recombinación. Se debe esperar encontrar una red de nucleasa, polimerasa y otras actividades, que constituyen sistemas de reparación superpuestOS de manera parcial (o donde una enzima por lo general utilizada para proveer alguna función puede ser sustituida por otra de una vía diferente) .

La recombinación es un

mecanismo importante de recuperación ante errores de replicación Conceptos pñncípales • Una horquilla de replicación puede quedarse varada cuando encuentra un sitio dañado o una hendidura en el DNA. Una horquilla varada puede revertirse por el apareamiento entre las dos cadenas recién sintetizadas. • Una horquilla varada puede reiniciar la reparación del daño y utilizar uoa helicasa para poder avanzar. La estructura de la horquilla varada es la misma que la unión Holliday y puede convertirse en una cadena dúplex y DSB por la acción de las resolvasas.

Todas las células tienen muchas vías para reparar el daño en el DNA. La vía que se utilice dependerá del tipo de daño y las circunstancias. Las vías de reparación por escisión pueden, en principio, usarse en cualquier momento, pero las de reparación por recombinación se pueden usar sólo cuando h ay una segunda cadena dúplex con una copia de la secuencia dañada, esto es, después de la replicación . Se presenta una circunstancia especial cuando se replica el DNA dañado porque la horquilla de replicadón puede quedarse varada en el sitio del daño.

'2G .9 La recombinadón es un mecanismo importante de recuperación ante errores de replicación

511

La horquilla de replicación se detiene en el sitio daf\adc La horquilla de replicación se queda varada en el sitio dañado

=======* La horquilla de replicación se revierte y colapsa La horqutlla de replicación se revierte y colapsa

Una resolvasa corta en la unión Se repara el daño

Se ha creado un

osa

La helicasa res1ablece la horquilla de replicación

Se crea otro osa si el daño consiste en una hendidura

Una horquilla de replicación se queda varaaa cuando alcanza un sitio dañado en el ONA. La reversión de la horquilla permite que las dos cadenas hijas se apareen. Después de que se ha reparado el daño, se restablece la horquilla por la migración de rama en avance catalizada por una helicasa. Las puntas de flecha indican los extremos 3'.

Las vías de reparación por recombinación permiten el restablecimiento de la horquilla después de que se ha reparado el daiio, o que Jo pasen por alto. La muestra un posible resultado cuando se detiene una horquilla de replicación. La horquilla deja de avanzar cuando encuentra el dat'io. El aparato de replicación se desensambla. al menos en forma parcial. lo que permite que ocurra migración de ramas cuando la horquilla se desplaza hacia atrás de manera eficaz y las nuevas cadenas hijas se aparcan para formar una estructura dúplex. Después de que se ha reparado el daño, una helicasa hace girar hacia adelante la horquilla para restable cer su estruc!ura. Después. el aparato de repücación se puede recnsamblar y se reinicia el proceso (véase la sección l 8.17, El prímosoma es necesario para reiniciar la replicación}. Se requiere polimerasa II de DNA para el reinicio de la replicación, que después es sustituida por la polimerasa m de DNA. 512

CAPÍTULO 20 Sistemas de reparación

La estructura de una horquilla de replicacvarada se asemeja a una unión de Holliday y las resolves:. pueden resolverla en la misma forma . El resultado depende : que el sitio dañado contenga una hendidura o no. El result:: 1 muestra que se genera una rotura de doble cadena cuandc corta un par de cadenas en la unión. El resultado 2 muestra -: se genera un segundo DSB en el sitio del daño si contiene _hendidura. Las puntas de flecha indican los extremos 3'.

La vía para el manejo de una horquiLla de rer cación varada requiere enzimas de reparación. Er. E. co/í los sistemas RecA y RecBC tienen una fund importante en esta reacción (de hecho, ésa pue..:: ser su principal función en la bacteria). Una posi~-, vía es que RccA estabilice el DNA de cadena úr. mediante su unión en la horquilla de replicad varada y quizá al actuar como sensor que detecta suceso de detención. El RecBC participa en la re:-~ ración del daño por escisión. Después de que se·~ reparado el daño, se puede reiniciar la replicació;Otra vía puede usar la reparación por reco· binación, quizá las reacciones de intercambio _ muestra que cadenas de RecA. La

La horqu illa de replicación se queda varada en el sitio dañado

-==-~""== ====---==- * Una cadena progenitora no dañada presenta entrecruzamiento

No se conoce la secuencia exacta de los sucesos, pero en la se ilustra una posibilidad. El principio es que el episodio de recombinación ocurre a cada lado del sitio dañado, lo que permite que la cadena únka no dañada se aparee con la dañada. Ello permite que la horquilla de replicación se reconstruya de manera que la repiicadón pueda continuar y evite de manera eficaz el sitio dañado.

E

La RecA desencadena el sistema SOS

Conceptos princ1pales La cadena desplazada se aparea con la complementaria

• El daño del DNA causa que RecA desencadene la respuesta SOS, que consta de genes que codifican muchas enzimas de reparación. la RecA impulsa la actividad de escisión propia de lexA. la LexA reprime el sistema SOS; su escisión propia activa esos genes.

Ocurre un segundo entrecruzamiento

La resolvasa actúa en las uniones

Se reinicia la replicación

Cuando una horquilla de replicación se queda arada, una reparación por combinación puede colocar una :::dena sin daño frente al sitio dañado, lo que permite que ·Jnti núe la replicación .

-srru ctura de la horquill a varada es en esencia la ::isma qu e la de una unión Holliday creada por :: recombinación entre dos DNA dúplex, lo que la _ 1nvierte en una diana para las resolvasas. Se ge·cra una rotura de la doble cadena si una resolvasa ::scin de cualqu ier par de cadenas complementarias. •demás, si el daño es, de hecho, u na hendidura, se .:-ea otra rotura de la doble cadena en este sitio. Se pueden rescatar las horquillas de replicación :aradas mediante la reparación por recombinación.

La participación directa de la proteína RecA en la reparación por recombinación es sólo una de sus actividades. Esta extraordinaria proteína tiene también otra fundón bastante distintiva. Se puede activar con muchos tratamientos que dañan el DNA o inhiben la replicación en la E. coli, lo que hace que desencadene una serie compleja de cambios fenotí picos llamados respuesta SOS, que incluye la expresión de muchos genes cuyos productos abarcan funciones de reparación. Estas actividades dobles de la proteína RecA hacen difícil saber si una deficiencia en la reparación de células mutantes para recA se debe a la pérdida de la fu nción de intercam bio de cadenas del DNA de RecA o a alguna otra función cuya inducción dependa de la actividad de proteasa. La inducción del daño puede adoptar la forma de irradiación ultravioleta (el caso más estudiado) o deberse al enlace cruzado o a agentes alquilantes. La inhibición de la replicación por cualquiera de varios medios, corno la privación de timina, la adición de fármacos o mutaciones en varios de los genes dna, tiene el mismo efecto. La respuesta adopta la forma de una mayor capacidad de reparación del DNA dañado, que se logra medianre la inducción de la símesis de los componentes del sistema de reparación por escisión de parche largo y las vías de reparación por recombinación Rec. Además, se inhibe la división celular. Se pueden inducir profagos Jisogénicos . El episodio inicial de la respuesta es la activación de RecA por el tratamiento dañino. No se sabe mu cho de la relación entre el suceso dañino y el cambio ?0. O La RecA desencadena el sistema SDS

513

GENES DIANA

CIRCUITO REGULADOR

1

t

Gen recA reprimido

GenlexA

1 Gen diana reprimido

INDUCCION DE RecA

El RecA desencadena la escisión de LexA

Gen recA inducido

Gen lexA

Gen diana expresado

La proteína LexA reprime muchos genes, incluso las funciones de reparación, recA y lexA . La activación de RecA lleva a la escisión proteolítica de lexA e induce a todos estos gene$.

súbito en la actividad de RecA. Una diversidad de episodios lesivos puede inducir la respuesta SOS; por ello. el trabajo actual se centra en la idea de que la RecA se activa por la presencia de algún producto intermedio común en el metabolismo del DNA. Es probable que la señal inductora consista en una pequeña molécula liberada del DNA o alguna estructura formada en el DNA mismo. In vitro, la activación del RecA requiere la presencia de DNA de cadena única y ATP. De este modo, la señal de activación podría ser la presencia de una región de cadena ünica en un sitio de daño. Cualquiera que sea la forma que adopte la señal, su interacción con RecA es rápida: la respuesta SOS ocurre en unos cuantOs minutos después de iniciar el tratamiento lesivo. La activación de Re cA ca usa la escisión pro teolitica del producto del gen lexA. La LexA es una proteína pequeña (22 kD) relativamente estable en célu las no tratada s, donde actúa como represora en muchos operones. La reacción de escisión es inusitada; la LexA tiene una actividad latente de proteasa activada por RecA. Cuando se activa la RecA, hace que lex.A realice una escisión autocatalítica; esto desactiva la función del represor LexA e induce de manera coordinada a todos los operones a los que .~e unió. La vía se ilustra en la Los genes diana para la represión por LexA incluyen muchas funciones de reparación. Algunos de estos gen es SOS son activos en células tratadas; otros son activos en células no tratadas, pero e l gra514

CAPÍTULO 20 Sistemas de reparación

do de expresión aumenta con la escisión de l e En el caso d.e uvrB. que es componente del sist ... de reparación por escisión, el gen tiene dos pn'~ tores; uno actúa de manera independiente de L~ e l otro está sujeto a su control. Así, después d : escisión de lexA e l gen se puede expresar desd ~ segundo promotor y también desde el primero La proteína LexA reprime sus genes dia.n.a: unirse a un segmento de 20 bp del DNA llam~ caja SOS. que incluye una secuencia de conse con ocho posiciones absolutamente conserva Como ocurre con otros operadores, las cajas S se superponen con los promotores respectivo&. :: el locus lexA. sujeto de la represión autógena. : dos cajas SOS cercanas. En el circuito SOS RecA y LexA son ellamut uas: la RecA desencadena la escisión de l ::r que reprime a recA y a sí misma. La respuesta S por tanto. causa amplificación de la proteína Re así como del represor LexA. los resultados no s. tan conuadíctorios como podrían parecerlo al pr cipio. El aumento de la expresión de la proleína Rees necesario (al parecer) para su panicipaC::ión dir~ ta en las vías de reparación por recombinación. C la indu cción. la concentración de RecA aumerespecto de su cifra basal de -1200 moléculas/cé. hasta por 50 tantos. Su alta concentración en ce las inducidas indica que hay suficiente RecA 1'asegurar que se fragmente roda la proteína Le lo que debería impedir que LexA restablecien; represión de los genes diana. No obstante, la principal importancia de e-. circuito para la célula yace en su capacidad de tornar con rapidez a la normalidad. Cuando se re: la señal de inducción, la ptoteína RecA pierdecapacidad de desestabilizar a LexA. En este momt · w, el gen lexA se está expresando en un grado .Len ausencia de RecA activada, la proteína Lex.-\ acumula con rapidez en la forma no fragmenu y desactiva los genes SOS. lo que explica porque respuesta SOS se revierte con libertad. La RecA también desencadena la escisión otras dianas celulares. a veces con consecuenc... más directas. La proteína UmuD se escinde cu~ do se activa la RecA; el episodio de escisión acr:UmuD y el sistema de reparación su sceptible errores. El mode lo actual para la reacción es que complejo UmuD 2 UnmC se una al filamento Re-_ cerca de un sitio de daño. RecA active el comr:: mediante la escisión de UmuD para generar Unn..: y el complejo. entonces. sintetice un segmente DNA para sustituir el material dañado. La activación de RecA también causa esáSl. de algunas otras proteínas represoras, como las

:arios profagos . .Entre ellas está el represor f.. (con d que se descubrió la actividad de proteasa), lo que rxplica porqué se induce A. por irradiación ultra. ioleta; se fragmenta el represor lisogénico, lo que ..ibera el Iago para ingresar al ciclo lítico. Esta reacdón no es una respuesta celular SOS, ~ino que más bien significa que el profago reconoce 4ue la célula está en problemas. Entonces, la super. ivencia se asegura de la mejor fonna mediante el ngreso al deJo lítico para generar una progenie de ..agos. En e!>te !lentido, la inducción de profagos se apoya en el sistema celular al responder al mismo .ndicador (c1Ctivadón de Re cA). Las dos actividades de RecA son relativamente mdependienres . La mutación recA44 1 pennite que -:>curra la respuesta SOS sin tratamiento de inducción, tal vez porque RecA se mantiene de manera ~spo ntáne a en el estado activado. Otras mutaciones ruprimen la posibilidad de activación. Ningún tipo Je mutación afecta la capacid11d de RecAde manejar el DNA. El tipo inverso de mutación, que desactiva .a función de recombinación pero deja jntacta la capaddad de inducir la respuesta SOS, permitiría desenmarañar los efectos directo e indirecto de RecA tn las vías de reparación.

E

Las células eucarióticas tienen sistemas de reparación conservados

Ccnceptos principales Las mutaciones RAD de levaduras, identificadas por fenotipos sensibles a la radiación, ocurren en genes que codifican sistemas de reparación. La xerodermia pigmentosa (XP) es una enfermedad humana causada por mutaciones en cualquiera de varios genes de reparación. Un complejo de proteínas. que incluye productos de XP y el factor de transcripción TF 11 H, provee en los seres humanos un mecanismo de reparación por escisión. • Los genes con actividad transcrípcional se reparan de manera preferente.

:os tipos de funciones de reparación reconocidas .m E. coli !os comparten una amplia variedad de or ganismos. Los sistemas eucarióticos mejor descritos ron las levaduras, donde Rad5I es la contrapane je RecA. En las levaduras, la principal función de >a proteína de transferencia de cadenas es la recom "'inación homóloga. Muchos de los sistemas de re1aración que se observan en la~ levaduras tienen :omrapanes directas en las células eucarióticas su•eriores, y en varios casos estos sistemas tienen que er con enfermedades humanas.

Los genes RAD imervienen en las ftwciones de reparación; se han descrito en términos genéticos en las levaduras por su stnsibilidad a la radiación . Hay tres grupos generales de genes de reparación en la levadura S. cerev1siae. identificados por el grupo RADJ (involucrado en Ja reparación por escisión), el grupo RAD6 (indispensable para la reparación posterior a la replicación) y el RAD52 (encargado de mecanismos similares a la recombinadón). El grupo RAD52 se divide en dos subgrupos por una diferencia de fenotipos mutantes. Un subgrupo afecta la recombinación homóloga, como se observa por la disminución de la rccombinación mitótica en RAD50, RAD51. RAD54, RAD55 y RAD57 Estas proteínas Rad forman un complejo multiproteínico en una rotura de la doble cadena. Después de que una exonuclcasa ha actuado en los extremos libres para generar colas de una sota cadena, la Rad51 inicia el proceso al unirse al DNA dt cadena única para formar un filamen to de nucleoproteínas. Las proteínas Rac\52. Rad55 y Rad54 se unen entonces de manera secuencial al filamento. Por el contrario, los índices de recombinación se incrementan en las mutantes RAD59, MREll y XRS:J; este subgrupo no tiene defidencia en la recombinación homóloga. pero sí en las reacciones de unión al DNA no homólogas. Una superfamilia de polimerasas de DNA que interviene en la síntesis de DNA para sustituir el material en los sitios dañados se identifica por los genes dmB y unmCD que codifican las polimerasas IV y V de DNA en E. coli, el gen RADJO que codifica una polimerasa 11 de DNA en S. cerevisiae y el ge:J.. XPV, que codifica el homólogo humano. Algunas veces se les llama polimerasas de ONA translesión. Una diferencia entre las enzimas bacteriana y eucariótica es que la última no es susceptible de error en los dímeros de timinas: introductn con exactitud un par A-A en oposici6n a un dúnero T-T. Sin embargo, cuando se replican en otros sitios de daño, son más susceptibles de introducir errores. Una característica interesante de la reparación que se ha descrito mejor en las levaduras es su conexión con la transcripción. Los genes con actividad transcripciooal se reparan de manera preferente. La consecuencia es que la cadena transcrita se repara de manera preferente (lo que elimina el impedimento de la transcripción). La causa parece ser una conexión mecánica entre el aparato de reparación y la polimerasa de RNA. La proteína Rad3, que es una helicasa indispensable para el paso de la csc:sión, es un componente de un factOr de transcripción vinculado con la polimerasa de RNA (véase la sección 24.12, Una conexión entre lranscripción y reparación). Las células de los mamíferos muestran heterogeneidad en la cantidad ele DNA resintetizado en

ZO.l.. Las células eucarióticas tienen sistemas de reparación conservados

515

El DNA esta dañado

TF11H

XPF ERCC1

XPB

XPD helicasas

endonucleasas

TF11H abre la doble hélice

""'

VJ\U\6 • r¡-~q XPG

XPF ERCC1

XPG escinde el extremo 3' de la lesión

XPF ERCC1

XPF/ERCC1 escinde el sitio S' de la lesión

meros de timinas. En la se muestra participadón en la vía de reparación. El comr· se une al DNA en un sirio de daño, tal vez por mecanismo que implica la acción colaboradora varios de sus componentes. Las cadenas de DNr~ desenrollan entonces casi 20 bp alrededor del e dañado. Esta acción la emprende la actividad de · helicasa del factor de transcripción TF11H, en sí r mo un gran complejo que induye los producto~ varios genes XP y que participa en la reparació1: DNA dañado que encuentra la polimerasa de R durante la transcripción. Después, las endonuc' sas codificadas por genes XP hacen cortes a CoL lado de la lesión. El segmento de una sola cadc que incluye las bases dañadas puede, entonces, ~· tituirse mediante la síntesis de una de reposicit!,. En casos donde la replicación se encuen tra ... un dímero de timinas que no ha sido retirad( requiere la actividad de polimerasa r¡ de DNA r~ avanzar y dejar atrás el dímero, el cual es codific.ó por XPV. Los cánceres de piel que ocurren er mutantes de XPV se deben, al parecer, a la pérti de la polimerasa de DNA.

Un sistema común repara las roturas de doble cadena Conceptos principales

516

Una helicasa desenrolla el DNA en un sitio dañado, las endonucleasas cortan a ambos lados de la lesión y se sintetiza un nuevo DNA para sustituir el segmento extirpado.

• La vía NHEJ puede·ligar extremos romos de DNA dúplex. • Las mutaciones en la vía NHEJ causan enfermedades¿los seres humanos.

cada lesión después de un daño. No obstante, los parches son siempre relativamente conos, de menos de 10 bases. Ciertas enfermedades heredi tarias humanas ofrecen indicios de la existencia y la imponancia de los sistemas de reparación en los mamíferos. La que mejor se ha investigado es la xerodermia pigmentosa (XP), un trastorno recesivo que causa hipersensibilidad a la luz del sol, y en panicular a su fracción ultravioleta. La deficiencia causa rraswrnos cutáneos (y a veces defectos más graves). La enfermedad se debe a una deficiencia en la repé\ración por escisión. Los fibroblastos de los pa dentes con XP no pueden cunar dímeros de pi rimidinas y otros productos voluminosos. Las mutaciones se encuentran en ocho genes conocidos como XP-A a XP -G. Tienen homólogos en los genes RAD de las levaduras, lo que muestra que esta vía se usa en forma generalizada en las eucariolas. Un complejo proteinico que incluye productos de varios genes XP se encarga de la esdsión de dí-

Ocurren roturas de cadena doble en las céh.. bajo diversas circunstancias. Inician el procest recombinación homóloga y son intermediarias . la recombinación de los genes de inmunoglobul: (véase la sección 23.1 O, las proteínas RAG catafu: la rotura y reunión). También se presentan ce consecuencia del daño al DNA; por ejemplo, ~ inadiación. El principal mecanismo para repa estas roturas se denomina unión de extremos homólogos (NHEJ ) y consiste en juntar y ligar extremos romos. Los pasos comprendid os en l\THEJ se resu!'" _ en la . El mismo complejo enzimá· realiza el proceso en NHEJ y la recombinación m unitaria. La primera etapa es el reconocimiem los extremos rotos por un heterodímero consritL por las proteínas Ku70 y K uSO, que fo rman un J:> · tidor que mantiene juntos los extremos y pem:: que otras enzimas actúen sobre e!Jos. Un com neme clave es la <.:inasa de proteínas dependien:L DNA (DNA-PKcs), que es anivada por el DNA r

CAPÍTULO 20 Sistemas de reparación

forilar dianas proteínicas. Una de estas dianas es ::>roteína Anemis, que en su fonna activada tiene ~dones de exonucleasa y endonucleasa, y puede rtar extremos colgantes y escindir las horquillas . : neradas por recombinación de genes de inmuno- 1bulinas. No se conoce la actividad de la polimera:: de DNA que llene cualquier protrusión restante ::una sola cadena. La unión real de los extremos de doble cadena la realiza la ligasa IV del DNA, que ::úa junto con la proteína XRCC4. Las mutaciones - cualquiera de estos componentes pueden hacer .as células eucarióticas más sensibles a la radiain. Algunos de los genes de estas proteínas tienen .Citación en pacientes con enfermedades debidas a diciencias en la reparación del DNA. El heterodímero Ku es el sensor que detecta el Jño del DNA mediante la unión a los extrem os ros . La estructura cristalina en la .uestra que se une sólo a los extremos. El cuerpo -= la p roteína se extiende casi dos giros sobre una ~ra del DNA (inferior), pero un puente estrecho 'ltre las subunidades localizado en el centro de la ¡ructura rodea por completo al DNA, lo que sig-~ca que el heterodímcro necesita deslizarse hada ., extremo libre. El K u puede unir extremos rotos al enlazar dos .oléculas de DNA. la capacidad de los heterodíeros de I
5'NN NNN 3' NNNNNNNNN

Reconoctmfento ormero Ku det extremo

NN NNN N3' NNNN5'

1

t

S' NN N N N 3' NNNNN N

Recorte

N

Artemls + DNA-PK

S' N NNN N 3' N N NNIII ,

Llenado

Enzima desconocida

N N N N3' IIINNN5'

1 f

5'N N N N N N ' 3' NNNNN N ~

. . Ltgactón

N N N N 3' N N N NS'

N NN N 3' NNN5'

Lígasa IV de 1 DNA + XACC4 t

5' N N N N N N N N N N N 3' 3' N N N N N N N N N N N 5'

Para la unión de extremos no homólogos es indispensable el reconocimiento de los extremos rotos, el recorte de los extremos colgantes, el llenado, o ambos, seguidos de la ligación.

El heterodímero Ku70-Ku80 se une a lo largo de dos giros de la doble hélice del DNA y la rodea en el centro del sitio de unión. Fotograña por cortesía de Jonathan Goldberg, 1"1emorial Sloan-Kettering Cancer Center.

cuencia de roturas cromosómicas e intercambios de cromátidas hermana!>. La BLM se vincula con otras proteínas de reparación como parte de un complejo grande. Una de las proteínas con las que interactúa 20.12 Un sistema común repara las roturas de doble cadena

517

Accesible a

otras proteínas

Si dos heterodímeros de Ku se unen al DNA, la dista ncia entre los dos puentes que rodean el DNA es de - 12 bp.

es hMLHl , que repara apareamientos erróneos y es homóloga humana de la mutL bacteriana. Los homólogos de levaduras de estas dos proteínas, Sgsl y MLHl también se asocian, lo que identifica a sus genes como parte de una vía de reparación bien conservada. El síndrome de rotura de Nijmegan es producto de mutaciones en un gen que codifica una proteína (llamada de manera variable Nibrina, p95, o NBSl) que es un componente del complejo de reparación Mre 11/Rad.50. Su participadón en la reparación de roturas de la doble cadena queda de manifiesto por la formación de focos que contienen e l grupo de proreínas cuando se irradian células humanas con agenLes que inducen roturas de doble cadena. Después de la irradiación, la cinasa ATMP (codificada por el gen A T) fosforila a NBSI; esto activa el complejo, que se localiza en sitios de DNA dañado. Los pasos siguientes comprenden el desencadenamiento de un punto de revisión (un mecanismo que impide que el ciclo celular avance hasta que se repare el daño) y el reclutamiento de otras proteínas que se requieren para reparar el daño.

E

Resumen

las bacterias contienen sistemas que mantienen la integridad de sus secuencias del DNA ante daños o errores de replicación y que distinguen entre eJ DNA y secuendas de una fuente extraña. Los sistemas de reparación pueden reconocer bases mal apareadas, alteradas o faltantes en el DNA, así como otras distorsiones estructura les de la doble hélice. Los sistemas de reparación por escisión fragmentan el DNA cerca del sitio del daño, retiran una cadena y sintetizan una nueva secuencia para sustituir el material extirpado. El sistema Uvr constituye la principal vía de reparación por escislón en E. coli. El sisLema dam participa en la corrección de apareamientos erróneos generados por la incorporación de bases incorrectas durante la rep licación 518

CAPÍTULO 20 Sistemas de reparación

y actúa al retirar de manera preferente la ba~. la cadena de DNA que no está metilada en 1<; cuencia diana dam. Los homólogos eucariótico sistema MutSL de E. coli participan en la repar&de apareamientos erróneos que provienen del _ lizarniento de la replicación; las mutaciones e : vía son frecuentes en ciertos tipos de cáncer. Los sistemas de reparación por recombinc..:: obtienen información a panir de un DNA dúp.:: la utilizan para reparar una secuencia que ha dañada en ambas cadenas. Las vías RecBC y P actúan ambas antes de Re cA, cuya función de rn ferencia de cadenas panidpa en toda recombina_ bacteriana. Un uso importante de la reparaciór: recombinación puede ser recuperarse de la circ.... tancia creada cuando se queda varada una horq_ de replicación. La orra capacidad de RecA es la de induarespuesta SOS. La RecAes activada por el DNA _ ñado en una íorma desconocida. Desencaden~ escisión de la proteú1a represora LexA, que así lit lo represión de muchos loci e induce la s íntes~ enzimas de las vías de reparación por escisión 1 paración por recombinación. Los genes bajo con:· de LexA poseen una caja SOS operador. La Rttambién activa de manera directa algunas fonT" de reparación. La escisión de represores de fa<. lisogérúcos puede inducir a Jos .fagos a entrar al ~ lítico. Los slsremas de reparación pueden conecra· con la transcripción en procariotas y eucariotas, :__ enfermedades humanas se deben a mutaciones : · los genes que codifican actividades de reparad que se asocian a l factor de transcripción TF 0H.-: nen homólogos en los genes RAD de las levadur~ lo que sugiere que este sistema de reparación ~ muy generalizado. La unión de extremos no homólogos (NHEJ • una reacción general para la reparación de extrerr rotos del DNA (eucariótico). El heterod(mero J= reún e los extremos rotos de manera que puedc.,ligarse. Varias enfermedades humanas son producde mutaciones en enzima~ de esta vía.

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Bll

Los sistemas de reparación corrigen el daño al DN1

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BIEI

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520

CAPÍTULO 20 Sistemas de reparación

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Transposones ESQUEMA DEL CAPÍTU LO Introducción Las secuencias de inserción son módulos de transposición sencillos • Una secuencia de Inserción es un transposón que codifica las enzimas necesarias para la transposición, flanqueadas por repeticiones terminales invertidas cortas. El sitio diana donde se inserta el transposón se duplica durante el proceso de inserción para formar dos repeticiones en orientación directa en los extremos del transposón. la longitud de la repetición directa es de 5 a 9 bp y es caracteñstica para cualquier transposón particular

Los transposones compuestos tienen módulos IS • Los transposones pueden portar otros genes además de los que codifican la transposición. • Los transposones compuestos tienen una región central flanqueada por un elemento !S en cada extremo. • Cada uno o ambos elementos IS de un transposón compuesto pueden realizar la transposición. • Un transposón compuesto puede actuar como unidad, pero un elemento JS activo en cualquier extremo también puede realizar la transposición de manera independiente.

La transposición ocurre por mecanismos replicativos y no replicativos • Todos los transposones utilizan un mecanismo común donde se hacen hendiduras escalonadas en el DNA diana, el transposón se une a los extremos prominentes y se llenan las brechas. El orden de los episodios y la naturaleza exacta de las conexiones entre el transposón y el ONA diana determinan si la transposición es replicativa o no replicativa.

Los transposones causan reestructuración del ONA • la recombinación homóloga entre múltiples copias de un transposón causa reestructuración del ONA hospedador. • la recombinación homóloga entre las repeticiones de un transposón puede llevar a la escisión precisa o impreciso;.

Intermediarios comunes para la transposición • La transposición se inicia con la formación de un complejo de transferencia de cadenas donde el transposón se conecta con el sitio diana a través de una cadena en cada extremo. • la transposasa Mu forma el complejo por sinapsis de Los extremos del ONA de Mu, seguida de la formación de hendiduras y luego una reacción de transferencia de cadena. Ocurre a continuación transposición replicativa si el complejo se reproduce, y transposición no replicativa si se repara.

La transposición replicativa avanza a través de un cointegrado • La replicación de un complejo de transferencia de cadenas

genera un cointegrado, que es una fusión de los replicones donador y diana. El cointegrado tiene dos copias del transposón que yacen entre los replicones originales. • La recombinación entre las copias del transposón regenera los replicones originales, pero el receptor ha ganado una copia del transposón. • la reacción de recombinación es catalizada por una resolvasa codificada por el transposón.

La transposición no replicativa avanza por rotura y reunión • La transposición no replicativa ocurre cuando se hace una hendidura en una estructura entrecruzada en el par no roto de las cadenas donadoras y se ligan las cadenas diana a cada lado del transposón. • Dos vías para la transposición no replicativa difieren de acuerdo a que el primer par de cadenas del transposón se una al sitio diana antes de que se corte el segundo par (Tn5), o que las cuatro cadenas se corten antes de unirse a la diana (TnlO). La transposición de TnA requiere transposasa y

resolvasa • La transposición replicativa de TnA requiere que una transposasa forme la estructura cointegrada y una resolvasa libere los dos replicones. • La acción de la resolvasa se asemeja a la proteína Int A. y pertenece a la familia general de reacciones de recombinación especificas de sitio similares a las de topoisomerasa, que pasan por un intermediario donde la protelna se une de manera covalente al DNA.

La transposición de Tn10 tiene múltiples controles • la tnhibición de copias múltiples reduce la tasa de transposición de cualquier copia de un transposón cuando se introduce otras del mtsmo transposón en el genoma. • Múltiples mecanismos afectan la tasa de transposición.

Los elementos de control en el maíz causan roturas y reestructuraciones • Se descubrió la transposición en el maíz por los efectos de las roturas cromosómicas generadas por la transposición de "elementos de control". • la rotura genera un cromosoma que tiene un centrómero y un extremo roto, asl como un fragmento acéntrico.

Continúa en lo siguiente página

521

• El fragmento acéntrico se pierde durante la mitosis; lo que puede detectarse por la desaparición de alelos dominantes en un heterocigoto. • La fusión entre los extremos rotos del cromosoma genera cromosomas dicéntricos, que presentan más ciclos de rotura y fusión . • El ciclo fusión-rotura-puente se encarga de la aparición de la variegación somática.

DO Los elementos de control forman familias de transposones • Cada familia de transposones en el maíz tiene elementos de contrpl, autónomos y no autónomos. • Los elementos de control autónomos codifican protelnas que les permiten realizar la transposición. Los elementos de control no autónomos tienen mutaciones que eliminan su capacidad de catalizar la transposición, pero pueden realizarla cuando un elemento autónomo proporciona las proteínas necesarias. • Los elementos de control autónomos tienen cambios de fase cuando sus plopiedades se alteran como resultado de cambios en el estado de metilación.

Hin

Los elementos Spm influyen en la expresión génica

fiiiB

Intervención de los elementos susceptibles de transposición en la disgenesia híbrida • Los elementos P son transposones que portan las cepas P de Drosophila melanagaster, no asl las cepas M. ., Cuando un macho P se cruza con una hembra M, se activa la transposición. • La inserción de elementos P en sitios nuevos en esas cruzas desactiva muchos genes y las hace infecundas.

6m Los elernentos P se activan en la línea germinal • los elementos P se activan en la línea germinal de cruzas de macho P con hembras M, porque un episodic de corte y empalme específico de tejido retira un intrón que genera la secuencia de codificación de la transposasa. • El elemento P también produce un represor de la transposición, que se hereda por vía materna en el dtoplasrna. • La presencia del represor explica porqué las cruzas de machos Mcon hembras P se mantienen fecundas.

Resumen

• Los elementos Spm afectan la expresión génica en sus sitios de inserción, cuando la proteína TnpA se une a sus sitios diana en los extremos del transposón. • Los elementos Spm se desactivan por metilación.

111

Introducción

Los genomas evolucionan por la adquisición de nuevas secuendas y la reestructuración de las existen res. La introducción súbita de nuevas secuencias se debe a la capacidad de los vectores de llevar información entre .los genomas. Los elementos extracromosómicos llevan la información en semido horizontal al mediar la transferencia (por lo general bastante corta) de material genético. En las bacterias, los plásmidos se mueven por conjugación (véase la sección 16. 1O, La conjugación transfiere DNA de cadena única), en tanto los fagos se ctiserninan por infección (véase el Capítulo 14, Estrategias de los fagos). Plásnúdos y fagos en ocasiones rransfieren genes hospedadores junto con su propio replicón. La transferencia directa de DNA tiene lugar entre algunas bacterias mediante transformación (véase la sección 1.2, El DNA es el material ge nético de las bacterias) . En eucariotas, algunos virus, sobre todo retrovirus, pueden transferir informadón genética durante un ciclo infeccioso (véase la sección 22.6, Los retrovirus pueden transduc.il' secuencias celulares). Las reestructuraciones son patrocinadas por procesos internos del genoma. Dos de las principales causas se resumen en la 522

CAPÍTULO 21 Transposones

El transposón genera una nueva copia en un sitio aleatorio

Ocurre entrecruzamiento no equivalente entre secuencias relacionadas (

X

Una causa importante del cambio de secuend; dentro del geno ma es el desplazamiento de un transposón a unuevo sitio. En ocasiones esto tiene consecuencias directas e~ la expresión génica. El entrecruzamiento no equivalente entr-: secuencias relacionadas causa reestructuraciones. Las copias~ transposones pueden ofrecer dianas para tales sucesos.

La rccombinadón no equivalente es productO iel apareamiento erróneo por los sistemas celulares .ara la recombinación homóloga. La recombinadón .1o recíproca da como resultado la duplicación o re:structuración de loci (véase la sección 6. 7, El en·:ecruzamiemo no equivalente reestructura grupos ~e genes). La duplicadón de las secuencias dentro de un genoma constitUye una fu eme importante de 1uevas secuencias. Una copia de la secuencia puede retener su función original. en tanto la otra evolu :iona hacia una nueva función. Es más, se encuenran diferencias significativas entre genomas indivi.iuales en el ámbito molecular debido a variaciones !-'Oiimórficas causadas por la recombinación. Como se apreció en la sección 6.14, Los minisalélites son :niles para el mapeo genético, esa recombinación s:ntre minisatélites se ajusta en su longitud, de ma:Jera que cada genoma individual sea diferente. Otra causa importante de variación la constimyen los elem entos suscep t ibles de transposición o transposones: se trata de secuencias bien definidas en el genoma, que son móviles y pueden :ransportarse a s( mismas a otras localizaciones den rro del genoma. La marca distintiva de un transposón es que no utiliza una forma independiente del elemento (como DNA de fago o plásmido), sino que se traslada de manera directa de un sitio del genoma a orro. A diferencia de casi todos los demás procesos comprendidos en la reesrrucruración del genoma, la transposición no depende de alguna relación entre las secuencias de los sitios donador y receptor. Los transposones sólo pueden moverse a sí mismos, y a veces a otrc1S secuencias. hacia sitios nuevos en otra parte dentro del mismo genoma; son, por tanto, la contraparte interna de los vectores, que puede transportar secuencias de un genoma a otro. Es posible que constitu yen la principal fuente de mutaciones en e l genoma. Los transposones pertenecen a dos clases generales. El grupo de traosposones revisado en este capítulo corresponde a secuencias de DNA que codifican proteínas que pueden manipular el DNA, de manera que se propaguen a sí mismas dentro del genoma. Los transposones revisados en el Capítulo 22. Retrovirus y retrotransposones, tienen relación con los retrovirus y La fueme de su movilidad es la capacidad de hacer copias del DNA de sus productos de transcripción del RNA; las copias de DNA se integran entonces a nuevos sitios en el genoma. Los uamposoncs que se moviliban por medio del DNA se encuentran en procariotas y eucarioras. Cada transposón bacteriano porta genes que codifican las actividades enzimáticas indispensables para su propia transposición. si bien en ocasiones también requieren funciones auxiliares del genoma

donde reside (como la polimerasa o la girasa del DNA}. Hay sistemas semejantes en las eucariotas, si bien sus funciones enzimáticas no están tan bien definidas. Un genoma puede contener elementos fun cionales y no funcionales (defectuosos). A menudo, la mayor parte de los elementos de un genoma eucariótico tiene defectos y ha perdido la capacidad de transposición independiente, aun cuando tOdavía las entima~ producidas por rransposones funcio nales pueden reconocerlos como sustratos para la transposición. Un genoma eucariótico contiene un número y una variedad gra nde de nansposones. El genoma de la mosca Liene >50 tipos de transposones, con un tota l de varios cientos de elementos individuales. Los elememos susceptibles de uansposición pueden facilitar las reestructuraciones del genoma de manera directa o indirecta: • El episodio mismo de la transposición puede causar de lcciones o inversiones, o conducir al movimienLo de una secuencia de hospe~ dador hada una nueva localización. • Los transposones sirven como sustratOs para los sistemas de recombínación celular cuando actúan como "regiones portátiles de homología"; dos copias de un transposón en düeremes localizaciones (incluso en cromosomas distintos) pueden proporcionar sitios para la recombinadón recíproca. Tales in~ tercambios ocasionan deleciones, tnsercione.s, inversiones o rranslocaciones. Las actividades intermitentes de un transposón parecen ofrecer una diana algo nebulosa para la selección na tural. Esa preocupación ha dado lugar a indicios de que los elementos susceptibles de transposición (al menos algunos) no confieren ventaja o desventaja al fenotipo. pero quizá constituyen un "DNA egoísta", aqt1el interesado sólo en su propia propagación. Además, cuando se considera la transposición un episodio diferente del de los otros sistemas de recombinación celular, se acepta de manera tácita la opinión de que el transposón es una enúdad independiente que reside en el genoma. Tal relación del transposón con el genoma se asemejaría a la de un parásito con su hospedador. Al parecer, la propagación de un elemento por transposición se equilibra con el daño que hace si un episodio de transposición desactiva un gen indis ~ pensable o si el número de transposones se conviene en una carga para los sistemas celulares. No obstante, se debe recordar que cualquier suceso de transposición que confiere una ventaja selectiva, por ejemplo, una rccsm.Jcturación genética, llevará a la supervivencia preferente del genoma que pona el transposón activo. 21.1 Introducción

523

Las secuencias de inserción son módulos de transposición sencillos Conceptos principales • Una secuencia de inserción es un transposón que codifica las enzimas necesarias para la transposición, flanq ueadas por repeticiones terminales invertidas cortas. • El sitio diana donde se inserta el transposón se duplica durante el proceso de inserción para formar dos repeticiones en orientación directa en los extremos del transposón . • La longitud de la repetición directa es de 5 a 9 bp y es caracteñstica para cualquier transposón particular.

Los elementos susceptibles de transposición se identificaron por primera vez en el ámbito molecu lar en forma de inserciones espontáneas en operones bacterianos. Ese tipo de inserción impide la transcripción., traducción o ambas, del gen donde se inserta. Se han desC'lito hasta ahora muchos tipos cliferentes de elementos susceptibles de transposición.

123
( '

987654321 987654321 Gen de transposasa

AT~­

TACG_T Sitio diana

~ Repetición "' 'lr· diana ·,~o? iiJa

Transposón

Repetición diana (bp)

- ¡¡

l»

~

~ ,, 1 el\ ·

Repetición Longi tud invertida (bp) global (bp)

1$1

9

IS2 IS4 ISS

5

23 41

11-13 4

18 16

IS10R

9

ISSOR 1$903

9 9

22 9 18

768 1327 1428

Repetición diana Selección de diana aleatoria

1329

puntos calientes AAAN20TIT puntos calientes NGCTNAGCN

1531 1057

puntos calientes aleatoria

1195

Los transposones tienen repeticiones terminales invertidas y generan repeticiones directas del DNA de los flancos en el sitio diana. En este ejemplo, la diana es una secuencia de 5 bp. Los extremos del transposón constan de repeticiones de 9 bp invertidas donde los números uno a nueve indican una secuencia de pares de bases. 524

CAPÍTULO 21 Transposones

Los transposones más sencillos se llaman s~ cuencias d e inserción (lo que refleja la forma que se detectan). Cada tipo recibe el prefijo IS sef do de un número que lo identifica. (Las clases or _ nales se enumeraron ele TSl a 1S4; las dases JlCI· riores tienen números que reflejan los anteceder.. del aislamiento, pero que no corresponden a la e total de elementos hasta entonces aislados.) Los ele m en tos IS son constituyentes nortr' les de los cromosomas bacterianos y plásmidos. : probable que una cepa estándar de E. coli comen_ varias coplas (menos de lO) de cualqu iera de elementos IS más comunes. Para describir una serción en un sitio particulax se utiliza el signo de manera que A.::ISl describe la inserción de elemento IS 1 en el fa go A. Los elementos I$ son unidades autónomas, Ci! una de las cuales codifica sólo las proteínas ind.. pensables para patrocinar su propia transposici Cada e lemento IS Liene diferente secuencia, Jlt comparten algunas característica s en su organi;..: ción. La estructura de un uansposón genérico an· y después de la inserción en un sitio diana se ilus en la , que también resume los detal _ de algunos elementos rs comw)es. Un elemento IS termina en re peticiones te ~ minales invertidas cortas; por lo general, las ..; copias de la repetición tienen una relación estre _ más que ser idénticas. Como se ilustra en Ja figu.. la presen cia de repeticiones terminales inverne._ indica que se encuentra la m isma secuencia avazando hacia fl elemento desde el DNA del flanc, ambos lados. Cuando un elemento IS realiza transposici
Por Jo tanto, un elemento IS muestra una estructura característica donde sus extremos se identifican por las repeticiones terminales invertidas, mientras gue los extremos cercanos del DNA del hospedador en los flancos se identifican por las repeticiones directas cortas. Cuando se observa ese tipo de organización en una secuencia de DNA, se considera como djagnóstico de un transposón e indica que la secuencia se originó en un suceso de transposición. Casi todos los elementos IS se insertan en una cliversidad de sitios en el ime1ior del DNA del hospedador; algunos, no obstante, muestran preferencia (grados variables) por puntos caJientcs particulares. Las repeticiones in venidas definen los extremos de un transposón. El reconocimiento de los extremos es común a los sucesos de transposición patrocinados por todos los tipos de tramposón. Las mutaciones que actúan en configuración cis e impiden la transposición se locaJizan en los extremos, que lali proteínas encargadas de la transposición reconocen. Las proteínas se llaman transposasas. Todos los elementos IS, excepto IS l. contienen una sola región de codificación larga, que se inicia apenas er¡ el interior de la repetición invertida en un extremo y termina apenas antes o dentro de la repe tición invertida en el otro extremo, el cual codifica la transposasa. La IS 1 tiene una organización más compleja, con dos marcos de lectura independkntes; la transposasa es producto de la estructuración de un marco durante la traducción para permitir el uso de ambas estructuras. La frecuencia de la transposición varía entre los diversos elementos. El índice global de transposidón es de -J o-3 a casi 1Q-4por elemento por generación. Las inserciones de ruanas inruviduales tienen lugar en un grado semejante al de la [asa de mutación espontánea, por lo general -lo-s a I0- 7 por generación. La reversión (por escisión predsa del elemento IS) suele ser inJrecu.eme. con una variación de lCJ-6 a 1o-' o por generación, que e5 -103 veces menos •recuente que la inserción.

111

Los transposones compuestos tienen módulos IS

Conceptos principales • Los transposones pueden portar otros genes además de los que codifican la transposición. • l os transposones compuestos tienen una región central flanqueada por un elemento IS en cada extremo. • Cada uno o ambos elementos IS de un transposón compuesto pueden realizar la transposición. • Un transposón compuesto puede actuar como unidad, pero un elernento IS activo en cualquier extremo también puede realizar La transposición de manera independiente.

Algunos transposones portan marcadores de resistenda farmacológica (u otros) además de sus funciones relativas a la transposición. Esos transposones se denominan Tn seguido de un número. Una clase de los transposones más grandes se denomina de elem e ntos compuestos, porque una región centra l que porta el marcador farmacológ ico es flanqueada por "brazos'' que constan de elementos IS. Los brazos pueden tener la misma orientación (lo más [recuente) o invertida. Asf, un rransposón compuesto con brazos que corresponden a repeticiones rurectas tiene la estructura

AnnL

ArmA

Región central

Si los brazos tienen repeticiones invertidas. la estructura es Arml

ArmA

Región central

Las flechas indican la orientación de los brazos, que se identifican como L y R de acuerdo con una orientación (arbitraria) del mapa genético del trans· posón, de izquierda a derecha. La estructura de un

Los módulos IS se repiten

ISL = izquierdo

F-

ISR

=derecho

Maroade)j~~alléiiJoriSpo-.OOc.-.---...;¡¡ 1 El modulo IS tiene repeticiones invertidas

1 El módulo IS tiene repetlciones invertidas

Ejemplo 181 Tn9

Módulos IS idénticos, ambos funcionales

Los módulos IS están invertidos

Ejemplo Elctremo izquierdo

Marcadores

Extremo derecho

Tn903

18903

kanR

Ambos extremos IS son funcionales

Tn10

IS10L no funcional

tet"

IS10R funcional

Tn5

ISSOL no funcional

ka nA

ISSOR funcional

Un transposón compuesto tiene una región central que porta los marcadores (como el de resistencia a fármacos) flanqueados por nódulos 15, que tienen repeticiones terminales invertidas cortas. Si los módulos mismos están en orientación invertida, las repeticiones terminales cortas invertidas en los extremos del transposón son idénticas. 21.3 Los transposones compuestos tienen módulos IS

525

l

El transposón se integra al DNA circular

+ tel'

IS10L

IS10R

Resuttado2

El transposón Tn10 se desplaza otra vez

El nuevo transposón creado por movilización de módulos IS10 en orientación alternativa Dos módulos 1510 crean un transposón compuesto que puede movilizar cualquier región del DNA que yace entre ellos. Cuando TnlO es parte de una molécula circular pequeña, las repeticiones 1510 pueden tener tra:-~sposición a cada lado del círculo.

transposón compuesto se ilustra con mayor detalle en la , donde también se resumen las propiedades de algunos transposones compuestos comunes. Los brazos constan de módulos IS y cada uno tiene la terminación h abitual de la estructura de repeticiones invertidas; como resultado. el trans posón compuesLo también termina con las mismas repeticiones invertidas cortas. En algunos casos, los módulos de un transposón compuesto son idénticos. como Tn9 (repeticiones directas deIS l) O Tn903 (repeticiones invertidas de IS903). En otros casos, los módulos tienen relación estrecha, pero no son idénticos. Por tanto. se pueden distinguir los módulos L y R en Tnl O o en Tn5. Un módulo IS funcional puede hacer transposición de sí mismo o de todo el rransposón. Cuando los módulos de un uansposón compuesto son idénticos, parece que cualquiera de ellos puede patrocinar el movimiento del transposón, como en el caso de Tn9 o Tn903. Cuando los módulos son distintos, tal vez difieran en su capacidad funcional, de manera que la transposición quizá dependa por completo 526

CAPÍTULO 21 Transposones

o de mane1·a principal de uno de los módulos. com• en el caso de TnlO oTnS . Se asume que los transposones compuesto evolucionaron cuando dos módulos en un principi' independientes se vincularon con la región central Tal situación pudiese surgir cuando un elemento 1~ se transpone a un sitio receptor cercano al sitio de· nador. Dos módulos idénticos pueden mantenerst iguales o diferenciarse. La capacidad de un solo m ódulo d~ realizar transposición de wdo el elemem compuesto explica la falta de presión selectiva sobr_ ambos módulos para mantenerse acrivos. ¿Qué se encarga de la transposición de u transposón compuesto en lugar de sólo el módul individual? Esta pregunta es en especial problem& tica cuando ambos módulos son funcionales. En e ejemplo de Tn9 donde los módulos son elemenh IS 1, parece que cada uno es activo por su propi : cuenta. así como en nombre del transposón con~ ­ puesto. ¿Por qué se conserva el transposón en s_ totalidad, en lugar de que cada secuencia de inseción vea por sí misma? Dos elementos TS, de hecho. pueden hact transposición de cualquier secuencia que resida e!'ltre ellos. así como en ellos mismos. La muestra que si Tn 1O reside en un replicón circula se ptlede considerar que sus dos módulos flanqueaal gen tetR del Tn 1Ooriginal o la secuencia en la ot...., parte del circulo . AsC en un episodio de transposción puede participar el transposón original Tn (marcado por el movimiento de tetR.) o la creacil de un nuevo transposón "volteado al revés" con región central alternativa. Nótese que Jos transposones original y "\'' tcado al revés" tienen módulos invertidos, pero evidente que estos módulos pueden funcionar .. cualquier orien tación con respecto a la región cer rral. La frecuencia de transposición de los transpos nes compuestos descíendc con la distancia entre 1 módulos. Por lo tamo. la dependencia de la longin. es un factor que determina los tamaños de los trar posones compuestos comunes. Una fuerza importante que apoya la transpc' ción de transposones compuestOs es la selección marcadores que realiza la región central. Un rr: dulo ISlO está libre de trasladarse por sí mism• se moviliza un orden de magnitud más a menw.. que Tn 1O. No ohstame, TnlO se mantiene conjc tado por la selección de tetR. de manera que ba condiciones selectivas. la frecuencia relativa de transposición del TnlO intacto aumenta mucho. Los elementos IS codifican las actividades uansposasa que se encargan de la creación de un si· diana o el reconocimiento de los extremos del tra:-o posón. Sólo se necesitan los extremos para que transposón actúe como sustraro en la transposiciéor

-

La transposición ocurre por mecanismos replicativos y no replicativos

Sitio diana,

wm¡m. mnmn

l.

Conc.?ptos principales • Todos los transposones utilizan un mecanismo común donde se hacen hendiduras escalonadas en el DNA diana, el transposón se une a los extremos prominentes y se llenan las brechas. • El orden de los episodios y la naturaleza exacta de las conexiones entre el transposón y el DNA diana determinan si la transposición es replicativa o no replicativa.

•l

ATGCA

JIIIli1 1111 rmnnu

!

ATGCA TACGT.,.

En la

se ilustra la inserción de un trans-

posón en un nuevo sirio . Consiste en hacer roturas escalonadas en el DNA diana, Ltniendo el transposón a los extremos de cadena única prominentes y llenando las brechas. La generación y el llenado de los extremos escalonados explican la aparición de repeticiones directas de DNA diana en el sitio de inserdón. Los escalones entre los eones en las dos cadenas determina la longitud de las repeticiones directas; de este modo, la repetición diana caractetísúca de cada transposón rcOeja la geometría de la enzima involucrada en el cone del DNA diana. El uso de extremos escalonados es común a todos los medios de transposición. pero se pueden distinguir tres tipos diferentes de mecanismo por el que se desplaza un Lransposón: • En la transpos ició n r e plicativa , el elemento se duplica durante la reacción. de manera que la entidad de transposición es una copia del elemento original. En la se resumen los resu ltados de tal transposición. El transposón se copia como parte de s u movimiento. Una copia se mantiene en el sitio original en tamo la otra se inserta en ttn nuevo sitio. Así, la transposición se acompaña de un aumento del número de copias del transposón. la transposición replicariva comprende dos tipos de activi dad enzimática: una tramposasa que actúa sobre los extremos del transposón original y una resolvasa que actúa sobre las copias duplicadas. Un grupo de transposones relacionados con TnA se desplaza sólo por transposición replicariva (véase la sección 21.7, La transposición replicativa avanza a través de un cointegrado). • En la transposición no replicativa, el elemento de transposición se traslada como una entidad física de manera directa de un sitio a otro y se conserva. Las secuencias de inserción y Jos transposones compuestos

Hendiduras escalonadas hechas en el sitio diana

"Tlii~JII""'II"""U'ru'mlllrTTIITrllll""ll

·rmm

.'TTTTTI El transposón m.uJ. se une a extremos de cadena única

TACGT TACGT' ATGCA

Las brechas en

lifllUl--:ru.ru U. ~1rmrr el sitio diana se

J.LlJJ.L\'L---.-----'~ 1

llenan y sellan

Repeticiones diana

Las repeticiones directas de la diana del DNA que flanquean un transposón se generan con la introducción de cortes escalonados cuyos extremos prominentes se enlazan al transposón.

Donador

IIIID

lffl

1 llillL --Lill

El donador se mantiene inalterado

Receptor

lff luuiT!¡

l Jl!!ffil El receptor gana una copia del transposón

La transposición replicativa crea una copia del transposón que se inserta en un sitio receptor. El sitio donador se mantiene sin cambio, por lo que tanto el donador como et receptor tienen una copia del transposón.

TnlO y TnS utilizan el mecanismo que se muestra en la y que comprende la liberación del transposón del DNA do-

nador flanqueador duraiHe la transferencia. Este tipo de mecanismo requiere sólo una Lransposasa. Otro mecanismo utiliza la cont:xión de secuencias de DNA donadora y diana, y comparte algunos pasos con la transposición replicativa (véase la sección 21.6, Intermediarios comunes de la transposición). Ambos mecanismos de la transposición no rcplicativa hacen que el elemento se inserte en el sitio diana y se pierda del si tio donador. ¿Qué pasa con la molécuJa

2 . La transposición ocurre por mecanismos replicativos y no replicativos

527

Receptor

Donador

111

111

11

1

l ---J. ? El donador tiene una rotura en el sitiO del transposón

El receptor gana una copia deltransposón

La transposición no replicativa permite que un transposón se desplace como una entidad ñsica de un sitio donador a uno receptor. Esto deja una rotura en el sitio donador, que es letal, a menos que se pueda reparar.

Donador

Receptor

lltt

p!IJ.

l

mmnunm . La transposición conservadora implica desplazamiento directo sin pérdida de enlaces nucleotídicos; compárese con la integración y escisión A..

donadora después de una transposidón no replicaliva? Su supervivencia requiere que los sistemas de reparación del hospedador reconozcan la rorura de la doble cadena y la reparen. • La transposición conservadora describe otro tipo de episodio no replicativo donde se escinde el elemento de un sitio donador y se insena en un sitio diana gracias a una serie de sucesos donde se conservan todos los enlacen nucleotidicos. En la se resumen los resultados de un episodio de conservación. Éste simula de manera exacra el mecanismo de la inregración A. abordado en la sección 19.16, La recombinación específica del sitio comprende rotura y reunión, y las transposasas de taLes elementos se relacionan con la familia de la integrasa A.. Los elementos que usan este mecanismo son grandes y pueden mediar la transferencia no sólo del elemento mismo, sino también del DNA donador de una bacteria a otra. Tales elementos se clasificaron en un principio como transposones. pero pueden con528

CAPÍTULO 21 Transposones

siderarse de manera más apropiada comt episornas. Algunos transposones utilizan un solo tipo ae: vía para la transposición. en tanto otros pueder. utilizar múltiples vías. Los elemenros ISl e IS90; emplean las vías no replicativa y replicativa, y b¿ sido bien descrita la capacidad del fago Mude carr· biar a cualquier tipo de vía desde una intermedian: común (véase la sección 21.6, Intermediarios comu· nes de la transposición). Los mismos tipos básicos de reacción participa: en rodas las clases de episodios de transposición. Lcr extremos del transposón se desconectan del DN:donador por reacciones de escisión que genera:: extremos 3'-0H. Los exrremos expuestos se u ne;después al DNA diana por reacciones de transferencia, que comprenden la transesterificación, don de el extremo 3'-OH ataca de 111.anera directa el DKdiana. Dstas reacciones tienen lugar dentro de u:complejo nucleoproreínico que contiene las enZ:· mas indispensables y ambos extremos del transptsón. Los transposones difieren en cuanto a si se reconoce eJ DNA diana antes o después de la escisiódel rransposón mismo. La selección del sitio diana la realiza en efecto la uansposasa. En algunos casos, vinualmen~:: se elige la diana en forma alearoria. En otros, ha~ especificidad por una secuencia de consenso o a guna otra característica en el DNA. La caracteríS1 ca puede adoptar la forma de una estructma en e DNA, como el DNA flexionado. o de un compl( proteína-DNA. En el último caso, Ja naturaleza de complejo diana puede hacer que el transposón ~" inserte en promotores espedficos (como Tyl o Ty3 que seleccionan promotores pol m en las levaduras), regiones inactivas del cromosoma o DNA e~ proceso de replicación.

1J11

Los transposones causan reest ructuración del DNA

Conceplos principales

,

• La recombinación homóloga entre múltiples copias de un transpos6n causa reestructuración del DNA hospedador. La recombinación homóloga entre las repeticiones de un transpos6n puede llevar a la escisión precisa o imprecisa.

Además de la transposición inrermolecular Nsicple", que da como resultado la inserción en unnu-tvo sitio. los transposones estimulan otros tipos ~~ reestructuraciones del DNA. Algunos de estos suc~ sos son consecuencias de la relación entre mú l üp.~

copias del transposón. Otros representan resultados alternativos del mecanismo de transposición y dejan indicios sobre la naturaleza de los sucesos subyacentes. Puede haber reestructuraciones del DNA hospedador cuando un transposón inserta una copia en un segundo sitio cerca de su localización original. Los sistemas de hospedador pueden realizar la recombinación recíproca emre las dos copias del transposón; cuyas consecuencias dependen de que las reperidones tengan la misma orientación o una invenida. La ilustra la regla general de que la recombinación entre cualquier par de repeticiones directas causará deleción del materia l entre ellas. La región interpuesta se extirpa como un círCLiio de DNA (que se pierde de la célula); el cromosoma conserva una copia de la repetición directa. Una recombinación entre los módulos IS de repetición directa del transposón compuesto Tn9 sustituiría al transposón JSl de un solo módulo. La deleción de secuencias cercanas a un transposón pudiese, por tanto, ser producto de un proceso de dos erapas; la transposición genera una repetición directa de un transposón y ocurre recombinación entre las repeticiones. Sin embargo. la mayor parte de las deleciones que surgen en la vecindad de los transposones tal \'ez sea resullado de una variación en la vía, seguida del episodio de transposidón mismo. se muestran las consecuenEn la cias de la recombinación recíproca entre un par de repeticiones invertidas. La región entre las repeticiones se invicne; las repeticiones mismas permanecen disponibles para facilitar más inversiones. Un transposón compuesto cuyos módulos se invienen es un componen te estable del genoma, si bien la dirección de la región central con respecto a los mód ulos pudiese inverrirse por recombinación. La escisión no es apoyada por los transposones m ismos. pero puede ocurrir cuando las enzimas bacterianas reconocen regiones homólogas en los transposones, algo importante porque la pérdida de un transposón puede restablecer la función en el siúo de inserción. La escisión precisa requiere el retiro del transposón más una copia de la secuencia duplicada. Esto sucede muy pocas veces; se presenta con una frecuencia de -10-4para Tn5 y -l0-9 para Tn lO. Es probable que implique una recombinación entre sitios diana de 9 bp duplicados. la e scisión imprecisa deja un residuo de rransposón que puede ser suficiente para impedir la reactivación del gen diana, pero tal vez sea insuficiente para causar efectos polares en genes cercanos. de manera que ocurre un cambio en el fenotipo. La

Repeticiones directas

r-

Apareamiento de repeticiones directas

e:===:::=:¡¡¡¡:¡¡¡¡;¡¡¡;

La recombinacíón libera material entre repeticiones como una molécula circular

La recombinación recíproca entre repeticiones directas escinde el material entre ellas; cada producto de recombinación tiene una copia de la repetición directa.

Repeticiones invertidas

Las repeticiones

1 invertidas se aparean

Región Invertida

La recombinación recíproca entre repeticiones invertidas invierte la región entre ellas.

escisióo imprecisa se prcsema con una frecuencia de -10-6 para Tnl O. Comprende la recombinadón entre secuencias de 24 bp en los módulos IS l O; estas secuencias son repeticiones invertidas, pero como los módulos IS 1O mismos están in venidos, forman repeticiones directas en Tn lO. la mayor frecuencia de escisión imprecisa en comparadón con la precisa tal vez refleje el aumento de la longitud en las repeticiones directas {24 bp en contraposición a 9 bp). Ningún tipo de escisión depende de funciones codificadas por el transposón, pero se desconoce el mecanismo. la escisión es independiente de RecA y pudi«!se ocurrir por algunos mecanismos celulares que generan deleciones espontáneas entre secuencias repetidas con espacios reducidos entre sí. 21. '\ Los transposones causan reestructuración del DNA

529

Intermediarios comu nes para la transposición Conceptos principales La transposición se inicia con la formación de un complejo de transferencia de cadenas donde el transposón se conecta con el sitio diana a través de una cadena en cada extremo. • La transposasa Mu forma el complejo por sinapsis de los extremos del DNA de Mu, seguida de la formación de hendiduras y luego una reacción de transferencia de cadena. • Ocurre a continuación transposición replicativa si el complejo se reproduce, y t ransposición no re plicativa si se repara.

Muchos elememos móviles del DNA se transponen de una localización cromosómica a otra por un mecanismo en esencia semejante. Incluyen elementos lS. transposones procarió ricos y eucarióticos y el bacteriófago Mu. La inserción de la copia de DNA

Transposón

Diana

! Sinapsis de los extremos Los extremos con hendidura se unen

Equivalente no plegado

La transposición se inicia con hendiduras en los extremos del transposón y del sitio diana, y con la unión de los extremos con hendioura a un complejo de transferencia de cadenas.

530

CAPÍTULO 21 Transposones

del RNA retrovírico uriliza un mecanismo similó · (véase la sección 22.2, El ciclo vital de los retrovirus comprende sucesos similares a la transpos~­ ción) . Las primeras etapas de la recombinación é ~~: inmunoglobulinas también son similares (véase :.= sección 23.1 O, Las proteínas RAG cata lizan la rotur: y reunión). La transposición se inicia con un mecanism común de unión del transposón a su diana. En -;. se muestra que el transposón tier. ~ hendiduras en ambos extremos, y el sitio diana en ambas cadenas. Los extremos con hendidura 5_ unen en forma cruzada para generar una conexiócovalente entre el transposón y la diana. Los dt extremos del transposón se juntan en este preces para que sea más sencillo seguir las escisiones, : ~ etapa de sinapsis se muestra después de la escisió:pero en realidad ocurre antes. Gran parre de esta vía fue descubíena por pr • mera vez en el fago Mu, que utiliza el p roceso d= transposición en dos fonnas. Al infectar una céhm hospedadora, el Mu se integra al genoma gracia a una transposición no replicativa; durante el s:guiente ciclo lítico, el número de copias se amplific: por transposición replicativa. Ambos úpos de transposición implican el mismo paradigma de reacci6 entre el transposón y su diana, pero las reacciontsiguientes son diferentes. La rransposasa MuA hace las operaciones inicia· les del lago de DNA. Tres sitios de unión MuA co_ consenso de 22 bp se localizan en cada extremo deDNA de Mu. U , L2 y L3 están en el extremo izquie!:do, mientras que Rl , R2 y R3 están en el extrem derecho. Un monómero de MuA puede unirse a cad: sirio. La MuA también se une a un sitio imemo eel genoma del Iago. La unión de MuA en los extremos izquierdo y derecho, además del sitio inrernr forma un complejo. La parricipación del sitio intern no es clara, paJece necesaria para la formación dt complejo, pero no para la escisiñn de cadenas y le~ pasos posteriores. La unión del rransposón Mu de DNA a un sill diana pasa por las tres etapas ilustradas en la '' . Esto comprende sólo los dos sitios más cercanos a cada extremo del transposón. Las subnnidadeMuA unidas a estos sitios forman un tetrámero, }, que logra la sinapsis de los dos extremos del tramposón. El tetrámero ahora actúa en una forma qu:: asegura una reacción coordinada de ambos extremos del DNA de M u. El MuA tiene dos sitios paTa 2 manipulación del DNA y su modo de acción impul~ a subw1idades de rransposasa a actuar en configuración trans. E1 sitio de unión de consenso se une : las secuencias de 22 bp que constituyen los sitios L L2, Rl y R2. El sitio activo fragmenta las cadena; de DNA de Mu en posiciones cercanas a los slti ~

Je unión Ll y Rl de Mt1A. El sitio activo no puede . scindir la secuencia de DNA gue es adyacente a .a secuencia de consenso en el sitio de unión de ·onsenso. No obstante, puede escindir la secuencia 5propiada en un segmento diferente de DNA. De este modo, los extremos del transposón son escindidos por subunidades MuA que actúan en :onfiguración trans. La forma de acción en configu:-ación trans indica que Jos monómeros en realidad -.m idos a I .l y R1 no escinden los sitios cercanos. Uno :le los monómeros unidos al extremo izquierdo bace Jna hendidura en el sitio en el lado derecho y vice;·ersa (no se sabe qué monómero está activo en esra etapa de la reacción) . La reacción de transferencia de cadenas también tiene lt1gar en configuración trans: el monómero en Ll transfiere la cadena en R 1 y viceversa. Pudiese ocurrir que cliferentes monómeros catalizaran las reacciones de escisión y transferencia de cadenas para un extremo determinado . Una segunda proteína, MuB, ayuda a la re acción. Influye en la selección de sitios díana. La Ylu tiene preferencia para la rransposición al sitio

L1 L2

R2R1

diana alejado más de 1 O a 15 kb de la inserción original. Ésta es la llamada "inmunidad de diana" . Se demuestra en una reacción in vitro que incluye plásmidos donadores (que contienen Mu} y diana (deficientes en Mu) , proteínas MuA y MuB, proteína HU de E. coli, Mg 2• y ATP.la presencia de MuB y ATP restringe la transposición de manera exclusiva al plásmido diana. El motivo es que cuando MuB se ttn e al DNA del complejo MuA-Mu, MuA ha ce que MuB hidrolice el ATP, después de lo cual se bbera MuB. No obstame, la MuB se une (de manera ioespecífica) al DNA diana, donde estimula la adivi· dad de recombioadón de MuA cuando se forma un complejo de transposición. En efecto, la presencia previa de MuA "elim.ioa" a MuB del donador, lo que da preferencia para la transposición al sitio diana. El producto de estas reacciones es un complejo de transferencia de cadenas donde eJ transposón se conecta al sitio diana por medio de una cadena en cada extremo. El siguiente paso de la reacción difiere y determina el tipo de transposición. En las siguientes dos secciones se observa cómo la estructura común puede ser sustrato para la replicación (lo que conduce a la transposición replicaliva}, o usarse de maneJa directa para rotura y unión (lo que conduce a tll1a transposición no replicativa) .

-===::....-.~

l +

Extremo izquierdo MuA

Extremo derecho

B1J La transposición replicativa avanza a través de un cointegrado

Sinapsis

Conceptos principales • La replicación de un complejo de transferencia de cadenas genera un cointegrado, que es una fusión de los replicones donador y diana. • El cointegrado tiene dos copias del transposón que yacen entre los replicones originales. la recombinación entre las copias del transposón regenera los replicones originales, pero el receptor ha ganado una copia del transposón . • La reacción de recombinación es catalizada por una resolvasa codificada por el transposón .

l

Escisión en configuración trans

... •

:;

y

O bien

1

.

3'·0H 3'.QH

+de cadena

3'·0H 3'·0H

Transferen~

u llu La transposición Mu pasa por tres etapas estables. La transposasa MuA forma un tetrámero que hace sinapsis con los extremos de un fago t'vlu. las subunidades de transposasa actúan en configurac1ón trans para hacer una muesca en cada extremo del DNA, y después, una segunda acción en confi· guración trans une los extremos con hendidura al DNA diana.

Las estrucruras básicas involucradas en la transposición replicativa se ilustran en la • Los extremos 3' del complejo de transferencia de cadenas sirven como cebadores para la replicación, lo que genera una estrucmra llamada cointegrad o, que representa la fusión de las dos moléculas originales. El coimegrado tiene dos copias del transposón, una en cada unión entre los replicones originales, orientados como repe Liciones dírecras. El entrecruzamiento se forma por

21 7 La transposición replicativa avanza a través de un cointegrado

531

Transposón

Transposón

\

1

...•...

Diana

\

o

Formación de hendiduras Los cortes de una sola cadena generan extremos escalonados tanto en el transposón como en la diana

: Fusión

'f

Cointegrado

Resolución

La transposición puede fusionar un replicón donador y uno receptor en un cointegrado. La resolución libera dos replicones, cada uno con una copia del transposón.

acción de la transposasa, como se describió en la sección anterior. Su conversión en el cointegrado requiere funciones de replicación del hospedador. • Una recombinación homóloga entre las dos copias del transposón libera dos replicones individuales, cada uno con una copia del transposón. Uno de los replicones es el replicón donador original. El otro es un rep licón diana que ha ganado un transposón flanqueado por repeticiones directas cortas de la secuencia diana del hospedador. La reacción de recombinación se llama resolución ; la actividad enzimática encargada se lJama resolvasa . Las reacciones comprendidas en la generación de un cointegrado se han definido con detalle para elfago Mu y se ilustran en la . El proceso se inicia con la formación del complejo de transferencia de cadenas (a veces Llamado también complejo de entrecruzamiento). Las cadenas donadoras y diana están ligadas de manera que cada extremo de la secuencia del transposón se une a una de las cadenas únicas prominentes generadas en el sitio diana. El complejo de transferencia de cadenas genera una estructura de forma cruzada que se mantiene junta en el transposón doble. El destino de la estrucrura de entrecruzamiento determina el modo de transposición. 5 32

CAPÍTULO 21 Transposones

Estructura entrecruzada (complejo de transferencia de cadena): Los extremos con hendidura del transposón se unen a los extremos con hendidura del sitio diana

La replicación de extremos 3' libres genera un cointe¡¡rado: La molécula única tiene dos copias del transposón

(C) El cointegrado dibujado como vía continua muestra que los transposones están en las uniones entre replicones

La transposici ón Mu genera una estruct...-; entrecru zada que se convierte, por replicación, en un co:-tegrado.

El principio de la transposición replicativa = que la replicación por medio del transposón lo d> plica, lo que crea copias en los sitios diana y do.r..ador. El producto es un cointegrado. La estructura del entrecruzamiento contie- , una región de una sola cadena en cada uno de extremos escalonados. Estas regiones son horquilia.. de seudorreplicación que ofrecen un molde para _ síntesis de DNA. (El uso de los extremos como c:badores para la replicación implica que debe ocur. rotura de la cadena con una polaridad que gener un extremo 3'-0H en ese punto.) Si la replicación continúa desde ambas horqui~ de seudorreplicación, avanzará por el transposón .s..

parando sus cadenas y terminando en sus extremos. La replicación tal vez se logre por funciones codifi.:adas por el hospedador. En esta juntura, la estructura se ha convertido en un cointegrado, que posee repeticiones directas del transposón en las uniones entre los replicones (como puede observarse por el rastreo de la vía alrededor del cointegrado).

fJD La transposición no replicativa avanza por rotura y reunión Conceptos principales • La transposición no replicativa ocurre cuando se hace una hendidura en una estructura entrecruzada en el par no roto de las cadenas donadoras y se ligan las cadenas diana a cada lado del transposón. • Dos vías para la transposición no replicativa difieren de acuerdo a que el primer par de cadenas del transposón se una al sitio diana antes de que se corte el segundo par (TnS) o que las cuatro cadenas se corten antes de unirse al sitio diana (TnlO).

La transposición no replicativa tiene lugar

cuando se libera una estructura de entrecruzamiento por la fo rmación de una hendidura, lo que inserta el transposón en el DNA diana, flanqueado por las repeticiones directas de la diana, y se deja al donador con una rotura de doble cadena.

La transposasa se une a

ambos extremos de Tn

La estructura de entrecruzamiento puede usarse

también en la transposición no replicativa. El principio de la transposición no repHcativa por este mecanismo es que una reacción de rotura y reunión permite reconstruir el sitio diana, con excepción del transposón; el donador se mantiene roto. No se forma un cointegrado. La muestra los episodios de esdsión que generan una transposición no replicativa del fago M u. Una vez que a las cadenas no rotas del donador se les hacen hendiduras, se pueden ligar las cadenas diana a cada lado del transposón. Las regiones de cadena única generadas por los cortes escalonados deben llenarse mediante síntesis de reparación. El producto de esta reacción es un replicón diana donde se ha insertado el transposón entre repeticiones de la secuencia creada por las hendiduras de cadena única originales. El replicón donador tiene una rotura de doble cadena a través del sitio donde originalmente se localizaba el transposón. Las transposiciones no replicativas pueden también ocurrir por una vía alternativa, donde se hacen hendiduras en el DNA diana pero también una rotura de doble cadena a cada lado del transposón, lo que lo libera por completo de las secuencias donadoras de los flancos (como se observa en la Figura 21.7). Esta vía de '"corte y pegadoH es utilizada por Tn 1O, como se ilustra en la Un experimento certero demostró que las transposiciones no replicativas de Tn 1o hicieron uso de un heterodúplex sintetizado de manera artificial de TnlO que contenía apareamientos erróneos

Los extremos transferidos son objeto de producción de hendiduras

Otras cadenas son objeto de

-

producción de hendiduras

Se libera el donador

El receptor es objeto de producción de hendiduras

Tn se une al sitio diana

Ambas cadenas de TnlO se escinden en forma secuencial, y después, el transposón se une al sitio diana con hendidura.

de una sola base. Si la transposición implica replicación, el transposón en el nuevo sitio contendrá información de sólo una de las cadenas TnlO progenitoras. No obstante, si la transposición ocurre por movimiento físico del transposón existente, se conservarán los apareamientos erróneos en el nuevo sitio, lo cual quedó demostrado en este caso. 21.8 La transposición no replicativa avanza por rotura y reunión

533

La escisión de Tn5 del DNA de los flancos comprende la formación de una hendidura, la reacción intercatenaria y la escisión de la horquilla.

Extremo izquierdo

Transposón

Extremo derecho

Extremo derecho Sitio activo

/

Contacto

/

Contacto

Sitio - activo Extfemo izquierdo

Cada subunidad de la transposasa Tn5 tiene un extremo del transposón localizado en su sitio activo y también hace contacto en un sitio diferente con el otro extremo del transposón .

La ctiferencia básica en la Figura 21.16 respecto del modelo de la Figura 21.15 es que ambas cadenas de TnlO se escinden antes de cualquier conexión con el si tío diana . El primer paso en la reacdón es el reconocimiento de los extremos del transposón por la transposasa, que forman una estructura proteinácea dentro de la que ocurre la reacción. En cada extremo del transposón, las cadenas son esdnctidas en un orden específico: la cadena transferida (la que se va a conectar con el sirio ctiana} se escinde prime ro, seguida de la otra. (Éste es el mismo orden de la transposición M u de las Figuras 21.14 y 21.15.) La Tn5 también hace transposición no replicativa, y en la se muestra la interesante reacción de escisión que separa el transposón de las secuencias de los flancos . La primera cadena de DNA es objeto de una hendidura. El extremo 534

CAPÍTULO 21 Transoosones

3'-0H que se libera ataca entonces a la otra caden ~ del DNA.lo que libera la secuencia del flanco y UJl ~ las dos cadenas del transposón en una horquiUa Luego, una molécula de agua activada ataca a 1~ horquilla para generar extremos libres para cad.: cadena del transposón. En el siguiente paso se libera el DNA donadc.' escindido y eltransposón se une a los extremos co~ hendidura en el sitio diana. El transposón y el siti• diana se mantienen constreñidos en la estrucrur: proteinácea creada por la transposasa (y otras prrteínas). La escisión de doble cadena en cada extrt mo del transposón impide cualquier r.ransposici6:de tipo replicativo y obliga a la reacción a avall.Zópor transposición no replicativa, lo que anoja e mismo resultado que se muestra en la Figura 21 .1~ pero con pasos de escisión y unión inctividuales qt; : tienen lugar en un orden diferente, Las transposasas Tn 5 y Tn l O actúan amba. como dímeros , Cada subuuidad en el dúnero tien ~ un sitio activo que cataliza de manera sucesiva :rotura de doble cadena de las dos en un extremo dt transposón y después cataliza la escisión escalonad: del sitio diana. En la se ilustra la C'-trucrura de la rransposasa TnS unida al transposó= escindido. Cada extremo del transposón se localiu en el sitio activo de una subunidad. Un extremo áe la subunidad también hace contacto con el otro e>.tremo del transposón, lo que controla la geomet.r:.:. de la reacción de transposición. Cada uno de ¡, sitios activos escindirá una cadena del DNA diam Es la geometría del complejo lo que determina ' distancia emre estos sitios en las dos cadenas djat'· (nueve pares de bases en el caso de Tn5) .

La transposición de TnA requiere transposasa y resolvasa Conceptos pñncipales • La transposición replicativa de TnA requiere que una transposasa forme la estructura cointegrada y una resolvasa libere los dos replicones. • La acción de la resolvasa se asemeja a la proteína Int 'A y pertenece a la familia general de reacciones de recombinación específicas de sitio similares a la topoisomerasa, que pasan por un intermediario donde la proteína está unida de manera covalente al DNA.

La transposición replicatJva es la única ton .. de movilidad de la famiüa de TnA, que consta _ transposo11es grandes (-5 kb) . No son compues; dependientes de los módulos de transposición tipo IS, sino que más bien consti tuyen unidad

independientes que portan los genes para la transposición, así como para características del tipo de la resistencia a fármacos. La familia TnA incluye varios transposones relacionados, de los que Tn3 y Tn 1 000 {también conocidos como yo) son los mejor caracterizados. Tienen la característica terminal habitual de las repeticiones in venidas con relación estrecha, en general de -38 bp de longitud. Las deledones que actúan en configuración cis en cualquier repetidón impiden la transposición <.le un elemento. Se genera una repcLición directa de 5 bp en el sitio diana. Portan marcadores de resistencia como amp'. Las dos etapas de la rransposición mediada por ToA se realizan a través de la transposasa y la resol vasa, cuyos genes (tnpA y tnpR) se identifican por mutaciones reccslvas. La eLapa de transposición involucra a los exrremos del elemento, como lo bace en los elementos de tipo IS. La resolución requiere un sitio interno espcdfico, característica exclusiva de la fam ilia ToA. Las mutaciones en mpA no perm iten realizar la transposición. El producto del gen es una transposasa que se une a una secuencia de -25 bp localizada dentro de los 38 bp de la repetición terminal inverrida. Existe un sitio de unión pa ra la proteína lHf de E. coli cercano al sitio de unión de la transposasa, y la transposasa se une de manera colaboradora con 1HF. La transposasa reconoce los exrremos del elemento y también hace las roturas escalonadas de 5 bp en el ONA diana donde se va a insertar el transposón. La lHF es una proteína de unión de ONA que a menudo participa en el ensamblaje de grandes es1ructuras en E. coli; es posible que su participación en la reacción de transposición no sea esen cial. El produC[o del gen tnpR tiene funciones dobles. Actúa como represor de la expresión génica y provee la !unción de resolvasa. Las mutaciones en mpR aumentan la frecuencia de la transposición. El motivo es que TnpR reprime la transcripción en tnpA y su propio gen. De este modo, la desactivación de la proteú1a TnpR permite una mayor síntesis de TnpA. lo que da como re su ltado una frecuencia más alta de transposiciones. Esto implica que la cantidad de la tramposasa TnpA debe ser un factor limitante de la transposición. Los genes tnpA y tnpR se expresan de manera divergeme desde una región de control intercistrónica rica en A-T que se indica en el mapa de Tn3 inclu ido en la . Ambos efectos de TnpR son mediados por su unión en esa región. En su capacidad como resolvasa, la TnpR participa en la rccombinación entre repetidoncs directas de Tn3 en una estrucrura cointegrada. Un coimegrado puede, en principio, resol verse con una recombinación h omóloga enrre cualq uier par de puntos

Unidades de transcripción

--+-.

res tnpA

tnpR

U

111

IR

ampR

úlpR

. -- - -Transcripción - - -,..

Los transposones de la familia TnA tienen repeticiones terminales invertidas, un sitio res interno y tres genes conocidos.

correspondiente en las dos copi.as del transposón . Sin embargo, la reacción de resolución de Tn3 tiene lugar sólo en un sitio específico. El sitio de la resolución se llama m. Se identifica por deleciones que actúan en configuración cis e impiden concluir la transposición, lo que causa la acumulación de coimegrados. En ausencia de res, la reacción de re~olución puede sustituirse con la recombinación general mediada por RecA, pero es mucho menos eficaz. Los sirios unidos por la resolvasa TnpR se resumen en la pordón inferior de la Figura 21.19. Ocurre unión independiente en cada uno de ti·es sitios, de 30 a 40 bp de longitud cada uno. Los tres si tios de unión comparten una homología de secuencia que define a una secuencia de consenso con simetría doble. El sitio I incluye la región definida en términos genéticos como sitio res; en su aus~ncia, la reacción d~ resolución no avanza ~n absolu to. No obscame, la resolución también comprende la unión en los siüos II y ill, porque la reacción avanza poco si cualquiera de estos sitios presenta deleción. El sirio 1 se superpone con el punto de inicio <.le la transcripción de tnpA. El sirio IJ se superpone con el punto de inido para transcripción de tnpR; una mutadón de operador se ubica apenas en el extremo izquierdo del sitio. ¿Imeractúan los sitios? Una posibil idad es que se requiera la uruón a los rres sitios para mamener el DNA en una topología apropiada. La unión en un solo conjunto de sitios puede reprimir la transcripción de tnpA y mpR sin introducir cambios en el DNA. En un análisis de resolución in vítro se usa una molécula cointegrada similar al ONA como sustrato. El susrraro debe ser superenrollado; su resolución produce dos círculos encadenados. cada uno con un sitio res. La reacción reqtliere grandes cantidades de 21.9 La transposición de TnA requiere transposasa y resolvasa

535

la resolvasa TnpR; no se n ecesitan factores del hospedador. La resolución ocurre en una gran estructu ra nucleoproteínica. La resolvasa se une a cada sirio res y, después, los sitios unidos se conjun tan para formar una estructura de -1 O nm de cUámerro, a veces llamada sinaptosoma, que contiene seis dímeros de resolvasa y dos sitios res. Ocurren cambios en el superenrollado durante l a reacción y el DNA se dobla en los sitios res por la unión de la transposasa. Se han determinado varias estructuras cristalinas de la yo resolvasa . La enzima aislada puede formar un dímero de dímeros, esto es, una subunidad tiene una int erfase que facilita la formación de dímeros y el dímero entonces utiliza una segunda interfase para formar un tetrámeto. El dímero puede unirse al sitio 1 y formar una estructura donde los segmentos catalíticos están distantes de los sirios diana de escisión en el DNA. La estructura cristalina del sinaptosoma, donde u n tetrámero de resolvasa se enlaza a través de Ser 1Q con dos DNA dúplex escindidos en el sitio I muestra que los sitios diana en las cadenas dúplex que van a recombinarse yacen en sitios opuestos del tetrámero. Esto in dica que un dímero debe girar 180" con relación al otro para reubicar el DNA con el fin de lograr la reacción de recombinación. Esta parte del mecanismo es diferente de la empleada por las recombinasas de tirosina (como Creo Flp) donde la enzima, en términos básicos, j unta los DNA recombinantes en forma de una unión Holliday (véase la sección 19. 18. La recombinación específica de sitio simula la actividad de la topoisomerasa). Ocurre la resolución por rotura y reu nión de enlaces, sin aporte de energía . La escisión se logra por una reacción de transesterificación que une de forma covalente la Ser 10 de una subunidad de resol· vas a con un fosfato 5 ' en el enlace cUana del sitio l. El producto consta de una resolvasa unida en fo rma covalente a ambos extremos 5 ' de Jos eones de do ble cadena hechos en el sitio res. La escisión ocurre de manera simétrica en una región pa lindrómica corta para generar dos extensiones de bases. Se puede describir la reacción de corte con expan sión de la imagen de la región de entrecruzamiento localizada en el sitio I de la siguiente forma: 5'TTATAA3' 3'AATATT5'

•

5'TTAT + proteína 3'AA

proteír1a-AA3' TATI5'

La reacción se asemeja a la actividad de Int A en los sitios att (véase la sección 19 .16, La re combinación específica de sitio implica rotura y reunión). De hecho. 15 de los 20 bp del sitio res son idénticas a las bases de posiciones correspondientes en att,

536

CAPÍTULO 21 Transposones

lo que sugiere que la recomhinación específica e sitio de A y la resolución de TnA han evoluciona~J. a panir de l.tn tipo común de reacción de recomt- nación. De hecho, se observa en la sección 23. t Las proteínas RAG catalizan la rotura y reuniór que la recombinación que involuo-a a los genes G. imnunoglobulinas tiene la misma base. La carc..:terística que compane t odas estas reacciones es transferencia. del extremo rc.>to a la proteína caL' . lítica como etapa intermecUa. antes de su re unir . con otro extremo roto (véase la sección 19.18, U: recombinación específica de sitio simula la ac.1lvid2 de la topoisomerasa). Las reacciones mismas son análogas en térm..nos de manipulación del DNA, aunque sólo ocutt resolución entre sitios intramoleculares, en tanto ·: recombinación entre sitios att es intermolecular direccional (como se observa por las diferencias f los sirios attB y attP) . El mecanismo de la acción pr ~­ teínica, no obstante, es diferente en cada caso. Ls resolvasa actúa en una forma en la que se unen cu ~ ­ tro subunidades a los sitios res recombínantes. Cad.:. subunidad hace una escisión de una sola caden a Una reorganización de las sub unidades con relacié.:a las otras desplaza entonces, en términos físicos. la cadenas de DNA y las coloca en una conformaciá:: recombinada. Esto permite a las hendiduras seliarse junto con Ja líberación de la resolvasa.

fE

La transposición de Tn 10 tiene

mú ltiples controles Conceptos princ1pales • La ihhibición de copias múltiples reduce la tasa de transposición de cualquier copia de un transposón cuando se introducen otras del mismo transposón en el geno ma. • Múltiples mecanismos afectan la tasa de transposición.

El control de la frecuencia de transposiciones ~ importante para la célula . Un transposón debe sr capaz de mantener cierra frecue ncia mínima de mo · vimlento a fin de sobrevivir, pero una frecuen cf¿ muy alta pudiese ser lesiva para la célula hospt · dadora. Cada transposón parece tener mecanismo . que controlan sn frecuencia de transposidón . S• han caracterizado d.iversos mecanismos para Tn l t: El Tn l O es un traosposón compuestO, donde -: elemento ISlOR proporciona e l módulo activo. L: organización del ISl OR se resume en la Se encuentran dos promotores cerca del límite externo. El promotor PIN se encarga de la transcripcióde IS 1OR. El p romotOr POUT hace que la transcri¡- · ción avance hacia el DNA del flanco adyacente. !..¿

La transposasa actúa en configuración ois sobre el molde de DNA

..:··..-

Pour - ·· · · · · · · · ..._

~ rN#

,.~

eN

Superposición de 36 bases ~

Transposasa Dos promotores en orientación contraria yacen cerca del límite externo de lSlOR. El fuerte promotor P0u1 impulsa la transcripción hacia el ONA hospedador de los flancos. El promotor P1N más débil, ocasiona la transcripción de un RNA que extiende la longitud de lSlOR y se traduce en la transposasa.

transcripción suele terminar dentro del uaosposón. pero en ocasiones continúa en el interior dt::l DNA del hospedador; a veces esa transcripción leída en forma completa se encarga de activar genes bacterianos adyacentes. El fenómeno de la "inhibición de copias múltiples" revela que la expresión del gen de la transposasa IS 1OR está regulada. La transposición de un elemento Tn lOco el cromosoma bacteriano disminuye cuando se introducen más copias de IS 1OR a través de un plásmido tle CO!)ias múltiples. La inhibición requiere el promotor P our y se ejerce en el ámbito de la traducción. La base del efecto radica en la superposición de las regiones terminales 5' de los productos de transcripción de PIN y PoUT· El RNA OUT es un produclO de transcripción de 69 bases, presente a más de 1OOx la concentración de RNA lN por dos motivos: P ouT es un promotor mucho más fuene que P 1N; y e l RNA OUT es más estable que el RNA IN. El RNA OUT actúa como R.J'IA en sentido opuesto (véase la sección 13.7, Las moléculas pequeñas de RNA pueden regular la traducción). La concentración de RNA OUT no tiene efecto en la situación de una sola copia, pero sí presenta uno significaTivo cuando están presentes más de cinco copias. Suele haber -5 copias de RNA OUT por copia de ISlO (que corresponde a - 150 copias de RNA OUT en una situación de copias múltiples usuaJes). El RNA OUT aparea sus bases con el.RNA lN y el exceso de RNA OUT asegura que el RNA IN se una con rapidez. antes de que pueda adherirse un ribosoma. Así, el RNA IN apareado no puede traducirse. La cantidad de la proteína transposasa a menudo es un rasgo crucial. El Tnl O cuya transposasa se sintetiza en la baja concentración de 0.15 molécula por célula por generación, muestra varios

t Tn10

El apareamiento IN impide la +--~-­ traducción del RNAIN La metllación impide la unión de la transposasa al DNA - - •

La metllación impide la slntesis de la transposasa-Varios mecanismos restringen la frecuenda de transposición de Tn10 mediante la afectación de la síntesis o el funcionamiento de la proteína transposasa. La metilación restringe la transposición de un transposón individual para que ocurra sólo después de la replicación. En situaciones de copias múltiples, la preferencia por la configuración cis restringe la selección de la diana, y el apareamiento de RNA OUT/IN inhibe la síntesis de la transposasa.

mecanismos interesantes. La resume los diversos efectos que influyen en la frecuencia de transposición. Un marco de lectura continuo en una cadena de ISlOR codifica la transposasa. La concentración de la transposasa lim.íta la tasa de transposición. Las mutaciones en este gen pueden complementarse en configuración trans por otro elemento IS lO de tipo silvestre, pero sólo con alguna dificultad. Esto refleja una fuerte preferencia de la transposasa por la actividad en configuración cis; la enzima actúa de manera eficaz sólo con el molde de DNA del que fue transcrita y traducida. La preferencía por la configuración cis es un rasgo común de las transposasas codificadas por elementos !S. (O tras proteínas que muestran preferencia por la configuración cis influyen sobre la proteína A involucrada en la replicación
537

JuntOs, los resultados de la preferencia por la configuración cis y la inbibici<Sn de copias m (lltiples, aseguran que un aumento del número de copias de TnlO en ungenoma bacreriano no cause una mayor frecuencia de transposición que pudiese dañar al genoma. Los efecros de la metilación constituyen el sistema más imponame de regulación de un elemento individual. Disminu)re la frecuencia de la transposición y (de mayor importancia) acoplan la transposición al paso de la horquilla de replícación, La capacidad de IS 1O de transposición tiene relación con e l cido de replicación por la respuesta del uansposón al estado de metilación en dos sitios. Un sitio está dentro de la repetición invertida en el extremo TSlOR donde se une la rransposasa. El otro sitio es el promotOr P 1N , del que se transcribe el ger'l de transposasa. Ambos sitios están metilados por el sistema dam descrito en la sección 15 .5, ¿Regula el inicio la metiladón en e l origen? La metilasa Dam modifica la adenina en la secuencia GATC de una cadena recién sintetizada generada por replicación . La frecuencia de ta transposición Tn 1O aumenta 1 000 ramos en cepas dam- donde los dos sitios diana carecen de grupos metilo. El paso de una horquiUa de replicadón sobre estos sitios genera secuencias hemimetiladas; ello activa al transposón por una combinación de trans cripción del gen de transposasa más a menudo des de PL', y un aumento de la unión de la u·ansposasa al final de JS 1OR. En una bacteria de tipo silvestre, los sitios se mantienen hemimetilados durante un periodo breve después de la replicacíón. ¿Por qué debería ser deseable que ocurriese la transposición poco después de la replicación? El me canismo no replicativo de la transposición de Tn 1O coloca al DNA donador en riesgo de destrucción (véase la Figura 21.7) . Las posibilidades de supervivencia de la célula pueden aumentar si la replicación acab& de ocurrir para generar una segunda copia de la secuencia del donador. El mecanismo es eficaz porque só lo una de las copias que acaban de replicarse da origen al suceso de transposición (determinado por qué cadena de cransposón no está metilada en los sitios dam). Un transposón selecciona sus sitios diana en forma aleatoria y, como resultado, hay una probabilidad razonable de que pudiese llegar a un operón activo. ¿Continuará la transcripción desde el exrerior a través del transposón y así activará a la t,ransposasa cuya producción puede, a su vez, llevar a un grado alto de transposición, tal vez letal? El Tn lO se protege contra tales sucesos por medio de dos mecanisrnos, La transcripción a través del extte-

538

CAPÍTULO 21 Transposones

mo ISl OR dismLnuye su actividad, al parecer porq\k inhibe su capacidad de unirse a la transposasa, y e RNAm que se extiende en sentido ascendente desde el promotor es poco traducido porque tiene Ul-~ estructura secundaria donde el codón de i.niciaciócs inaccesible.

Los elementos de control en el maíz causan roturas y reestructuraciones Conreptos principales • Se descubrió la trans posición en el maíz por los efectos de las roturas cromosómicas generadas por la transposición de "elementos de control". la rotur~ genera un cromosoma que tiene un centrómero y un extremo roto, así como un fragmento acéntrico. • El fragmento acéntrico se pierde durante la mitosis; lo que puede detectarse por la desaparición de alelas dominantes en un heterocigoto. • La fusión entre los extremos rotos del cromosoma genera cromosomas dicéntricos, que presentan más ciclos de rotura y fusión . • El ciclo de fusión-rotura-puente se encarga de la aparición de la variegación somática.

Una de las consecuencias más visibles de la exister · cia y movilidad de los uansposones ocurre durar· te el desarrollo de las plantas, cuando se prcsema variación somá tica, la cual se debe a cambios en ~= localízación o conducta de los elementos de con~ troJ (el nombre que recibieron los transposones ~ el maíz antes de que se descubriera su naturalez..; molecular). Dos características del maíz han ayudado as~­ guir los sucesos de [ransposición. Los e le mento~ J control a menudo se insertan cerca de genes qu._ tie nen efecros visibles pero no letales sobre el fénotipo. El maí'l. muestra desarrollo clona!. lo que significa que la aparíción y 1a sincronización de l.' episodio de transposición se pueden visualizar corr se muestra en la La naturaleza del episodío no i.mpon(l; pudie<.ser u na mutación puntiforme, una inserción, ur ~ escisión o una rotura cromos6mica. Lo que impor..,¡ es que tiene lugar en una célula heterocigota par : alterar ta expresión de un alelo . Los d.escencliem~ de una célula que ha sufrido el suceso presenra · después un nuevo fenotipo, en tanto los descen dientes de células no afectadas por el suceso con- núan mostrando el fenotipo original. Las originadas por mitOsis de una célula detemiuada se mantienen en la misma localizaciór.

dan origen a un sector del tejido. El cambio en el fenotipo dura me el desarrollo somático recibe el nombre de variegación; se descubre por un sector del nuevo fenotipo que reside demru de un teji do del feno tipo original. El tamaño del sector depende del número de divisiones ciel linaje que le dio origen, de manera que el ramaño d~ la nueva zona del nuevo fenotipo se determina por el momen to en que ocu rre el cambio en el genotipo. Cu anto más temprano haya ocurrido en el linaje celular mayor será el número de descendientes y, por tamo, el tamaño del parche en el tejido madu ro. Esto se observa de forma más clara en la variación del color del meollo, cuando aparecen parches de un color demro de otro. La inserdón de un elemenro de control puede afectar la actividad de los genes cercanos. Las dekcioncs, dupllca<:iones, inversiones y translocaciones se presentan todas en los sitios donde hay elementos de con trol. La rotura cromosómica es una conse cuencia común de la presencia de algunos elemenws. Una característica única del sistema en el mafz es que las actividades de los elementos de control se regulan durante el desarrollo. Lo~ elementos presentan transposición y fadlitan reestructuraciones génicas en momentos y frecuencias característicos durante el desa rrollo de las plantas. La conducta carac[erística de los elementos de control en el mafz se tipifica por el elemento Ds, que en un principio se identificó por su capacidad de ofrec:er un sitio para la rotura cromosómica. Las . Conconsecuencias se ilustran en la sidérese una célula heterocigota donde Ds yace en un homólogo entre el centrómero y una serie de marcadores dominantes. El otro homólogo carece de Ds y presenta marcadores rcccsivos (C. bz y wx). La rotura en D~ genera un fragmento acéntrico que porta los marcadores dominantes. Como resu1tado de su fa lta de un centrómero, este fragmento se pierde en la mitosis. Así. las células descendien tes sólo tienen los marcadores recesivos que porta el cromosoma ínregro. Esto da el tipo de situación cuyo resultado se m uestra en la Figura 21.22. La muestra que la rotura en Ds conduce a la formación de dos cromosomas desusados, generados por la unión de los extremos rotos de los productos de la replicación . Uno es un frag mento acéntrico o en forma de U constituido por las cromátidas hermanas unidas en la región distal a Ds (a la izquierda, como se ilustra en la fig ura}. El otro es un cromosoma dkéntrico con forma de U que incluye a las cromátidas hermauas proximales a Ds (a la derecha en la figura). Esta úluma estructura conduce al dclo clásico de rot ura-fusión -puent e ilustrado en la figura.

La rotura de un cromosoma causa pérdida de un alelo dominante

· "'- . 1

-. .. _.... ....... i i ·."" ·~

.... .-. ..,_ y ..y v• . 1.. .. ~

j

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........

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• -'• - ' 'f

oc

-

genotip~

o.. Q . .....

.

00 00

V

Las células de un ongmal muestran fenotipo dominante La clona descendente de una mutante muestra un fenotipo recesivo

l Meollo con un sectOf de fenotipo receSivo

El análisis clonal identifica un grupo de células provenientes de un solo ancestro, donde un episodio mediado por transposición altero el feno tipo. La sincronización del episodio durante el desarrollo la indica el número de células; la especificidad hística del suceso puede estar indicada por la localización de las células.

Centrómero

(e/

Fenotipo celular

Bz Wx Os

Cl Bz Wx

(e bz wx

t

Rotura en Ds

Fragmento acéntrico

(e/

Bz Wx 1 e=~

(e

bz w x

"=:::::::=:>

l (e

Mitosis

e

tn wx

bz wx

Una rotura en un elemento de control causa la pérdida de un fragmento acéntrico; si el fragmento porta los marcadores dominantes de un heterocigoto, su pérdida cambia el fenotipo. los efectos de los marcadores dominantes, ([, Bz, y Wx pueden visualizarse por el color de las células o con una tinción apropiada.

21.11 Los elementos de control en el maíz c¡; usan roturas y reestructuraciones

539

(

Por ejemplo, considérese el cromosoma con deleción que perdió A. En el siguiente ciclo ocurre una rotura entre By C, de manera que los descendiente· se
ae ~

Os A

Rotura en Os

(

11 A

!

ae ~

Replicación

(

11 A B

e

=>

(

1 1A B e

~

~

Primer ciclo de retura de fusión-puente Fusión de cromátides hermanas

~

1

El fragmento acéntrico se pierde

C.

](~#3 ~

Los centrómeros se separan en la mitosis

e B A

! e

e

A

s e

:::=J

Rotura

B A

AIIT:=:) ....:

Cromosoma con Cromosoma con duplicación de A delación de A Segundo-ciclo de rotura de fusión-puente

• •

rsr-:=J . ~-==:J ~· · ·· ·· ··· · ·· ~

Ccsac~

C

~ G B

Cromosoma con duplicación de B

slif:_=:J Cromosoma con delación de B

El Os provee un sitio para el inicio del ciclo de rotura-fusión-puente de cromátidas. Los productos se pueden seguir por análisis clonal.

Obsérvese el destino del cromosoma dicéntrico cuando intenta segregarse en el huso rnitótico. Cada uno de sus dos centrómeros jala hacia el polo opuesto. La tensión rompe el cromosoma en un sitio aleatorio entre los centrómeros. En el ejemplo de la figura la rotura tiene Jugar entre los loci A y B con el resultado de que un cromosoma hijo tiene duplicación de A en tanto el otro presenta su deleáón. Si A es una marcador dominante, las células con la duplicación conservarán u n fenoúpo, pero las células con la deledón mostrarán el fenotipo a. recesivo. El ciclo de rotura -fusión-puente continúa a través de más generaciones celulares y permite que los cambios genéricos persistan en los descendientes. 540

CAPÍTULO 21 Transposones

Los elementos de control forman fa milias de tra nsposones Conceptos principales • Cada familia de transposones en el maíz tiene elementos de control autónomos y no autónomos. • Los elementos de control autónomos codifican proteínas que les permiten realizar la transposición. Los elementos de control no autónomos tienen mutaciones que eliminan su capacidad de catalizar la transposición, pero puedef! realizarla cuando un elemento autónomo proporciona las proteínas necesarias. • los elementos de control autónomos tienen cambios d~ fase cuando sus propiedades se alteran como resultado de cambios en el estado de metilación.

El genoma del maíz contiene varias familias de elementos de control. Los números, tipos y localiz:.ciones de los elementos son característicos de cae.: cepa individual de maíz. Pueden ocupar una par: ~ significativa del genoma. Los miembros de cada fa milia se dividen en dos clases: • Los e lemen t os d e control a,utónom O'Etienen la capacidad de realizar escisión transposidón. Como resultado de la acti\-dad continua de un elemento autónomo, S'lnserción en cualquier locus crea un ale! inestable o "mutable". La pérdida del ek · mento autónomo mismo o de su capacida..: de transpo~ición convierte a un alelo mutable en un alelo esrable. • Los elementos de cont rol no a utónomos son estables¡ no presentan transpcsición o sufren otros cambios espontánec~ de su condición. Se tornan inestables sóJ· cuando un miembro autónomo de la misma familia está presente en otro sitio de genoma. Cuando está complementado er configuración trans por un elemento aur6nomo, un elemento no autónomo mues~ la variación habitual de actividades vinculadas con los elementos autónomos, como -~ capacidad de transposición a nuevos sitio~ Los elementos no autónomos se derivan ci-t

elementos autónomos porque pierden las funciones en configuración trans indispensables para la transposición. Las familias de elementos de control se definen por las interacciones entre elementos autónomos y no autónomos. Una familia consta de un solo tipo de elemento autónomo acompañado por muchas variedades de elementos no amónomos. Un elemento no autónomo se ubica en una familia por su capacidad de ser activado en configuración trans por los elementos autónomos. Las principales familias de elementos de control en el maíz se resumen en la DescritOs en el ámbito molecular, los transposones del maíz companen la forma habitual de organ.it:ación (repeticiooc~ invenictas en los extremos y repeticiones cortas y directas en el DNA diana adyacerl,te), por Jo demás, varían el tamaño y capacidad de codiftcación. Todas las famil ias de transposones companen el mismo tipo de relación entre elemen tos autónomos y no amónomos. Los elementos autónomos tienen marcos de lectura abiertos entre las repeticiones terminales, en tanto los elementos no autónomos no codifican proteínas funcionales. A veces, las secuencias internas se relacionan con las de elementos autónomos que en otros momentos han tenido divergencia completa. El transposón mutador es uno de los elementos más sencillos. El elemento autónomo MuDR codi fica los genes mudrA (que codifica la transposasa :vtURA) y mudrB (que codifica una proteína accesoria no esencial). Los extremos de los elementos están marcados por repeticiones invertidas de 200 bp. los elementos no au tónomos, en términos básicos -.ualquier unidad que tcuga repeticiones invertidas, que pudiesen no tener ninguna relación de secuenda interna con MuDR, también son movilizados por .'vl.URA. Por lo gen e raL hay va rios miembros comunes - 10) d<: cada familia de transposones en ungenoma vegetal. Mediante el aná li sis de elementos autónomos y no autónomos de la familia Ac/Ds se cuenta con información molecular acerca de muchos ejemplos individuales de estos elementos. En !a se resumen sus estructuras. La mayor parte de la longitud del elemento au iÓnomo Ac es ocupada por un solo gen constituido por cinco exones. El producto es la transposasa. El elemento mismo termina en repeticiones invertidas de 11 bp y se duplica una secuencia diana de 8 bp ~n el sitio de inserción. Los elementos Ds varían en longitud y seruenda pero tienen relación con Ac. Terminan en las mismas repeticiones invertidas de 11 bp. Son más ..:ortos que Ac y la longitud de la deleción es varia· !:>le. En un extremo, el elemento Ds9 üene una dele-

Autónomo

No autónomo

Presenta Activación en Reqwere un transpostción configuración trans elemento de forma autónomo

óndopT~"''

J

Se traslada a un nuevo sitio

Se traslada a un nuevo sitio

Familias de transposones del malz

------1

Ac (activador) Mp (modulador)

Os (disociación)

Spm (mutador-supresor) En (potenciador)

dSpm (Spm defectuoso) 1(inhtbidor)

Dt (punteado)

Sin nombre

MuDR (mutador)

Mu

Cada familia de elementos de control tiene miembros autónomos y no autónomos. Los elementos autónomos están aptos para la transposición. Los elementos no autónomos son deficientes e n la transposición . los pares de elementos autónomos y no autónomos se pueden clasificar en >4 familias.

Exón 1

2

3

4

-

5

-

Transcripción 500 bp

Ds9 Ds2d1 Ds2a2 Ds6 El elemento Ac tiene cinco exones que codifican una transposasa; los elementos Os tienen deleciones internas.

ción de sólo 194 bp. En una deleción más extensa, el elemento Ds6 conserva la longitud de sólo 2 kb, que representa un kb desde cada ex1remo de Ac. Un elememo D~ doble complejo tiene una secuencia Ds6 insertada en orientación inversa dentro de otra. Los elementos no autónomos carecen de secuencias internas, pero poseen las repeticiones terminales invertidas (y quizá otra!> características de secuencia). Los ele memos no autónomos se derivan de elementos autónomos por deleciones (u otros cambios) que desactivan la transposasa que actú a en configuración trans, pero dejan intactos los sitios 21.12 Los elementos de control forman familias de transposones

541

(incluidos los extremos) donde actúa la transposasa. Sus estructuras varían de mutaciones menores (pero inactivantes) de Ac hasra secuencias que presentan deledones mayores o reestrucLUraciones. En el otro extremo, 1os miembros de la familia Dsl incluyen secuendas cortas cuya única relación con Ac radica en que poseen repeticiones terminales invertidas. Los elementos de esa clase no necesitan derivarse de manera directa de Ac, pero pudiesen hacerlo por cualquier suceso que genere repeticiones invertidas. Su existenda sugiere que la transposasa reconoce sólo las repeticiones invertidas terminales o tal vez las repeticiones terminales en conjunción con alguna secuencia interna corta. La transposición de Ac/Ds ocurre por un mecanismo no repücativo y se acompru.1a de su desaparición en Ja localización del donador. El anállsis clona! sugiere que la transposición de Ac/Ds casi siempre ocurre poco después de que el elemento donador se ha replicado. Es1.as características se asemejan a la transposición del elemento bacteriano Tn 1O (véase la sección 21.10. la transposición de TnlO tiene múltiples controles). La causa es la misma; la transposición no tiene lugar cuando el DNA del transposón está metilado en ambas cadenas (el estado habitual antes dela metiladón) . y se activa cuando el DNA es hemimetilado (el estado habitual en cuanto termina la replicación). El sitio receptor con ú·ecuencia está en el mismo cromosoma que el sitio donador, y a menudo bastante cerca. La replicadón genera dos copias de un donador potencial Ac/Ds, pero por lo general sólo una copia en realidad presenta transposición ¿Qué pasa con el sitio donador? Las reestructuraciones que se en cuentran en sitios desde los que se han perdi do elementos de control podrían e>:plicarse en términos de las consecuencias de una rotura cromosómica, como se ilustró ames en la Figura 21.23. Los elemenlOs autónomos y no autónomos. están sujetos a una variedad de cambios en su coniliclón. Algunos de estos cambios son genéticos; otros. epigenéticos, El principal cambio es (por supuesw) la conversión de un elememo autónomo a uno no autónomo, pero pueden ocurrir otros cambios en los elementos no autónomos. los defectos de la actuación en configuración cis pueden hacer a un elemento no autónomo impermeable a los elementos amónomos. Así, un elemento no autónomo puede volverse estable de manera permanente porque ya no p uede ser activado para efectuar la transposición , Los elementos autónomos están sujetos a "cambios de fase" que son alteraciones hereditarias, pero también relativamente inestables, de sus propiedades. Adoptan la forma de una desactivación rever542

CAPÍTULO 21 Transposones

sible donde un elemento oscila entre estados actiY e inactivo durante el desarrollo de la planta. los cambios de fas e en los tipos Ac y Mu ~ elemento autónomo son resultado de cambios en : metilación del DNA. Las comparaciones de las S\.15 ceptibilidades de los elementos activos e ina-c th , a las enzimas de restricción sugieren que la forr....; inactiva del elemento es metilad.a en Ja secuenc.:: diana B:ay varios sitios diana de cada elemerY no se sabe cuáles controlan el efecto. En el ca~ de MuDR, la desmetiladón de las repeticiones tc-:minales aumenta la expresión deJa uansposasa _ que sugiere que el efecto pudiese ser mediado por ::! control del promotor para el gen de la transposas:; Sería conveniente saber qué cor¡,trola la metilaciCJ y desmetilación. de los elementos. El efecto de la melilación es en general comt:e..ntre los transposones de las plantas. La mejor G;: mostración del efecto de la metilación sobre la ac vidad proviene de las observaciones hechas con mutante ddml de Arabidopsis que causa una pérdl,~ de metilaci6n en la hererocromatina. Entre las eL nas que pierden grupos metilo está una familia .;.transposones relacionados con MuDR. El análi~ directo de las secuencias genómicas muestra q_ la desmetilación causa sucesos de transposición.:... rnetjlación tal vez es el principal mecanismo utL zado para i'rnpedir que los t ransposones dañeu :. genoma por transposición muy frecuentes. Puede haber controles autorregulados de transposición, análogos a los efectos de la ilunUL dad mostrados por los transposones bacterianos.:. aumento del número de elementos Ac en el geno~ disminuye la frecuencia de la transposición. El e mento Ac puede codificar un represor de la h·ansr sición; es posible que la actividad la realice la misr::proteína que provee la función de transposasa.

gg.

fDI

Los elementos Spm influyen en la expresión génica

Conceptos principales • Los elementos Spm afectan la expresión génica en sus sitios de inserción, cuando la proteína TnpA se une a sus sitios diana en los extremos de los transposones. • Los elementos Spm se desactivan por metílación.

Los elementos autónomos Spm y En son casi ié.e: ticos; difieren en menos de 10 posiciones. En. la se resume su estructura. Las repetidoterminales invertidas de 13 bp son indispensar para la transposición, según indica el fenotipo :: transposición defectuosa de deleciones en los .

tremos. Los transposones relacionados con Spm se encuentran en otras plantas y se definen como miembros de la misma familia por su organización semejante, en términos generales. Todos comparten repeticiones terminales invertidas casi idénticas y generan duplicaciones de 3 bp del DNA diana con ia transposición. Nombrado~ por sus similitudes terminales, se conocen como el grupo CACTA de transposones. Se transcribe una secuencia de 8 300 bp a partir de un promotor en el extremo izquierdo del ele mento . Los 1 1 exones contenidos en el producto de rranscripción se escinden en un mensajero de 2500 bases. El RNAm cod ifica una proteína de 621 aminoácidos. El gen se denomina rnpA y la proteína se une a una secuencia de consenso de 12 bp, presente en múltiples copias en las regiones terminales del elemento. Se requ iere la función de tnpA para la escisión, pero en ocasiones no es suficiente. Todos los elemcmos no autónomos de esta familia (señalados como dSpm para Spm defectuoso} tienen mucha relación en su estructura con el elemento Spm mismo. Presentan deleciones que afectan a los exones de mpA. Otros dos marcos de lectura abiertos (ORFl y ORP2) se localizan dentro del primer imrón largo de tnpA. Están contenidos en un RNA de 6000 bases alternativamente escindido. presente en 1% de la concentración del RNAm de tnpA. La función que contienen los ORPI y 2 se llama tnpB. Puede proporcionar la proteína que se une a las repeticiones invertidas terminales de 13 bp para escindir los ex:remos para u·ansposición. Además del elemento Spm activo por completo, hay derivados Spm-w que muestran actividad más débil en la transposición. El ejemplo provisto en la Figura 21.27 tiene una deleción que elimina tanto a ORFl como a ORF2, lo que sugiere que la necesidad de transposición de mpB puede pasarse por alto o cambiarse. Las inserciones de Spm pueden controlar la expresión de un gen en el sitio cuando ocurren. Un locus receptor pudiese quedar bajo control positivo ~' negativo. Un locus susceptible de supresión por Spm presenta inhibición de la expresión. Un locus dependiente de Spm se expresa sólo con la ayuda de Spm. Cuando el elemento insertado es un dSpm. la supresión de la dependencia responde a la función .:le acción en configuración rrans provista por un Spm autónomo. ¿Cuál es la base de esros e(ectos Jpuestos? Un alelo susceptible de supresión dSpm contie,e una inserción de dSpm dentro de un exón del _5en. Esa estructura hace surgir la pregunta inmediata, ¿cómo un gen con una inserción dSpm en un :-xón puede llegar a expresarse? La secuencia dSpm

1 kb

Spm-w-8011 dSpm-7995 dSpm-79978 dSpm-Boo4

ElSpm/En tiene dos genes. El tnpA consta de 11 exones que se transcriben en un RNAm de 2 500 bases, con corte y empalme. El tnpB puede constar de un RNAm de 6 000 bases que contiene ORFl + ORF2. puede escindirse del producto de transcripdón por el uso de secuencias en sus extremos. El suceso de escisión puede dejar un ~ambio en la secuencia del fu\lAm que explica así un cambio ton las propiedades de la proteína que codifica. Se ha descubierto una capaddad similar de escisión a partir de un productO de Transcripción para algunas inserciones de Ds. El tnpA provee la función supresora por la que en un prindpio se nombró al elemento Spm. La presencia de un elemento defecruoso puede disminuir la expresión de un gen donde reside, pero no eliminarla. La introduccion de un elememo autónomo que posea un gen tnpA funcional, no obstante, puede suprimir por completo la expresión del gen diana. La supresión es causada por la capacidad de tnpA de unirse a sus sitios diana en el elemento defecwoso. que bloquea el avance de la transcripción. Un alelo dependieme de dSpm contiene una inserción cerca de un gen, pero no en su imerior. La inserción parece proveer un pmenciador que activa aJ promotor del gen en ellocus receptor. La supresión y dependencia de dementos en dSpm parecen estar sujetas a la misma imeracción entre el prod\tcto de actividad en configuración trans del gen rnpA del elemento autónomo de Spm y los sitios de acción en configuración ds en los extremos del elemento. Así, una interacción simple emre la proteína y los extremos del elemento suprime o activa un locus diana. dependiendo de que el elemento se localice en sentido ascendente o dentro del gen receptor. Los elementos Spm se encuentran en una variedad de estados, que van desde actividad completa hasta crípticos. Un elemento críplico es silente y no presenta transposición por sí mismo ni acriva los elementos dSpm. Un elemento crfptíco puede reac-

21.1..1 Los elementos Spm influyen en la expresión génica

543

tívarse de manera rransitoria o convertirse al estado activo por la interacción con un elememo Spm por completo activo. La desactivación es causada por metilación de secuencias en la vecindad del pun Lo de inicio de la transcripción. La uaturaJeza de los sucesos que se encargan de la desactivación de un elemento por metilación nueva o de la activación por desmetilación (o porque se evita la meti lación) no se conoce aún.

Intervención de los elementos susceptibles de transposición en la disgenesia híbrida Conceptos principales • los elementos P son transposones que portan las cepas P de Drosophi/o melanogaster, no así las cepas M. • Cuando un macho P se cruza con una hembra M se actíva la transposición. La inserción de elementos P en sitios nuevos en esas cruzas desactiva muchos genes y las hace infecundas.

Cierr.as cepas de D. melanrgaster encuentran dificultades en las cruzas. Cuando se cruzan las moscas de dos de esas cepas, la progenie muestra "rasgos disgenéticos", una serie de defccLos que incluye mutaciones, aberraciones cromosómicas, segregación distorsionada en la meiosis y esrerilidad. La aparición de estos defectos correlacionados se llama

disgenesia híbrida . Se han identificado dos sistemas encargados de la disgenesia híbrida en D. melanogaster. En el primero, las moscas se dividen en los tipos I (inductor) y R (reactivo). La fecundidad disminuida se observa en cruzas de machos I con hembras R, pero no en sen-

Macho

Hembra M

p

Hembra

Macho

p

M

l El hlbrido parece normal pero es estéril

!

NO HAY PROGENIE

La disgenesía híbrida es asimetrica; es inducida por cruzas de machos P con hembras M, pero no por la de machos Mcon hembras P. 544

CAPÍTULO 21 Transoosones

tido opuesro. En el segundo sistema las moscas dividen en los dos tipos, P (de comribución pater y M (de comribución materna). En la se ilustra la asimetría del sistema; una cruza el" un macho P y una hembra M causa disgenesia, p-. la cruza inversa no lo hace. La disgenesia es sobre todo un fenómen<' células germinativas. En las cruzas que involuc:-. el sistema P-M, las moscas híbridas Fl Lienen 1 ~ dos somáticos normales. No obstante, sus góna ~ no se desarrollan. El defecro morfológico sobre desarrollo de los gametos data de la etapa en la \: comienzan las divisiones celulares rápidas en 1.: nea germinal Cualquiera de los cromosomas de un macb puede inducir la disgenesia en una cruza con .._hembra M. La construcción de cromosomas rect bina mes muestra que varias regiones dentro de c.s cron1osoma P pueden causar disgenesia, lo que giere que un macho P tíene secuencias en mue localizaciones cromosómicas diversas que pueor: · inducir disgenesia. Las localizaciones diGeren er · cepas P individuales. Las secuencias P específicas :tán ausentes de los cromosomas de las moscas ~. La naturaleza de las secuencias específicas F identificó primero por mapeo del DNA de mutap· w encontradas cmre los híbridos disgenéticos. : das la mutaciones son resultado de la inserción DN A en el locus w . (La insetción desacliva el ~ y da origen al fenotipo de ojos blancos por el ~ ­ recibe su nombre el locus.) La secuencia insert.G se denomina elemento P . Las inserciones del elemento P forman un sEema de transposición clásico. Los elementos in viduales varían en longitud, pero tienen secuent. homóloga. Todos los elementos P poseen repetic nes Lerminales invertidas de 31 bp y generan ; _ peticiones directas del DNA diana de 8 bp con transposición. Los elementos P más largos tier r -2 .9 kb de longitud y presema·1 ruatro marcos lecturas abiertos. Los elementos más conos surg... al parecer con bastanLe frecuencia, por delecior. -: internas de un factor P de longitud totaL Al men algunos de los elementos P más cortos han per d_o la capacidad de producir la transposasa, pero ~ probable que los active la enzima codificada por .. elem ento P completo en configuración trans. Una cepa P porta de 30 a 50 copias del elemer" P, casi 33% de ellas de longítud completa. Los e.t:mentos están ausentes de las cepas M. En una ceP, se ponan los elementos como componentes ine· tes del genoma. pero se activan para la transposid cuando un macho P se cruza con una hembra/\-' Los cromosomas de las moscas híbridas disgec ticas P -M tienen elementos P insertados en muer sitios nuevos. Las inserciones desactivan a los ge1~ .

donde se localizan y a menudo causan roturas cromosómicas. El resultado de la transposición es, por tamo, desacrivar al genoma.

SE

1n1rón 1 lntron 2 lntrón 3 Elemento P ORFO ORFl ORFl! ORF:>

Los ele mentos P se activan en la linea germinal

JTranscnpctón ANA corto ANA largo

Conceptos principales • Los elementos P se activan en la línea germinal de cruzas de machos P con hembras M porque un episodio de corte y empalme especifico de tejido retira un intrón que genera la secuencia de codificación de la transposasa . • El elemento P también produce un represor de la transposición, que se hereda por vía materna en el citoplasma. • La presencia del represor explica por que las cruzas de machos Mcon hembras P se mantienen fecu ndas. La activadón de los elementos Pes espedfica de tejido; ocurre sólo en la linea germinativa. No obsta me, los elementos P se transcriben tanto en la línea germinal como en tejidos somáticos. La especifiddad hística es conferida por un cambio en el patrón de cone y empalme. En la se muestra la organizadón del elemento y sus productos de transcripdón. El producto de transcripción primaria se exriende 2.5 kb o 3.0 kb; la diferenda tal vez refleje sólo la susceplibilidad de escurrimiento del sitio de rerminadón. Puede haber dos productos proteínicos: • En tejidos somáticos sólo se escinden Jos primeros dos imronec;, lo que crt::a una región de codificación de ORFO-ORF l-ORF2. La traducción de este RNA da lugar a u·n a pro teína de 66 kD, que correspon de a un represor de la actividad del transposón. • En tejidos de la línea germ inal tiene Jugar otro episodio de corte y empalme que retira el im rón 3. Esto conecta los cuatro marcos de lect ura abiertos en un RNAm que se tra duce para generar una proteína de 87 kD, que es la transposasa. Dos tipos de experimento han demosrrado que es necesario el cone y empalme del tercer intrón para la transposición. Primero, si las uniones de corte y empalme se muran in virro y el elemento P se reinrroduce a las moscas, su actividad de transposición se elimina. En segundo término. si el tercer intrón presenta deleción. de modo que ORF3 se incluya de manera constitutiva en el RNAm de tOdos los tejidos, ocurre transposición en tejidos somáticos, así como en la línea germinal. Por tanto, siempre que ORF3 es objeLO de corte y empalme al marco de lectura anterior, el elemento P se acti va. Éste es

~

Permanece el tnlrón 3 RNAm somático

b

- Marco de lectura+

Repres!r de 66 kD

Unea

minativa

RNAm

L

-

Marco de lectura~

Transposasa de 87 kD

El elemento P tiene cuatro exones; los primeros tres se cortan y empalman juntos en la expresión somática; los cuatro se cortan y empalman juntos en la expresión de la línea germinal.

un suceso regulador crucial y suele presentarse sólo en la linea germinal. ¿Qué se encarga del cone y empalme específicos de tejido? Las células somáticas contienen una proteína que se une a la secuencia del exón 3 para prevenir el corre y empalme del último intrón (véa se la sección 26.12, El corte y empalme alternativos implican el uso diferencial de las uniones de corte y empalme). La ausencia de esta proteína en las célula~ de la línea germina l permite que e l corte y empalme generen el RNAm que codifica la transposasa. La transposición de un e lemento P requiere -150 bp de DNA terminal. La transposasa se une a secuencias de lO bp que están cercanas a las repeticiones invertidas de 31 bp. La transposidón ocu · rre por un mecanismo no replicativo de "corte y pegado'' que se asemeja al de TnlO. (Contribuye a una disgenesia híbrida en dos rormas: la inserción del elememo con transposición en un nuevo sitio puede causar mutaciones y la rotura que se deja en el sitio donador [véase la Figura ll. 7}, tienen efecto adverso.) Es interesante que en un porcentaje significa tivo de los casos, la rotura en un DNA donador se repare con el uso de la secuencia del cromosoma homólogo. Si el homólogo tiene un elemento P, su presencia en el sirio donador puede restablecerse (de manera que el episodio simula el resultado de l~.

' Los elementos Pse activan en la línea germinal

54S

una transposición replica tiva). Si el homólogo carece de un elemento P. la reparación puede generar una secuencia que carece de dicho elemento, por lo que al parecer se provee una escisión precisa (un suceso desusado en otros sistemas susceptibles de transposición). La dependencia de una disgenesia híbrida sobre la orientación sexual de una cruza muestra que el citoplasma es importante, así como los propios factores P. La contribución del citoplasma se describe como dtotipo: una línea de moscas que contienen elemenros P tiene cirotipo P. en tanto una linea de moscas que carece de elementos P tiene citotipo M. Ocurre disgenesia híbrida sólo cuando Jos cromosomas que contienen factores P se encuentran en el citotipo M. es decir. cuando el macho progenitor tiene elementos P y la hembra no. El cítolipo muestra un efecro citoplásm ico beredable; cuando tiene lugar una cruza entre el citotipo P (el progeni tor femenino tiene elementos P). la d.isgenesia híbrida se suprime por varias generaciones de cruzas con progenítores femeninos M. ASí. algo en el citotipo P, que se puede diluir después de varias generaciones, suprime la disgenesia híbrida. El efecto del citotipo se explica en términos moleculares por el modelo de la . Depende de la capacidad de la proteína de 66 kD de reprimir

Linea P (cruza de macho P con hembra P) Cromosomas del macho Elemento P ORFO ORF2

1

-

-

,!ORF1

.

Cromosomas de la hembra Elemento P

ORF3

~

.

Citotipo Represor de 66 kD 66K

.

El represor 1mp1de la transposición de todos los elementos P

• • • • • ••••• • • • • • •••• J•• • ••• • •• • •• • • • • • •

Cq.Jza de macho P con hembra M Cromosomas del macho Elemento P

Cromosomas de la hembra

Cito1ipo

Sin elementos

Ninguno

El elemento P sintetiza la transposasa

y Oisganesia hlblida Cruza de macho M con hembra P Cromosomas del macho Sin elementos

Cromosomas de ta hembra Elemento P

Citotipo Represor de 66 kD 66K

........... ..... ..•..

~

El represor impide la transposiCIÓn de todos tos elementos P

Las interacciones entre los elementos P delgenoma y un represor de 66 kD en el citotipo determinan la disgenesia híbrida. 546

CAPÍTULO 21 Transposones

la transposición. La proteína es provista como t.:. factor materno en el oocito. En una línea P de': haber suficiente proteína para impedir la transpo$ ción. aunque haya elementos P. En cualquier cru.que involucre a una hembra P, su presencia impi\> la síntesis y actividad de la rransposasa. No obstare. cuando el progenitor femenino es de tipo : no hay represor en el oociro y la introducción un elemento P del progenitOr masculino da corr resultado la actividad de transposasa en la líno: · germinal. La capacidad del citotipo P de ejercer _.efecto por más de una generación sugiere que det· haber suficiente proteína represora en eJ oocito. con la suficiente estabilidad, para pasar a través dt:< adulto y estar presente en los oocitos de la siguien: generación. Las cepas de D. melcmogaster descendien tes 1.: moscas atrapadas en estado silvestre hace m ás de; años son siempre M. Las cepas procedentes de mi"'K. cas capturadas en los últimos lO años son casi sierr-pre P. ¿Significa esto que la familia de elemento5: ha invadido poblaciones silvestres de D. melanogas·~ en años recientes? Los elementos P son, de hech muy invasores cuando se introducen en una nue' ~ población; la fuente del elcmenw invasor tendr ~ que haber sido otra especie. La disgenesia híbrida disminuye las cruzas. p..lo que constituye un paso en la vía hacia la esped.:ción. Supóngase que se crea un sistema disgenétic por un elemento susceptible de u·ansposíción en a guna localización geográfica. Otro elemento puec~ crear un sistema diferente en alguna otra localize· ción. Las moscas en las dos áreas serían d.isgenética para los dos sistemas (o qu izá más). Si esto las hace estériles entre ellas y las poblaciones se aíslan er términos genéticos, puede ocurrir una separació: ad icional. Múltlples sistemas disgenéricos, por tau· to, cond ucen a la impos ibilidad de apareamiento,· a la especiación.

Resumen Las células procarióticas y eucarióticas contienen UK variedad de transposones que se desplazan cuand mueven o copian secuencias de DNA. El transposó:: puede identificarse sólo como una entidad demr... del genoma¡ su movilidad no implica una form.; independiente. El transposón pudiese ser de DNn egoísta, interesado sólo en la perpetuación propi.: dentro del genoma residente; si confiere cualquie ventaja selectiva sobre el genoma, ésta será indirecta Todos los transposones tienen sistemas que limitar la extensión de la transposición porque cuando e. irrefrenable parece ser lesiva, pero los mecanisme· moleculares son diferentes en cada caso.

EJ arquetipo de transposón tiene repeticiones invertidas en los extremos y genera repeticiones directas de una secuencia cona en el silio de inserdón. Los tipos más sencillos son las secuencias de inserción (IS) bacterianas, que constan en esencia de las repeticiones terminales invertidas en los flancos y un marco de codificación cuyo producto proporciona actividad de transposición. Los transposones compue~to~ tienen módulos terminales que constan de elementos JS; uno o ambos módulos TS ofrecen actividad de transposasa y las secuencias entre ellos (que a menudo portan resistencia a los antibióticos) se tratan como pasajeros. La generación de repeticiones diana en los flan cos de un transposón refleja una característica frecuente de la transposición. El sitio diana es escindido en puntos escalonados de cada cadena de DNA por una distancia (ija (a menudo cinco o nueve pa· res de bases). El transposón es en efecto insertado entre Jos extremos de cadena única prominenres generados por Jos eort~s escalonados. Las repetidones diana se generan por el Uenado de regiones de cadena única. Los elementos lS, los rransposones compuestos y los elementos P se desplazan por transposición no replicativa, donde el elemento se mueve de manera directa de un sitio donador a un sirio recepror. Una enzima transposasa única cataliza la reacción. Ocurre por un mecanismo de "corte y pegadoN, donde eltransposón se separa del DNA en los flancos. la escisión de los extremos del transposón, las hendiduras en el siuo diana y la conexión de los extremos del transposón a las hendiduras escalonadas, tienen lugar todos en un complejo nucleoproteínico que contiene a la transposasa. La pérdida del transposón del donador crea una rmura de doble cadena cuyo destino no es claro. En el caso de 1'n lO, la transposición es posible en cuanto concluye la replicación del ONA. cuando los siti.os reconocidos por el sistema de metilación dam son hemimctilados de manera transitoria. Esto exige la existencia de dos copias del sitio donador, que tal vez aumenten las posibilidades de supervivencia de la célula. La familia de transposones TnA se moviliza por transposición replicativa. Después de que el transposón en el sitio donador se conecta con el sitio diana, la replicación genera una molécula cointcgrada que tiene dos copias del transposón. Una reacción de resolución, que comprende la recombinación entre dos sitios paniculares, libera entonces las dos copias del transposón, de manera que una se mantiene en el sitio donador y otra aparece en e l sitio diana. Se requieren dos enzimas codificadas por el transposón: la transposasa reconoce los extremos del transposón y los conecta a l sitio diana, y la re·

solvasa proporciona una función de recombinación específica de sitio. El fago Mu experimenta transposición replica· tiva por el mismo mecanismo que TnA. También puede usar su intermediario cointegrado para la transposición por un mecanismo no replicativo. La diferencia entre esta reacción y la transposición no replicativa de elementos lS es que los episodios de escisión se aparecen en un orden diferente. Los rransposones mejor descritos en plantas son los elemenros de control del maíz, que se dividen en varias familias. Cada familia contiene un solo tipo de elemento autónomo que es análogo de los tramposones bacterianos en su capacidad de movj . 1ización. Una familia también contien e muchos elementos no autónomos diferentes que provienen de mutaciones (por lo general deleciones del elemento autónomo}. Los elementos no au tónomos carecen de la capacidad de tra nsposición, pero muestran actividad de transposición y otras habilidades de l elemento autónomo cuando está presente uno para proporcionar las fundone5 necesarias de acción en configuración rrans. Además de las consecuencias directas de inserción y escisión. es posible que los elementos del maíz también controlen las anividades de los genes en o cerca de los sitios donde se inserran; este control puede estar sujetO a la regulación del desarrollo. Los elementos del mafz insertados en genes pudiesen extirparse de los productos de [ranscripción, lo que explica porqué no tan sólo impiden la actividad génica. El control de la expresión del gen diana comprende una variedad de efectos moleculares, como la acrivación al ofrecer un potenciador y la supresión al interferir en los episodios posteriores a la transcripción. · La transposición de elementos del maíz (en particular Ac) no es replicariva y es probable que requiera sólo una enzima transposasa única codlOcada por el elemento. La transposición ocurre de preferencia después de la replicación del elemento. Es posible que haya mecanismos que limiten la frecuencia de la transposición. Las reestructuraciones ventajosas del genoma del maíz pudiesen haberse conectado con la presencia de Jos elementos. Los elementos P en D. melanogaster se encargan de la disgenesia híbrida, que tal vc7. sea el precursor de la especiación. Una cruza entre un macho que porta el elemento P y una hembra que carece de él genera híbridos estériles. Un elemento P tiene cuatro mél.Jcos de lectura abiertos, separados por intrones. El cene y empalme de los tres primeros ORF genera un represor de 66 kD y se presenta en rodas las células. El corte y empalme de Jos cuatro ORF para generar la transposasa de 87 kD ocmre 21.16 Resumen

547

sólo en la línea germinal por un episodio de corte y e mpalme espedfico de tejido. Los elementos P se desplazan cu ando están expuestos al citoplasma que carece del represor. El brote de S\t cesos de transposición desactiva al genoma mectiante inserciones aleatorias. Sólo un elemento P completo puede generar la transposasa, pero la enzima puede m ovilizar los ele m en tos defectuosos en confi guración crm15.

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Los elementos de control forman familias de transposones

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m

Los elementos P se activan en la linea germinal

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Referencias

549

Retrovirus y retroposones ESQUEMA DEL CAPÍTULO ftD

Introducción El ciclo vital de los retrovirus comprende sucesos similares a la transposición

• Se pierden dos pares de bases de DNA de cada extre la secuencia retrovíñca durante la reacción de ínteg ~

• Un retrovirus tiene dos copias de su genoma de RNA de cadena unica Un provírus integrado es una secuencia de ONA de cadena doble. Un rettowus genera un provirus mediante transcripción mversa del genoma retrov'írico.

• los retrovirus en proceso de transformación se gene un suceso de recombinación donde una secuencia d• celul•r sustituye a una parte del RNA retioVfrico.

Los genes retroviricos codifican poliproteínas

Los transposones Ty tienen una organización s1milat los retrovirus endógenos. • los tJansposone.s Ty son retJoposone.s con activid.ld transcoiptasa 1nversa que realizan transposición a tr un intermediario de RNA.

Los elementos Ty de las levaduras se asemej los retrovirus

• Un retrovuus caractenstico tiene tres genes: gag, poi y env. Las proteínas Gag y Pol se traducen a partir de un producto dt' transcnpción de longitud comple.ta del genoma. • La traduccion de Pol requiere un cambio de ma1co por el ribosoma. fnv se traduce a partir de un RNAm individual que se gener.1 por fragmentación. • Cada uno de los tres productos proteínicos es procesado por proteasas para dar ongen a múltiples proteinas.

Muchos elementos susceptibles de transposi residen en Drosophila melanogaster

• Cop1o es un retioposón abundante en D. melonogasl

Los retro posones son de tres clases

El DNA vírico se genera por transcripción inversa Se repite una secuencia corta (R} en cada extremo del RNA v!rico. de manera que los ewemos 5' y 3' corresponden a R·U5 y U3-R, respecti~~ameme. La transcriptasa inversa inicia la síntesis cuando ur1 RNAt cebador se une a Ll11 sitio distante de 100 a 200 bases del extremo 5'. Cuando la enzima alcanza el extremo, las bases 5' terminales del RNA se fragmentan. lo que expone el exLremo 3' del producto ONA. • Los pares de bases expuestos del extremo 3' se aparean con el extremo 3' de otro genoma de RNA. • La slntesis continúa y genera un producto donde las regiones 5' y 3' se repiten. lo que da a cada extremo la estructura U3-R-U5. Ocurren episodios Similares de cambio de cadenas cuando la uanscriptasa inversa utiliza el producto ONA oara generar una caoena complementaria. • El cambio de cadenas es un ejemplo del mecamsmo de selección de copias de la recombinación.

• Los retJoposones de la superfamilia vírica son transt que se desplazan a través de un RNA que no c:onstit partfcula intecciosa. Algunos retroposones se asemejan de manera direcl retrovirus en su uso de LTR, en tanto otros no tiene • Se pueden encontrar otros elementos que fueron ge por un episodio de transposic1ón mediada por RNA. por si mismos no codifican enzimas que puedan cat transposición. • los trilnsposones y retroposones constituyen cas1 la del genoma humano,

fml!]

• la orgamzati6n del DNA provi"ñc:o en un cromosoma es la misma oue en un tiansoosón, donde el proVlrus es flanqueado por repeticiones directas cortas de una secuencia en el mio diana. • El ONA hneal se 1nserta en forma directa en el cromosoma del hospeoador gracias a la acción de la enzima ínteg1asa retrov1rica.

La familia Alu tiene muchos miembros muy dispersos

• Una parte importante del ONA repetitivo en genom¡ mamlfero está constituida por repeticiones de una s fam1ha organizadas como tiansposones y deri~~adas produ"os de transcnpción de la polimerasa 111 de F

Los seudogenes procesados se originaron co sustratos para la transposición · Un seudogén procesaoo se derilfil de una secnpdon inversa.

fl:lll El ONA virico se integra al cromosoma

550

Los retrovirus pueden hacer transducción de secuencias celulares

f!1B

Las UNES utilizan una endonucleasa para 91 un extremo con actividad cebadora

• Las UNES no tienen lTR y para rebar la transcnpcié inversa reQulrren que el retioposón codifique una endonucleasa Que genere una hendidura,

Resumen

Introducción ~

transposición que comprende un intermediario Jbligatorío de RNA es una prop1edad excluSlva de .as eucariotao; y prov1ene de la capacidad de los retroviru de msenar copia!; de Di'iA (provirus) de ..m genoma vírico RNA en lus cromosomas de una .:élula hospedadora Algunoc; transposones eucarióticos se relacionan con pro"i ru~ retrovmcos en su Jrgaruzaaón general ) experimentan transposidón a través de mtcrmedtanos de Ri'IA. Como clase. es~os elementos se llaman retroposones (o a veces retrot rans posones ). Los retroposones más sencillos no tienen actividad de t ransposición. pero presentan seruendas que los eleme nt o~ activos r<>cr>nocen como sustraros para 1.:1 mmspos ici6 n . Por lo ranro, los elementos que usa n unn transposición independiente de RNA van desde los retrovirus mism<">S (que tienen capa ddad para infectar con libertad células hospedadoras), hasta secu~ncia s con transposición a rravés de RNA, y hasta aquellos que por sí mismos no tienen 1a capac1dad de transposición. Comparten con wdos aOS tra nc;posone~; la caracterí\IÍCa dtagnÓStica de generar repeticiones canas direcras de 01\ A diana en el sirio de una anst:rción Incluso en gcnomas donde no se hao detecta Jo loe; tran..posonc) activos c;e encuentran vestigios :fe episodios anuguos de transpoc;ición en forma de ~epeticione~ d1ana dtrectas que flanquean seruendas repeuúvas dispersas. las caraaerísucas de estas secucndas a vccec; com prenden una secuencta de RNA como progénitora de la secuencia geonómica DNAJ, lo q ue su~tcre q ue el RNA debe haberse convenido en una copic1 ele ONA dúplex que se insertó en el gt:noma r or un suceso
Como cualq tt ier ot n¡ ciclo de reproducción, el le un rctrovirus o renoposón es contin uo; es arbi:rario considera r como ''inic1o" el punLO donde se jnrerrumpe. No obc.télnte, la manera de ver estos elemen1os es parcial. por la fo rma en que sueJen 'lbseJVarse ( ) Los retrovirus se conc;ideraron primero parú·utas vírica~ infecciosas capaces de realizar rrans;nistón emre celulas y por ello se l.TCe que el ddo illtracelular (qut comprende un DKA dúplex) es un medio de reproducción de 'irus RNA. Los re•roposones se descubneron como componeores del genoma, y la<; formas de RNA se han definido en su mayor parte por sus funCiones como RNAm. Así. .os a111ores consideran a los rerroposones como secuencias gcnómicas (d t DNA duplt!x) que pueden realizar tran~ostción dentro de un genoma; no migran enrrc célula\.

El ciclo vital de los retrovirus comprende sucesos similares a la transposición Conceptos principales • Un retrovirus tiene dos copias de so genoma de RNA de cadena única . Un provirus tntttgrado es una secuencia de ONA de cadena doble. Uo retrovirus genera un provuus mediante transcripció~ inversa del genoma retrovirico.

Los rerroviru!-1 tienen Kenomas de RNA de cadena única que se replica n gracia~ a ~tn tmcrmediario de DNA de doble cadena. El ciclo vital de u n virus comprende una etapa obJJga10rla e n la que se insena DNA de doble cadena en rl genomrt del hospedador por un episodio simtiJr a la transposición y que genera repeticiones directa~ tortas de DNA diana. La lmponancia de ~' ta reacción l'ebasa la perpetuación del 'irui>. Algunas de su~ consecuendas son que: • Una 'ecuencia r~trovirica m1egrada en la línea germmauva se mantkne dentro del genoma celular como p rovirus endógeno. A1 1gual que un bactenn!ago líl>ogén ico, un prov1rus actúa t.Omo pane del material genéuco dell1rganismo.

. . .a· ••• •••••••••••• ••• · · · ~ · · ·· ···· ·· ······· ··

y

. Provfrus : ~) ¡

'..• INTRACELULAR EXTRACELULAR

Relrowus -

•

ANA

•

ANA

., ...... ... ...... ..·.

t

..• .... •..... .•....

En los ciclos reproductivos de los retrovirus y Los retroposones se alterna la transcripción inversa de RNA a ONA con la transcripción de ONA a RNA. Sólo los retrovirus pueden generar particulas infectantes. Los retroposones se confinan a un ciclo intracelular.

22 .2 El ciclo vital de los retrovirus comprende sucesos similares a la transposición

..,_ 5 .:•

vv

RNA VV

1}ranscñpción + mversa LTR

DNA lineal

LTR

fiVlV:Vl\li\/i\/im

~ Integración Provirus'-

RNA VV

vv

El ciclo vital retrovírico procede por transcripción inversa del genoma del RNA en DNA dú plex, que se inserta en el genoma del hospedador para ser transcrito en RNA.

•

En ocasiones se recombinan secuencias celu lares con la secuencia rerrovírka y des pués se transportan jumas; estas secuencias pueden insertarse en el genoma como secuencias dúplex en nuevas localizaciones. • Las secuencias celulares que experimenlan transposición por un retrovirus pueden cambiar las propiedades de una célula cuando se infecta con el virus. Las particularidades del ciclo de vida de los retrovirus se ilustran en la _Los pasos o·uciales son que el RNA vírico se convierte en DNA. el DN'A se integra al genoma del hospedador. y después, el provirus de DNA de Lrans<.:ribe en .RNA. La enzima encargada de generar la copia inicial de DNA a partir del RNA es la transcriptasa inversa . La enzima conviene el RNA en una cadena dúplex lineal de DNA en el cíLOplasma de la célula infectada. El DNA también se convierte en formas circulares, pero éstas no paJecen iuvol ucradas en la replicación. El DNA lineal se abre camino hacia el núcleo. Una o más copias de DNA se integran al genoma del hospedador. Una sola enzima, llamada integrasa , se encarga de la integración. El provjms es Lranscrito por la maquinaria del hospedador para produdr RNA vírico. que sirve como RNAm y como genomas para empaquetamiento dentro de viriones. La integración es una parte normal del ciclo vital. indispensable para la transcripdón. Dos copias del genoma RNA se empaquetan en cada v irión, lo que hace a la panícula vírica individual eficazmeme diploide. Cuando una célula es infectada de manera simultánea por dos virus dife -

CAPÍTULO 22 Retrovirus y retro posones

1DJ Los genes retrovíricos codifican poli proteínas Conceptos principales

¡

Transcrlpción

552

remes. pero relacionados. es posible que genere pa tículas víricas heterocigotas que portan un genor: de cada tipo. La díploidia puede ser importante par_ permiúr al virus adquirir secuencias celulares. La enzimas r.ranscriptaSCl. inversa e integrasa se tran~­ portan con el genoma dentro de la panícula vúic.:

• Un retrovirus característico tiene tres genes: gag. pal ~

env. • Las proteínas Gag y Pol se traducen a partir de un producto de transcripción de longitud completa del genoma. • La traducción de Pol requiere un cambio de marco por el ribosoma. • Env se traduce a partir de un RNAm individual que se genera por fragmentación . • Cada uno de los tres productos proteínicos es procesado por pro te asas para dar origen a proteínas múltiples.

Una secuencia retro vírica usual contiene tres o cuatro "genes". (En este contexto e l término genes se usa para identificar regiones codificames, cada um de las cuales en realidad da origen a múltiples prc•· reí nas por reacciones de procesamíemo.) Un genema relrovírico habitual con tres genes se organiu en la secuencia gag-pol-env. como se indica en le El RNA.m tetrovírico Liene una estructura cor>· vencional; presenta una c ubierta en el extremo S'~ está po liadenilado en el ext remo 3'- Se represente: en dos RNA.m. Se [!·aduce la longitud total de RNAP" para dar lugar a las poliproteínas Gag y Pol. El pr~>­ ducto Gag se traduce mediante la Jectma desde e codón de iniciación hasta el primer codón de ter~ ml.nación. Este último debe ser pasado por aJto par.: que Poi se exprese. Diferentes virus util izan mecanismos diverso5 para avanzar y dejar atrás a l codón de terminaciór gag. conforme a la relación entre los marcos de lcaura gag y poi. Cuando gag y poi se continúan, J¿ supresión por un glutamil-RNAt que reconoce e codón de terminación permite la geneTación de una sola proteína. Cuando gag y poi están en diferentes marcos de lectura. tiene lugar un cambio de marc() ribosómico que genera una sola protefna. Por lo general, la lectura completa es -5% eficaz, de manerc que la proteína Gag supera por casi 20 tantos a lé proteína Gag-Poi.

.

' .

~...:

10-80

¡o-

1

,. U5

100

Genoma vírico

gag

':imt:=

-2000

-1800

Traducción

¡

Procesamlento ~

El empalme produce ANA subgenómico

Traducción !

~

Supresión o cambio de marco en el extremo de gag

Procesamiento!

Cada gen genera varios productos protefnicos

Procesamiento

¡

Gag MA =matriz (entre la nucteocáps1de y la envoltura vírica) CA =- cápside (principal componente estructural) NC = nucleocápsíde (que empaqueta el dímero de ANA) PR =- proteasa (escinde Gag-Poi y Env) Poi AT = transcriptasa inversa (sintetiza DNA) IN-= integrasa (integra el provirus DNA al genoma) ~v SU= proteína de superticie (las espigas sobre el vfrión interactúan con el hospedador) TM =transmembrana (media la fusión virus-hospedador)

los genes de los retrovirus se expresan como poliproteínas, que son procesadas hacia productos individuales.

La poliproteína Env se expresa por orros medios: el empalme genera un mensajero s~cbgenómico, más corto, que se traduce en el producto Env. El gen gag da origen a los componentes proteínicos del centro nudeoproteú1ico del virión. El gen poi codifica funciones encargadas de la síntesis y recombinación de ácidos nudeicos. El gen env codifica componentes de la envoltura de la partícula, que también secuestra componentes de la membrana citop.lásrnica de la célula. Los productos Gag, Gag-Poi y Env son poliproteínas fragmentada'> por una proteasa para liberar las proteínas individuales que se encuentran en los viriones maduros. La actividad de proteasa es codificada por el virus en diversas formas: puede ser parte de Gag o Pol y a veces adquiere la forma de un marco de lectura independiente adidonaJ. La producción de una panícula retrovírica comprende el empaquetamiento del RNA en el centro, su rodeo por proteínas de la cápside y la extracción por presión de un segmento de membrana de la se muestra célula del hospedador. En la la liberación de partículas infecciosas por ese medio. El proceso se revierte durante la infección: un virus infecta una nueva célula al fusionarse con su membrana plasmática y luego liberar el contenido del virión .

Los retrovirus (VIH) experimentan gemación desde la membrana plasmática de una célula infectada. Fotos por cortesía de Matthew A. Gonda, Ph.D., Chief Executive Officer, International Medical lnnovations, 1nc.

22.3 los genes retrovíricos codifican poliproteínas

553

10-80-RUS

1-

80-100

gag

poi

- 2000

-2900

.,. -1800

U3 R-1Q-80 1

17Q-1260

Forma lineal del DNA v/rico U3 RUS

, -.

gag

U3 RUS

pe/

LTR 25Q-1400 bp

LTR

Fom'la de DNA vfrico integrado U3 ha perdido 2 bp

US ha perdido 2 bp

j_

1

~r

-¡

U3 FIU5

gag

Repetición de 4-6 bp del ONA diana

poi

::......c....:....:.:_ U3 RUS "Hospedador

r

Repelición de 4-6 bp del DNA diana

El RNA retrovírico termina en repeticiones directas (R); el DNA lineal libre termina en LTR y el provirus concluye en LTR, acortados cada uno por un par de bases.

E1J

El DNA vírico se genera por transcripción inversa

Conceptos principales " Se repite una secuencia corta (R) en cada extremo del RNA vírico, de manera que los extremos 5' y 3' sean R-US y U3-R, respectivamente. • La transcriptasa inversa inicia la síntesis cuando un RNAt cebador se une a un sitio distante de 100 a 200 bases del extremo 5'. • Cuando la enzima alcanza el extremo, las bases 5' terminales del RNA se fragmenta n, lo que expone el extremo 3' del producto DNA. • Los pares de bases expuestos del extremo 3' se aparean con el extremo 3' de otro genoma de RNA. • La síntesis continúa y genera un producto donde las regiones S'y 3' se repiten. lo que da a cada extremo la estructura U3-R-U5. • Ocurren episodios similares de cambio de cadenas cuando la transcriptasa inversa utiliza el producto DNA para generar una cadena complementaria. • El cambio de cadenas es un ejemplo del mecanismo de selección de copias de la reco.mbinación.

Los re[rovirus se denominan virus de cadena positiva porque el propio RNA vírico codifica los productos proteúúcos. Como su nombre lo indka. la transcriptasa inversa se encarga de convertir el genoma (cadena RNA positiva) en una cadena complementaria de DNA que se denomina cadena de DNA 11egativa. La transqiptasa inversa también catafua etapas posLeriores de la producdón del DNA 554

CAPÍTULO 22' Retrovirus y retroposones

dúplex. Tiene una actividad de polimerasa que permite sintetizar un DNA dúplex a partir del p: dueto de transcripción inversa de una sola cad ::-na del RNA. La segunda cadena de DNA en e~ estrucrura dúplex se denomina cadena d e DI\ positiva. Como adyuvame indispensable de er. actividad, la em:ima tiene una actividad de RNAa H, que puede degradar la porción RNA del h1bñ: RNA-DNA. Todas las transcri.ptasas inversas retvíricas comparten similitudes considerables de . .:... secuencias de aminoácidos y se pueden reconoce: secuencias homólogas en algunos otros retropo~ nes. En la se comparan las estructuras _ las formas de DNA del vLrus con el RNA. El ~ vírico tiene repeticiones directas en sus extrem Esos segmentos R varían de 10 a 80 nucleótidos C' diferentes cepas de virus. la secuenáa del exlrer 5' del virus es R-U5 y la secuencia en el extremt es U3-R. Los segmentos R se usan durante la coml'f:"" sión de la forma de RNA a la de DNA para gene:-: las repeticiones directas más extensas que se obs~­ van en el DNA Hneal ( y ) -=:.. acortamiento de 2 bp en cada extremo de la foJ':T"' integrada es consecuencia del mecanismo de in[e~ dón (véase la Figura 22.9). Al igual que con oLras polimerasas de DNA. rranscriptasa inversa requiere un cebador. El ceb= dor natural es el RNAt. Hay un RNAt del hosped.:.dor. sin carga. en el virión. Se aparea una secuenc: de 18 bases en el extremo 3' del RNAt con las e rrespondientes en un sitio que se encuentra a lOC _ 200 bases de ilistancia del CX[remo 5' de una de ;: moléculas de RNA vírico. El RNAt puede tambieaparear sus bases con un sitio cercano al extreJL. 5' del otro RNA vírico, lo que ayuda a la formad de un dímero entre los RNA víricos. He aquí un dilema: la tran scripta.sa inversa iL cia l a síntesis del DNA en un sitio apenas 100 a 2C bases en sentido descendente respecto del extrert: 5'. ¿Có1no puede generarse el DNA que represenel genoma intacto de RNA? (Ésta es una valian _ extrema del problema generaJ en la replicación ~ los extremos de cualquier ácido nudeico lineal; vézse la sección 16.2, Los extremos del DNA lineal s<. un problema para la replicación .) La sú1 resis in vitro avanza hasta el llnal y genera una secuenda de DNA breve llamada DK de detención fuerte-negativo. EsLa molécula no encuen rra i11 vivo porque la símesis continúa por reacción ilustrada en la Figura 22.6. La transcriprasc inversa cambia de moldes y se lleva al DNA nacien;_ con ella a un nuevo molde. Éste es el primero .:. dos saltos entre moldes. En esta reacción, la región R en el extremo ; del mo lde de RNA es degradada por la activida_

El retrovlrus provee la cadena positiva de RNA

S' R

~A

US

El ANAl cebador hibridiza al sltro de unión sobre el ANA)? retrovlrico

5'

R

!

3'

f

3'

!

La transcriptasa inversa inicia la síntesis del DNA de cadena negativa • Cadena negativa•

ll 11 1 -

3'

r !

Las enzimas alcanzan el extremo del molde y generan un DNA fuerte de detención negativo .,_ De detención • fuerte negativo

3'

S')?

Se degrada la región terminal de la cadena de ANA Nuevo....!.. extremo

S'

'

Se sintetiza la cadena positiva de detención fuerte del DNA

3'

.~1

El DNA de cadena positiva se transfiere

S'

1 i'

rrrnrf?f ~n · m

al otro extremo de la cadena negativa

5'

1 't

l

S' 3'

t

en el segundo salto

3'

""trrri'I'IP'fPif...'i'li,.,.... , n¡ ........ ",,t

S' 3'

S'

3'

Concluye la síntesis de la cadena positlva de DNA

!

3' 3'

~

)R

7f

La transcriptasa inversa reanuda la 1 síntesis de DNA de cadena negativa+

-

Se degrada el ANA y quedan fragmentos residuales para cebar la sfntesis de DNA

S'

La región A de DNA de una sola cadena se aparea con el extremo 3' con otro ANA retrovfrico en el primer salto Apareamiento - S' 5' , .• ,, llfl~

S' 3'

[([[[[[[[[[[(tt!]L

3'

3' S'

S' Se retira el ANAt cebador

•r •rr· rJ.iii_ R

J,J§

3'

, , 3

J]ff[

Se genera la cadena DNA negativa por medio del cambio de molde durante la transcripción inversa.

de RNAasa H de la transcriptasa inversa. Su retiro permüe que la región R en el extremo 3' realice apareamiento de bases con el DNA redén sintetizado . La transcripción inversa continúa después por la región U3 hacia el cuerpo del RNA. El origen de la región R que se aparea con el DNA de detención fuerte-negativo puede estar en el extremo 3' de la misma molécula de RNA (apareamiento intrarnolecular), o el extremo 3' de una molécula diferente de RNA (apareamiento intermolecular) . Se usa el cambio a un molde diferente de RNA en la figura porque hay datos de que la secuencia del RNAt cebador no se hereda en un dclo de vida del retropos6n. (Si ocurriese apareamiento intramolecular, se esperaría que la secuencia se heredara porque ofrecería la única tuente para la secuencia de w1ión del cebador en el siguíeme ciclo. El apareamiento intermolecular permite que otro RNA retrovírico provea esta secuencia.)

nrrrmrnrrnrr

S' ...! Concluye la síntesis del DNA de cadena negativa

""tr""f"ff'ttifff .... , .,..,..~.......,.....~.,..,

3' S' . _LTA_ .

5' 3'

~

~

5' 3'

..,_ LTR---..

La síntesis de la cadena positiva de DNA requiere un segundo salto.

El resulTado del cambio y la extensión es la adición de un segmento U3 al extremo 5'. El segmento de secuencia U3-R-U5 se denomina r e p etición terminal larga (LTR) porque una serie similar de episodios añade un segmento U5 al extremo 3' y da lugar a la misma estructura de U5-R-U3. Su longitud varia de 250 a 1400 bp (véase la Figura 22.5). Ahora se necesita generar la cadena de DNA positiva y la LTR en el otro extremo. La reacción se muestra en la Figura 22.7. La transcriptasa inversa ceba la síntesis de la cadena positiva de DNA a partir de un fragmento de Rl~A que queda después de degradar la molécula o-riginal de RNA- Se genera una cadena de DNA de detención fuerte-posiúvo cuando la enzima alcanza el exrremo del molde. Este DNA se transfiere entonces al otro extremo de una cadena negativa. donde tal vez se libere gracias a una reacción de desplazamiento cuando ocurra una segunda ronda de síntesis de DNA a partir de un fragmenLo cebador en ubicación más alta (a su izquierda en la figura). Se hace uso de la región R para el apareamiento con el extremo 3' de u,na cadena de DNA negativa . Este DNA de doble cadena requiere entonces concluir ambas cadenas para generar una LTR dúplex en cada extremo. 22.4 El DNA vírico se genera por transcripción inversa

555

. La transcriptasa inversa la cadena de DNA

~

¡

.._

sinteti~a

La enzima se disocia del molde

l

5'

La enzima se une a un nuevo molde

3'

3'

~

5'

Se reinicia la transcripción inversa

~

5'

3'

La recombinación con selección oe copias tiene lugar cuando la transcriptasa inversa libera su molde y reinicia la síntesis de DNA utilizando uno nuevo. Es probable que la transferencia entre las cadenas del molde ocurran de manera directa, pero aquí se muestra en pasos independientes para ilustrar el proceso.

Cada panícula rerrovírica porta dos genomas de RNA. Esto hace posible que ocurra la recombi nación duranre un ciclo viLal vírico , En principio. esto pudiese presentarse durante la síntesis de las cadenas nega tiva, positiva. o de ambas. • El apareamientO intermolecular que se muestra en la Figura 22.6 permite que ocu rra una recombinación emre secuerKias de los dos moldes sucesivos de RNA cuando se sintetiza la cadena de DNA negativa. La recombinación retrovírica es en su mayor parte debida a la transferencia de cadenas en esa etapa. cuando se traslada la cadena naciente de DNA de un molde de RNA a otTO durame la transcripción inversa. • Se puede sintetizar DNA de cadena positi va de manera discontinua en una reacdón que comprende varias iniciaciones internas. Puede haber también transferencia de ca · denas durante esta reacción, pero es menos frecuente. La característica común de ambos episodios es que la recomblnación es consecuencia de un cambio de molde durante el acto de la súltesis de DNA. Éste es un ejemplo general de un mecanismo de la recombinación llamado selección de copia. Durante muchos años se consideró como un posible meca-

556

CAPÍTULO 22 Retrovirus y retroposones

nismo para la recombinacióo en general. Es pe probable que se emplee en sistemas celulares, pt. constituye una base común para la recombinac durante la infección por virus RNA, incluso aqu !Jos que se replican de manera exclusiva a través ~ formas RNA, como los de la poliomielitis. El cambio de cadenas ocurre con cierta frecuc cia durante cada cido de transcripción inversa. _ deciJ:. además de la reacdón de transferencia q u es forzada en el fmal de la cadena del molde .= principio se ilustra en la . si bien no sabe mucho del mecanismo. Ocurre transcri.pcit:>inversa ú1 vivo en 1111 complejo de ribonudeoprotenas, donde la cadena molde de RNA se une a coz-ponentes del virión, incluida la prin.cipal p roteírde la cápside. En el caso del vrn. la adición de es-...: proteína (NCp7) a un sistema in vitro causa recomb-nación . El efecw es probablemente indirecto: Nc~­ afecta la estructura del molde de RNA. lo que a _ vez alLera la posibilidad de que la transcriptasa i:: versa cambie de una cadena molde a otra.

El DNA vírico se integra al cromosoma Conceptos principales • La organización del DNA provírico en un cromosoma es la misma que en un transposón, donde el provirus es flanqueado por repeticiones directas cortas de una secuencia en el sitio diana. • El DNA lineal se inserta en forma directa en el cromosoma del hospedador gracias a la acción de la enzima integrasa retrovírica. • Se pierden dos pares de bases de DNA de cada extremo de la secuencia retrovírica durante la reacción de integración.

La organizactón del proviru s mtegrado se asemeja a la del DNA lineal. Las LTR en cada extremo del provirus son idénticas. El extremo 3' de U5 consra de una repetición corta inverri.da con relaciót: al extremo 5' de U3, de manera que la LTR misma termina en repeticiones conas inverti das. EJ DNA provírico integrado es como w1 Lransposón: la secuencia provírica termina en repeticiones invenidas y ílanqueada por repeticiones cortas directas del DNA diana. Se genera el provirus cuando se insena de manera directa un DNA lineal a un sitio diana. (Además del DNA lineal hay formas circulares de las secuencias víricas.) Una tiene dos secuendas LTR adyacentes generadas por la unión de los extremos lineales. La otra tiene sólo una LTR, a l parecer generada por un episoctio de recombinación y que en realidad constituye la mayor parte de los círculos.

Durante mucho tiempo pareció que el círculo podría ser u na integración intermedia (por analogía con la integración del DNA A.; hoy se sabe que se usa la forma lineal para la u:negradóo). La integración del DNA lineal es catalizada por un produclO vírico único, la integrasa, que actúa en el DNA lineal retrovírico y el DNA diana. La reacción se Hustra en la • 1 Los extremos del DNA virico son importantes. Por ejemplo, las mutadones en los exr.remos de los rraosposones impiden la integración. La ca.racterísli ca más conservada es la presencia de una secuencia del dinucleótido CA cerca del extremo de cada re petición in venida. La integrasa une los extremos del DNA lineal en un complejo ribonucleoproteínico y después convierte los extremos romos en or.ros en recesión por el retiro de bases más allá del CA que se conserva. En general esto implica la pérdida de dos bases. Se eligen sitios diana en for.tna aleatoria con respecto a la secuencia. La integ¡asa hace cortes esca lonados en un sitio diana. En el ejemplo de la Figura 22.9 los cortes están separados por 4 bp. La longitud de una repetición diana depende del virus particular; puede ser de 4, 5 o 6 bp. Al parecer se determina por la geometría de la reacción de la integrasa con el UNA diana. Los extremos 5' generados por la fragmema dón del DNA diana presentan unión covalente con !os extremos 3' en recesión del DNA vírico. En ese ;lll nto ambos cx1remos del DNA vírico se unen por una cadena al DNA d iana . La regjón de una sola cadena es reparada por enzimas de la célula del bos~ pedador, y durante esta reacción se retiran las dos !:Jases que prouuyen en cada extremo 5' del DNA ~·írico. El resultado es que el DNA vírico integrado ha perdido 2 bp en cada LTR: esto corresponde a !'a pérdida de 2 bp desde el extremo izquierdo del :13 terminal y a la pérdida de 2 pb desde el exrre;no derecho del US 3' terminal. Hay una repetición .:aracterística cona directa del DNA diana en cada extremo de un gcnoma relrovírico imegrado. El DNA vírico se integra aJ genoma del hospeda jor en sitios seleccionados en forma aleatoria. Una :élula infectada recibe de una a lO copias del pro tri~ :us. (Un virus infeccioso emra al ciroplasma, por su ~uesto, pero la forma de DNA se integra al genoma :>o el núcleo.) Los retrovirus pueden replicarse sólo en .:élulas proliferantes porque el ingreso al núcleo re~ 4uiere que la célula pase por la mitosis, cuando el _;enoma v[rico logra el acceso al marerial nuclear. La región U3 de cada LTR porta un promotOr. -=1 promotor en la LTR izquierda se encarga del inido de la transcripción del provirus. Recuérdese que :;e requiere la generación del DNA provírico para: ~bicar una secuencia de U3 en la LTR izquierda;

1. La integrasa_genera dos e)(tremos 3' oon retraso de dos bases en ~TR LTR LTR

2.la lntegrasa genera exVemos escalonados en el DNA d!ana

IUHIITlDflL

• Jm: 5'

5'

3'

3'

3. La integrasa vlncula los extremos 3' con retraso de l TR a los extremos 5' escalonados de la diana

la integrasa es la única proteína vírica necesaria para la reacción de integración, donde cada LTR pierde 2. bp y se inserta entre repeticiones de 4 bp del DNA diana.

por lo lanto, se observa que el promotor es, de he cho, generado por la conversión del RNA en DNA dúplex. A veces (tal vez con muy poca frecuencia). el promotor en la LTR derecha facilita la transcripción de las secuencias del hospedador cercanas al ciclo de integración, La LTR también lleva un reforzador (una secuencia que activa a los promotores vednos), que -puede actuar sobre las secuendas celular y vírica. Ta l vez a la integración de un retrov1rus se deba que una célula hospedadora pase a un estado t umorigénico cuando se activan cienos tipos de genes en esta forma. ¿Se pueden escindir del genoma los provirus integrados? Podría ocurrir recombinación homóloga enrre las LTR de un provirus; hay LTR solitarias presemes en algunos genomas celulares que podrían constituir vestigios de un episodio de escisión . Hasta ahora se han analizado los retrovirus en términos del ciclo iniectame, donde se necesita integración para la producción de más copias defu'IA. No obstante, cuando un DNA vírico se integra a la línea germinativa se convierte en un ''provirus endógeno~ originado en el organismo. Los virus endógenos por lo general no se expresan, pero en ocasiones son activados por episodios extemos, como una infección con otro virus. 22.5 Et DNA vírico se integra al cromosoma

557

Los retrovirus pueden hacer transducción de secuencias celulares Concepto principal • Los retrovirus transformant.es se generan por un episodio de recombinación donde una secuencia de RNA celular sustituye parte del RNA retrovírico.

Una informaci ón interesante acerca del ciclo vital vírico surge de la aparición de virus de transducción, que son variantes que han adquirido secuen-

VIrus defectuoso RUS

,gag

í!'J6iit"'

Virus auxiliar RU5 gag

-~ p~ oj~~ ::1ái~-~WJ=~ U3 "" R

Las proteínas del virus auxiliar ~pueden logra!" • • • la replicación del virus defectuoso Los virus en transformación con replicación defectuosa presentan sustitución de una secuencia celular por una parte de \a secuencia vírica. El virus defectuoso puede replicarse con la ayuda de un virus auxiliar que realiza las fu nciones naturales.

DELECIÓN

1 Transcripción de 't otro provlrus

Transcripción a parlir dell provirus con delec!On t

JEmpalme

/ Ernpaquetado en el virión

Recombinaclón del RNA ~

l

==============~m

Se pueden generar genes cor1 replicación defectuosa mediante la integración y deleción de un genoma vírico para obtener un producto de transcripción celular-vírica unido, que se empaqueta con un genoma normal de RNA. Se necesita recombinación no homóloga para generar el genoma de transformación con replicación defectuosa. 558

CAPÍTULO 22 Retrovirus y retroposones

cias celulares en la forma ilustrada en la 1 . Parte de la secuencia vírica ha sido suslituk. por el gen v-o11c. La sínrésis de proteínas genera ~ Gag-v-Onc en lugar de las proteínas usuales Ga,. Pol y Env. El virus resultante presenta un defec to de la replicación; no puede mantener un d e lnfectanrt por sí mismo. Sin embargo, pu ede pe--peruarse en compañía de un v irus au x iliar, qv proporciona las funciones víricas fa lta ntes. Las siglas Onc constituyen una abreviatura oncogénesis, la capacidad de transformar célul? cu ltivadas de manera que se liberen de la regulaci hahitu al del crecimiento y sea posible su divisit irresrricta. Los genes onc vírico y celular pueden s~ causa de la aparición de células tumorigén icas. Un gen v-onc confiere a un virus la capacidad _ transformar un cieno úpo de célula hospedado:-:: Los locl con secuencias homólogas que se cncue;tran en el genoma del hospedador corresponder genes c-onc. ¿Cómo adquieren los retrovirus gen'= o11c? Una característica reveladora es la discrepa- cía en las esrructuras de los genes c-onc y v-onc. L genes c-onc por lo general son imerrumpidos por :-· trones, en tamo los v-onc no son imerru1npidos. Essugiere que los genes v-onc se originan de copias _ los genes c-onc empalmadas al RNA. se jJustra un modelo para _ En la formación de los v.irus en transformación. Un re rrovüus presenta lntegradón cerca de un gen c-e·· Tiene lugar una deleción que o rigina fusión del p:- virus al gen c·onc; la transcripción genera entone: un RNA unido que contiene secuencias vírícas e un extremo y secuencias celulares onc en el ot: El empalme retira los i.ntrones de las partes ví.r..... y celular del RNA. El RNA tiene las se•1ales apr piadas para el empaquetamiento den tro del virifse generarán viriones si la céluta también contie::. otr¡¡ copia intacta del provirus. En este punto, a~~ de las panícu las víricas djpJoides puede contener ._ RNA fusionado y un RNA vírico. Una recombinación entre estas secuencias dría generar el genoma de transformación, don hay repeticion es víricas en ambos exn·emos. (Oc~ rre con frecuencia alta la recomblnación por '"rios medios durante el dclo infeCLame retrovíri:No se sabe nada acerca de sus requerimientOs homología en los sustratOs, pero se supone que reacción no homó loga entre un genoma víricc la parte celular del RNA fusionado procede por . mismos mecan ismos que se encargan de la reco:-bínadón vírica.) Las características comu n es de todas las d as-de reLrovirus sugieren que pueden derivarse de _ ancestro único. Los elementos de las secuencias inserción (1$) primordiales podrían haber rodea._ a un gen de polimeJ·asa de ácido nucleico del hl

v

pcdador; la unidad resu ltantt' tendría la iorma de LTR-poi-LTR. que pudiese ~:volucionar hada un viws infecrame por la adquisición de habihdades más compleja~ para manipulat su~.tratos tanto de DNA como de RNA, inchuda la incorporación de genes cuyos productos pcrmill<.'ran d empaquetamiento del RNA. Otras funCiones, como la transformaCión de genes. podnan mcorporarse despues. (Ko hay motivo para suponer que el mecanismo mvoluaado en la adqutsición de hmcione~ celulares sea exclusivo de los genes om. no obstante, es posible que los virus que punan t'l>lO~ genes tengan una ventaja selectiva debido a '>ll efeuo e\lirnulador del crecimiento celular.)

Los elementos Ty de las levaduras se asemejan a los retrovi rus

~¡¡~...,.--tyA

tyB

- - - ANA de 57 kD ---~ - --ANA de 5O k.b-..

Protetna TyA

Cambio de marco 1

Protefna TyA-B

Lo$ elementos Ty terminan en repeticiones direct¡¡s cort~s y se transcriben en dos RNA superpuestos. Tienen dos marcos de lectura con secuencias ri!lacionadas con los genes retrovlricos gng y pol.

Conceptos principales Los transposones Ty tienen una organización similar a la de los retrovirus endógenos. Los uansposones Ty son retroposones con actividad de transcriptasa inversc1 que realizan transposición a traves de un intermediario de RNA

Los elementos Ty lOn<.tituyen una familia de secuenctas repcuuvas di!.pcrsa:, de DNA que se encuenuan en sitios diversos de cepas disímiles de levadura'>. Las siglas 1)• corresponden a una abreviatura de ..transposones de l~vadurah (del inglés, cransposon ytast, Ty). Un cptsodio de. transposición da origen a un vestigu> lclract~ríslico: 5 bp del DNA diana se repiten a cilda lado del elemento Ty in senado. Los elemento¡, Ty son r e troposones que rca li ~an la transposicí6n po r el mlsmo mecanismo que los retrovlrus. La frecuencia de la t ronsposición 1)1 es menor que la de gran pa n e de los tre~nsposones bacteria nos. - l0"7 1o-s. Hay mucha divergencia en1re Jos distinros elementos Ty. Casi todos entran en una de do!> clases principales llamadas TyJ y T'y917" Tienen la misma organización general ilu!>trada en la Cada clem<'nlo tiene 6. 3 ktl de longllud: los úlrimos 330 bp en cada extremo con'>lltuyen repeticiones dírectac; llamadas S. Cada uno de los elementos Ty de cada tipo tie-ne muchos cambto~ respecto del proEOtipo de su clase. como las sustnuoones, inserciones y drkdoncs de pates de: bases. Hay- 30 copias del tipo Tyl y -6 del tipo Ty9J 7cn un gt!noma característico de levadura Ademas, hay- LOO elementos delra indcpendknte~ llamados solo Las seruenda!. delta lclmbtén muestran mud1a heterogeneidad. ~i bien es posible que las dos repe-

o

t:.¿ •

ticiones Je un elemento mdtvldual Ty sean idénticas, o al menus con una relilcion muy cercana. Las secuendas de/m vinlUiadas con e h.-memos Ty muestran mayor consl'rvacion de secuencia., de los elementos delta solo lo que c;uwcrc que el r~conoCímtento de las repeliciones paruopa en la transposición. El elemento TY se transnibe en dos especies de Rl\A poli(A)', que constituyen >5% del RNAm total de una célula haploidc de levadura. Ambas especies lllician en el interior de un promotor en el elememo S en el extremo izquicrdu. Uno termma después de 5 kb; el orro lo hace después de 5.7 kb, dentro de la secuencia S en d exttcmo Jcrccl1o. La secuencia del dcmemo Ty úene do~ marcos de lecLUra abil!rto~ q ut se c.:xprl!san en la misma dirección, pero e;~ leen en fases Jiferemes y se su perponen por 13 arni r1oácidos. La secuencia de TyA hace pensar que codifica un¡:¡ protefna de unión al DNA. La secuencia ele TyB con tiene regiones con homologías con las sccucnctas mmscriptasa iJwersa. proteasa e imcgra!>a dl· Jos retrovirus. La organitación y la\ funciones de TyA y TyB son análogas de la (Onducta de las funuones gag y poi retrovíricac;. LO\ marco~ de lecwra 1)'A y TyB se expresan en do) forma'> La prmcma TyA representa el marco de lectura 1)•A \ u~rmtna en su extremo. Sin embargo el marw de lenura TyB SI:! expresa sólo como pane de una rrotefna de un•ón. donde la región TyA se h.tstona con la rtgion TyB gracias a un episodio especítim de cambio de marco. que permite pasar por alto el codón de terminación. (Eslo es aná logo a la Lraducción de gag-poi en los retrovirus.) La recombinadón entre elementos Ty parece ocurrir en salva~. cuando se detecta un episodio hay una mayor probabiltdad de encontrar otros. Los elementos Ty de las levaduras se asemejan a los retrovirus

559

Elemento Ty de inicio

Se marca una unidad delta Sustitución de bases

1

~

El promotor precede al elemento; se agrega el fntróñ lntrón

_L Los elementos con transposición tienen deltas notorias, sin intrón

Un elemento Ty único sometido a procesos de ingeniería para contener un intrón, experimenta transposición para formar copias que carecen del intrón. Las copias poseen repeticiones terminales idénticas, que se generan desde uno de los extremos del elemento Ty original.

Hay conversión genética eno:e elementos Ty en diferemes localizadones, con el resultado de que uno e_~ Hsustituido" por la secuencia del otro. Los elementos Ty pueden escindirse mediante rccombinación homó1oga entre las secuencias delta de repetición directa. Es posible que el gran número
o

560

CAPITULO 22 Retroviru~ y retroposones

La transposidón da como resultado la aparición múltiples copias del transposón en el genoma de levadura. pero rodas las copias carecen del intróSe conoce sólo una forma de retirar intrones· empalme de RNA, lo que hace pensar que la trar posición Líen e lugar ~por el mismo mecanismo eren tos retrovirus. El elemento Ty se transcribe a RNA que es reconocido por el aparato de desdob¿ miento. Una transcriptasa inversa reconoce e l ~-­ desdoblado y regeneta una copia de DNA dúpJe, La analogía con los retrovirus continúa toda· más. El elcmemo Ty original tiene una dij'erencde secuencia entre sus dos elementos delta. Sin e. bargo, los elementos donde ocurrió transposid p.o seen secuencias delta idénticas, que se <.lerivan ~­ delta 5' del elemento original. Si se considera a _ secuencla delta exactamente como una LTR, ccsistence en las regiones U3-R -U5, el RNA de Ty : extiende de una región R a otra. Así como se mu.,.rra para los retrovirus en las Figuras 22.3 a 22.6. regenera la LTR completa cuando se agrega un!:..=al extremo 3' y un U3 al extremo 5'. La transposición es controlada por genes de:tro del elemcn to Ty. El promotor GAL utilizado pa; _ controlar la transcripción del elemento Ty marca..; es inducible; se activa con la adición de galactosa.=-. Lnducción del L)romowr tiene dos efectos. Es nec:: sa rio activar la transposición del e lemen.to ma.rcac. y ésta también aumenta la frecuenda de transpo!>dón de los demás elementos Ty en el cromosorr... de la levadura, lo que implica que los productos d.... elemento Ty pueden actuar en conformación trr. sobre otros elementos (en realidad sobre sus RN.,l. El elelnemo Ty no da origen a partfculas uúe...ciosas, pero se acumulan partículas similares a 'li.r:.. (del inglés virus-like particles, VLP) en el interior L;: las células donde se ha induddo la tra.nsposició~ Las panículas, que se pueden observar en la -~· , contienen RNA de longitud completa, DK.:de doble cadena, activi dad de transcriptasa inve~ y un producto TyB con actividad de integrasa . E producto TyA es fragmentado como w1 precurst gag para producir las proteínas centrales madura del VLP. Esto aumenta todavía 111ás la analogía entr~ el transposón Ty y los renovirus. En resumen, eelemento Ty actúa como un rerrovirus que perd; su gen env y, por tanto, no 1mede empaqucrar bies u genoma. No rodos los elemenws Ty de cualquier genorr..: de levadura están activos: la mayor pane de ellos 1:: perdido la capacidad de transposición (y son análogos a provirus endógenos inenes}. No obstante estos elementos "muertos" conservan las repeticiones delta y, en consecuencia, proveen dianas par.= la transposidón en respuesta a las prote[oas sintetizadas por un elemento anivo,

Repeticiones directas

~ f~

~~~

Copia 20-60 copias

~

Repeticiones invertipas Repeticiones invertidas largas

~~ 0

~

.

FB

!-\~~'

-30 copias Repeticiones invertidas cortas

Los elementos Ty generan partícula~ similares a virus. Reproducida de J. Mol. Biol., vol. 292, AL-Khayat, H. A., et al., Yeast Ty retrotransposons..., pp. 65-73. Copyright 1999, con autorización de Elsevier. Foto por cortesía del Dr. Hind A. AL-Khayat, Imperial College London, United Kingdom. t

oo ~so copias Tres tipos de elementos de transposición en D.

melonogoster tienen diferentes estructuras.

Muchos elementos susceptibles de transposición residen en Drosophila melanogaster Concepto principal • Copio es un retroposón abundante en Drosophila

melanagaster.

La presencia de elememos susceptibles de transposición en D. melanogaster se dedujo por primera vez después de observaciones análogas a aquellas con que se identificaron las primeras secuencias de inserción en E. coli. Se encuentran mutaciones inestables que revierten aJ lipo silvestre por deleción, o que generan deledones del material de [os flancos con un punto terminal en el sitio de origen de la mutación. Son causadas por varios tipos de secuencias susceptibles de transposición, que se ilustran en la G . Estas secuencias incluyen a 1 retroposón copia, la familia FB y los elementos P analizados antes en la sección 21.14, Paniclpadón de los elememos suscepübles de transposición en la disgenesia de híbridos. la familia mejor descrita de retroposones es =opia . Su nombre refleja la presencia de un gran número de secuencias relacionadas muy de cerca que codifican abundantes RNAm. La familia copia -se toma como paradigma para varios otros tipos de elementos con secuencias que no tienen rela<.:íón, pero cuya estructura y conducta general parecen similares. El número de reproducciones del elemento cot>ia depende de la cepa de la mosca; por lo gen eral es de enrre 20 y 60. Los integrantes de la familia están

bastante dispersos. Las localizaciones de Jos elemencopia muestran un espectro diferente (si bien con superposición} en cada cepa de D. melanogaster. Es1as diferencias han surgido durante periodos evolutivos. Las comparaciones de cepas que han tenido divergencia en fechas recien tes (durante los Llltimos 40 años) como resultado de su propagación en el laboratorio revelan pocos cambios. No se puede calcular el ritmo del cambio, pero la natura leza de los sucesos s ubyacentes queda de manifiesto por el resultado de las célu las que crecen en cultivo. El número de elementos copia por genoma aumema de manera sustancial, hasta el niple. Los elementos adicionales representan inserdones de secuencias copia en sitios nuevos. La adaptación al cultivo en algu na forma desconocida aumenta de manera transitoria la tasa de transposición dentro de los límites de 1o- 3 a 1o-l episodios por generación. El elemento co¡n·a tiene -5 000 bp de longitud, con repet..icicmes directas terminales idémicas de 276 bp. Cada una de las repeliciones directas termina en repeticiones invertidas relacionadas. Una repetición dírecta de 5 bp de DNA diana se genera en el sitio de inserción. La divergencia entre cada uno de los integrantes deJa familia copia es pequeña, de <5%; las variantes suelen contener pequeñas deleciones. Todas estas características son comunes a otras familias similares a copia, si bien sus miembros individuales muestran mayor divergencia. la identidad de las dos repeticiones directas de cada elemento copia indica que interactúan para permitir sucesos de corrección o que ambas son generadas a partir de una de las repeticiones directas de un elemento progenitor dmante l.a transposición.

tOS

22.8 Muchos elementos susceptibles de transposición residen en Drosophilo melanogaster

561

Como en el caso similar de los elementos Ty, esto hace pensar eu una relación con los retrovin.ls. Los elementos copia en el genoma siempre es[án in tactos; no se han detectado copias individuales de las repeticiones terminales (aunque sería de esperar que se generasen sj la recombinación produjese deleción del mat.erial interj)uesto) . En ocasiones se en cuemran elementos copia en forma de DN A circuTar libre; a l igual que los círculos de DNA retrovírico, su forma más prolongada riene dos repeticiones terminales y la más cona tiene sólo una. Se han comurucado panículas que contienen RNA de copia. La secuencia copia contiene un <:oJo marco de lecLura largo de 4227 bp. Hay homologías emre panes del marco de lecwra abierta de copia y las secue ncias gag y poi de los reu-ovtrus, Es notable la ausencia de las homologias de alguna relación con secuencias retrovíricas env lnruspensable::. para la envoltura del virus, lo que significa que es poco probable que copia pueda gene(ar particulas sim ilares a virus. Los vroducws de transcripción copla se encuentran como RNAm poli(A) ~, que representa productos de transcripdón de longi tud rotal y pardal. Los RNAm tienen un extremo 5' común derivado de la iniciación a la mitad de una de las repeticiones terminales. Se producen varias proreínas, tal vez gra.das a episodios como el empalme de RNJ-\ y la fragmentación de poliproteínas. No se cuenta con p ruebas directas del modo de transposición de copia; como resultado. hay tantas similitudes con la organización rerrovírica que parece inevüable que copia tenga un origen relacionado con los retrovirus. Es difícil decir cuántas funciones retrovíricas posee copia. Se sabe, por supuesto. que efenúa transposición. pero (como en el caso de los elementos 7)!) no hay pruebas de que tenga alguna capacidad infecciosa.

fi11

Conceptos principales • Los retroposones de la superfamili a vírica son transposones que se desplazan a t ravés de un RNA que no constituye una partícula infecciosa. • Algunos retroposones se asemejan de manera directa a retrovirus en su uso de LTR, en tanto otros no tienen

LTR. • Se pueden encontrar otros element os que fueron generados por un episodio de transposición mediada por RNA. pero por si mismos no codifican enzimas quEpuedan catalizar la transposición. • Los transposones y retroposones constituyen casi la mitad del genoma humano,

Se define a los rerroposones por su uso de mecar..;; mos de rransposición que comprenden la tTanscf.:dón inversa de RNA en DNA. Se conocen ues el~ de retroposones, incluidos en la •: • Los nliembros de la superfrunilia vírica C' difican ac[ividades de rra nscriptasa invers.2 inregrasa, o ambas. Allgual que otros rerr posones. se reproducen de la misma mane ra que los retrovirus. pero difieren de el!, porque no pasan por una forma infecci o:~ independiente. Se describen mejor eo l elementos Ty y copia de levaduras y mosca.. • Las secuencias repetidas largas dispers~ (UNES) también tienen actividad de tra1: criptasa inversa (y pueden, por tanto, cor siderarse como constitutivas de m iemb: más distantes de la superfamilia vírica pero carecen de LTR y usan un mecanh m diferente al de los retrovirus para cebar _ reacdón de tra~lsa·iptasa inversa. Provi ene:. ?l~l

?"' Supertamma vlrica Tipos frecuentes Ty (S. cerevlsiae) copia (D. melanogaster)

Los retroposones son de tres clases

Superlamilia no vi rica

L1 (humano)

Sin repeticiones

SIN ES (mamiferos) Seudogenes de productos de transcripción de pol lll Sin repeticiones

7-21 bp

7-21 bp

Transcrlptasa Inversa o endonucleasa

Ninguna (o ninguna que codifique proóuctos de transposones) Sin intrones

8 1, 8210,84 (ratón)

Termlhaciones

Repeticiones terminales largas Repeticiones en 4-6 bp dianas Actividades Transcriptasa inversa, enzimálicas integrasa, o ambas Organización

-

UNES

Puede contener intrones Uno o dos ORF (retirados en el RNAm Ininterrumpidos subgenómico)

Los retroposones pueden dividirse en las superfamili as víricas, que son similares a retrovirus o UNES. y superfamilias. no víricas, que no ejercen funciones de codificación.

562

CAPÍTULO 22 Retrovirus y retroposones

nr productos de transcnpción tle la polimera~a n de RNA. Una muy escasa parte de los elememoc; en el gcnoma tient! lunCJón completa y puede clcctuar transpmictón de manera amónoma· otros presentan mutauones y por C'llo sólo pueden hacc1 trarupos1oÓn comn rec;uhado de un elemento autóní:lmO qu{' acrua en configuración lmi!S. • 1.1)., miembros de la superfam iUa no vírica -.e identifican por caraclcrisuca-. ex1~rnas e intel nas que sugieren que pruvlenen de secu~?ncias de RNA. Sm embargo en e:.tos casos sólo se puede especular acerca de como !-e generó una copia de DNA. St' c;upone que c•an diana de un ep1sodio d~: transposición por un SIStema enzimático codif1cado t'n otro ~i t io, Osea, siempre carecieron d~ clllWnomia. Se originaron en ¡.>roductos de transcripción celular. No cod ilican prmeín.H con funcio nes de tram.posición. El wmponc.!nlc más promincmc de esta familia tt:dbe el nombre úe s~cuenctas repetidas disPersa'> conas (SrNES) . Esros compon~mes 'ic..' dt·nvan Je productos de transcripaón d~ la potimcrasa 111 de RNA. La muestra la-; relaciones de orga !'Jjzacion y sccuenda de los ckmenw" que codifican a tram.criptasa inversa. Al igual que lns retrovirus, !l'> rerrn¡HlSOncs que c.ontienen LTR 'e pueden .:.la'ltficat por grupo~ de atu~rdo con d numero de 11a reos de kct ura independiente par a ~1a9 poi e zm y d orden de los genes. A pesar de esas "lpta:.a mver;a l' mtegrasa Lo!> elememos I INES dt• mamíferos .-omune' tknen dos marco<; de lectura; uno codtfica .ma prureína de unión de ácido nudeicn y la otra la lctividad de transcriptasa inversa y endonucleasa. Lo" clerm:mos que cont ienen LTR pueden va 'iar dt' retrovirus imegrados a retrnpmnnc~ qut han 1erdido la capaodad de generar partfculas mkccio·as. Lm genomas áe levadura y musca ucnen ele· 'Tlen[O!> 7y v u1pia que no pueden generar pamculas nfecCtn'>-'"· Los gcnomas de mamif~ro conuenen ·et rovirus cndogenos que, cuando l.'l>rán activos, 1ueden g~nl!rar panículas infecciosas El genoma je ratt\n tknc vario~ retrovirus entl6g<'nm aCLivos ~ue son capaces de generar pan1cula~ qu~ propagd11 oicrcitlne<; horizontales. Por comraste, ca:.i todos os rrtrovirus endógenos perdieron su acuvidad tace casi so millones de año" en ci hnajt> humano el genoma ttene hoy en su mayor pane rcsros nacttvoo, de los reuovirus endógenos. Lc"'s IJNES y SlNES constituyen una pane imlOrtante del gcnoma animal. En un pt íncipio se Jefinierou por la existencia de un \!ran número de

)ecucnocls relauvameme cortas relacionadas enrre si (constituidas por el DNA coo repet•oón moderada descritas t-n la sección 4.6, Genomas eucarióticos que contienen scctlt!ncias de DNA n.'pCtllivas y no repc ruíva~. Las LINI:S mcluyeu secuenCias oh. persas largas y las SINES, secuencias dispcr!>as tonas. (Se desc..nben como .,ecucncias dispersas o repeticiones di per a s. por su presencia comun y tliMnbución g~netalintda) Las plantas conucncn otw tipo de el~memo movil pcqueñll llamado MITE lqLit! corresponde a un elcmC?mo invertido de transposición rcperiua en muuatura). Tales elementos terminan en repeticiom·s im erudas. uenen una secuenC1a d1ana c..le 2 o 3 bp. no pr~-;entan secuencias de wdifkaciótl y tien~:n dt:' 200 a 500 bp de longitud Ha}' al menos nut::ve <.le lalC?!> familias (por ejemplo} en el genoma uel c=trrot. A menudo se encuentran en n:gioncs que ílanq Ul'tlll genes que codifican proteína:.. No rienen relaci()n con SINES o UNES. Las UNES y SINES constmryen una partt stgnificaliva del DNA rcpeutivo de los genomas arumaJes. En muchos genomas eucanoúcos elevados ocupan -sor..¡" del DNA total En la se resume la dt~tlibución de los difen:mes rlpos de lt~mspo'>ones. que ronsmuyen ca~1 la mitad del gcnorn<~ humano. Exccrro por las SIN ES, que casi siempre carecen de funciun, los otro~ tipos de elementos c~rán consritttid~'s por representantes funcionales }' otros que han -.ulrido Jcledones que eliminaron parte de los mat co' de lectura que codifican las proteínas necesal ias para la rransposición. Los porcent.ljco; relati· vos de estos tipO'> de transpo<-<'Ol'S son. en general, similares en el genoma de raton una UNFS común en gl:'noma .. dt· mamíferos se d~nomma U. El miembro usual lll'llC - 6500 Ofl y 1l'rmina en un l.egmcrno rico rn A. Los dos marcos de lecLura abierta de un elemcnw dt longitud total ~e denominan ORFI y ORrl. rt número

Ty

~TyA

l

Copla

.QRF

LTA

LTR

1

loRF1l

Homotogra con

gag

UNES

TyB

ORF2 poi

lnt

los retroposones que se relac•onan muy de cerca con los retrovirus tienen una organización similar, pero las UNES comparten sólo la act1v1dad de transcñptasa inversa. 2l .9 Los retfoposones son de lres clases

563

Elemen to

Longitud

Organización

Retrovlrus /retroposón

iiiii gag

UNES (autónomo), p. ej, L 1

ORF1

poi

~

Número

Fracción

!~U'Aifilil

1-1 1

450 000

8%

lfmil

6-8

850 000

17%

<0.3 1 500 000

15%

(poi)

SlNES (no autónomo), p. ej., Alu Transposón de DNA

(Kb) Genoma humano

Transposasa

~

2-3

300 000

3%

Cuatro tipos de elementos de transposición constituyen casi la mitad del genoma humano.

de elen1enws de longitud total suele ser pequeño (-50) y el resto de las copias son truncas. Se pueden encontrar productos de transcripción. Como lo indica su presencia en el DNA repetitivo, la familia UNES muestra variación de secuencias entre miembros individuales. Sin embargo, los imegrames de la familia dentro de una especie son relativamente hom ogéneos en comparación con la va1iación observada entre dos especies . Ll es el único miembro de la familia UNES que ha estado activo en los linajes de ratón o humano . Parece haber permanecido muy activo en el ratón. pero ha declinado en el Unaje huiuano. Sólo ha habido una SIN ES activa en el linaje hun1ano. el elemenlo común Alu. El genoma de ratón tiene una coou·apane de este elemento, B 1, y también otros SlNES (B2, ID. B4) que llan presentado actividad. El Alu humano y el SINE S B l de ratón tal vez provengan del RNA 7SL (véase la sección 22.l0, La familia Alu tiene muchos miembros muy dispersos). El otro SINE S de ratón parece haberse originado de llll producto de transcripción inversa de RNAr. Es probable que la t ransposición de SINES se deba a que un elemento activo Ll las reconoce como sustratos.

flD

La familia Alu tiene muchos miembros muy dispersos

Concepto plincipal • Una parte importante del DNA repetitivo en genomas de mamíferos consta de repeticiones de una sola familia, organizadas como transposones y derivadas de ptoductos de t ranscripción de la poli me rasa lii de RNA.

Las SINE$ más notorias incluyen miembros de una sola familia. Su breve longiwd y alto grado de repetición las hacen comparables al DNA de secuencias simples (satélite), excepto que los miembros individuales de la familia esrán dispersos en el genoma en lugar de confinados a grupos seriados. De nuevo. 564

CAPÍTULO 22 Retrovirus y retroposones

h ay similitud significativa entre los miembn una especie en comparación con la vatiación ::= especies. En elgenoma humano, una gran pat1e del!: moderadameme repetitivo se encuentra coml cuencias de -300 bp que están entremezcladas DNA no repetitivo. Al menos la müad del ma:edoble desnaturalizado es fragmentado porla en=... de restricción Alui en un solo sitio localizado 1- adelante en la secuencia. Las secuencias fragrrradas perten ecen todas a un a sola familia coor-..::. como familia Alu. de acuerdo con los mediC"S identificactón. Hay - 300 000 miembros en e· _ noma haploide (equivalentes a un miembro r · kb de DNA).las secuencias individuales Alu riel" dispersión amplia, Hay una familia de secuer..c relacionadas presenr.e en el ratón (donde los 50 miembros se denominan fam ilia B 1) en el crk = chino (donde se llama familia equ iva lente Alt.. en otros manúferos . Cada uno de los miembros de la familia .liene relación más que ser idénticos. La familia mana parece haberse 01iginado por una duplicac en serie de 130 bp con una se<.:uencia no relacioflE' de 31 bp insertados en la mitad derecha del dim .r Las dos repeticiones a veces se de nomina n "m. .: izquierda'' y "mitad derecha" de la secuencia ___ Cada integrante de la familia Alu tiene una iderdad promed.io de 87% con la secuencia de conse.La unidad de repetición B 1 de ratón tiene l3C de longitud y .correspond e a un monómero ci~ w1idad humana. Tiene homología de 70 a 80 % _ la secuencia humana. La secuencia Alu tiene relación con el RNA - ~ un componente deJa parócula de reconocimiem ~ señal (véase la secdón 1O. 9, la SRP interactúa e el recep tor SRP) . El R.NA 7SL corresponde a la rru izquierda de una secuencia Alu con una inserc en medio. Así, las 90 bases terminales 5' del ~ 7SL son homólogas con el ex tremo izquierdC' Alu. las 160 bases cenu ales del RNA 7SL no tie;;. h omología con Alu y las 40 bases terminales 3 _

RNA de 7SL son homólogas con el extremo derecho de Alu. El RNA 7SL es codificado por genes que la polimera~oa lll de RNA transcnbc de manera activa. Es posible que estos genes (u otros relacionados con ellos) den ongen a las secuencias inactivas AJu. Lo~ miembros de la familia Alu se asemejan a transposones porque están Oanqueados por repericion es directas corras. Muestran, no obstame, la curiosa característica de que las longirudes de repeticion son diferentes para cada miembro de la familia. Se derivan de productos de transcripción de la polimerasa m de R.NA y, como resultado, es posible que cada miembro porte promotores activos mternos Se ha encont1ado una divemdad de propiedades de 1<1 familiA Alu, y su ubicuidad ha originado muchos indicios respecto de su 1unci6n. No obsrante, a !m no es posible discernir su función real. Al menos algunos miembros de la familia Alu pueden transcribirse en RNA independientes. En el criceto chino algunos (aunque no todos) miembros de la familia equivalente a AJu parecen tener transcripción m I'IVO. Se encuentran unidade) de uansoipción de e~e ripo en la vecindad de otras urúdades de rrarucrtpción. Lm miembros de la familia Alu pueden incluirse dencro de unidades de transcripción de genes esrrucwrale'i, según se observa por su presencia en el RNA nuclear largo. La presencia de copias múltiples de la o;ecuencia Alu en una sola mol€cula nuclear puede generar la estructura secundaria. De hecho. la presencia de miembros de la familia AJu en forma de repeticiones invertidas se encarga de la mayor parte de la e'>trucrura secundaria que se encuentra en el RNA nuclear de los mc1mírero!>

11m

Los seudogenes procesados se originaron como sustratos para la transposición

Concepto print ipal • Un seudogén procesado proviene de una secuencia de RNAm por transcripción inversa.

Cuando una secuencia generada por transcripción mversa de un RNAm se inserta en el genorna, se puede reconocer su relación con el gen a partir del cual se tramcribió el RNAm. Tal secuencia se denomina seudogén procesado para reflejar el hecho de que se procesó a parrir del RNA y es 1nanivo. se comparan las caraCLeristicas En la esp~:cífica!- de un .seudogén procesado con las del gen original y el RNAm. La figura muestra todas las

EKon 1

Gen ¡ntetTumpiOo

ANA nuclear

lntrón

Exon 2

Exón 3

~ vvv ~

"VVVV'V"\/AAAAAAAA

RNAm

El ex11emo 5' corresponde coo el RNAm

Seudogen procesaclo

lnltón

'V:\,.f '-rvv"..../\..A..~r

J.

El extremo 3' hene un segmento A·T

k'V\.rv\.CVJ~,

1-

Tira coohnua de t»eones --..

Repelicl6n corta d•recla del ONA diana

1

RepeltQón corta d1recta del DNA diana

Pueden surgir ~eudogenes por transcripción inversa a

partir del RNA para formar DNA dúplex, que se integran al genoma.

características diagnósticas imponames, de las que sólo algunas .,e encuentran en cualquict ejemplo individual. Cualquier producto de transcripción de la polimcrasa 11 de RNA pudiese, en principio, dar origen ., tal seudogén y hay muchos ejemplos que incluyen los seudogenec; procesados de globina, que fueron Jos primeros en descubrirse (véase la secctón 3. 11 . Los seudogenes son callejones sin salida de la evolución) El seudogtn puede iniciarse en el punto equivalente al extremo 5' del RNA, circunstanda que ~ería d<' esperar solo si el DNA se hubiese originado del RNA. Varios seudogenes constan de secuencias exónicas unidas de manera precisa: no se conocen mecanismos para rcconoce1 introncs en el DNA. por lo que esta circunstancia constitUye un argumento a favor de una etapa mediada por el RNA. El seudogén puede Lcrminar t'n un segmento corto de pares de bases A-Tal parecer derivadas de la cola poli(A) del RNA. A cada lado del seudogén hay una repetidón cona direcra que parece haberse generado por un episodio simjJar a la tramposición. Los scudogenes procesados residen en localizaciones oo relacionadas con sus ~itios de origen supuestos. Los seudogencs procesados no portan ninguna información que pudiera servir para respaldar un suceso de transposición (o llevar a cabo la transcripción inversa precedente del RNA). Esto hace pensar que el RNA era sustrato para otro sistema y codificado por un retroposón. De hecho. parece que los elementos UNES activos proveen gran parte de la actividad de rranscrtptas.1 inversa y que se encargan no sólo de su propia transposJdón, SJUO también de actuar sobre las Sl.NES y generar seudogenes procesados.

?.2.Ll Los seudogenes procesados se originaron como sustratos para la transposición

565

f!D Las LIN ES utilizan una endo nudeasa para generar un extremo con actividad cebadora

La hendidura proporciona un extremo de cebación

Concepto principal • Las LINES no tienen LTR y para cebar la transcripción inversa requieren que el retroposón codifique una endonucleasa que genere una hendidura .

Los elementos de UNES y algunos otros no terminan en las LTR características de los elementos rerrovíricús. Es ro lleva a la interrogante: ¿Cómo se ceba la transcrlpdón inversa? No comprende la reacción común donde el cebador de RNAm se aparea con el LTR (véase la Figura 22.6). Los marcos de lectura abierta en estos elementos carecen de muchas de las funciones retrovíricas, como dorrunios de pro re asa o imegrasa, pero por lo general tienen secuencias similares a la transaiptasa inversa y codifican una actividad de endonucleasa. En la UNES U humana, ORFl es una proteína unida a DNA y ORF2 tiene actividades tamo de transcriptasa inversa como de endonucleasa; ambos productos son indispensables para la transposición. La muestra cómo estas actividades sostienen la transposición. Se bace una hendidura en el sirio diana del DNA por actividad de una endonucleasa codificada por el renoposón. El produc10 RNA del elememo se vincula con la proteína unida en la hendidura . La hendidura provee un extremo 3'- 0H que ceba la símesis de DNAc sobre el molde de RNA. Se requiere un segundo episodio de escisión para abrir la otra cadena de DNA. y el luorido RNA/DNAse vincula con el otro exuemo de la hendidura en esta etapa, o después de que se ha convertido en una cadena doble de DNA. Algunos intrones móvHes utilizan un mecanismo semejante (véase la Figura 27.12) . Cuando se originan elementos a partir de la LTanscripción de la polimerasa rr de RNA. las secuencias genómlcas son necesariamente inactivas: carecen del promotor que se encontraba en un sitio ascendente respecto del punto de origen inicial de transcripción. Éstos suelen poseer las características de un producto de uanscripción maduro, po·r lo que se denominan seudoge nes procesados Uno de los motivos por lo que los elememos de UNES son tan eficaces radica en su método de propagación. Cuando se traduce un RNAm de UNES, los productos proteíuicos muestran una prefereoda cis para unirse al RNAm a partir del cual se tradujeron. La muestra que el complejo de 566

CAPÍ TULO 22 Retrovirus y retroposones

-ANA

El DNAc crece a partir_.:;;"~ de3'·0H / El RNA es e l - molde

Se crea un intrón por recombinacíón La retrotransposíción de elementos diferente.i

a LTR ocurre por formación de una hendidura en la diana ceel fin de proveer un cebador para la síntesis de DNAc sobre _• molde de RNA. Las punt as de flecha indican extremos 3'.

CITOSOL

¡

Inserción de una copia de un DNA en un sitio nuevo

Se transcribe una LINES hacia un RNA que ;E traduce en proteinas que se ensamblan en un complejo c:el RNA. El complejo se transloca al núcleo, donde inserta L · :: copla de DNA en el genoma.

_#

NúCLEO

CITOSOl

Un traosposón se transcribe hacia un RNA que se desplazan de manera indepen:iente hacia el núcleo, donde aclúan sobre cualquier par de ·:peticiones invertidas con la misma secuencia que en el trans:-osón original.

;e traduce en protelnas que

-ibonucleoprotema-. se traslada entonces a l nucleo, Jonde las proteínac; imenan una copia del DNA en ~1 genoma. La transcripción inversa a menudo no wanza por completo hasta el final. de modo que la :opia es inaaiva Sin embargo, hay posibilidades de illSerdón de una cop1a activa porque las prorcínas 3ctúao sobre un producto de transcnpción del ele;neoto activo original. En contraste. lac; pwtefna" producidas por los :ransposones de DNA deben importarse al núcleo después de su síntesis en el dwplasma. pero no cuentan con métodos para distinguir emre rransposoncs de longitud completa y transposones inac!ivos con dclcción. La muestra que en ugar de distinguir estos dos tipos de transposones. las proteínas reconorerán de manera indiscriminada cualquier elemento por vin uct de la s repeticiones que marca n sus extremos. Esto disminuye mucho su posibilidad d~ actua r sobrl! un elemento de 1ongitud completa en comrapoc;idon a uno que h a re nido delcción. u consecuencia es que los elementos inactivo~ se acumulan }', en un momento dado, la familia desaparece porque una transposasa ctene pocas posibilidades de hallar una diana que sea un rransposón por completo funcionaL ¿Están ocurriendu en la actuahdad sucesos de transposición en t:MO~ genomas, o sólo se observan vestigios en sistemas antiguos? Esto varía con la especie. Hay 5olo unos cuantos transposones activos en la acwalidacl en el genoma humano pero, en contraste. se conocen varios transposoncs activos en el gcnoma de rawn. Esro explica el hecho de que las mutaoones espontán eas causadas por in serciones tle UNES se pre:.cman con una tasa de

-3% en eJ ratón, pero de ~ólo 0. 1% en el hombre. Parece haber de - 1O a 50 elementos activos de UNES en el genoma humano. Se pueden señalar algunas enfermedadeo; hllmanas como resultado de la rransposidón de U a los genes y otras den vadas de episodios no e
Resumen La transcnpción inversa es el mecanismo unificador de la reproducCión de retrovirus y perpetuadón de retroposones. El CiclO de cada ttpo de elemento es en principio similar, aunque l o!~ retrovirus sueJen considerarse desde la perspectiva de la forma vírica libre (RNAm). en tanto los rctroposones se consideran desde el p11nto dC' vista de la forma genómica

(DNA doble). Los rcuovirus ~len en genomas de RNA de cadena única que se replican mediante un intermediario de DNA de dobl.c cadeJ1<J. Un rctro virus individual contiene dos copias de su genoma. El gen oma con tiene los genes gag. poi y env que se traducen en poliprOLcínas. cada una de ellas tragrn~ntada en proteínas Iuncionales más pequeñas. Los componente!> Gag y Env se encargan del t:mpaquetamiemo del RNA y la generaCión del virión; los componentes Poi participan en la síntesis de áctdo nucleicos. La transcnptasa mversa es el prin cipal componente de Poi y se encarga de la síntesis de una copia de DNA (cadena negativa) del RNA vírico (cadena positiva) El producto de ONA es más largo que el molde de RNA; medianrc el cambio de! moldes, la 1ranscriptasa inve1sa copta desde la secuencia de 3' de RNA hasta el extremo 5' del DNA y desde la secuenCia 5' del RNA hil~ta el extremo 3' del DNA, lo que genera la<:. LTR carac terísticas (repeticiones terminales largas) del DNA. Ocurre un cambio simi~l 13 Resumen

567

lar de moldes cuando se sintetiza la cadena positiva del DNA utilizando la cadena negativa como lllOlde. El .DNA doble lineal se insena en el genoma de un hospedador ~radas a la participación de la enzima integrasa. La n·auscripción del DNAimegrado desde un promotor en la LTR izquierda genera lnás copias de la secuencia de RNA. Los cambios de molde durante la síntesis de ácidos nucleicos permiten que ocurra la recombinación por selección de copias. Duranre un ddo infeccioso, un retrovirus puede intercambiar pane de su secuencia habitual por una secuencia celular. El virus resultante suele tener defectos de replica ción, pero puede perpetuarse durame la evolución de una lnfección conjunta con un vi rus auxiliar, Muchos de los v irus defectuosos han aJquirldo una versipn RNA (v-onc) de un gen celular (c-onc). La secuencia onc puede set de cualquiera de varios genes cuya expresión en la forma v-onc hace que la célula se trans-forme hacia un fenotipo tumorigénico. El episodio de in tegración genera repeticiones cliana (como transposones que se d.e~-plazan a través del DNA) . Por lo tanto, un provirus insenado posee Lerminadones directas reperidas de LTR. flanc¡ueadas por repeLiciones corras de DNAdlana. Los genomas de manúfcros y aves tienen provirus endógenos (inactivos) con dichas estructuras. Se han encontrado otros elementos con esa organización en una diversidad de genomas, de manera más notoria en S. cerevisiae y D. melanogaster. Los ele memos Ty de las levaduras y los elem.emos de copia de las moscas tie· nen secuencias de codificación con homología con la rranscriptasa inversa y se desplazan a través de una forma de RNA. Pueden generar partículas que simu lan virus pero no tienen capacidad infectante. Las secuencias LINES de los genomas de manúferos se retiran aú11 más de Los retrovirus, pero conservan diferentes similitudes que sugieren un origen común. ULilizan un tipo diferente de actividad cebadorapara iniciar la acción de la Lranscriptasa inversa, donde una actividad de endonudeasa vinculada con la Lranscriptasa jnversa forma una hendidura que provee un extremo 3'-0H para la símesis de cebación sobre un mo lde de RNA. La frecuencia de transposiciones de UNES aumenta porque sus productos pro~eúticos tienen actividad en cis; se vinculan con el RNAm del que fueron traducidas para forma r un complejo ríbonucleoproreíníco que se LransporLa al núcleo. Los miembtas de otra clase de retroposones cuentan con wdos los pun tos calientes de la Lransposición a través de RNA. pero no Lienen secuencias de codificación (o al menos ninguna que simule funciones retrov(rícas). Pueden haberse oríginado como pasajeros en un episodio de transposición se568

CAPÍTULO 22 Retrovirus y retrooosones

mejame a la retrovirica, donde un RNA fue djana de una Lranscriptasa inversa. Los seudogenes procesados surgen por dichos episodios. Una familia particularmente notoria que pa rece haberse originado por un suceso de procesamiento es la familia AJu. Algunos RNAsn., incluido el RNAsn 7SL (un compo· nente de SRP) ti.enen relación con esta familia.

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l1lt

El DNA vírico es generado por transcripción inversa

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Ell

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lliJ

Los elementos Ty de las levaduras se asemejan a los retrovi'rus

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E

Las UNES utilizan una endonucleasa para generar un

extrerno con actiVIdad cebadora MtlCUlJJ rle ri!visión Ostenag. E M ano k:az.uztan. H H (200 1J Brology of mamrnalian 1.1 rctrotrJnSJ>ilSOIIS Amut Rtv. GmeL 3"5. 501-538

Artlculos de

inve~tlgaclón

Feng, Q .. MOI\Hl1 J V., I<JZ
Referencias

569

Diversidad inmtLinitaria ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción

• la segunda recombinación une V con 0-J-C. El segmento Cconsta de varios exones.

La selección clonal amplifica linfocitos que responden a antígenos individuales

La recombinación genera una gran diversidad

• Cada linfocito B expresa una sola inmunoglobulina y cada linfocito T. un solo receptor de células T. • Hay una gran variedad de inmunoglobuünas de células 8 y receptores de células T. • la unión de un antfgeno con una inmunoglobulina de células B o un receptor de células T desencadena la multiplicación clona!.

Los genes de las inmunoglobulinas se ensamblan en los linfocitos a partir de sus constituyentes • Una inmunoglobulina es un tetrámero de dos cadenas ligeras y dos pesadas. • Las cadenas ligeras pertenecen a las familias ), y K; las cadenas pesadas fo rman una sola familia. Cada cadena tiene una región terminal N variable (V) y una región terminal e constante (C). • El segmento V reconoce al antigeno y el C pro•Jee la respuesta efectora. • los segmentos V y Cson codificados separadal'11ente por segmentos de los genes V y C. • Para unir un segmento del gen V con uno del uen C, por recombinación somática se genera un código ~¡én ico de una cadena Integra de inmunoglobulina.

Las cadenas ligeras se ensamblan por recombinaci6n simple • Una cadena ligera ?, se ensambla por recombinación simple entre un gen Vy un segmento del gen J-C. • Un segmento del gen V tiene un exón líder, un íntrón y una región de codificación variable. • El segmento del gen J-C tiene un exón corto d'e codificación J, un intrón y una región de codificación C. Una cadena ligera x se ensambla por recombinación simple entre un segmento de gen Vy uno de los cinco segmentos J que preceden al gen C.

Las cadenas pesadas se ensamblan mediante dos recombinaciones • las unidades de recombinadón de cadenas pesadas son un gen V, un segmento Oy un segmento del gen J-C. • La primera recombinación une a Ocon J-C.

570

• Un locus de cadena ligera produce más de 1 000 cadenas por la combinación de 300 genes V con cuatro a cinco genes C. • Un locus H puede producir más de 4 000 cadenas por combinación de 300 genes V. 20 segmentos Oy cuatro segmentos J.

La recombinación inmunitaria utiliza dos tipos de secuencias de consenso • la secuencia de consenso utilizada para !a recombinación es un heptámero separado de un nonámero por 12 o 23 pares de bases. • La recombinación ocurre entre dos secuencias de consenso con espaciamientos diferentes.

La recombinación genera deleciones o inversiones • La recombinación se debe a roturas de la doble cadena en tos heptámeros de dos secuencias de consenso. • Los extremos seiial del fragmento entre roturas suelen unirse para generar un fragmento circular escindido. • los extremos de codificación se enlazan de manera covalente para unir V a J-C (cadena L) o O a J-C y V a 0-J-C (cadena H). • Si se invierten los genes recombinantes en lugar de unirse en orientación directa, hay una inversión y no una deleción de un circulo escindido.

La exclusión alélica es desencadenada por rearreglo productivo • La recombinación para generar un gen íntegro de inmunoglobulina es productiva si lleva a la expresión de una proteína activa. • Un rearreglo productivo impide que ocurra cualquier rearreglo adicional, a diferencia del rearreglo no productivo. • La exclusión alélica se aplica separadamente a las cadenas ligeras (sólo puede rearreg\arse de manera productiva una cadena K o A) y a las pesadas (una cadena pesada se rea~regla de manera productiva).

Las proteínas RAG catalizan la rotura y la nueva unión • Las proteínas RAG son necesarias y suficientes para la reacción de corte y empalme.

• La actividad de- glucosilasa de uracilo·ONA influye en el patrón de mutaciones somáticas. • Una hipermutación puede empezar por la acción secuencial de esas enzimas.

• La RAG1 reconoce las secuencias de consenso nonaméricas para la recombmación. la RAGl se une .a RAGl y se corta y empalma en el heptámero. la reacción se asemeja a la de resolución tipo topoisomerasa que ocurre e11 la transposición. Una de las histonas avanza a través de un intermediario en horquilla en el extremo de couificación; l~ ilbert\.11\l de la horquilla se !!f)l:arga de la inserción de bases adicionales (nucleótidos T) en el gen recombinado. • La transferasa de dexosinucleósidos inserta nucleótidos N adicionales en ~l extremo de codificación. • La secuencia del codón del sitio de la reacción de unión V·(D)J es muy variable y codifica el aminoácido 96 en el sitio de unión del antígeno. • Las roturas de la doble cadena en las uniones de codificación son reparadas por el mismo sistema involucrado en la unión de extremos no homólogos det DNA dañado. • Un reforzador del gen C activa al promotor del gen V después de que la recombinac1ón ha generado el gen íntegro de inmunoglobulina.

Las inmunoglobulinas aviarias se ensamblan a partir de seudogenes • En el pollo, un gen de inmunoglobulina se genera copiando una secuencia de uno de tos 25 seudogenes del gen V de un locus activo úmco.

La célula 8 de memoria permite una respuesta secundaria rápida • La respuesta p;maria a un ant•geno es montada por las células B. que no sobreVIven después de( período de respuesta. • Se producen células B de memoria con especificidad para el mismo antígeno, pero están inactivas. • Una reeMposición al antlgeno origina la respuesta secundaria, en la cual las células de memoria se activan rápidamente.

La expresión de la cadena pesada temprana puede cambiar por procesamiento del RNA

los receptores de las células T tienen relación

• Todos los linfocitos empiezan por sintetizar la forma de lgt~ unida a la membrana. • Un cambio en el empalme del RNA hace que sea remplazado por la forma secretada cuando la célula B se diferencia.

• Las células T usan un mecanismo similar de unión V(O)J·C a las células B para producir uno de los dos tipos de receptor de células T. • En > 95"/o de los linfocitos T se encuentra TCR a~; la lCR yó se encuentra en < 5 por ciento.

El cambio de clase es producto de la recombinación del DNA

con las inmunoglobulinas

111BiJ El receptor de

la célula T actúa con el MHC • El TCR reconoce a un péptido corto unido en un surco de una proteína del ~~~I Cen la superficie de la célula presentadora.

• Las inmunoglobulinas se dividen en cinco clases, según el tipo de región constante de la cadena pesada. • El cambio de clase para modificar la región Ck se debe a una recombinaci6n entre las regiones S que lleva a la deleción de la región entre la antigua Crl y la nueva. • Pueden presentarse múltiples recombínaciones de cambios sucesivos.

Ellocus de histocompatibitidad mayor codifica muchos genes del sistema inmunitario • Ellocus del MHC codiñca las proteínas de clases I y II, así como otras del sistema inmunitario. las proteínas de clase 1 son los antígenos de trasplante ennrgados de distingUH entre tejidos "propios" y "ajenos". • Una proteína de clase I del f\IHC actúa como heterodímero con la ~~ microglobullna. • Las proteínas de clase Il participan en las intervenciones entre células T. • Una proteína de clase U del MHC es un heterodímero de cadenas Ci 'J ~-

El cambio se debe a una nueva reacción de recombinación • Habrá un cambio por una rotura de la doble cadena seguida de la reacción de unión no homóloga de extremos. La característica importante de una regiOn de cambto son las repeticiones invertidas. • El cambio requiere de activaci611 de los promotores que están en dirección ascendente respecto de los sitios de cambio,

fiiJ!J

La inmunidad innata utiliza las vías de señal conservadas

La mutación somática genera otras diferencias en et ratón y el ser humano • Los genes activos de inmunoglobulina tienen regiones V con secuencias que cambian respecto de la línea germinativa oor mutación somática. • Las mutaciones ocurren como sustituciones de bases individuales. • Los sitios de mutación se concentran en los sitios de unión de antígeno. El proceso depende del reforzador que activa la transcripción en ellocus lg.

La inmunidad innata se desencadena por receptores que reconocen segmentos (PAMP) altamente conservados en bacterias u otros agentes infectantes • Suelen usarse receptores similares a tragarnonedas para activar la vía de respuesta • Las vías se conservan mucho de invertebrados a vertebrados y se encuentra una vía ;1náloga en las plantas.

f¡1ffil

Resumen

la desaminasa de citidina y ta glucosilasa de uracilo inducen la mutación somática • Para la mutación somática y para el cambio de clase se requiere de una desaminasa de citidina.

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

571

111

Introducción

Es un axioma de la genética que todas Las células somáticas del organismo heredan la constitución génica creada en el cigoto por la combinación de espermatozoide y oocito. Para explicar los diferentes fenotipos de células somáticas específicas se observa un comrol diferencial de la expresión génica, más que cambios en el contenido del DNA. Sin embargo, hay situaciones excepcionales en que la reorganización de ciertas secuendas de DNA regula la expresión génica o crea nuevos genes. El sistema inmunitario es un caso sorprendente y amplio en el que el contenido del genoma cambia cuando la recombinaclón origina genes activos en los linfocitos. Otros casos se debeo a la sustitución de una secuencia por otra para modificar el tipo de apareamiento de las levaduras o generar nuevos antígenos de superficie por los tripanosomas. La respuesta inmunitaria de los vertebrados proporciona un sistema de protección que disüngue las proteínas extrañas de las propias del organismo y reconoce la materia extraña (o parte) como constituyente de un antígeno. Por lo general, el antígeno es una proteína (o una molécula añadida a una

La secreción de anticuerpos por la célula 8 reQuiere de células T auxiliares

(

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D:éJ)iJ13$f

t Anticuerpos

¡

Antígeno Complejo antígeno-anticuerpo

-

El macrófago engulle al complejo

.( _ Complemento

La inmunidad humoral es confeñda por la unión de anticuetpos libres y antígenos para forma r complejos antlgeno-anticuerpo eliminados de la corriente sanguínea por los macrófagos o que son atacados directamente por las proteínas del complemento. 5 72

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

proteína) que ha ingresado a la corriente sanguínea del animal, por ejemplo, la cubierta proteínica de un virus infeccioso. La exposición a un antígeno inicia la producción de una respuesta inmunitaria, que específicameme reconoce al antígeno y lo destruye. Las reacciones inmu11itarias son tarea de los leucocitos, los linfocitos B y T y los macrófagos. Los linfocitos reciben su nombre de los tejidos que los producen. En los mamíferos, las células B maduran en la médula ósea, en tanto las células T maduran en el timo. Cada clase de linfocito utiliza el reamglo de DNA como mecanismo para producir las proteínas que le permiten participar en la tespuesta inmunitaria. El sistema inmunitario tiene muchas fo~:mas de dcstcuir a un invasor antigénico, pero conviene con$iderarlas en dos clases generales. El tipo de respuesta que monte el sistema inmunitario cuando encuentra una estructura extraña depende, en parte, de la naturaleza del antígeno. La respuesta se defu1e en función de que sea ejecutada principalmente por células B o por células T. La respuesta humoral depende de las células B y es mediada por la secreción de anticuerpos, que son proteínas inmunoglobul.ínicas. La producción de un anticuerpo específico para una molécula extraña es el suceso principal del reconocimiento de un antígeno, que implica que el anticuerpo se una a una pequeña región de la estructura en el antígeno. En la se representa la función de los anticuerpos. La materia extraña que circula en la sangre, por ejemplo, tma toxina o una bacteria patógena, tiene una superficie que presenta antigenos, los cuales son reconocidos por los anticuerpos que forman complejos antígeno-anticuerpo. Dichos complejos atraen después la atención de otros componentes del sistema inmunitario. La respuesta hummal depende de esos otros componentes en dos formas. Primero, las células B necesitan señales de las células T para secretar anticuerpos. Dichas células T se llaman células T auxiliares porque facilitan la tarea de las células B. Segundo, Ja formación del complejo antígenoanticuerpo es desencadenada por el antígeno que se va a destruir. La principal vía es la de la acción del complemento, componente cuyo nombre refleja su capacidad de constituir un "complemento" de la acdón del anticuerpo mismo. El complemento es un conjunto de casi 20 proteínas que actúa en una serie de actividades proteolíticas. Sí el antígeno blanco es parte de una célula, por ejemplo, una bacteria tnfectanre, la acción del complemento culmina con la lisis de la célula diana. la acción del complemento también constituye un medio para atraer a los macrófagos, que ingieren las células blanco o sus productos; una a lternativa es que el complejo activo

de un anticuerpo sea captado di rectamente por los macrófagos (céluléls carroñeras) y destruido. La respu esta media da por células depende de una clase de linfocitos T llamados células T citotóxicas (o células T asesinas). En la se indica la función básica de la célula T en el reconocimiento de un antígeno blanco. Por lo general, ante un parásito intracelular, como un virus que infecta las células del propio cuerpo, se produce una respuesta mediada por células. Como resultado de la infección vírica se exponen fragmentos de antígenos extraños (víricos) en la superficie de la célula. Dichos fragmentos son reconocidos por el receptor de la cé lula T (TCR ). que en la célula T es el equivalenre del anticuerpo producido por u na célula B. Una característica el a ve de esta reacción de reconocimiento es que el anLígeno cfebe ser presentado por una protefna celular integrame del MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) . Dicha proteína tiene un surco en la superficie que se une a un fragmento peptídico derivado del antígeno extraño. La combinadón del fragmento peptídico y la proteína del MHC es reconocida por el receptOr de la célula T. Todo individuo tiene un conjunto característico de proteínas del MRC imponames en las reacciones anre un injerto: el injeno de tejido de un individuo a otro es rechazado por la diferencia deJas proteínas del MHC del donador y el receptor. problema de gran intponancia médica. La necesidad de que los Unfocitos T reconozcan tamo al anúgeno extraño como a la proteína del MRC asegma que la respuesta mediada por células se produzca sólo en las células del hospedador que han sido infectadas por un antígeno extraño. (La división de las proteínas del MHC en los ripos generales de clases 1 y li se describe más ade lante. en la sección 23.20. Ellocus de h istocompatibilidad mayor codifica los mú ltiples genes del sistema inmunitario.) El propósito dr cada tipo de respuesta inmunitaria es atacar un blanco extraño, y el reconoci miento de dicho blanco es prerrogativa de las inmunoglobulinas de las células By los receptores de las células T. Un aspecto cn1cial de su función yace en la capacidad de distinguir lo "propio" de lo "ajeno". Nunca deben ser atacadas las proteínas y células del cuerpo mismo. pero los blancos ex1raños deben ser destruidos por completo. La propiedad de no atacarse "a sí mismo" se llama tolerancia, cuya pérdida produce una enf erme dad autoinmunitaria, en la que el sistema inmunitario ataca al propio cuerpo. a menudo con consecuencias desastrosas. ¿Qué impide que la reserva de linfocitOs responda ante las proteínas Hpropias"? Probablemente la tolerancia aparece muy temprano en el desarrollo

de los linfocitos, cuando se destruyen las células B y T que reconocen a los antígenos ·propios", Cenómeno conocido como d e leción clona!. Además de esa selección negativa. hay también una selecdón positiva de células T que portan ciertos conjuntos de receptores. Un corolario de la rolcrancia es que puede ser dificil obtener anticuerpos con proteínas que tengan una relación estrecha con las del propio organismo. En la práctica, por lo tanto, puede ser difícil usar (por ejemplo) ratones o conejos para obtener anticuerpos contra proteínas humanas que se han conservado bien durante la evolución de los ma míferos. La tOlerancia del ratón o el conejo ante su propia proteína podría extenderse a las proteínas humanas en tales casos. Cada uno de los tres grupos de proteínas requeridos por la respuesta inmunitaria, inmun oglobulinas, receptores de células T y proteínas del MBC, son diferentes. El análisis de un número importante de individuos permiLió encontrar muchas variantes de cada proteína. cada una de las cuales es codificada por una gran familia de genes; en el caso de losanticuerpos y los receptores de células T. la diversidad

La célula blanco infectada

~el antígeno

. ... >fJ '

l

o

Célula T asesina

f¡

El MHC "presenta" el anlfgeno al receptor de la célula T

1

o

~ Célula T asesina

~

El linfocito T reconoce al fragmento antigén¡co + MHC

En la inmunidad mediada por células, las células T asesinas utilizan el receptor de células T para reconocer un fragmento del antígeno extraño que la proteína del MHC presenta en la superficie de la célula blanco. 2.3 .l Introducción

5 73

de las poblaciones aumenta por rearreglos del DNA en los linfoci tos importantes. Las inmunoglobulinas y los receptores de las células T son contrapartes directas, cada una producida por su p ropio tipo de linfocito. La estructura de las proteínas está relacionada, y sus genes se relacionan en cuanto a organización; el origen de dichas variaciones es similar. Las proteínas del MHC comparten también algunas características comunes con los anticuerpos, igual que otras proteínas específicas de linfocitos. Así pues, al abordar la organización génica del sistema inmunitario se enfrenta una serie de familias de genes relacionados, de hecho una superfamilia que podría haber evolucionado a partir de un ancestro común que representa una respuesta inmunitaria primitiva .

reconoce al antígeno

1

t

Expansión clonal

La reserva de linfocitos inmaduros contiene células B y T que forman anticuerpos y receptores con diversas específicídades. Su reacción con un antígeno lleva a La expansión clonal del linfocito con el anticuerpo (célula B) o el receptor (célula T) que puede reconocer al antígeno. 57 4

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

La selección don al amplifica linfocitos que responden a antígenos individuales Conceptos principales • Cada linfocito B expresa una sola inmunoglobulina y cada linfocito T, un solo receptor de células T. • Hay una gran variedad de inmunoglobulinas de células B y receptores de células T. • La unión de un antígeno con una inmunoglobulina de células B o un receptor de células T desencadena la multiplicación clona!.

El nombre de la respuesta inmunitaria describe una de sus características medulares. Después de que un organismo se ha expuesto a un antígeno, se vuelve inmune a los efectos de una nueva infección. Antes de exponerse a un antígeno en panicular, el organismo carece de la capacidad para enfrentar cualesquiera de sus efectos tóxicos, la cual adquirirá durante la respuesta inmunitaria. Una vez eliminada la infección, el organismo conserva la capacidad de responder rápidamente en caso de reinfección. Esas características se ajustan a la teoría de la selección clona! ilustrada en la . La reserva de linfocitos contiene células B y T que portan una gran variedad de inmunoglobulinas o receptores de células T. Cualquier linj(lcito B individual produce una inmunoglobulina susceptible de reconocer sólo un antígeno, igual que un linfocito T individual produce sólo un recepror particular de células T. En la reserva de linfocitos inmadu ros, las células B y T no estimuladas son morfo lógicamente indistinguibles, pero ante la exposición a un antígeno, una célula B cuyo anticuerpo puede unirse al antígeno, o u na célula T cuyo receptor puede reconocerlo, se estimula para dividirse. tal vez por alguna retroalimentación desde la superficie, donde ocurre la reacción anticuerpo/receptor-antígeno. Las células estimuladas se desarrollan entonces hacia linfocitos B o T maduros, lo cual incluye cambios morfológicos que involucran, por ejemplo, un aumento de tamaño (especialmente pronunciado en las células B). La expansión inicial de una población específica de células B o T ante la primera exposición a unantígeno se llama respuesta inmunitaria primaria, la cual da lugar a la producción de un gran número de linfocitos B o T con especificidad para el antígeno blanco. Cada población representa un don de la célula de respuesta original. Las células B secretan anticuerpos en grandes cantidades, e incluso podrían dominar a la población de an Licuerpos.

de las poblaciones aumenta por rearreglos del DNA en los linfocitos importantes. Las inmunoglobulinas y los receptores de las células T son contrapartes directas, cada una producida por su propio tipo de linfocito. La estructura de las proteínas está relacionada, y sus genes se re lacionan en cuanto a organización; el origen de dichas variadones es similar. Las proteínas del MHC comparten también algunas características comunes con los anticuerpos, igual que otras proteínas e~pecíficas de linfocitOs. Así pues, al abordar la organización génica del sistema inmunitario se enfrenta una serie de familias de genes relacionados, de hecho una superfamilia que podría haber evolucionado a partir de un ancestro común que representa una respuesta inmunitaria primitiva.

reconoce al antigeno

1 Expansión .. clona!

La reserva de linfocitos inmaduros contiene células By T que forman anticuerpos y receptores con diversas especificidades. Su reacción con un antígeno lleva a la expansión clonal del linfocito con el anticuerpo (célula B) o el receptor (célula T) que puede reconocer al antígeno. 574

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

&

La selección donal amplifica linfocitos que responden a antígenos individuales

Conceptos principales • Cada linfocito B expresa una sola in_munoglobulína y cada linfocito T, un solo receptor de células T. • Hay una gran variedad de inmunoglobutínas. de células B y receptores de células T. • La unión de un antígeno con una inmunoglobulina de células B o un receptor de células T desencadena la multiplicación clonal.

El nombre de la respuesta inmunitaria describe una de sus características medulares. Después de que un organismo se ha expuestO a un antígeno, se vuelve inmune a los efectos de una nueva in fección. Antes de exponerse a un antígeno en particular, el organismo carece de la capacidad para enfrentar cualesquiera de sus efectos tóxicos, la cual adquirirá durante la respuesta inmunitaria. Una vez eliminada la infección, el organismo conserva la capacidad de responder rápidamente en caso de reinfecdón. Esas características se ajustan a la teoría de la selección clonal ilustrada en la . La reserva de linfocitos con tiene células B y T que portan una gran variedad de ínmunoglobulinas o receptores de células T. Cualquier linfocito B individual produce una imnunoglobulina susceptible de reconocer sólo un antígeno, igual que un linfocito T individual produce sólo un receptor pm1icular de células T. En la reserva de linfocitos inmaduros, las células B y T no estimuladas son morfológicamente indistinguibles, pero ante la exposición a un antígeno, una célula B cuyo anticuerpo puede unirse al antígeno, o una célula T cuyo receptor puede reconocerlo, se estimula para dividirse, tal vez por alguna retroalimentación desde la superficie, donde ocurre la reacdón anticuerpo/receptor-antígeno . Las células estimuladas se desarrollan entonces hacia linfocitOs B o T maduros, lo cual incluye cambios morfológicos que involucran, por ejemplo, un aumenro de tamaño (especialm ente pronunciado en las células B). La expansión inicial de una población espeáfica de célu las B o T ante la primera exposición a unantígeno se llama respuesta inmunitaria primaria, la cual da lugar a la producción de un gran número de linfocitos B o T con especificidad para el antígeno blanco . Cada población representa un don de la célula de respuesta original. Las célu las B secretan anticuerpos en grandes cantidades, e incluso podrían dominar a la población de anticuerpos.

Después de que se ha montado una respuesta inmunitaria primaria ex itosa, el organismo conserva células B y T que portan eJ anticuerpo o recepto r correspond iente. Estas cé lulas de memoria representan un estodo intermedio entre la célnla madura y Ja inmadura; no han adquirido todas Jas características de las células maduras, pero tienen una vida prolongada y rápidamenle pueden llegar a serlo. Su presencia permite montar una r espuesta inmunitaria secundaria rápidamente si el animal es expuesto otra vez al mismo antígeno. La reserva de linfocitos inmaduros del mamífero contiene -10 12 células, algunos con especificidades únicas (porque nunca han encontrado un antígeno correspondiente), en tanto que otros están representados hasta por 106 células (porque la selección clona! ha expandido la reserva celu lar para responder al antígeno). ¿Qué ca racterísticas se recon ocen en un antígeno? Los antígenos suelen ser macromolecu1ares, y si bien las moléculas pequeiias pueden tener det enninames antigénicos y ser reconocidas por anticuerpos, por lo general no son eflcaces para provocar una respuesta inmunitaria (por su reducido tamano); no obstante, [a provocan cuando se conjugan con una molécula portadora más grande (por lo general una proteína). La molécula pequeña utilizada para provocar una respuesta medían te esos mecanismos se llama h apteno. En realidad, sólo una pequeña parte de la superficie de un antígeno macromolecuJar es reconocida por alguno de los anticuerpos. El siüo de unión consta de sólo cinco o seis aminoácidos, pero, obviamente, una proteína en particuJar puede tener más de uno de esos sirios de unión, en cuyo caso, produce anticuerpos con especifkidad para diferentes regiones. La región que provoca una respuesta se denom.ina d eterminante antigénico o epítopo. Cuando un antígeno contiene varios epítopos, algunos suelen ser más eficaces que otros para provocar Ja respuesta inmun itaria; de hecho, pueden ser tan eficaces como para que dominen po r completo la respuesta. ¿Cómo encuentran antígenos blanco los linfocitos y dónde ocurre su maduración? los linfocitos son célu las peripatéticas que se desarrollan a partir de células madre in maduras localizadas en la médula ósea del adulto y que emigran a los tejidos lin· foides periféricos (bazo, ganglios linfáticos), ya sea en forma cürecta por la corriente sanguínea (si son célu las B), o a través del timo (donde se convienen en células T). tos lin focitos tieoen recirco lación entre sangre y linfa; el proceso de dispersión asegura que un antígeno será expuesto a los linfoc.itos de todas las especificidades posibles. Cuando un linfocito

encuentra un antígeno que se tme a su anticuerpo o receptor, la expansión clona! inicia la respuesta inmunitaria.

Los genes de las inmunoglobulinas se ensamblan en los linfocitos a partir de sus constituyentes Conceptos principales • Una inmunoglobulina es un tetrámero de dos cadenas ligeras y dos pesadas. • Las cadenas ligeras pertenecen a las familias A. y K; las cadenas pesadas forman una sola família. • Cada cadena tiene una región terminal N variable (V) y una región terminal e constante (C) . • El segmento Vreconoce al antígeno y el C provee la respuesta efectora. • Los segmentos Vy e son codificados separadamente por segmentos de los genes Vy C. • Para unir un segmento del gen Vcon uno del gen C, por recombinación somática se genera un código genico de una cadena íntegra de inmunoglobulina . Una caracterfstica notoria de la respuesta inmuni ~ taria es la capacidad de un animal de producir un anticuerpo apropiado siempre gue se exponga a un nuevo antígeno. ¿_Cómo puede el organismo estar preparado para producir anticuerpos proteínicos, cada uno disefi.ado específicamente para reconocer un antígeno, cuya estructura no puede preverse? Para fines prácticos, suele considerarse que un mamífero tiene la capacidad de producir de 1Qi> a 108 anticuerpos diferentes, cada uno de los cuales es un tetrámero de inmunoglobulina. constituido por dos cadenas ligeras (L) y dos cadenas p esada s (H} idénticas. Si una cadena ligera puede vincularse con una pesada para producir de 106 a l ORanticuerpos potenciales, se requieren de 10 1 a 104 cadenas ligeras y de 103 a 104 cadenas pesadas d iferentes. llay dos tipos de cadenas ligeras y -l O tipos de cadenas pesadas. Las diferentes clases de inmunoglobuünas tienen funciones efectoras diversas. La clase depende de la región constante de la cadena pesada, que ejerce la función efectora (véase la Fig. 23.17}. La estructura del tetrámero de inmunoglobulina se ilustra en la . Las cadenas ligeras y las pesadas comparten el m ismo tipo general de organización, donde cada cadena proteínica consta de dos regiones principales, la región variable (reg~ón V) N terminal y la re gi ón constante (reg jón C) e terminaL definídas originalmente por compara ción de las secuencias de aminoácidos de diferentes

23.3 Los genes de las inmunoglobulinas se ensamblan en los linfocitos a partir de sus constituyentes

S75

~-

Dominio C1

~ 13iSdQta ·-

--Dominio C2

.- --Dominio C3

- - - Funciones efectoras Cadena pesada

Las cadenas pesadas y ligeras se combinan para formar una inmunoglobulina con varios dominios bien definidos.

cadenas de imnunoglobulinas. Como los nombres sugieren, las regiones variables muestran cambios considerables en la secuencia de una proteína a la siguiente, en tanto que las constantes muestran semejanzas sustanciales. Las regiones conesponclientes de las cadenas ligeras y pesadas se vinculan para generar dominios diferentes en la proteína inmunoglobulina. El dominio variable (V) se genera por la vinculación entre las regiones variables de las cadenas ligera y pesada. El dominio V se encarga del reconocimiento del antígeno. Una inmunoglobulina tiene una esnuctura con forma de Y, donde los brazos son idénticos y cada uno tiene una copia del dominio V. La producción de dominjos V de diferentes especificidades da lugar a la capacidad de responder a diversos antígenos. El número total ele regiones variables para las proteínas de cadena ligera o pesada se mide en cientos; así, la proteína muestra la máxima versarilidad en la región encargada de la unión

del antígeno. El nt1mero de regiones constantes es bastante más reducido que el de regiones variables, por lo generaL sólo hay una a diez regiones e en un úpo específico de cadena . Las regiones constames de las subunidades del tetrámero de inmunoglobulina se reladonan para generar varios dominios e individuales, el primero de los cuales es resultado de la relación entre la región constante única de la cadena ligera (el..) y la pane CH 1 de la región constante de la cadena pesada. Las dos copias de es re dominio complelan los brazos de la molécula en forma de Y. El vínculo enlre las regiones e de las cadenas pesa 5 76

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

das genera los dominios e restantes, cuyo número varía según el tipo de cadena pesada. Al comparar las características de la región variable y la constante se llega al dilema central de la estructura del gen de inmunoglobuli.na. ¿Cómo codifica el genoma un conjunto de proteínas donde una cadena polipcptídica indiVidual debe tener una de menos de diez posibles regiones C, pero puede tener alguna de va1ios cientos de posibles regiones V? Resulta que el número de secuendas de codifica ción para todo tipo de región refleja su variabilidad . Hay nwchos genes que codifican regiones V, pero sólo unos cuantos codifican regiones C. En ese contexto, "gen" significa una secuencia del

DNA que cod~fica una parte definida del po/ipépfido final de immmoglobulina (cadena pesada o ligera) . Así, los genes V codifican regiones variables y los genes e, regiones constantes, si bien ninguno se expresa como unidad independiente. Para construir una unidad que pueda expresarse en forma de una cadena ligera o pesada auténtica, un gen V debe unirse físicamente a un gen C. En ese sistema, dos "genes" codifican un pohpéptido; para evitar confusiones, se hará refere ncia a estas unidades como "segmentos de gen ", más que ''genesff . Las secuencias que codifican las cadenas ligeras y pesadas se ensamblan de la misma forma, uno de

muchos segmentos de/gen V puede unirse a uno de unos cuantos segmentos del gen C. Esta recom binación som ática ocurre en el linfocito B, donde se expresa el anticuerpo. El gran número de segmemos cüsponibles del gen V se encarga de la mayor pane de la diversidad de las inmunoglobulinas, si bien no toda la diversidad está codificada en el genoma, parte se genera por cambios que se preseman durante el proceso de construcción de un gen funcional. En esencia, la misma descripción se aplica a la formación de genes funcionales que codif1can las cadenas proreínicas del receptor de las células T, que puede ser de dos lipes, uno constituido por dos variantes de cadena llamadas a y ~ y otro constituido por cadenas y y S. Como los genes que codifican las inmunoglobuli.nas, los que codifican las cadenas ind ividuales de recepwres de célu las T constan de partes separadas, que incluyen regiones V y C, las cuales se unen en una célula T activa (ver secdón 23.18, Los receptores de las células T tienen relación con las inmunoglobulinas). Así pues, el hecho crucial acerca de la sínresis de las inmunoglobulinas es que el arreglo de los segmentos

de los genes V y e es d({erente en las células que producen las inmunoglobulinas (o receptores de células T) del de todas las otras células somáticas o germinativas. La construcción del gen de una inmunoglobulina o un recepto r de célula T funciona les pudiese

parecer un proceso de Lamarck, que representa un cambio en el genoma que responde a una característica particular del fenotipo (el antígeno). Al nacer, el organismo no posee el gen funcional para producir un anticuerpo o receptor de célula T en panicular, sino un gran númew de segmentos del gen V y un número más pequeño de segmentos del gen C. la construcción subsiguiente de un gen activo con esas panes permite Ja síntesis del anticuerpo o receptor, de manera que es1é disponible para reaccionar con el antígeno. La teoría de sekcción clona! implica que ese rearreglo del DNA tenga lugar antes de la exposición al antígeno, que emonces da lugar a la selección de las células que portan u na proteína susceptible de unirse al antígeno. El proceso completo ocurre en las células somáticas y no afecta a las de la línea germioativa, por tanto, la respues ta a un antígeno no es heredada por la progenie del organismo. Hay dos fami lias de cadenas ligeras de inmunoglobulínas, K y A, y una que conúene todos los tipos de cadena pesada (H). Cada familia reside en un cromosoma diferente y consLa de su propio conjunto de segmentos de genes V y C, el denominado patrón de línea germinativa, que se encuentra en la línea germinativa y en las células somáticas de todos los linajes diferentes al sistema inmunitario. No obstante. en una célula que expresa un anticuerpo, cada una de sus cadenas, una de tipo ligero (K o A.) y una de ripo pesado, es codificada por un gen integro único. El suceso de recombinación que lleva a un segmento de l gen V a unirse con uno del gen C crea un gen activo constituido por exones que corresponden precisamente a los dominios funcio nales de la proteína. Los intrones se rcüran en !a forma usual por empalme del RNA. la recombinación entre segmentos de los genes V y C para da r loci funcionales ocurre en u na pobla ción de linfocitos inmaduros. Un linfocito B suele tener sólo un rcarreglo productivo de segmentos del gen de cadena ligera (K o A.) y uno de los segmentos del gen de cadena pesada, igual que un linfocito T rearregla de manera productiva un gen a y uno ~~ o un gen o y uno y. El anticuerpo o receptor de cé lula T producido por cualquier célula depende de la configuración panicular de segmentos de los genes V y e que se han unido. Los principios por los que se ensamblan los genes funcionales son los mismos en cada familia, pero hay diferencias en los detalles de la organización de los segmentos de los genes V y e, así como en la reacción de recombinadón entre ellos. Además de los segmentos de los genes V y e, en los loci somáticos funciona les se incluyen otras secuencias cortas de DNA (incluidos los segmentos J y D).

Las cadenas ligeras se ensamblan por recombi nación única Conceptos principales • Una cadena ligera Á se ensambla por recombinación simple entre un gen Vy un segmento del gen J-C. Un segmento del gen Vtiene un exón líder, un intrón y una región de codificación variable. El segmento del gen J-C tiene un exón corto de codificación J, un intrón y una región de codificación C. • Una cadena ligera te se ensambla por recombi nación simple entre un segmento de gen Vy uno de los cinco segmentos J que preceden al gen C.

Un a cadena ligera A se e nsambla a partir de dos . El segporciones, como se ilustra en la mento del gen V consta del exón líder (L) separado del segmento variable (V) por un solo intrón. El segmento del gen e consta del segmento .J, separado por un solo intrón del exón constante (C). El nombre del segmento J es una abreviatu ra de juntura, porque identifica la región en que se conecta con eJ segmento V. Así, la reacción de juntura no implica directamente a los segmentos de los genes V y C, sino que se presenta a través del segmento J; cuando se describe la unión de dos "segmentos de genes V y e" de cadenas ligeras, en realidad se hace referencia a la unión V-JC. El segmento J es cono y codifica los úlEimos aminoácidos de la región variable, como detinen sus secuencias. En el gen íntegro generado por recornbinación, el segmento V-J <:onstituye un solo exón que codifica a la región variable completa. Las consecuencias de la reacción dejunrura K se . Una cadena ligera K tamilustran en la bién se ensambla a parrir de dos poJciones, pero hay u na diferencia en la organización del segmento del gen C. Un grupo de cinco segmentos J se dispersa en una región de 500 a 700 bp, separados por un inrrón de 2 a 3 kb del exón C~. En el ratón, el segmento J central no es funcional (1j1J3 ). Un segmento V, puede unirse a cualquiera de los segmentos J. Sea cual sea el segmento J utilizado, se convierte en la parte terminal del exón variable íntegro. Cualquier segmento .J a la i1quierda del segmento de recombinación J se pierde (en la figura se ha perdido Jl). El segmento J ubicado a la derecha del c;egmen to J recombinamc se trata como pane del imrón situado entre el exón variable y el constame (en la figura, J3 se incluye en el intrón que se empalma). 23.4 Las cadenas ligeras se ensamblan por recombínación Onico

577

•• Gen V

Codones de línea - 19 a _ 4 germinativa

Gen C

110 a COOH

-4 a +97

Reccmbinación somática

1

DNA de linfocito

Transcr;pmón

1

ANA nuclear

Empalme!

==

RNAm Traducción!

Cadena ligera de inmunogloloulina Variable

Constante

El segmento gé~nico C A. es precedido por un segmento J, de manera que la recombinación V-J genera un gen d<e cadena ligera A. funcional.

Unea germinativa Recombinaci ón somática en J2!

Transcripción! J2

ANA nuclear

J3

--~ ::::===::::::::::::::= ~=====:::::==:~==========

¡

Empalme de J2 a C ANA m

~~======--~;:=========:; Traducción!

Cadena ligera de inmunoglobulina Variable

Constante

El segmento génico C K es precedido por múltiples segmentos J en la línea germinativa. La unión V-J reconoce a cua lquiera de los segmentos J, que después se empalma con el segmento génico C, durante el procesami,ento del RNA.

578

CAPÍTULO 23 Diversidad i nmu nitaria

Todos Jos segmentos J funcionales poseen una señal en el límite izquierdo que hace posible la recombinación con el segmento V; también poseen una señal en el límite derecho que se puede usar para el empalme con el exón C. Cualquier segmento J reconocido en la unión D-J del DNA utiliza su señal de empalme en el procesamiento del RNA.

Las cadenas pesadas se ensamblan mediante dos recombi naciones Conceptos pnnc1pales • Las unidades de recombinación de cadenas pesadas son un gen V, un segmento D y un segmento del gen J-C. • La primera recombinación une a D con J-C. • La segunda recombinación une a V con D-J-C.

• El segmento Cconsta de varios exones.

La construcción de la cadena pesada implica un segmento adicional. El segmento D (por diversidad) se descubrió merced a la presencia de dos a trece aminoácidos adicionales en la proteína, entre las seruendas codificadas en los segmentos V y J. Un arreglo de > 1O segmentos D yace en el cromosoma, entre los segmentos VH y los cuatro JH. l.a unión V-D -J ocurre en dos etapas, como se ilustra en la . El primero de los segmentos D se rccombina con un segmento JH; un segmento VH se aúna entonces con el segmento combinado DJw La reconstrucción lleva a la expresión

Lfder

..'"

lntrón

\.. Linea germlnativa

Variable

"

del segmento C11 adyacente (que consta de varios exones) . (En la sección 23.12, El cambio de clase es producto de la recombinación del DNA. se analiza el uso de los diferentes segmentos del gen CH; por ahora, sólo se considerará la reacción en cuanto a la conexión con uno de varios segmentos J que preceden a l segmento del gen Cw) Los segmentos D se organizan en forma seriada. El locus de cadena pesada del ratón contiene 12 segmentos D de longitud variable, en tanto que ellocus humano tiene -30 segmentos D (no necesariamente wdos activos}. Algún mecanismo desconocido debe garantizar que el mismo segmento D participe en las reacciones de unión D-J y V-D (cuando se describe la unión de los segmentos de los genes V y C para cadenas pesadas se supone que el proceso ha sido concluido por reacciones de unión V-D y D-J). Los segmentos V de las tres familias de inmunoglobulinas son simi lares en cuanto a organización. El primer exón codifica las secuencias de señal (implicadas en la unión con la membrana} y el segundo, la porción principal de la propia región variable (<1 00 codones de longitud}, el resto proviene del segmento D (sólo en la familia H} y de un segmento J (en las tres familias}. La estructura de la región constante depende del tipo de cadenas. Para ambas cadenas ligeras, K o A, dicha región es codificada por un exón único (que se convierte en el tercer exón del gen activo reconstruido) . Para las cadena!> H, la región constante es codificada por varios exones; de manera equivalente, en la cadena proteínica que se muestra en la Figura 23.4, diversos exones codifican las

01-010

J1·J4

~ \./¡V\.~

ONA de rrnfocllo

la estructura actual del gen C se interrumpe

Los genes de las cadenas pesadas se ensamblan por reacciones secuenciales de unión. Primero, un segmento D se une a un segmento J, y después un segmento génico V se une al segmento D.

23.S Las cadenas pesadas se ensamblan por dos recombinaciones

5 79

regiones cl!l' de bisagra, CHl y CH3. Cada exón eH tiene -100 codones de longitud y la bisagra es más corta. Los intrones suelen ser relaúvameme pequeños (-300 bp).

La recom binaci ón genera una gran diversidad Conceptos ptincipales • Un locus de cadena ligera produce más de 1 000 cadenas por la combinación de 300 genes V con cuatro a cinco genes C. • Un locus H puede producir más de 4 000 cadenas por combinación de 300 genes V, 20 segmentos Dy cuatro segmentos J .

Ahora deben revisa rse los diferentes tipos de segrncmos de los genes V y C para ver qué tanta diversidad se adapta a la variedad de regio nes de codificación que pona la línea germinativa. En cada familia del gen de cadena ligera de Ig, muchos segmentos del gen V se vinculan con un número mucho menor de segmentos deJ gen C.

Segmentos génicos v,

J). 1 C~ 1 J12CA2 J).3Ci.3

F

L

rr

2 en el ratón 4 segmentos génicos J-C en el ratór -300 en el hombre >6 segmentos J -C en el hombre La familia A. consta de segmentos génicos Vunidos a un número pequeño de segmentos génicos J -C.

Jl-5

c.

1111 1 1 Las familias K humana y de ratón constan de segmentos génicos V unidos a cinco segmentos J conectados a un solo segmento génico C.

-.GenesVH ~ Segmentos DJ - - -Segmentos del gen C -300

-20

Kb 300

rl

6 111> ll[fl' 250

200

Y1 ljll:c.t1 IVY ,--1-

150

100

---+a f"f

E

1 l

ll

50

2

o

Un solo grupo génico humano contiene toda la información para el ensamblaje del gen de cadena pesada. 580

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

En la se muestra que el locus ')..tiene -6 segmento~ del gen C, cada uno precedido por su propio segmento J. En el ratón, el locus A. tiene mucho menos diversidad que ellocus humano: la principal diferencia es que en el ratón hay sólo dos segmentos del gen Vl' cada uno enlazado con dos regiones J-C. De los cuatro segmentos del gen e~.. uno está inactivo. En algún punto en el pasado, el ratón sufrió una deleción catastrófica de la mayor parte de los segmentos del gen V,_ de línea germinativa. En la se muestra que ellocus K tiene sólo un segmento del gen C, si bien es precedido por cinco segmentos J (uno de ellos inactivo). Los segmentos del gen V)\' ocupan un gran grupo del cromosoma, en dirección ascendente respecto de la región constante. El grupo h.umano tiene dos regiones; inmediatamente antes del segmento del gen C._.. una región de 600 l80% de identidad de los aminoácidos. La [amilia del ratón es desusadamente grande (- 1 000 genes), y hay -18 familias V'<' cuyo tamaño varía de 2 a 100 miembros. Como en otras familias de genes relacionados, los segmentos del gen V relacionados forman subgrupos generados por duplicación y divergencia a partir de los miembros ancestrales individuales. Sin embargo, muchos de los segmentos V son seudogenes inactivos. y <50 posiblemente se usen para generar inmunoglobulinas. Un linfocito determinado gen era ya sea una cadena ligera K o una A para relacionarse con la cadena pesada. En el bornbr¡;, -60 % de 1as cadenas ligeras es K y -40% es A. En el ratón, el 95% de las células B expresa el tipo K de la cadena ligera, supuestamenre porque el número de segmemos del gen A es menor. El locus único para la producción de cadenas pesadas en el hombre consta de varias secciones de, y es sifinidas, como se resume en la milar en el ratón. donde hay más segmentos del gen V"' menos segmentos D y J y una ligera diferencia en el número y la organización de los segmentos del gen C. El miembro 3' del grupo V" está separado por sólo 20 kb del primer segmento D. Los segmentos D se distribuyen en -50 kb, seguidos del grupo de segmentos J. En los siguientes 220 kb se encuentran todos los segmentos del gen Cw de los cuales, nueve son funcionales. y dos seudogenes. La organización sugiere que un segmenlo del gen y debe h aberse du-

plica.do para producir el subgrupo y-ry-E-C/.., después de lo cual se duplicó el grupo entero. ¿Hasta qué grado la díversidad de la información de línea germinal genera la variedad de la región V de las proteínas inmunoglobulinas? Combinando cualquiera de los -50 segmemos del gen V con cualquiera de los cualro a cl,nco segmentos J, un locus usual de cadena ligera tiene el potencial de producir casi 2 50 cadenas; el locus de la cadena H está todavía más diversificado. Por la combinación de cLlalquiera de los -50 segrnemos Vw 20 segmentos D y cuatro segmentos .1, el genoma podría producir 4 000 regiones variables para acompañar cualqu ie r segmento del gen C¡.¡· En los mamíferos, ése es el punto de pa rtida de la diversidad, pero hay mecanismos adicionales que introd ucen más cambios . Cuando se analizan variantes esrrechameme relacionadas de las inmunoglobulinas, a menudo hay más proteínas de las que pudiera pensarse por el número de segmentos correspondientes del gen V. Los nuevos miembros son creados por cambios somáticos en los genes individuales, durante o después del proceso de recombinación (ver secdón 23.14, La mutadón somáti ca genera diversidad adicional en el rarón y el hombre) .

Ell

La recombinación inmunitaria utiliza dos tipos de secuencia de consenso

Conceptos principales La secuencia de consenso utilizada para la recombinación es un heptámero separado de un nonámero por 12 o 23 pares de bases. • La recombinación ocurre entre dos secuencias de consenso con espaciamfentos diferentes.

El ensamblaje de genes de la cadena ligera y la pesa da implica el mismo mecanismo (aunque el número de pa rtes es diferente), se encuentran las m ismas secuencias de consenso en Jos límites de wdos los segmentos de la línea germina tiva que participan en las reacciones de unión. Cada secuencia de consenso consta de un heptámetro separado de un nonámero por 12 o 23 bp. En la se ilustra la relación de las secuendas de consenso en los loci de Jg de ratón. En el locus K, cada segmento del gen VK va seguido de una secuencia de consenso con un espaciamien to de 12 bp; cada segmenro J"es precedido por una secuencia de consenso con espaciamiento de 2 3 bp; la orientación de las secuencias de consenso V y J está invenida. En ellocus A., cada segmento del gen

v, va seguido de una secuencia de consenso co n espaciamiento de 23 bp, y cada segmento del gen J;.. es precedido por u na secuencia de consenso de 12 bp de tipo espaciador. La regla que rige la reacción de jumura es guc una secuencia de consenso con un típo de espaciamiento puede unirse sólo a una secuencia de consenso con el otro tipo de espacíamiento. Las secuencias de consenso de los segmentos V y 1 pueden estar en cualquier orden, de modo que los di feremes espaciamientos no imparten ninguna información direccional, sino que sirven para evitar que un segmento del gen V o J se recombine con otro igual. Este concepto se confirma por la estructura de los componentes de Jos segmentos del gen de la cadena pesada. Cada segmento del gen Vf1 va seguido de una secuencia de consenso de tipo espadador de 23 bp. Los segmentos D son flanqueados a uno y orro lado por secuencias de consenso de tipo espaciador de 12 bp. Los segmentos JH son precedidos por secuencias de consenso de tipo espaciador de 23 bp. Así, el segmento del gen Y debe unirse a u n segmento D, y éste, a un segmento J. Un segmento del gen Y no puede unirse directamente con un segmento J, porque ambos poseen el mismo típo de secuencia de consenso. El espaciamiento entre Jos componentes de las secuencias de consenso corresponde casi a uno o dos giros de la doble hélice, lo cual podría reflejar una relación geométrica en la reacción de combinación. Por ejemplo, las proteínas de recombinación pueden acercarse a l DNA lateralmente, de la misma fo rma que la polimerasa de RNA y los represores se aproximan a los elementos de reconocimiento, como promotores y operadores.

Heptámetro

Nonámero

Nonámero

He¡:>lámetro

CACAGTG 'C~AA~~CCGGT1T'~G - CACTGTG GTGTCAC TGTT~TTGG~CAA~AAC~ G T GACAC

Espaciador de 12 bp

Espaciador de 23 bp

V).

o Las secuencias de consenso están presentes en orientación invertida en cada par de sitios de recombinación. En un miembro de cada par, el espaciamiento entre sus componentes es de 12 bp, y en el otro, de 23 bp.

23.7 La recombinación inmunitaria utiliza dos tipos de secuencia de consenso

581

La recombi nación genera deleciones o inversiones Conceptos principales • La recombinacíón se debe a roturas de la doble cadena en los heptámeros de dos secuencias de consenso. • Los extremos señal del fragmento entre roturas suelen unirse para generar un fragmento circular escindido. • Los extremos de codificación se enlazan de manera covalente para unir Va J-C (cadena L) o Oa J-C y V a D-J-C (cadena H). • Si se invierten los genes recombinantes en lugar de unirse en orientación directa, hay una inversión y no una deleción de un círculo escindido.

La recombinación de los componentes de los genes de inmunoglobulina se logra mediante un rearreglo físico de secuencias que implica rotura y nueva unión, pero el mecanismo es diferente del de la recombLnación homóloga. En la se ilustran las caracrerísticas generales de la reacción para una cadena A. ligera. (la reacción es similar en ellocus de la cadena pesada, con la salvedad de que hay dos sucesos de recombinación, primero D-J y después, V-DJ.) la rotura y nueva unión tienen lugar como reacciones independiente; hay una rotura de la doble cadena de los hectámeros que yacen en los exu·e-

Los extremos de los heptámeros identifican los extremo~ de codiffcación

.

...

Espaciador de 23 bp

Espaciador de 12 bp Escisión

'

Extremo señal

Extremo señal

Extremo de codificación

Extremo de --"'"" codificación

Juntura ~

Juntu~ ra

de / codificación

Juntura señal

~

La rotura y nueva unión en secuencias de consenso genera genes de inmunoglobulinas. 582

1DJ

La exclusión alélica es desencadenada por un rearreglo productivo

Conceptos principales

~

.r-

V-

mos de las unidades de codificación, lo cual libere rodo el fragmento entre el segmento del gen V ~ el del gen J-C; los puntos terminales de ese fragmento se denominan términos señal. El extreme fragmentado de los loci V y J-C se llama término de codificación. Los dos extremos de cod.ificaciór. T.ienen enlace covalente para formar una unión de codificaci6n, la cual enlaza los segmentos V y J s. también se conectan los dos extremos señaL el fragmento escindido formaría una molécula circular. Se ha demostrado que los loci V y J-C estár. organizados con la misma orientación, de modo que el corte de cada secuencia de consenso libera entre ellos una región como fragmento lineal. Si se uneL. los extremos señal, se forma una molécula circular como se indica en la Figura 23.12.la deledón pare liberar un círculo esci ndido es el modo predominante de recombinación en los lod de inmunoglobu.Unas y TCR. En algunos casos excepcionales, la orientación del. segmento del gen V está invertida en el cromosoma. respecto de los loci J -C. En ral caso, la rorura y nueva unión invierte el material interpuesto, er: lugar de eliminarlo, Los resulLados de la deleción respecto de la inversión son los mismos mostrados antes para la recombinación homóloga entre la repetición directa o la invertida en las Figuras 2 1.9 y 2Ll0, con la salvedad adicional de que la recombinación con un segmenro del gen V hace necesario que los extremos señal se unan. de otra manera, habrá una rotura en el locus. En la recombinación de TCR, se produce una inve rsión y, en ocasiones. también en el locus de la cadena ligera K.

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

La recom binación para generar un gen íntegro de inmunoglobulina es productiva si lleva a la expresión de una proteína activa . • Un rearreglo productivo impide que ocurra cualquier rearreglo adicional, a diferencia del rearreglo no productivo. • La exclusión alélíca se aplica separadamente a las cadenas ligeras (sólo puede rearreglarse de manera productiva una cadena K o A.) y a las pesadas (una cadena pesada se rearregla de manera productiva).

Cada célula B expresa un solo tipo único de cadena ligera y uno de cadena pesada, porque nada más tiene lugar un rearreglo productivo de cada tipo en un linfocito dado para producir un gen con una

cadena ligera y una pesada. Cada suceso involucra a los genes de sólo uno de los cromosomas homólogos, de modo que los aleZos del otro cromosoma no se expresan en la misma célula; este fe nómeno se conoce como e xclusión alélica. La exclusión alélica complica el análisis de la recombinación somática; una sonda que reacciona con una región en que ha tenido lugar el rearreglo de un homólogo, también detectará las secuencias alélicas del otro homólogo. de modo que se tiene la obligación de analizar los diferentes destinos de los dos cromosomas juntos. El patrón usua l mostrado por un gen activo con rean:eglo puede interpretarse según una deleción del material entre Jos Joci V y C recombinanles. En las células activas se observan dos tipos de organizadón génica: • Las sondas para el gen activo suelen revelar una copia con rearreglo y una de la linea germinativa, de modo que se supone que la unión ocurrió en un cromosoma, mientras que el otro se mantuvo sin cambjos. • Pueden encontrarse dos patrones diferentes de reaneglo. lo cual indica que los cromosomas han experimentado rearreglos independientes. En algunos de estos casos, el material entre los segmentos de los genes V y e recombinantes está por completo ausente de la línea celular, lo cual explica muy fáciJmeme por la aparición de deleciones independientes (resultado de recombinaciones} en cada cromosoma. Cuando dos cromosomas carecen del patrón de linea germinativa, por lo general uno de ellos ha pasado por un rearreglo productivo para generar un gen funcional y el otro ha experimentado un rearreglo no productivo, lo cual podría asumir varias formas, pero en cada caso, la secuencia del gen no se expresaría como cadena de inmunoglobulina. (Puede ser incompleto, por ejemplo, porque se produjo la unión D-J, pero no la consiguiente unión V-D, o bien ser aberrante, con el proceso concluido, pero sin generar un gen que codifique una proteína fundonal.) La coexjsrencia de rearreglos productivos y no productivos sugiere que hay un asa de retroalimentación que contTola el proceso de recombinación, modelo esbozado en la . Supóngase que cada célula inicia con dos loci en una configuración Ig 0 de líneagerminativa sin rearreglo, cualquiera de esos loci puede pasar por un rearreglo para generar un gen productivo, Ig+, o uno no p rodnctivo, lg-. Si el rearreglo es productivo, la síntesis de una cadena activa provee un desencadenante para evitar el rearreglo del otro alelo, y la célula activa tendrá una configuración Ig 0 /Ig'.

Si el rearreglo es no productivo, se creará una célula con la configuración Ig 0 /lg-" No hay impedi mento para el rearreglo del alelo de línea germinal restante, que de ser producLivo, la célula expresada tendrá una configuración Ig' /Ig-. También en este caso, la presencia de una cadena activa suprime la posibilidad de rearreglos adicionales. La célula lg· /1g- es productO de rearreglos sucesivos no productivos. En algunos casos, este rípo de célula puede intentarlo otra vez; en ocasiones, los patrones de DN A observados sólo pueden haber sido generados por arreglos sucesivos. La esencia del modelo es qtte la célula sigue tratando de recombinar segmentos de los genes V y C hasta lograr un rearreglo productivo. La exclusión alélica es causada por la supresión de rearreglos adicionales ran pronto como se produce una cadena activa. El uso de este mecanismo in vivo se demuestra por la creación de ratones transgénicos, cuya línea germ ina ti va tiene un gen de lnmunoglobuUoa con rearreglo. La e:srpresió.n del transgén en las célu las B suprime el rearreglo de genes endógenos. La exclusión alélica es independiente para los loci de las cadenas pesadas y ligeras . En general, los genes de las cadenas pesadas son los primeros en pasar por un rearreglo. La exclusión alélica de las cadenas ligeras debe aplicarse de manera equivalente a ambas familias (las células pueden tener cadenas ligeras activas K o/...). Es posible que

Genes de lfnea germinativa (lgOftgO)

V \¡

El rearreglo productivo culmina en lgO/Ig'

.• ............ ·.

J

El [earreglo no produclívo culmina en lgOflg-

V

Transcñpoión

>--- ..... La expresión de lg impide tearre9}os adicionales

T ranscripclón

Un rearreg\o exitoso para producir una cadena activa ligera o pesada evita rearreglos adicionales del mismo tipo y da como resultado la exclusión alélica.

23.9 La exclusión alélica es desencadenada por un rearreglo productivo

583

la célula 1·earregle primero sus gen es 1< y trate de rearreglar los A. sólo si ambos intentos con los K no tienen éxito. Una paradoja interesante de esta serie de sucesos es que las mismas secuencias de consenso y la misma recombinasa V (DJ) participan en las reacciones de recombinación en los loci H, K y A., y sin embargo, lús tres loci se rearreglan en un orden establecido. ¿Qué asegura que el rearreglo de cadenas pesadas preceda al de cadenas ligeras, y que et rearreglo K preceda al!-..? Los loci pueden volverse accesibles a la enzima en diferentes momemos, ral vez como resultado de la transcripción, la cual ocu· ne incluso ames del rearreglo, si bien, por supuesto, los producLos no tienen ftmción de codi.ficación. La transcripción puede cambiar la estructura de lacromatina, lo cual pone a disposición de la enzima las secuencias de consenso para la recombiinación.

BE

Las proteínas RAG catalizan la rotura y la nueva uni ón

Concepros principales

-

• Las proteínas RAG son necesarias y suficientes para la reacción de corte y empalme. • La RAGl reconoce las secuencias de consenso nonaméricas para la recombinación. La RAG,2 se une a RAG1 y se corta y empalma en el heptámero . • La reacción se asemeja a la de resolución ti1po topoisomerasa que ocurre en la transposición. • Una de las histonas avanza a través de un intermediario en horquilla en el extremo de codificación; ta abertura de la horquilla se ,encarga de la inserción de bases adicionales (nucleótid!os T) en el gen recombinado. • la transferasa de desoxinucleósidos inserta nudeótidos N adicionales en el extremo de codificación. • l a secuencia del codón del sitio de la reacción de unión V-(D)J es muy variable y codifica el aminoácido 96 en el sitio de unión del antígeno. • Las roturas de la doble cadena en las uniones de codificación son reparadas por el mismo sis;tema involucrado en la unión de extremos no homólogos del DNA dañado. • Un reforzador del gen Cactiva al promotor del gen V después de que la recombinación ha genera1do el gen íntegro de inmunoglobulina.

Las proteínas RAGl y RAG2 son necesarias y suficientes para seccionar el DNA en la reoombinación V(D)J; son codificadas por dos genes, separados por
CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

ratones que carecen de RAGJ o RAG2 no pueden recombinar sus inmunoglobulinas ni sus recepwres ~- _ células T, y como resultado, portan linfocitos de B T inmaduros. Las proteínas RAG juntas emprendelas reacciones catalíticas de rotura y nueva unión á; DNA y también proveen una red estructural en :: cual ocurren las reacciones. La RAG 1 reconoce las señales de heptámerC' nonámero con el espaciamiento apropiado 1212; y recluta a RAG2 para el complejo. El nonámer proporciona el sitio para el reconocimiento inici.: y el heptámero dirige el sitio de corte. se muestran las reaccione..... En la 1 involucradas en la recombinación. El complejo prcduce una hendidura en una cadena de cada unióu la cual tie ne extremos 3'-0H y 5'-P. El extrem' libre 3'- 0B ataca enwnces la unión fosfato en := posición correspondiente de la otra cadma de la e¡ . tructura doble, lo cual da lugar a horquilla en el e):· tremo de codificación donde la terminación 3' dc:una cadena se enlaza de manera covalente con lo terminación 5' de la otra, de modo que se produc~ una pérdida de continuidad roma de doble cadena en el extremo señal. Este segundo cone es una reacción de transesterificación en la cual se conservan las energías de enlace y que simula las reacciones similares a la!de topoisomerasa caralizadas por las proteínas re solvasa de transposones bacterianos (véase secciór 21. 9, La transposición TnA requiere de rransposasa y resolvasa). La semejanza con estas reacciones es respaldada aún más por una homología entre RAG I y las proleínas invenasa bacterianas (que invierten segmemos específicos del DNA por reacciones de recombinación similares). De hecho, las proteínas pueden insertar un DNA donador cuyos extremos libres constan de las secuencias señal apropiadas (heptámetro-12/espaciador nonámero -23) en un DNA blanco no relacionado en una reacdón de transposición in vitro. Esto sugiere que la rccombinación somática de genes inmunitarios evolucionó a partir de un lransposón ancestral y también que las proteínas RAG se encargan de las translocaciones cromosómicas donde se conectan loci de lg o TCR con otros lod. Las horquillas de los extTemos de codificación proporcionan el sustrato para la siguiente etapa de la reacción. Si se introduce una sección de una sola cadena cerca de la horquilla, en el extremo, una reacción de desapareamíenro genera la prorrusión de una sola cadena. La sínLesis de un complemento para la cadena única expuesta convierte entonces e l extremo de codificación en una esrrucrura doble ampliada, reacción que explica la introducción de nucleótid os P en los extremos de codificación; constan de unos cuantos pares de bases adicionales

Gen V

Gen J-C

'

o:GTTT 1' ¡23 A T"G CGAAAAACA GTGACAC GGl::

rra

TA GAC AGTG{ }ACAAAAACC 12 TGTTTTTGG AT GT.GTCAC

¡c era

P

TA CACAGTG

CACTGTG CCG G TGACAC G(;tr

ATGTGTCAC

~

Extremo de codificación Extremo señal en horquilla romo

6H

TA - O P-CACAGTG CACTGTG-OH P- CCG AT-P HO-GTGTCAC GTGACAC-P 0-GCl.C

¡ i

'

TA-9 AT-P

P, -CCG

•.

0-G.GC

T

ATA

Recorte

T~

Extremo de codificación TA AT

RAG1,2 hace una hendidura en una cadena de cada unión El -OH libre ataca el enlace en otra cadena y crea horquillas en los extremos de codificación Se escinde una cadena adyacente a la horquilla La cadena escindida se separa para generar un extremo libre (las bases afectadas se muestran en negro) Recorte del extremo, adición aleatoria de nucleótidos (N) o ambos

AT

""

lccG

H

o

Hendidura en una

cadena

•

Extremo de

Extremos de codificación unidos

~edificación

i

NNGGC.CG NNCCGGG

Nucleótidos P

/

TA NNGGCO.(il ATNNCCGGC

N ucleótidos

Se llenan los extremos de una sola cadena

Los extremos de codificación se unen

N/

El procesamiento de los extremos de codificación introduce variabilidad en la unión.

relacionados con el extremo de codificación original, pero de orientación invertida . También pueden insenarse algunas bases adicionales aparentemente con secuencias aleatorias entre los extremos de codificación que se conocen como nucleótid os N. La inserción se debe a la actividad de la enzima transferasa de desoxinucleósido (que se sabe es un componente activo de los linfodtos) en el extremo libre de codificación 3' generado durante el proceso de unión. Así pues, los cambios en la secuenda durante la recombinadón son conseCLiencia de los mecarúsmos enzimáticos implicados en la escisión y nueva unión del DNA. En la recombinadón de la cadena pesada se pierden pares de bases o se insertan en las uniones VH-D, D-J, o ambas; también ocurren deledones en la unión v..-.J._, pero la inserción en esas uniones es desusada. Los cambios de secuencia afectan al aminoáddo codificado en las uniones V -D y D-J de las cadenas pesadas o en la unión V -J de las ligeras.

Estos diferentes mecanismos, juntos, aseguran que una unión de codificación puede tener una secuenci~ diferente de la pronosticada por la unión directa de los extremos de codificación en las regiones V, D, y J. Los cambios de secuencia de la unión hacen posible codificar una gran variedad de aminoáci.dos en este sitio. Es interesante que el aminoácido de la posidón 96 es creado por la reacción de juntura V-J; forma parte del sitio de unión del antígeno y puede también involucrarse en el logro del contacto enrre las cadenas ligeras y las pesadas, de modo que la máxirna diversidad se genera en el sitio que hace contacto con el antígeno blanco. Los cambios en el número de pares de bases de la unión de codjficación afectan el marco de lectura. El proceso de unión parece ser a leatorio respecto del marco de lectura, de manera que probablemente sólo el 33% de las secuencias unidas conserva el marco apropiado de lectura de unión a unión. Si la región V-J se une de manera que el segmento J 23.10 Las proteínas RAG catalizan la rotura y la nueva unión

585

quede desfasado, la traducción termina prematuramente con un codón de finalización en el marco incorrecto. La formación de genes aberrantes se puede considerar como el precio que Ja célula debe pagar por tener una mayor diversidad, la cual es obtenida al ajustar la secuencia en el sitio de unión. En las reacciones de unión que involucran al segmento D de la cadena pesada se genera una diversidad similar, incluso mayor; el resultado observado es el mismo respecto del marco de lectUia; los genes no productivos son generados por sucesos de unión que ubican a J y C fuera de fase respecto del segmento génico V precedente . La reacción de unión que funciona en el extremo de codificación utiliza la misma vía de unión texminal no homóloga (NHEJ) con que se reparan secciones de la doble cadena en las célu las (véase sección 20 .1l. Las células eucarióticas ban conservado sistemas de reparación). Las etapas iniciales de la reacción fueron identificadas por el aislamiento de productos imermedios de linfocitOs de ratón con la mutación de inmunodefidencia combinada grave (SCID), que da Jugar a un grado muy disminuido de actividad en la recombinación de inmunoglobuHnas y TCR. Los rarones SCID acumulan moléculas rotas que terminan en pérdidas de conlinuidad de la doble cadena en los extremos de codificación, de modo que no son comperemes para concluir algunos aspectos de la reacción de juntura. La mu tación SCID desactiva una cinasa de proteínas dependiente del DNA (DNA-PK). la cinasa es reclutada en el DNA por las proteínas Ku70 y Ku80, que se unen a los extremos del DNA. La DNA-PK produce fosforilación de la proteína Anemis, que provoca una hendidura en los extremos en horquilla y, por tanto, la

Promotor

La expresión de la cadena pesada temprana puede cambiar por procesamiento del RNA

rnactivo

Conceptos principales

l-

• Todos los linfocitos empiezan por sintetizar la forma de IgM unida a la membrana. • Un cambio en el empalme del RNA hace que sea remplazado por la forma secretada cuando la célula B se diferencia.

Exón V

l

Exones C Recomblnaclón

•:•~·c;l~~~iÓ~ ~

•

Reforzador

- Transcrlpción ~ Un promotor génico Vestá inactivo hasta que la recornbinación lo lleva cerca de un reforzador del segmento del gen C El reforzador está activo sólo en los linfocitos B. 586

desactiva (también tiene actividad de exonuclca y endonucleasa en la vía NUEJ) . La unión real . realizada por la ligasa rv de DNA y también requiere de la pro teína XRCC4 . Como resultado, en !: prote ínas Ku y XRCC4 o en la ligasa IV de Dt\-.de pacientes humanos con enfermedades produ~ das por deficiencias en la reparación del DNA, encuentran mutaciones que producen una may sensibilidad a la radiación. ¿Cuál es la relación entre la un ión de los Se: memos génícos V y e y su activación? Los segment. del gen V sin rearreglo no se presentan de manera .;;tiva en el RNA. No obstante, Cllando un segmento <.~ gen V se une de manera produ ctiva a un segme~~ de C"' la unidad resultante se transcribe. La secuer cia de dirección ascendente de un segmento del gc V no se modifica con la rea cción de unión; COl'!: resultado el promocor tendrá que ser el mismo en los:nes sin rearreglo, o con rearreglo, ya sea no productir: productivo. En dirección ascendente de cada segmento e ~ gen V se encuentra un promotor, pero está inacth y para que se active, debe relocalizarse en la región : EJ efecto dependerá de secuencias en dirección dt'. cendenre. ¿Cuál sería su participación? Un reforzad localizado en el segmemo del gen C, o en di.recoc. descendeme respecto del mismo, activa al promot:J • en el segmento del gen V. El reforzador es específh. de tejidos y está activo sólo en células B. Su existenáz sugiere el modelo UustJado en la , dom. el promotor del segmento del gen V es activado cuardo se lleva dentro de los limites del reforzador.

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

El periodo de síntesis de IgM con que se inicia ~ desarrollo del linfocito consta de dos partes, durante las cuales se sintetizan versiones cliierentes de 1c región constante 11: • Conforme una célula madre se diferencia e:: un pre-linfodto B, se sintetiza una cader...z ligera acompañante y aparece la molécu2 de lgM (L 2 p 2 ) en la supexficie de la céluJ.; Esa forma de lgM contiene la versión p '" dl.

la región constante (la m indica que la lgM está localizada en la membrana). La localización en la membrana puede relacionarse con la necesidad de iniciar la proliferación celular en respuesta al primer reconocimiento de un antígeno. • Cuando el Jiniocito B se diferencia más en dirección de célula plasmática se expresa la versión lls de la región constante. La IgM en realidad es secretada como un pentámero IgM,J donde J es un polipéptido de unión (sin conexión con la región J) que forma enlaces disulfuro con las cadenas p. La secreción de la proteína va seguida de la respuesta humoral que se muestra en la Figura 23.1. Las versiones ll 111 y ll, de la cadena pesada p. difieren sólo e n el extremo terminal C. La cadena llm term ina en una secuencia bi dro (óbica qu e probablemente la 6.je en la membrana. Dicha secuencia

El gen

m1

c. tiene 6 axones

m2 m3m4

M1 M2

E

Etapa unida 'l la membrana El ANA nuclear termina en M2 Los exones M1 y M2 están presentes en RNAm

f~--

AAAA

!

El ca mbio de clase es producto de la recombinación del DNA

Conceptos principales • Las inmunoglobulinas se dividen en cinco clases, según el tipo de región constante de la cadena pesada. • El cambio de clase para modificar la región C" se debe a una recombinación entre Las regiones S que lleva a la deleción de la región entre la antigua CH y la nueva. • Pueden presentarse múltiples recombi naciones de cambios sucesivos.

Empalme

Etapa secretora El ANA nuclear termina después del exón 4 El RNAm tiene sólo cuatro axones

l

es sustituida por una secuencia hidrofílica más corta en J.l, ; la sustitución permite que la cadena pesada J.l pase a través de la membrana. El cambio en el extremo e se logra por un suceso de empalme alterno controlado por el extremo 3' del RNA nuclear, como se ilustra en la En la etapa de unión con la membrana, el RNA termina después del exón M2, y la región constante se produce por el empalme de seis exones. Los primeros cuatro codifican a los cuatro dominios de la región constante, en tanto que los últimos dos, Ml y M2, codifican el segmento hidrofóbico de 41 bases de la región C terminaL que es un remolque no traducido. La unión de empalme 5' con el exón 4 se enlaza con la unión de empalme 3' en el inicio de Ml. En la etapa de secreción, el RNA nuclear ternli.na después del exón 4. Se ignora la unión de empalme 5' en ese exón, la cual habfa estado relacion ada con la forma M 1 en la membrana, de modo de permitir que e l exón se extienda otros 20 codones. En otras regiones constantes se encuentra una transición similar de la forma de membrana a la secretada. La conservación de las estructuras de exón sugiere que el mecanjsmo es el mismo.

_ AAAA Empalme

El extremo 3' controla el uso de uniones de empalme, de manera que se expresen formas alternas del gen de cadena pesada.

La clase de inmunoglobulina se define por el tipo de región ew En la se resumen las cinco clases de Ig. La lgM (primera in.rnunoglobulina producida por alguna de las células B) y la IgG (la conocida) poseen la capacidad medular de activar al

Tipo

lgM

lgD

lgG

lgA

lgE

Cadena pesada

l.l

S

y

(X

€

Estructura

(l.l¡l¡)~J

02~

(<xll¡)¡J

Proporción

5%

1%

yll2 80%

~Lz <1%

Desarrollo de tolerancia (?)

Activa el Se encuentra Respuesta complemento en las secreciones alérgica

Función efectora Activa el complemento

14%

El tipo y función de la inmunoglobulina dependen de la cadena pesada. La J es una proteína de unión en la IgM; todos los demás tipos de Ig corresponden a tetrámeros. 23 .12 El cambio de clase es producto de la recombinación del DNA

587

complemento, y de ahf la destrucción de las células invasoras . La lgA se encuentra en las secreciones (como la saliva) y la lgf: se vincula con la respuesta alérgica y la defensa contra los parásiws. Todos los linfocitOs inician su vida productiva como célula~ inmaduras que participan en la síntesis de IgM, las células que la expresan tienen el arreglo de grupO del SegmentO del gen (H de linea gerrninativa que se muestra en la Figura 23.1 O. La reacción de j untura V-D-J desencadena la expresión del segmento del gen C~. En general, un linfodto produce sólo una clase de inmunoglobulina en un momento dado, pero dicha clase puede cambiar en el linaje celular. dicho cambio se llama cambio d e clase y se debe a la suslitución del tipo de región e" que se expresa. El cambio puede ser simulado por efectos ambientales, por ejemplo, el factor de crecimiento TGF~ causa un cambio de CP a C11• EL cambio se produce sólo en el segmento del gen CH: el mismo segmemo V11 sigue exptesdndose, de modo que un segmento dado del gen V" puede expresarse con éxito en combinación con más de un segmento del gen C11 . La misma cadena ligera continúa expresándose en todo e l linaje de la célula, por lo tanto, el cambio de dase permite modificar el tipo de respuesta efectora (mediada por la región C"), mientras se mantiene la rnisma capacidad de reconocimíemo de antígeno (mediada por las regiones V).

VDJ

Genes Regtones de cambio

¡1 ¡¡

11

Sy3

S·{ 1 Sy 2b

_

S.¡2a Se Sa,1S¡x2

¡

siJ ...,.. Recomblnación Sy1

-""'" ' ,.,. ,~ . . r ,. VDJ

fp fa. e

yf

o

-

DNA circular escindido

o.l o.2

-

S¡¡,y 1 S'(t!b S y 2a St 5(1.1 Sa2

' - - -...---- 1 s~. y

-

1 ...,..

Recomb~nación

"/,

Sal

t-

Se expresa el gen a.l - - - . VDJ

'12~ t

~

y2a

cx1 ~

H

Puede haber un cambio de clase de genes de cadena pesada por recombinación entre regiones de cambio (S), con deleción del material entre los sitios S de recombinación. Los cambios pueden ser sucesivos. 588

CAPÍTU LO 23 Diversidad inmunitaria

Los cambios en la expresión de segmentos del

gc11 Cu son de dos tipos; la mayor parte ocurre por sucesos adicionales de recombinación del DNA qu~: implican un sistema diferente del encargado de l< juntura V-D-J (que puede funcionar sólo en etapas posteriores del desarrollo de la célula B). El olrr tiene lugar en el ámbito del procesamiento del RNA . que en general se relaciona con el cambio de la secuencia C terminal de la región Cw más que con ur. cambio de clase (ver sección 23.1 L La expresión temprana de la cadena pesada puede cambiar poprocesamiento del RNA). Las células que se expresan en dirección desccncteme respecto de los segmenros del gen C11 lienen deleciones de C y de los otros segmentos géni•• cos que preceden al segmenlo expresado de d ich gen . El cambio de clase se debe a una recom bina· ción para ubicar un nuevo segmento del gen CH en yuxtaposición con la unidad V-D-J expresada. Las se::cuencias de las unidades V-D -J-eH modi ficadas muestran que los sitios de cambio, denominados regiones S, están en sentido ascendente respectr de los segmentos del propio gen ew En la se muestran dos cambios sucesivos. En el primer cambio, la expresión de e va se•• guida por la de C.11, segmento génico que es llevadc a la posición expresada por recombinadón emre los sitios S,, y S ,r El primero yace entre los segmentos génicos V-D-J y C~'. y Sr t' en dirección ascendente respecto del segmento del gen c.,,; emre los dos sitios de cambio, la secuencia de DNA se escinde como molécula circular. El modelo de deleción lineal impone una resrricción al Jocus del gen de la cadena pesada. una vez que se ha hecho un cambio d<

clase, es imposible expresar malquier segmento géníco cr que 11ttbiel'a residido emre e,, y el nuevo segme11to génic.-

c,r En el ejemplo de la Figu ra 23. 18, las células que

expresan C.11 deberían ser capaces de originar célula~ que expresaran C.13 , que ha sido eliminado. No obstante, debería ser posible realizar otro cambio a cualquier segmento del CH en sentido descendente respecto del gen expresado. En la Figura 23.18 se muestra un segundo cambio a la expresión de cf.( logrado por recombinación entre sa l y la región de cambio Su 1 1 generada con el cambio original. Se supone que IOdos los segmentos génicos e!: tienen regiones S en dirección ascendente respecto de las secuencias de codificaciou, pero no se sabe si hay alguna restricdón en el uso de las regiones S, que experimentan cambios secuenciales, si bien se ignora si son optativos u obligatorios para p roceder hacia los segmentos posteriores del gen CH. También sería imcrcsante saber si la !gM puede cambiar directameme a cualquier otra clase. Las re giones S yacen en los intrones que preceden a las

regiones de codificadón del gen Cw de modo que con el cambio no se modifica el marco de lectuca de la traducción.

El cambio se debe a una nueva reacción de recombinación Conceptos principales • Habrá un cambio por una rotura de la do ble cadena seguida de la reacción de unión no homóloga de extremos. • La característica importante de una región de cambio son las repeticiones invertidas. • EL cambio requiere de activación de los promotores que están en dirección ascendente respecto de los sitios de cambio. Se sabe que los sitios de cambio no se definen de una sola manera, pues diferentes células que expresan elliDSillO SegmentO génitO (H han ffiOStradO recombinación en puntos diferentes. La longilud de las regiones de cambio varía (según definen los límites de los sitios implicados en la recombinación) de 1 a lO kb; contienen grupos de repeticiones corras, invertidas, cuya longitud fluctúa entre 20 y 80 unidades de nucleótidos. La secuencia primaria de la región de cambio no parece ser importante, lo que interesn son las repeticiones invertidas. Una región S suele localizarse -2 kb en dirección ascendente respecto de un segmento del gen Cw La reacción de cambio libera el material esdndido entre los sitios de cambio como una molécula de DNA circular, para lo cual se requieren dos de las proteínas que intervienen en la fa se de unión de la recombinación de VD.J (y también en la vía de unión general de extremos no homólogos, NHEJ), Ku y DNA-PKcs, lo cual sugiere que la reacción de unión podría usar la vía NHEJ. Básicamente, esto implica que la reacción se debe a una fractura de la doble cadena seguida de una nueva unión de los extremos separados. En la generación de la fracwra de la doble cadena se pueden conjunrar las características de la reacción para proponer un modelo cuyos puntos críticos son: • Se requiere transcripción a través de la re gión S; • las repeticiones invertidas son cruciales, y • la fractura puede ocurrir en muchos sitios diferentes de la región S. En la se muestran las etapas de la reacción de cambio de clase. Un promotor (I) yace inmediatamente e n dixección ascendente respecto de cada región de cambio que implica la transcripción desde ese promotor. Este ú!Umo podría res-

pondera los activadores, que a su vez responden a las condiciones ambjentales, como la estimulación por citOcinas, lo cual da lugar a un mecanismo para regular el cambio . Así pues, la primera etapa en el cambio es la activación de los promotores I que están en dirección ascendeme respecto de cada una de las regiones de cambio que participan. Cuando esos promotores se activan, generan productos de transcripción estériles que se empalman para lmir a la región I con la correspondiente región constante de la cadena pesada. ' La clave para descifrar el mecanismo del cambio fue descubrir la necesidad de la enzima AID (desamlnasa de dtidina inducida por activación) , pues sin ella, el cambio de clase se interrumpe antes de la etapa de producción de ln hendidura. La mutación somática también resulta obstaculizada, lo cual muestra una conexión interesante entre dos procesos fundamentales para La diversificación inmunitaria (véase la sección 23.15, La mutadóo somática es inducida por la desaminasa de citidina y ia, glucosilasa de uracilo). La AID se expresa sólo en una etapa específica durante la diferenciación de los linfocitos B, lo cual restringe los procesos de cambio de da se y mutación somática a esta etapa. La AJD es miembro de una clase de enzimas que actúa en el RNA para convertir una citidina en uridina (véase sección 27.10, La

Expresión VDJ Genes Regiones de cambio Productos de transcripción empalmados

¡.¡.

- '

!

IS

1S

il VDJ11 l!t~~

fl¡t

Escisión

Escisión VDJ

Escisión

!e

lll 1 '

Unión VDJ

e

!!1

¡

Productos de transcripción empalmados

VDJe

El cambio de clase pasa por etapas bien definidas. Los promotores I inician la transcripción de productos estériles. Las regiones de cambio se escinden. Las regiones escindidas se unen. 23.13 El cambio se debe a una nueva reacción de recombinación

589

horquillas por la interacción entre las repeticíone< invertidas de la cadena desplazada que no sirve de molde, como se muestra en la , lo cu<; combinado con la generación de sitios sin bases er. esa cadena, podría llevar a la rotura. Dos imerrogantes críticas siguen sin respuesta ¿Cómo hace blanco el sistema en las regiones apropiadas dellocus de la cadena pesada? ¿Qué controla el uso de los sitios de cambio?

Repeticiones invertidas

l

Transcripción

HorquillaCadena~~

RNA

molde

Cadena molde

Cuando en la transcripción se separan las cadenas del DNA, una puede formar una repetición invertida si la secuencia es palindrómica .

edición del RNA ocurre en las bases individuales), pero su especificidad diferemc y actúa en el DNA de una sota cadena. Para el cambio de clase y la mutación somática también se requiere de otra enzima, la UNG, una glucosflasa de uradlo del DNA que elimina e l uracilo que genera la AlD por desaminación de la citidina. En los ratOnes con deficiencia de UNG, el cambio de clase disminuye 1O veces, lo cual sugiere un modelo en que las acciones sucesivas de AID y UNG crean sitios que han perdido una base en el DNA, con consecuencias diferentes en el cambio de clase y los sistemas de mutación somática. La fuente del DNA de una sola cadena, blanco de la AID, se genera por el proceso de transcripción estériL muy probablemente por exposición de la cadena de DNA que no es molde y que es desplazada cuando la otra se usa como m olde para la síntesis de RNA. Este fenómeno es respaldado por la observación de que la AJD hace blanco preferentemente en cilidinas de la cadena que no funciona como molde. Pa ra dar lugar a un cambio de dase, estos sitios se convienen en roturas de la cadena nudeotídica que proporcionan los sucesos de escisión que se muestran en la Figura 23.19. Los extremos rotos se unen con la vía .N HEJ, sistem a de reparación que incide en las roturas de la doble cadena del DNA {véase la sección 20.1 2, Un sistema común repara las rotu ras de la doble cadena). No se sabe aún cómo Jos sitios sin bases se convierten en roturas de do ble cadena; podría necesitarse el sistema de hidrato de silicato de magnesio (MSH) que participa en la reparación de apareamientos incorrectos del DNA, pues las mutaciones del gen MSH2 aminoran los cambios de clase. Una característica no explicada es la participación de las repeticiones invertidas; quizá se formen 590

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

La mutación somática genera otras diferencias en el ratón y el ser humano Conceptos princip;¡les • Los genes activos de inmunoglobulina tienen regiones Vcon secuencias que cambian respecto de la línea germinativa por mutación somática. • Las mutaciones ocurren como sustituciones de bases individuales. • Los sitios de mutación se concentran en los sitios de unión de antígeno. • El proceso de pende del reforzador que activa la transcripción en ellocus Ig.

Las comparaciones entre las secuencias de los genes de inmunoglobulina expresados y los segmen tos génicos V correspondiemes de la línea germinativa muestran que en la población expresada aparecen nuevas secuencias. Parte de esa diversidad adidonal es resultado de los cambios de secuencia en las junturas V-J o V-D-J ocurridos durante el proceso de recombinación, mientras que otros se presentan en ubicadón ascendente en sitios del dominio variable. Los cambios en las secuencias génicas V después de que se ha obtenido un gen funcional de ínmunoglobulina pot rearreglo son generados por dos tipos de mecanismos. En el ratón y el ser humano, dicho mecanismo es la inducción de mutaciones somáticas en localizaciones específicas del gen, en especial en el linfocito aclivo. El proceso suele llamarse hipermutactón. En polJos, conejos y cerdos, un mecanismo diferente aprovecha la conversión génica para cambiar un segmento del gen V expresado en la secuencia correspondiente de un gen V diferente (ver sección 23 . 16, Las inmun.oglobulinas aviarias se ensamblan a panir de seudogenes) . Para ident..iñcar los fragmenros correspondientes de la lfuea germinativa se puede usar una sonda que represente un segmento génico V expresado, cuyas secuencias deben identificar el repertorio completo disponible para el organismo. Cualquier gen expresado cuya secuencia sea diferente, debe haber sido generado por cambios somá ticos.

Asegurar que cada contribuyente potencial de los segmentos génicos V de la línea germinativa en realidad ha sido identificado constituye un proble ma. el cual se resuelve con la sencillez del sistema de cadena A. en el ratón. En una encuesta entre pacientes con mieloma, que producen cadenas Á.1, se observó que muchos tienen la secuencia del segmento único de línea germinativa, pero otros tienen nuevas secuencias que deben haberse generado por mutadón del

seomento génico de la línea germinaciva. Para determinar la [recuencia de la mutación somática en otros casos es necesario revisar gran número de células en que se exprese el mismo segmento génico V. Uu procedimiento práctico para identificar a ese grupo es caracterizar las inmunoglobulinas de una serie de células, todas con expresión de una respuesta inmunitaria ante un antígeno en particu lar. Los epítopos uti lizados para este fin son pequeñas moléculas, haptenos. cuya estructma definida posiblemente provoque una respuesta coherente, a diferencia de una proteína grande, de la cuaL diferentes panes producen anticuerpos diversos. Un hapreno se conjuga con una proteína no reactiva para formar el antígeno. Las células se obtienen por inmunización de ratones con el antígeno y recuperadón de linfodtos reactivos y, en ocasiones. por la fusión de esos linfocitos con el mieloma (tumor inmonal) para generar un hibridoma, que sigue expresando de manera indefinida el anticuerpo deseado. En un ejemplo. 1 O de 19 líneas celulares dilerentes que producen anticuerpos dirigidos contra el hapteno fosforilcolina. tenían la misma secuencia VH, que era el segmento T15 del gen V de la línea germinativa, uno de los cuatro genes VH relacionados. Los otros nueve segmentos génicos expresados diferían entre sí y de los cuaL ro miembros de línea germinativa de la familia; tenían una relación más estrecha con la secuencia de línea germinal Tl 5 que con cua lquiera de las orras. y sus secuencias flanco eran las mismas que rodean a Tl5, lo cual sugirió que ~e originaron en un miembro Tl S por mutación somática. En la se muesu·a que los cambios de secuencia se localizan en torno al segmento génico V, con extensión en una región desde -150 bp en dirección descendente respecto del promotor del gen V y abarcando -1 .5 kb; roman la forma de sustituciones de pares de nucleótidos individuales. Por lo general, hay -3 a -15 !>UStituciones, que corresponden a <1O cambios de aminoácidos en la proteína. Se concentran en el sitio de unión de antígeno (generando así la máxima diversidad para reconocer antígenos nuevos) . Sólo algunas de las mutaciones afectan la secuencia de aminoácidos, pues otras ya-

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2 kb

C

.. La mutación somática tiene lugar en la región que circunda al segmento Vy se extiende sobre Los segmentos VDJ unidos. ccn en posiciones de codificación de tercera base. así como en regiones no traducidas. La gran proporción de mutaciones ineficaces s ugiere que la mutación somá[ica es más o m e nos a leatoria en u na región que incluye e l segme n to génico V y que va más allá. Algunas mutaciones mues tran la tendencia a recurrir muchas veces. y podrían representar puntos calientes como resultado de alguna preferencia intrínseca del sistema. Al parecer, durante la proliferación donaL la mutación somática ocurre con una frecue ncia de ~ 1o-)/bp por generación celular. Casi la mitad de las células de la progenie gana una mutación, de manera que las células que expresan anticuerpos mutados se convierten en una fracción elevada del clon. En mucho~ casos se usa de manera sistemática una sola familia de segmentos génicos V para responder a un amígeno en particular. Supuestamente, ante la exposición a un antígeno. la región V con afinidad int1·ínseca más alta proporciona el punto de inicio, de modo que la mutación somática aumenta el repertorio. T...as mutaciones aleatorias tienen efectos impredecibles en la función proteínica; algunas la desactivan, en tanto otras le confieren alta especificidad para un anúgeno específico. La propordón y la eficacia de los linfocitos que responden aumentan por selección en la población de linfocitos de las células que Lienen anticuerpos en Jos cuales una m uta ción ha aumentado la afinidad por el antígeno.

La desaminasa de citidina y la glucosilasa de uracilo inducen la mutación somática Conceptos principale~ Para la mutación somática y para el cambio de clase se requiere de una desaminasa de citidina. • La actividad de glucosilasa de uracilo-DNA influye en el patrón de mutaciones somáticas. • Una hipermutación puede empezar por la acción secuencial de esas enzimas.

2,.15 La desaminasa de citidina y la glucosílasa de uracilo inducen la mutación somática

591

La mutación somática tiene muchos de los mismos requisitos que el cambio de dase (véase sección 23.13, El cambio ocurre por una reacción de recombinación nueva) : • La transcripción debe ocurrir en la región blanco (como en este caso, por La demanda del reforzador, que activa la transcripción en cada locus Tg); • se necesitan las enzimas AID y UNG, y • partidpa el sistema de reparadón de apareamiento erróneos de MSH. La forma en que el retiro de la base desaminada lleva a la muradón somática es sugerida por el experimento que se resume en la . Cuando la AID desamina a la citosina, genera uracilo, que entonces es retirado del DNA por la UNG. Normalmente, todas las posibles sustituciones ocurren en el sitio sin bases, pero si se obsrruye la acción de la glucosilasa de DNA-uracilo, el resultado será diferente. Si no se retirara el uradlo del DNA, tendría que aparearse con la adenina durante la replicación, y en última instancia, el resultado sería la sustitución de un par original C-G con uno T-A. La glucosilasa de DNA-uracilo se puede bloquear introduciendo en las células la codificación génica para

una proteína que inhiba la enzima. (El gen es un componente del bacreriófago PSB-2, cuyo genoma es poco común porque contiene uracilo, de manera que es necesario bloquear la enzima durante una infección por fago.) Cuando se introduce el gen en una línea de células linfocíticas es notorio el cambio en el patrón de mutaciones, pues casi todas incluyen la transición pronosticada de C-G a A-T. La clave de la generación de una variedad aleatoria de mutaciones es, por tanto, crear el sitio sin bases, y después se recluta el sistema de reparación MSH para escindir y sustituir la tira de DNA que contiene el sitio dañado. La posibilidad más sencilla es que si se sustituye por una polimerasa de DNA sujeta a error, podría haber mutadones. Otra posibilidad es que se creen tantos sitios sin bases, que los sistemas de reparación se vean rebasados. En caso de replicación, esto podría llevar a la inserción aleatoria de bases frente a los silios sin bases. No se sabe aún qué limita la acción de este sistema a la región blanco para la hipermutación. La diferencia en los sistemas es al final del proceso, cuando se introducen roturas de la doble cadena en el cambio de clase, pero se crean mutaciones puntuales individuales durante la mutación

Resultados experimentales

la desaminasa de ci11dina crea un parU-G

~

G

U

G

La glucosilasa de DNA-uracllo crea un sitio sin bases Patrón normal de mutación

En la replicación se insertan bases en forma aleatoria en dirección opuesta a la hendidura

rLa replicación de un par U-G causa transición deGaA

G -tA=48% G-+ C=39% G-+ T"' 12% G

La glucosilasa de DNA-uracilo G ES BLOQUEADA G~A=84%

G-+C=16% 1

Cuando la acción de la desaminasa de citidina (arriba) va seguida de la acción de la glucosilasa de DNA-uracilo se crea un sitio sin bases. La replicación más allá de ese sitio debe insertar las cuatro bases de forma aleatoria en la cadena hija (centro). Si no se elimina el uracilo del DNA. su replicación causa transición de C-G a T-A. 592

CAPÍTU LO 23 Diversidad inmunitaria

somática. No se sabe con exactitud donde divergen los sistemas. Una posibilidad es que las roturas se introduzcan en sitios sin bases durante el cambio de clase, pero que se reparen de manera errática en la mutación somática, o bien, que se introduzcan las roturas en ambos casos, pero se reparen en una forma susceptible de error en la mutación somática.

Las inmunoglobulinas aviarias se ensamblan a partir de seudogenes Ccncepto princíoal • En el pollo, un gen de inmunoglobulina se genera copiando una secuencia de uno de los 25 seudogenes del gen V de un locus activo único.

El sistema inmunitario del pollo es el paradigma para conejos, vacas y cerdos, que dependen del uso de la diversidad codificada en el genoma. Un mecanismo similar es utilizado por el locus único de cadena ligera (de tipo A.) y el de la cadena H. En la se incluye una interpretación de la organizadón del loct.rs A.; sólo tiene un segmento génico V iuo.cional, y los segmentos J y C. En dirección ascendente respecto del segmento VA1 se encuemran 25 seudogenes V).. organizados en cualquier orienraclón, los cuales han sido clasificados así porque presentan deleción de un segmento de codificación en uno o en ambos extremos, carecen de señales apropiadas para la recombinaci6n, o ambos. Esta asignación se confirma por el hecho de que sólo el segmento génico V._1 se recorobina con el segmento génico J-C._. Sin embargo, las secuencias de los segmentos génicos V..-J -e, con rearreglo muestran diferencias considerables. Un gen rearreglado tiene una o más posiciones en que han ocurrido varios cambios de secuencia. Casi siempre se puede encontrar una secuencia idéntica a la nueva en uno de los seudogenes (que no cambian) . Las secuencias excepcionales que no se encuentran en un seudogen siempre representan cambios en la unión de la secuencia o riginal y la modificada. Así, para generar diversidad se emplea un mecanismo nuevo. Las secuencias de los seudogenes, de entre 10 y 120 bp de longitud, se introducen en la región v~.c activa por conversión génica, en tamo que la misma no modificada no se expresa, ni siquiera en las primeras etapas tempranas de la respuesta inmunitaria. Es posible que Lln suceso de conversión tenga éxito cada diez a veinte di visiones celulares en todas las secuencias V 1.~ con rearreglo. Al término del pedodo de maduración inmunitaria,

una secuencia con esas caraeterfslicas cuenta con cuatro a seis segmentos compartidos que abarcan toda su longitud y que se derivan de diversos seudogenes donadores. Si todos los seudogenes participaran, ;las combinaciones posibles serían 2.5 x 103 ! La base enzimática para el copiado de secuencias de seudogenes en el locus expresado depende de las enzimas involucradas en la recombinación. además de que se relaciona con el mecanismo de hipermuración somática que introduce diversidad en el ratón y el hombre. Para el proceso de conversión génica se necesitan algunos de los genes implicados en la recombinación; por ejemplo, se evita por la deledón RAD54. Por otra parte, la deleción de diferentes genes recombinames (XRCC2, XRCCJ, y RAD51B) tiene otro efecto muy irrteresante, la mu tación somática del gen V en el locus expresado. La frecuencia de las mutaciones sornáricas es -lO mayor que la tasa usual de conversión génica. Estos resultados muestran que la ausencia de mutación somática en el pollo no se debe a una deftci encia de los sistemas emimáticos correspondiente del ratón y el hombre; la explicación más probable para una conexión (o su carencia) entre la recombinación y la mutación somática, es que las roturas no apareadas en ellocus desencadenan la inducción de mutaciones. Así pues, el motivo de la mutación somática en el ratón y el hombre, pero no en el pollo, pLrede estar en los detalles de la operación del sistema de reparación que actúa en las roturas dellocus. Es más eficiente en el pollo, de manera que el gen se repara por conversión ames de que puedan inducirse mutaciones.

25 seudogenes V

J

e

1

1!

v~-.1

o

Juntura V-J

La secuencia del seudogén sustituye la parte correspondiente

de V~ i

Ellocus A. de cadena ligera del pollo tiene 25 seudogenes Veh dirección ascendente respecto de la región funcional única V-J-C. Las secuencias derivadas de los seudogenes, sin embargo, se encuentran en genes activos V-J-C con rearreglo.

23.lé las inmunoglobulinas aviarias se ensamblan a partir de seudogenes

593

La célula B de memoria permite una respuesta secundaria rápida

Células madre en la médula ósea

Conceptos principales La respuesta primaria a un antígeno es montada por las células 8, que no sobreviven después del periodo de respuesta. Se producen células 8 de memoria con especificidad para el mismo antígeno, pero están inactivas.

SCID RAG1 ,2 etc.

Rearreglo del gen de lg

Células S

Una reexposición al antígeno origina la respuesta secundaria, en la cual las células de memoria se activan rápidamente.

Antrgeno Respuesta primaria

En este momento ya es posible resumir la relación entre la generación de a mi cuerpos m u y afines y la diferenciación de la célula B. En la se muestra que las células B se derivan de una po blación auLOrrcnovable de células madre de la mé dula ósea. La maduración para producir células B depende del rearreglo del gen Ig, que requiere de las funciones de los genes SC!D y RAG 1.2 (además de otros). Si se bloquea el rearreglo génico no se producen células 8 maduras. La especificidad de los anticuerpos que portan las células B depende de las combinaciones paniculares de las regiones V(D)J y de cualquier nucleótido adicional incorporado durante el proceso de unión. La exposición a un amígeno desencadena dos aspectos de la respuesta inmunitaria; la respuesta inmunitaria primaria se debe a la expansión clona! de células B en respuesta a un antígeno, con lo cual se genera un número importante de células plasmáticas específicas del a ntígeno; hay un cambio de isolipo para generar el Lipo apropiado de respuesta efectora. l.a població n de células encargadas de la respuesta primaria constitu ye un p un to te rminal. pues no viven más allá de la respuesta primaria misma. El fenómeno de la memoria de la célula B permite preparar para una respuesta iru:nunitaria secundaria . La mutación somática genera célulasB con mayor afinidad por el amígeno que no desenca denan una respuesta inmunitaria en ese momento. aunque podrían presentar cambios en el isotipo para seleccionar otras formas de la región C"; se almacenan como células de memoria con especificidad apropiada y tipo de respuesta efectora, pero no están activas, se activan cuando hay una nueva exposición al mismo anúgeno; el antígeno las selecciona de antemano, de modo que pueden montar una respuesta ~ecundaria muy rápida, sencillamente por expansión clona!; durante la respuesta secundaria no hay más muLacioncs somáLicas ni cambios de isolipo . 594

CAPÍTU LO 23 Diversidad inmunitaria

Célula B de memoria

Mutación somática • Cambio 1 deisotipo t

Expansión

••

clonal y

Células de memoria

cambio de lsotipo

1

~ Respuesta secundaria

-a •• 1

Expansión

clona!

't

Células plasmáticas

La diferenciación de la célula B se encarga de la inmunidad adquirida. Las células pre-B se convierten en células B por rearreglo del gen de Ig . La exposición inicial a un antlgeno provoca la respuesta primaria y el almacenamiento de células de memoria. la exposición subsiguiente a un antígeno provoca la respuesta secundaria de l¡¡s células de memoria.

Las vías que se resumen en la Figura 2 3.24 muestran el desarrollo de la inmunidad adquirida, esro es, la respuesta a un antígeno. Además de estas células. hay un conjunto independienre de células B llamado de células Ly-1, las cuales han pasado por un proceso de rearreglo del gen V y aparentemente se seleccionan para la expresión de un repertorio panicular de especificidades de anticuerpos. No presentan mutación somática ni respuesta de memoria, si bien podrían participar en la inmunidad natural, esto es, tener una capacidad intrínseca para responder ame cienos antígenos. La es una descripción más detallada del desarrollo de la célula B. El primer paso es la

Recombinación ~ DH-JH Se expresa la cadena ligera subrogada

Célula pre-B grande Recombinación ~ VH-DH JH

r

1x

107

Receptor pre-8 de la cadena pesada; cadena ligera ~ subrogada

células

Célula pre-B pequeña 2 x 1O' células

Célula B inmadura

~

El receptor de antígenos de la célula B consta de un tetrámero de inmunoglobulina (H1 L?) enlazado con dos copias del heterodímero de transducción de señal (Igo.~).

J.l expresada

•

2 x 10 células 7

Receptor B de cadena pesada; cadena ligera 11: KOA

Célula B madura 2 x 10S células

•

Receptor B de cadena pesada: cadena ligera ~o

JCOA

El desarrollo de la célula B procede en etapas secuenciales.

recombinación de los segmentos D y J de la cadena pesada J..i, que se logra por recombinación de V -D, que genera una cadena pesada J.l. Como se mostró antes, en la Figura 23 .13, pueden tener lugar varios sucesos de recornbinación, incluida una sucesión de rearreglos no productivos y productivos. Estas células expresan una proteína que simula una cadena A., llamada cadena ligera subrogada (SL), la cual se expresa en la superficie y se vincula con la cadena pesada ¡.¡ para formar el receptor pre-B; es similar a un complejo de inmunoglobulinas, pero no se comporta como ellas. La producción de la cadena J.l reprime la síntesis de la cadena SL y las células se dividen para convenirse en células pre-B pequeñas. A continuación, se expresa la cadena ligera y aparece una inmunoglobulina funcional en la superficie de las células B inmaduras; se presentan divisiones celulares adicionales y se añade la expresión de la cadena 8 pesada

a La de la cadena p, conforme las células se coman B maduras. Las inmunoglobulinas actúan tamo por secreción en las células B, como por expresión superficial. En la se muestra que el complejo activo de la super.fide celular se llama rece ptor d e la célu la B (BCR ) y consta de una inmunoglobulina vinculada con proteínas transmembrana llamadas Iga y lg~, las cuales proporcionan Los componentes de señalización que desencadenan las vías intracelulares en respuesta a una unión antígeno-anticuerpo. La activación de BCR también es influida por interacciones con otros receptores, por ejemplo, para mediar la interacción de células B activadas con anúgeno y células T auxiliares.

fDil

Los receptores de las células T tien en relación con las in munoglobuli nas

Conceptos principales • Las células T usan un mecanismo similar de unión V(O)J-C a las células B para producir uno de los dos tipos de receptor de células T. • En >95% de los linfocitos T se encuentra TCR o.~; la TCR yó se encuentra en <5 por ciento.

El linaje linfocítico constituye un ejemplo de oportunismo evolutivo; tamo en las células B como en las T se utiliza un procedimiento similar para generar proteínas con una región variable susceptible de dar lugar a una diversidad significativa, en tan-

23.18 Los receptores de las células T tienen relación con las inmunoglobulinas

595

t0 que las regiones constantes son más limitadas · contribuyen a una pequeña variedad de funcio ne< efectoras. Las célu las T producen uno de dos ti]} <.le receptor de céllllas T; estos receptores de célula T se sintetizan en momentos diferentes durante _ desarro llo de las células T, como se resume en é

l Sin rearreglo

Sin rearreglo

SloteSis do

·~{

El receptor yo se sintetiza al principio del desarrollo de la célula T; el TRC <X~ se sintetiza más adelante y se encarga de la inmunidad "clásica" mediada por células, en la cual se reconocen juntos los antígenos blanco y de histocompatibilidad del hospedador.

se organiza en la misma forma que los genes de inm:.. noglobulina, con segmentos separados que se juntan p: una reacció11 de recombi1tación específica dellinfodto. LCJ$

Organizactón de ratón y humana Vo.1-48V&Vo. Dó J~ C& J 111-1 00 /'o..

kb 140 120

...-1'-.

100

80

1

60

40

20

Resumen del u humano: 42 V 61 J Ellocus del TCRo: humano tiene segmentos o:

y S dispersos. Un segmento V6 se localiza en el grupo v.... Los

segmentos D-J-C6 yacen entre los segmentos génicos V y J-C11. Ellocus del ratón es similar, pero tiene más segmentos V6 •

Organización de ratón y hombre ~1 ~2 ~~ V <60

500 kb

DJC DJC 1 61 171

280 kb

30

20

1o

V

1

o

Resumen del p humano: 47 V, 2 D, 13 J Ellocus del TCR~ contiene muchos segmentos génicos Vdispersos en -500 kb que se encuentran -280 kb en dirección ascendente respecto de los dos grupos D-J-C. 596

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

El receptor yo se encuentra en <5% de Jos linf citos T; es sintetizado sólo en las primeras etapas d~ desarrollo de las células T. En rarones, es el únl... receptor detectable con <15 días de gestación, pe virtualmente se ha perdido para el momento de nacimiento, en el día 20. El TCR cx.P se en cuentra en >95% de los lirIocitos; se sinte tiza más tarde que el yo, durante ., desa rrollo de las células T. En ratones. empieza a S( detecta ble entre los días 15 y 17 de gestación. Par-2 el nacimiento, es el receptor predominan le, el cua es sintetizado por un linaje independiente de la células involucradas en la síntesis de TCR yo; impüc: eventos de rearreglo independientes. Como las inmunoglobulil1as, un TCR debe rec<.. nacer un antígeno extraño de estructura impredecible . El problema del reconocimiento de antígent. por las células By T se resuelve en la misma forme: y la organización de los receptores de la célula T "~ asemeja a la de los genes de inmunoglobulinas e; el uso de regiones variables y constantes. Cada loe:.

componentes son los mismos que se encuentran er. las tres familias de Tg. La organización de las proteínas del TCR simula la de las inmunoglobulinas; las secuencias V tienela misma organización interna general tanto en las proteínas lg como en el TCR. La región C de estt. ú ltimo se relaciona con las regiones constantes de Ig y presenta un solo dominio constante, seguid de porciones transmembrana y citoplásmicas. La es· u-uctura exón-intrón tiene relación con la funcióro proteínica. Las similitudes de organización de los genes dt TCR y con los de Ig es notOria. Como se resume er la , la organización del TCR a es similar a la de lg K, con segmentos del gen V separados de un conjunto de segmentos J que precede a un solc segmento del gen C. La organización dellocus ec similar en el ser humano y el ratón, con sólo algunas diferencias en cuanto a número de segmentos del gen Va y de J 0 • (Además de los segmentos a este locus también contiene segmentos qu e se describen brevemente.) Los componentes de TCR ~ son similares a lo~ de IgH. En la se observa que la organización es diferente, con segmentos del gen Y

o,

separados por dos grupos. cada un o de los cuales contiene un segmento D. varios segmentos J y un segmento del gen C. Tambit!n en este caso. las únicas diferencias cn1 re el ser humano y el ratón yacen en el nú m ero de unidades v11 y JP. La diversidad es generada por los mismos mecanismos que en la!> inmunoglobulínas; la imrínseca es r esultado de la combinación de una variedad de segmentos V. J, D, y C; cienas diferencias adicionales resultan de la introducción de nuevas secuencias en las uniones entre dichos componentes (en forma de nucleótidos P y N; véase la Fig. 23.14). Algunas cadenas TCR ~ incor poran dos segmentos D. generados por uniones D-D (dirigidas por una o rganización apropiada de las secuencias de nonámero y heptámero). Una diferencia ent re TCR e Ig es q ue la mutación somáLica no ocurre en los loci de TCR. Las determinaciones del grado de diversidad muestran que las 10 12 célul as T d ~ l ser h u mano contiene n 2.5 x 10 7 cadenas <X ciHc remes, relacionadas con 106 cadenas ~ diferentes. Posiblemente los mismos mecanismos participen en las reacciones de recombinación de genes de Tg en células B y genes de TCR en células T. Los segmentos del TCR recombinados son rodeados por secuencias de consenso nonaméricas y heptaméricas. idénticas a las que utilizan los genes de Ig, lo cual lleva a pensar seriamente que parúcipan las mismas enzimas. La mayor pane de los rearreglos quizá tenga lugar por el modelo de deleción (véase la Fig. 23.12). No se sabe cómo se controla el proceso de que los loci de Ig se rearregla n en las células B. en tanto q ue los receptores de células T se rearreglan en células T. La organización del locus y se asemeja a la de IgA., con segmentos génicos V separados de una serie de segmentos J-C. En la se muestra que ese locus tiene re l
o

Ratón

V

J1C 1

C2J2

J4C4

-. -- - .. - .... Dirección de la expresión

Ser humano

J1 C1 J2 c2

Y:-r

V

kb 100

80

60

40

20

Ellocus TCRy contiene un pequeño número de segmentos funcionales del gen V (y también algunos seudogenes no ilustrados) en dirección ascendente respecto de los loci J-C. segmemos V 5, algunos exclusivos del rearreglo 8, pero otros rambién se encuentran en rearreglos a . Se desconoce la base de la especificidad para la selección de segmentos V en los rearreglos a y ~; una posibilidad es que m uchos de los segmentos del gen V" pueden unirse al segmento DDJ5, pero que sólo a lgunos (definidos. por lo tanto, como V6) puedan proporcionar proteínas activas. Por el momenro, los elementos V que se encuentran en las cadenas han sido etiquetados como segmentos del gen V,; sin embargo, no es posible juzgar si son realmente exclusivos del rearreglo o. El arreglo disperso de genes implica que la síntesis de los receptores TCR ap y el recepror yo es mutuamente exclusiva en cualquier alelo, pues el locus ose pkrde por comple to cuando se presenta el rearreglo V"'-Jct. Los rearreglos en los loci de TCR, como los de los genes de iumunoglobulina, pueden ser productivos o no produCtivos. El locus Pmuestra exclusión alélica, muy parecida a la de Jos loci de las inmunoglobulinas; el remreglo se suprime una vez que se ha generado un alelo produ ctivo. Ellocus a puede ser diferente; varios casos de rearreglo continuo sugieren la posibilidad de que la sustitución de secuencias va podría continuar después de la generación de un alelo productivo.

o

f!D

EL receptor de La célula T actúa con el MHC

Concepto pñnc1pal

• El TCR reconoce un péptido corto unido a un surco de una proteína del MHC en la superficie de la célula presentadora. Las células T con receptores a~ se dividen en varios subtipos con d iversas funciones conectadas con in-

2U9 El receptor de la célula T actúa con el MHC

597

teraccíones emre células implicadas en la respuesta inmunitaria. Las células T citotóxicas poseen la capacidad de lisar una célula blanco infectada, en tanto que las células T auxiliares facilitan la eliminación del blanco mediada por la célula To la interacción antígeno-anticuerpo mediada por la célula B . Una diferencia importante entre los anticuerpos de las células By los receptores de las células Tes la íorma en que manejan el antígeno. Un anticuerpo reconoce una región corta (epítopo) en un antígeno. El receptor de la célula T se une a un péptido pequeño, de cuatro a cinco aminoácidos de longitud, procesado a partir del antígeno por reacciones de escisión. El fragmento peptídJco es HpresentadoN a la célula T por una proteína del MRC, de modo que la célula T reconoce de manera simultánea al antígeno extraño y a una prmeína del MHC que porta la célula transportadora, como se ilustró antes en la Figura 23.2. Tamo Jas células T auxiliares como las T asesinas actúan de esta forma, pero tienen d iferentes requerLmientos para la presentación del antígeno; en cada caso se utilizan tipos diversos de proteína del MHC (véase la secdón 23.20, Ellocus de histocomparibilidad mayor coctifica muchos genes del sistema inmunitario). Las células T auxi-

CD4- CDSRecombinación mediada por RAG Expresión de TCR~ TCRP se une a la. cadena o: subrogada

Expresión de preTCRa

CD4+

Se expresan CD4 y CD8

coa~

Expresión de TCRP

El desarrollo de la célula T procede en etapas secuenciales. 598

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

liares requieren de la presentadón del antígeno P• una proteína del MHC de clase lL en tanto que a la T asesinas les debe ser presentado por una proteír:~ de clase I del M.HC. El receptor TCR o.~ se encarga de la función cic: las células T auxiliares en la inmunidad humoral : de las células T asesinas en la inmunidad mectiad~ por células, de modo que tiene que reconocer ta.r: to el antígeno extraño como la proteína del MHC. del hospedador. La proteína del MHC se une a ur péptido cono derivado del antígeno extraño y e TCR reconoce entonces al péptido en un surco de: la superficie del MHC. Se dice que e l MHC prem> ta el péprido al TCR (el péptido se genera cuand e l proteosoma fragmenta la proteína extraña para producir segmentos de 8 a 10 moléculas de longitud) . DeLerrninado TCR tiene especi.ficidad para una proteína del MFIC en particular, así como para e amígeno extraño. La base para esa doble capaddaé es uno de los aspectos más interesantes que estár. por definirse acerca del TCR o.~. La recombinación para generar cadenas de TCR (uncionalcs se vincula con el desarrollo del línfocit(' T. según se resume en la . La primera etapa es el rearreglo para formar una cadena TCR ~ aaiva. que se une a una cadena a subrogada y sin rearreglo, llamada pre-TCR o.. En esta etapa _ el linfocito no ha expresado las proteínas de superfide CD4 ni CD8. El hererodímero pre-TCR se une entonces al complejo de señal CD3 (véase más adelante). Las señales del complejo desencadenan varios ciclos de división celular durante los cuales se rearreglan las cadenas o. y los genes CD4 y CDS se activan, de modo que el linfocito se convierte de CD4-cos- a CD4+Cos•, momento del desarrollo que se denomina selección ~ y genera tjmodtos DP. El rearreglo de la cadena a continúa en los timocitos DP y el proceso de maduración procede por selección positiva (para complejos de TCR maduros susceptibks de unir un ligando) y por selección negativa (contra complejos que interactúan con ligandos, propios, inadecuados). Ambos tipos de selección implican la interacción con proteínas del MHC. Los rimociros DP mueren después de -3 días o se convierten en linfocitos maduros como resultado del proceso selectivo. El heterodímero de superficie TCR ap presenta enlaces cruzados durante la selección positiva (lo que rescata a los timociros de la muerre). Si los timodtos sobreviven a la selección negativa subsiguiente, dan origen a las clases definidas de linfocitos T q11e son CD4' CD8- yCD4-C08•. El receptor de las células T se vincula con un complejo de proteínas llamado CD3 que participa en la transmisión de una señal que parte de la superficie de la célula hacia el interior cuando su

receptor re lacionado se activa por la unión con el antígeno. La imagen actua l de Jos componentes del complejo receptor de una célula T se ilustran en la . El punto importante es que la interacción de las regiones variables del TCR con el antígeno provoca que las unidades~ del complejo CD3 activen la respuesta de la célula T. La aclivación del CD3 constituye el medio por e l que 1os TCR <X~ o yo señalan que han reconocido un antígeno, fenómeno comparable con la constitución del receptor de la célula B, en el que la inmunoglobulina se vincula con las cadenas de señallga~ (véase la Fig. 23.26) . Aún no se resuelve un dilema clave sobre la función de la célula T. La inmunidad mediada por cé lu las implica dos procesos de reconocimiento; el del antígeno extraño requiere de la capacídad de responder a estructuras nuevas, en tanto que el de la proteína del MHC se limita, por supuesto, a una de las codificadas por el genoma, pero aún así, hay muchas proteínas del MHC diferentes, de modo que en ambas reacciones de reconocimiento, la diversidad requerida es considerable . Tanto las células T aux.iUares como las asesinas dependen de diferentes clases de proteínas del MHC; sin embargo, utilizan la misma reserva de segmentos génicos a y ~ para ensamblar sus receptOres. Incluso teniendo en cuenta Ja introducción de variaciones adicionales durante el proceso de regeneración de TCR, no se sabe cómo se ponen a la disposición suficientes versiones diferentes del receptor de células T como para satisfacer todas esas exigencias.

La reglón V del TCR reconoce al antlgeno

1·

La cadena t, es efectora Las dos cadenas del receptor de la célula T se vinculan con los polipéptidos del complejo CD3. Las regiones variables del TCR están expuestas en la superficie de la célula. Los dominios citoplasmáticos de las cadenas de (03 desempeñan una función efectora.

s

E

Ellocus de histocom pati bilidad mayor codifica muchos genes del sistema inmunitario

Conceptos principales • Ellocus del MHC codifica las proteínas de clases I y 11, así como otras del sistema inmunitario. • Las proteínas de clase I son los antígenos de trasplante encargados de distinguir entre tejidos "propios" y "ajenos". • Una proteína de clase I del MHC actúa como heterodímero con la ~z microglobulina. • Las proteínas de clase 1I participan en las intervenciones entre células T. • Una proteína de clase II del MHC es un heterodímero de cadenas a y ~·

El locus de histocompatibilidadmayor ocupa un pequeño segmento de un cromosoma en el ratón (que se llama Jocus H2) y en el hombre (llamado J.ocus HLA); en dicho segmento hay muchos genes que codifican funciones relacionadas con la respuesta inmunitaria. En loci génkos individuales cuyos productos han sído identificados se encontraron muchos alelas en la población; ellocus se describe como altamente polímórfico, es decir, que cada genoma tal vez sea diferente de los demás. Los genes que codifican otras funciones también se localizan en esa región. Los anrígenos de histocompatibilidad se clasifican en tres tipos, según sus propiedades inmunitarias, además de que otras proteínas que se encuentran en linfocitos y macrófagos tienen una estructura relacionada y son importantes para la funció n de las células del sistema inmunitario; Las proteínas de clase 1 del MHC son antígenos d e trasplante y se encuentran en todas las células de los manúferos. Como su nombre sugiere, se encargan del rechazo de tejidos extraños, que se reconocen como tales en virtud de su arreglo espeáfico de antígenos de trasplante. En el sistema inmunitario deben estar en células blanco para la xespuesta mediada por células. Las proteínas de clase I se definen serológicamente (por sus propiedades antigénicas). La clase 1 de genes murinos codifica las proteínas H2-K y H2-D /L. Cada cepa de ratones tiene uno de varios posibles aletos para cada una de esas funciones. Las funciones de la clase I humana incluyen los antígenos de trasplante usuales, HLAA, By C. Las proteínas II del MHC se encuentran en la superficie de los linfocitos B y T, asf como de los macrófagos. Estas proteínas panicipan en la comunicación emre células, necesaria para ejecutar

23.20 El locus de histocompatibilidad mayor codifica muchos genes del sistema inmunitario

599

la respuesta inmunitaria; en particular, son necesarias para la función de las célu las T auxiliares. Las funciones de la clase II murina se defi¡;¡en genética mente como I-A e !-E. La región de cla.se rr humana (también Llamada HLA-D ) está dispue-sta en cuatro subregiones, DR, DQ, DZ/DO, y DP. Las proteínas del co m plemento se codifican en un locus que también se conoce como región S, por suero, o sea que son component•:::s séricos. Su fun ción es interactuar con complejos antígeno-anticuerpo para dar lugar a las lisis de céllulas en la vía clásica de la respuesta humoral.

las proteínas de los loci Qa y Tia se encuentran en células hematopoyétícas murinas; se les conoce como antígenos de di[erenciación porque cada una se encuentra sólo en un subgrupo específico de células sanguíneas, supuestament,;: relacionada con su función. Tienen vínculos estructurales con las proteínas H2 de clase I y. como el!las, son polimódicas. Ahora es posible relacionar los tipos de proteínas con la organización de los genes que las codifican. La región del M.BC originalmente se definió por vía genética en el ratón, donde la región clásica H2 ocupa 0.3 unidades de mapa. Aunada él la región adyacente, donde también se encuentran mutadones que afectan a la función inmunitaria, corresponde a una región de -2 000 kb del DNA, la cual ha sido secuenciada completamente en varios mamíferos, así como en aves y peces. Comparando estas secuencias se llega a la conclusión de que, en generaL la organización ha sido conservada. En la se Tesume la organización genérica del ratón y del hombre. Las regiones ge-

nómicas en que se localizan los genes de clases J -

n marcan los límites originales del locus (que va_ en di recdón de telómero a centrómero; de derecta izq uierda, como se muestra en la figura ). Los genes de la región que separa a los de clase I y los ¡f_ clase JI codifican para muy diversas funciones, e la llamada región de clase liT. La definición de 1 extremos dellocus varía en (unción de la espedc y la región que se encuentra más allá de los gene de clase I, del lado telomérico, se denomina regü~ extendida de clase r. Asimismo, la región que esr.: más allá de los genes de clase TI, del lado centrfl -

mérico, se denomina región extendida de clase [ La principal diferencia entre el ratón y el homb!'" es que, en el ratón, la región extendida de clase ~ contiene a lgunos genes de clase I (f12-K). En las regiones del MHC de Los mamíferos ha· varios cienros de genes, pero es posible que much · menos sean los que proporcionan las funciones de MHC, como en el caso del pollo. que tiene 92 kb : sólo nueve genes. Como en las comparaciones de otras familia_ génicas, hay tüferencias en cuanto al número exac~ to de genes dedicados a cada función. Ellocus deMHC muestra amplias variaciones entre individuo> de modo que el número de genes puede ser diferente en sujetos diferentes. Como regla general, !>ir.: embargo, el genoma de ratón tiene menos gene• H2 activos que el humano. Los genes de clase rr sor. exclusivos de los mamíferos (excepto un subgmpo¡ y como regla, en aves y peces, diferentes genes ocupan su 1ugar. Hay -8 genes de da se I funcio nales er. el ser humano y -30 en el ratón. La región de claseI también incluye muchos otros genes. Las regiones

.' Codifica la clase 1 del MHC

480Mb

Codifica la clase 11 de1l MHC

700Mb

Cod'íñca muchos genes no relacionados

860Mb

Codifica la clase 1 del MHC

Clase 1 extendida

Reglón 11 extendida 845 Mb

100 kb

700Mb ~Ufl1&1

960Mb

Telómero

La reglón del MHC cubre >2 Mb. Las proteínas del MHC de clases I y II son codificadas por dos regiones separadas. la región de clase III se define como el segmento que las separa. Las regiones extendid.as describen segmentos sinténicos a cada lado del grupo. la principal diferencia entre el ratón y el ser humano son los genes H2 de clase I en la región extendida, a la izquierda. Ellocus murino se localiza en el cromosoma 17 y el humano, en el 6.

600

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

de clase m son muy similares en seres humanos y ratones. Todas las proteínas del MHC son dímeros loca lizados en la membrana plasmática, con una parte importante que protruye en el lado exrracelular. Las estructuras de las proteínas de clases I y U del MHC están relacionadas, aunque presentan düerentes componentes, como se resume en la Los antígenos de clase U constan de dos cadenas, a. y~. cuya combinación genera una estructura global en la cual hay dos dominios extracelulares. Todas las proteínas de clase l del MHC constan de un dímero entre la propia cadena de clase 1 y la proteína ~2-microglob ulin a. La cadena de clase I es un componente transmembrana de 45 kD con nes dominios e x te rnos (cada LlltO de -90 anünoácidos de longiwd, uno de los cuales interactúa con la ~2 -microglobulina), una región t ransm embrana de -40 fragmentos y un dominio citoplásm.ico de -30 fragmentos que reside en el interior de lacé lula. La ~2 microglobulina es una proteína secretada de 12 kD necesaria para transportar la cadena de

Clase 1

Clase 11

clase 1 a la superficie de la célula. Los ratones que carecen del gen ~2 de la microglobulina no tienen antígeno de clase I del MHC en la superficie celular. La organización de los genes de clase I, resumida en la . coincide con la estructura proteínica. El primer exón codifica una secuencia señal (escindida de la proteína durante el paso por la membrana). Los siguientes tres exones codifican a cada uno de Jos dominios externos. mientras que el quinto hace lo propio con el dominio transmembrana. Los últimos tres exones, bastante pequeños,

codifican juntos al dominio citoplásmico. La única diferencia en los genes de antfgenos de trasplante humanos es que su dominio citoplásmico es codificado sólo por dos exoncs. El exón que codifica el tercer dominio externo de los genes de clase 1 está muy conservado respecto de los otros, y quizá represente la región que interactúa con la ~2 microglobulina. lo cual explica la necesidad de una estnJCtura constante. Ese dominio también muestra homologías con los dominios de la región constante de las inmunoglobulinas. ¿Qué se encarga de generar el alto grado de polimorfismo de esos genes? Casi todas las varia dones de secuencias entre alelos ocurre en el primero y segundo dominios externos, a veces asumiendo la forma de un grupo de sustituciones de bases en una pequeña región. Un mecanismo implicado en su generación es la conversión entre genes de dase l; hay tamo seudogenes como genes funcionales. El gen de la ~2 microglobulina se localiza en un cromosoma separado; tiene cuatro cxones, el pri mero de los cuales codifica una secuencia señal; el segundo, para la mayor parte de la proteína (de los aminoácidos 3 a 95); el tercero para los últimos cuatro aminoáddos y pane del remolque no traducido, y el resto, para la parte restante del remolque.

Clase 11

1[

a.

Clasell~

ii ..-

13 microglobulina Exones

Los antígenos de histocompatibilídad de clases 1 y Il tienen una estructura relacionada. Los antígenos de clase I constan de un solo polipéptido (ex) con tres dominios externos (a.l, a.2, a.3) que interactúa con la microglobulina ~2 (¡32m). El antfgeno de clase 11 consta de dos polipéptidos (a. y (3). cada uno con dos dominios (<Xl y <X2. ~1 y ~2) y una estructura global similar.

ii Lideres Extracelulares Transmembrana

No traducidos Citoplasmáticos

Cada clase de genes del MHC tiene una organización característica en que los exones representan dominios proteínicos individuales.

23.20 Ellocus de histocompat:ibilídad mayor codifica muchos genes del sistema inmunitario

601

La longitud de la P2 minoglobo lina es simílar a la de un gen V de inmunoglobulina, con ciertas similitudes en cuanto a constitución de aminoáddos, y algunas homologías (limitadas} de la secuencia de nucleótidos entre la P2 microglobulina y los dominios constantes de Ig o el tercer dominio e-xterno del gen de tipo T. Todos los grupos de genes descritos en este capítulo pueden haber descendido de un ancestro común que codificaba un dominio primitivo.

La inmunidad innata utiliza las vías de señal conservadas Conceptos principales • La inmunidad innata se desencadena por receptores que reconocen segmentos (PAMP) altamente conservados en bacterias u otros agentes i nfectantes. • Suelen usarse receptores similares a tragamonedas para activar la vía de respuesta. • Las vías se conservan mucho de invertebrados a vertebrados y se encuentra una vía análoga en las plantas.

La respuesta inmunitaria descrita en este capítulo comprende un conjunto de reacciones que se presentan ame un patógeno por selección de linfodtos (células B o T) cuyos receptores (anticuerpos o TCR) lienen gran afinidad por el patógeno . La base de este proceso selectivo es la generación de un número muy considerable de receptores, como para dar lugar a una elevada posibilidad de reconocer una molécula extraña. Los receptores que reconocen Jas proteínas propias del cuerpo son motivo de exclusión en e tapas tempranas del proceso. La activación de los receptores de las células B desencadena las vías de la respuesta humoral, en tanto que la de receptores de las células T, desencadena las vías

Organismo

Patógeno

Localización

Todas las bacterias

Formilmetionina

Casi todas las proteínas

La mayor parte de las bacte rias

Peplldoglucano

Pared celular

Bactenas gramnegativas

Upopolisacárido

Pared celular

Levaduras

Zymosan

Pared celular

Los patrones moleculares relacionados con pa-

tógenos (PAMP} son compuestos comunes a muchas variedades de bacterias o levaduras; se exponen en caso de infección . 60 2

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

de la respuesta med iada por células. La respueglobal ante un anúgeno a través de la selecci.óyreceptorcs de los linrocitos se denomina inmu: dad adaptativa (o inmunidad adquirida). := generaL la respuesta se monta durante varios d después de la activación inicial de las células B que reconocen el patógeno extraño. El organisconserva una memoria de respuesta que le perrr. reaccionar más rápidamente si vuelve a expone al mismo patógeno. Los principios de la irununic : adaptativa son similares en tOdos los verrebrad aunque varían en detalles. Otro tipo de respuesta inmunitaria ocurre r. rápidamente y se encuentra en una mayor varied.: de animales (entre otros, los que n o tienen innnidad adaptativa) . La imnunidad innata dcper. del reconocimiento de cienos patrones predefinic en los patógenos extraños. los cuales se han co servado patógeno~ porque so n esenciales para función, pero no se en cuentran en las e ucario~ ­ más elevadas. Por lo genera l, el segmento es rec nocido por un receptor ded icado a desencaden.: la respuesta innata ame una infección, el cuaJ ~ encuentra en células como los neutrófilos y los ru.;crófagos, que hacen que el patógeno sea fagocita(;. y eliminado. La respuesta es rápida porque el cojunto de receptores ya está en las células y no tie..que amplificarse por selección, está muy conserva y se encuentra en todo tipo de organismos, deSumoscas hasta el ser humano. Cuando la respues;: innata puede enfrentar eficazmente una infecdóla respuesta adaptativa no se desencadena. Hay de·ra superposición entre las respuestas porque activ~ ­ aJgunas de las mismas vías, de manera que las céh.· las activadas por la respuesta il1nara pueden partidpa r después en la respuesta adaptativa. Los segmentos que desencadenan la inmunida innata suelen denominarse patrones mo lecularerelacionados con patógenos (PAMP), y en la se observa que están ampliamente distribuidt : en una amplia gama de organismos. La fo rnúlmetionina se usa para iniciar casi todas las proteína~ bacterianas, pero no se encuentra en las eucariota~ El peptidoglucano de la pared ce lular es exclusi\'t de las bacterias, en tanto que el lipopolisacárido (LPS) es un componente de la membrana externc. de la mayor pane de las bacterias gramnegativas que también se conoce como endotoxina; causa del síndrome de choque séptico. Un descubrimiento clave de la naturaleza de la inmunidad innata fue la participación de los receptores de peaje (TLR); el que se relaciona con e. receptor ILl de los mamíferos, desencadena la vía en el género Drosophila, donde con trola el desarrollo dorsal-ventral. Esro lleva a la activación del (acto;-

de transcripción dorsal. miembro de la familia Rel que se vincula con el factor NF-KB de los manúferos. La vía de la inmunidad innata es paralela a la vía de peaje. con componentes similares. De hecho, uno de los primeros indicios de la naturaleza de la inmurudad innata en la mosca fue el descubrimjemo del factor de transcripción Dif (factor inmunitario relacionado-dorsal), que es aCtivado por una de esas vías. Las moscas no tienen sistema de inmunidad adaptativa pero son resistentes a las infecciones microbianas porque sus sistemas inmunitarios innatos desencadenan la síntesis de potentes péptidos amimicrobianos, de los cuales se han identificados siete diferentes en el género Drosophila, que se sintetizan en el cuerpo graso (órgano equivaleme al hígado); dos de los pépLidos son antimicóticos y cinco actúan sobre todo en bacterias. La forma en que general mente actúan es asesinar el organismo blanco por pcrmeabilización de su membrana. Estos péptidos se codifican en genes cuyos promotores responden a los factores de transcripción de la familia Rel. En la se resumen los componentes de las vías innatas del género Drosophíla. En el género Drosoplllla actúan dos vías de respuesta innata; una responde principalmente a hongos, en tanto que la otra hace lo propio sobre todo contra bacterias gramnegativas; las baCterias grampositivas pueden desencadenar ambas vías. En la se resumen los pasos de cada u na. Los hongos y las bacterias grampositivas activan una cascada que genera péptidos activado res de TLR. vía similar a la de NF-K.B. El receptor de peaje activa al factor de transcripción Dif (pariente del NF -lC.B), que en úllima instancia conduce a la activación del péptido antimicótico, drosomisi.na. Las bacterias gramnegativas desencadenan una vía a través de un receptor diferente que activa el factor de tram.cTipción Relish, que lleva a la producción del péptido bactericida, actacina. Esta vía se denomina Imd po( uno de sus componentes, una proteína que tien e un "dominio mortal" relacionado con los encontrados en las vías de la apoptosis. Los agentes clave de la respuesta a las bacterias son proteínas llamadas PGRP debido a su gran afinidad con los pepridoglucanos bacterianos, de las cuales hay dos tipos. Las PGRP-SA son proteínas extracelulares cortas que probablemente acrúan por activación de proteasas que desencadenan la vía de peaje. Las PGRP-LC son proteínas transmembrana con un domiruo extracelular PGRP pero su función exacta se desconoce. La respuesta i11mu·nitaria innata está muy conservada. Los ratones resistentes al choque séptico presentan mutaciones en el receptOr de peaje TI..R4

La bacteria tiene PAMP

Péptidos activados LLR extracelular (Región rica en leucína) Receptor de peaje (TLR)

Factor de transcripción de la familia Rel Péptidos bactericidas y antimicótioos Los péptidos permeabilizan la bacteria la inmunidad innata es desencadenada por PAMP. En la mosca da lugar a la producción de péptidos que activan los receptores de peaje. los receptores conducen a una vía que activa un factor de transcripción de la familia Re!. Los genes blanco para ese factor incluyen péptidos bactericidas y antimicóticos, que actúan por permeabitización de la membrana del organismo patógeno.

\

Hongos

Bacterias

:::2~r· 1

Proteas: : Péplidos , Peaje

~

~

PGRP-SA

Receptor de peaje (TLR)

Via similar a la de

NF-~eB

~

Vía lmd

~ Dorsal

..

Bacterias

~ Factor de transcripción de la lamilia Rel

Péptidos . . bactericidas y Drosomtctna antimícólicos

Aelish

tSAlacína

Una de las vías de inmunidad innata del género

Drosophi/a tiene relación estrecha con la vía para la activación NF-KB de los mamíferos; la otra tiene componentes relacionados con las vías de la apoptosis.

23.21 La inmunidad i nnata utiliza las vías de señal conservadas

603

cuando son rratados con LPS. Un homólogo humano del receptor de peaje puede activar algunos genes de respuesLa inmunitaria, lo cual sugiere que la vía de la inmunidad innata puede también funcionar en el hombre. La vía de dirección descen dente respecto de TLR suele ser similar en todos los casos y por lo general lleva a la activación del factor de transcripción NF-KB. Aún no se sabe si la vía de dirección ascendente se conserva y. en particular, si los PAMP actúan por generación de ligandos que a su vez activan los TLR, o si podrían interacTuar directamente con eUos. La vía de dirección ascendente de TLR es diferente en mamíferos y moscas porque los patógenos activan directamente los TLR de los mamíferos. En el caso del LPS, el patógeno se tUle a la proteína CD 14 de superficie, lo cua l permite que CD 14 active a TLR4 y desencadene la vía de respuesta hmata. Hay -20 receptOres en la claseTLR del genorna humano. indicio de cuantos patógenos pueden desencadenar la respuesta innata. Las planras tienen amplios mecanismos de defensa, entre los cuales hay vías análogas a la res puesta innara en animales. Es aplicable e1 mismo principio de que los PAMP son segmentos que idcnufican al agente como patógeno. Las ptoteínas que responden a los patógenos son codificadas por una clase de genes llamada de resistencia a la enfermedad, muchos de los cuales codifican para receptores que comparten una propiedad con la dase TLR de receptores en animales, el dontinio extracelular tiene un segmento llamado región rica en leu.cina (LLR) . El mecanismo de respuesta difiere del de las células animales y se dirige a la activación de una cascada cinética de proteínas activadas por mitógenos (MAPK) . Muchos patógenos diferentes activan la misma cascada, lo cual sugiere que diversas interacciones patógeno-receptor convergen en la activación del primer MAPK, o ames.

fDll

Resumen

Las inmunoglobulinas y los recepwres de células T son proteínas con funciones análogas en la participación de las células B y Ten el sistema inmunitario. Una Ig o una proteína TCR se genera por rearreglo dd DNA en un solo linfociro; la exposición a un antígeno reconocido por Ig o por TCR lleva a la expansión donal para generar muchas células con la mtsma especificidad que la original. Muchos rearreglos ocurren en etapas tempranas del desarrollo del sistema inmunitario, de modo que se crea un gran repenorio de células de diferentes espedficidades. 604

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

Cada proteína inmunoglobulina es un tetrán. ro que contiene dos cadenas ligeras idénticas y d cadenas pesadas idémicas. Un TCR es un díme~ que comienc dos cadenas diferentes. Cada cadepolipeptidica se expresa por un gen creado por e· lace de uno de muchos segmentos V a través segmentos D y J con uno de unos cuantos segme-~ ­ tos C. Las cadenas lg L (K o A. ) tienen la estruct- ra general de V-J-C; las lg H tienen una esrrucuV-D -J-C, en tanto que TCR ex y y tienen comp nenres del tipo de las cadenas lg L; TCR S y ~ s similares a las cadenas H de lg. Cada tipo de cadena es codificado por un gn grupo de genes V separados del grupo de segment D. J y C. Los números ue cada Lipo de segmenLo y~ organización son diferemes para cada tipo de cadt na, pero el principio y el mecan.ismo de la recoml:> nación parecen ser iguales. Las mismas secuenci.: de consenso de nonámero y heptámero panicipa en cada rccornbinación; la reacción siemp re ill'plica unión de un consenso con espaciamiento l _ 23 bp y un consenso con cspac.iamiento de 12 t-: La reacción de escisión es cata !izada por las protcnas RAGl y RAG2, en tanto que la de unión lo ro por la misma vía NHEJ que repara las roturas c. doble cadena en las células. El mecanismo de a ~.:­ ción de las proteínas RAG tiene relación con -= a(dón de recombmación específica de sitio catalizc.da por las resolvasas. Por la unión de diferentes segmemos V, D. J a un segmento C se genera una gran diversidad sin embargo, durante el proceso de recombinadór se introducen variaciones adicionales en forma óc cambios en las uniones en nes segmentos, así coro también se inducen cambios en los gene.s de irum;noglobnlina por mutación somática, que requiere las acciones de la dcsaminasa de citidina y la glucosilasa de uradlo. Las mutaciones ind ucidas po; la desaminasa de dtidína posiblemente lleven a le. eliminación del uracilo por la glucosilasa de uracUC' seguida de la inducción de mutaciones en los sitio~ donde hay ausencia de bases. La exclus ión alélica asegura que un linfocito determinado simeLice sólo una Tg o un TCR. Ur. rearreglo productivo inhibe la aparición de rearreglos adicionales El uso de la región V depende de. primer rearreglo produC[ivo, pero las células B dejan de usar los genes cli de la cadena ').l inicial por una de las cadenas H coctificadas más adelante en dirección descendente. Ese proceso implica un tipo diferente de recombinación en el que las secuencia(; entre la región VDJ y el nuevo gen CH presentan deleción. El uso del gen CH da lugar a más de un cambio. El cambio de clase exige 1a misma desaminasa de citidina que se necesita para la mutación so-

mática, pero se desconoce su función. En una etapa previa de la producción de Ig, se pasa de la síntesis de una versión unida a membrana de la proteína a una versión de secr~ción. Esos cambios se logran por escisión alterna del producto de transcripción. La inmunidad innata es una respuesta desencadenada por receptores cuya especifiddad está predeterminada para ciertos segmentos comunes en bacterias y otros agentes infecciosos. El receptor que desencadena la vía e~ por lo general miembro de la da se de peaje y la vía simula la desencadenada por esos receptores durante el desarrollo embrionario. La vía culmina con la activación de factores de transcripdón que dan lugar a la expresión de genes cuyos produ cLos de!>activan al agente infeccioso, en general por pcrmeabilización de su membrana.

Elll

La recombinación inmunitaria utiliza dos tipos de secuencias de consenso

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CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

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EJID

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f!D

La desaminasana de citidina y la gtucosilasa de uracilo inducen la mutación somatica

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sm

Las inmunoglobulinas aviarias se ensamblan a partir de seudogenes

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La célula B de memoria permite una respuesta secunda ria rápida

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fJID

m

El receptor de la célula T actúa con el MHC

ce

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E

Ellocus de histocompatibilidad mayor codifica muchos genes del sistema inmunitario

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La inmunidad innata utiliza las vías de señal conservadas

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Artlcutos de iovest1gac1ón Los receptores de las células T tienen relacion con las inmunoglobu\inas

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Refere ndas

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608

CAPÍTULO 23 Diversidad inmunitaria

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Promotores y potenciadores ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción las polimerasas de RNA eucarióticas constan de muchas subunidades • La polimerasa de RNA T sintetiza RNAm en el nucléolo. • La polimerasa de RNA 11 sintetiza RNAm en el nucleoplasma. • La polimerasa de RNA m sintetiza RNA pequeños en el nucteoplasma. • Todas las polimerasas de RNA eucarióticas tienen -12 subunidades y son agregados de >500 kD. • Algunas subunidades son comunes a los tres tipos de polimerasas de RNA. • la subunidad más grande de la oolimerasa de RNA II tiene un dominio carboxilo terminal (CTD) constituido por múltiples repeticiones de un heptámero.

los elementos promotores se definen por mutaciones y vestigios • Los promotores se definen por su capacidad para provocar la transcripción de una secuencia agregada a un sistema de prueba apropiado in vitro o in vivo.

la poli merasa de RNA I tiene un promotor bipartido • El promotor de la polimerasa de RNA 1 consta de un promotor medular y un elemento de control en flujo ascendente (UPE). • El factor UBFl envuelve al DNA con una estructura protelnica para acercar el centro y el UPE. Et SL1 incluye el factor TBP QUe participa en el inicio por las tres polimerasas. la polimerasa de RNA se une al complejo UBFt-SLl en el promotor medular.

la polimerasa de RNA Ill utiliza promotores en flujo ascendente y descendente • La polimerasa de RNA III tiene dos tipos de promotores. Los promotores internos tienen secuencias de consenso cortas dentro de la unidad de transcripción y producen inicio a una distancia fija de flujo ascendente. • Los promotores de Rujo ascendente contienen tres secuencias de consenso cortas en flujo ascendente respecto del punto de inicio, donde se unen los factores de transcripción.

El TF111 B es el factor de encargo para Los promotores de la Pol III • El TF111 A y TFmC se unen a la secuencias de consenso y permiten al TF, 116 unirse en tos puntos de inicio.

• El TF,11 B tiene a TBP como una de sus subunidades y permite la unión de la polimerasa de RNA.

El punto de inicio de la polimerasa de RNA II • La polimerasa de RNA II requiere de factores generales de transcripción (llamados TF 11 X) para iniciar la transcripción. • los promotores de la polimerasa de RNA li tienen una secuencia corta conservada Py~ CAPys (el InR de inicio) en el punto de inicio. • La caja TATA es un componente común de los promotores de la polimerasa de RNA Il y está constituido por un octámero rico en A-T localizado -25 bp en flujo ascendente respecto del punto de inicio. • El DPE es un componente común de los promotores de la polimerasa de RNA II que no tiene caja TATA. • Un promotor medular de la polimerasa de RNA li incluye el lnR y la caja TATA o un DPE.

la TBP es un factor universal • La TBP constituye un componente del factor de posicionamiento necesaria para que cada tipo de polimerasa de RNA se una a su promotor. • El factor para la polimerasa de RNA 1l es TF11 D, que consta de TBP y 11 TAF, con una masa total de -800 kD.

la TBP se une al DNA de forma inusual • El TBP se une a la caja TATA en el surco menor del DNA Forma una silla de montar en torno al DNA y lo dobla -ao•. Algunos de los TAF simulan histonas y podñan formar una estructura parecida a un octámero de histona.

El aparato basal se ensambla en el promotor • La unión de TF110 a la caja TATA es el primer paso del inicio. • Otros factores de transcripción se unen al complejo en un orden definido, aumentando, así, la longitud de la región protegida en el DNA. Cuando ta polimerasa de RNA Il se une al complejo, empieza ta transcripción.

El inicio va seguido de la depuración del promotor Para disolver et DNA y permitir el traslado de la polimerasa, se necesitan TF0 Ey TF11 H. • La fosforilación del CTD podña ser necesaria para que se inicie la elongación. Para terminar un inicio abortivo, se requiere de fosforilación adicional del CTD en algunos promotores. • El CTD puede coordinar el procesamiento del RNA con la transcripción.

Continúa en la siguiente página

609

Una conexión entre transcripción y reparación

fZim

Los genes transcritos se reparan de manera preferencial cuando se daña el DNA. • El TFuH proporciona ligamiento para un complejo de enzimas de reparación. Las mutaciones del componente XPO de TF11H causan tres tipos de enfermedades humanas.

los elementos de secuencia corta se unen a activado res

m

fZII

• Un potenciador activa al promotor más cercano, es decir, a cualquier distancia en flujo ascendente o descendente respecto del promotor. Un UAS (secuencia de activador ascendente) de las levaduras se comporta como potenciadot, pero funciona sólo en flujo ascendente respecto del promotor. • En potendadores y promotores se encuentran elementos de secuencia similares. • los potenciadores forman complejos de activadores que actúan directa o indirectamente con el promotor.

Introducción Para que empiece la transcripción se necesita la enzima polimetasa de RNA y factores de transcripción. Cualquier proteína necesaria para el inicio de la transcripción pero que, en sí, no es parte de la poJjmerasa de RNA, se define como factor de transcripción, muchos de los cuales actúan reconociendo sitios de acción cis en el DNA. La unión al DNA. sin embargo, no es su único medio de acción. Un factor puede reconocer a otro, a la polimerasa de RNA o, tal vez, incorporarse a un complejo de inicio sólo en presencia de varias otras proteínas. La prueba final para la participación del aparato de transcripción es funcionaL debe requerirse de una proteú1a para que ln transcripción tenga lugar en un promotor o conjunto de promotores específico. Una diferencia signitlcativa en la transcripción del RNAm eucariótico y el procariótico es que el inicio en un promotor eucariótico implica a gran CAPÍTULO 24 Promotores y potenciadores

los potenciadores actúan aumentando la concentración de los activadores cerca df promotor los potenciadores suelen funcionar sólo en configuración ds con un promotor diana. • Es posible hacer que los potenciadofes funcione- ~ configuración lrons por ligamiento del DNA cont~­ en el promotor diana con DNA contenido en el potenciador mediante un puente proteínico o pe• concatenación de las dos moléculas. • El principio es que un potenciador funciona en cualquier situación en que está constreñido a la proximidad que el promotor,

La estructura del promotor es flexible, pero el contexto puede ser importante

los potenciadores contienen elementos bidireccionales que facilitan el inicio

610

• los potenciadores están hechos del mismo tipo := elementos de sewencia que se encuentran en lo; promotores. • la densidad de \os componentes de secuencia es en el potenciador que en el promotor.

• Los elementos de secuencia corta conseJVados se d1spersan en la región que precede al punto de inicio. • Los elementos en f.ujo ascendente aumentan la Frecuencia del inicio. • Los factores que se unen a ellos para estimular la transcripción se llaman activadores.

• Ningun elemento individual de flujo ascendente es indispensable para la función del promoto1, si bien uno o más deben estu presentes para que el inicio sea eñcaz. • Algunos elementos son reconocfdos por muchos factores, y un factor utilizado en un promotor en particular puede ser determinado por el contexto de los otros factores unidos.

Los potenciadores contienen los mismos elementos encontrados en los promotores

fZim

La expresión genética se vincula con la desmetilación • La desmetitación en el extremo 5' del gen es nere::· para su transcripción.

f1lm

los islotes CpG son dianas reguladoras • los islotes CpG rodean a los promotores de genes expresión constitutiva donde no están metilados. • los islotes CpG también se encuentran en los promotores de algunos genes regulados por tejía~ • Hay -29 000 islotes CpG en el genoma humano. • la metilaci6n de un is(ote CpG impide la activac'.;un promotor en su interior. • la unión de proteínas a pares de CpG metilados y en represión.

E

Resumen

número de factores que se u nen con diversos _ memos que acrúa n en confi guración cis. El prc :.~ tor se define como la región que contiene todos •. sitios de unión, esto es, todos l o~ sitios de u nión pueden sostener la transcripción con la eficacia r mal y el control apropiado. Así, la principal cara:rística de un promoLOr de un RNAm eucariótic la localización de los sirios de unión para los faG · de transcripción . La misma polimerasa de Rl\~­ une cerca del pumo de inido, pero no hace come.directo con la región extendida de flujo ascendt: del promotor. Por el contrario, los promotores :terianos descritos en el Capítulo 1 L Transcripc se definen, en gran medida, según el sitio de ude la polimerasa de RNA en la vecindad inme11 del pumo de inido. la transcripción en células eucarióticas se _ de en tres clases. cada una uanscrira por una r merasa de RNA diferente:

• La polimerasa de RNA I transcribe RNAr. • La polimcrasa de RNA n transcribe RNAm. • La polimerasa de RNA lll transcribe RNAt y OlrOS RNA pequeños. Para el inicio se necesitan factores de transcripción, pero no después. En el caso de las tres enzimas eucarióticas, los factores, más que las polimerasas de RNA mismas, son los principales encargados de reconocer al promotor, lo cual difiere deJa polimerasa de RNA bacteriana, en cuyo caso, es la enzima la que reconoce las secuencias promotoras. Para todas las polimera!>as de RNA eucarióticas, los factores crean una esrructura en el promotor de modo de proporcionar la di ana que reconoce la enzima. Para las polimerasas de RNA I y HL esos factores son relativamente sencillos, pero para la polimerasa II, forman un grupo de dimensiones comiderables conocido colecúvamentc como b asal, o en genera l, como factore s. Los factores basales se unen con la polimerasa de RNA n para formar un complejo que rodea el punro de inicio y determinan su sitio; por otra parte, junto con la polimc.rasa de RNA constituyen el aparato de transcripción basaJ . Los promorores de las polimerasas de RNA l y O se encuentran (principalmente) en flujo ascendenre respecto del pumo de inido, pero algunos de la de RNA III están en Oujo descendente. Cada promotor incluye conjuntos característicos de secuencias cortas conservadas reconoddcts por la clase apropiada de factores. Las polimerasas de RNA 1 y m reconocen cada una un conjunto relativamente restringido de promotores y dependen de un pequeño número de factores accesorios. Los promotOres utilizados por la polimerasa de R.J'\!A H muesrran más varíación en secuencias y su organización es modular. Los elementos de secuen cia cona reconocidos por facron::s de transcripción se encuentran en ilujo ascendente respecto del punto de inicio. Esos sitios de acción con configuración ds suelen estar dispersos en una región >200 bp. Algunos de esos elementos y los factores que los reconocen son comunes; se encuentran en una variedad de promotores y se usan de manera consecu tiva, mienrras que otros son espeáficos, identifican cierras clases de genes y su uso es regulado. Los elementos se preseman en diferentes combinacio:tes en cada promotor. Todos los promotores de la polimerasa de RNA ::I tienen elementos de secuencia cerca del punto de inicio, los cuales se unen al aparato basal y esta:>Lecen dicho sitio. Las secuencias más alejadas en flujo ascendente determinan si el promotOr se expresa en todos los tipos de células o es regulado de :nanera espeó6ca. Los promOLores que se expresan je manera constitutiva (sus genes a veces se llaman

genes domésticos) úeneu elementos de secuencia de flujo ascendente reconocidos por activadores ubi cuos. Ninguna combinación de elemento/factor es un componente indispensable del promotor, lo cual sugiere que el inicio de la polimerasa de RNApuede ser promovido de muchas formas. Los promotores que se expresan sólo en ciertos momentos o lugares tienen elementos de secuencia que requieren de activadorcs disponibles sólo en esos momentos o lugares. Los componentes de secuencia del promotor se definen de manera operacional por la demanda de que deben estar ubicados en las cercanías del pumo de inicio y de que se necesitan para éste. El poten ciador es otro tipo de sitio involucrado en el inicio, el cual se identifica por secuencias que estimulan el inicio, pero que se localizan a conside rable distancia del punto de inicio. Los elementos potenciadores suelen ser dlanas de la regulación temporal específica de tej ido. En la se muestran las propiedades generales de promotOres y potenciadore!>. Los componen1es de un potenciador se parecen a los del promotor, ya que constan de diversos elememos modulares, sin embargo, están muy apretados y actúan como los del promotor. El poten dador no necesita estar cerca del pumo de inicio. Las proteínas unida~ a elementos del potenciadar interactúan con proteínas unidas a elementos del promotor. La diferencia entre promorores y potenciadores e!> operativa, más que implicar una diferencia fundamental en el mecanismo. Esta perspectiva es reforzada por el hecho de que algunos tipos de elementos se encuentran tanto en promotores como en porenciadores. la rranscripdón eucariórka muy a menudo está bajo regulación positiva. Con control específico del tejído se proporciona un fnctor de transcripción que act iva a un promotor o a un conjunto de promotores que contienen una secuencia diana común; la regulación o repres ión específica de Lln promotor diana es menos frecuente. En generaL una unidad de transcripción eucariótica contiene un solo gen, y la terminación tiene lugar una vez concluida la región de codificación. La terminación carece de la importancia reguladora necesaria para sistemas procarióticos. Las polimerasas de RNA I y Ill terminan en secuendas y reacciones definidas, pero no esrá clara la forma de terminación de la polimerasa de RNA n. No obstante. el suceso significativo en la generación del extremo 3' de un RNAm no es propiamente un suceso de [erm.inación, resulta de una reacción de escisión en el producto primario de transcripción (véase Capítulo 26, Escisión, empalme y procesamiento del RNA). 24.1 Introducción

611

Promotor

•

..- -100bp - . Contiene varías elementos de secuencia, muy juntos, que se unen a factores de transcripción

Gen

- 200 bp en flu¡o ascendente ~ respecto del punto de IOICIO

la separación entre potenciador Contiene elementos de secuencia dispersos y promotor puede que unen factores de transcripción ser de varias kb Sólo la localización de los elementos muy cercanos (<50 bp) al punto de inicio de la transcripción es fija

Un gen comun transcrito por la polimerasa de RNA JI tiene un promotor que, en flujo ascendente, parte del sitio donde se inicia la transcripción, el cual contiene varios elementos de secuencia cortos (<10 bp) que se unen a factores de transcripción dispersos en >200 bp. Un potenciador con un arreglo más estrechamente empaquetado de elementos que también se unen a los factores de transcripción puede localizarse a varios kb de distancia . (El DNA puede ser ensortijado o estar reestructurado desde otro punto de vista, de manera que los factores de transcripción de uno y otro interactúen para constituir un gran complejo proteínico.)

Las polimerasas de RNA eucarióticas constan de muchas subunidades Conceptos principales • la polimerasa de RNA I sintetiza RNAm en el nucléolo. • La polimerasa de RNA II sintetiza RNAm en el nucleoplasma. • La polimerasa de RNA I1I sintetiza RNA pequeños en el nucleoplasma. • Todas las polimerasas de RNA eucarióticas tienen -12 subunidades y son agregados de >500 kD. • Algunas subunidades son comunes a los t res tipos de polimerasas de RNA. La subunidad más grande de la polimerasa de RNA U tiene un dominio carboxilo terminal (CTD) constituido por múltiples repeticiones de un heptámero .

Las tres polime rasas de RNA eucarióticas se ubican de manera diferente en el núcleo, en función de los genes que transcriben. La actividad preponderante es la de la enzima polimerasa de RNA 1, que reside en el nucléolo y se encarga de la transcripción de genes que codifican RNAr; contribuye en la mayor parte de las smresis de RNA celular (en cuanto a canúdad). La otra enzima primordial es la polimerasa de RNA II, localizada en el nucleoplasma (la parte del núcleo que no es el nucléolo). Representa prácticamente tOda la actividad celular restante y se encarga de sintetizar el RNA nuclear heterogéneo (RNAJm ), precursor del RNA.

612

CAPÍTULO 24 Promotores y potenciadores

La polimerasa de RNA m es una actividad t_ mática menor. Esta enzima nucleoplásmica sim,RNAl y otros RNA pequeños. Todas las polimerasas de RNA eucarióticas proteínas grandes que aparecen como agreg2 >500 kD y por lo general tienen -12 subunida_ La enzima codificada puede llevar a cabo la tr.: cripción dependiente de un molde del RNA, :- _ no iniciarla selectivamente en los promotore~ constitución general de una enzima polimera~ RNA II cucariótka, como se tipifica en Sacdzast'1' cerevisiae. se ilustra en la . Las dos sub dades más grandes son homólogas de las su bur. des~ y Wde la polimerasa de RNA bacteriana: de la s ubunidadcs restantes son comunes a roda polimerasas de RNA, esto es, son también cor nemes de la 1 y la m. La subunidad más grande de la polimerasa RNA n tiene un dominio carboxil o termir(CTD ) constituido por múltiples Jepeticione-= una secuencia de consenso de siete aminoad que es exclusiva de dicha polimerasa. Hay -2 serina o treonina, fenómeno que forma pane e~ reacció n de inicio (véase la sección 24.11, El ir va seguido de la eliminación del promotor). Las polimerasas de RNA de mitocondrias \ roplastos son más pequeñas y simulan la polime:-_ de RNA bacteriana, más que alguna de las enzi nucleares. Por supuesto, los genomas de los orga los son mucho más pequciios, la polimerasa resi~

Xenopus laevis. El producto de transcripción kD /Relacionada con la subunidad ~· • bacteriana 200 Une DNA Tiene CTD =(YSPTSPS)n (levadura, n = 26; ratón, n =52] 100

50

25

Relacionada con la subunidad 13 bacteriana Une nucleótidos <-Relacionada con la subumdad a bacteriana -Común a las tres polimerasas -Común a las tres polimerasas -Común a las tres pollmerasas

IW1

Algunas subunidades son comunes a todas las clases de polimerasas de RNA eucarióticas y otras se relacionan .:on la polimerasa de RNA bacteriana.

<e necesita transcribir relativamente pocos genes y el comrol de la transcripción posiblemente sea mucho más sencillo (si es que existe). Así, esas enzimas son análogas de las de fagos. que no necesitan la capaddad para responder a un ambiente más complejo. Una distinción práCJica importante entre las enzimas eucarióticas depende de su respuesta al octapéptido tlicídico a amanitina. Básicamente en :odas las células eucarióticas, la actividad de lapo!irnerasa de RNA es inhibida rápidamente por las bajas concentraciones de amanirina alfa, pero la polimerasa de RNA I no se inhibe. La respuesta de :a polimerasa de RNA lll a la amanitina alfa está menos bien conservada y en células animales es :nhibida por altas concentraciones, si bien en leva Ju ras e insectos no se inh ibe.

Los eleme ntos promotores se definen por mutaci ones y vestigios Los promotores se definen por su capacidad para provocar la transcripción de una secuencia agregada a un sistema de prueba apropiado, in vitro o in vivo.

El primer paso de la caracterización de un promotor -=s definir la longitud global del DNA que contiene

:odos los elementos de secuencia necesarios. Para ~uo. se necesita un sistema de prueba en el que Jn promotor se encargue de la generación de un ~rod ucto fácilmente analizable. Tradicionalmente se han aplicado varios sistemas: • En el sistema del oocilo se inyecta un molde de DNA en el núcleo de un oocito de 21hJ

del RNA puede recupe rarse y analizarse. La principal limitación de este sistema es que se restringe a las condiciones que prevalecen en el oocito. Permite la caracterización de secuencias de DNA, pero no de los factores que normalmente se unen ellas. • Los sistemas de transfección permüen introdu cir DNA exógeno a una célula cultivada y expresada. El sistema es genuinamente in vivo, en el semido de que la transcripción la lieva a cabo el mismo aparato encargado de expresar el genoma propio de la célula. Sin embargo, difiere de la situación natural porque el molde está constituido por un gen que normalmente no sería tra nscriro en la cé lu la hospedadora. La utilidad del sistem a puede ampliarse utilizando diversas células hospedadoras. • Los sisLemas transgénicos implican agregar Wl gen a la línea germinaLiva de un animal. La expresión de un transgén puede ser seguida en uno o todos Jos tejidos del animal. AJgunas li.m.iradones comWles son aplicables a los sistemas transgén.icos y a la transfecdón, pues el gen adicional a menudo está presente en múltiples copias y se integra en una localización dilcrcme del gen endógeno. Las discrepancias en la expresión de un gen in vi/ro y su expresión como transgén pueden proporcionar información importante acerca de la partidpadón del contexto genóm.ico del gen. • El sisLcma in vitro adopta el abordaje clásico de purificar tOdos los componentes y m anipular las condiciones hasta que se observa un inicio confiable. Por in icio "co nfia ble" se entien de la producción de un RNA que in icie en el sitio correspondiente del extremo S' del RN Am (o los precursores RNAr o RNAL}, lo cual. en ú ltima instancia. permite caracteri7.ar los elementos de la secuencia individual en el promotor y los facto res de lranscripción que se le unen. Cuando se analiza un promotor, es importante que sólo la secuencia del promotor cambie. En la se muestra que siempre se coloque la misma secuencia larga, ascendente, cerca del promotor para asegurar que se encuentre siempre en el mismo contextO. La terminación no ocurre p ropiameme en sistemas in vitro, de modo que el molde se corta a cierta distancia del promotor (por lo general -500 bp en flujo descendenre}, lo cual garantiza que todas la!> polimerasas "se viertan" en el mismo punto, generando, así. un producto de transcripción identificable.

Los elementos promotores se definen por mutaciones y vestigios

613

'1

La secuencia de flujo ascendente es siempre la misma

Sólo el promotor de prueba difiere

La longitud del producto de transcripción es definida

punto. como se ilustra en la . El J[m. ascendente se puede identificar eliminando prog; sivaroente el material de dicho extremo basta que pierda la función del promotOr. Para probar ell.úr • descendente. es necesario reconectar el promo: aconado a la secuencia por transcribir, ya que :. otra manera no habría producto qué analizar. Una vez que los límites del promotor se h.: definido, es posible determinar la importancia • las bases específicas que tiene en su interior in:= ducieodo mutaciones puntuales u otras reestr . turaciones en la secuencia. Como en el caso de polimerasa de RNA bacteriana, éstas pueden car; . terizarse como mutaciones ascmdentes o descendeJ;

Algunas de esas recstruCLuraciones afectan sólca Un promotor se pone a prueba modificando la secuencia que se conecta con una secuencia de flujo ascendente constante y a una unidad de transcripción constante de flujo descendente.

Promotor

Transcrito

'

1

Transcripción!

.-::?:

l

Ya no se produce RNA: la delación ha entrado al promotor El limite de flujo ascendente del promotor yace entre los extremos de las delaciones

Los límites del promotor se determinan mediante deleciones que eliminan progresivamente más material de un lado. Cuando una deleción no puede impedir la síntesis de RNA, pero la siguiente detiene la transcripción, el límite del promotor debe estar entre ambas.

Se empieza con un fragmento específico de DNA con el que puede dar principio la transcripción en uno de estos sistemas. de manera que los límites de la secuencia que constituye al promotor pueden determinarse restando la longitud del fragmento de cada extremo hasta que cese su actividad en algún 614

CAPÍTULO 24 Promotores y potenciadores

velocidad de inicio. en tanto qu e otras inciden e:: sitio donde ocurre, como se observa en un camr de p unto de inicio. En todo caso, para asegurarse que se trata de productos comparables. es necesacaracterizar el extremo 5' de l RNA. Para identificar los componentes de secuer:de un promotor (o cualquier otro sitio del DNA pueden aplicar varios criterios: • Las mutaciones en el sitio impiden las :C... dones in vitro o in vivo. (Hoy se cuenta: muchas técnicas para introducir mutado~ puntuales en pares de bases particulares en principio, es posible mutar todas las p dones de un promotor y estudiar la secu~ cia con mutación in vitro o in vivo.) • Las proteínas que actúan por unión con sitio pueden ser identificadas en él; debrhaber una correlación entre la capac .:.... de las mutaciones para evitar la funciór. promotor y la unión del factor. • Cuando un sitio reconocido por un facto:- . particular se encuentra en varios p romores. debería ser posible derivar u na seCL-:: cia de consenso que se una al factor. -_ nuevo promotor tendrá que encargarse ese factor cuando se introduzca u n a ce apropiada del elemento.

1BJ

La poli meras a de RNA I tie ne un promotor bipartido

Concepto5 principales • El promotor de la polimerasa de RNA I consta de un promotor medular y un elemento de control en flujo ascendente (UPE). El factor UBFl envuelve al DNA con una estructura proteínica para acercar el centro y el UPE. • El Sll incluye el factor TBP que participa en el inic'~ por las tres polimerasas. • La polimerasa de RNA se une al complejo UBFl-Sll: el promotor medular.

La polimerasa de RNA L transcribe a partir de un :~ólo tipo de promotOr los genes del RNA ribosómico. el producw de rran~cripción incluye secuencias de RNAr grandes y pequeños que después se liberan por escisión y procesamiento. Hay muchas copias Je la unidad de transcripción, las cuales alternan con espaciadores no transcritos y se organizan en ~n conjunto, según se describió en la sección 6.8, Los gene~ de RNAr (orman repeticiones en serie. La >rganizacíón del promotor y los sucesos implicados ~n el inicio se incluyen en la El promOLor consta de dos regiones separadas. El promotor medular rodea al pumo de inicio con una extensión de -45 a +20, suficienre para que ie inicie la transcripción. En general. es rico en GC (algo desusado para un promotor). excepto por el t'm ico eJemen Lo conservado de la secuencia, una secuencia corta, rica en A-T, que rodea el p unto .:le inicio, llamada Inr. Sin embargo, la eficacia del ;:Jrom otor medular aumenta mucho por la partici pación del elemenLo promotor ascendente (UPE), utra secuencia rica en G-C y relacionada con la del promotor medular que abarca de-180 a -107. Este :ipo de organización es común a los promotores Poi de muchas especies, si bien las secuencias en sí .-arían ampliamente. La polimerasa de RNA 1requiere de dos factores Juxiliares; el que se une al promotor medular consta de cuatro proteínas. (Se denomina SLl, TIF-IB, y Rib l , en diferentes especies). Uno de sus componen.cs, la proteína unidora de TATA (TB P), es un factor ;¡ue también necesitan para el inicio las polimerasas je RNA n y 1U (véase la sección 24.8, La TBP es un :actor universal.) La TBP no se une directamente con d DNA rico en G-C y la unión de DNA es responsa tlilidad de los otros componentes del factor de unión 11edular. Es posible que Ja TBP interactúe con la "lOlimerasa de RNA. tal vez mediante una subun idad ~om ú n o una característica qu e se ha conservado ~mre las polimerasas. El factor de un ión medular :')ermite a la polimerasa de RNA 1 iniciar a partir del 'lrom otor con una frecuencia basal baja. El factor de unión medular tiene como respon~bilidad prioritaria garantizar que la polimerasa de RNA esté adecuadamente localizada en el punto de Jlicio. En pocas palabras, las polimerasas RNA IT y lll Jesempeñan una función similar mediante un factor ~ue consta de TBP relacionada con otras proteínas. :..sí pues, una característica comt'm del inicio por las :res polimerasas es confiar en un factor de "posijonamientoH constituido por IBP relacionado con roteínas específicas de cada tipo de promotor. Para el inicio de alta frecuencia, se requiere del acmr UBF, polipéptido sencillo que se une a un ele'ilento del UPE rico en G-C. Un indicio de la forma ::n que el UBF interactúa con el factor de unión me-

Elemento promotor de lkJjo ascendent~

,..

-170 -160 -150 -140 -130 - 120 -1 10 El UBF se une at elemento p
r

'- ~ ~.lW_:1\.l~~~¡¡

La hOioenzlma poltmerJSsa de ANA loncluya un lector de un.OO central (SL 1) que sa une ot promotor medular

Las unidades de transcripción de la polimerasa de RNA I tienen un promotor medular separado por - 70 bp del elemen-

to promotor de flujo ascendente. La unión de UBF a UPE aumenta la capacidad del factor central de unión de aunarse al promotor

medular. El factor de unión central (Sll) ubica a la polimerasa de RNA I en el punto de inicio.

dular e~ la importanda del espaciamiento entre el UPE y el promotor medular, lo cual puede cambiarse por distancias que implican números enteros de giros de DNA, pero no por distancias que introduzcan medios giros. El UB F se une con la hendidura menor del DNA y lo envuelve en un asa de casi 360°, de modo que pone al núcleo muy cerca del UPE . En la Figura 24.5 se observa el inicio como una serie de interacciones en secuencia, pero la polimerasa de RNA 1 existe como una holoenzima que contiene la mayor pane de los factores necesarios para el inicio, si no es que todos, y que probablemenre es reclutada directameme al promoror.

B1J La polimerasa de RNA III utiliza promotores en flujo ascendente y descendente (onct!ptos principale-s • la polimerasa de RNA lii tiene dos tipos de promotores. • los promotores internos tienen secuencias de consenso cortas dentro de la unidad de transcripción y producen inicio a una distancia fija de flujo ascendente. Los promotores de flujo ascendente contienen tres secuencias de consenso cortas en ftujo ascendente respecto del punto de inicio, donde se unen los factores de transcripción.

El reconocimiemo de los promotOres por la polimerasa de RNA m ilustra de manera sorprendente la participación relativa de los factores de transcripción

24.5 La polimerasa de RNA IIl utiliza promotores en flujo ascendente y descendente

615

y la enzima polimerasa. Los promotores se clasifican en dos clases generales, reconocidas en diferentes formas por diversos grupos de factores. Los promotores de los genes 5$ y de RNAt son internos y se encuentran en Hujo descendente respecto del punro de inicio. Los promotores de los genes del RNAsn (RNA nuclear pequeño) yacen en flujo ascendente respecto del punto de inicio, a la manera más convencional de otros promotores. En ambos casos, cada elemento es necesario para las funciones del promotor que corresponden exclusivamente a secuencias reconocidas por factores de transcripción que, a su vez, dirigen la unjón de la polimerasa de RNA Antes de que se identificara al promotor de los genes del RNA 5S en X. laevis, en todos los imentos por identificar secuencias de promotores se suponía que podrfan encontrarse en flujo ascendente respecto de l punto de inicio. El análisis de deleción, sin embargo, mostró que el productO RNA 5$ ¡sigue

simetizándose cuando se elimina toda la secue:del gen en Oujo ascendente! Cuando las delecioncs continúan en el gen gue sintetizándosc un producto muy similar el! maño al RNA 5S usual, miemras la deleción term ames de la base +55. En la se mueque la primera parte del productO RNA correspt r a un plásmido de DNA, la segunda represent..< segmento resrame de la secuencia usual de RNA = Sin embargo, cuando la deleción rebasa la posk +55, no hay transcripción, de modo que el pwtor yace en flujo descendente respecto de dicha pos:_ pero hace que la polimerasa de RNA lil inid~ transcripción a una distancia rnás o menos fij¿ flujo ascendente. Cuando la deleción parte del extremo dista. gen. la transcripción no se afecta si los primero• _ bp quedan intactos, pues una vez que la delec hace un corte en esa región, la transcripción e_ de modo que la posición límite en flujo descendcdcl promoror es casi +80. Asf pues, el promoror de la iranscripción del .7

5S yace entre las posiciones +55 y +80, dentro de., Punto de inicio Flujo 1 ascendente

Promotor

•

Región transcrita

La deleclón que elimina secuencias en flujo ascendente respecto del promotor permite que la transcripción empiece en la posición correspondiente al punto de inicio usual

El análisis de deleción muestra que el promotor de los genes de RNA SS es interno; el inicio ocurre a una distancia fija (-55 bp) en flujo ascendente respecto del promotor.

Un fragmemo que comenga esa región puede:paldar el inicio de cualquier DNA donde quiera se coloque, desde un punto de ilúcio a -55 b:-distancia en flujo ascendente (el punto de inia• vestrc es único; en deleciones que no lo Liene:transcripción se inicia en la base pmínica más ce:na a la posición 55 bp en flujo ascendeme resJr." del promotor). En la se resumen las esrrua_ de los tres tipos de promorores de la potimeras; RNA. Hay dos tipos de promotor interno, cada_ de los cuales contiene una estructura bipanida eque dos elementos de secuencia corta están sepa: dos por una secuencia variable. El tipo 1 con~:¿ una secuencia de caja A separada de una secu e:;¡_ de caja C, y el 2, de una secuencia de caja A sep.:.da de una secuencia ele caja B. La distancia ene: caja A y la caja l3 en un promotOr de tipo 2 Jll. variar ampliamente, pero, en general, dichas cz no pueden acercarse mucho sin abolir su ftmc Un grupo común de promotores de tipo 3 tiené elementos de secuencia en flujo ascendente resr _ del punto de inicio.

El TFmB es el factor de encar~ : para los promotores de la Pol :Oct

PSE

Los promotores de la polimerasa de RNA III podñan consistir en secuencias bipartidas en ftujo descendente respecto del punto de inicio, con la caja Aseparada de las cajas C o 8, o estar constituidos por secuencias separadas en flujo ascendente respecto del punto de inicio (Oct, PSE, TATA).

616

CAPÍTULO 24 Promotores y potenciadores

Conceptos

p1incipales

• EL TF,uA y TF111C se unen a la secuencias de consem: permiten al TF,uB unirse en los puntos de inicio. • El TF111 B tiene a TBP como una de sus subunidades _ permite la unión de la polimerasa de RNA.

-:s interacciones deta lladas son diferentes en los - -='S tipos de promotor interno. pero el pri ncipio es el .ismo. El TFwC se une en Oujo descendente respecdel punto de inicio, ya sea de manera indepenente (promotores 1ipo 2) o en combinación, con ~:uA (promotores de tipo 1). La presencia de TFme ::rm.ite al facwr de posidonamiento TFmB unirse . el punto de inicio. A continuadón se recluta la limerasa de RNA. En la se resumen las etapas de la :acción en los promotores internos de tipo 2. El ::.ne se u ne a las cajas A y B, lo cual permite a TF~ '1irse en el pumo de inicio. En ese pumo se puede ~ir la polirnerasa de RNA lll. La diferencia en los promotores internos de tipo es que TFruA debe unirse a una caja A para perri r que TFmC se una a la caja C. En la . muestra que una vez que se ha unido TFme, los cesos siguen el mismo curso que con todos los proowres de tipo 2, con un ión de TFu,B en el punto _ inicio y la polimerasa de RKA lll uniéndose al :nplejo. Los promotores de tipo 1 se encuentran :oen los genes del RNAr 55. TF111 A y TF111C son factores de ensamblaje ya única fu nción es facilitar la unión de TFmB en _ localización correcta. Una vez que se une TF wB· pueden eliminar TFwA y TFwC del promotor (por :a concentración de sales in vitro) sin afectar la .:.acción de inicio. El TF,i3 se mantiene unido en la "indad del punto de inicio y su presencia es suficiente 'lO para permitir que la polimerasa de RNA lll se una !l punto de inicio. Así, TFwB es el único factor de do real requerido por la polimerasa de RJ.\iA m. : .a secuencia de sucesos explica cómo las cajas de ~ promotores en flujo descendente pueden hacer ~e la polimerasa de RNA se una en el punto de cío, en una ubicación algo más alejada en fl ujo :endente. Aunque la capacidad de transcribir es1> genes es conferida por el promotor interno, los .:nbios en la región inmediata en flujo ascendente .5peno del punto de inicio puede n a lterar la efica, de la transcripción. El TFmC es un gran complejo proteínico (> 500 - . comparable en tamaño a la propia polimerasa RNA que contiene seis subunidades. El TFmA es embro de una clase imeresanre de proteínas que :~ uye un segmenro de unión de ácidos nudeicos ~acto dedo de t.inc (véase la sección 25.9, Un seg.:nto de dedo de zinc es un dominio de unión del "A) . El factor de posicionamiento, TP¡JB. consje tres subunidades; incluye la misma proteín a, -:?,presente en el factor de unión medular de los motores de Poi I y también en el factor de trans'lCión (TF11D) correspondleme de la polimerasa de "A II. Asimismo, incluye Brf, que tiene relación ~ el fact or TF 11 B utilizado por la polimerasa de

Punto de inicio

Pollll

Los promotores internos de pollii, tipo 2, utilizan la unión de TF111C con las secuencias de las cajas A y B para reclutar al factor de posicionamiento TF1118, que a su vez recluta a la polimerasa de RNA III.

Punto de inicio 1

Los promotores internos de pol III, tipo 1, utilizan los factores de ensamblaje TF111 Ay TF111Cen las cajas Ay C para reclutar al factor de posicionamiento TF111B, que a su vez recluta a la polimerasa de RNA III.

RNA. La tercera subunidad se llama B", prescindible si el DNA doble se disuelva parcialmente, lo cual sugiere que su función es iniciar la burbuja de transcripción; la panicipación de B" puede ser comparable con la correspondiente del factor sigma

24 .6 El TF111 Bes el factor de encargo para tos promotores de la Pol III

6 17

en la polimerasa de RNA bacteriana (véase la sección ll.l6. La susütución de factores sigma puede controlar el inicio). La región de flujo ascendente desempeña un papel convencional en la tercera clase de promotores de la polimerasa de RNA ID. En el ejemplo de la Figura 24.8 hay tres elemenros de flujo ascendente que también se encuentran en promotores de Jos genes de RNAsn transcritos por la polimerasa de RNA U. (Los genes de algunos RNAsn son transcritos por la polimerasa de RNA ll y orros por la de RNA 111.) Los elementos de flujo asce·ndeme actúan de manera similar en promotores de ambas. El inkio en un promotor de flujo ascendente de la poUmcrasa de RNA lii puedt' tener lugar en una región corta inmediatamente anterior al punto de inicio y conliene sólo e l elemento TATA. La eficacia de la transcripción, sin embargo, aumenta mucho por la presencia de elementos PSE y OCT. Los facrores que se unen a dich os elememos imeractúan de manera cooperativa. (El elemento PSE puede ser indispensable en los promotores usados por la polimerasa de RNA TI, en ramo es estimulador en promotores utilizados por la polimerasa de RNA ID; su nombre significa elemento de secuencia proximaL) El e lemento TATA confiere especificidad para el tipo de polimcrasa (IT o ITI) reconocida por un promotor de RNAsn; está unido a un factor que incluye TBP. que en realidad reconoce la secuencia en el DNA. La TBP se vincula con arras proteínas específicas del tipo de promotor. La función de TBP y las proteínas vinculadas es colocar correctamente la polimerasa de RNA en el punto de inicio, lo cual SI! describe en más detalle para la polimerasa de RNA n (véase la sección 24.8, La TBP es un facLOr universal). Los fac tores actúan en la misma forma para ambos tipos de p romotores de la polimerasa de RNA

Hl. se unen en el promotor antes que la. propia polimemsa de RNA se puedn u11it y forman un complejo de preiniciación que dirige la unión de polimerasa de RNA. La polimerasa de RNA m de por sí no reconoce la secuencia del promotor, pero se une junto a ractores que de suyo están unidos apenas en flujo ascendente respecto del punto de inicio. Para los promotores internos de tipo l y 2, los factores de ensamblaje aseguran que TFmB (que incluye TBP) se una justo en ubicación ascendente respecto del punto de inicio, de modo de proporcionar iníormación de posición. Para los promotores de flujo ascendente, el TF10B se une direcramente con la región que incluye la caja TATA, lo cual significa que independientemente de la localización de las secuencias del promotor, cerca del punto de inicio se unen factores para ctirigir la unión de la polimerasa de RNA m. 618

CAPÍTULO 24 Promotores y potenciadores

El punto de inicio de la poli me rasa de RNA II Conceptos principales La potimerasa de RNA II requiere de factores genera.!f de transcripción (llamados TFnX) para iniciar la transcripción. Los promotores de la potimerasa de RNA II tienen u-secuencia corta conservada Py2CAPy5 (el InR de ini~: en el punto de inicio. • La caja TATA es un componente común de los promotores de la polimerasa de RNA 11 y está constituido por un octámero rico en A-T localizado~-­ bp en flujo ascendente respecto del punto de inicie. • El DPE es un componente común de los promotores la polimerasa de RNA 11 que no tiene caja TATA. • Un promotor medular de la polimerasa de RNA II incluye el InR y la caja TATA o un DPE. La organización básica del aparara de transcri_!' de genes que codifican proteínas fue revélad :; el descubrimiento de que la polimerasa de RK..-. riñcada puede catali7ar la síntesis de RNAm. no iniciar la transcripción, a menos que se ag~. un extracto adicional. La purificación de ese e>. to llevó a la definición de los (actores genera.~ transcripción, un grupo de proteínas que nece~ polimerasa de RNA U para el inicio en todos lo)· motores. Junto con esos (actores. la polimera _ RNA U constituye el aparato basal de transennecesario para transcribir cualquier promot : factores generales se describen como TFux, d "X" es una letra que identifica al factor indi\·. Las subunidades de polimerasa de RNA II y l wres generales de tran scripción se conse1Ya e u ca riotas. El punto de partida del análisis de la or= zación de los promotores es definir al promedular como la secuencia más corta en qt.-: polimerasa de RNA Il puede iniciar la tra.'- _ ción. En principio, un promotOr medularexpresarse en cualquier célula, y comprende cuencia mínima que permite a los facto res = r
..

~''

Punto de inicio ):

1 TATAA ......N20······ YYCAYYYYY ...... N2•······AGAC

L--.,--1

L-..,---1

Caja TATA lnr DPE Promotor medular ~ ~ que contiene TATA ...,_Promotor medular ~ sin TATA

El promotor mínimo de pol 11 puede tener una .?!ja TATA a -25 bp en flujo ascendente respecto de lnr. La caja -~TA contiene la secuencia de consenso de TATAA. EllnR tiene ;irimidinas (Y) que rodean a CA en el punto de inicio. La DEP ~iá en flujo descendente respecto de este último. La secuencia -uestra la cadena de codificación .

Podría esperarse que cualquier componente de ..ccuencia implicado e n la unión de la po limerasa _e RNA y los factores generales de transcripción .1era conservado en casi todos los promotores, o =.'1 todos. Como sucede con los promotOres bacte-:anos, a l comparar los de la polimerasa de RNA ll, .iS homologías en las regiones cercanas al punto de "'Jeto se limitan a secuencias bastante cortas que ~uivalen a las secuencias implicadas en la función e los promotores por mutación. En la e muestra la esrructura de un promotor medular _e poi n típico. En el punto de inicio no hay gran homología de ~cuencias, pero sí una tendencia a que la primera ase de RNArn sea A, llanqueada a ambos lados por :rimidinas. (Esta desaipdón también es válida para ' secuencia de inicio CAT de los promoto res bacte-.mos.) Dicha región ~e denom ina iniciador (Inr), en general, p uede describirse como Py 2 CAPy). Inr está contenido entre las posiciones -3 y +5. ~uchos promotores tienen una secuencia llamada :;.aja TATA. que en las eucariotas superiores suele calizarse -25 bp en Oujo ascendente respecto del unto de inicio y que constituye el único elemento .d promotor de flujo ascendente con localización -:-lativamcme fija respecto de dicho punto. La seJencia medular es TATAA. y s uele ir seguida de ~ras tres pares de bases A-T. la caja TATA tiende - ser rodeada por secuencias ricas en G-C, que po-ía ser un factor de su función. Es casi idéntica a =secuenda -lO de los promotores bacterianos; de echo, podr\a pasar por uno de ellos, excepto por la -~erencia de localización, en -25 y no en -l O. las sustituciones de una sola base en la caja - .tiA actúan como mutacíones descendentes sóJ as; algunas invierten la orientación de un par ·T, de manera que la sola composición de bases 1 es su.ficieote para su funci ón. Así. la caja TATA nslituye un elemento cuya conducta es análoga

=

al conceplo de promotor bacteriano. una secuencia corta, bien definida, apenas en flujo ascendente respecto del punto de inicio, necesaria para la transcripción. Los promotores que no contienen un elemento TATA se llaman p romotores sin TATA. Los rastreos de secuencias de promotores sugieren que el 50%, o más, pueden carecer de TATA. Cuando tm promotor oo incluye una caja TATA, suele contar con otro elemento, el DPE (elemento promotor de flujo descendente), que se localiza entre +28 y +32. Casi todos los promotores medulares constan de u na caja TATA más I..nR o un InR más DPE .

B1J La TBP es un factor universa l Conceptos principales • l a TBP constituye un componente del factor de posicionamiento necesaria para que cada tipo de polimerasa de RNA se una a su promotor. • El factor para la polimerasa de RNA Il es TF11 D, que consta de TBP y 11 TAF, con una masa total de ~800 kD .

El primer paso en la fo rmación de un complejo en un promotor que contenga una caja TATA, es la unión del factOr TF0 .0, que úene dos tipos de componente, con una región en flujo ascendente respecto de la secuencia TATA. El reconocimiento de dicha caja es conferido por la prole rna de unión a TATA (TBP ), una pequeña proteína de -30 kD. Las otras subunidades se llaman TAF (factores vincula dos con TBF), algunas de las cuales tienen relación cstequiométrica con TBP; otras están presentes en cantidades menores. Los TF11D que contienen diferentes TA.F, podrían reconocer diferentes promotores; algunos TAP (subestequiométricos) son específicos de tejidos. En general. la masa total de TFuD es de - 800 kD, contiene TBP y 11 TAF, con una variación de masa de entre 30 y 250 kD . Los TAF de TF,,D reciben el nombre de TAFuOO, donde "00" incluye la masa molecular de la subunldad . Los factores de posicionamiento, que constan de TBP vinculada con un conjunto de TAF, se encargan de la identi.ficación de Ladas las clases de pro motores. Se podría considerar que el TFwB (para los promotores de pol lll) y ~ 1 SLl (para los de poi l) están constituidos por TBP relacionada con un grupo particular de proteínas que susútuye a los TAF que se encuentran en TF0 D. La TBP es el componente clave, y se incorpora a cada tipo de promotor por un mecanismo diferente. En el caso de promotOres de la polimcrasa de RNA U, un faclor clave de po~ siciona mi cnto es la distancia fija de la caja TATA respecto del punto de inicio. 24.8 la TBP es un facto( universal

619

Promotores de pollll

Promotores de poli

TBP

TBP

• En una vista transversal se observa qL'"rodea al DNA del Lado del su rco estrecho. La TBP cons-:: dos dominios conservados relacionados (idénticos hasta ~40%) que se muestran en azul claro y oscuro. La región te..N varía ampliamente, y se representa en verde. Las dos ce:~ de DNA de doble hélice son de color gris, claro y oscuro. Ir:cortesía de Stephen K. Burley.

Promotores de pol ll

se comporta de la misma forma que TBP y apor propio conjuntO de TAF para fo rma r un comr que actúa como alternativa de TF11D en u n con.'_ específico de promotores.

La TBP se une al DNA de forma inusual Conceptos pnncipales Las polimerasas de RNA se posicionan en todos los promotores por un factor que contiene TBP.

En la se muestra que el factor de posicionam iento reconoce al promotor de manera diferente en cada caso. En los promotores de la polimerasa de RNA lll, TFmB se une jumo a TFmC. En los promotores de la polimerasa de RNA 1, SL 1 se une junto con UBF. El TF11D sólo está encargado de reconocer promotores de la polimerasa de RNA II. En un promotor que tiene un elemento TATA. la TBP se une específicamente con el DNA, pero en otros, puede hacerlo por vínculo con otras proteínas que se unen al DNA. Cualquiera que sea el medio de entrada al complejo de inicio, tiene el propósito común de interactuar con la polimerasa de RNA. El TF1p es ubicuo, pero no único. Todas las eucariotas multicelulares también expresan un complejo alterno que contiene TLF (factor similar al TBP en -60%) y no TBP. Probablemente inicie la formación del complejo mediante el conjunto usual de factOres TF n· pero el TLF no se une a la caja TATA, y no se sabe como actúa . En el género Drosophila también hay un tercer factor. TRFl, que 620

CAPÍTULO 24 Promotores y potenciadores

• El TBP se une a la caja TATA en el surco menor del :: • Forma una silla de montar en torno al DNA y lo dor:_;_ -80°. • Algunos de los TAF simulan histonas y podrían for~c. una estructura parecida a un octámero de histona.

La TBP tiene la propiedad inusual de unixse al;:.. en e l surco men or (vinualrnente todas las pr nas de unión a DNA conocidas se unen en el ~ mayor). la estructura cristalina de la TBP st.; un modelo detallado de unión. En la se muestra que rodea una cara del DNA y f una "silla de montar" en tono a la doble hélice hecho, la cara interna de la TBP se u n e al D: la superficie externa, más grande. queda dispo para extender contactos en dirección de otras tcínas. El sitio de unión del Dl\A consta de uminio terminal C. que se conserva entre espec'. cola terminal N variable está expuesta para in:~ ruar con otras proteínas. Como medida de con: ción del mecanismo de inicio de la transcripci~­ secuencia de unión de TBP con DNA perdura .en 80% emrc las levaduras y los seres humar La unión de TBP puede no concordar e presencia de nucleosomas, los cuales se for"'"

sobre todo, colocando las secu encías ricas en A-T con los surcos menores hacia el interior. de modo Je evitar la unión de TBP, fenómeno que podría explicar porqué los nucleosomas impiden el inicio Je la transcripción. La TBP se une al surco menor y dobla al DNA -so·. como se ilustra en la . La caja TATA >e dobla hacia el surco mayor y ensancha el menor. :..a dispersión se restringe a los 8 bp de la caja TATA; en cada extremo de la secuencia, el surco menor ·ienen su ancho usual de -S Á, pero en el centro es de >9 Á, lo cual constituye una deformadón de .a estructura, pero no separa realmente las cadenas de DNA porque se mantiene el apareamiento de las t>ases. La extensión del doblez puede variar respecto Je la secuenda exacta de la caja TATA y se correlaciona con la eficacia del promotor, Dicha estructura tiene varias imp licaciones fun.::ionales, pues si se modifica la organiLación espacial .iel DNA a cada lado de la caja TATA. los factores :ie transcripción y la polimerasa de RNA formarán ·Jn vínculo más estrecho del que sería posible con el JNA lineal. El doblez de la caja TATA corresponde ~1 desdoblamiento de casi un tercio de giro del DNA es compensado por una rotación positiva. La TBP en el surco menor, combinada con la ..111ión de ouas proteínas en el surco mayor, estable:e contactos de alta densidad de proteína-DNA en .:sa región. ln vitro. la unión de TBP purificada con )NA protege -1 giro de la doble hélice en la caja ~ATA, que por lo general abarca de -37 a -25. No 'bstamc, la unión del complejo TF uD en la reacción Je inicio suele proLcger la región de -45 a -10, y .ambién va más allá en flujo ascendente, respecto Jd punto de inicio. La TBP es el único factor geneal de transcripción que hace contactO específico de ecueucia con el DNA. Demro del TF,p como complejo proteínico li· "'re, el factor TAFn230 s~: une a TBP. donde ocupa .1 superfkic cóncava de unión al DNA. De hecho. la :structura del sitio de unión que yace en el dominio crminal N de TAFn230 simula la superfide del sur_; menor del DNA. Esa similitud molecular permite TAF11 230 controlar la capacidad de TBP de unirse _,m el DNA; el dominio terminal N de TAF11230 debe c!splazarse de la superticie de unión del DNA de -ap para que TFtP se una al DNA, Algunos TAF simulan histonas, en panicular :-.\Fu42 y TAFu62 parecen ser homólogos (distantes) e las hisronas H3 y H4, y forman un heterodímero -Hizando el mismo segmento (pliegue de histona) ~e las histOnas para su interacción. (Las histonas !{3 y H4 forman el meollo del octámero de histonas. .l)mplcjo básico que se une al DNA en la cromatina .JcaJiótica; véase la sección 29.7, Organi7.acióndel aámero de histonas.) Junto con otros TAF. TAF1142

La estructura cocristalina de TBP con DNA de - 40 al punto de inicio muestra un doblez en la caja TATA que ensancha el surco estrecho donde se une TBP. [magen cortesía de Stephen K. Burley.

y TAFU6.2 pueden formar la oase de la estructura que simula un octámero de histonas, estructura que puede encargarse de las interacciones inespecíficas de secuencia de TF11D con el DNA. Los pliegues de histonas rambién se usan en interacciones pareadas entre otros TAFw Algunos de los TAF11 pueden encontrase en otros complejos. así como en TF 0 D. Particularmente los TAF0 similares a lústonas se encuentran también en complejos protei.rtic;os que modifican la estructura de lo cromatina antes de la transcripdón (véase sec.ción 30. 7, Las aceti lasas se vinculan con los aclivadores).

El aparato basal se ensambla en el promotor Conceptos principales • La unión de TF11Da la caja TATA es el primer paso del inicio. Otros factores de transcripción se unen al complejo en un orden definido, aumentando, así, la longitud de la región protegida en el DNA. Cuando la polimerasa de RNA ll se une al complejo, empieza la transcripción.

El inicio implica que los factores de transcripdón actúen en un orden definido para constituir un complejo que se une a la poli me rasa de RNA. La serie de sucesos se definió inicialmente por seguimiento del ~t. . 'lO

El aparato basal se ensambla en el promotor

621

FACTOR

COMPLEJO DE TRANSCRIPCIÓN

TF11D TBP

1 1 TAFs

surco menor TF11A

TF11F

Pollmerasa

Un complejo de inicio se ensambla en los promotores de la polimerasa de RNA li mediante una secuencia ordenada de vínculo con factores de transcripción.

tamaño creciente del complejo proteínico relacionado con el DNA, pero ahora pueden definirse con mayor detalle en función de las interacciones reveladas por las estructuras cristalinas de los diversos factores y de la polimerasa de RNA unida al DNA. El vestigio de las regiones de DNA protegidas por cada complejo sugiere el modelo que se resume en la . Conforme cada factor TF 0 se une al complejo. se cubre una longitud cada vez mayor de DNA, la polimerasa de DNA se incorpora en la última etapa. El encargo a un promotor se inicia cuando el TF 0 D se une con la caja TATA. (El TF0 D también reconoce la secuencia InR en el punto de inicio.) Cuando el TF 0 A se une al complejo, el TFnD adquiere la capacidad de proteger una región que se extiende más adelante en flujo ascendente. El TF11 A puede activar la TBP al aliviar la represión causada por TAF 0 230. La adición de TF11 B protege parcialmente la región de la cadena molde en las cercanías del punto de inicio, de-l O a +lO, lo cual sugiere que TF 0 B se une en flujo descendente desde la caja TATA tal vez en relación laxa con el DNA y orientado de manera asimétrica respectO de las dos cadenas. La estructura 622

CAPÍTULO 24 Promotores y potenciadores

Dos imágenes del complejo ternario de-: TBP-DNA muestran que el TF11 B se une a lo largo de la a:: flexión del DNA. Las dos cadenas del DNA son de color =: y amarillo, la TBP es azul y el TF11B, rojo y púrpura. Imá~-e-­ cortesla de Stephen K. Burley.

cristalina que se muestra en la an;. did1o modelo. El TF0 B se une al lado de TBP extiende para prolongar el contacto en una d_ caras del DNA; hace contacto con el surco n:, en flujo descendente respecto de la caja TATA: el mayor en flujo ascendente, respecto de la TATA. en una región llamada BRE. En organisarcaicos, el homólogo de TF11 B en realidad estaL contactos específicos de secuencia con el prom en la región BRE. El TF11 B proporcionaría las'....ficie, que a su vez es reconocida por la polirnede RNA, de modo que se encarga de la direcdtunión de la enzima. La estructura cristalina de TFuB con lapo rasa de RNA muestra que tres dominios del b .... interactúan con la enzima. Como se ilustra e-:: máticameme en la . un listón de Z:. tem1inal de TF 0 B hace con tacto con la enzima ::: del sitio donde sale el RNA, de modo que est dría interfenr con la salida del RNA y con el ca.. de inicio abortivo a escape promotor. Un "d.:: alargado de TF0 B se insena en el cemro activo · polimerasa. El dominio terminal C interactúa la polimerasa de RNA y TF11B para orientar el:::!" también determina la vía del DNA donde enr;: contacto con los factores TF0 E, TF0 F y TF11H pueden alinearlos en el complejo del factor ba;

El factor TF11 F es un heterotetrámero constituido por dos Lipos de s ttbunidad, de las cuales, la más grande (RAP74) tiene una aCtividad de helicasa de DN A dependiente de ATP, que podría participar en la solubilización del DNA en el inicio. la subunidad más pequeña (RAP38) tiene ciena homología con Las regiones del factor sigma bacteriano que hacen contacto con la polimerasa medular. y se une estrechamente con la polimerasa de RNA ll, que el TF0 F puede llevar hacía complejo de ensamblaje de la transcripción y proporcionar el medio por el que se une. El complejo de TBP y T A.F puede interactuar con la cola CTB de la polimerasa de RNA, y la interacción con TF 0 B tal vez también sea importante cuando TF11 F/pollmerasa se unen al complejo. La unión de la poli.mcrasa extiende los sitios protegidos en flt1jO descendente hasta + 15 en la cadena molde y +20 en la que no es molde, La enzima abarca la longitud total del complejo porque se observa protección adicional en el límite de flujo ascendente. ¿Qué sucedt con los promotores sin TATA? Se :equiereo los mismos facrores generales de la trans.:ripción, incluido TF11D. El Tnr proporciona el elemento de posicionamiento y el TF 0 D se une a él por ·a capacidad de uno o más TAF de reconocer clirec.ameme ellnr. Otros T AF en TF 0 D también recono.:en el elemento DPE en flujo descendente respecto je] punto de inicio. la fundón de la TBP en esos ·romotores es más parecida a la que tiene lugar en JS promotores de la polimerasa de RNA I y en los , romotores internos deJa polimerasa de RNAID. El ensamblaje del complejo de inicio de lapoj merasa de RNA Il proporciona un contraste ineresame con la transcripción procariótica. La po~merasa de RNA bncteriana es esencialmente un ;:gregado cohe rente con capacidad in trínseca de _nirse al DNA; el factor sigma. necesario para el !licio pero no para la elongación, se vuelve parte de 3 enzima an tes de que se una a l DNA, aunque más 1rde es liberada. La polimcrasa de RNA 11 puede nirse al promotor pero sólo después de que se han njdo factores de transcripción separados. Los facto·:-s tienen una participación análoga a la del factOr .gma bacteriano, permitir que la polimerasa básica ·econozca específicamente al DNA en las secuendas romotoras, pero ha evolucionado de manera más '~dependiente. De hecho, los factores se encargan "lbre todo de la especificidad del reconodmiemo d promotor y sólo algunos participan en los conJetos proteína-DNA (sólo TBP hace contactos esecíficos de secuenda); por ranro. las interacciones roteína-proteína son importantes para el ensam. .aje del complejo. Cuando hay una caja TATA, determina la loca..zación del pun to de inicio, y su deleción h ace que

DNA en flu¡o ascendente Salida de ANA Ptnza

TF D 11

DNAen fluio descendente

TF B (N·Iam11nal) 11

TF11 B (C·termlnal)

Movtmtento enzimático ______..

\

Nucleótidos

El TF¡¡ Bse une al DNA y entra en contacto con la polimerasa de RNA cerca del sitio de salida del RNA y en el centro activo, y la orienta sobre el ONA. Compárese con la Figura 24.17 que muestra la estructura de la polimerasa implicada en la transcripción. éste se torne errático, si bien cualquier disminución global de La transcripción es relativamente pequeña. En realidad, algunos promotores sin TATA carecen de puntos de inicio únicos y el inicio tiene lugar en cualquiera de un grupo de puntos de inicio. La caja TATA alinea a la polimerasa de RNA (por la interacción con TF 0 D y otros factores) , de manera que se inicie en el sitio apropiado. Esto explica que la localización sea fija respecto del punto de inicio. La unión de TBP y TATA es la característica predominante del reconocimiento del promotor, p ero también dos grandes TAF (TAF 0 250 y TAF11 150) hacen contacto con el DNA cerca delpumo de inicio e influyen en la eficacia de la reacción. Si bien in vilro el ensamblaje puede ocurrir en el promotor medular, esa reacción no es suficiente para la transcripción in vivo, en la cual se requieren conexiones con activado res que reconocen a los elementos más alejados en flujo ascendente . Los activadores imeract(Jan con el apara lo basal en diversas etapas durante su ensamblaje (véase sección 25.5, Los activadores interactúan con el aparato basal).

El inicio va seguido de la depuración del promotor Conceptos principale!. • Para disolver el ONA y permitir el traslado de la polímerasa, se necesitan TF11E y TF11 H. • La fosforilación del CTO podría ser necesaria para que se inicie la elongación. • Para terminar un inicio abortivo, se requiere de fosforilación adicional del CTO en algunos promotores. • El CTD puede coordinar el procesamiento del RNA con la transcripción .

2',11 El inicio va seguido de la depuración del promoto1'

623

La mayor parte de los factores generales de transcripción son necesarios sólo para unir la polimerasa de RNA al promotor, pero algunos actúan en una etapa posterior. La unión de TF0 E hace que el límite de la región protegida en flujo descendente se extienda por otro giro de la doble hélice, hasta T 30. Después de TFuE se unen al complejo dos factores adicionales, TF11H y TF11J, que no cambian el patrón de unión con el DNA. EL TF0 H es el único factor general de transcripción que tiene varias actividades enzimáticas independientes, cnrre otras, la de ATPasa, helicasas con ambas polaridades y cinasa que puede fosforilar la cola CTD de la polimerasa de RNA II. Este fa ctor es excepcional en el sentido de que también puede participar en la elon gación. Su interacción con el DNA en flujo descendente respecto del punto de inicio es necesaria para que la polimerasa del DNA escape del promotor, además de que también participa en la reparación de daños del DNA (véase la sección 24.12, Un a conexión entre transcripción y reparación).

Lo

pollmon"a do

RNJ,.,~ f'.¡

• [YSPTSPSJn

Para liberar a la poli me rasa de RNA y que inicie la transcripción, puede necesitarse fosforilación del CTD por actividad de cinasa del TF11 H. 624

CAPÍTULO 24 Promotores y potenciadores

La reacción de inicio, definida por la form a.: del primer enlace fosfocliéster, ocurre una vez q ... ha unido la polimcrasa de RNA. En la ' se propone un modelo donde se necesita la fo~ !ación de la cola para la liberación de la polimede RN A IT respecto de los [acrores de transcrip~ de modo que pueda hacer la transición a la It: elongada. Gran parte de los factores de transcrirse libera del promotor en esta etapa. En un molde lineal, para el movimiento ... _ polimerasa se requiere de la hidrólisis de AE TF11E y la actividad de helicasa de TF~ (provisr.:la subunidad XPB). Este requisiro es pasado po; por un molde superenrollado, lo cual sugiere se necesitan TFrrE y TF11H pa ra solubilizar elD~­ permitir el inicio del movimiento de la polime-La actividad de helicasa ele la subunidad XPB TF1fl se en carga de la so lubilización en sí del D La polimerasa de RNA Il vacila en algun ~ = nes cuando inicia la transcripción. (El resultad es distinto del inicio abortivo de la polimerax RNA bacteriana descrito en la sección 11.11, E tor sigma controla la unión con el DNA, auli el mecanismo es diferente.) En muchos gene; polimcrasa de RNA U termina después de un e rramo y se fragmenta rápidameme. Para exrela elongación hada el gen, se requiere de un? nasa llamada P-TEFb, miembro de la familia que regula el ciclo celular. La P-TEFb actúa L CTD para fosforilarlo aún más. No se sabe poes necesario ese efecto en algunos promotoresen otros, tampoco cómo se regula. El CTD también puede estar implicado cliret. indirectamente con el procesamiento del RNA pués de que ha sido sintelizado por la polime de RNA JI. En la se resumen las ::, ciones de procesamiento en que puede partic La enzima de ('Obertura (transferasa), que ag- • el fragmento G al extremo 5' de un RNAm rec sintetizado, se une a la forma fosforilada del elo cual podría ser imponame para la modifica.:-del extremo 5' tan pronto como se sintetice. _ conjunto de prO[eínas llamadas SCAF se une al;:y, a su vez. podrían unirse con factores de cor empalme. el cual sería, quizá. un medio de e dinación de la transcripción y el corte y empa Algunos componentes del aparata de fragme:ción lpoliaden.ilación también se unen al CTD . • trañameme en el momento de inido, ¡de modo la polimerasa de RNA está üsta para las reacci• de procesamiento del extremo 3' tan pronto c.: se establece! Todo ello sugiere que el CTD puedt un punto de concentración general para cone, otros procesos con la transcripción. En los cast · formación de capuchón, corte y empalme, el e-

Formación de capuchón en el extremo S'

Una conexión entre t ranscripción y reparación Conceptos

Complejo del ca,uchón

¡

principate~

Los genes transcritos se reparan de manera preferencial cuando se daña el DNA. El TF11H proporciona ligamiento para un complejo de enzimas de reparación. • Las mutaciones del componente XPD de TF11 H causan tres tipos de enfermedades humanas.

Los SCAF reclutan factores de corte y empalme

SCAF

••

-Factores de rotura y empalme Poliadenilación y fragmentación del extremo 3'

El CTD es importante para reclutar enzimas que •odifican el RNA.

. Jnciona de manera indirecta para promover la forOlación de complejos proteínicos que llevan a cabo as reacciones, si bien en la generación del extremo ~ · suele panicipar directamente en la reacción. El proceso general de inicio es similar al catali-ado por la polimerasa de RNA bacteriana. La unión _e una polimerasa de RNA genera un complejo ~errado que, en una etapa postertor, se conviene =!l un complejo abierto, en el cual se han separa~o las cadenas del DNA. En la reacción bacteriana, .: formación del complejo abieno concluye con el -ambio estructural necesario para el ONA; una dife·.:ncia en la reacción eucariótica es que se necesita .n desenrollado más amplio del molde después de ~ta etapa.

En bacterim y otras eucariotas hay un vínculo directo entre la polimerasa de RNA y la activadón de la reparación. El fenómeno básico fue descubierto porque se da preferencia a la reparación de los genes transcritos; más rarde se supo que es sólo la cadena molde del DNA la que constituye la diana, y que la cadena que no es molde se repara a la misma velocidad que la mayor parte del DNA. En las bacterias, la actividad de reparación es tarea del sistema de escisión-reparación uvr (véase la sección 20. 3, Sistemas de reparación y escisión en E. coli.). La reparación preferencial se elimina por mutaciones en el gen de mfd, cuyo producto proporciona el ligamiento de la polimerasa de RNA a las enzimas Uvr. En la se muestra un modelo del vínculo entre la transcripción y la reparación. Cuando la polimerasa de RNA encuentra daños del DNA en la cadena molde, se detiene porque no puede usar las secuencias dañadas como molde porque no puede dirigir el aparcamiento de bases complementarias. Esto explica la especificidad del efecto en dicha cadena (los daños en la que no es molde no impiden el avance de la polimerasa de RNA). La proteína Mfd tiene dos funciones. La primera ímplica el desplazamiento del complejo ternario de polimerasa de RNA del DNA, y la segunda hace que la enzima UvrABC se una al DNA dañado, lo cual cor1 duce a la reparación del DNA por el mecanismo de escisión-reparación (véase la Fig. 20.11 ). Después de que se ha reparado el DNA, la siguiente polimcrasa de RNA que atraviesa el gen puede originar un producto de transcripción normal. Un mecanismo similar, si bien depende de otros componentes, se usa en las eucariotas, pues se da preferenda a la reparación de la cadena molde de un gen transcrito después del daño inducido por UV. El factor general de transcripción TFtfi participa y se encuentra en formas alternas constituidas por un centro relacionado con otras subunidades. El TFaH tiene una ftmción común en el inicio de la transcripción y la reparación del daño. La misma subunidad de helicasa (XPD) crea la burbuja de 24.12 Una conexión entre transcripción y reparación

625

lranscripción inicial y solubiliza el DNA en el sitio dañado. Sus otras funciones difieren entre transcripción y reparación, según la forma apropiada del complejo. La muestra que el factor básico implicado en la transcripción consta de un centro (de cinco unidades) relacionado con OLras subuoidades con actividad de cinasa; ese complejo también incluye una subunidad de reparadón. La subunidad catalítica de cinasa que fosforila el CTD de la polimerasa de RNA pertenece al grupo de cinasas que participa en el control del ciclo celular. Es posible que esa conexión inOuya en la transcripción como respuesta a la e1apa del ciclo celular. El complejo alterno consiste en el centro relacionado con un gran grupo de proteínas codifica-

La polímerasa de ANA se detiene en el sitio daí'lado del molde

El Mld se une a la polimerasa de ANA detenida

das por genes de reparación (el modelo básic muestra en la Figura 20.25) . Las proteínas de rF ración incluyen una subunidad (XPC) que recor. al DNA dañado, desempeña la función de acomiento y permite que se dé preferencia a la rep~­ ción de una cadena molde cuando la polimeras¿ RNA se detiene en el DNA dañado. Otras prote· vinculadas con el complejo son las endonucle:. (XPG, XPF y ERCC1 ). En los complejos de levad· (donde a menudo se identifican por mutaciones defectuosas en la reparación) y en el ser hun:.:.. (porque se identifican con mutaciones que ca· enfermedades resultantes de deficiencias en la paración del DNA dañado) se encuentran prote homólogas. Las subunidades que llevan el nor. de XP son cod ificadas por genes en los cuale5 mutaciones causan xerodennia pigmentosa (\·~ la sección 20.1 1, Las células eucarióticas han _ servado los sistemas de reparación). El complejo de cinasa y el de reparación pue vincularse y disociarse de manera reversible res-Lo del TF 0 H central, Jo cual sugiere un mode: que para el inicio se requiere de la primera f de TF 0 H, pero puede ser sustituido por la otra ma (tal vez como respuesta a los daños enconrr.: en el DNA) . El TFuH se disocia de la polimera.z Rl\A en una de las primeras etapas de la elonga(después de la transcripción de -so bp); su n _ unión en un sitio de DNA dañado puede exigir e ponentes de acoplamiento adicionales.

El TF 11H proporciona una cinasa en el inicio El TF11 H - - - - ' medular Se liberan la polimerasa de ANA y el producto de transcripción

El TF 11 H proporciona un complejo de reparación en la elongación

La UvrAB inicia la reparación de la escisión

Complejo de UvrA

UvrB

MId

El Mfd reconoce a una polimerasa de RNA detenida y dirige la reparación correspondiente hacia la cadena molde dañada.

626

CAPÍTULO 24 Promotores y potenciadores

El centro TF11H puede vincularse con una ~ en el inicio y con un complejo de reparación cuando ene_~ DNA dañado.

la (unción para reparación puede requerir de modificación o fragmentación de la polimerasa de RNA, cuya subunidad grande se fragmenta cuando la enzima se detiene en los sitios de daño por UV. Se desconoce la conexión entre el aparato de transcripción/reparación como tal y la fragmentación de La polimerasa de RNA, quizá sea necesario eliminar Ja polimerasa una vez que se estanca. Esa fragmentación de la polimerasa de RNA es deficiente en células de pacientes con el síndrome de Cockayne (trastorno de la reparación), causado por mutaciones en uno de dos genes (CSA y CSB) cuyos productos parecen ser parte de TFuH o unirse a él. Dicho síndrome también suele ser provocado por muraciones en XPD. Otra enfermedad que puede ser causada por mutaciones en XPD es la tricotiodistrofia, que tiene poco en común con XP o con el síndrome de Cockayne (incluye retraso mental y son notorios los cambios en la estructura del pelo). Todo ello apunta a que XPD sea una proteína pleiotrópica, en la cual diversas mutaciones pueden afectar a diversas funciones. De hecho, para la estabilidad del complejo TPnH durante la transcripción se requiere de XPD, pero la actividad de helkasa como tal no es necesaria. Las mutaciones que impiden que XPD estabilice el complejo causan la tricotiodistrofia. La función de reparación necesita la actividad de heli..:asa, y las mutaciones que afectan su actividad dan lugar a deficiencias en la reparación que origina el síndrome de Cockayne o en XP.

~

(ij

Los elementos de secuencia corta se unen a activadores Conceptos principales los elementos de secuencia corta conservados se dispersan en la región que precede al punto de inicio. los elementos en flujo ascendente aumentan la frecuencia del inicio. • los factores que se unen a ellos para estimular La transcripción se llaman activadores. Un promotor de la polimerasa de RNA ll consta de dos tipos de región; el punto de inicio mismo se

identifica por la cercanía con lnr, la caja TATA, o ambos. Aunada a los fa<.1ores generales de transcripción, la polimerasa de RNA II forma un complejo de inicio que rodea al punto de inicio, como ya se describió. Sin embargo, la eficacia y la especificidad con que se reconoce un promotor, depende de secuencias cortas más alejadas en flujo ascendente, las cuales se identifican por un grupo diferente de faetores. llamados activad o res. En general, las secuencias diana están -100 bp en flujo ascendente respecto del punto de inicio, pero en ocasiones están más lejos. La unión de activadores con dichos sitios puede influir en la formación del complejo de inicio (probablemente} en cualquiera de varias etapas. En la se resume el análisis de un promotor típico. Se introducen sustituciones deba-

4

E o e

11

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2

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z> - 100 CGTAGA

-80 Cl.

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-40

o. ,Mri TGCTCACACAGGATAGAGAGGGCAGGAGCCAGGGCAGGC

-20 GGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCCTCACA

la mutagénesis de saturación de la región de flujo ascendente del promotor de la ~ globina identifica tres regiones :Jrtas (centradas a -30, -75 y -90) necesarias para et inicio de la transcripción que corresponden atas cajas TATA, CAAT y GC. lit .13 los elementos de secuencia cortos se unen a activado res

62 7

ses individuales en casi toda s las posiciones de las 100 bp en flujo ascenden te respecto del punto de irucio de la~ globina, y el sorprendeme resultado es que casi ninguna de las mutaciones afecta la capacidad del promotor para iniciar la transcripción. Por otra par te, ocurren mutaciones descendentes en tres localizaciones correspondientes a tres elementos conos bien definidos. Los dos elementos en flujo ascendente producen un efecto mayor en el grado de transcripción que aquél más cercano al punto de inicio. Además, se produce mutación ascendente sólo en uno de los elementos. Se concluye que las ues secuencias cenas centradas en -30, -75 y - 90 constit uyen el promotor, y cada un a de ellas correspon de a la se cuen cia de consenso para un tipo común de elemento p romotor. La caja TATA (centrada en-30) es el componenre menos eficaz del promotor. segú n se decermina por la disminución en la transcripción p rovocada por las mutaciones. Nótese que aunque no se impide el inicio cuando hay mutación en la caja TATA- varía la localización usual precisa del punto de inicio. lo cual confirma la participación de dicha caja como componente crucial del posicionarruemo del promotor medular. Los elementos basales y los que se encuentran en flujo ascendente respecto de ellos tienen diferentes funciones. Los elementos basales (la caja TATA e Tnr) determinan principalmente la localización del punto de iludo, pero pueden respaldar el inicio sólo en un nivel bastante bajo; idemiflcan la lomlizacióll en que los factores generales de transcripción se ensam blan para formar el complejo basal. Los elementos de secuencia en fl ujo más ascendente influyen en la frecuencia de inicio. con toda probabilidad al acLu ar de manera ditecta en los [actores generales de t ranscripción a fin de promover la eficada del ensamblaje en un complejo de inlcio (véase la sección 25.5. Los activado res interactúan con el aparato basal). La secuencia en -75 es la caja CAAT. así llamada por su secuencia de consenso, que fue un o de tos primeros elementos comunes en ser descrito. A menudo se localiza cerca de -80, pero puede fu n cionar a distancias que varían considerablemente respecto del punto de inicio y en cualquier orientación . Su susceptibilidad a las mutaciones sugiere que participa de manera importante en la determinadón de la eficada del promotor, pero no influye en su espcdficidad. La caja GC en -90 contiene la secuencia GGGCGG; a menudo hay múltiples copias en el promotor, en cualquier orientación. Esta caja también es un componente relativamente común del promotor. 628

CAPÍTU LO 24 Promotores y potenciadores

La estructura del promotor es flexible, pero el contexto puede ser importante Conceptos principales • Ningún elemento individual de flujo ascendente es ir dispensable para la función del promotor, si bien une m~s deben estar presentes para que el inicio sea efia: Algunos elementos son reconocidos por muchos factores. y un factor utilizado en un promotor en particular puede ser determinado por el contexto de ..;. otros factores unidos.

Los promotore~ se organizan según un prin d ph "mezcla y apareamiento" . Diversos elementos p den contribuir a la funció!1 del promotor, pero n:. guno es in dispe nsable para todos. En la se in cluyen algunos e jemplos. Emre esos prom · res se encuentran en total cuatro tipos de elemerr·. cajas TATA. GC, CAAT y el octámero (un eleroe; de 8 bp) . Los elementos encontrados en cualqu! de esos promotores difieren en núm ero, localizae y orientación, ninguno es común a w dos. Si b el promotor conduce información direcciona. transcripción procede sólo en flujo descen d er.~ las cajas GC y CAA T parecen tener la capacidaci actuar en cualquier orientación, lo cual implicalos elementos funcionan sólo como sirios de u r!l de DNA para acercar los factores de u anscripca1 punto de inicio; la estructura de u n factor de ser suficientemente flexible com o para permi•. establecer contactos prmeína -proteína con el ¡;rato basaL independientemente de la forma en el dominio de un ión de DNA esté orientado y ó::disrancia exacta del pun to de inicio. Se supone que los activadol·es, que son ma menos ubicuos, está n disponibles pa ra cualqt

Punto de inicio. SV40 temprano

--===~ Cinasa de tirnidina ~

Histona H2B

- 140-120-100-80 -60 -40 -20 bp

l

Tipos de

módulo

~

Octámero CAAT GC TATA

Los promotores contienen diferentes com: cienes de cajas TATA, CAAT, GC y otros elementos.

promotor que renga una copia del elemento que reconocen, entre los que se incluyen las cajas CAAT y GC, y el octámero. Todos los promotores podrían necesitar uno o más de esos elementos para funcionar eficazmente. Un activador suele unirse a una secuencia de consenso de <1 O bp, pero en reaUdad cubre una longitud de -20 bp del DNA. Dado el tamaño de los activadores y la longitud del DNA que cubre a cada uno, es de esperar que las diversas proteínas cubran jumas toda la región en flujo ascendente a partir del punto de irucio en que residen los elementos. En general, una secuencia de consenso en particular es reconocida por el activador correspondiente (o por un miembro de una familia de factores). Sin embargo, en ocasiones, una secuencia de promotor específica puede ser reconocida por uno de varios actlvadores. Un activado.r ubicuo, el Ocr-1, se une con el octámero para activar el gen de l<1 histona H2B (y posiblemente también otros); es el único factor de unión octámero en células no Hnfoides. Sin embargo, en células linfoides, un acrívador diferente, el Oct-2, se une al octámero para activar el gen de la cadena ligera kappa de inmunoglobulína. Así, Oct-2 es un activador específico de tejido, en tamo Oct-1 es ubicuo. No es tan importante conocer los detalles exactos del reconocimiento, como el hecho de que diversos activadores reconocen las cajas CAAT. El uso del mismo octámero en el gen H2B de expresión ubicua y en los genec; de inmunoglobulina específicos de linfoides constiruye una paradoja, ¿por qué el Oct-1 ubicuo no puede activar los genes de inmunoglobulina en tejidos no linfoides? E1 con:exto debe ser importante; tal vez se requiera Oct-2 más que Oct-1 para interactuar con otras proteínas que se unen en el promotor. Estos resultados indican que no es posible pronosticar si un gen será activado por un activador en panicular sendllameme con base en la presencia de elementos específicos en su promotor.

Hasta ahora se ba considerado al promotor como una región aislada que se encarga de la unión de la polímerasa de RNA. pero los promotores eucarióticos no necesariamente actúan solos; cuando menos algunos casos. la actividad del promotor aumenta enormemente por la presencia de un potendador, que consta de otro grupo de elementos, pero se localiza a distancia variable de los considerados como parte constitutiva del promotor mismo. El concepto de que el potenciador es distinto del promotor refleja dos características; no es necesario que la posición del potenciador respecta del promotor sea fija, sino que puede variar sustancial mente. En la se muesrra que puede ser de flujo a~cendeme o descendente, además de que suele actuar en cualquier orientación respecto del promotOr (es decir, puede estar invertido) . Las manipulaciones del DNA muestran que el poren ciador puede estimular a cualquier promotor que esté cerca; en genomas silvestres pueden estar dentro de los genes (esto es. apenas en flujo descendente del promotor) o a decenas de kilobases en cualquier dirección de flujo . Para fines operarivos, en ocasiones conviene definir al promotor como una o varias secuencias del DNA que deben estar e11 1111a localización (relativamente) fija respecco del punto de inicio. definición que incluye a la caja TATA y otros elementos de flujo ascendente, pero se excluye al potenciador, si bien esta definición es de trabajo, más que una clasificación rígida. En las levaduras se encuentran elementos aná logos a los potenciadores llamados secuencias activadoras en flujo a scend ente (UAS), Jos cuales

Los potenciadores contienen elementos bidireccionales que facilitan el inicio Conceptos principales • Un potenciador activa al promotor más cercano, es decir, a cualquier distancia en flujo ascendente o descendente respecto del promotor. • Un UAS (secuencia de activador ascendente) de las levaduras se comporta como potenciador, pero funciona sólo en flujo ascendente respecto del promotor. • En potenciadores y promotores se encuentran elementos de secuencia similares. • Los potenciadores forman complejos de activadores que actúan directa o indirectamente con el promotor.

Transcripoón

Un potenciador puede activar a un promotor desde localizaciones de flujo ascendente o descendente y su secuencia se puede invertir respecto del promotor.

24.15 Los potenciadores contienen elementos bidireccionales que facilita n el inicio

629

pueden acLUar en cualquier orientación y a distancias variables en flujo ascendente respecto del promotor. pero no en flujo descendente. Su función es regulatoria; en varios casos, la UAS está unida a las proteínas reguladoras que activan los genes en flujo descendente. Los experimentos de reconstrucción en que se elimina la secuencia del potenciador del DNA y después se inserta en otro siúo. muestran que es posible mantener la transcripción normal en tanto se encuentre en cualquier punto de la molécula del DNA. pero si se coloca un gen de ~-globina en una molécula de DNA que contiene un potcnciador, su transcripción aumenta, in vivo, más de 200 veces, incluso si el potenciador está varios kb en flujo ascendente o descendente respectO del punto de inicio, en cualquier orientación; todavía no se sabe a qué distancia deja de actuar el potenciador.

fE

Los potenciadores contienen los mismos elementos encontrados en los promotores

Conceptos principales • Los potenciadores están hechos del mismo tipo de elementos de secuencia que se encuentran en los promotores. • La densidad de los componentes de secuencia es mayor en el potenciador que en el promotor.

Una diferencia entre el potenciador y un promotor común es la densidad de los elementos reguladores. En la se resume la sensibilidad del potenciador SV40 a los daños provocados por una mutación, y se observa que un porcentaje mucho

mayor de sus sitios influye directamente en su It. ción, a diferencia de lo que ocurre con el promC'· analízado en la misma forma en la Figura 24.: Hay un incremento equivalente en la densidad los sitios de unión de proteínas, de los cuales, rr chos son elementos comunes, por ejemplo, A.P el octámero. La especificidad de la transcripción puede controlada por un promotor o un potenciador. ·promotor puede ser específicamente regulad un potenciador cercano se utilizará para aurr.t tar la eficacia del inicio; o bien, un promotOr p ... de carecer de regulación específica pero actha sólo cuando un potenciador cercano es actiYc específicamente. Un ejemplo son los genes de munoglobu linas, que portan potenciadores de·· de la unidad de transcripción. Los potencia dor~ las inmu noglobulinas parecen esrar activos sólc los lin foc itOs B, donde se expresan los genes de inmunoglobulinas. Tales pote nciadores propor.:; nan pane de la red regulatoria mediante la cuC! controla la expresión génica. Una diferencia enue potenciadores y prom res puede ser que aquéllos se muestran más coorativos entre la unión de factores. Un complejo:: se ensambla en el poteociador y que responde a? (interferón) y se ensambla de manera coopera para formar una estructura funcional llamada p tenciadorsoma.la unión de la proteína no~ na HMGI (Y) dobla al DNA en una estructura ~ después se une a varios activadores (NF-l
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o

o. CCAGCTGTGGMTGTGTGTCAGTIAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGMGTATGCMMlCATGCATCTCAi\TIAGTCAGCAAC GGTCGACACCTTACACACAGTCAi\TCCCACACCTTTCAGGGGTCCGAGGGGTCGTCCGTCTTCATACGmCGTACGTAGAGTIMTCAGTCGTIG"

AP4

AP1

AP3

AP2

Octámero

AP1

Un potenciador contiene varios segmentos estructurales. En el histograma se ilustra el efecto de todas las mutaciones que reducen la función del potenciador a <75% del tipo silvestre. Los sitios de unión para las proteínas se indican abajo del histograma. 630

CAPÍTU LO 24 Promotores y potenciadores

complejo ayuda al complejo de preiniciación de los ~actores de transcripción basal que se ensamblan en el promotor para reclutar a la polimerasa de RNA. En la sección 25.5, Los activadores interactúan con el aparato basal. se describe en detalle la función de .os coactivadores.

E

Los potenciadores actúan aumentando la concentración de los activadores cerca del promotor

Conceptos

princípale~

• Los potenciadores suelen funcionar sólo en configuración cis con un promotor diana. • Es posible hacer que los potenciadores funcionen en configuración trans por ligamiento del ONA contenido en el promotor diana con ONA contenido en el potenciador mediante un puente proteínico o por concatenación de las dos moléculas. El principio es que un potenciador funciona en cualquier situación en que está constreñido a la misma proximidad que el promotor.

.:_Cómo puede un potcnciador eslimuJar el inicio en un promotor que puede estar loca lizado a cualquier jjstanda de uno y otro lado? Cuando se descubrie:on los porenciadores, se tomaron en cuenta varias ;>Osibilidades respecto de su acción como elementos .:laramente diferenn:·~ de los promotores. • Un potenciador podría cambiar la estructu ra global del molde, por ejemplo, influyendo en la densidad del supe renrollado . • Podría encargarse de localizar el molde en un sitio específico dentro de la célula, por ejemplo, al uni rlo a la matriz nuclear. • Un potenciador podría proporcionar un Nsirio de entrada", un punto en que lapolimerasa de RNA (o alguna otra p roteína, esencial) se vincula in idalmeme con lacromatina. Ahora se considera que la función del potenjador implica el mismo tipo de interacción con el =.parato basal que las interacciones dependientes Je elementos promotores de flujo ascendeme. Los JIOtenciadores son modulares, igual que los promo.ores. Cienos e lementos se en cuentran tamo en "~Otenciadores como en promotores, y algunos de .os que se cncuemran en los promotores, compar:en con los potenciadores la capacidad de actuar 1 diferentes di!>tancias y en cualquier orientación. \sí, se desdibuja la distinción entre potenciadores y "'romotores; los primeros podrían ser considerados

como porradores de elementos del promotor, porque se agrupan estrechamente, y porque tienen la capacidad de actuar a distancias mayores. respecto del punto de inicio. La fun ción esendal del potenciador podría ser aumentar la concentración del activador cerca del promotor (cercanía, en este sentido, es un término relativo) . Dos tipos de experimentos ilustrados en la sugieren que eso es lo que ocurre. Un fragmento de DNA que incluye un potendador en un extremo y un promotor en el otro, no se transcribe de manera eficaz, pero el potenciador puede estimular la transcripción desde el promotor cuando se conectan mediante un puente proteínico. Los efectos estnJctu rales del tipo de los cambios en el superenrollado, no podrían transmitirse a través de tal puemc, lo cual sugiere que la característica clave es acercar mucho a potenciador y promotor. Un potenctador bacteriano proporciona un sitio de unión para el regulador NtrC, que actúa sobre la poHmerasa de RNA utilizando promotores reconocidos por o 54 • Cuando el potcnciador se coloca en u n círculo de DNA concatenado (enlazado) con un círculo en que se encuen tre el promotor, el inicio es casi tan eficaz como cuando el potenciador y el promotor están en la misma molécula circu lar. Sin embargo. no hay inicio si el potendador y el promo· tor están separados. También en este caso se sugiere que la característica más importante es la localiza ción de la proteína unida con elpotendador, lo cual aumenta la posibilidad de que este últirno entre en contacto con una proteína un ida al promotor.

Estructuras Inactivas

Estructuras activas Puen~. proteínico

r\

¡f'ti

Promotor

Po•encíador

,'/VJW/V.AI"dY/VV/Y/V/\'1'\YV/V/VJ('(/\

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~~ ~ l~,rf

Círculos concatenados

a~ < T7.; ~ -

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,¿

Un potenciador puede actuar acercando proteínas al promotor. Si bien no actúa en un promotor en el extremo opuesto de un ONA lineal largo, se torna eficaz cuando el DNA se integra a un círculo mediante un puente proteínico. Cuando el potenciador y el promotor se encuentran en ONA circulares diferentes no interactúan, pero pueden hacerlo cuando las dos moléculas se concatenan.

N.l1 Los potenciadores actúan aumentando la concentración de los activadores cerca del promotor

631

Si las proteínas unidas en un potenciador a varios kb de distancia de un promotor interactúan directamente con proteínas unidas cerca del punto de inicio, la organización del DNA debe ser suficientemente flexib le como para permitir que potenciador y promotor se ubiquen cerca uno del otro, para lo cual es necesario que el DNA interpuesto se pueda expulsar como una "asa" grande. Tales asas se han observado directamente en el caso de un potenciadar bacteriano. Una interesante excepción a la regla de que los potenciadores actúan en configuración cis en circunstancias na rurales es el fenómeno de la transfección. El apareamiento de los cromosomas somáticos permite a un potenciador de un cromosoma activar a un promotor del cromosoma homólogo, lo cua l refuerza el punto de vista de que los potenciadores actúan por proximidad. ¿Qué limita la aclividadde un potenciado!'? Por lo generaL actúa sobre el promotor más cercano, pero hay circunstancias en que un potenciador está entre dos promotores y activa sólo a uno de ellos con base en contactos específicos proteína-proteína entre los complejos unidos con los dos elementos. La acción de un potenciador puede ser limitada por un aislador, elemento del DNA que impide al potenciador actuar en los promotores más allá de su ubrcación (véase la sección 29 .14, Los aisladores bloquean las acciones de los potenciadores y de la heterocromarina). No se ha definido aún qué tan general es el potenciamiento; se desconoce qué porcentaje de los promotores celulares requiere de un potenciador para alcanzar su grado usual de expresión, y también qué tan a menudo un potendador constituye una ciiana para la regulación. Algunos potenciadores se activan sólo en los tejidos en que actúan sus genes, pero otros podrían estar activos en todas las células.

reversible desencadenado por modificaciones de histonas que incluyen desacelilación y metilac proteínicas (véase la sección 30.9, La metilaciór. las histonas y el DNA está relacionada). La metilación es también un suceso epiger. co, en cuyo caso, puede dar lugar a modificacioT' específicas del espermatozoide o e1 oociro, de m · que cal vez habría una diferencia entre dos alelo> la siguiente generación. El resultado de esto podr.:. ser diferencias en la expresión de los alelos pater y materno (véase la sección 31.8, La me ti ladón _ DNA es la causa de la impresión). En este capítulo se abordan los medios por que la merilación influye en la transcri pción, ~ son los mismos si se agregan o eliminan grupos :tilo como suceso regulatorio locaL o epigenéúcc: La metilación en los promotores de la polín: rasa de RNA II ocurre en pares CG. La distribuc de los grupos metilo puede realizarse aprovechan : las enzimas de restricción que rompen sitios dieque contienen pares CG. En la secoparan dos tipos de actividades de restricción. E~ isoesquizómeros son enzimas que fragmentar misma secuencia diana del DNA, pero responder manera di1ereme ame su estado de metilación. La enzima HpaiT fragmenta la secuencia CCC _ (escribiendo la secuencia de sólo una cadena DNA). Sin elnbargo, si la segunda C está metilada enzima ya no podrá reconocer el sitio. No obstar

Los sitios son escindidos independientemente de la metilación

011

E

rJ,

Mspl

No metilado

La expresión genética se vincula con la desmetilación

Concepto principal • la desmetilación en el extremo 5' del gen es necesaria para la transcripción.

La metilación del DNA es uno de varios sucesos re guladores que influyen en la actividad de un pro motor; su efecto impide la transai.pción, y los grupos metilo deben ser eliminados para que se active el promotor. Dicho efecto está bien caracterizado en los promotores de las polimerasas I y Il de RNA. De hecho, la metilación es un suceso regulatorio 632

CAPiTULO 24 Promotores y potenciadores

El sitio metilado no se escinde

El sitio no metilado se escinde

la enzima de restricción Mspi fragmenta ta:.:.. las secuencias CCGG, metiladas o no, en la segunda C, ¡r..Hpaii fragmenta sólo los tetrámeros CCGG no metilados.

la enzima Mspi fragmenta el mismo sitio diana, independientemente el estado de mctilación en esa C, de modo que se puede usar Mspl para identificar todas las secuencias CCGG y usar Hpall para determinar si están mctiladas. Con un sustrato de DNA no merilado, las dos enzimas generarían las mismas bandas de restricción. No obstante, en el DNA mctilado, las posiciones modificadas no son fragmentadas por la Hpall; para cada una de dichas posiciones, un segmemo mayor de Hpan sust.ituye a dos segmentos de Mspl. Véase el ejemplo de la Muchos genes muestran un patrón en que el estado de merilación es comrantc en casi todos los silios, pero varía en otros; algunos de los sitios están metilados en todos los tejidos revisados, a diferencia de otros. Una mínima parte de los sitios está metilada en

los tejidos en que el gen no se expresa, pero no está metilada en sitios en que el gen no está activo. Por lamo. se puede describir a un gen activo como submetilado. Los experim entos COC1 el fármaco 5-azacitidina aportan pruebas indirectas de que la desmetilación puede dar como resultado la expresión genética. Dicho fármaco se incorpora al DNA, no a la citidina, y no puede metilarse porque la posición 5' está obstruida, lo cual lleva a la aparición de sitios desmetilados en el DNA como consecuencia de la replicación (según el esquema de la derecha de la Figura 15.7). Los efectos fenotípicos de la 5-azadtidina incluyen la inducción de cambios en el estado de diferenciación celular. Por ejemplo, se induce a células musculares a desarrollarse a partir de precursores celulares dilerentes del músculo. El fármaco también activa genes en un cromosoma X sllencioso,

Producto d,:¡ digestión de Hpall

Producto de digestión de Mspl

Una banda exclusiva de Hpall sustituye a ~ las bandas de Mspl Bandas exclusivas de Mspl s1t1os metilados

=

Banda en la m1sma - - - -- -..( posición = sitio no metilado

JO r

Los resultados de Mspl y Hpaii se comparan electroforesis en gel de los fragmentos.

lo cual resulta en la posibilidad de que el estado de metilación podría estar relacionado con la inaClividad cromosómica. Revisando el estado de merilación de los genes residentes, es posible comparar los resultados de la introducción de DNA metilado, o no, a nuevas célu las hospedadoras, experimentos que muestran una clara correlación: el gen metilado está inactivo, pero el no metilado está

activo.

¿Qué extensión tiene la región submetilada? En el grupo de genes de a globina del pollo de células eritroides adultas, la submetilación se confina a los sitios que van de -500 bp en flujo ascendente respecto del primero de dos genes a de adultos. a -500 bp eJJ flujo descendente del segundo. Los sitios de submetilación se encuentran en la misma región, incluido el espaciador intermedio. La región de submetilación coincide con la de sensibilidad mcíxima a la desoxirribonucleasa 1. Con esto se argumenta que la submetilación es la característica de u n dominio que contiene un gen LranscritO o varios. Como con otros cambios de la cromatina, parece probable que los grupos metilo se relacionen con la capacidad de transcripción, más que con la transcripción en sí. El problema de la interpretación del vínculo general entre la activación del gen y la submetilación es que sólo participa una minoría de los sitios meolados (en ocasiones muy pequeña). Es posible que el estado de merilac1ón sea crítico en sitios específicos o en una regtón restringida, como también lo es que una disminución en el grado de metilación {o inclu so la eliminación total de grupos metilo de alguna cadena delDNA) sea parte de algún cambio estructural que permite que avance la transcripción. En particular, la desmetilación del promotor podría ser necesaria para que esté disponible para el inicio de la transcripción. En el gen de y globina, por ejemplo, la presencia de grupos metilo en la región que rodea al punto de inicio, emre-2 00 y +90, suprime la transcripción. La eliminación de los tres grupos metilo localizados en flujo ascendente respecto del punto de inicio, o de los tres grupos metilo en flujo descendente, no alivia la supresión, pero la eliminación de todos los grupos metilo permite que el promotor funcione. Por lo ranro, la transcripción puede implicar una región sin meúlos en el promotor (véase la sección 24.19, Los islotes CpG son dianas reguladoras). Hay excepciones a esta relación general. Algunos genes pueden expresarse incluso si están muy metilados. así que cualquier de las conexiones entre metilación y expresión no son universales en un organismo, pero la regla general es que la metilación impide la expresión génica y que se necesita desmetilación para lograr la expresión. 24.18 la expresión genética se vincula con la desmetilación

633

Los islotes CpG son dianas reguladoras Conceptos prmcipales

• • • •

Los islotes CpG rodean a los promotores de genes con expresión constitutiva donde no están metilados. Los islotes CpG también se encuentran en los promotores de algunos genes regulados por tejidos. Hay -29 000 islotes CpG en el genoma humano. La metilación de un islote CpG impide la activación de un promotor en su interior. La unión de proteínas a pares de CpG metilados resulta en represión.

La presencia de islotes CpG en las regiones 5' de algunos genes se relaciona con el efecto de la metilación en la expresión genética. Dichos islotes se detectan por una mayor densidad de la secuencia dinucleotídica CpG (CpG = 5'-CG-3'). El par CpG se encuentra en el DNA de los vertebrados con apenas una frecuencia del -20% de lo que se esperaría a panir del porcentaje de pares de bases G-C (quizá porque los pares CpG están metilados en C y la desaminación espontánea de la metil-C la lransforma en T, con lo que se introduce una mutación que elimina al par}, pero en ciertas regiones, la densidad de los pares CpG llega al valor

)'-globlna

5' Exón

Exón

1

2

500

1000

bp

APRT

5' Exón 1

Exón 2

La concentración usual de los pares CpG en el DNA de mamífero es -1/100 bp, como en el caso de un gen de gamma globina. En un islote rico en CpG la densidad aumenta a >10 pares/100 bp. El islote del gen APRT se inicia -100 bp en flujo ascendente respecto del promotor y cubre -400 bp hacia el gen. Cada línea vertical representa un par CpG, 63 4

CAPÍTULO 24 Promotores y potenciadores

pronosticado; de hecho, aumenta l O veces, resper del resco del genoma. En esas regiones, los pa:: CpG no están mctilados. En escos islotes ricos en CpG, el contenido pr medio de G-C es de -60%, respecto del promea.. de 40% de la mayor parte del DNA; asumen forma de cadenas de DNA, por lo general de l ¿ _ kb de longitud. Hay -45 000 de ellos en el geno::humano, algunos en elementos repetidos Alu, q~ zá como consecuencia de su elevado contenido G-C. En la c;ecuenciación del genoma humano confirmó que, descartados éstos, hay -29 000 is. tes, y son menos en el genoma de ratón, -15 5C Más o menos 1O000 de los islotes pronosticados , ambas especíes parecen residir en un contexto secuencia que se conserva enrre especies, lo c~;..o sugiere que podrían corresponder a aquellos q1 tienen imponancia reguladora. La estructura de cromatina en esas regiones presenta cambios vi~ culados con la expresión génica (véase la secd 30.1 L La activación del promotor implica una s-:rie ordenada de sucesos), disminuye el conten.k ~ de la hisLOna H l (lo cual probablemente signifL que la estructura es menos compacta); las ot;.: histonas están ampliamente acetiladas (caraCl('ríslica que tiende a vincularse con la expresic génica } y hay sitios hi.persensibles (como sería esperar de los promotore~ activos) . En varios casos, los islotes ricos en CpG emp'c.-zan justo en nujo ascendente respecto de u u pr motor y se extienden en flujo descendente hada = región transcrita, ames de desaparecer. En la se compara la densidad de los pares CpG ::una región "general" del geno m a con un islote Cp-: identificado a partir de la secuencia del DNA; es: último rodea la región S' del gen APRT, que tie1· expresión constilu liva. Todos los genes "domésticos'' que se expres¿de manera constitutiva tienen islotes CpG, es dec'casi la mitad; la otra mitad se presenta en los prom• tores de genes regulados por tejidos, y sólo una requei1a parte (<40%) de esos genes tiene islotes,~ cuyo caso. no están metilados, independientemef!·: del estado de expresión del gen. Los islotes ríe en CpG no merilados pueden ser necesarios pe!' por lo tanto, es insuficiente para la transcripdóAsí, la presencia de islotes CpG no meúlados puetomarse como mdicio de que un gen es potenciamente activo, que ser transcrito inevitablemen~­ Muchos islotes no metilados en animales, se tornametilados en líneas celulares de cultivos de tejidi' lo cual podría relacionarse con la imposibilidad e esas líneas para expresar todas las funciones usua!_ del tejido del que se derivan. La metilación de un islote CpG puede afectar transcripción por uno de dos mecanismos:

• La merilación de un sitio de unión para algún factor puede evil'ar su unión, como en el caso de la unión con un sito regulador diferente del promotOr (véase la sección 31.9, Los genes con impresión opuesta pueden ser controlados por un solo centro} . • La metilación puede hace1· que represores específicos se unan al DNA. La represión se debe a uno de dos tipos de proteínas que se unen a las secuencias CpG metiladas. La proteína MeCP 1 requiere de varios grupos metilo para unirse al DNA, en tanto que MeCP2 y una familia de proteínas relacionadas se pueden unir a un solo par de bases CpG metiJadas. Esto explica

porqué se necesita una zona sin metilación para el inicio de la rranscripdón. La unión de proteínas de cualqu ier tipo impide la transcripción in vitro por un extracto nuclear. La MeCP2, que reprime directamente la tmnscripdón por inreracción con complejos en el promotor, se une también al complejo represor Sin3, que tiene actividad de desacetilasa de histonas (véase la Figura 30.16}. Esta observación constituye una conexión directa entre dos tipos de modificaciones represivas, la metilación del DNA y la desacetílación de hisronas. La ausencia de grupos metilo se vincula con la expresión génica, si bien hay algunas dificultades para c;ustentar que el estado de metilación consti :uya un medio general de control de la expresión génica. En el caso de Drosophila melanogaster (y otros \nsectos dípteros), e l DNA está escasamente metilado (sí bien hay un gen que posiblemente codifique una metiltransferasa) y en el nematodo Clostridium elegans el DNA no está metilado. Las otras diferencias emre la cromatina inactiva y la activa parecen .ser las m ismas que en ~spccies que presentan metiJación. AsL en esos o rganismos, cualquiera que sea la organización de La melilación en los vertebrados, es sustituida por algún oLro mecanismo. En genes activos se producen tres cambios: • Se establece uno o varios sitios hjpersensibles cerca del promotor. • Los nucleosomas de un dominio que incluye la región transcrita se tornan más sensibles a la desoxirribonucleasa l. • El DNA de la misma región está submerilado. Todos esos cambios son necesarios para la transJipción.

E

Resumen

:>e las tres polimerasas de RNA eucarióticas, la 1 transcríbe del DNAr y contribuye a la mayor parte

de las actividades; la n transcribe genes estructurales para RNAm y tiene los productos más variados, en tanto que la lll, transcribe RNA pequeños. Las enzimas tienen estructuras similares, con dos grandes subunidades y muchas subunidades más pequeñas; hay algunas subunídades comunes emre enzimas. Ninguna de las tres polimerasas de RNA reconoce directamente a sus promotores. Un principio unificador es que los factores de transcripción tienen la responsabilidad primaria de reconocer los elementos de secuencia característicos de cualquier promotor en panicular y sirven, a su vez, para unirse a la polimerasa de RNA y posicionarla correctameme en el punto de inicio. En cada tipo de promotor, el complejo de inicio se ensambla por una serie de reacciones en que los factores individuales se unen al complejo (o lo abandonan). El factor TBP es necesario en las tres polimerasas de RNA para el inicio; en cada caso pwporcíona una subunidad de un factor de transcripción que se une en las cercanías del punto de inicio. Un promotor consta de varios elementos de secuencia conos en la región en Oujo ascendente respecto del punto de inicio, cada uno de los cuales está unido a un factor de rranscripdón. El aparato basal, que consiste en los factores TFn, se ensambla en el punto de inicio y permite que se una la polimerasa de RNA . La caja TATA (si la hay), cercana al punto de inicio, y la región iniciadora, ubicada justo en éste, se encargan de la selección del punto de inicio exacto en los promotores de la polimerasa de RNA II. la TBP se une directamente con la caja TATA, en su caso; en los promotores que careceh de ella, se loca liza cerca del punto de inicio por unión a DPE en flujo descendente. Después de la unión de TFuD, los Otros facrores generales de transcripción de la polimerasa de RNA 11 ensamblan el aparato de transcripción basal en e l promotor. Otros elementos del promotor localizados en flujo ascendente respecto de la caja TATA se unen a activadores que interactúan con e l aparato basal. Los activadores y los factores basales son liberados cuando la polimerasa de RNA inicia la elongación. El CTD de la polimerasa de RNA TI es fosforilado durante la reacción de inicio. El TF0 D y las proteínas SRB pueden interactuar con el CTD, así como proporcionar un punto de contacto para las proteínas que modifican el producto de transcripción del RNA, incluida la enzima de estructuración del capuchón 5', los factores de cone y empaJme y el complejo de procesamiento 3'. Los promotores pueden ser estimulados por porencíadores, secuencias que pueden actuar a grandes distancias y en cualquier orientación, a uno y otro lado de un gen. Los potenciadores también constan 24.20 Resumen

635

de conjuntos de elementos, si bien su organización es más compacta. Algunos elementos se encuentran tamo en promowres como en potenciadores. Los potenciadores tal vez actúen ensamblando un complejo proteínico que interactúa con las proteínas unidas en el promotor, lo cual implica que el DNA interpuesto forme "asas". Los islotes CpG contienen concentraciones de pares CpG; a rnénudo rodean a los promotores de genes con expresión constitutiva, aunque también se encuentran en los promotores de los genes regulados. El islote que incluye a un promoror debe estar no metilado para que dicho promotor pueda iniciar la transcripción.. Una proteína específica se une a los pares CpG metilados y evira el inicio de la transcripdón.

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Los potenciadores contienen elementos bidireccionales que facilitan el inicio

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los potenciadores actúan aumentando la concentración de los activadores cerca del promotor

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E

Los islotes CpG son dianas regu ladoras

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Referencias

639

Activación de la transcripción ESQU EMA DEL CAPÍTULO Los elementos de respuesta son reconocidos :: los activadores

Introducción • La expresión del gen eucariótico suele controlarse en el ámbito del inicio de la transcripción.

Los elementos de respuesta pueden localizarse en promotores o potenciadores. • Cada elemento de respuesta es reconocido por un ar. "' especifico. • Un promotor puede tener muchos elementos de respl.;:que, a su vez. pueden activar la transcripción de ma-~'"' independiente o en ciertas combinaciones.

Hay varios tipos de factores de transcripción • El aparato basal determina el punto de inicio de la transcripción. • Los actívadores determinan la frecuencia de la transcripción. • los activadores actúan estableciendo contactos protelna· proteína con los factores basales. Los activadores pueden actuar a través de coactivadores. • Algunos componentes del aparato de transcripción actúan modificando la estructura de la cromatina.

Hay muchos tipos de dominios de unión con : • los activadores se clasifican de acuerdo con el tipo e~ unión con DNA. • Los miembros del mismo grupo tienen variaciones de secuencia de un .segmento especifico que les confieréespecificidad para sitios diana específicos.

Dominios independientes se unen con el DNA y activan la transcripción • La actividad de unión con DNA y activación de la transcripción son obra de dominios independientes de un activador. la función de la unión del dominio con el DNA es acercar el dominio de activación de la transcripción al promotor.

EL segmento de dedo de zinc es un dominio e<: unión con DNA • Un dedo de zinc es un asa oe -23 aminoácidos que sobresale de un sitio de unión de zinc formado por lo; aminoácidos His y Cis. • Una prote!na con dedos de zinc suele tener varios. La porción Cterminal de cada dedo forma un o. hélice : se une a un giro del surco mayor del DNA. • Algunas proteínas de dedos de zinc se unen con el Rl\· no al ONA, o además de al DNA.

El análisis de dos híbridos detecta interacciones proteína-proteína • El análisis de dos hlbridos actúa solicitando una interacción entre dos protefnas, donde una tiene un dominio de unión con DNA y la otra un dominio de activación de la transcrioción.

Los activadores interactúan con el aparato basal

Los receptores de esteroides sc:1 activadores

• El dominio de unión con DNA de un receptor de estero':"' es un tipo de dedo de zinc que tiene la porción Cis, pe-: la His. • Los receptores de glucocorticoides y estrógenos tienen dos dedos de zinc cada uno, el primero de los cuales determina la secuencia diana del DNA. " Los receptores de esteroides se unen al DNA como dime·

Algunas proteínas de unión con promotor corresponden a represores

La unión con elemento de respuesta es activad;: por la unión con ligando

• La represión suele lograrse por afectación de la estructura de la cromatina, pero hay represores que actúan por unión

con promotores específicos.

640

gi!J

• El principio que regula la función de los activadores es que el dominio de unión con el DNA determina la especificidad para el promotor o potenciador diana. • El dominio de unión con DNA se encarga de localizar el dominio de activación de la transcripción en las cercanías del aparato basal. • Un activador que actúa directamente tiene un dominio de unión con el DNA y uno de activación. • Un activador que no tiene un dominio de activación puede actuar uniéndose a un coactivador. que si to tiene. • Varios factores del aparato basal son dianas con las que interactúan activadores o coactivadores. • La polimerasa de RNA puede vincularse con diversos conjuntos alternos de factores de transcripción en forma de un complejo holoenzimático.

• Los receptores de esteroides son ejemplos de activadc~:o:. de respuesta a ligandos que se activan por unión con _esteroide (u otras moléculas relacionadas). • Hay dominios separados de unión con DNA y de unión :: tigandos.

Los receptores de esteroides tienen dedos de r-

La unión del ligando con el dominio C terminal aumento ..; afinidad del dominio de unión con DNA por su sitio día·: especifico en el DNA.

Los receptores de esteroides reconocen a los elementos de respuesta por un código combinatorio • Un elemento de respuesta a esteroides consta de dos sitios mitad cortos. palindrómicos o de repetición directa. Hay sólo dos tipos de sitios mitad. • Un receptor reconoce su elemento de respuesta por la orientación y el espaciamiento de los sitios mitad. • la secuencia de los sitios mitad es reconocida por el primer dedo de 2inc. • El segundo dedo de zinc se encarga de la dimerización, que determina la distancia entre subunidades. • La separación de las subunidades en el receptor determina el reconocimiento del espaciado en el elemento de respuesta. • Algunos receptores de esteroides actúan como homodfmeros, en tanto que otros fo rman heterodimeros. • Los homodlmeros reconocen elementos de respuesta palindrómlcos; los heterodfmeros reconocen elementos de respuesta de sitios mitad con repetición directa.

Los homeodominios se unen con dianas relacionadas en el DNA • El homeodominio es un dominio de DNA de 60 aminoácidos que tiene tres a. hélices. • El C terminal del o: hélice 3 tiene 17 aminoácidos y se une con el surco mayor del ONA. El brazo N terminal del homeodominio se proyecta hacia el surco menor del DNA. • Las protelnas que contienen homeodominios pueden corresponder a activadores o represores de la transcripción.

Introducción La expresión de los genes eucarióticos suele controlarse en el ámbito del inicio de la transcripción. ~ =.s

diferencias fenotípicas que distinguen a los dítipos de célu las en una eucariota superior se =ben en gran parte a diferencias en Ja expresión e genes qu e codifican proteínas. esto es, las transras por la polirnerasa ll de RNA. En principio, la presión de eso~ genes podría ser regulada en una :varias etapas. Se pueden distinguir (cuando me-) cinco puntos de control posibles que forman 5erie siguiente: Activación de la estructura del gen ~:sos

J. Inicio de la transcripción J,

Procesamiento del producto de transcripción

J. Transpone al citoplasma

.!Traducción del RNAm

SJig

Las proteínas hélice-asa-hélice interactúan por vínculo combinatorio • las proteínas hélice·asa·hélice tienen un segmento de 40 a 50 aminoácidos que incluye dos o: hélices anfipáticas de 15 a 16 aminoácidos, separados por un asa. las hélices se encargan de la formación de dímeros. • las proteínas bHLH tienen una secuencia b!Jsica adyacente al segmento HLH. que se encarga de la unión con el DNA. • las proteínas de clase A ~HlH son de expresión ubicua. en tanto que las de clase B bHLH son especificas de tejido. • Una proteína de clase B por lo general forma un heterodimero con una proteína de clase A. • las proteínas HLH que carecen de región básica impiden que la contraparte bHLH de un heterodímero se una con el DNA. • Las protefnas HLH forman vínculos combinatorios que podrían cambiar durante el desarrollo por la adición o la eliminación de proteínas específicas.

Las cremalleras de leucina partici pan en la forma ción de dímeros • La cremallera de leucina es una hélice anApátlca que presenta dimerizaci6n. • La cremallera es adyacente a una región básica que se une con el ONA. La dimerización forma el segmento bZIP donde se unen en forma simétrica dos regiones básicas a repeticiones invertidas del DNA.

UD Resumen

Como se observa en la , la expresión génica en eucariota!. es controlada sobre todo al iniciarse la transcripción. Para la mayor parte de los genes, es el principal punto de conuol de su expresión, el cual implica cambios de la estructura de la cromatina del promotor (véase la sección 30.11, La activación del promotor implica una serie ordenada de sucesos), acompañada de la unión del aparato basal de transcripción (que incluye la polirnerasa II de RNA) al promotor. (La regulación en etapas subsiguientes de la transcripción es rara en células eucarióricas. En algunos genes se observa terminación prematura, la cual es contrarrestada por una cinasa, P-TEFb, pero por lo demás, no parece q ue se emplee el proceso anti terminadón.) El producto primario de la transcripción es modificado por un capuchón en el extremo 5' y, en general. también es transformado por la poliadenjlación del extremo 3'. Se deben extirpar los inrrones de los productos de transcripdón de los genes interrumpidos y el RNA mad uro debe exportarse del núcleo al citoplasma. La reguladón de la expresión gén.ica por selección de secuencias en el ámbito del RNA nuclear podcía implicar u na o todas esas etapas, pero la que más ha tenido preocupado, en cuanto a pruebas, se refiere a cambios en el corte ~:

- Introducción

641

Control del inicio de fa transcripción: usado por casi lodos los genes La estructura focal del gen cambia

El aparato general de transcripción se une con el promotor

interrogantes acerca de esa forma de regula... ¿Cómo identifica el factor de transcripción su gde genes diana?¿ Cómo se regula la actividad m. del factor de transcripción en respuesta a sef.: intrínsecas o extrínsecas?

Hay varios tipos de factores de transcripción Conceptos pnncipales

El RNA se modifica y procesa: puede controlar te expresión de productos génicos aliemos

-

.-~·..,--~o,;.-====AAAA

El RNAm se exporta del núcleo al citoplasma: no regulado

AAAA - - - -= Núcleo

~ ...-.

'11

Citoplasma

Se traduce el RNAm: regulado en el desarrollo de anftbios

La expresión génica es controlada principalmente al inicio de la transcripción, y es raro que los pasos subsiguientes permitan determinar si se expresa un gen, aunque se puede usar un control del proceso para definir la forma del gen se representa en el RNAm.

y empalme; algunos genes expresan mediante patrones alternos de cone y empalme cuya regulación controla el tipo de producto proteínico (véase la sección 26.12, El cone y empalme alterno implica el uso diferencial de uniones de corte y empalme). En última instancia, la traducción de un RNAm en el citoplasma puede controlarse de manera específica. Si bien el empleo de ese mecanismo es raro en las células somáticas del adulto, se presenta en algunas situaciones embrionarias, lo que implicaría la locali.lación del RNAm en sitios específicos donde se expresa el bloqueo del inicio de la traducción por factores proteínicos específicos o ambos. La regulactón de la transcripción génica específica de tejidos constituye el meollo de la diferenciación eucariótica. Un factor de transcripción regulatorio sirve para el control común de gran número de genes diana y se ha intentado responder a dos

64 2

• EL aparato basal determina el punto de inicio de la transcripción. • Los activadores determinan La frecuencia de la transcripción . • Los activadores actúan estableciendo contactos proteína-proteína con los factores basales. • Los activadores pueden actuar a través de coactivadores. • Algunos componentes del aparato de transcripción actúan modificando la estructura de la cromatina.

CAPÍTULO 25 Activación de la transcripción

El inicio de la transcripción implica muchas :acciones proteína-proteína enue factores de ca cripción unidos con el promotor o un potenci:. así como con la polimerasa de RNA. Los fac: requeridos para la transcripción se pueden divic varias clases, las cuales se describen en la sigu.:_ lista. En la se resumen sus propieda • Los factores basales, aunados a la polir.:.~ sa de RNA, se unen con el punto de i.-_ de la caja TATA (véase la sección 24.1. aparato basal se ensambla en el promo: • los activadores son factores de transe ción que reconocen elemen tos de conse específicos, conos y que se unen con . del promotor o de activadores (véas_ sección 24.13, Los elementos de secu~­ cortos unen activadores). Su acción im,.., aumentar la eficacia del aparate basaJunirse con el promotor, de modo que~ mentan la frecuencia de la transaipd se necesitan para que un promotor acn.:un nivel adecuado. Algunos activadore túan de manera constitutiva (son ubic-.... en tanto a otros tienen un papel regu.a y se sintetizan o activan en momentt\5pecíficos o en tejidos específicos, de r.:: que se encargan del control de los parr _~ de transcripción en tiempo y espado. _ secuencias a las que se unen se llamar: mentos de respuesta. • Los miembros de otros grupos de fac: para la transcripción eficaz, en sí. n •.

unen con el DNA. Los coactivadores properdonan una conexión entre activadores y aparato basal (véase la secdón 25.5, Los acLivadorcs interactúan con el aparato basal); actúan por imeracdones proteína-proteína y forman puentes entre los activadores y el aparato basal de transcripdón. • La acción de algunos activado res y otros reguladores provoca cambios en la cromatina (véase la sección 30.7, Las acetilasas se relacionan con activadores). La diversidad de los elementos a partir de los Jales puede construirse un promotor funcional :as variaciones en cuanto a su localización, res.:cto del punto de inicio, sugieren el argumende que los activadores tienen capacidad para teractuar entre sí o en interacdones proteín a-pro _fua en múltiples formas. No parece haber restric.vnes en cuanto a relaciones potenciales entre Jos .ementos. La naturaleza modular del promotor se ..rstra mediante experimentos en que se han inter_mbiando regiones equivalentes de promotores feremes. Los promotores híbridos, por ejemplo, ·:me los genes de la timidina cínasa D y los genes de : globulina beta fundonan bien, lo cual sugiere que . principal propósito de los elementos es acercar los .:rivadores a los que se unen, al complejo de ini · adón, donde las interacciones proteína-proteína -~terminan la eficacia de la reacción de inicio. La organización de los promotores de la poli.erasa II de RNA contrasta con la de los promores bacterianos, en la cual todos los factores de ~~nscrípción deben actuar directamente con la pome rasa de RNA. En el sistema e ucariótico, sólo 1S factores basales interactúan directamente con la ::~zima. Los activadores pueden interactuar con los :;,ctores basales o con coactlvadores que, a su vez, nreractúan con los factores basales. La construcción _el aparato en capas de interacción explica la flexi~ !.lidad con que los elementos pueden disponerse y .! distancia en que pueden dispersarse.

111

Do mi ni os independientes se unen con el DNA y activan la transcripción

Conceptos principales • La actividad de unión con DNA y activación de la transcri pción son obra de dominios independientes de un activador. • la función de la unión del dominio con el DNA es acercar el dominio de activación de la transcripción al promotor.

Potenciador

.rv

La pollmerasa de ANA y los factores basales se unen con el promotor Promotor Los activadores se unen con el promotor

Los activadores se unen con sitios distales en el prom otor o con potenciadores

Los coactivadores conectan a los aclivadores con los factores basales

Los coactivadores o reguladores actúan en la estructura local del gen

los factores involucrados en la expresión génica incluyen la poli merasa de RNA y el aparato basal, activadores que se unen directamente con el DNA en el promotor o con potenciadores; coactivadores que se unen t anto a los activadores como al aparato basal, y reguladores que actúan en la estructura de la cromatina.

Los activadores y orras proteínas reguladoras necesitan dos tipos de capaddad: • Reconocen secuendas diana específicas localizadas en activadores, promotores u otros elementos reguladores que afectan a un gen diana particular. • Una vez unido con el DNA, un actívador ejerce su función al unirse con otros componenrcs del aparato de transcripción. ¿Es posible caracterizar dominios en el activadar que se encargan de esas actividades? A menudo un activador tiene dominios separados que unen DNA y activan la transcripción. Cada dominio se comporta como un módulo independiente que actúa por su cuenta cuando se enlaza con un dominio

25.3 Domi nios i ndependientes se unen con el DNA y activan la transcripción

643

de otro tipo. La geometría del complejo de transcripción global debe permitir al dominio de activación entrar en contacro con el aparato basal, sin importar la localización exacta y la orientación del dominio de unión del DNA. Los elementos de dirección ascendemc respecto del promotor deben estar a una distancia apreciable desde el punto de inicio y en muchos casos orientados en cualquier dirección. Los activadores incluso pueden e:.tar más lejos, y siempre muesnan independencia de orientación. Esta organización tiene implicaciones tanto para el DNA como para las proteínas. El DNA puede presentar asas o condensarse de alguna forma para permitir la formación del complejo de transcripción. Por otra parte, los dominios del activador pueden conectarse de fo rma flexible como se ilustra esquemáticamente

Dominio conector

\ Dominio de unión con DNA Las funciones de unión con DNA y su activación en un factor de transcripción pueden incluir dominios independientes de la proteína.

en la . Lo principal en este caso es los dominios de unión y de activación del DN;._ independientes, y se conectan de forma que pe ten que el dominio de activadón interactúe e aparato basal, independientemente de la orie ción y la localización exacta del dominio de u;de DNA. La unión con DNA es necesaria para la acción de la transcripción, pero ¿la activación depc:de un dominio de unión de DNA en particular-: En la se ilustra un experimento· responder a esra pregunta. El activador Gal4: un dominio de unión de DNA que reconoce un y un dominio de activación que estimula el ir en el promotor diana. El represor bacteriano :.~ tiene un dominio de unión de DNA terminal K reconoce un operador específico. Cuando Le:x,. une a este operador, reprime al promotor adyac te. En un experimento de "trueque", el domini unión de DNA de lexA puede ser sustituido el de DNA de Ga\4, de manera que el gen híl'· pueda imroducirse en la levadura con un gen d = que contenga VAS o un operador LexA. Una proteína Gal4 auténtica puede activa: gen diana sólo si tiene un VAS. Obviamente, e presor LexA por sí mismo carece de la capac para activar cualquier tipo de diana, y el híb:LexA-Ga\4 ya no puede activar un gen con : ¡pero ahora puede activar al gen que porta el radar LexA!

Actlvador Gal4

l Unión de Gal4 con DNA Unión y transcnpción

1

Unión de LaxA con DNA La capacidad de Gal4 para activar la transcripción es independiente de su especificidad para la unión con DNA. Cuando el dominio de unión con DNA Gal4 es sustituido por el de unión con DNA lexA, la proteína híbrida puede activar la transcripción cuando se coloca un operador LexA cerca de un promotor.

644

CAPÍTULO 25 Activación de la transcripción

Este resultado concuerda con el punto de vista -odular de la transcripción. El dominio de unión n DNA sirve para llevar la proteína hacia la loca..:..ación correcta. No tiene importancia cómo o dónt:: se une precisamente al DNA. pero una vez ahí, dominio de transcripción-activación puede ejer.:-r su acción. De acuerdo con este punto de Vista, .:> importa si el dominio de activación de la transipción se acerca al promotor por reconocimiento ~un UAS, a rravés del dominio de unión de DNA e Gal4 o por reconocimiento de un operador LexA, - :ravés del módulo de especificidad de LexA; la ca,1cidad de ambos tipos de módulo para acruar en .:.s proteínas hJbridas sugiere que cada dominio de ' proteína se pliega de ma nera independiente en .na estn1ctura acliva en la cua l no influye el resto e la proteína. La idea de que los activadores tienen dominios ~dep endie nt es que se unen con el DNA y que la - ,:'livación de la transcripción se refuerza por la caacidad de la proteína tal del V1H para estimular el údo sin unión alguna de DNA. La proteína tat se ne a una región de la estructura secundaria en el :oducto RNA; la parte del RNA requelida para la :ción de tat se llama secuenda tar. En la se muestra un modelo del funcionamiento de .: interacción tat-rar en la estimulación de la trans-

ción de facrores de transcripción en las cercanías del promotor, lo cual puede lograrse cuando los activa dores se unen con los potenciadores en el entorno general cuando se unen a componentes del promotor de dirección ascendente, o en un caso extremo, con el producto de RNA por sostén a manera de correa. la exigencia común en todos estos casos es la flexibilidad del arreglo tridimensional exacto del DNA y las proteínas. El principio de Los dominios independiente~ es común en los activadores de la transcripción. Se podrfa considerar que la función del dominio de unión de DNA es acercar el dominio de activación al punto de inicio. Esto explica porqué las localizaciones exactas de los sitios de unión con DNA pueden variar en el promotor.

111

El aná lisis de dos híbridos detecta interacciones proteína-proteína

Concepto principéll • El análisis de dos híbridos funcionan por requerimiento de una interacción entre dos proteínas donde una tiene un dominio de unión de DNA y la otra un dominio de activación de la transcripción .

~pción.

la secuencia tar se localii:a justo en dirección escendente del punto de inicio, de manera que ::Jando se une a tar, se acerca al complejo de íni~ación, lo cual es suficiente para asegurar que su Jminio de activación esté lo suficientemenre cerca el complejo de iniciación. El dom inio de activación "lleractúa con uno o más de los factores de transipción unidos con el complejo de la misma forma ,.-~e una activador. (Obviamente el primer producto .e transcripción puede formarse en ausencia de tal, e modo de proporcionar el sitio de unión .) Cienas estructuras en que se obtuvo tat por 1geniería genética consti tuyen una demoStración _xtrema de la independencia de Jos dominios de )calización y aCtivación, de manera que el dominio e activación se conectara con el dominio de unión .:d DNA y no con la secuencia de unión usual tar. :uando se colocaba un sitio diana apropiado en el romotor, el dominio de activación tat podía activar ? transcripción, lo cual sugiere que debería pen.arse que la unión de DNA (o en este caso la unión .e RNA) proporciona una función "de sostén", cuyo ~incipal propósiTo es asegurar que el dominio de activa:.Jn está cerca del complejo de inicio.

La noción de sostén a manera de correa cons-:uye un ejemplo más específico de la idea genera l ~e que el inicio requiere de una elevada concentra-

El modelo de indepcndenda de dominio es la base de un análisis muy útil para la detección de interacciones proteínicas. De hecho, el dominio de conexión de la Figura 25.3 se sustituye con la interacción proteína-proteína, principio que se ilustra en

( Dominio de unión con RNA Producto de transcnpción

Domin1o de activación "\.

•

T ranscripclo,._..

Comple¡o de inlcio

-..T Dominio de un16n con DNA

El dominio de activación de la proteína TATA de VIH puede estimular la transcripción si se inserta cerca por unión con un producto de RNA de una ronda previa de transcripción. la activación es independiente del medio de inserción, como se muestra por la sustitución de un dominio de unión con DNA por el dominio de unión con RNA.

2S.4 El análisis de dos híbridos detecta interacciones proteína-proteína

645

la . Una de las proLeínas en estudio se fusiona con un dominio de unión de DNA., y la otra, con uno de activación de la transcripción. (Esto se logra enlazando las secuencias de codificación apropiadas para caso y creando proteínas sintéticas por expresión de los genes híbridos.) Si las dos proteínas que se estudian pueden interactuar entre si, las dos proteínas híbridas harán lo propio, lo cual se refleja en el nombre de la técnica, análisis de d o s h íbr idos. La proteína con el dominio de unión de DNA se fusionan con un gen reportero que tiene un promotor simple con su sitio diana, pero no puede acriva1· el gen por sí mismo. La activación ocurre sólo si el segundo híbrido se une con el primero para llevar el dom.inio de activación al promotor. Se puede usar cualquier gen reportero cuando el producto es fácilmente analizable, y esta técnica ha dado origen a varios procedimientos automáticos para probar rápidamente interacciones proteína-proteína. La eficacia de la técnica ilustra de manera sorprendente la naturaleza modular de las proteínas. Incluso cuando se ha unido a otra proteína, el dominio de unión con DNA puede fusionarse con el

o

Participantes

" Proteína 1 fusionada con un dominio de unión con DNA

1

DBD

Protefna 2 AD fusionada con un dominio de activación Sistema de reporte

Si1io de unión con protelnas --ro: _...__....._.........""'.... '

¡

u otro producto del reportero Las protelnas no Interactúan: no hay expresión CAT

las prole(nas interactúan y activan la expresión

,.....-----,_,

La técnica de dos híbridos estudia la capacidad de dos proteínas de interactuar al incorporarlas a proteínas híbridas donde una tiene un dominio de unión con DNA y la otra un dominio de activación de la transcripción. 646

CAPÍTULO 25 Activación de la transcripción

DNA y el dominio de activación de la transcripciór puede hacer lo propio . En consecuencia, la capacidad de interacción de las dos proteínas en estudio no es inhibida por la unión de los dominios dt unión con DNA o de activación de la transcripciór (Obviameme hay excepciones en que no son aplicables estas sencillas reglas y la interferencia entr-: los dominios de la proteína híbrida impide que le. técnica funcione.) La utilidad de este análisis es que sólo requier. que las dos proteínas estudiadas pueden interactuar entre sí. no necesitan tener nada qué ver con li transcripción. Como resultado de la independencia d: los dominios de unión con DNA y de activadó-de la uanscripción, todo lo que se requiere es qu se unan, lo cual sucederá en tanto las dos prote·nas en esrudio puedan interactuar en el ámbito de.

núcleo.

E

Los activado res interactúan co n el apa rato basal

Conceptos principales • El principio que regula la función de los activadores es que el dominio de unión con el DNA determina la especificidad para el promotor o potenciador diana. • El dominio de unión con DNA se encarga de localizar el dominio de activación de la transcripción en las cercanías del aparato basal. • Un activador que actúa directamente tiene un dominio de unión con el DNA y uno de activación. • Un activador que no tiene un dominio de activación puede actuar uniéndose a un coactivador, que sí lo tiene. • Varios factores del aparato basal son dianas con las q ~c:~ interactúan activadores o coactivadores. • La polimerasa de RNA pUede vincularse con diversos conjuntos alternos de factores de transcripción en forma de un complejo holoenzimático.

Un activador puede actuar directamente cuanri consta de un dominio de unión con DNA enlaza... con uno de activación de la transoipción, como ~ ilustra en la Figura 25.3. En otros casos, el actiHdor no tiene en sí un dominio de activación de .: lranscripción. pero se une a otra proteína, un coa :tivador. que sí lo tiene. En la se mues¡¡: la acción de este tipo de activador. Los activadorcpueden considerarse como factores de transcripcil cuya especificidad es conferida por la capaddad • unirse con factores de transcripción del DNA y directamente con el DNA. Un activador en partic~ lar puede necesitar un coactivador específico.

Si bien los componentes proteínicos se organi:..m de manera diferente, el mecanismo es el mismo. _n activador que establece contacta directo con el :"larato basal tiene ún dominio de activación unido ! '1 forma covalente con el dominio de unión con : NA. Cuando un activador actúa a través de un co:livador, las conexiones implican una unión no coalente entre subunidades de prote(nas (compáren~ las Figs. 25.3 y 25 .7). Las mismas interacciones .: encargan de la activación, índependientemenle :: que los diversos dominios estén presentes en la .isma subunidad proteínica o clivididos en varias e esas subunidades. Un dom inio de activación de la transcripción -.:tú a a través de lograr contactos proteína-proteína . m los factores de trascripción general que promue ~n el ensamblaje del aparato basal. Se p uede hacer )ntacro con el aparato basal en cualquiera de los . Herentes factores basales, pero en general ocurre · )n TFuD, TF1!B o TF 11A; los cuales participan en !apas tempranas del ensamblaje del aparato basal ·;éase la Fig. 24.14). En la se ilustra la ituación en que se hace un contacto de ese tipo . 2l principal efecto de los activad ores es influir en el :ensamblaje del aparato basal. El TFuD puede ser la diana más frecuente de los .:ctivadores, que pueden contactar a cualquiera de ·arios TAF. De hecho, una acción importante de los ~AF es proporcionar la conexión del aparato basal ~ l os activadores, lo cual explica porqué la TBP sola ustenta la transcripción de nivel basaL pero se re"Uieren TAFo Tf0 D para ruveles más altos de ~rans­ .:ripdón estimulados por activadores. Los diferentes -:-AF ele TF11D pueden proporcionar superficies de .!lteracción con dilerentes activadores, de los cuales, 2lgu nos interactúan sólo con TAF individuales, en .amo que otros lo hacen con varios. Se supone que a interacción ayuda a la unión de TF 0 D con la caja ~ATA o con otros activadores en torno al complejo ~ D - caja TATA. En cualquier caso, la interacción 0 ::stablece el complejo de transcripción basaL que .acelera el proceso de inicio y, por tanto, aumenta :-L uso del promotor. Los domirtios de activación de los activadores de evaduras Gal4 y Gcn4 tienen múltiples cargas ne_5alivas, lo que llevó a describirlos como "activad ores ~ddos". Otro activador de es1e tipo, particularmente =ficaz, es el que porta la proteína Vp 16 del virus del nerpes simple (VP16 no tiene de po r sí un domin.io de unión con DNA, pero interactúa con el aparato .ie t ranscripción a través de un a proteína intermeiia). Se han hecho experimentos para caracterizar .as funciones del activador ácido en que frecuenlemente se utiliza la región activadora de VP 16 enlazada a un segmento de unión con DNA.

Los activadores ácidos actúan por incremento de la capacidad de TF0 B de unirse al complejo de inicio basal. En experimentos in vitro se ha demostrado que la unión de TF 0B con un complejo de inicio en un promotOr de adenoVirus es estimulada por la presencia de los activadores GAL4 o VP16 ácido, y que este último puede unirse a TFuB. E l ensamblaje de TF;B en el complejo de su promotor es, por tanto, una lim itante de la velocidad estimulada por la presenda de un activador ácido . La resistencia de un promotor de la polimerasa U de RNA ante la reestructuración de elementos y su inctiferencia incluso ame Jos elememos particulares presentes sugieren que los sucesos que la activan son relativamente de naturaleza genera l. Cualquier activador cuya región de activación se pone al alcance del inicio basal tiene la capacidad de estímular Sl-1 formación. Algunos ejemplos sorprendentes de tal versatilidad se han logrado por la estructuración de promotores constituidos por nuevas combinaciones de elementos. Así pues, cuando un elemento UASc de levadura se inserra cerca del promoLOr de un gen eucariótico superior, éste puede ser activado por Gal4 en una célula de mamífero cultivada. Por

Un activador puede unirse a un coactivador que hace contacto con el aparato basal.

El activador hace contacto con TAF en TF11D

l

El activador hace contacto con TF11B

1

Los activadores pueden actuar en diferentes etapas del inicio por contacto con TAF de TFuD o con TF118. 25.1;; Los activadores interactúan con el aparato basat

64 7

Los activad ores y factores basales se unen

1

Se une la holoenzima potimerasa de RNA

La polimerasa de RNA e.s una holoenzima que contiene muchos activadores.

tamo, cualquiera que sea el medio que Gal4 utiliza para activar al promotor parece haberse conservado entre las levaduras y las eucarioras de más alta jerarquía. La proteína Gal4 debe reconocer alguna caracterísúca del aparato de transcripción de los mamíferos que simu la sus contactos normaJes en levaduras. ¿Cómo estimula la transcripdón un activador? Se pueden imaginar dos tipos generales de modelo: • El modelo de reclutamiento señala que su solo efecto es aumentar la unión de la polimerasa de RNA con el promoror. • Un modelo alterno supone que en el comp lejo de transcripdón se induce algún cam bio, por ejemplo de la conformación de la enzima, que aumenta su eficacia. En una prueba de esos modelos, en un caso de levaduras, se demostró que el reclutamiento puede contribuir a la activación. Cuando la concentración de la polimerasa de RJ'\TA se aumentó lo suficiente, el actívador no pudo producir ningún aumento de la transcripdón, lo cual sugiere que su único efecto es aumentar la concentración eficaz de la polimerasa de RNA en el promotor. Cuando se suman todos los componentes requeridos para la transcripción eficaz, factores basales, polimerasa de RNA, activadores y coactivadores, se obtiene un aparato muy grande que consta de >40 proteínas. ¿Es factible que ese aparato se ensamble en el promotor? Algunos activadores, coactivadores y factores basales pueden ensamblarse de manera gradual, pero entonces tal vez se unan a un complejo muy grande constituido por la polimerasa 648

CAPÍTULO 25 Activación de la tra nscripción

de RNA previamente ensamblada con activac y coactivadores adicionales, como se ilustra e ~ Se han encontrado varias formas de poli me de RNA en que la enzima se vincula con faa de transcripción. El "complejo de holoenzimas levaduras más notorio (definido como capaz de ciar la transcripción sin componentes adicion¿, consta de la poümerasa de RNA vinculada cor complejo de 20 subunidades llamado mediad que incluye productos de varios genes dond ... mutaciones impiden la transcripción, incluido gunos loci SRB (así llamados porque muchos de genes originaJmente se identificaron como supr... res de mutaciones en la polirnerasa B de RNA nombre fue sugerido por su capacidad para me: los efectos de los activadores. El mediador es 1: ~ sario para la transcripción de casi tOdos los genelevaduras, en tanto que para la transcripción f.. genes eucarióticos más elevados se requieren e piejos homólogos. El mediador presenta un caT" de conformación cuando interactúa con el d nio terminal (CTD) de la polimerasa de RNA; p-.. transmitir efectos de activación o represión d componentes de flujo ascendente hacia la poli.I:;-. sa de RNA. Probablemente es liberado cuandc polimerasa inicia la elongación. Algunos fac: de transcripción influyen directamente en ella interacción con la polímerasa de RNA o el apa basal, pero otros actúan por modificación de i¿ rrucrura de la cromatina (véase la sección 30. · remodelado de la cromatina es un proceso act.

Algunas proteínas de unión con promotor corresponden a represores Concepto principal • La represión suele lograrse por afectación de la estructura de la cromatina, pero hay represores que actúan por unión con promotores específicos.

La represión de la transcripción en eucarimz logra en general en el ámbito de influencia eestructura de la cromatina; las proleínas regu_ ' ras que actúan como represores bacterianos . actividad en configuración trans para bloque: transcripción son relativamente raras, pero se nocen algunos ejemplos. Un caso es el del re sor global NC2/Drl/DRAP1, heterodímero q1 • une con TBP para impedir su interacción con componentes del aparato basal. La importanca esta interacción es sugerida por la letalidad d-:

Los eleme ntos de respuesta son reconocidos por los activadores

Activa El complejo de transcripción se ensambla en el testículo (no se ilustra() todos los componentes del aparato 1:1asal) TATA Punto de inicio

CAAT CAAT

Conceptos pñncipale5

Octámero

• Los elementos de respuesta pueden localizarse en promotores o potenciadores. Cada elemento de respuesta es reconocido por un activador especiñco.

r\..r\.;1 Oct-1

CTF

Oct-1

Un promotor puede tener muchos elementos de respuesta que, a su vez, pueden activar la transcripción de manera independiente o en ciertas combinaciones.

Inactiva la CDP Impide que otros factores se unan a la caja CAATy los factores basales no J')Ueden unirse

Un complejo de transcripción implica el reco"Jcimiento de varios elementos del promotor H2B del erizo ::: mar en el testículo. La unión del factor de desplazamiento =~Al en el embrión impide que el factor de unión CAT se una, _;manera que no puede formarse un complejo activo.

""':!utaciones nulas en los genes que codifican al re-resor en levaduras. Los represores que así actúan, .arLícipan activamente en la inhibición de la fun ~,ón del aparata basal. En un caso más específico, la secuencia CAAT : s diana de la reguladón. En el promotor de un gen ara la bistana H2B se encuentran dos copias de ese ~temento (véase Flg. 24.22), que se expresa sólo du;ante la espermatogénesis del erizo de mar. Los fa eores de unión de CAAT pueden extraerse del tejido ·=sticular y también de tejidos embrionarios, pero .Sio el del primero se puede unir a la caja CAAT. En '>S tejidos embrionarios, otra proteína, llamada de ~splazamiento de CAAT (CDP), se une a las cajas =~T, evitando así, que el activador las reconozca. En la se ilustran las consecuencias e la expresión genética. En los resúculos, el promolr se une a los factores de transcripción de la caja - ·\TA, las cajas CAAT y las secuencias octaméricas. =..~tej idos embrionarios, la exclusión del factor de :úón de CAAT desde el promotor evita el ensam:aje de un complejo de transcripción . La analogía · >11 el efecLo de un represor bacteriano para impedir inicio por l.a polimerasa de Rl\!A en el promotor .:s obvia. Estos resultados también concuerdan con . hecho de que no puede suponerse la función de _na proteína en la unión con un elemento promor conocido: puede ser un activador, un represor o ~cluso carecer de importancia para la transcripción ...: un gen.

El principio derivado de la caracterización de genes controlados en común es que comparten un elemento promotor (o potenciador) 1·econocido por un activador. Un elemento que hace que un gen responda a tal factor se denomina elemento de respuesta, como el HSE (elem e nto d e respuesta al choque t é rmico); el GRE (elem ento d e r espuesta a glucocorticoid es), y el SER (ele m ento d e r espuesta sérico). Los elementOs de respuesta contienen secuencias de consenso cortas; las copias de los elementos de respuesta encont.rados en diferentes genes tienen relación estrecha, pero no necesariamente son idénticas. La región a 1a que se une el factor cubre una distancia corta a un lado y otro de la secuencia de consenso. En los promotores, los elementos no están presentes a distancias fijas respecto del punto de inicio. en general se encuenrran a <200 bp en flujo ascendente respecto de él. La presencia de un sólo elemento suele ser suficiente para conferir la respuesta reguladora, pero a veces se encuentran varias copias. Los elementos de respuesta pueden locaüzarse en promotores o potenciadores. En general, algunos tipos de elemenros se encuentran en uno, más que en el otro; normalmente, un HSE se encuentra en un promotor, en tanto un GRE se encuentra en un potenciador. Se supone que todos elementos de respuesta actúan por el m ismo principio general, se requiere la unión de un activador al elemento de respuesta para permitir a la polimerasa J.e RNA inkiar la transcripción. La dHerencia respecto de los activadores constitlltivamente aclivos es que la proteína está disponible o está activa sólo en determinadas condiciones, las cuales determinan cuándo se va a expresar el gen. Ejemplo de una circunstancia en que muchos genes son controlados por un solo factor es la respuesta de choque térmico, común a una amplia variedad de procariotas y eucarioLas, la cual implica múltiples controles de la expresión génica. Un aumento en la temperatura in terrumpe la transcrip-

25.7 Los elementos de respuesta son reconocidos por los activadores

649

excesivas de metales pesados uniéndose con é5· eliminándolos de la célula. El gen se expresa egrado basal. pero es inducido a niveles más ele\ : de expresión por los iones de los metales pe~= (como el cadmio) o por los glucocorricoides. U gión de control combina varios tipos de elemcreguladores. En la se resume la organiZó_ del promotor para un gen MT. Una caracten< importante de ese mapa es la elevada concentra de elementos que pueden activar la transcrip.... Las cajas TATA y GC están en sus posiciones t:. les, bastante cerca del punto de inicio. Para el gbasal de cxpresi6n también son necesarios los elementos de nivel basal (BLE) que coinciden e descripción formal de potenciadores. Aunque l~A.. tados cerca del pumo de inicio, se pueden tras~ · a cualquiera otro sin perder su efecto; contiene;cuencias relacionadas con las encontradas en potenciadores y se unen a proteínas que se fusil con e l potenciador SV40. El elemento de respuesta TPA (TRE) es secuencia de consenso presente en varios pe· dadores. incluido un BLE de meralotioneína _ repeticiones de 72 bp del virus SV40. El TR'E::. un sitio de unión para el factor A.Pl. interacción forma parte del mecanismo para la expresión e tirutiva, de la que APJ es un acrivador. La urr de API también tiene una segunda función, el-:conftere una respuesta a los ésteres de forbol, e el TPA (agente que promueve tumores), y esa puesta es mediada por la interacción de APJ TRE. Esta reacción de unión es una forma (a qu e no necesariamente la única) de que los és~: de forbo l desencadenen una serie de cambios a. transcripción. La respuesta inductiva anre los metales es'ferida por secuencias múltiples del elemento de-

ción de algunos genes, aC[iva la transcripción de los genes de choque térmico, y provoca cambios en la producción del RNAm. El control de Jos genes de choque térmico ilustra las diferencias entre las formas de control eucalióticas y procarióticas. En las bacterias se sintetiza un nuevo factor sigma que dirige a la holoenzima polimerasa de RNA a reconocer una secuencia alterna -lO común a los promotores de genes de choque térmico (véase la sección 11 .16, La sustitución de los factores sigma puede comrolar el inicio) . En las eucariotas, los genes de choque térmico rambié11 poseen una secuenda de consenso común (HSE). pero se localiza en diversas posiciones respecto del punto de inicio y es reconocida por un acúvador independiente. el factor de transcripción de choque térmico (HSTF). La activación de este factor, por tanto. constituye un medio de inicio de la Lranscripción en el gmpo específico de -20 genes que la secuencia diana apropiada contiene en su promotor. Los genes de choque térmico de Drosophila melanogaster contienen múltiples copias de HSE . El HSTF se une de manera cooperariva con los elememos de respuesta adyacentes. Tamo HSE como HSTF han sido conservado durante la evolución y es sorprendente cómo un gen de choque térmico de D. melanogaster se pueda activar en especies tan distantes como los mamiferos o los erizos de mar. Las proteínas HSTF de la mosca de la fruta y las levaduras parecen similares, y muestran el mismo patrón vestigial del DNA que contiene secuencias de HSE. El HST de levaduras se fosforila cuando las células entran en choque térmico. modificación que se encarga de la activación de la proteína. El gen de la metalotioncína (MT) constituye un ejemplo de cómo un solo gen puede ser regulado por muchos circuitos diferentes. La proteína metalor.ioneína protege a la célula de concentraciones

Elementos de respuesta GRE Caja-E

BLE

MRE

BLE

MRE

TRE

-260 -240 -220 -200 -180 -160 -140 - 120 -100 -80 Unión da prolefna Reooptof
AP2

esterolde$

MTF1

AP2 AP1

BLE = elemento de grado basal GRE =elemento de respuesta a glucocorticoides MRE ; elemento de respuesta a metales TRE =elemento de respuesta a TPA

-60 SP1

MTF1

La región reguladora del gen de metalotioneína humano contiene elementos reguladores en el promotor y el potenciador. El promotor tiene elementos para la inducción por metales; un potenciador tiene un elemento de respuesta a los glucocorticoides. Los elementos promotores se muestran arriba del mapa y abajo, las proteínas que se unen a ellos.

650

CAPÍTULO 25 Activación de la transcripción

~esta a metales MRE, que actúan como elementos rvmotores. La presencia de un MRE confiere la ..:.naddad de re'Jlonder ame un metal pesado. y con - inclusión de varios elementos se logra un mayor -.ado de inducción. El factor MTF 1 se une con MRE -71 respuesta a los iones metálicos. La respuesta a las hormonas esteroides es re_JJada por un GRE localizado a 250 bp en flujo as:ndeme respecto del punto de inicio. que se corona como potenciador. La deleción de esa región ' afecta el grado basal de expresión o inducido por oes metálicos, pero es absolutamente necesaria ~ra la respuesta a esteroides. La regulación de la metalotioneína ilustra el rincipio general de que cualquiera de los elementos

de transcripción). También se encuentra en una forma ctiferente en el segmento de receptOres de esteroides. • Los re ce ptores de esteroides se definen como grupo por una relación funcional, cada uno es activado por la unión con un csteroide en particular. El receptor de glucoconicoides es el que ha sido analizado más a fondo. Además de otros. como el de la hormona tiroidea o el del ácido retinoico, los recepLOres de esteroides son miembros de la superfamilia activada por Jiga ndos, con el mismo modo de acdón gmeral: el factor pro-

:atizados en un potenciador o promotor pu~de activar ... manera independiente al gen. La ausencia de un

• El segmento h é lice-giro-h élice se idenrificó origina lmente como domin io de un ión con DNA de los represores de fagos . Una hélice CJ. yace en el surco mayor del DNA y la otra en ángu lo, atravesándolo. Una for ma relativa del segmento está presente en el homeodominio. secuencia caracterizada por primera vez en varias proteínas codificadas por genes encargados de la regulación del desarrollo en el género Drosaphi/a, así como en genes de factores de transcripción de mamíferos. • El segmento anfipático héJice-asa-hélice (HLH) se identificó en algunos reguladores del desarrollo y en genes que codifican proteínas eucari6ticas de unión con DNA. Cada hélice an6pática presenta una cara de moléculas hidrófobas en un lado y cargadas en el otro. La longitud del asa de conexión varía de L2 a 28 aminoácidos, segmento que permile la ctimerización de las protemas. y una región básica cercana hace con tacro con el DNA. • Las crema lle r a s de l e ucina consta n de una cadena de aminoácidos con u na m o lécu la de leucina en cada séptima posición. Una cremaJlcra de leuci.na de un polipéptido interactúa con la de otro polipép tido para formar un dímero. la cadena de moléculas con carga posiúva adyacente a cada cremallera participa en la unión con DNA. La actividad de un activador inductble puede ser regulada en una de varias formas, como se ilustra esquemáticamenre en la • Un factor es específico de un tejido porque !>e sinteriza en deLcrmjnado tipo de célula, lo cuaJ es común en los factores que regulan el desarrollo, como las proteínas de horneodominio. • La actividad de un factor puede ser con trolada directamente por modificación. El

_,emen to necesa rio para un modo de activación no ecta la activación en Los otro~ modos. ta diverdad de elementos, su independencia de acción y .z flexibilidad al parecer ilimitada de sus reestruc.~raciones relalivas sugiere que es posi.bk que un ctor de unión con cualquier elemento aumen te ~ manera independiente la eficacia del inicio por aparato basal de transcripción, probablemente en nud de una interacción proteína-proteína que es_ttiliza la formación de un complejo de inido o lo :--:ilita de alguna otra forma.

Hay muchos tipos de dominios

de unión con DNA '

J1n~t.;s

princi¡Mies

los activadores se clasifican de acuerdo con el tipo de unión con DNA. Los miembros del mismo grupo tienen variaciones de secuencía de un segmento específico que les confieren especificidad para sitios diana específicos.

- frecuente que un activador tenga una estructura oduJar en la cual diferentes dominios se encargan - la unión con DNA y la activación de la cranscrip•n, y los factores suelen clasificarse de acuerdo o dicho tipo de dominio. En general, un segmenrelativamente corto del mismo se encarga de La ~ón con DNA: • El segmento dedo de z inc consliLUye un dominio de unión con DNA que se detectó por primara vez en el factor TFmA, el cual es necesario para que la polirnerasa III de RNA transcriba los genes de RNAr 55. Desde entonces, se ha identificado en otros factores de transcripción (y supuestos factores

teínico está inactivo hasta que 110 se une con un pequei1o ligando.

ób.g Hay muchos tipos de dominios de unión con DNA

651

Estado inactivo Sin protelna

Mecanismo de activaclónEstado activo

Ejemplo

Se sintetiza la proteína

Homeo· protelnas

Proteína fosforilada

~ ~ ...=.~~""'----"""""""""'"'!

~ """"''""-"""-.;;_.-"' Proteína desfosforilada

Unión de ligando

Receptores de asteroides

contrapartes alternas se aparean, e< mente las proteínas HLH. • El faclor puede ser fragmentado a • un precursor inactivo. Se produce vador como proteína unida a la enuclear y el retículo endoplásm.ic sencia de esteroles (como el colestei' que el dominio dtosólico se fragrn!' modo que se traslada al núcleo y (('la forma activa del aclivador. A continuación se analizan en detalle ..; dones de unión y activación del DNA prorpor algunas de esas clases de pro[eínas.

~

Liberación por el inhibidor

Cambio de contraparte

Sellberael ,_. factor activo por escisión

NF·l\·B

El segmento dedo de zinc :... un dominio de unió n con : HLH (MyoD/D)

Respuesta de estero!

Prote!na unida a membrana

La actividad de un factor de transcripción regulador puede ser controlada por la síntesis de proteínas, por modificación cova· lente de las proteínas, unión de ligandos o por unión de inhibidores que secuestran a la proteína o afectan su capacidad de unión con el DNA.

HSTF se convierte a la forma activa por fos[orilación. La APl (heterodímero entre las subunidades Jw1 y Fos) se conviene a la forma actíva por fosforilación de la subunidad Jun. • · Un fac tor es activado o desactivado por unión con un ligando, como los receptores de esteroides, que son ejemplos selectos. La unión del ligando puede infiuü en la loca lización de la proteína (que provoca el tras· lado del citoplasma al núcleo), así como en la determinación de su capacidad de unión conDNA. • La disponibilidad de un factor puede variar; por ejemplo, el factor NF·KB (gue acliva los genes K de inmunoglobulinas en los linfocitos~), presente en mudlOs tipos de células, pero es secuestrado en el citoplasma por la proteína inhibidora I- KB. En los lLniocitos B. el NF-KB es liberado de 1- KB y se dilige al núcleo, donde activa la transcripción. • Un factor dimérico puede tener contrapartes alterna s, una de las cuales provoca su inact ividad; la síntesis de la contraparte activa puede desplazar a la inactiva. Esas situaciones se amplifican en mallas en que diversas 652

CAPÍTULO 25 Activación de la transcripción

Conceptos principales • Un dedo de zinc es un asa de - 23 ami noácidos :; sobresale de un sitio de unión de zinc formado :-· aminoácidos His y Cis. • Una prote1na con dedos de zinc suele tener var:. • la porción e terminal de cada dedo forma un 0: -:; que se une a un giro del surco mayor del DNA. • Algunas proteínas de dedos de zinc se unen con ~ y no al DNA, o además de al DNA.

Los dedos de zinc reciben su nombre de la • tura ilustrada en la , en la que t. queño grupo de aminoácidos conservados ).;:; con un .ion zinc para constituir un dominh pendiente en la proteína. Dos tipos de prote"·· unión con DNA tienen estructuras de ese tiproteínas de "dedos de zinc'' usuales y los recede esteroides. Una "proteína de dedos" por lo genera1 una serie de dichos dedos, corno se muestra e" gura. La secuencia de consenso de un sólo de Cis-X 2 •4 -Cis-X,-Phe-X5 ·Le u· X2 • His-X3 • Hi~ El segmento toma su nombre del asa d ... noáddos que sobresale del sitio de unión cor. :: se denomina dedo Cis/His 2• El zinc se mamieuna estructura tetraédrica formada por las rr: las de His y Cis conservadas; el dedo mismo :de -23 aminoácidos y el enlace entre dedos tener de siete a ocho. Los dedos de zinc son segmentos comu:las proteínas de unión con DNA que por lo gcse organizan como una serie única de repeUc aunque a veces hay más de una. La extensión dedos va de nueve repeticiones, que ocupan ~ totalidad de la proteína (como en TF1uA}, a st··

~queño

dominio constituido por dos dedos (como el regulador ADR 1 del genero Drosophila). El ac··ador Spl tiene un dominio de unión con DNA . _.e consta de tres dedos de zinc. La estructura cristalina del DNA unido a una ~oteína con tres dedos sugiere la forma ilustrada "'iquemáúcameme en la . La parte terina! e de cada dedo forma ex hélices que se unen :-n el DNA, la parte terminal N forma una hoja ¡3. ?ara simplificar, La hoja 13 y la localización del ion -~ zinc no se muestran en la parte inferior de la gura. ) las tres cadenas ex-helicoidales se ajustan .1 un giro del surco mayor; cada ex-hélice (y, por .mto, cada dedo) hace dos contactos espeáficos de ccuencia con el DNA (indicados por las flechas). .-e considera que los aminoácidos no conservados _, el sitio terminal e de cada dedo se encargan del ~conocimiemo de sitios diana específicos. Sabiendo que los dedos de zinc se encuentran .r1 activadores auténticos que ayudan a las polime·.:sas de II y m de RNA, es posible analizar a las pro~ínas de los dedos desde una perspectiva inversa. :uando se observa que una proteína tiene varios de .stos dedos, a primera vista hay cuando menos una -~zón para investigar su posible participación como ~ctor de transcripción. Ese tipo de identificación j giere que varios loci implicados en el desarrollo . !nbrionario de D. melanogaster son reguladores de 3 transcripción. Es necesario ser cauteloso en la interpretación .e la presencia de (supuestos) dedos de zinc, espe_.almente cuando la proteína contiene un segmento e sólo uno de ellos. Los dedos suelen participar n la unión con RNA, más que con DNA, o tal vez .: siquiera tengan actividad de unión con ácidos uclcicos. Por ejemplo, el prototipo de proteína de edos de zinc, TF1rJA, se une tanto al gen 55 como ; su produ cto, RNAr 55. Un factor de inicio de la :-aducción, eiF2~, tiene un dedo de zinc, y las mu~ciones en esa estructura influyen en el reconoci"'liento de los codones de inicio. Las proteínas de la .ápside retrovírica tienen un segmento relacionado .on el dedo, que podría participar en la unión con .., ~A vírico. -:1

Cis

Phe

His

Leu

El factor de transcripción SPl tiene una serie de tres dedos de zinc, cada uno con un patrón característico de moléculas de cisteína e histidina que constituyen el sitio de unión del zinc.

Zn

Zn

Zn

Forma una

Forma una

ho¡a 13

o.-hélice

los dedos de zinc pueden formar hélices alfa que se insertan en el surco mayor, relacionado con las hojas beta del otro lado.

Los receptores de esteroides son activadores Conceptos principales • los receptores de esteroides son ejemplos de activadores de respuesta a ligandos que se activan por unión con un esteroide (u otras moléculas relacionadas) . • Hay dominios separados de unión con DNA y de unión con ligandos.

Las hormonas estcroides se sintetizan en respuesta a diversas actividades neuroendocrinas y ejercen efectos importantes en el crecimiento, el desarrollo de los tejidos y la homeostasia corporal en el mundo animal. En la se clasifican los principales grupos de esteroides y algunos otros compuestos con actividades (moleculares) relacionadas. 25.10 Los receptores de esteroides son activadores

653

[ Cortlcoides (asteroides suprarrenales) 1

Los glucocorticoides aumentan la glucemia y también t•enen cH 0H 2 acción antitnllamatorta 1 CHC=O OH

Los mineralocorticoides mantienen el equilibrio de agua y sales

El ácido retinoico (vitamina A) es un rr geno encargado de la diferenciación del eje ~ roposterior en la yema de extremidad del Pldesarrollo. Su metabolito, el ácido 9-cis reti:" se encuentra en tejidos que son sitios impor., para el almacenamiento y metabolismo de la mina A.

Se podrían considerar esas diversas actividades. minos de vías para la 1egulación para la expresión i· Esos diversos compuestos companen una forJT acción común: cada uno es una pequeíia molén._Hormonas asteroides sexuales Los andrógenos son necesarios Los estrógenos participan para el desarrollo sexual en el desarrollo sexual OH CH OH masculino 3 femenino

o

OH

Desarrollo y mortogénes1s Para el desarrollo óseo y el metabolismo del calcio se requiere Vitamina O

El ácido retinoico es un morfógeno yH3 C~C -CH2-CH 2 CH

2-yH "'

CH~H3

Hormonas ~ro1deas Las hormonas tiroideas regulan la tasa metabólica basal

-o l

HO

O

o ' f '

COOH CH2-?H

1

-

NH Tnyodotironina (T3)

Ácido (uans) rettnoico

Varios tipos de moléculas hidrófobas pequeñas activan los factores de t ranscripción.

La glándula suprarrenal secreta > 30 esteroides, los dos grupos principales son glucocorticoides y mineralocorticoides. T..os esteroides proporcionan las hormonas reproductivas (sexuales masculinas o andrógenos y sexuales femeninas o estrógenos). Se requiere viwmina E para el desarrollo óseo. Otras hormonas que tienen estructuras y propósitos fisiológicos no relacionados funcionan en el ámbito molecular de manera similar a las hormonas esteroides. Las hormonas tiroideas, que se basan en formas yodadas de la tirosina, controlan la tasa metabólica basal en animales. Las hormonas esteroides y tiroideas pueden también ser imporranres para la metamorfosis (los ccdicsteroides en insectOs y las hormonas tiroideas en ranas).

654

CAPtrULO 25 Activación de la transcripción

se une a un receptor específico que activa la transcr. génica. ("Receptor" puede ser nombre equivoc la proteína es un receptor para la hormona es!. de o tiroidea en el mismo se ntido que el rer· Laces un receptor de 1.111 ~-galactósido; es deccs receptOr en el sentido de contener una pr<' unida a la membrana que se expone en la super celular.) Los receptores para los diversos grupos de monas esreroidcs, tiroideas y el ácido relinoic. presentan una nueva ''superfamilia" de regulatl génicos, los activadores de respuesta a ligand<.. dos los receptores rienen dominios independk para la unión con DNA y a las hormonas que e en las mismas localizaciones relativas. Su orgarción general se resume en la La parte central de la proteína es el domin~ unión con DNA. Esa región tiene reladón esm: con Jos diversos receptorc~ de esteroides (dese par más estrechamente relacionado, con ídem· de secuencia del 94%, hasta el par menos bier lacionado, con identidad de 42% ). El acto de Uí con DNA no puede desconectarse de la ca pacida activar la transcripción, porque las mulacione ese dominio afeCLan ambas actividades. Las regiones terminales N de los recept muestran la más baja conservación de secuen~ incluyen OCIClS regiones necesarias para activa transcripción. Los dominios terminales C se unen a las hor nas. Aquellos en la familia de receptores de este. des muestran identidades que van desde 30 ha 57%, lo que refleja la especificidad para horm<' individuales. Sus relaciones con los otros rec... Lores son mínimas y reOcjan la especificidad p una djversidad de respuestas. hormonas tiroid\.vitamina D, ácido retinoico. y así sucesivamer. Este dominio también contiene los segmentos t. cargados de la dimerización y uno involucrado la activación de la transcripción. Algunos ligandos tienen múltiples recepto.. con relación estrecha, como tos tres receptores ácido retinoico (RARa, ~.y y) y los tres recepto del ácido 9-cis-retinoico (RXR a, ~~ y 'Y)-

Unión de DNA y activación de la transcripción (la identidad varía de 94 a 42%) Las regiones lermlnales Regiones de unión de hormonas N tienen <15% de y dimerización (la identidad varía Identidad (necesaria de 57 a 15%) pata activar la transcripción)

Glucocorticoides

94

57

Mineralocorticoides

90

55

Progesterona

76 50

Andrógenos

52 30

Estrógenos

47

17

Trlyodotironina

42 <15

VItamina D

45 1'5

Ácido retinoico

40

Ácido 9-cis retinoico

15

Los receptores de muchas hormonas esteroides jroideas tienen una organización similar, con una región ter_;rtal N individual, una región de unión con DNA conservada y --a región terminal Cde unión con hormonas. Las identidades :1 relativas a GR.

Los receptores de esteroides tienen dedos de zinc 1

:.,nc~tos

principales

El dominio de unión con DNA de un receptor de asteroides es un tipo de dedo de zinc que tiene la porción Cis, pero no la His. Los receptores de glucocorticoides y estrógenos tienen dos dedos de zinc cada uno, el primero de los cuales determina la secuencia diana del DNA. Los receptores de esteroides se unen con el DNA como dímeros. Los receptores de esteroides se unen al DNA como di meros.

receptores de esLeroides (y algunas otras proteítienen un tipo de dedo de zinc diferente del de :s,/His, y su estructura se basa en una secuencia .ñ el consenso de unión de zinc:

_ lS

3S)

Cis· X2 -Cis-X •l -Cis-X2 -Cis

Estas secuencias se llaman dedos Cis/ Cis2' que elen no ser repetitivos, a di[erencia de la repe:ión seriada de los de Lipo Cis/ His 2 . Los silios de -tión con DNA (cuando se conocen) son conos y :líndromos. Los receptores de glucoconicoides y estrógenos ;:neo dos dedos cada uno, ambos con un átomo de "'lC en el centro de un tetraedro de cisteínas. Los >S dedos forman a -hélices que se pliegan juntas

Unlon con DNA

Espaciado

El prímer dedo de un receptor de esteroides regula qué secuencias se unen (las posiciones se muestran en color púrpura); el segundo dedo controla el espaciado entre las secuencias (las posiciones se muestran en azul) .

para fonnar 1.111 dominio globular grande. Los anillos aromáticos de dichas hélices y una hoja ~ que conecta las dos hélices constituyen un sitio hidrófobo. Un lado de la hélice terminal N hace contacto con el surco mayor del DNA. de tal forma que dos receptores de glucoconicoides presentan dimerización al unirse al DNA, y cada uno panícipa en un giro sucesivo del surco mayor que se adapta a la naturaleza palindrómica del elemenro de respuesta (véase la sección 25.13, Los receptores de esteroides reconocen elementos de respuesta por un código combinatorio). Cada dedo controla una propiedad significativa se identifican los del receptor. En la aminoácidos importantes; los del lado derecho del primer dedo determinan la secuencia diana en el DNA y los de la izquierda del segundo dedo controlan el espaciado entre los sitios diana reconocidos por cada subunidad en el dímero (véase la secdón 25.13, Los recepwres de esteroídes reconocen elementos de respuesta por un código combinatorio). La prueba directa de que el primer dedo se une con DNA se derivó de un experimento de "trueque de especificidad" en el cual se detectó el dedo del receptor de estrógenos y se sustituyó con la secuencia del receptor de glucocorticoides. La nueva proteína reconocía la secuencia GRE (diana usual del receptOr del glucocorticoidcs) y no ERE (diana usual del receptor de estrógenos), de modo que esa región establece la especificidad para reconocer el DNA. Las diferencias entre los dedos de los receptores de glucoconicoides y estrógenos yacen sobre todo en la base de esas estructuras; la sustitución en dos posiciones que se muestra en la permite al receptor de glucocorticoides unirse a un ERE y no a un GRE. ·;_,

Los receptores de esteroides tienen dedos de zinc

65~

SD La unión con el elemento de respuesta se activa por la unión con ligando -

Misma secuencia en - - - ambos receptores

Diferente secuencia en cada receptor

Concepto principal • La unión del ligando con el dominio C terminal aumenta la afinidad del dominio de unión con Dt. ~ : su sitio diana específico en el DNA.

---

e e

G

• • ••••• • • ••• •• 1. ··>

C

S

• • • • •• • • • • •. • • • • ••...,

C

Especificidad GRE

G Especificidad ERE

La discriminación entre las secuencias diana GRE y ERE depende de dos aminoácidos de la base del primer dedo de zinc del receptor.

Este rolde

Receptor ~

.r

l " l

CITOPLASMA

NÚCLEO

Promotor GRE/potenciador

l

Activación

J

Transcripción

~

Los glucocorticoides regulan la transcripción génica al hacer que su receptor se una a un potenciador, cuya acción es necesaria para la correspondiente del promotor. 656

CAPÍTULO 25 Activación de la transcripción

Se sabe mucho acerca de la interacdón de los _ cocon icoides con su receptor, ilustrada en la . Una hormona esteroide puede pasar a tra· _ la membrana e ingresar a la célula por d.ifuslón siYya dentro de la célula, un glucoconicoide se un.. receptor. (Los trabajos sobre el receptor de gluc _ ticoides se han basado en la dexaroetasona, hoc esteroide sin té tica). No se ha definido la localiza.. de los reccprores libres, que podría estar en equL entre el núcleo y el citoplasma. No obstante, Cl..2.ia hormona se une con el receptor, la proteína se ... viene a su forma activada, que tiene mayor afir por el DNA, de manera que el complejo honr. receptor siempre se localiza en el núcleo. El receptor activado reconoce una secuenc: consenso específica que identifica al GRE, el suele localizarse en un potenciador que tal vez varios kb en flujo ascendente o descen deme -pecto del promotor. Cuando el complejo esrede -receptor se une con el potenciador, se acti promotor cercano y ahí empieza la transcripa La activación del potenciador proporciona eJ JP-, nisrno genera l por el que los esteroides regula;amplio conjunto de genes diana. La región term inal e regula la actividad _ receptor de forma que va ría respecto del receptor clividual. Si el domiluo terminal C del. receptor de 1.. coconicoides presenta deleción, la protema temr N restante se activa de forma constitutiva porque requiere de este roides para su actividad, lo cuS: giere que sin éstos, el domituo de unión de estero· :. evita que el receptor reconozca a GRE y actúa ceregulador interno negativo. La aclición de esteroi:. desactiva la inhibición, dejando libre la capacidad receptor de unirse a GREy activar la transcripciór: _ base para la represión podría ser interna, depende' Íl1teracciones con otra parre del receptor o tal vez producto de una imeracción con alguna otra prore::que se desplaza cuando se une el esteroide. La interacción emre los dominios es difere:en el receptar de estrógenos; si el dominio de uni con hormonas presenta deleción, la protema no a tivará la tra nscripción aunque con tin úa uniénd'a GRE, región que, por lo tanto, es necesaria paesrimular la actividad más que para reprimirla.

Los receptores de esteroides reconocen a los elementos de respuesta por un código combinatorio Conc~ptQS

priocipqles

• Un elemento de respuesta a esteroides consta de dos sitios mitad cortos, p¡¡lindrómicos o de repetición directa. Hay sólo dos ti pos de si ti os mitad. • Un receptor reconoce su elemento de respuesta por la

orientación y el espaciamiento de los sitios mitad. • La secuencia de los sitios mitad es reconocida por el primer dedo de zinc. • El segundo dedo de zinc se encarga de· la dimerización, que determina la distancia entre subunídades. La separación de las subunidades en el receptor determina el reconocimiento del espaciado en el elemento de respuesta. • Algunos receptores de esteroides actúan como homodímeros, en tanto que otros forman heterodímeros. • Los homodímeros reconocen elementos de respuesta palindrómicos; los heterodímeros reconocen elementos de respuesta de sitios mitad c·on repetición directa.

Cada receptor reconoce a un elemento de respuesta constituido por dos repericiones cortas (o sitios miLad), lo cual sugiere de inmediato que el receptor se une como dímero, de modo que cada mitad de la secuencia de consenso entra en contacLO con una subunidad (que recu erda la interacción operador A--represor descrita en la sección 14.11, El represor utiliza un segmento hélíce-gíro-hélice para unirse con el DNA) . Los s irios mitad pueden disponerse como estructuras palíndromas o repeticiones con la misma orienración; están separados por O a 4 pares de bases cuya secuencia carece de importancia. Sólo dos tipos de sitio mitad son utilizados por los diversos receptores, y su orientación y espaciado determinan qué recepLor reconoce al elemenro de respuesLa, de modo que los elementos de respuesta con secuencias de consenso restr ingidas serán reconocidos específicamente p or una variedad de receptores. Las reglas que n orman el reconocimiento no son absolutas, podrían modificarse por contexto, y también hay casos en que los elementos de respuesta palíndromos son reconocidos de manera p ermisible por más de un receptor, Los receptores pertenecen a dos grupos: • Los receptores de gl ucocortico ides (GR), mineraloconicoides (MR), andrógenos (AR) y progesterona (PR) forman homodímcros

TGTICT 0-4 bp AGAACA ACAAGA TCTTGT --.,

-

Glucocorticoíde (GR) Mineralocorticoide (MR) Andrógeno (AA) Progesterona (PR) Los elementos de respuesta formad os en el sitio mitad palindrómico TGTTCT son reconocidos por varios receptores difere ntes, dependiendo del espaciado entre tos sitios mitad.

TGACCT ACTGGA Q-5

,.---RXR

TGACCT

bp ACTGGA /'

1 bp 3 bp 4 bp

• RXR · VDR • T3R

5 bp • RAR

Los elementos de respuesta con la repetición directa TGACCT son reconocidos por heterodímeros, de los cuales es miembro RXR.

y reconocen elementos de respuesta cuyos sitios mitad tienen la secuencia de consenso TGTTCT; en la se m uestra que se disponen de manera palindrómica y que el espaciamiento entre ellos determina el tipo de elemento. El receptOr dt: estrógenos (ER) actúa de la misma forma, pero tiene la secuencia TGACCT del sitio mitad . • El receptor del ácido 9 -cis-retfnoíco ('RXR ) forma homodímeros y también heterodímeros con -1 5 receptores adicionales, inclui do el tiroideo (T3R), el de la vitamina D (VDR) y el del ácido retinoico (RAR). En la se muesLra que los dímeros reconocen a los medios elementos con la secuencia TGACCT; estos últimos se disponen como repeticiones directas y su reconoclrniemo es controlado por el espaciado entre ellos. Algunos de los recepwres hererodiméricos se acrivan cuando el ligando se une a su contraparte por RXR, en tanto que otros se pu eden activar por unión de ligandos, ya sea a esta subunidad o a la subunidad RXR. Esos recepLOres también p ueden formar homodímeros que reconocen secuen cias palíndromas .

25 .• 3 Los receptores de esteroides reconocen a los elementos de respuesta por un código combinatorio

657

Ahora ya es posible entender las bases de la especificidad del reconocimiento. Recuérdese que La Figura 25.17 muestra cómo el reconocimiento de la secuencia del sitio mitad es conferido por la secuencia de los aminoácidos en el primer dedo, mientras que la especificidad para el espaciamiento entre los sitios mitad reside en Jos aminoácidos del segundo dedo. la estructura del dímero determjna la distanCia emre subunidades, que se establece en giros sucesivos del surco mayor y así conu-ola la respuesta del espaciado de los sirios mitad. Las posiciones exactas de las moléculas encargadas de la dimerización difieren de las combinadones individuales pareadas. ¿Cómo activan la transcripción los receptores de esteroides? No actúan directamente en el aparato basaL más bien a uavés de un complejo activador. El coactivador rjenc varias actividades, entre otras, el componcme común CBP/p300, una de cuyas funciones es modificar la estructura de la cromatina por acerilación de histonas (véase la Fig. 30.14). Todos los recep10res de la superfamilia son activadores de la transcripción. que dependen del ligando, pero algunos también pueden reprimir la transcripción. Los receprores TR y RAR se unen a ciertos lod en f01ma de heterodímeros con RXR en auseuc1a de un ligando y reprimen la transcripción mediante su capacidad de interacción con una proteína correpresora, que anúa por el mecanismo inverso al usado por los coactivadores, es decir, inhibe

Correpresor

l

Coactivadores ""'PCAF CBP/p300

Ug¿

~----

Pollmerasa de RNA

----------

los receptores de esteroides TR y RAR se unen con el correpresor SMRT en ausencia de un ligando. El promotor no se expresa. Cuando el SMRT es desplazado por la unión de un ligando, el receptor se une a un complejo coactivador, lo cual conduce a la activación de la transcripción por el aparato basal. 658

CAPiTULO 25 Activación de la transcripción

la función del aparato de transcripción basa: de cuyas acciones es la desacetilación de his¡ (véase La Fig. 30.16) . Se desconoce la irnporw: relativa de la actividad del represor frente a le. : vadón dependiente del ligando en la respue; siológica a la hormona. El efecto de la unión del ligando con el rec~ es la conversión de un complej o represor eT! activador, como se muestra en la .~ hay un ligando, el recepror se une a un com· correpresor; el componcnre del correpresor q une con el receptor es SMRT y la unión dellig< produce \10 cambio de conformación que lo de:za, lo cual permite que el coactivador se una.

Los homeodominios se uner con dianas relacionadas en el DNA Conceptos principales

• El horneodominio es un dominio de DNA de 60 aminoácidos que tiene tres a-hélices. • El e terminal del a-hélice 3 tiene 17 aminoácidos) :: une con el surco mayor del DNA. El brazo N terminal del homeodominio se proyecta hacia el surco menor del DNA. las proteínas que contienen homeodominios puede~ corresponder a activadores o represores de la transcripción.

La homeocaja es una secuencia que codifica dominio de 60 aminoácidos en las proteína' muchos organismos cucarióticos cuyo nombr~ deriva de su identificación origina l en los loci meóticos de Drosophila (cuyos genes determina identidad de las estructuras corporales). Se enct. tra en muchos de los genes gue regulan el d, rrollo temprano en el género Drosophila, así e en segmentos relacionados de genes de una arr· variedad de cucariotas superiores. El homeodon"·se encuentra en muchos genes encargados de la gulación del desarrollo, y las secuencias relaciona con él forman parte de varios tipos de Iactore::transcripción de animales. En los genes homeóticos del género Drosop ·: a menudo el homeodominio está cerca del extre:ternúnal C. En la se resumen algu:ejemplos de genes con homeocaja . Con frecut: cia, la conservación de las secuencias en los gL es escasa, excepto en la homeocaja, en la cua' variable. Un grupo importallle de genes del géro Drosvphila que la incluyen, úene una secue& _ bien conservada, con sim ili!Udes del 80% aJ 9(

.o compa raciones pareadas, mientras que en otros as bomeocajas tienen una relación menos estrecha. :::1 homeodominio suele combinarse con otros seg--.emos en factores de transcripción animales, como •.::1 las proteínas Oct (de unión de octámero), donde .oa cadena conservada de 75 aminoácidos, Uamada región Pou, se localiza cerca de una región que si1ula el homeodominio. Las homeocajas del grupo "\tu de proteínas cuya relación es menos estrecha ün el grupo origina l constilllyen la extensión más '~ejada de la familia. El homeodominio se encarga de la unión con NA y los experimentos de trueque de bomeodo-:linios cnrrc proteínas sugieren que la especificidad el reconocimiento del DNA yace en el homeodo:Jinio. per o como con los represores de fagos, no se 1uede deducir un código simple que relacione las . ecuencias de proteínas y el DNA. La región termi.al C del homeodominio es homólogo al segmento lélice-giro- hélice de los represores procarióticos. En a sección 14.11 , El represor u tiliza u11 segmento .élice-giro-hélice para unirse al DNA, ya se hizo derencia a que el represor A tiene una "hélice de ~conocimiento" (hélice o:-3) que hace contacro en J surco mayor del DNA, en tanto que otra (hélice ~-2 ) yace en un ángulo que atraviesa el DNA. El omeodominio puede organizarse en tres regiones .dicoidales potenciales; en la se coroaran las secuencias de los tres ejemplos; la parte 1ejor conservada de la secuencia yace en la tercera élice. La diferencia entre dichas estructrnas y las .. d represor procaríótico se encuentra en la longitud •e la hélice que reconoce al DNA, hélice -3, que tie e 17 aminoácidos de longitud en el homeodom1nio ·especro de los nu eve del represor A.

En la se representa esquemática mente la estructura de la proteína dentada del homeodominio de D. melnnogaster. La hélice 3 se une en el surco mayor del DNA y establece el mayor número de contactos entre la proteína y el áddo nucleico, de los cuales, muchos de los que orientan la hélice en el surco mayor son con la columna de fosfatos, de manera que no son específicos para la seruenda del DNA, sino que se encuentran sobre todo en una cara de la doble hélice y flanquean las bases con las que se hacen contactos específicos. Los contactos restantes son del brazo terminal N del homeodominio, secuencia inmediata a la primera

Homeodominio

1

Antp en eve

400

Hox Oct-1

763

Ocl-2

467

El homeodominio puede ser el único segmento de unión con DNA en un regulador transcripcional, o podña combinarse con otros segmentos. Representa una parte bien definida (60 moléculas de la proteína) .

En Antp

1 Brazo N terminal ;o Hélice i 20 Glu UsArg Pro Arg Treo Ala Phe SerSer Glu Gln LeuAia Arg Le u Us Arg Glu Phe Asn Glu ArgUs Arg Gli Arg GlnTreoTirTreoArg TirGinTreoLeuGiuLeuGiulls GluPhe His Phe

Oct-2

Arg Arg Us Lis Arg TreoSer lle GluTreoAsn Val Arg PheAia Leu Giu Lis Ser Pne Le u Ala ~

H~~2

~

En Antp

Asn Arg TirleuTreoGiuArgArg Arg Glu Glu LeuSef SerGiu LeuGii Leu Asn ArgTirleuTreoArgArgArgArglle Glu lle Ala His Ala LeuCis Leu

Oct-2

Asn Glu LisPro TreoSerGluGiu lle Leuleune Ala Glu Gln LeuHis Met

En

41 so Hélice 3 60 Asn GluAiaGinlle Lis 11& TrpPheGinAsnLISArgAialis lle Lts Lis SerAsn

Antp

TreoGiu ArgGin lle LJs lle TfpPileGlnAsnArgArg MelltS Trplls Lts GIUAso

Oct-2 Glu Lis GluVallie ArgVa!TrpPheCisAsnArgArgGinlis Giulls Arglle Asn El homeodominio de un gen del género Antennapedio representa el principal grupo de genes con homeocajas en el género Drasophilo¡ el dentado (en) representa otro tipo de gen homeótico, y el factor Oct-2 de mamífero, a un grupo de factores de transcripción con relación distante. El homeodominio se numera de manera convencional del 1 al 60. Se inicia con el brazo terminal N y las tres regiones helicoidales ocupan las posiciones 10· 22, 28· 38 y 42-58. Los aminoácidos señalados en azul se conservan en las tres muestras.

25.14 Los homeodominios se unen con dianas relacionadas en el DNA

659

El brazo terminal N Las hélices 1 y 2 yacen sobre el DNA yace en el surco meno

28

1

\u ;SA

4~ ) 10

La hélice 3 yace en el surco mayor

La hélice 3 del homeodominio se une con el surco mayor del DNA, con las hélices 1 y 2 fuera de la doble hélice. la hélice 3 hace contacto con la columna de fosfatos y las bases especificas. Et brazo terminal N yace en el surco menor y hace contactos adicionales.

Las mismas contrapartes (Exd y Hth) están pretes con cada proteína 1Tox en el complejo trim¿por Jo que sigue siendo un enigma la forma er se manifiesta la especifLcidad de cada una de e Las proteínas del homeodominio pueden e Iituir activadores o represores de la transcrip ... pero la naturaleza del factor depende de Olro u dominios, pues el homeodominio se encarga só la unión con DNA. El dominio acrivador o el re sor actúan ambos por influenda en el aparato t ?Los dominios activadores pueden interactuar coactivadorcs, que a su vez se unen a los corr"" nemes del aparato basal. en tanto que los dorlli del represor también inleractúan con el apara• transcripción (esto es, no acrúan impidiendo e • ceso al DNA como tal). El represor Eve, por ejerr:. interactúa directamen te co n TF 0 D.

~ hélice, y se proyecta hacia el surco menor. Así. las regiones terminal N y terminal C del homeodominio son Jas principales encargadas de hacer contacto con el DNA. Una demostración sorprendeme de la generalidad de este modelo se deriva de una comparación de la estructura cristalina del homeodominio de la proteína dentada con la de la proteína de apareamiento a2 de las levaduras. El dominio de unión con DNA de esta proteina semeja un homeodominio, puede formar tres hélices similares y su estructura en el surco de DNA puede estar superpuesta casi exactamente sobre la del homeodominio dentado. Esas similitudes sugieren que todos los homeodominios se unen con el DNA de la misma forma. lo cual significa que el número relativamente pequeño de moléculas de la hélice- 3 y el brazo terminal N se encarga dt: la especificidad de los contactos con el DNA. Un grupo de proteínas con un homeodominio es el de las protcú1as Hox, que se unen con el DNA con una especificidad de secuencia bastante baja y han constituido un enigma en cuanto a su forma de presentar diferentes especificidades; de ahí se deriva que las proteínas Hox a menudo se unen con el DNA como heterodímeros con una contraparte (llamada Exd en moscas y Pbx en los vertebrados). El heterodímero tiene una especificidad más restringida in vicro que una proteína Hox, por lo generaL se une a la secuencia de lO bp TGATNNATNN, pero esto no basta para explicar las diferencias de espedfiddad de las proteínas Hox. Una lercera proteína, Hth, necesaria para localizar a Exd en el núcleo, también forma parte del complejo que se une con DNA y puede restringir aún más los sitios de unión.

660

CAPÍTULO 25 Activación de la transcripción

Las proteínas hélice-asa-hélice interactúapor ví nculo combinatorio

Conceptos principales • las proteínas hélice-asa-hélice tienen un segmente de 40 a 50 aminoácidos que incluye dos a hélices anfipáticas de 15 a 16 aminoácidos, separados por _asa. • las hélices se encargan de la formación de dímeros. • Las proteínas bHLH tienen una secuencia básica adyacente al segmento HLH, que se encarga de la unión con el ONA. Las proteínas de clase A bHLH son de expresión ub;: en tanto que las de clase B bH LH son específicas d¡:, tejido. • Una proteína de clase B por lo general forma un heterodfmero con una proteína de clase A. • Las proteínas HLH que carecen de región básica impiden que la contraparte bH LH de un hetero díme ·~ se una con el DNA. • las proteínas HLH forman vínculos combinatorios q.;, podñan cambiar durante el desarrollo por la adiciór : la eliminación de proteínas específicas.

Dos carac1erísticas comunes de las protein
·~

MyoO

Ala Asp Arg Arg usAia Ala Treo Mal Arg Gln Arg Arg Arg

Id

Arg Leu Pro Ala Leu Leu Asp Gln Glu Gtu Val .Asn Val Leu

MyoD Id

Leu Ser Lis Val Asn Gln Ala Phe Gln Treo Leu Us Arg Cís Treo

Hélice

Leu Tír Asp Met ~ Glo Cis

Se encuentran moleculas

Myo O l.Js Id Us

r.,

ser Arg Leu us Gln Leu Val

Val Gln lle Leu Arg Asn Ala lle Arg 1ir lle Gln Gn Leu Gll.l

Reglón b3slca Se1s moléculas conservadas están ausentes de Id 1

conservadas tanto en Myod como en Id Hélice 2

Val Gln lle Leu Glu His Val lle Asp Tir lle Arg Asp Leu Glu

Todas las proteínas HLH tienen regiones que corresponden a las hélices 1 y 2. separadas por una asa de 10 a 24 aminoácidos. Las proteínas básicas HLH tienen una región con cargas positivas conservadas, inmediatamente adyacentes a la hélice l .

.eínas de ese grupo forma n homodfmeros y heteroj ímeros mediante interacciones entre los fragmen .os hidrófobos de la cara correspondiente de ambas ••élices. Las regiones helicoidales tienen de 15 a 16 ~mi n oácidos de longitud y cada una incluye varios se com.:agmemos conservados. En la aran dos ejemplos. La capacidad de formar (líme ·os reside en estas hélices antipáticas y es cornún a :odas las proteínas HUI. El asa probablemente sea i!Tlportante sólo para dar libertad de interacción in.lependieme a dos regiones helicoidales. Casi todas las proteínas HLH contienen una :egión adyacente al segmento del mismo nombre ;ue, en sí, es altamenre básico, y se necesita para la Joión con DNA . Hay -6 moléculas conservadas en Jna cadena de 15 aminoácidos {véase la Fig. 25.26). -Os miembros de l grupo que la tienen. se llaman proteín as bHLH . Un dímero en que ambas subJnidades tienen la región básica, puede unirse al JNA. Los dominios HLH probablemente orieman .:e manera correcta las dos regiones básicas apona.!as por las subunidades individuales. Las proteínas bHLH forman parte de dos grupos jen era les. La clase A consta de proteínas con ex-:'lresión ubicua, incluida la E l 2/E47 de mamífero, ::n tamo que la B está formada por proteínas que ){~ expresan en forma específica de tejido. incluidas •iyoD. miogcnina y Myf-5 de mamífero {gntpo de 1ctivadores que participa en la miogénesis [forma.:ión de músculoj). Una forma de acción frecuente je una protefna bHLH específica de tejido es formar ..!n heterodímero con una comrapane ubicua. Hay .irnbién un grupo de productos génicos que espejfican el desarrollo del sistema nervioso de D. me..:nogaster (donde Ac·S es el componente específico le tejido y da el componente ubicuo). Las proteínas . lyc (contraparte celular de productos oncogéni.:vs que participan~ la regulación del crecimiento) orman una clase apane de proteínas bHLH, cuyas ~onrrapartes y dianas son diferentes.

Los dímeros formados a partir de pro teínas bHLH difieren en su capacidad de unión con el DNA; por ejemplo, los homodímeros E47 y los heterodímeros El2-E47 y MyoD-E47 se forman eficazmente y se unen con fuerza al DNA; El 2 presenta buena homodimeri7.ación. pero se une mal a l DNA, en tanto que MyoD apenas presenta homodimeri· zación. Así. tamo la fonnación de dímeros como la unión con DNA pueden representa r importantes punros reguladores. En ese contexto, es posible definir grupos de proteínas HLH cuyos miembros forman diversas combinaciones pareadas, pero a partir de las secuencias no es posible pronosticar la fortaleza de la formación de dímeros y de la unión con DNA. En ese grupo, wdos los dímeros que se unen con el DNA reconocen la misma secuencia de consenso. pero no se sabe aún si diferentes homodímeros y hetcrodímt'ros tienen preferencia por sitios dianas ligeramente diversos reladonados con sus funciones. Las diferencias en el resultado de la unión con el DNA dependen de las propiedades de la región del segmento HLH o cercana a ésta; por ejem plo, El2 ctifiere de E47 porque posee una región inhibídora muy cerca de la región básica. qu e impide qu e el DNA se una a homodímeros. Algunas proteínas HUI carecen de la región básica, contienen moléculas de prolína, o ambos, lo cual parece modificar su función. En la Figura 25.26 se muestra el ejemplo de la proteína Id, que tiene la misma capacidad de formar dímeros que las proteínas bHLH, pero un dímero que contiene una subunidad de ese tipo ya no puede unirse de manera específica con el DNA, lo cual constituye una demostración convincente de la importancia de la duplicación del segmenro de unión con DNA en proteínas de unión con DNA . La importancia de la diferenciadón entre las pro teínas HLH y bHLH no básicas es sugerida por las propiedades de dos pares de proteínas HlH, el par da-Ac-S/emc y el par MyoD/ld. En la se

2::1•• > Las proteínas hélice-asa-hélice interactúan por vínculo combínatorio

661

las protelnas bHLH presentan dlmerlzación

y se unen con el ONA

HLHi •··r ~ Región básica'

Las protel nñs HLH no basfcas Impiden la unión con ONA

~ ····:····

• -HLH

1 ...Sin región básica

Myo0/E12 o Ac-S/da

E12/ld oAC-S/emc

... Afinidad Insuficiente para unirse al ONA

Un dímero HLH donde ambas subunidades son de tipo bHLH se puede unir al DNA, a diferencia de uno en que una subunidad carece de región básica.

ilustra un modelo de sus funciones en la formación de una red regulaLOria. En D. melanogaster el gen eme (extramacroclzaetae) es necesario para establecer el parrón espacial normal de Jos órganos sensoriales del adulto; actúa suprimiendo la función de varios genes, incluidos da (sin hermana) y achaerescute (complejo Ac-S). Ac-S y da son genes de tipo bHLH. El supresor eme codifica una proteína HLH que carece de la región básica, y se supone que en ausencia de una fundón eme, las proteínas da y Ac-S forman dímeros que acrivan la transcripción de genes diana apropiados, pero la producción de la proteína eme da lugar a la síntesis de heterodímeros que no pueden unirse al DNA, así qut:' es necesaria la producción de dicha proteína e11 las células apropiadas para suprimir la funci ón de Ac-S/da. La formación de células musculares es desen cadenada por un cambio en el programa de transcripción que requiere varias proteínas bHLH. entre otras, MyoD. la cual es producida específicameme en células m iógenas. además de que la sobreexpresión en otras células puede inducirlas a iniciar un programa miogénico. El desencadename de la diferenciación muscular es tal vez un hererodímero constituido por MyoD-El2 o Myo-E47, más que un homodímero de MyoD. Antes de que se inicie la miogénesis. un miembro de tipo no básico de HLH. la proteína Id, se puede unir a MyoD, El2, o ambas, y E47, para formar hererodímeros que no se pueden unir al DNA; se une mejor a El2/E47 que a MyoD y, por tanto, podría acUlar por secuestro deJa cont raparte bHLH ubicua. La sobreexpresión de Ld put:'de evitar la miogénesis, de modo que su 66 2

CAPÍTULO ?!l Activación de la transcripción

elimi nación podría desencadenar la liberaC' MyoD para iniciar la miogénesis. Un activador de bHLH, como MyoD, pueoc trolarse en varias formas; se evita su unión .._ DNA cuando es secuestrado por una contr" HLH, como ld y suele activar la !l:anscripción ~ a una contraparte bHLH. como El2 o E47. Tar: puede actuar como represor específico de sitio·_ a otra contraparte; la proteína bHLll MyoR . un dímero MyoD-MyoR en los mioblastos en ceso de proliferación, que reprime la transcr (en Jos mismos loci diana donde MyoD-El.: activa la transcripción} . El comportamiemo de las proteínas HLB tanto, Hustra dos principios generales de la ; _ !ación de la transcripción . Un pequeii.o núme!" proteínas forma vínculos combinatorios. Las ( binaciones particulares tienen funciones diferl.respecto de la unión con DNA y la reguladc la transcripción. La diferenciación puede dept. de la presencia o eliminación de contrapartes ticulares.

Las cremalleras de leudna participan en la formación

de dímeros Conceptos principales La cremallera de leucina es una hélice anñpática que presenta dimerización. La cremallera es adyacente a una región básica que SE une con el DNA. La dimerización forma el segmento bZIP donde se uneen forma simétrica dos regiones básicas a re peticione;; invertidas del DNA.

Las interacciones entre proteínas son un te:-:-frecuente en la estructuración de un complejo transcripción, y un segmemo que se encuentra t varios activadores (y otras proteínas) panlcipa en '"' imeraccioncs de homodímeros y heterodímeros. =..cremallera de leudna es una cadena de aminoácid rita en moléculas de leucina que proporciona L segmento de dimerizae~ón. La formación del díme~ en sí surgió como principio común a la acción =_ las proteínas que reconocen secuencias específic: de DNA, y en el caso de la cremalle1·a de leucina, s. relación con la unión con DNA es parúcularmen~~ clara. porque se puede ver cómo la dimerización yuxtapone a las regiones de unión con DNA de ca¡.¿ subun.idad. En la se presenta de maner.: csqucmátíca la reacción. En la estructu ra de una a hélice anfipática, !. grupos hidrófobos (incluida la Jeudna) están en ll-

:~do

y los cargados en el orro. Una cremallera de forma una hélice anfipática en que las moéculas de leucina de la cremaUera de la proteínapo'rían sobresalir del ex. hélice e interdigitarse con las _ucinas de la cremallera de otra proteína en paraele, de modo de formar un asa ensortijada. Las dos ;élices dextrógiras se enredan una en torno a la otra :tOn 3. 5 moléculas por giro, de manera que el patrón e repite integralmente cada siete moléculas. ¿Cómo se relaciona esta estructura con la unión : ·m DNA? La región adyacenre a las leucinas repetilas es altamente básica en cada una de las proteínas le cremallera y podría constituir un sitio de unión :vn DNA. De hecho, la~ dos cremalleras tie leudna 1rman una estructura en Y en la que las primeras • mstitu yen el tronco y las dos regiones básicas se Jd hic ren para formar los brazos que se unen con :1 DNA, Jo cual se conoce como segmento estruc ·uraJ b Z IP y explica porqué las secuencias diana >ara tales proteínas son repeticiones invertidas sin epa roción. Para fomentar la formación de homodímeros heterodímeros se pueden usar cremalleras, son =~gmen t os largos. La Jeucina (u otro aminoácido ..idrófobo) ocupa cada séptima posición de la cremallera potencial. Hay cuatro repeticiones en lacre11allera (Leu-X6 ) de la proteína C/EBP (facwr que -e une corno dímero tamo a la caja CJ\AT como al '10tenciador central SV40) y cinco repeticiones en os facrorr.s .Jun y Fos (que forman un activador '1eterodimérico, AP l). El APl fue identificado por primera vez mer:ed a su unión con una secuencia de DNA en el "Otcnciador SV40 (véase la Fig. 24.14). La prepa ·ación activa de APl incluye varios polipéptidos. :.n componente ímponante es Jun, producto del ~en r:-jun, identificado por su relación con el on:ogén c-fun que pon a e l virus del sarcoma avjario. ::1 genoma del ratón contiC'ne una fami lia de genes relacionados, c-jun (aislado origi nalmente), junB y .mD (idemificados por homología de secuencias con :m). Las tres proteínas Jun muestran considerables imilitudes en su secuencia; tienen cremalleras de eucina que pueden interactuar para formar homoi fmeros o heterodímeros. El otro componente importante de APl es el roducto de un gen adicional con una contrapare oncogénica. El gen c-fos es el homólogo celular el oocogén v-Jos que pona el virus del sarcoma 'Ilurino. La expresión de e-Jos activa genes cuyos romotores o potenciadores poseen un sitio diana \Pl y cuyo productO es una fosfoproteína nuclear ~ue pertenece a un grupo de proteínas. Las otras ·C describen como antígenos relacionados con Fos FRA) y constituyen una familia de proteínas simiares a Fos. ~ucina

Las leucinas de las caras hidrófobas de las hélices interactuan

1 La reg10n oas1ca se une con DNA Subunídad

~

La región oásíca se une con DNA

1

Subunidad 2

Las regiones básicas del segmento bZ1P se mantienen juntas por la dimerización de la región en cremallera adyacente cuando las caras hidrófobas de dos cremalleras de leucina interactúan en orientación paralela.

La proteina Fos también tiene una cremallera de leucina, no puede formar homodímcros. pero sí un heterodímero con Jun; para la reacción se requiere de una cremallera de leucina en cada proteína. La capacidad de formar dímeros es una parte cruda! de la interacción de estas factores con el DNA. y la proteína Fas no puede en sí unirse al DNA, ral vez por su imposibilidad de formar un dímero. Sin embargo, el heterodímero Jun-Fos puede unirse al DNA con la misma especificidad de diana que el dímero Jun-Jun, y ese heterodimero se une con sitio APl con una afinidad -lOx respecto de la del homodímero Jun.

Resumen Los [actores de transcripción incluyen a basales, activadores y coacrivadores. Los factores basales imeractLJan con la polimerasa de RNA en e l punto de inicio; los activadores se unen a elementos de respue:;ta cortos específicos (Res) localizados en promotores o potenciadores y los aclivadores acrúan mediante interacciones proteína-proteína con el aparato basal. Algunos acúvadores interactúan directamente con el aparato basal, en tanto que otros requieren de coactivadorcs para mediar la interacción. Lo~ activadores a menudo tienen una estructura modular con dominios independientes encargados de la unión con DNA y la activación de la transcripción. La principal función del dominio de unión con DNA puede ser insenar el dominio activador cerca del complejo de uuión. Algunos elementos de respuesta están presemes en muchos genes y son reconocidos por [actores ubicuos, otros se enruentran en unos cuantos

?S 11

Resumen

663

genes y son reconocidos por factores específicos de tejidos. Los promotores de la polimerasa de IT de RNA comienen una variedad de elementos de acción cortos en configuración cis, cada uno reconocido por un facwr de acción en configuración trans. Los elementos de acción en configuración ds se localizan en flujo ascendeme respecto de la caja TATA y pueden presentarse en cualquier orientación y a diferentes distancias respectO del punto de inicio. Los elementos de Uujo ascendente son reconocidos por activadores que interactúan con el complejo de transcripción basal para determinar la eficacia con que se usa un promotOr. Algunos activadores interactúan dircc1amente con componentes del aparara basal, y otros, a través de un intermedia1io llamado coaclivador. Las dianas del aparato basa l son TAF de TFuD. TFnB o TFnA. La interacción estimula el ensamblaje del aparato basal. Ono segmento implicado en la unión con DNA es el dedo de zinc, que se encuentra en proteínas que se unen con el DNA o el RNA (y en ocasiones con ambos). Un dedo tiene moléculas de cisteína que se unen con el zinc. Un tipo de dedo se encuentra en repeticiones múltiples de algunos factores de transcripción. y el orro, en repeticiones únicas o dobles de otros. Se han identificado varios grupos de factores de transcripción por homologí'a de secuencias. El homeodomio.io es una secuencia de 60 moléculas que se encuemra en genes que regulan el desarrollo de insectos y gusanos, así como en factores de transcripción de mamíferos; se relaciona con el segmento procariótico hélice-giro-hélice y proporciona el segmento por el que los factores se unen con el DNA. La cremallera de leucina comiene una cadena de aminoácidos rica en leucina que participa en la dimerización de los factores de transcripción . Una región básica adyacente se encarga de la un ión con DNA. Los receptores de esteroides fueron los primeros miembros identificados de un grupo de lactares de transcripci6n en que la proleína se activa por unión con una pequeña hormona hidrófoba. El factor activado se localiza en el núcleo y se une a su elememo de respuesta espeófico. donde activa la transcripción. El dominio de unión con DNA tiene dedos de zinc. Los receptores son homodímeros o hcterodímeros. Los primeros reconocen todos los elementos de respuesta palindrómicos con la misma secuencia de consenso; la diferencia emre los elementos de respuesta es el espaciado de las re peticiones invertidas. Los heterod.ímeros reconocen repeticiones directas, que se distinguen asimismo por el espaciado emre repeticiones. El segmento 664

CAPÍTULO 25 Activación de la transcripción

de unlón con DNA de esos receptores incluye dedos de zinc; el primt:ro determina qué secuer de consenso se reconoce y el segundo respond. espaciado entre las repeticiones. Las proteínas HLH (hélice-asa-hélice) tiel1' hélices anfipáticas encargadas de la dimerizaáéadyacemes a regiones básicas que se unen cor DNA. Las proteínas bHLH tienen una región ba. que se une con DNA y pertenecen a uno de grupos, de expresión ubicua y específicas de tejil> Una proteína activa suele ~er un heterodímero e dos subunidades, una de cada grupo. Cuando dímero úene una subunidad sin región básica puede unirse al DNA, de ma nera que las subuni. des pueden evitar la expresión gén ica. Los víncu. combinatorios de sub~m idades forman redes re.,. la doras. M u chos factores de transcripción actúa n co::dímeros, y es frecuente que haya múltiples rnit::bros de una fami lia que fo rman hererodímewhomodímero~. lo cual da lugar al potencial de rigir la expresión genética para las combinado .. complejas. En algunos casos, una familia inclu miembros inhibitarios, cuya participación en la~ mación de dímeros impide que su comrapane aG la transcripción.

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E!IJ

Dominios independientes se unen con el ONA y activan la transcripción

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Ell

El anAlisis de dos híbridos detecta interacciones proteína-protelna

"rtn·uto de

invP~ti~ación

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m

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Las cremalleras de leucina participan en la for!Tl? -

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m Artkul::t

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666

CAPíTULO 25 Activación de la transcripción

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Corte, empalme y procesamiento del RNA ESQUEMA DEL CAPÍTULO La RNPsn U1 inicia el corte y empalme

IntrodLicción

La RNPsn U1 inicia el corte y empalme por unión con el sitio 5' mediante una reacción de apareo RNA-RNA. E1 complejo E contiene RNPsn U1 unida al sitio 5', La proteína U2Af unida a una vla de pirimidina entre el sitio de ramificación y el de corte y empalme 3', y proteínas SR que conectan la RNPsn Ul con la U2AF.

Las uniones de corte y em palme nucleares son secuencias cortas Los sitios de corte y empalme son las secuencias que rodean inmediatamente los limites de exón-intrón. Se nombran de acuerdo con sus posiciones respecto de intrón. El sitio de corte y empalme 5' del extremo S' (izquierdo) del intrón incluye la secuencia de consenso GU. • El sitio de corte y empalme 3' está en el extremo 3' (derecho) del intrón e incluye la secuencia de consenso AG. • La regla GU-AG (originalmente llamada regla GT-AG según la secuencia de DNA) describe la necesidad de esos dinudeótidos constantes en las dos primeras y las dos últimas posiciones de los intrones en los pre-RNAm.

El complejo E puede formarse por definición de intrón o exón La via directa de formación de un complejo E es pc.ra RNPsn U1 unirse al sitio de corte y empalme 5' y para U2Af, unirse a una llia de pirimidina entre el sitio de ramificación y el de corte y empalme 3'. Otra posibilidad es que el complejo se forme entre U2 AF en la llia de pirimidina y RNPsn Ul en el sitio 5' de corte y empalme de flujo descendente. El complejo E se torna en A cuando la RNPsn U2 se une con el sitio de ramificación. Si se forma un complejo E utilizando el sitio 5' de corte y empalme de flujo descendente. éste es sustituido por el correspondiente 5' de flujo ascendente cuando el complejo E se convierte en el complejo A. Los sitios de corte y empalme 3' débiles pueden requerir un potenciador de corte y empalme localizado en el exón de flujo descendente para unirse directamente con las proteínas SR.

Las uniones de corte y empalme se leen por pares El corte y empalme depende sólo del reconocimiento de pares de uniones de corte y empalme. Todos los sitios de corte y empalme 5' son funcionalmente equivalentes, igual que los sitios de corte y empalme 3'.

El corte y empalme del pre-RNAm procede a través de un lazo • El corte y empalme requiere de Los sitios 5' y 3' y de un sitio de ramificación justo en flujo ascendente respecto del 3'. La secuencia de ram ificación se conseNa en levaduras, pero esU menos bien conseNada en eucaríotas superiores. Cuando el intrón se escinde en el sitio de corte y empalme 5' y este último se une en la posición 2' de una A. en el sitio de ramificación dentro del intrón, se forma un lazo. • El intrón se libera como lazo cuando se escinde en el sitio de corte y empalme 3'; después se juntan los exones izquierdo y derecho. • Las reacciones ocurren por transesterificación, donde un enlace es transferido de una localización a otra.

Cinco RNPsn forman el empalmosoma La unión de las RNPsn US y U4/U6 convierte al co11plejo A en el empalmosoma Bl, que contiene todos los componentes necesarios para el corte y empalme. El empalmosoma pasa a través de una serie de complejos adicionales conforme avanza el proceso. La liberación de la RNPsn Ul permite al RNAsn U6 interactuar con el sitio de corte y empalme 5' y convierte al empalmosoma Bl en empalmosoma 82. Cuando U4 se disocia de la RNPsn U6, este último puede aparearse con el RNAsn U2 para formar el sitio catalítico activo.

Se requieren RNAsn para el corte y empalme Los cinco RNAsn implicados en el corte y empalme son U1. UZ. U5, U4 y U6. Con algunas proteínas adicionales, las RNPsn forman el empalmosoma. Todas las RNPsn, excepto U6, contienen una secuencia conseNada que se une a proteínas Sm, reconocidas po1 anticuerpos generados durante una enfermedad autoinmunitaria.

.,

Un aparato alternativo de corte y empalme utiliza diferentes RNPsn Una vía alterna de corte y empalme utiliza otro conjunto de RNPsn que constituyen el empalmosoma U12.

Continúa en la siguiente página

667

• la endonucleasa de las levaduras es un heterotetrAmero con dos subunidades catalíticas (relacionadas). • Utiliza un mecanismo de medición para determinar .:. sitios de escisión por sus posiciones relativas respe..de un punto de la estructura del RNAt. • la nucleasa antigua trene una estructura más senciu y reconoce segmentos estructurales de protuberanc': helice-protuberancia en el sustrato.

• los intrones diana se definen por secuencias de consenso más largas en las uniones de corte y empalme, pero, en general, incluyen las mismas uniones AU-AC. • Ciertos intrones tienen las uniones de corte y empalme AU-AC, incluidos algunos dependientes de U1 y otros, de Ul2.

El corte y empalme está relacionado con la exportación del RNAm • Las protefnas REF se unen a las uniones de corte y empalme por un vinculo con el empalmosoma. • Después del corte y empalme se mantienen adheridas al RNA en La unión exón-exón. • Interactuan con la proteína de transporte TAP/Mex, que exporta el RNA a través de un poro nuclear.

BE

'miJ

implica el uso diferencial de uniones de corte y empalme

Las reacciones de corte y empalme en configuración trans utilizan RNA pequeños

fE4Ii)

gm

La endonucleasa de corte y empalme reconoce al RNAt o Una endonucleasa escinde los precursores oe RNAt en ambos extremos del intrón.

668

CAPÍTULO 26 Corte, em palme v procesamiento del RNA

Los extremos 3' del RNAm se generan por escisión y poliadenilación • la secuencia AAUAAA es una señal para la escisit· que genera ún extremo 3' del RNAm poliadeniladG. • La reacción requiere de un complejo proteínico q~~ contiene un factor de especificidad, una endonúc:: y una po.imerasa poli{A). • El factor de especificidad y la endonucleasa escin;;,; el RNA en flujo descenaente respecto de AAUAAJ... • El factor de especificidad y la polimerasa poli(A) agregan continuame11te -200 moléculas de A al extremo 3'. • En el género Xet~opus, las secuencias ricas en A-l; :~ cola 3' controlan la poliade11ilación o desadenilac-crtoplasmática durante el desarrollo embrionario.

El corte y empalme del RNAt en levaduras implica escisión y reunión El corte y empalme de RNAt se debe a reacciones sucesivas de escisión y ligadura.

los extremos 3' de los productos de transcripción pol 1 y pol III se generan po· ter mi nación • La polimerasa I de RNA termina la transcripción e:; una secuencia ñnalizadora de 18 bases. • La polimerasa III de RNA te rmina la tra nscripción" secuencia poli (U)4 de una secuencia rica en G-C..

• Las reacciones de corte y empalme suelen ocurrir sólo entre unior~es de corte y empalme en configuración cis de La misma molécula de RNA. • En los tripanosomas y gusanos ocurren corte y empalme en configuración trons en el sitio en que una secuencia corta (RNA SL) se empalma con los extremos 5' de muchos RNAm precursores. la estructura del RNA Sl simula el sitio de unión Sm de los RNAsn U y podria tener una participación análoga en la reacción.

o

La respuesta de la proteína no plegada tier~ relación con el corte y empalme del RNAt • la Iretp es una protefna interna de la membrana nuclear con su dominio tenninai-N en la luz del Ef: terminal-e en el núcleo. • La unión al dominio termínal-N de una proteína no plegada activa la nucleasa terminal-e por autofosforilac.ión. • La nucleasa activada escinde al RNAm Hacl para liberar un intrón y generar exones que se unen pe· • ligasa de RNAt. • El RNAm Hacl escindido codifica un factor de tra:r:.cripc.ión que activa genes codificadores de chape:t.-_ que ayudan a olegar las proteínas no plegadas.

0:0 El proceso de corte y empalme alternativo los exones especificas pueden excluirse o inc!uirse en el RNA producido mediante el uso, o no, de un par de uniones de corte y empalme. • Los exones pueden extenderse cambiando una de las uniones de corte y empalme para usar una unión alternativa. • la determinación del sexo en el género Drosophi/a implica una serie de sucesos de corte y empalme allernativos en genes que codifican productos sucesivos de una vla. ~ Los elementos P del género Drosophilo muestran corte y empalme alternos específicos de la línea germinal.

reaccior~

• La liberación del intrón genera dos mitades de RN:..: que se unen para formar la estructura madura. • las mitades tienen tos extremos singulares 5' hid ro y 2'-3' fosfato cíclico. • El extremo S'-OH es fosforilado por una cinasa de potinucte6tidos; la fosfodiesterasa abre el grupo fosfato cielito para producir un exttemo 2' fosfato • grupo 3'-0H; los extremos de los exones se unen ~ acción de una Ligasa de RNA y el 2' fosfato es retira-.. por una fosfatasa.

Los intrones del grupo II se cortan y empalman a sí mismos por la formación de un lazo • los intrones del grupa 1I se es.cinden par s! mismos del RNA mediante un proceso de corte y empalme autocatalltico. • las uniones y el mecanismo de corte y empalme de Los intrones del grupo JI son similares a los de Los intrones nucleares. • Un intrón del grupo Il se pliega en una estructura secundaria que genera un sitio catalítico que simula la estructura del intrón nuclear U6-U2.

La escisión y ligadura del RNAt son separadas

fiifii)

La escisión del extremo 3' del RNAm de histonas puede requerir de un RNA pequef~ ., Los RNAm de histonas no están poliadenilados; s.: extremos 3' se generan por una reacción de escis-i:· que depende de La estructura del RNAm.

• la reacción de escisión exige la unión de SLBP a una estructura de tallo-asa y que se aparee el RNAsn U7 con una región adyacente monocatenaria.

fiiRl

La producción de RNAr requiere de sucesos de escisión • El RNAr grande y el pequeño se liberon por e.sdsión a partir de un RNA precursor común .

f1D

• Para convertir la uridína en seudouridina se necesita el grupo H/ ACA de RNAsno. • Para generar una estructura usual. sustrato de la modificació11, en todos tos casos, la base del RNAsno se aparea con una secuencia de RNAr que contiene la base diana.

fmJ

Resumen

Se requieren RNA pequeños para el procesamiento del RNAr • Para modificar la posición 2' de la ribosa con un grupo metilo se requiere del grupo C/D de RNAsno.

111

Introducción

Todas las clases de organismos tienen genes inte~rumpidos, los cuales representan un porcentaje menor de los genes de las eucariotas inferiores, peTo !a mayor pane de los genes de genomas de euca ríotas s uperiores. Los genes varían ampliamente en fundón del número y la longitud de los intrones, ~ero un gen típico de mamífero tiene de siete a ocho exones dispersos en - 16 kb. Los exones son relati•:amente conos (- 100 a 200 bp) y los íntrones, relativamente largos (>l kb) (véase la secdón 3.6, Los genes muestran una amplia variedad de tamaños). La discrepancta eoLre la organizadón ininte rrumpida de un gen y aquella no interrumpida de ;.u RNAm requiere del procesamiemo del produciO primario de transcripción, e l cual tiene la misma organización que el gen y suele denorn.inarse preRNAm. La eliminación de Jos intrones del pre RNAm deja un mensajero usual de -2 .2 kb medianle un denominado corte y empalme del RNA. La eliminación de los intrones constituye una parte importante de la producción de l RNA en todas las ::-ucarioras. (Aunque los genes interrumpidos son relativamente .r:aros en las eucariotas inferiores, como las levaduras, en el porcentaje global se subestirna la importancia de los intrones, pues la mayor parte de los genes interrumpid os codifica proteínas relativamenLe abun.dantes. El corte y empalme, por tanto, participa en la producción de un mayor por!:entaje total del RNAm del que sería aparente al analizar el genoma, tal vez hasta el 50%.) Una de las primeras claves sobre la naturaleza de la discrepancia de tamaño entre los genes nuclea~ Tes y sus productos en eucariotas superiores provie ne de las propiedades del RNA nuclear. Su tamaño promedio es mucho mayor que el de RNAm, es m u y inestable y la complejidad de su secu encia es mucho mayor. Dada su amplia distribución, se le denominó RNA nuclear heterogéneo (RNAhn ), e incluye al pre-RNAm, pero podría también abarcar otros productos de la transcripción (esto es, aquellos que

.

200 Á )

40S

RNA de 500-800 bases

=

=======::::-:==:==---=

Proteínas medulares ( -30-40 kD)

A1

A2

81

82

C1

C2

El RNAhn es una partícula de ribonucleoproteína organizada como una serie de cuentas.

finalmente no llegan a RNAm durante el procesamiento). La forma física del RNAhn es de ribonucleoprotcína (RNPhn), donde el RNAhn está urudo a proteínas. Segú n se caracterizó in vitro, una partícula de RNPhn as u m e la fo rma de cuentas conectadas por un hilo, estructura que se resume en la . Las proteínas más abundantes ele Ja panícula son proteínas nucleares, pero hay otras con una estequiometría menor que constituyen un total de - 20. Por lo generaL las proteínas están presentes en -los copias por núcleo, respecto del - 10 6 del RNAhn. En algunos casos su participación puede ser estructural en el empaquetado del RNAhn, y se sabe que varias viajan entre el núcleo y el citoplasma y partidpan en la exportación del RNA o controlan su actividad. El corte y empalme ocurre en el núcleo, aunado a otras modificaciones que experimentan los RNA redén sintetizados. En la se r evisa el proceso de expresión de un gen interrumpido. El product o de la transcripción tiene un capuchón en el extremo 5' (véase la sección 7.9, El extremo 5' del RNAm eucariótico tiene capuchón), ha sido motivo de eliminación de intrones y está poliadenilado en

26.1 I ntroducción

669

Exón 1 lntrón 1

-

Exón 2 lntrón 2 Exón 3 lntrón 3 Exón 4

rv:l\...,..

" V\.

lntrón 4 Exón 5

· V "\..""

r\/\,

r

~Transcripción 1 Capuchón del eX1femo 6'

¿-=-

1 Poli(A) del extremo 3' t Modificación terminal

"-A200

~ Corte y empalme Exón

tntrón

_ Ex~

~ Se rompen t~iones exón-intrón ~ Se unen los exones

-=Transpone ~ Traducción

Aroo

NÚCLEO

CITOPLASMA

El RNA se modifica en el núcleo por adiciones al extremo 5' y al 3' y por corte y empalme para eliminar los intrones. El suceso de corte y empalme implica la rotura de las uniones exón-intrón y la reunión de los extremos de los exones. El RNAm maduro se transporta a través de poros nucleares hacia el citoplasma, donde se traduce.

el extremo 3' (véase la sección 7.10, El extremo 3' está poliadenilado). El RNA se transporta entonces a través de los poros nucleares hacia el citoplasma, donde se encuentra disponible para su traducción. Respecto de las diversas reacciones de procesamiemo que ocurren en el núcleo, debería saberse en qué punto ocurre el corte y empalme ante las otras modificaciones del RNA, ¿en u na localización específica del núcleo y se conectan con otros sucesos, como el transpone del núcleo al citoplasma? ¿Qué importancia tiene en la expresión de los genes interrumpidos el que no se produzca? Respecto de la reacción de corte y empalme en sí, uno de los principales enigmas es cómo se controla su especificidad. ¿Qué asegura que los extremos de cada intrón se reconozcan en pares, de manera que se retire la secuencia correcta del RNA? ¿Se escinden los imrones de un precursor en un orden en panicular? ¿Se utiliza la maduración del RNA para regular la expresión génica por discriminación emre los precursores disponibles o por cambio del parrón de corte y empalme? Se pueden identificar varios tipos de sistemas de corte y empalme: • Los intrones se reti ran del preRNAm de las eucariotas superiores por un sistema que re6 70

CAPÍTULO 26 Corte, em palme y procesamiento del RNA

conoce sólo secuencias de consenso ce~ conservadas en los límites exón-intrón interior del intrón. Esa reacción requie~­ un gran aparato de corte y empalme asume la forma de un arreglo de protey ribonucleoproteínas y que actúa COIT' gran complejo paniculado (empalmaseEl mecanismo de corte y empalme im:" transesterificación, además de que el cc caralítico incluye el RNA y proteínas. • Cienos RNA tienen la capacidad de esesus imrones de manera autónoma, los les forman dos grupos, según su estrur secundaria o terciaria; ambos usan rea ... nes de transesterificación en que el R!\. el agente catalítico (véase Capítulo r RNA catalítico). • La eliminación de inlrones de los pre sores RNAt nucleares de levaduras im"" actividades enzimáticas que manejan e: rrato en forma similar a la de las enzimac proccsamiento del RNAt. en cuyo caso característica crítica es la conformadórprecursor del RNAt. Estas reacciones de _ te y empalme son caralizadas por envque dan lugar a escisión y ligadura.

ED

Las uniones de corte y empalme nuclea res son secuencias cortas

Conceptos principales • Los sitios de corte y empalme son las secuencias qu~ rodean inmediatamente los límites de exón-intrón. Sé nombran de acuerdo con sus posiciones respecto de. intrón. • El sitio de corte y empalme 5' del extremo 5' (izquierdo) del intrón incluye la secuencia de consenso GU. • El sitio de corte y empalme 3' está en el ext remo 3' (derecho) del intrón e incluye la secuencia de conse-- · AG. • La regla GU-AG (originalmente Llamada regla GT-AG ~._ gún la secuencia de DNA) describe la necesidad de e-· dinudeótidos constantes en las dos primeras y las e:~ últimas posiciones de los intrones en los pre-RNAm.

Para centrarse en los sucesos moleculares i.mpL:.. dos en el cone y empalme de los intrones nucle.:..se debe considerar la naturaleza de los sitios : corte y em palme, los dos límites exón-intrón. _ incluyen los sitios de escisión y nueva unión. Si se compara la secuencia nudeotídica RNAm con la del gen estructural, las union es eexones e imrones pueden ser asignadas. Los ~

Sitio izquierdo (5')

---,---1 _

Gtoo Utoo A62 Asa G84 U63 . - -

,.¡g,-"'!

'

lntrón Los extremos de los intrones nucleares se definen por la regla GU-AG .

.tremos de un intrón no son homólogos ni ampliaente complementarios, las uniones, sin embargo, ~nen secuencias de consenso bien conservadas, Jnque bastante cortas. Es posible asignar un extremo específico a cada trón, dependiendo de la conservación de las unioes exón-intrón, que pueden ser alineadas pa ra tnsrituir la secuencia de consenso que se inclu ye . !l la Los submdices indican el porcentaje de aparición e la base específica en cada posición de consenso; ...: conservación es elevada sólo inmediatamente dentro ;:! intrón en las supuestas uniones, de modo que la 'CUencia de un intrón genérico se identifica como: GU ..... ..AG

El imrón definido de esta manera se inicia con -· dinucleólido GU y termina con el AG, de modo Jea menudo se dice que las uniones cwnplen con · regla GT-AG (lo cual reOeja el hecho de que las ~cuencias se analizaron originalmente en función el DNA, pero, obviamenre, el GT de la secuencia ~codificación del DNA se convierte en GU en el ~A).

Nótese que ambos sitios tienen diferentes se.:.tencias, por tanto, definen los extremos de un in~ón de manera direccional. Se nombran de izquierda - derecha, a lo largo del intrón, como sitio de corre y . !!lpalme 5' (a veces llamado sitio izquierdo o dona)t) y sitio de cone y empalme 3' (también llamado io derecho o acepLOr). Las secuencias de consenso e señalan como sitios reconocidos por mutaciones \lotiformes en el corte y empalme, que in vivo e in :ro, impiden dicho cone y empalme.

Un RNAm típico de mamífero tiene muchos intrones. El problema básico del corte y empalme del pre RNAm resulta de la sencillez de los sitios respectivos y se ilustra en la : ¿Qué garantiza que se corten y se empalmen los pares de sitios correctos? Los pares GU-AG correspondientes deben recorrer grandes distancias (algunos intrones tienen >lO kb de longitud), de modo que es posible imaginar dos tipos de principio que podrían encargarse del apa reamiento de los sirios 5' y 3' apropiados: • Tal vez sea una propiedad intrínseca del R.!\! A conectar los sitios en los extremos de un inu·ón en particular, lo cual implicaría aparear secuencias o estructuras específicas. • Podría ser que todos los sitios 5' fuesen equivalentes desde el punto de vista funcional, y tOdos los 3', indistinguibles, pero el corre y empalme podría seguir reglas que garanticen que el sitio 5' siempre se conecte con el siguiente sirio 3' del RNA. Los sitios de cone y empalme y las regiones circundantes no tienen secuencias complementarias, lo cual descarta modelos de apareamiento de bases complementarias entre los extremos de los intrones.

El apareamiento de uniones equivocadas elimina na los exones

-Glt

AG

t:t

AG

A

--....!Glf"

AG:::::I

Las uniones de corte y empa lme se leen por pares Ccnceptos principales • El corte y empalme dependen sólo del reconocimiento de pares de uniones de corte y empalme. • Todos los sitios de corte y empalme 5' son funcio nalmente equivalentes así como los sitios de corte y empalme 3'.

Gu :=:::=:::=: AG::=n

-GO

Las uniones de corte y empalme se reconocen sólo en las combinaciones de pares correctas. 26 ~ Las uniones de corte y empalme se leen por pares

671

Los experimentos con precursores de R:'{A híbridos muestran que cualquier sitio de c:one y empalme 5' puede, en principio, conectarse con uno 3'. Por ejemplo, cuando el primer exón de una unidad de transcripción temprana de SV40 se enlaza con el tercer exón de la p-globina de ratón. se puede extirpar el intrón híbrido para generar una conexión p erfecta entre el exón de SV40 y el de p-globina. De hecho, esa posibilidad de intercambio es la base de la técnica de arrapamienro de exones descrita antes, en la Figura 4.11. Tales experimentos ponen en claro dos puntos generales: • Los sitios de corte y empabne so11 genéricos; no presentan especificidad por precu rsores individuales de RNA, y los precu(sores individuales no confieren iniormaciqh específica (como la estructura secundaria) indispensable para el corte y empalme. • El aparato de corte y empalme no es específico de un tejhio; en general, cualquier célula puede escindir y empalmar un RNA apropiadamente, sea o no sintetizado normalmente por ella. (En la sección 26.12. El corte y empalme alternativos implican el uso diferendal de uniones de corte y empalme. se analizan excepciones en que hay patrones alternativos de corre y empalme específicos de tejidos.) He aquí una paradoja. Es posible que todos los silios de corte y empalme 5' parezcan similares al aparato de cone y empalme, lo mismo que todos los sitios de corte y empalme 3'. En principio. cualquier

sitio de corte y empalme 5' puede reaccionar co1t cualquier sitio de corte y empalme 3 ', pero en drcunstandas normales, el cone y empalme ocurre sólo e11tre los sitios 5' y 3' del mismo inu:ón. ¿Qué reglas aseguran que el reconocimiento de siúos de coTte y empalme se restrinja de manera que sólo los sitios 5' y 3' del mismo intrón se conen y empalmen? ¿Se retiran los ímrot1es en un orden específico de un RNA en particular? Mediame pruebas de manchado de RNA se pueden identificar RNA nucleares que representan productos intermedios de los que se han eliminado alguno~ intrones. En la se muestra una mancha de los precursores del RNAm ovomucoide. Hay una serie bien definida de bandas que sugiere que el corre y empalme ocurre por vías determinadas (si se retiraran los siete imrones de manera totalmente aleatoria, habría más de 300 precursores con diferentes combinaciones de intrones y no se verían bandas bien definidas). No parece haber una vía única, pues se pueden encontrar productos intermedios donde se han retirado comb inaciones diversas de imrones. No obstante, hay pruebas de la presencia de una o va-

6 72

CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

...,___ Gen :5.6 kb - - - • 2

3

RNAm

4

5

6

=1.1 kb

Producto primario de transcripción (5.5 kb)

Carece de intrones 5 y 6

Carece de intrones 4, 5, 6 y 7

Contiene sólo el intrón 3

RNAm (1.1 kb)

Estudio Northern del RNA nuclear con una sc-- ::. ovomucoide que identifica precursores definidos del RNAm :: indican los contenidos de las bandas más prominentes. Ima:-~ cortesía de Bert W. O'Malley, Baylor College of Medicine. -

rí as vías preferidas. Cuando sólo se ha perdido intrón, esto ocurre práccicamente siempre en e· :e o 6, cualquiera puede ser el que se pierda prime Una vez que se han perdido los dos íntrones, 5 6. vuelven a ser los más frecuentes, pero hay or;~ combinaciones. El imrón 3 nunca (o cuando me!' muy rara vez) se pierde en uno de los primeros:~ pasos del cone y empalme . A panír de ese pat:se observa que hay una vía preferida por la que eliminan los inrrones en el orden 5/6, 7 /4, 2/1 pero hay otras, puesto que (por ejemplo) en algu moléculas el último intrón en perderse es 4 e con la salvedad de que en la interpretación de e'-"' resultados no se cuenra con pruebas de que tiY' esos productos intermedios en realidad condU2~­ a un RNAm maduro. La conclusión general sugerida por este aná: es que la confirmación del RNA influye en la acr bilidad de los sitios de cone y empalme. Conforn!t retiran itllrones específicos. la conformación cam y se dispone de nuevos pares de sitios de corte y e

.: 1me.

Sin embargo, la capacidad del precursor para minar sus intrones en más de un orden sugiere _e se dispone de conlormacioncs alternas en cada _·apa. Por supuestO, mientras mayor sea la molécumás opciones estructurales brindará, y cuando se nsideran genes más grandes, se difi culta ver qué n específicamente podrían controlar la reacción ~estructu ras secundarias. Una conclusión impor'me de este análisis es que ln reacción 110 avanza

.-ue11cialmente a lo largo del precursor.

S~ iti.., o• 5-'~.....-~ s~ rtl;:;.. o..;:3_ ' _ _ 3, 5•_ _ __.

GU UACUAAC AG

Py

80

N Py

Un modelo sencillo para controlar el reconoci-

iento de los sitios de corte y empalme seria que aparato respectivo actuase de manera progresiva. abieodo reconocido un sitio 5', podría recorrer el "lA en la dirección apropiada hasta encomrar el si_Jiente sitio 3', lo cual restringiría el corte y empalme :sitios adyacentes. Ese modelo. no obstante, ha sido escartado por experimentos que muestran que el. me y empalme pueden ocurrir en configuración -.ms, en circunstancias especiales, como la reacción 'itennolccutar (véase la sección 26.13, Las reaccioes de corte y empalme en configuración trnns ut1lim RNA pequeños), o en moléculas de RNA donde arte de la cadena nucleotídica es sustituida por un ~:Uazador químico; esto significa que no puede exi;!.rse un rastreo estricLo a lo largo del RNA desde e l aio de corte y empalme 5' hasta el 3' correspon-ieme. Otro problema con el modelo de rasrreo es . ue no explica la existencia de patrones de corre y .:mpalme alternativos, donde (por ejemplo}, un sitio '~mÚn 5' se empalme con más de un sitio 3'.la base rua el reconocimiento apropiado de los pares de si.>s de corre y empaJme cotTectos sigue sin definirse ' talrn ente.

B1J

EL corte y empalme del pre-RNAm procede a través de un Lazo

Ccnceptos principales • El corte y empalme requiere de los sitios 5' y 3' y de un

sitio de ramificación justo en flujo ascendente respecto del3'. • La secuencia de ramificación se conserva en levaduras, pero está menos bien conservada en eucariotas superiores. Cuando el intrón se escinde en el sitio de corte y empalme 5' y este último se une en la posición 2' de una A, en el sitio de ramificación dentro del intrón, se forma un lazo. El intrón se libera como lazo cuando se escinde en el sitio de.corte y empalme 3'; después se juntan los exones izquierdo y derecho. Las reacciones ocurren por transesterificación, donde un enlace es transferido de una localización a otra.

2ó.

80

Py Pu 75 A Py95 87

Consenso animal Corte en el sitio 5' y formación de un lazo por enlace 5'·2' que conecta el intrón 5'-G con el lugar 2' de A en el sitio de ramificación 5'

. ,. . . . .

~---UACUA~CAG

3'

3'

Corte en el sitio 3' y unión de axones; ellntrón se libera como lazo UG

5'

3'

5

'

3'

UACUAACAG 2'

l s•·---------

s·- ---

3'

3'

Desramit1cación dellntrón 5' GU UACUAACAG 3'

El corte y empalme ocurre en dos etapas, primero se escinde el exón 5' y después se une con el exón 3'.

El mecanism o de corte y empalme ha sido caracteJi7.ado in vitro mediante sistemas que permiten la eliminación de intrones de precursores de RNA. Los extractos nucleares pueden cortar y empalmar precursores de RNA purificados. lo cual demuestra que la acción no está vincu lada con el proceso de transcripción. En RNA que no úcnen capuchón es posible el corte y empalme, o bien, la poliadenilación. Las reacciones de corte y empnlme como tales son independientes de la transcripción o modifica ción del RNA, sin embargo. ocurren normalmente en forma coordinada y su eficacia puede ser influida por otros sucesos de procesamiento. Las etapas del cone y empalme in vitro se ilustran en la vía de la . Se analiza la reacción respecto de las e species individuales de RNA identificables. pero recuérdese que, ín vivo. las que contienen exo nes no se liberan como moléculas libres, se mantienen un idas por el aparato de cone y empalme. El primer pa~o es e scindir en e l sitio de corte y empalme 5', separando el exón izquierdo de la molécula de intrón-exón derecha; el exó n izquierdo asume la forma de una molécula lineal y la molécula intrón-exón derecha forma un lazo, en el cual eJ El corte y empalme del p(e·RNAm procede a través de un lazo

673

extremo 5' generado en el final del intrón se une por enlace 5'- 2' con una base, dentro del intrón. La base d.lana es una A en una secuencia llamada sitio de ramificación . La escisión en el sitio 3' de corre y empalme libera al intrón libre con [orma de lazo; el exón dere· cho se liga (corta y empalma) con el exón izquierdo. Por claridad, las reacciones de escisión y ligadura se muestran separadamente en la figura, pero en realidad ocurren como una transferencia coordinada. El lazo es entonces "desrarn.ificado" para obtener u n intrón lineal escindido, que se degrada rápidameme. Las secuencias necesarias para el corte y empalme son las cortas de consmso r;ie los sitios 5 'y 3 ' y del de ramificación. Ya sabiendo que la mayor parte de las secuencias de un intrón pueden ser motivo de deleción sin impedir el corte y empalme, se Sabe que el intrón (o exón) no necesita una confom1adón específica. El sitio de ramificación, muy conservado en las levaduras y con la secuencia de consenso UACUAAC, tiene una participación importante en la identificación del sitio de corte y empalme 3'. Por el contrario, en eucariotas superiores no está bien conservado y tiene preferencia por pminas o pirimidinas en cada posición, además de conservar el nucleóLido diana A (véase la Fig. 26.6). El sitio de ramificación yace a una d.istancia de lS a 40 rntdeót)dos en flujo
ciones o deleciones impiden el cone y empale:. levaduras. En eucariotas superiores, las restricc en su secuencia son más relajadas, lo cual le C( re la capacidad de usar secuencias relacionadas madas sitios crípticos) cuando la cadena amf.· sufre deleción. La proximidad con el sitio 3' de .... y empalme parece importante, pues el críptico s: pre está cerca del sitio autentico; el críptico se sólo cuando el sitio de la ramificación está de~ vado. Cuando la secuencia de rama críptica se de esa forma, el corre y empalme parecen nor.rr desde otra prespectiva, y los exones dan origen a mismos productos que los de tipo natural. Laf¡¡ del sitio de ramificación, por tanto, es identificar el S!. de corte y empalme como diana para la conexiór. el sitio 5' de corte y empalme. Esto puede exp. se porque ocurre una interacción entre comp proteínicos que se unen a esos dos sitios. EJ enlac~ constituido por el lazo va, de la ~ ción 5' de laG invariable que estaba en el exrrr 5' del intrón a la posición 2' de la A invariabk sitio de ramificación, que corresponde a la re" molécula A de la caja UACUAAC de las levadu: Las reacciones q uímicas proceden por t ranse.: terificación; un e nlace es, de hecho, transferí.: una localización a otra . En la se mue: que el primer paso es un ataque n ucleoú1ico p extremo 2'-0H de la A invariable de la secueUACUAAC en el sitio 5' de corte y empalme. E segundo paso, el extremo 3'-0H libre del exón rado por la primera reacción, ataca ahora el e11 del sitio 3' de cone y empalme. Nótese que se e serva el número de enlaces fosfodiéster .. Orígjmeme había dos enlaces 5'-3' en los sitios de o y empalme exón-jnrrón, pero uno ha sido sustiL por e l enlace 5'-3' entre los exones y el otro, po: enlace 5'-2' que forma el lazo.

fZII

Se requieren RNAsn para el corte y em palme

Conceptos principales • Los cinco RNAsn implicados en el corte y empalme scUl, U2, U5, U4 y U6. • Con algunas proteínas adicionales, las RNPsn forman i empalmosoma. • Todas las RNPsn, excepto U6, contienen una secuenó conservada que se une a proteínas Sm, reconocidas por anticuerpos generados durante una enfermedad autoinmunit aria.

+ -OH

El corte y empalme nuclear se debe a dos reacciones de transesterificación, en las cuales un grupo OH ataca a un enlace fosfodiester. 674

CAPÍTULO 26 Corte, empalme v procesamiento del RNA

Los silios de corre y empalme 5' y 3', y la secuenc de ramificación, son reconocidos por componen·~ del aparato de corte y empalme que se ensamb!~

ara formar un gran complejo, el cual une los sitios :· y 3' de cone y empalme antes de que ocurra :ualquier reacción, lo que explica porqué una de- ciencia en cualquiera de esos sitios puede impedir ~inicio de la reacción. El complejo se ensambla de -,ancra secuencial en el pre-RNAm y los complejos :accionadores de diferentes tamaños pueden reco>Ocer diversos intermediarios. El corte y empalme .ene lugar sólo después de que todos los compo_emes se han ensamblado. El aparato de corte y empalme contiene tan 'l proteínas como RNA (además del prc-RNAm). -OS RNA adoptan la forma de pequeñas moléculas resenres a manera de ribonucleoproteínas. Tanto -• núcleo como el citoplasma de las <.:élulas euca'1Óticas contienen muchas especies pequeñas bie n _efin idas de RNA, cuyo tamaño va de 100 a 300 -ases en eucarioras superiores y hasta -LOOO bases :n las lcvadu ras. También la cantidad varía conJerab lemenre, de l os a l 0 6 moléculas por célula asta concentraciones demasiado bajas como para t r detectadas de manera directa. Los restringidos al núcleo se llaman RNA nudeares p e que ños (R N Asn ), y los del citoplasma, ':tNA citoplasm á ticos p equeños (RNAsc). En su .:stado natural se presentan cumo partículas de ribo·'Jcleoprotcínas (RNPsn y RNPsc); coloquialmente ! les llega a llamar snurps y scyrp s. También hay ...na clase de RNA pequeños en el nucléolo, llamaos RNAsno, que participan en el procesamiento .el RNA ribosómico (véase la sección 26.22, Se re. Jieren RNA pequeños para el procesamienro del ~.xA.r).

Las RNPsn involucradas en el corte y empal además de muchas otras proteínas, forman un . :an complejo específico llamado e mpa lmos oma . - islado in vitro de los sistemas de corte y empa lme, ~-.á constiwiclo por una partícula de ribonucleopro::ínas de 50 a óO S, y puede formarse en etapas, . •nrorme se unen las RNPsn a través de "va rios mplejos de corte y empalme~. El empalmosoma . una gran estructura, con una masa mayor que .. del ribosoma. En la se resumen sus complmemes. _, s cinco RNAsn comribuyen con más del25% de _ masa, y con sus 41 proteínas vinculadas, consti~ ren casi la mitad de la masa. Algunas de las 70 Jteínas que se encuentran en el empalmosoma se ~criben como factores de corte y empalme, que duyen las necesarias para el ensamblaje del em_.mosoma y para unirlo al sustrato RNA, además :!as implicadas en sucesos catalíticos. Por otra par..: se han señalado otras -30 proteínas vinculadas -:1 el empalmosoma que panicipao en otras etapas _ la expresión génica, lo cual sugiere que puede _.:er las veces de apara to de coordinación.

El empalmosoma se forma en el RNA precurso: intacto y pasa a través de un estado intermedio en e! cual contiene la molécula lineal individual del exón 5' y ellazo-intrón-exón derecho. El complejo tiene muy poco producto de corte y empalme, Jo cuaJ sugiere que ~ucle liberarse de inmediato, después de la escisión del sitio 3' y la ligadura de los exones. Se puede pensar que las partículas de RNPsn participan en la estructuración del empalmosoma. Como el ríbosoma, el empalmosoma depende de interacciones RNA-RNA, así como proteína-RNA y proteína-proteína. Algunas de las reacciones en que participan las RNPsn requieren que el RNA aparee sus bases directamente con secuencias del RNA que se cona y empalma, en tanto que otras requieren del reconocimiento entre RNPsn o entre sus proLeínas y otros componentes del empa lmosoma. La importan cia de las moléculas de RNAsn puede probarse directame nte en levaduras, provocando mutaciones en sus genes. Las mutaciones en los cinco genes de RNAsn son mortales, e impiden el corte y empalme. Todos los RNAsn involucrados en el cone y empalme se pueden reconocer en formas conservadas en células animales. de aves e insenos. En las levaduras, los RNA correspondientes a menudo son bastante más grandes, pero las regiones conservadas induyen características similares a las de RNAsn de la~ cucariotas superiores. Las RNPsn implicadas en el corte y empalme son U l, U2, US, U4 y U6, nombrados de acuerdo con Jos .RNAsn prcsemes. Cada R.N'Psn contieoe un sólo RNAsn y varias proteínas (<20) . Las Rl\TPsn U4 y U6 suelen encontrarse como una sola parúcula (U4/U6). Un centro estructural común para cada

~e,

30 protelnas adicionales 2.1 MOa 17%de la masa

70 factores de corte y empalme 4.7 MOa 38% de la masa

5 RNAsn

3.3 MOa 27% de la masa

41 protelnas en RNPsn 2.2MOa 18% de la masa

H empalmosoma mide -12 MOa. Cinco RNPsn contribuyen con casi la mitad de la masa; el resto de La5 proteínas incluye factores de oorte y empalme conocidos, así como las implicadas en ambas etapas de La expresión génica. 26.5 Se requieren RNAsn para el corte y em palme

67 5

RNPsn consta de un grupo de ocho proteínas, todas reconocibles por un amisuero auroinmunitario llamado a nti-Sm; las secuencias conservadas en las proteínas forman la diana de los anticuerpos, en tanto que las otras son exclusivas de ella. Las proteínas Sm se unen a la secuencia conservada PuAU,,. Gpu, presente en rodos los RNAsn, excepto U6,-que en su lugar contiene un conjunto de prordnas similares a Sm (Lsm) . Las proteínas Sm deben participar en la reacción aULoinmunitaria, si bien no se ha aclarado su relación con el fenotipo de la enfermedad auroinmunltaria. Algunas de las proteínas de la RNPsn pueden participar directamente en el corte y empalme, mientras que otras tal vez sean necesarias para actividades estructurales o sólo para el ensamblaje o las interacciones entre panículas de RNPsn. Casi el 33% de las proteínas involucradas en el cone y em.palrne son componentes de las RNPsn. Pruebas cada vez más numerosas de la panicipadón directa del RNA en la reacción de corte y empalme sugieren que re lativamente pocos factores de corte y empalme participan directamente en la carálisis, casi todos participan en acrividades esrructurales o de ensamblaje.

La RN Psn Ul inicia el corte y empa lme Conceptos principales • La RNPsn Ul inicia el corte y empalme por unión coel sitio 5' mediante una reacción de apareo RNA-RNJ. • El complejo E contiene RNPsn Ul unida al sitio 5', la proteína U2AF unida a una vía de pirimidina entre el sitio de ramificación y el de corte y empalme 3',) proteínas SR que conectan la RNPsn Ul con la U2AF.

En general, el cone y empalme se puede dividí· dos etapas: • En primer término se reconocen las secr.. cias de consenso del sitio 5' de corre y ~ palme, la secuencia de ramificadón y la adyacente de pirimidina. Se ensambla complejo que contiene todos Jos componetes de corte y empalme. • Las reacciones de escisión y ligadura ca m!_>; entonces la estructura del sw.u·ato RNA.: componentes del complejo se liberan o re ganizan conforme avanzan las reacciones corre y empalme.

EL punco importante es que todos los componentes corte y empalme estén ensamblados y tienen asegurr..· sitios de corre y empalme disponibles antes de que se/;.; algún cambro irreversible en el RNA .

El RNAsn Ul tiene una estructura de bases apareadas que forma varios dominios. El extremo 5' se mantiene con una sola cadena y puede aparear sus bases con el sitio de corte y empalme 5'.

676

CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

El reconocimiento de las secuencias de cons~: so involucra al RNA y a las proteínas. Ciertos R..NA. tienen secuencias complementarias de las de cr senso o emre sí, y el apareamiento de bases er: RNAsn y pre-RN/\m, o emre varios RNAsn, tie:un papel importante en el corte y empalme. La RN Psn Ul humana contiene ocho proteínc: además de RNA. En la se mues tra s estructura secundaria, que tiene varios dominios. =. sitio de unión Sm <:S necesario para la interacd • con las proteínas usuales de la RNPsn. Los domini identificados por estructuras individuales de tall asa proporcionan sitios de unión para proteínas e· elusivas de la RNPsn Ul. La unión de la RNPsn U l con el sirio 5' de cor y empalme es el primer paso de dicho proceso. :::. recluranúcnro de RNPsn Ul implica una imeracció entre una de sus proteínas (U l-70k) y la proteíl': ASF/Sf2 (factor general de corte y empalme de cl2 se SR; véase más adelante). El RNAsn Ul aparea st. bases con el sitio 5' mediante una región de una so·.; cadena en su extremo 5', que suele incluir una fi de cuarro a seis bases, complementaria de la del siti de corte y empalme. Las mutaciones del sitio 5' de corte y empame y en e l RNAsn U 1 se pueden usar para proba:

directamente la nece~idad de que se apareen emre ellas. Los resultados de tal experimento se muesrran en la . La secuencia de tipo natural deJ sitio de corte y empalme del pre-RNAm del adenovirus 12$ se aparca en cinco de seis posiciones con el RNAsn U l. Un mutame del RNA 125 que no ¡>uede cscindirse ni empalmarse tiene dos cambios de secuencia: las fracciones GG de las posiciones 5 a 6 del intrón cambian a AU. La mutación modifica el patrón de aparcamiemo de bases entre el RNAsn Ul y el sitio de cone y empalme 5', si bien nomojifica la extemión global del apareamiento (puesto que se pierde complememariedad t:n una posición y se gana en otra). El efecto en el corte y empalme sugiere que la imcracción base-apareamiento es importante. Cuando se introduce una mutación en el RNAsn Ul que restablece el apareamiento en la posición 5', .se recuperan el corte y empalme normales. Otros casos en que se producen mutaciones correspondiem es en el RNAsn Ul para ver si es posible su orimir la mutación en el sirio de cone y empalme sugieren la regla general: es necesaria la comple~ mentariedad entre RNAsn U l y el sitio 5' de cone :·empalme para que éste se lleve a cabo, pero su -eficacia depende sólo del número de pares de bases ~ue pueden formarse. La reacción de apareamiemo ~e estabiliza por las proteínas de RNPsn UI. En la se muestran las etapas tem"rana~ del conc y empalme. El primer complejo ormado durante esta actividad es el E (corte y em"alme tempranos), que contiene RNPsn Ul, el fac : > r de cone y empalme U2AF y miembros de una amilia llamada de proteínas SR, que comprende un grupo importante de factores de corte y empalme y reg11ladores. los cuales toman su nombre de ~ na región rica en Arg-Ser, de longitlld variable. Las "roteínas SH interactúan entre sí a través de dichas -egiones, y también se unen al RNA; constituyen n componente indispensable del empalmosoma y )[rnan una malla sobre el sustrato de RNA; conec3D a U2AF con U J ( ). EJ complejo E .1ele denominarse complejo de a~ignación, debido :que su formación identifica a un pre-RNAm como JStrato para la formación del complejo de corte y :npalme. En el complejo E, el U2AF se une a la región :me el sitio de ramificación y el 3' de corte y cmlime. El nombre refleja su aislamiento original ~mo factor auxiliar U2. En casi todos los organis .os tiene una subunidad grande (U2AF 65) que ace contacto con una vía de plrimid ina de flujo ~scendemc respecto del sitio de ramificación; una equeña subunidad (U2AF35) hace contacto direc con el dinucleótido AG en el sitio 3' de corte y ~palme . En Sacclzaroinyces ceuvisiae, esa función

es realizada por la proleína Mud2, comraparte de U2AF65. y se une sólo a la vía de pirimidina, Jo cual marca una diferencia en el mecanismo de cone y empalme entre S. cerevisiae y otro~ organismos. En las levaduras. el sitio 3' de corte y empalme nc participa en las primeras etapas de formación del complejo de cone y empalme, pero sí en todos lo~ demás casos conocidos. Otro factor de cor:e y empalme, llamado SFl en mamíferos y BBP en levaduras, conecta U2AFI Muct2 con la RNPsn U 1 unida en el sito 5' de corre y empalme. La formación del complejo mejora con las reacciones cooperativas de las dos proteínas; SFI y U2AF (o BBP y Mud2) se unen al sustrato de Rl~A con - JO más eficacia que cua lquiera por sr sola. Dicha interacción tal vez se encarga de hacer la primera conexión entre los dos sitios de corte y empalm e a través del iotrón . El complejo E se convierte en complejo A cuan· do la RNPsn U2 se une con el sirio de ramificadón. para lo cual se requieren tanto RNPsn Ul como U2AF/Mud2. El RNAsn U2 incluye seruendas com· plementarias del siLio de ramificación. Una secuen·

ANA Ul de tipo Silvestre y Pf&ANAm de 125 Cone y empalme nonnal

3' C AU Uc-A.U 5' Exon5' G U GAGG tnltón3' Srtto de cone y empalme del !ldenovlrus !25

RNASI1 U 1 de tipo sllvest•e y mutan te de pre-RNAm de 125

No hay corte y empalme

3' CAUUCAU 5' Exón5' G U G A A U lnt!Ón 3' Sitio da oone y empalme

con mutación RNAsn Ut y ANA 125 oon mutación Se restablece el oone y empalme

3' Mutacl6n en RNASI1 U 1 C.AUUUAU 5' E)oo5' GUGA AUinttón3'

Las mutaciones que inhabilitan la función del sitio de corte y empalme 5' pueden ser suprimidas por mutaciones compensatorias en el RNAsn Ul, que restablecen el apareamiento de bases. Z6.6 La RNPsn U1 inicia el corte y empalme

677

cía cercana al extremo 5' del RNAsn aparea sus bases con la secuencia de ramificación en el intrón. En las levaduras, implica generalmente la formación de una estructura doble con la caja UACUAAC (véase la Fig. 26.14). Varias proteínas de la RNPsn U2 se unen con el sustrato RNAjusw en flujo ascendente respecto del sitio de ramificación. La adidón de la RNPsn U2 al complejo E genera el complejo A previo al corLc y empalme, para la cual se requiere de la hidrólisis de ATP y asigna un pre-RNAm para la vía de corte y empalme.

Exón

lntrón

au

Exón

-11A~e--

P.y:'AG=

5' Sllto de vra Py S11iO de corte y empalme ramificación ASF/SF2 ' RNPsn U1 y factor ASF/SF2 se unen con el sitio de corte y empalmeS'

Sitlo de corte y empalme3'

1

• GU

WICUAAC

El complejo E puede forma "': 7 por defi nició n de intrón o E Conceptos principales • la vla directa de formación de un complejo E es ~: NRPsn U1 unirse al sitio de corte y empalme 5' ~· :: U2AF, unirse a una vía de pirimidina entre el sitie ramificación y el de corte y empalme 3'. • Otra posibilidad es que el complejo se forme entre __ AF en la vía de pirimidina y RNPsn U1 en el sitio = corte y empalme de flujo descendente. • El complejo Ese torna en A cuando la RNPsn U2 s: _ con el sitio de ramificación. • Si se forma un complejo E utilizando el sitio 5' de ~ y empalme de flujo descendente, éste es sustituie: el correspondiente 5' de flujo ascendente cuando :: complejo Ese convierte en el complejo A. • Los sitios de corte y empalme 3' débiles pueden requerir un potenciador de corte y empalme localizado en el exón de flujo descendente para ur·directamente con las proteínas SR.

U2AF65 U2AF35

1

Ul RNPsn

1

U2 AF se une con la vra Py y el sitio de corte y 1 empalme3'

-

Py-AG

UACUAAC'"

l

1

SF1/BBP

1 SFt/BBP conecta RNPsn Ul con U2AF

Py-AG = UACUAAC

EL complejo de asignación (E) se forma por adición sucesiva de RNPsn Ul al sitio de corte y empalme 5', U2AF a la vía de pirimidina/sitio de corte y empalme 3', y la protelna puente SF1/BBP.

Hay más de una forma de constituir el comp:c en la Figura 26.12 se iluman algunas posibilid.; La reacción más directa es que ambos sitios de:. y empalme se reconozcan en el imrón. La pre~­ de RNPsn U 1 en el sitio 5' de corte y empalr-o: indispensable para la unión de U2AF en la ,--;: pirirrtidina en flujo descendente respecto del si u ramificación, lo cual hace posible que los exue5' del intrón se unan en ese complejo. El com:E se conviene en A cuando la RNPsn U2 se une ;: el sitio de ramificación. La característica básica lÚ vía de corte y empalme es que los dos sitios de corte_-

Defintofón de exón

Dellnlclón de fntrón Exón

-

lntrór>

Exón tJACttAA~ AC3

GU Sitios·

Sitio de ramificación

lnlrón Exón lntrón Exón ===r.:Gu -UACUAAC Py- AG GU Sitio 5' Silío de Sitio 3' SilloS' ramillcaclón

SFI

= = =

l

U2AF Complejo E

GU UACUAAC" Py AG- -

Proternas SR

)

GU

UACUAAC"" fly AG

GU

GU

UACUAAC Py AG

GU

U1

= GU UACUAAC Py AG

GU

Puede haber múltiples vías para el reconocimiento inicial de los sitios 5' y 3' de corte y empalme.

6 78

CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

va/me son. reconocidos sin necesidad de secuencias ajenas J.! intrón, proceso llamado definición de jntrón. En un caso extremo, las proteínas SR pueden permitir a U2AF/RNPsn U2 unirse in vitro sin U l, lo ~ual da lugar a la posibilidad de que hubiera una vía 1ndependiente de Ul para el corte y empalme. Cuando los intrones son largos y los sitios de ::one y empalme débiles. puede seguirse una ruta alterna para formar el empalmosoma. Como se muestra a la derecha de la figura, el sitio 5' de corte :· empalme es reconocido por el RNAsn Ul en la :orma usual, no obstante que el3' se reconoce como parte de un complejo formado a través del siguiente ~xón, en cuyo caso, el siguiente sitio 5' de corte y em palme también está unido al RNAsn U 1, el cual es conectado con el U2AF por las proteínas SR en :a vía de pirimidina. Cuando se un e RNPsn U2 para genera1· el complejo A. hay una reestructuxación por la cual el sitio 5' de corte y empalme correcto el del exrremo izqu ierdo) desplaza al de flujo des.:cndente del complejo. La característica importante Je esa v1a de corre y empalme es que se requieren •ecuenctas de flujo descendente respecto del intrón 'Tlismo, que por lo general incluyen el sitio 5' de :one y empalme siguiente, proceso denominado d efinición de exón . Este mecanismo n o es uni·ersaL no se encuentran proteínas SR ni definición 1e exón en S. cerevisiae. Los sirios 3' de corte y empalme "débiles# no se anen a U2AF y RNPsn U2 de manera eficaz; se ne~sit an secuencias adicionales para unir las proteí"las SR, que ayudan a U2AF en su unión con la vía ie pirimidina. Tales secuencias se llaman "potenciaiores de corte y empa lme", y se encuentran muy ·:recuenremenre en un exón en flujo descendente ·especto del sitio 3' ele corte y empalme.

empalme se vincuJan con el complejo en un orden definido. En la se muestran los com ponentes de los complejos identificables conforme avanza la reacción. El complejo Bl se forma cuando un primer ribete que contiene las RNPsn U5 y U4/U6 se une con el complejo A que contiene RNPsn Ul y U2; este complejo se considera empalmosoma porque tiene los componemes necesarios para la reacción de corte y empalme; se conviene en complejo B2 después de que se libera U1, disociación necesaria para permitir que otros componentes se yuxtapongan con el sitio 5' de corte y empalme, sobre todo con el RNAsn U6. En ese punto, el RNAsn U5 cambia de posición, pues inicialmente está cerca de las sec ue ncias exónicas del sitio 5' de corte y empalme, pero se traslada ccrc
ASF /SF2......._

f... ...--Ul

SF1 /IBBP

UG UACUAAC

Py

Comvtejo E

AG -

Complejo A U2 se une con sitio de ramificación

• q'u2 \JACUAAC

•n

Py

/us

UG

U6 U2AF

/

U4-

AG =-: U5 se

une con el exón en el sitio 5' U6 se une a U2

Py

Ci nco RNPsn forman el empalmosoma

Complejo 82

AG

Conce¡:ms principales la unión de los RNPsn U5 y U4/U6 convierte al complejo A en el empalmosoma Bl, que contiene todos los componentes necesarios para el corte y empalme. • EL empalmosoma pasa a través de una serie de complejos adicionales conforme avanza el proceso. • la liberación de la RNPsn Ul permite al RNAsn U6 interactuar con el sitio de corte y empalme 5' y convierte al empalmosoma Bl en empalrnosoma B2. • Cuando U4 se disocia de la RNPsn U6, este último puede aparearse con el RNAsn U2 para formar el sitio catalítico activo.

: espués de la formación del complejo E, los de-:1ás RNPsn y los facwres involucrados en el corre y

Complejo 61

Se une el recortador U5/U4/U6

/

UAOUAAC

Et1J

AG . -

Se libera U1 US cambia de exón a fnlrón --== U6 se une en el sitio de corte y empalme 5'

• Hidrólisis de ATP

UJ

G

Py

l

AG

Hldrólisos de ATP ~

Complejo C1 Se libera U4 U6/U2 catahza la transeslerilicación U5 se une con el exón en el sitio de corte y

empalme3'

Se esr.il"de el sitio 5' y se lofiTla oola.Zo

ComplejoC2

~

U21U51U6 se mantienen unidos con el lazo El sitio 3' se escinde y se hgan los exones El ANA escmdido se libera El lazo se desramilica

La reacción de corte y empalme pasa por definidas en las cuales la formación del empalmosoma implica la interacción de componentes que reconocen a las secuencias de consenso. 2.b

1)

Cinco RNPsn forman el ernpalmosoma

679

3'

cA u G A

g~-U6

CGA

Centro catalítico

5' 3':Eióñ:Z{UI Sitio de corte y empalme 3' (derecho)

gGu A gé u

".,.,

UGAUC~~cF"

3' 5'

A ACUAGAIJ

G UGUAGUA ACAtJCA{J A

Sitio de ramificación

Sitio de corte y empalme 5' (izquierdo}

El apareamiento de U6-U4 es incompatible con el de U6-U2, Cuando U6 se une con el empalmosoma, está apareada con U4, cuya liberación permite un cambio de conformación de U6; una parte de la secuencia liberada forma una horquilla (gris oscuro) y la otra parte (negro) se aparea con U2. Una región adyacente de U2 ya está apareada con el sitio de ramificación, lo cual condwce a U6 a una yuxtaposición con el sitio de ramificación. Nótese que el sustrato RNA se invierte respecto de su orientación usual y se muestra de 3' a 5'.

La función del RNAsn U4 puede ser secuestrar al RNAsn U6 hasta que se necesite, En la se muestran los cambios que ocurren en las interacciones de apareamiento de bases entre RNAsn durante el corte y empalme. En la RNPsn U6 /U4 una longitud continua de 26 pares de bases de U6 se aparea con dos regiones independientes de U4, que cuando se disocia, la región que se libera en U6 queda a la disposición para captar otra estructura. La primera parte de ella se aparea con U2 y la segunda forma una horquilla intramolecular. La interacción entre U4 y U6 es mutuamente incompatible con la interacción entre U2 y U6, por lo que la liberación de U4 controla la capacidad de avance del empalmosoma. Por claridad, en la figura se muestra el sustrato RNA extendido, pero el sitio 5' de corte y empalme en realidad está cerca de la secuencia U6 inmediata al iado 5' de la cadena unida a U2. Esta secuencia del RNAsn U6 se aparea con secuencias del íntrón justo en flujo descendente respecto del GU conservado en el sitio 5' de corte y empalme (las muta 680

CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

ciones que potencian tal apareamiento mejora_ eficacia del corte y empalme). Así pues, varias reacciones de apareamtc entre RNAsn y el sustrato RNA ocurren durar.corte y empalme, las cuales se resumen en la • . Las RNPsn tienen secuencias que se apa~ con el sustrato y entre sí, además de regiones nocatenarias en asas muy cercanas a secuencias sustrato, que tienen una participación imponz.a juzgar po't la capacidad de las mutaciones d · asas para bloquear el corre y empalme. El apareamiento de bases entre U2 y el pun: ramificación, y entre U2 y U6, crea una esu·uc que simula el centro activo de los intrones del gr. IJ de autocorte y empalme (véase la Fig. 26.2C cual sugiere la posibilidad de que el compon-: catalítico incluyera una estructura de RNA gene= por la interacción U2-U6. La U6 se aparea ctJsitio 5' de corte y empalme, y los experimem,-.: enlaces ctuzados muestran que un asa del R.'\US es inmediato a las posiciones de primeras h en ambos exones. Aunque se pueden definir la _ ca nía del sustrato (el sltio 5' de corte y empall= el sitio de ramificación) y los snurps (U2 y U6¡ -:.centro catalítico (como se m uestra en la Fíg, 26 los componentes que realizan las transesterific~­ nes no han sido identificados de manera direc¿ La formación del lazo en el sitio de xami:': _ ción se encarga de determinar el uso del sitio 3 corte y empalme, porque la secuencia de cons..::: 3' más cercana al lado 3' de la ramificación se~ viene en diana para la segunda transesterificac La segunda reacción de corte y empalme se pre~ ta inmediatamente después, reacción que req~.: de la unión de RNPsn U5 con el sitío 3' de co:~ empalme, pero no hay pruebas de una reacciór:. apareamiento de bases, La conclusión impo.rtantc sugerida por c resultados es qu e los componentes RNAsn del ap.: de corte y empalme interactúan tanto entre sí como e;

sustmto RNA mediante interacciones de apareamie1:~ bases, interacciones que permiten cambios en la estnúque podrían llevar a la aposición de ,qrupos reactil ~ inclusive, a crear centros catalíticos. Es más, los cabias de conformación de Jos RNAsn son reversfu por ejemplo, no se usa RNAsn U6 en una reacC"' de corre y empalme, y al concluir, deb~ liberarStU2 de manera que pueda volver a formar la esctura doble con U4 para iniciar otro ciclo de co:-. empalme. Se han descrito reacciones individuales en cada RNPsn participa, pero como se esperaríti una serie compleja de reacciones, cualquier R?--; en particula r puede tener más de una participac en el corte y empalme. Así, la capacidad de la RJ"\.~ Ul de promover la unión de RNPsn U2 con el s

importantes para crear o liberar estructu ras en los componentes pre-RNAm o RNAsn de los empalmosomas. Algunas de las proteínas PRP son componen tes de panículas RNPsn, pero otras actúan como factores independiemcs. Un ejemplo ioreresante es PRPl6, helicasa que h i.droli.za el ATP y se vincula transiroriamente con el empalmosoma para participar en el segundo paso catalítico. Otro ejemplo es PRP22, helicasa dependiente de 1\TP necesaria para liberar el RNAm maduro del empalmosoma. La conservación de enlaces durante la reacción de cone y empalme indica que no es necesaria la introducción de energía para impulsar la tormación del enlace en sí. lo cual implica la necesidad de hidrólisis del ATP para orros fines. El que PRP 16 y PRP22 uLilicen ATP. puede ser ejemplo de un fenómeno más general, el uso de la hidrólisis de ATP para producir los cambios conforroacionales necesarios para el avance del corte y empa lme.

U1 se aparea con el slllo de corte y empalme 5'

3'

\ )1

Ur::t:AUUC~

5' AOOUAUGU

Sitio de corte

y empalmeS'

U2 se aparea con el sitio de ramificación

U2

5'

3'

3'~111:~

5'

5'-IJACUAAC ---11~3'

Sitio de ramlllcacl6n

U6 se aparea con ¡¡1 sitio de corte y empalme 5' U6

3'~ACA5'

S'IIGGUAU()U 3'

Sitio de corto y empalme 5'

U5 está ce roa de ambos axones

Un aparato alternativo de corte y empalme utiliza diferentes RN Psn

El axón 1 en +1 Ex0n2en+1

~ 11u u

"- e

' e us " o

e

e

Conceptos principales

El corte y empalme utiliza una serie de reac:iones de apareamiento de bases entre RNAsn y los sitios de :orte y empalme.

Je ramificación es independiente de su capacidad de •mión con el sitio 5' de corte y empalme; de la mis'Tia manera se pueden ctefi nir diferentes regiones de RNPsn U2 necesa rias para la uni ón con el sitio de ramHicadón y la interacción con otros componentes iie corte y empalme. Se ha h echo un extenso análisis de las muta, iones en las levaduras para identificar los compo a enres de RNA y los componentes proteínicos del empalmosoma. Las mutaciones necesarias en los ;enes para el cone y empalme se identifican por la acumulación de precursores no empalmados. Una serie de loci que identifica a genes potencialmente .:edificadores de proteínas implicadas en el corte y :.>mpalme, originalmente se llamaron RNA, pero hoy ;e conocen como muta mes PRP (por procesamiento 1el pre-RNA). Varios de los productOs de esos genes :ienen segmentos que lo!> identifican como proteí~as de unión a RNA, y algunos parecen relacionarse .:on una familia de hellcasas de RNA dependientes :kl ATP. Se supone que además de las i.nteraccio;;es RNA-RNA, las imeracciones proreínas-RNA son

• Una vía alterna de corte y empalme utiliza otro conjunto de RNPsn que constituyen el empalmosoma U12. • Los i ntrones diana se definen por secuencias de consenso más largas en las uniones de corte y empalme, pero, en general, incluyen las mismas uniones AU-AC. • Ciertos intrones tienen las uniones de corte y empalme AU-AC, incluidos algunos dependientes de Ul y otros, de Ul2 .

los intron es GU-AG so n la gran mayoría, >98% de las uniones de con e y empalme en el genoma humano; menos del 1% u tilizan uniones relacionadas GC-AG y después. bay una clase menor de intrones marcados por los ext remos AU-AC que representan el 0.1 por ciento. El descubrimiento del primero de ellos requirió un aparato de cone y empalme alternativo llamado empalmosoma Ul2, constituido por U 11 y U12 (relacionados con Ul y U2, respectivamente), una variante U5 y los RNAsn U4atac y U6atac. La reacción de cone y empalme es esencialmente igual a la de los intrones GU -AG y los RNAsn actúan de manera análoga. Se desconoce si hay diferencias en los componentes proteínicos de este aparato. Ahora resulta que la dependenda del tipo de empalmosoma recibe 1ambién la influencia de secuen cias en el interior del i.ntrón. por lo que hay algunos intrones AU-AC con escisión y empalme

26.9 Un aparato alternativo de corte y empalme utiliza diferentes RNPsn

681

por empa lmosornas de cipo U2 y o1ros GU-AG con corte y empa lme por los de ripo U l2 . Una secuencia de consenso fucnc del extremo de la izquierda define el lipo de intrón dependiente de Ul2: S'\UAUCCUUU ..... 3'PyAGc- De hecho, casi wdos los imrones dependientes de Ul2 tienen terminaciones GU .. ..... AG. además de un punto de ramificación muy conservado, UCCUUPuAPy. que se aparea con un Ul2, motivo por el cual se usa la denominación intrón dependiente de Ul 2, en vez de intrón AU-AC . Ambos tipos de incrones coexisten en una variedad de genomas, y en algunos casos se encuentran en el mismo gen, si bien los intrones dependientes de U 12 tienden a ser flanqueados por imrones dependientes de U2. Lo que se sabe acerca de la filogenia de estos intrones es que los dependientes de AU-AG Ul 2 ta l vcz.Iucron más frecuentes en algún momento, pero tienden a convenirse en extremos GU-AG y a Ja depe ndencia de U2 durante la evolución. La evolución común de los sistemas resalta por el hecho de que utilizan conjuntos análogos de apareamiento de bases entre RNAsn y con el sustrato pre RNAm. La participación de RNPsn en el corre y empalme es un ejemplo de su intervención en las reacciones de procesamiemo del RNA. pues es necesario para varias acciones durante el procesamiento del RNA nuclear hacia RNAr maduros. En especial por la demostración de que Jos intrones del grupo 1 son de cone y empalme propios y que el RNA de la ribonucleasa P tiene actividad catalítica (como se describe en el Cap. 27, RNA catalíúco), es posible que las acciones RNA-RNA sean importantes en muchos sucesos del procesamiento del RNA.

fZ1m

El corte y empalme está relacionado con la exportación del RNAm

Conceptos principales • Las proteínas REF se unen a las uniones de corte y empalme por un vínculo con el empalmosoma. • Después del corte y empalme se mantienen adheridas al RNA en la unión exón-exón. • Interactúan con la proteína de transporte TAP/Mex, que exporta el RNA a través de un poro nuclear.

DNA y qué garantiza q ue sólo se exporten R~ completamente procesados. Las respuestas se · donan, en parte, con el momento relativo er; ocurren los sucesos: los empalmosomas tal ' e-;;; formen para eliminar intrones antes de haber::cluido la transcripción. aunque también puede be1· una conexión directa entre con e y empalr:exporración. Los intrones podrían impedir la exponadór RNAm porque se vinculan con el aparato de caempalme. si bien el empalmosoma rambién P'proporcionar el punto inicial de contacro con el:.rato de exportación. En la se mue un modelo en que el complejo proteínico se _ con el RNAa través deJ aparato de corteyempa dicho complejo consta de >9 proteínas y se 1 4 EJC (complejo de j untura de exones) . El EJC participa en varias"fuuciones de R. empalmados en las cuales participan directam · ciertas proteínas del EJC y otras reclutan prote adicionales para funciones específicas. El pr:comacro en el ensamblaje de EJC es con uno de factores de corte y empalme, y después. el E;.: manliene unido al RNAm justo en !1ujo ascenc te respecto de la juntura exón-cxón. EL EJC n vincula con el RNA transcrito de genes que carc ~ de intrones. por lo que su participación en el pro-. es exclusiva para los productos empalmados. En caso de dcledón de inrrones en un gerc producto se exporta mucho más lentamente al L.

Exón

tnlrón

Exón

~ Corte y empalme

~

la proteína se une con el complejo de corte y empalme

1 La proteína se mantiene

t en la unión exón·exón 1 El complejo (EJC) se t ensambla en la unión exón-exón

Después de que se ha sintetizado y procesado el RNAm, se exporra del núcleo al citoplasma a manera de un complejo ribonudeoproteínico. Las proteínas encargadas del transporte "van y vienen" entre núcleo y citoplasma, sólo permanecen brevemente en el compartimienw. Dos aspectos importantes son cómo reconocen esas proteínas sus sustratos de 682

CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

El EJC se une a protefnas implicadas en la exportac16n, localización y decadencia del RNA

El EJC (complejo de unión de exones) se une:.. RNA por reconocimiento del complejo de corte y empalme.

La proterna REF (Aty) es parte del EJC

REF El factor de transporte TAP/Mex se une a REF

E! TAP/Mex neva el RNAm e través del poro nuclear

Tt\PIMex<" NÚCLEO

CITOPLASMA

Se Jlbera TAP/Mex

Una proteína REF se une a un factor de corte y empalme y se queda con el producto RNA. El REF se une a un iactor de exportación que se une con el poro nuclear.

plasma, lo cual sugiere que el inrrón puede propordonar una señal de unión al aparato de exportación. Ahora se puede abordar ese fenómeno según una serie de interacciones proteínicas, como se muestra en la . El EJC incluye un grupo de pro¡eínas llamado familia REF (cuyo miembro mejor caracterizado es Aly). Las protemas REF, a su vez, interactúan con uoa proteína de transporte (cuyo nombre varía, TAP o Mex), que se responsabiliza clirectamente de la interacción con los poros nl.l cleares. Para definir un RNA con corte y empalme, se puede usar un sistema similar, de man era que las mmaciones de terminación previas al último exón desencadenen su degradación en el citoplasma (véase la sección 7 .14, Las m u tacioncs de terminación desen cadenan un sistema de vigilancia).

fE

Los intrones del grupo II se cortan y empalman a sí mismos por la formación de un lazo

·:onceptos principales • Los intrones del grupo 11 se escinden del RNA por un suceso autocatalítico. • Las uniones y el mecanismo de corte y empalme en intrones del grupo II son similares a los de los intrones nucleares. • Un intrón del grupo Il se pliega en una estructura secundaria que genera un sitio catalítico similar a la ordenación del intrón nuclear U6-U2.

Los intrones de genes que codifican proteínas (de hecho, excepto los nucleares de codificación de RNAt) pueden dividirse en tres clases generales. Los intrones nucleares pre-RNAm se identifican sólo por la posesión de dinucleótidos GU .... AG en los extremos 5' y 3' y el sitio de ramificación/vía de pirimidina cerca del extremo 3', no muestran ninguna característica común en la estructura secundaria. Los inrrones de los grupos 1 y lJ se encuemran en organelos y bacterias (Jos del grupo T también esrán en el núcleo de eucariotas inferiores) y se clasifican de acuerdo con su organización interna; cada uno puede plegarse en un tipo usual de estructura secundaria. Por otra parte, tienen la notable capacida d de esdn clirse de un RNA, lo que se llama a utoescisión. Los intrones del grupo l son más comunes que los del grupo ll, y hay poca relación entre ambas clases, pero en cada caso el RNA puede hacer la reacción de escisión in vitro por sf mismo, sin necesidad de actividades enzimáticas provistas por proteínas; sin embargo, casi no hay duda de in vivo se requieren para ayudar al plegamiento (véase Cap. 27, RNA catalítico). En la se muestra que mediante dos transesterificadones sucesivas se escinden tres clases de inrrones (mostradas antes en la Fig. 26.6, para los imrones nucleares). En la primera reacción, la unión exón-imrón 5' es atacada por un grupo hidroxilo Ubre (proporcionado por una posición 2 '- 0H interna en los intrones nucleares y del grupo U, y por un nucleótido de guanina libre en Jos del grupo!). En la segunda reacción, el 3'- 0H libre en el extremo del exón liberado ataca a su vez la unión intrón-exón 3'. Hay paralelismos entre los inLrones del grupo II y el corte y empalme de l pre-RNAm. Los intrones mitocondriales del grupo n se escinden por el m ismo mecanismo que Jos pre-RNAm nucleares, a travé!> de un lazo que se mantiene unido por un enlace 5'-2'. En la se muestra un ejemplo del lazo producido por corte y empalme de un intrón del grupo II. Cuando u n RNA de grupo n aislado se incuba in vitro, sin componentes adicionales, puede presentar una reacción de corte y empalme, lo cual significa que la secuencia misma del inLrón de RNA del grupo D puede llevar a cabo las dos reacciones de transesterificación que se muestran en la Figura 26.18. El número de enlaces fosfodiéster se mantiene en la reacción y, como resultado, no se necesita un apone externo de energía, lo cual podría haber sido una característica importante en la evoludón del corte y empalme. En una estructura secundaria que contiene varios domin ios formados por tallos de pa res deba-

26.11 Los intrones del grupo II se cortan y empalman a si mismos por la formación de un lazo

683

ANA nuclear Primera transferenciar-- OH Exón 1

1

-

- A

G

Exón 2

Segunda ~ transferencia Grupo 11

d3

d2

d4 d5

d1

~A G 1

d6

Segunda ~~ OH transferenciaExón 1 Exón 2

El corte y empalme libera un intrón del gn..: mitocondrial en forma de lazo estable. Tomada de Van De- =R., et al EMBO J. 1987. 6: 1079-1084. Imagen cortesía de __ A. Grivell, European Molecular Biology Organisation .

Grupo 1 G--OH

(-

.

Pnmera

\--transt~rencia

jJ ._5

P3

P5 PB

Segunda transferencia

py--

Exón 1

P8

Exón2 pg

Son tres las clases de reacciones de corte y empalme que tienen lugar mediante dos esterificaciones. En primer término, el grupo OH libre ataca la unión exón 1-intrón y después, el OH creado en el extremo del exón 1 ataca la unión intrón-exón 2.

ses y asas de una sola cadena, se forma un imrón del grupo U. El dominio 5 está separado del 6 por dos bases; este último contiene una molécula de A que dona el grupo 2'- 0H para la primera transesterificación y constituye un dom inio catalítico en el RNA. La muestra una comparación de esa estructura secundaria con la formada por la combinación de U6 con U2 y de U2 con el sitio de ramificación. La similitud sugiere que U6 puede tener actividad cata lítica. Las características del corte y empalme del grupo TI sugieren que el proceso evolucionó a partir de una reacción autocatalílica de una molécula individual de RNA, en la cual se Jograba una deleción controlada de una secuencia interna. Es posible que dicha reacción implique que el RNA se pliegue en 684

CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

una conformación específica o en una serie de e formaciones, lo cual ocurriría exclusivame tUl configuración cis. La capacidad de los in trones del grupo TI r;;. eliminarse a sí mismos por un suceso de cor. . empalme autocatalítico contrasta con la neces w de il1trones nucleares para un aparatO de col"" empalme complejo. Los RNAsn del empalmos' pueden ser considerados como compensadorela falta de información de secuencias en el int r además de que proporcionan la información _ querida para formar estructuras particulares er RNA. Las funciones del RNAsn pueden haber e· lucionado a partir del sistema autocatalítico origi.-. Estos RNAsn actúan en configuración trans sot- e! sustrato pre-RNAm; se podría imaginar qut: capacidad de Ul para aparearse con el sitio de co:y empa lme 5', o de U2 con la secuencia de ramific ción, sustituyó a una reacción similar que reque.:- · que el inrrón portara la secuencia importante. P tanto, los RNAsn pueden presentar reacciones e el sustrato pre -RNAm y entre sí, las cuales han s;.. tituido a una serie de cambios conformacionaJes q _ se presenran en el RNA que se corra y empalma p- mecanismos del grupo TI. De hecho, esos camb: han liberado al sustrato pre-RNAm de la obligad' de portar las secuencias necesarias para pa trocir~a la reacción. Conforme el aparato de corte y emp<: me se ha wrnado más complejo {y el número ~ sustraws potenciales ha aumentado), las proteú1a han tenido un papel más importante .

El corte y empalme nucleares estructuren un sitio activo por apareamiento entre U6-U2 y U2-intrón

UJ!AU!; -.Jv0

5'

3'

GA

AACUAGAU U2 G .u GUAGUA ACAAUCAU

3'

1

OH

l

Exón 1···G

U El corte y empalme del grupo 11 originan un centro aclivo a partir de las reglones de apareamiento de bases de los dominios 5 y 6

5'

3'

YA

El corte y empalme nuclear y el del grupo li -ptican la formación de estructuras secundarias similares. las ·-:cuencias son más específicas en el proceso nuclear; el del : ·upo li hace uso de posiciones que podñan ser ocupadas por :Jrinas (R) o pirimidinas (Y).

El proceso de corte y empalme alternativo implica el uso diferencial de uniones de corte y empalme 1Conceptos pnncip-'les • los exones específicos pueden excluirse o incluirse en el RNA producido mediante el uso, o no, de un par de uniones de corte y empalme. • los exones pueden extenderse cambiando una de las uniones de corte y empalme para usar una unión alternativa. • la determinación del sexo en el género Drosophilo implica una serie de sucesos de corte y empalme alternativos en genes que codifican productos sucesivos de una vía. los elementos P del género Drosophilo muestran corte y empalme alternos específicos de la línea germinal

Cuando un gen interrumpido se rranscribe en un RNAsn que da origen a un solo tipo de RNAm con corte y empaJme. no hay ambigüedad en la asignación de exones e inrrones. Los RNA de algunos genes, sin embargo, siguen patrones de corte y empalme alternativos que se presentan cuando un solo gen da origen a más de una secuencia de RNAm. En algunos casos, el patrón último de expresión es díctado por el transcrito primario, debido a que el uso de diferentes puntos de in.ido o la generación de extremos alternativos 3' modifica el patrón de corte y empalme. En cienos casos. un solo transcritO primario se corta y empalma en más de una forma, y se sustituyen, agregan o elim inan exones internos, mientras que en OLros, los múltiples productos son simetizados en la misma célula, aunque en otros el proceso es regulado, de manera que hay patrones de corte y empalme espedflcos solo en condiciones también específicas. Una de las cuestiones más importantes acerca del corte y empalme. es determinar qué controla el uso de tales vías alternas. las proteínas que intervienen para desviar el uso de cidos alternativos de corte y empalme se han identificado de dos maneras. En algunos sistemas de mamíferos ba sido posible caracterizar el corte y empalme alternativo in vitro, e identificar las proteínas que se requieren para el proceso. En la D. me/anogaster. las aberraciones en el corte y empalme alternativo pueden ser producto de mutaciones en los genes que sufren el proceso. o de aquellos cuyos productos son necesarios para la reacción. se muestran ejemplos de corEn la te y empa lme alternos, en Jos cuales, el sitio respectivo se mantiene const<mte. mientras que el ouo varía. Los antígenos T grande/e pequeña de SV40 y el producto de la región de ElA adenovírico se gene(an por conexión de un 5' variante con un 3' conStante, mientras que en el caso de los antígenos T/ t el sitio S' urilizadb para el antígeno T elimina un codón de terminadón presente en el RNAm del antígeno t, de manera que el antígeno T es más grande que el antígeno t. En el caso de los productos de transcripción de E 1A. uno de los sitios S' se conecta con el último cxón en un marco de lectura diferente, nuevamente a travé~ de un cambio significativo en la parte terminal-e de la proteína. En esws ejemplos, todos los sucesos de corte y empalme importantes ocurren en todas las células donde se expresa d gen, de manera que se hacen todos los productos proteínicos. Hay diferencias en la relación de anógenos T/ t en diferentes tipos de células. La proteína extraída de células que producen relativamente más antígeno t pequeño. puede dar lugar a la producción preferencial de RNA de 1 pequeño en extractos de otros tipos

26.12 El proceso de corte y empalme alternativo implica el uso diferencial de uniones de corte y em palme

685

Los antlgenos T/t de SV40 cortan y empalman dos sitios 5' con el sitio 2' usual

2

- ,:- ,...,.,3 "" Exones

~

-.=:/'\---

~

T

La E1 A de adenowus corta y empalma sitios variables 5' a un sitio 3' comün 1

Wi\r 13S 12S

9S

2

3

4

Exones

-~289 ammoácidos ~243 aminoácidos

~55 aminoácidos Marcos de lectura alternos

El tra de D. melanogaster corta y empalma el sitio 5' con sitios 3' alternos

3

Exones

1 \ _Macho y hembra - - - S i n proteína 1 \ _Sólo la hembra - - - 2 0 0 aminoácidos

las formas alternativas de corte y empalme pueden generar diversos productos proteínicos a partir de un gen individual. El cambio de los sitios de corte y empalme puede introducir codones de terminación (marcados con asteriscos) o cambiar los marcos de lectura.

celulares. Esta proteína, llamada ASF (factor de corte y empalme alternativo). resulta ser la misma que el factor de cone y empalme SF2, 11ecesario para los primeros pasos del ensamblaje del empalmosoma y para la primera reacción de escisión-ligación (véase la Fig. 26.13). La ASP/SF2 es una proreí11a de unión de RNA de la familia SR. Cuando un pre-RNAm tiene más de un sirio de corte y empalme 5' que precede a un solo sitio de cone y empalme 3', el aumento de concentración de ASF/SF2 prom1.1eve el uso del sitio S' más cercano al 3', a expensas del otro, efecto que puede ser contrarrestado por otro factor de cone y empalme, SF5 . Aún se desconoce la fundón molecular exacta de los facLOres en el control de la limitación del corte y empalme, pero en términos generales, se observa que el corte y empalme altemaúvos que implican a diferentes sitios S' puede ser influido por proteínas involucradas en el ensamblaje del empalmosoma . En el caso de los antígenos T/ t, el efecto tal vez yace en una mayor unión de las proteínas SR con el sitio preferido. El corte y empalme alternativo también puede ser influido por la represión de un sitio. Los exones 2 y 3 del gen T de rroponina de ratón son 686

CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

mutuamente excluyentes, se usa el 2 en el m:. liso y 3 en los otros tejidos. El músculo liso co:-protcínas que se unen a elementos repetidos~­ zados a cada lado del exón 3 que impiden el ... los sitios 3' y 5' necesarios para iocluirlo. La vía de determinación del sexo en D. ir . gaster implica imeracdones en una serie de " donde sucesos de corte y empalme alternos ._ guen a machos y hembras. La vía roma la . ilustrada en la , en la cual, la re._ de cromosomas X con autosomas determina presión de sxl y los cambios de expresión pa~= cuendalmente a rravés de los otros genes ha-: el último de la vía. La vía se inicia con el corre y empalme e· fico de sexo de sxl. El exón 3 del gen sxl ca: un codón de terminación que impide la sínre-una proteína funciona l, aden1ás de e~tar inclu' el RNAm producido en los machos, pero sepa-::;_ alto en las hembras. (Otro ejemplo de la e\it.: de exones se ilustra la .) Como re. do, sólo las hembras producen la proteína Sx,· concentración de aminoácidos básicos simulti otras proteínas de unión de RNA. La presencia de la proteína Sxl cambia e: y empalme del gen transformador (tra). En la F _ 26.21 se muestra que dicho proceso implica e; y empalme de un sitio 5' constante con sitios .! nativos 3' . El patrón de corre y empalme se pr<: en machos y hembras, y da como resultado ur con un codón temprano de terminadón. La pi':' cia de la proteína Sxl inhibe el uso del sitio n :de corte y empalme 3' por unión con la vía ~:; lipirimídina, en su sitio de ramificación. Cuan pasa por alto ese sitio, se utiliza el siguiente si:. con lo cual se genera un RN.Am específico femc: que codifica a una proteína. Así pues, tra produce una protdna sólo en :-_ bras, que es un regulador de corte y empalme. E 2 tiene una función similar en las hembras también se expresa en la línea germinativa m2 lína). Las proteínas Tra y Tra2 son factores de te y empalme SR que actúan direcLameme e:" productos de transcripción diana, además de o rar (en las hembras) en la modificación del c1empalme de dsx. En la figura 26.23 se muestran ejemplos en los sitios de corte y empalme se usan para ag:-~. o sustituir exones o intrones, con la consigui: simetización, otra vez, de diferentes producto!teínicos. En el gen de doble sexo (dsx), en las h..bras empalman el sitio 5' del intrón 3 con ei 3' de ese mismo intrón, de modo que la traduc termina al final del exón 4. En los machos, el S' del intrón 3 se empalma directamente con e. tío 3' del intrón 4, de modo que se omite el ex•

Jel RNAm, y se permite a la traducción continuar hasta el exón 6. El resultado del corte y empalme alternativos es que se producen diferentes proteí:tas en cada sexo. El producto masculino bloquea la diferenciación sexual femenina, en tanto que e] producto femenino reprime la expresión de genes específicos del macho. El corre y empalme alternativos de RNA dsx es .:onrrolado por la competencia entre sitios de corte r empalme 3'. El RNA dsx contiene un elemento de aujo descendente en el sitio de corte y empalme 3', en el extremo izquierdo, el cual se une a Tra2; las Proteínas Tra y SR se vinculan con Tra2 en el sitio, .:¡ue se convierte en un promotor de la unión de J2AF con la vfa adyacente de pirimidina, fenómeno que asigna el sitio 3' para la formación del empal:nosoma en las hembras, más que el sitio alternativo 3'. Las proteínas reconocen al promotor de manera .::ooperativa, tal vez dependiendo de la formación de alguna estructura secundaria, así como de la se..uencia en sí. Así pues, la determinación del sexo tiene una :>irnetría complaciente: la vía se inicia con un su:eso específico de corte y empalme femenino que provoca la omisión de un exón que tiene un codón .:le terminación y termina con un suceso de corte y ::mpalme específico femenino que lleva a la inclu ;ión de un exón que tiene un codón de terminación. :.os sucesos tienen diferentes bases moleculares; en el primer punto de control. Sxl inhibe el patrón de (Orte y empalme predeterminado, y en el último, ~ra y Tra2 cooperan para promover el cone y em~alme específico femenino. Las proteínas Tra y Tra2 no son necesarias para ~1 corte y empa lme normales, pues en su ausen:ia, las moscas se desarrollan normalmente (como machos). Corno reguladores específicos, no necesa' iamente necesitan participar en la mecánica de la :eacción de corte y empalme, a ese respecto cUfiercn .le SF2, que es un factor general req ueTido para el .::orte y empalme, pero también puede in nuir en la ,elección de sirios alternos. Los elementos P de D. melm1ogaster muestran J n patrón de corte y empalme específico de tejido. ::n las células somáticas hay dos sucesos de corte empalme, pero en la línea germinativa, un su.:eso adicional elimina otro intrón. Un codón de .erminación yace en el intrón específico de línea ~erminativa, de modo que se produce una proteína· ~ás larga (con diferemcs propiedades) en la línea ~erminativa. En la sección 21.15, Los elementos P •t: activan en la línea germinativa, se analizan las .:onsecuencias del control de la transposición, pero "Jor ahora, se señala que la especificidad de tejido :s resulrado de diferencias en el aparato de corte y ~mpalme.

vra masculina

Vfa femenina Razón X:A

Alta

\~

~7>·.;~ (f> ;.ot'

~"~'!'e - '

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e"I'!'Q?>

s1n producto

-

JI"

Corte y empalme predeterminados sin producto Corte y empalme predeterminados sin producto Proteína Dsx específica

masculina

o"

/-l.onel respecro---+- ó>~e '1. 1>0 del sexo ~e e\ ,ei({''~Proteina Sxl \t''t'~ 9\eÓe Transformador

Proteína Tra

---+-

1

Promueve el corte y empalme femeninos

-

+

0~e "'s 0

rranslormador 2 - - - . ).}e..¡

..,.._ Doble sexo

e e\\e((' e er.\,t'

~~o"l'!' ~?l;({'e Proteina Tra2 k' '1 9~ Proteína Dsx

--+

espe(:Uica femenina

l

l

Impide la diferenciación femenina (Y promueve el desarrollo masculino)

Suprime los genes masculinos (y promueve el desarrollo femenino)

l

Macho

Hembra

J

La determinación del sexo en D. melanogasterimplica una vía en que tienen lugar diferentes sucesos de corte y empalme en las hembras. ~~ bloqueo en cualquier etapa de la vía da lugar al desarrollo masculino.

El

Dsx de D. melenogester pasa por alto un exón

\.. .... J\.,;

1\ !\ !\ Hembra 1\ !\ ~Macho El rt tropomtoslna cona y empalma exones alternativos

~ Músolllo liso ~ Otrostejidos /\

Los elementos P escinden un intrón adicional

1\._

fL. =

Proteina somática

1\. A 1\ 66K 'r:::::::::l '-1 '===::! Proteína de línea

1

germinativa 87K ------~~----------~

Los sucesos de corte y empalme alternos que involucran ambos sitios pueden dar lugar a adición o sustitución de exones.

La vía de corte y empalme predeterminada del preRN"Am del elemento Pes el patrón germinativo, cuando el RNA es sometido a un extracco de cone y

26.12 El proceso de corte y empalme alternativo implica el uso diferencial de uniones de corte y empalme

68~

empalme heLerólogo (humano) en el cual se escinde el inuón 3. Los extractos de células somáticas de D. melanogascer, sin embargo, contienen una proteína que inhibe la escisión de dicho intrón . La proteína se une a secuencias del exón 3, y si esas secuencias presentan deleción, el inrrón se escinde, de modo que la fw1dón de la proteína quizá sea reprimir el vínculo del empalmosoma con el sitio 5' del intrón 3 .

Las reacciones de corte y empalme en configuración trans utilizan RNA pequeños Cortu~pt.os

prindpales

• Las reacciones de corte y ernpalme suelen ocurrir sólo entre uniones de corte y empalme en configuración cis de la misma molécula de RNA. • En los tripanosomas y gusanos ocurren corte y empalme en configuración trans en el sitio en que una secuencia corta (RNA SL) se empalma con los extremos 5' de muchos RNAm precursores. La estructura del RNA SL simula el sitio de unión Sm de los RNAsn U y podría tener una participación análoga en la reacción.

Desde una perspectiva tanto mecanística como evolutiva, el cone y empalme se considera como una reacción intramolecular que resulta esencialmente en una deleción controlada de las secuencias de intrón en el ámbito del RNA. Desde un punto de vista genético, el corte y empalme ocurre sólo en confi-

guración cis, lo cua l signi.fica gue sólo las sec-.. _ de la misma molécula de RNA pueden cortarse y r 1 marsejuntas. En la parte superior de la se muestra la situación n ormaL los introne;; den eliminarse de cada molécula de RNA de::: de permitir el corte y empalme simultáneo cxoncs, pero no hay corte y empalme intem:: lar de exones entre moléculas de RNA. No se de decir que nunca ocurra un corte y empalr: configuración cis, entre productOs de transcr.pre- RNAm del mismo gen, pero se sabe que ser excesivamente raro, pues si fuese frecuen¡.exoncs del gen podrfan complementarse gen. mente, en vez de pertenecer a un solo grLr complementación, Algunas manipu laciones pueden generar e te y empalme en co nfiguración trans; en el eje. de la pane in[erior de la Figura 26.24 se intro-w ron secuencias complementarias en los intron. dos RNA. El apareamiento de bases entre Los plcmcntos debería crear una molécula con forr-_ H, que podría empalmarse en configuración · para conectar exones de las moléculas de RNA tapuestas; ambas reacciones ocurren in vitro. Otra situación en que es posible un corte y palme en configuración trans i11 vitro se presc cuando se proporcionan substratOs de RNA. que contiene un sitio de corre y empalme 5' ~­ con un sitio de corre y empalme 3', aunados.:: cuencias d~ flujo descendente apropiadas (ya s:- ~ siguiente sitio de cone y empalme 5', o un P' ciador de corte y empalme). De hecho, ésre sL.-

El corte y empalme normal ocurre sólo en configuración cis Exón 1

lntrón

Exón 2

Exón 3

ln!rón

Exón 4

Puede ocurrir corte y empalme en configuración trans si se introducen secuencias complementarias en los intrones

_..

Exón 1

.o.tróo__

Exó.pJ

Exón 3

!nt!9n

Exón 4

~

Productos de corte y empalme en configuración cis

Productos de cona y empalme en configurac•ón trans

El corte y empalme suele ocurrir sólo en configuración cis entre exones de la misma molécula física de ONA, pero en configuración trans que soportan el apareamiento de bases entre intrones. 688

CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

el corte y empa lme por definición del exón (véase parte derecha de la Figura 26.12) y muestra que, in vitro. no es necesario que los sitios de cone y empalme izquierdo y derecho se encuentren en la misma molécula de RNA. Estos resultados demuestran que no hay impedimento mecanístico para el ensamblaje en confi guración trans y descartan modelos de corre y empalme que exijan el movimiemo progresivo de un empalmosoma a lo largo del RNA; por otra parte, el empalmosoma debe ser capaz de reconocer los sitios de corte y empalme 5' y 3' de diferentes RNA, cuando esrán muy cerca. Aunque el corre y empalme en configuración trans es raro in vivo, ocurre en circunstancias especiales. Uno se revela por la presencia de una secuencia líder de 35 bases al final de numerosos RNAm, en el tripanosoma, si bien la secuencia líder no se codifica en flujo ascendente respecto de las unida des de rransoipción individual. Por el contrario, se transcribe en un RNA independiente que porta secuencias adicionales en el extremo 3' , desde una unidad repetitiva localizada en otra parte del genoma. En la 1.. se muestra que ese RNA corta la secuencia líder de 35 bases seguida de una secuencia de sirio de corte y empalme 5'. Las secuencias de codificación del RNAm portan un sitio de corte y empalme 3' inmediatamente anterior a la secuencia que se encuentra en el RNAm maduro. Cuando se conectan la secuencia líder y el RNAm mediante una reacción de cone y empalme en configuración trans, efectivamente la región 3'-del RNA líder y la 5' del RNAm constituyen las milades 5' y 3' de un jntr6n. Al ocurrir el corte y empalme, se forma un enJace 5'-2' por la reacción usual entre GU del intrón 5' y la secuencia de ra mitkación cercana al AG del intrón 3'; no hay un enlace covalente entre ambas partes del intrón, y por ello generan una molécula en forma de Y, no un lazo. La situación similar es con la expresión de genes de actina en el C:lostridium elegans: tres RNAm de actina (y algunos más de RNA) comparten la misma secuencia líder de 22 bases en el extremo 5' . La secuencia líder no está codificada en el gen de actina, pero se· transcribe de manera independiente como parte de un RNA de l OO bases, codificado por un gen en otra parte. El corte y empalme en configuración trans también ocurre en los cloroplastos. El RNA que dona el exón 5' para el corte y empalme en configuración trans, se denomina RNA SL (RNA líder con corte y empal m e ). Los RNA SL que se encuentran en varias especies de tripanosomas, y también en eJ nematodo (C. elegans), presentan algunas características comunes; se pliegan en una estructura secundaria común que tiene 26-.

n

tres tallos-lazos y una región de una sola cad¡;-na que simula el sitio de unión de Sm, de manera que se presentan como RNPsn que forman parte de la clase Sm de RNPsn. Los trípanosomas poseen los RN Asn U2. U4 y U6, no así U l o U5. La ausencia de RNAsn Ul se puede explicar por las propiedades del RNA SL, susceptible de realizar las funciones que el RNAsn Ul suele desempeñar en el sitio de corte y <:lmpalme 5', de modo que el RNA SL consta efectivamente de una secuencia de RNAsn que posee función Ul enlazada al sitio de exón-intrón que reconoce. Hay dos tipos de RNA SL en C. elegans; el RNA SL 1 (primero en ser descubieno) se utiliza para corre y empalme de secuencias de codificación precedidas sólo por regiones 5' no traducidas (situación más frecuente) , en tanto que el RNA SL2 se usa en casos en que un pre-RNAm contiene dos secuencias de codificación; se corta y empalma a la segunda liberándose de la primera y permitiendo que se utilice como RNAm indepcndieme. Cerca dell5% de los genes de C. elegans están organizados en unidades de transcripción que incluyen más de un gen (lo más frecuente es que sean de dos a tres). Aún no se define el significado de esa forma de organización para el control de la expresión génica. En general, esas unídades de transcripción no simulan operones, en los cuales los genes actúan de manera coordinada en una vía.

Repeticiones seriadas de la unidad líder

Unidades de transcripción individuales

"\

l

t

Uder de 100 bases

35 bases -

Secuencia de RNAm

GLJ.: A AG~-=== ¿lntrón izquierdo? ¿lntrón derecho?

,;t-

t

G

A.

Lrder de

..-_ Líder Molécula con forma de Y

AG·=====

Secuancia de RNAm

35 bases

El SLRNA proporciona un exón conectado con el primer exón de un RNAm por corte y empalme en configuración trans. La reacción implica las mismas interacciones que el corte y empalme en configuración cis nuclear, pero genera un RNA con forma de Y, en vez de un lazo.

Las reacciones de corte

yempalme en configuración trans utilizan RNA pequeños

689

la reacción de corte y empaJme en configuración tra11s del RNA SL puede representar un avance en la evolución del apa rato de corte y empalme preRl~Am. En configuración cis, el RNA SL proporciona la capacidad de reconocer el sitio de corte y empalme 5', probabilidad que depende de la con[ormación específica del RNA; las funciones restantes requeridas para el corte y empalme provienen del RNPsn. Por otra parre, el RNA SL puede actuar sin participación de las proteínas. como las RNPsn en U l, l.o cual sugiere que el reconocimiento de l sitio de corte y empalme 5' depende clirectamente del RNA.

RNAI maduro RNAt precursor

e

G

e A

AU Ge"' A?

CG m AU

e u

A

e

Ant1codón

e

G

e

A

A V GC"'

.

Alb.:Apaream•ento

eA GAU U e --¡v u ~.trd'

! ~ --El

1ft CA

intrón se aparea oon el asa anticodón

AA-f..A lntrón

EJII

El corte y empalme del RNAt en levaduras im plica escisión y reunión

El intrón en el RNAt de levaduras apare: bases con el anticodón para cambiar la estructura del: -anticodón; el apareamiento entre una base excluida de:. ~ y el asa del íntrón del precursor puede ser necesario p:..é corte y empalme.

Concepto .pñncipal El corte y empalme de RNAt se debe a reacciones sucesivas de escisión y reunión.

Casi todas las reacciones de corte y empalme dependen de secuencias de consenso cortas y ocurren por transesterificación. donde se coordina la TOtul·a y eso·ucruración de enlaces, en tanto que el corte y empa1me de los genes de RNAt se logra por un mecanismo di(erente, que depende de reacciones independienLes de escisión y reunión, Unos 59 de los 272 genes de RNAL nuclear de la levadura S. cerevisíae están jmerrumpidos; cada uno tiene un solo intrón localizado apenas un nucleótido más allá del sitio 3' del anticodón . la longitud de los in Lrones fluclLia entre 14 y 60 bp; los de genes de RNAt relacionados tienen vínculos en secuencia, pero los ü1trones de genes de RNAl que representan diferentes aminoácidos no están relacionados. No

hay secuencia de consenso que pueda ser reconocida por las enzimas de corte y empalme, lo cual también es válido para los genes nucleares de RNAt interrumpidos en plantas, anfibios y mamíferos. Todos los imrones incluyen tma secuencia complementaria a la del anticodón de RNAt, lo cual da lugar a una conformación alternativa para el brazo del anticodón, en la que sus bases se aparean pata formar una extensión del brazo usual, como en el ejemplo de la , sólo se afecta el brazo del anticodón, el resw de la molécula conserva su estructura usual. La secuencia y el tamaño exacto del intrón carecen de importancia, casi ninguna mutación impide el corte y empalme; el corte y empalme del RNA.t depende

sobre todo del reconocimiento de una estructura secundaria común en el RNA.l, más que de una secuencia común del intrón. Las regiones de varias panes de la molécula 690

CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

son importantes, incluido el segmento entre el b. _ aceptor y el brazo D, del brazo C T\f, y especiaJ¡~ te el brazo anticodón. Esto recuerda las exige::: _ estructurales impuestas al RNAt para la símes. prmeínas (véase Cap. 8, Síntesis de proteínas). Sin embargo, el intrón no carece por comr de importancia, se necesita el apareamiento t'una base del asa del intrón y una base no par_ d.el tallo para el corte y empalme. Las mutacf en otras posicíones que influyen en did1o ap¡¡ · miento (por ejemplo, para genexar patrones ~ nativos de apareamiento) intervienen en el ..:: y empalme. Las reglas que rigen la disponibi de precursores de RNAt para eJ corte y empalr _ asemejan a las que dirigen el reconocimiem las sintetasas de aminoacil-RNAt (véase la sec.. 9.9, Los RNAt son cargados con aminoácido: las sin tetasas). En un murante de levadura sensible a la te!T ratura, que no puede eliminar los intrones, los ~ cursores interrumpidos se acumulan en el núc:_ pueden ser usados como sustratos por un sis:. libre de células extraído de las de tipo silveStre lo cual puede resullar el corte y empalme del cursor, en virtud de la disminución de tamañ sultame. Esto se observa en la electroforesis e~ por un cambio en la posición de la banda, com . La disminución de ~c. ilustra en la 6o se discierne por la aparición de una bande representa al innón. El extracto libre de células puede fracd
son cata/izadas por diferentes enzimas.

Electroforesis en gel

Par de bases Anticodón Sen2Sen15O =Par de bases anticodón-intrón (Al)

Precursor ANAl lntrón 1 1 El corte y empalme del RNAt de levaduras in vitro puede ir seguido del análisis del RNA precursor y los pro-

Las escisiones 3' y 5' del pre-RNAt de S. cerevisiae son catalizadas por diferentes subunidades de endonucleasa; otra subunidad puede determinar la localización de los sitios de escisión determinando la distancia a parti r de la estructura madura. El par de bases Al también es importante.

ductos por electroforesis en gel.

• El primer paso no requiere de ATP; implica rotura del enlace fosfodiéster por una reacción de nucleasa inusual; es cataUzada por una endonucleasa. • El segundo paso requiere de ATP e implica la formación de un enlace, es una reacdón de ligadura, y la enzima encargada de esa actividad se describe como una RNA ligasa .

La endonucleasa de corte y empalme reconoce al RNAt Conceptos principales • Una endonucleasa escinde los precursores de RNAt en ambos extremos del intrón. • La endonucleasa de las levaduras es un heterotetrámero con dos subunidades catalíticas (relacionadas). • Utiliza un mecanismo de medición para determinar los sitios de escisión por sus posiciones relativas respecto de un punto de la estructura del RNAt. • La nucleasa antigua tiene una estructura más sencilla y reconoce segmentos estructurales de protuberanciahélice-protuberancia en el sustrato.

La endonudeasa se encarga de la especifiddad del r~conocimiento del imrón y de escindir al precursor en ambos extremos del mismo. La endonucleasa de la levadura es una proteÚla heterotetramérica cuyas actiVidades se ilustran en la . Las subunidades relacionadas Sen 34 y Sen2 escinden los sitios de corte y empalme 3' y 5', respectivamente. La subunidad Sen54 puede determinar Jos sitios de

5' 3'

N N N N N N

o e

Pu Py_ , ; Pu - -

e;

Proluberancia

o

U P.r--- Hélice

e o

N N

Pu - --

Proluberanc•a

/ PuPy Pu Py

La er¡donucleasa de corte y empalme del RNAt arcaico escinde las cadenas que sobresalen en un segmento protrusión- hélice-protrusión.

escisión ''midiendo" la distancia desde un punto de la esrructura del RNAr que se encuentra en el codo de la estructura en forma deL (madura). Se desconoce la participación de la subunidad Senl5, pero su gen es indispensable en las levaduras, pues se requiere el par de bases que forma entre la primera base del asa del anticodón y la base precedeme del sitio de corte y empalme 3' para el sitio de escisión del corte y empa lme 3'. Una profundización interesante en la evolución del corte y empalme del RNAL proviene de las endonucleasas arcaicas, homodímeros u homotetrámeros en que cada subunidad tiene un sitio activo (aunque sólo dos de eUos funcionan en el tetrámero) que fragmenta uno de los sitios de corte y empalme. La subunidad tiene secuencias relacionadas con las se26.15 La endonucleasa de corte y empalme reconoce al RNAt

691

cuencias de sitios activos de las subunidades Sen34 y Sen2 de la emJma de levaduras. Sin embargo, la enzima arcaica reconoce su sustrato de forma diferente, y en lugar de medir la distancia a partir de secuencias específicas, reconoce la característica estructural llamada protrusión-hélice-protrusión. En la se muestra que la escisión ocurre en ambas protrusiones. Así, el inicio del corte y empalme del RNAtprecede a la separaci6n de las enzimas arcaicas y las euca.riotas, si se originó a raíz de la inserción del intróu en el RNAt, debe haber sido un suceso muy antiguo.

La escisión y la ligadu ra del RNAt son reacciones separadas Conceptos principales • La liberación del intrón genera dos mitades de RNAt que se unen para formar la estructura madura . Las mitades tienen los extremos singulares 5' hidroxilo y 2'-3' fosfato cíclico. • El extremo 5'- 0H es fosforilado por una cinasa de polinucleótidos; la fosfodiesterasa abre el grupo fosfato cíclico para producir un extremo 2' fosfato y un grupo 3'-0H; los extremos de los exones se unen por acción de una ligasa de RNA y el 2' fosfato es retirado por una fosfatasa.

""2'-3' p +

La fostodlesterasa abre el ar1111o fosfato

Cadena

La crnasa fostorila el e)(jremo 5'-0H

o

Cadena

R~ ~" "~'" 0

y__.OH ~

o-6- o

cf''o

2'-3' fosfato cíclico

3'-HO, 2' fosfato

o-g-o

OH

tH 0

Base

tH 0

Base

~-~ Cadena

Cadena

RNAt

ANAl

El corte y empalme del RNAt requiere de actividades se· paradas de nucleasa y ligasa. Los límites de exón-intrón son escindidos por la nucleasa para generar fosfato cíclico de 2' a 3' y un extremo 5' OH . El fosfato cíclico se abre para generar los grupos 3'-0H y 2' fosfato; el 5'-0H está fosforilado. Después de liberar al intrón, las mitades de moléculas de RNAt se pliegan en una estructura similar al RNAt. que ahora tiene una rotura 3'- 0H, 5'-P, sellada por una ligasa. 692

CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

La reacción total del corre y empalme del RNA' resume en la . Los productos de la : cisión son un intrón lineal y dos medias moléC' de RNAt. Cada extremo 5' termina en un grupo h idn y cada extremo 3' en un grupo fos[ato cíclico 2 (Todas las demás enzimas de corre y empalme RNA escinden el otro silio del en lace fosJato.) Las dos mitades de RNAt aparean sus bases ~ formar una estructura similar al RNAt, y cuaod agrega ATP se presenta la segunda reacción. Are extremos inusuales generados por la endonu,clt ... deben ser modificados, de modo que el grupo fo~ cíclico se abre para generar un extremo 2' fos1z reacción que requiere de la actividad de lafosfo
mente los enlaces, y las secuencias requeridas para la reacción yacen en el intrón.

E

La respuesta de la proteína no plegada tiene relación con el corte y em palme del RNAt

Conceptos principales • La Irelp es una proteína interna de la membrana nuclear con su dominio terminal-N en la luz del ER y el terminal-( en el núcleo. • La unión al dominio terminal-N de una proteína no plegada activa la nucleasa terminal-e por autofosforilación. • La nucleasa activada escinde al RNAm Hacl para liberar un i ntrón y generar exones que se unen por una li gasa de RNAt.

• EL RNAm Hacl escindido codifica un factor de transcripción que activa genes codificadores de chaperones que ayudan a plegar las proteínas no plegadas.

Un sistema de cone y empalme desusado relacionado con el corte y empalme del RNAt media la respuesta a las proteínas no plegadas de las levaduras. la acumulación de este lipo de proteínas en fa luL del retículo endoplásmico (ER) desencadena una vía de respuesta qu.;: lleva al aumento de la transcripción de genes que codifican chaperones, los cuales facilitan el plegamiento de las proteínas en el ER. de modo que debe trasmitirse una señal de la luz del ER al núcleo. El censor que activa la vía es la proteína Irel p, proteína integral de membrana de tipo cinasa (Ser/ Treo) que tiene dominios a cada lado de la membrana del ER. El dominio terminal-N, en la luz del ER, detecta las proteínas no plegadas, supuestamente por unión con tos segmentos expuestos, lo cual provoca la agregación de monómeros y activa el dominio terminal-e en el otro lado de la membrana por autofosforilación . Los genes activados por esta vía tienen un elemento promotor común llamado UPRE (elemento de respuesta de proteína no plegada), al cual se une el facror de transcripción Haclp para producir una respuesta a la acumulación de proteínas no plegadas; el desencadenantc de la producdón de Haclp es la acción de lrelp en el RNAm de Hacl. La operación de la vía se resume en la . En condiciones normales, cuando la vía no está activada, el RNAm de Hacl se traduce en una proteína que se fragmenta rápidamente. La activación de Trelp da origen al corte y empalme del RNAm de HacJ que cambiará la secuencia de la pro-

teína a una forma más estable, la cual proporciona el facwr de transcripción funciona l que activa los genes con UPRE. En esta reacción participan componentes inusuales de corte y empalme. La Jrelp tiene actividad de endonucleasa, que actúa directamente en el RNAm de Hacl para escindir las dos uniones de corte y empalme, las cuales están unidas por la ligasa de RNAt, la cual actúa en la vía de corte y empalme de RNAt. la reacción de endonudeasa simula la escisión del RNAt durante el corte y empalme. ¿Dónde ocurre la modificadón del RNAm Hacl? Es probable que la lrelp esté en la membrana inrerna del núcleo, con el dominio sensor terminal-N en la luz del ER y el terminal-e cinasa/nucleasa en el

núcleo, lo cual le permictrfa actuar directamente en el RNA de Hacl ames de que se exporte al citoplasma, además de facilitar el acceso a la RNAt ligasa. No hay u na relación aparente entre la actividad de nucleasa de Irelp y la de endonucleasa de corte y empalme del RNAt, de modo que no es obvio cómo evolucionó este sistema especializado.

El dominio EA-luminal se une con la protefna no plegada

El dominio nuclear/ citosólico escinde el HAC1 ANAm

--=- -==== ~ =

l

Traducción

!

Degradación

1

Ligasa t deRNAt

Traducción HAC1

UPRE La respuesta de la proteína no plegada se produce por activación de un corte y empalme especial del RNAm HACl para producir un factor de transcripción que reconoce al UPRE.

26.17 La respuesta de la proteína no plegada tiene relación con el corte y empalme del RNAt

693

BE Los extremos 3' de los productos de transcripción pol I y pol III se generan por terminación Concepto~

principales

• La polimerasa I de RNA termina la transcripción con una secuencia finalizadora de 18 bases. • La polimerasa Ili de RNA termina la transcripción en la secuencia poli (U)4 de una secuencia rica en G-C.

Los extremos 3' del RNA pueden generarse en dos forma s. Algunas polimerasas de RNA terminan la transcripción en una secuencia definida (tcrmi-

3' 5'

Cuando se genera un extremo 3' por terminación, la polimerasa de RNA y el RNA se liberan e[l una secuencia definida (de terminación) en el DNA.

5'

Cuando se genera un extremo 3' por escisión, la polimerasa de RNA continúa la transcripción, mientras una endonucleasa hace un corte en una secuencia definida en el RNA. 694

CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

nadora) en el DNA, como se muestra en la . en tanto que otras polimerasas de RNA. muestran una terminación definida, sino que c0linúan más allá del siúo que corresponde al extrer: 3' generado por la escisión del RNA por una ene nucleasa, como se muestra en la La información acerca de la reacción de term nación para las polimerasas de RNA eucarióticas;:; menos detallada que el conocimiento que se ticde la iniciadón. Las polimcrasas 1 y Ili de RNA r. nen sucesos de terminación bien definidos (co:la poli merasa de RNA bacteriana). pero no se aclarado si la polimerasa II de RNA suele termir:.: de esa forma. Para la polimerasa 1 de RNA, el producto Ú!:"" co de transcripción es un gran precursor que CC' tiene las secuencias del RNAr mayor. El precur5 está sujetO a un procesam iento extenso, con LJterminación en un sitio definido > 100 bp en fh:. descendente respecto del extremo 3' maduro, gerrado por corre y empalme. La terminadón imp: el reconocimiento de una secuencia terminadora ~ 18 bases por un factor auxiliar. Con la polimerasa ID de RNA, la transcripd in vitro genera moléculas con los mismos extren; 5' y 3' que los sintetizados in vivo. La reacción _ terminación simula la terminadón intrú1seca p la polimerasa de RNA bacteriana (véase la secci 11.2 1, Hay dos tipos de terminadores en B. coli) __ terminación suele ocurrir en el segundo U de u~ serie de cuatro bases U, pero hay heterogeneida de modo que algunas moléculas terminan en :: o hasta cuatro bases U. La misma heterogeneié: se observa en moléculas sintetizadas in vivo, de w· nera que parece una característica de buenafede reacción de terminación. Como los terminadores procarióticos, la sede U es tá incrustada en una región rica en G-C aunque hay secuencias simétricas cada 180°, no_ necesarias para la terminación, pues las mutador que eliminan la simetría no evitan la conclus; normal de la síntesis de RNA; tampoco hay secue- cias necesarias más allá de la serie U porque to".: las secuencias vitales pueden ser sustituidas, ~ ningún efecto en la terminadón. La serie U misma no es suficiente para la :t minación porque hay regiones de cuatro moléct: : U sucesivas en las unidades de transcripción le:ü... por la polimerasa III de RNA (si bien no hay se;:U~ internas. lo cual coincide con una mayor efica;:en la terminación cuando el terminador es U5, rr. que una secuencia U4 ). Así pues, la caracterísí clave de la terminación debe ser el reconocimie• de una secuencia U4 en un contexto rico en pade bases G-C.

¿Cómo ocurre la reacción de terminación? No -:: puede confiar en la debilidad de la región del fbrido RNA-DNA rU-dA que yace en el extremo ~~ transcrito. pues a menudo sólo se transcriben ..JS primera~ <.los moléculas de U. Tal vez la región -.::a en G-C participe en el cnlentecimiemo de la '!lZima. pero no parece que una comrapane de - horquilla esté involucrada en la terminación en -1.5 procariotas. Se mantiene el enigma en cuanto a .=forma en que la em.ima puede responder de maera tan específica a una señal tan breve. A diferenia de la reacción de iniciación, que la polimerasa '!1 de RNA no puede realizar sola. la terminación arece ser una función de la enzima misma.

E

Los extremos 3' del RNAm se generan por escisión y poli ade ni lación

1 Conceptos prindpille~

La secuencia AAUAAA es una señal para la escisión, que genera un extremo 3' del RNAm poliadenilado. • La reacción requiere de un complejo proteínico que contiene un factor de especificidad, una endonucleasa y una polimerasa poli(A). • El factor de especificidad y La endonucleasa escinden el RNA en flujo descendente respecto de AAUAAA. • EL factor de especificidad y la polimerasa poli(A) agregan continuamente -200 moléculas de A al extremo 3'.

:.os exrremos 3' del RNAm son generados por es dsión, segu ida de poliadenilación. La adición de '"~oli(A) al RNA nuclear puede evitarse mediante el :lOálogo desoxiadcnosina, que también se conoce :omo cordicepina, que si bien no detiene la trans:ripción del RNA nuclear, al agregarla se impide la lparición de RNAm en el citoplasma, con Jo cual se Jemuestra que la poliadenilación es necesaria para la Qladuración del RNAm a partir del RNA nuclear. La generación del extremo 3' se ilustra en la . La polimerasa de RNA transcribe más 'liá del sirio correspondiente al extremo 3', de modo ..¡ue las secuencias de RNA se reconocen como dianas ~ra un conc endonucleolítico segtúdo de poliadeniladón; un solo complejo de procesamiento realiza d corre y la poliadenilación; esta última estabiliza el RNAm contra la fragmentación desde el extremo 3'; d extremo 5' ya está estabilizado por el capuchón. La 'lOlimerasa de RNA continúa la transcripción después Je la escisión, pero el extremo 5' que se genera está Jesprotegido. El suceso de escisión proporciona un desencade~ante indirectO de la tetminación por la polimerasa

n de RNA.

Una exonuclcasa se une con el extremo 5' del RJ~A. que sigue siendo transcrito después de la escisión y fragmenta al RNA en forma más rápida que su síntesis; se aparea con la polimerasa de RNA para después interactuar con proteínas auxiliares unidas al dominio carboxilo terminal de lapolimerasa, interacción que desencadena la liberación de la polimerasa de RNA del DNA y lleva a su fin la transcripdón. El modelo global es similar al de la partidpación de Rho en la term.inaáón de la transcripción por la polimerasa de RNA bacteriana (véase la secáón 11.22, ¿Cómo fundona el factor Rho?), lo que explica porqué los sitios de tenninación para la polimerasa II de RNA no están bien definidos, sino que pueden ocurrir en varias localizaciones de una prolongada región de !lujo descendente respecto del sitio correspondiente al extremo 3' del RNA. Una característica común del RNAm en eucariotas superiores (no así en las levaduras) es un a secuencia altamente conservada, AAUAAA, en la región de 11 a 30 nucleótidos en Oujo ascen dente respecto del sitio de adición de poli(A), La deleción o mutación del hexámero AAUAAA impide la generación de un extremo 3' poliadenilado, pues la señal es necesaria para la escisión y lil poliadenilaáón. El desarroUo de un sistema en el cual la poliadenilación ocurre in vitro. abrió las puertas al análisis de las reacciones. La formación y las funciones del complejo que realiza el procesamiento 3' se ilustran en la . La generación de la estructura 3' terminal apropiada requiere de una endonu deasa constituida por los componentes CFl y CFIT para escindir el RNA, una poli m erasa poli (A) (PAP)

Elongación

---.

' E.

SCISI'6 n

Capuchón 5'

Endonucteasa

El RNAm se estabiliza por polladenilación

..,.--Exonucleasa Oegradac1ón Poliademlac1ón

1Capuchón 5'

AAUAJ

La secuencia AAUAAA es necesaria para que la escisión genere un extremo 3' para La poliadenilación.

26.19 los extremos 3' del RNAm se generan por escisión y poliadenilacion

695

5'

3' CPSF AAUAAA

~

c~t\c~c G

PAP El factor de escisión genera un extremo 3'

AAUAAA

La polimarasa poli(A) (PAP) agrega moléculas de A

/ PAP AAUAAA ~ AAAAAAAA-3' CstF La proterna de unión poii(A) (PBP) se une a poli(A)

PBP AAUAAA CstF

AAAAAAAAAAAAAA-3'

El complejo se disocia después de agregar -200 moléculas de A

AAUAAA

PBP AAAAAAAAAAAAAA-3'

El complejo de proce~amiento 3' consiste de varias actividades; el CPSF y el CstF constan cada uno de varias subunidades; Los otros componentes son monoméricos. La masa total es de >900 kD.

para sintetizar la cola poli(A) y un componence de especificidad (CPSF) que reconoce la secuencia AAUAAA y dirige las otras acrividades. Un factor de estimulación, CstF, se une a una secuencia rica en G-U en flujo descendente respectO del sitio mismo de escisión. El factor de especificidad contiene cuatro subunidades que juntas se unen específicamente al RNA que contiene la sccuenda AAUAAA. Las subunidades individuales son proteínas con segmentos de unión al Rl\'A comunes, pero que por sí mismas se unen de manera inespecífica al RNA. Las interacciones proteína-proteína entre subunidades tal vez sean necesarias para generar el sitío de unión especííico a AA.UAAA. El CPSF se une fuertemente a esta última sólo cuando también está presente el CstF para unirse al sitio rico en G-U. Para las reacciones de escisión y poliadenilación se necesita el factor de especificidad, que se 696

CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

encuentra como complejo con la endonudea:; polimerasa poli(A), complejo que suele real•-escisión seguida de poliadenilación en una estrechamente acoplada. Los dos componentes CFI y CFH (facto: escisión I y IT), aunados al factor de especi~::­ son necesarios y suficientes para la esdsión e. n ucleolítica. La polimerasa poli(A) tiene una actividad _ lítica inespecífica . Cuando se combina con los componentes, la reacción sintética se hace ey. fica del RNA que contiene la secuencia AAt: -- La reacción de poliadenilación pasa por dos e 2' primero se agrega una secuencia más bien oligo(A) (- 10 moléculas), al extremo 3', rea~ ­ absoluLamente dependiente de la secu encia A.- _ AA, que realiza la polimerasa poli(A) dirigida~ factor de especificidad. En la segun da fase, :a _ oligo(A) se alarga hasta un total de -200 moléc Dicha reacción requiere de otro factor estimu.: que reconoce la cola oligo(A) y dirige a lapa· rasa poli(A) específicamente a que extienda e tremo 3' de una secuencia poli(A). · La polimerasa poli(A) agrega por sí mismaléculas de A individuales a la posición 3' . Su :intrínseca de acción es distributiva, se disoda pués de que se ha agregado cada nudeótido, s! en presencia de CPSF y PABP (proteína de u poli(A) ) actúa de manera progresiva para eXt.c una cadena poli(A) individual. La PABP es una tefna de 33 kb que se une de manera estequiorr _ ca al segmento poli( A), cuya longirud es contr por la PABP, que de alguna manera limita La ac de la polimerasa poli(A) a -200 adiciones de rr culas de A. El límite podría representar la an. ladón de una masa críLica de PABP en la ca~ poli{A). La PABP se une con un facto r de inic la Lraducción, e !F4G, generando así una asa ceda en la cual un complejo proteínico contieu~ extremos 5 ' y 3' del RNAru (véase la Fig. 8.:_ la sección 8.9, Las eucariotas usan un comple muchos factores de iniciación). La poliadenilación determina de manera irrtante la función del RNAm, pues puede atcctar¡¿la estabilidad como el inicio de la traducción(\ e la sección 7.10, El extremo 3' está poliadenilc: Durante el desarrollo embrionario de algunos - _ nismos, la poü(A) conrrola la rransducdón, de eque los RNAm previos pueden estar poliadenil.; (para estimular la Lraducción) o desadenilados ¡ terminarla). Durante el desarrollo embrionari• género Xenopus, la poliadenilación del RNArn e citoplasma depende de un elemento específic, actuación en configuración cis (el CPE} en la col.: otra frecuencia rica en AU, UUUUUAU.

Bn los embriones del género Xmopus, cuando ':":lenas dos tipos de secuencias de actuación en con5guración cis que se encuentran en la cola 3' pueien desencadenar la desadenilación. Por una pane, :-1 EDEN (elemento de desadenilación embrionaria) =~ una secuencia de 17 nudeótidos. en tanto que os elementos /\RE son ricos en AU y suelen con:ener repeticiones seriadas de AUUUA. Hay una ;bonucleasa poli(A) (PARN) especifica que podría 'larticipar en la fragmentación. Obviamente, la des::denilación no siempre es desencadenada por los ~ tememos específicos; en ciertas situaciones (induiJa la rragmemadón normal del RNAm conforme mvejece), la poli(A) se fragmenta, a menos que sea t>specíficameme es[abilizada.

La escisión del extremo 3' del RNAm de histona puede requerir un RNA pequeño Conceptos principales • Los RNAm de histonas no están poliadenilados; sus extremos 3' se generan por una reacción de escisión que depende de la estructura del RNAm. • la reacción de escisión exige la unión de SLBP a una estructura de tallo-asa y que se aparee el RNAsn U7 con una región adyacente monocatenaria. Algunos RNAm no están poliadenilados. de modo que la formación de sus extremos 3' es diferente de .a reacción coordinada de escisión/poliadeniladón. ios miembros más notables de esta clase de RNAm ;on los que codifican para las histonas que se sintetizan du.ramc la replit:ación del DNA, la formación de :uyos extremos 3' depende de la estructura secundaria . La estructura del extremo 3' es de tallo-lazo muy conservada, con un tallo de 6 bp y u n asa de ::uatro nuclcóriclos. La escisión ocurre a una disl.ancia de cuatro a cinco bases en flujo descendente ~especw del tallo-lazo. Para la reacción de escisión. se requieren dos factore s, que la proteína ele unión JI tallo-asa (SLBP) reconozca la estructura y que el RNAsn U7 se aparee con una secuencia rica en ?Urinas (el elemento de flujo descendeme hisrona u HDE) localizada -10 nucleótidos en flujo deseenJeme respecto del sito de escisión. Las mutaciones que no permiten la formación iel tallo doble en la estructura tallo -lazo impiden ,a formación del extremo del RNA. Las mutacioues secundarias que restablecen la estructura doble aunque no necesariameme la secuencia original) ;e comportan como revenares, fenómento que su~iere que Informati6n de la estructura secundaria es más :mportante que la secuencia eXt1cta. La SLBP se u ne con

uu

u u

RNAm H3

. UA Horqutlla --e G Consen¡¡o 1 UA CG 5'. AACcfJ CCACCACACCCCCAAGAAAGAUUCUCGUUAAA CAACCGUGA uCUGGGAAGAUclfJ\l\.lGII-COUUCU AG5• GC CG GC RNAsn U7 GG AU GC GC CG

U A GA

la generación del extremo 3' del RNAm de la histona H3 depende de una horquilla conservada y una secuencia que aparea sus bases con el RNAsn U7. ta llo-asa y después interactúa con el RNAsn U7 para promover su interacción con el sitio de unión del flujo descendente ele RNPsn U7, que es una RNPsn menor constituida por 63 nucleótidos del RNAsn U7 y un conjumo de varias proreínas (incluidas las S m; véase la sección 26.5, Se requieren RNAsn para el corre y empalme). La reacdón emre el RNAm de la histana H3 y el RNAsn U7 se incluye en la . La horquilla en flujo ascendente y el HDE que se aparea con el RNAsn U7 se han conservado en el RNAm de la histona H3 de varias especies. El RNAsn U7 tiene secuencias hac.:ia su extremo 5' que se apa rean con las de consenso del RNAsn de histonas. El procesamiento 3' es inhibido por mutaciones en HDE que reducen su capacidad de apareamiento con el RNAsn U7. Las mutaciones compensatorias en este último que restablecen la complementariedad, también restablecen el procesamiento 3'; esto sugiere que el RNAsn V7 actúa por apareamiento de bases con el RNAm de histonas. La secuencia de HDE varía entre los d iversos RNAm de histonas, de modo que la unión de RNAsn no es por sí misma necesariamente estable. sino que requiere también de la imeracdón con SLBP. La escisión para generar un extremo 3' ocurre a una distancia fija respecto del sitio reconocido por el RNAsn U7. Jo cual sugiere que e l RNAsn participa en la definición del sitio de escisión. Sin embargo, los factores realmeme encargados de la escisión no han sido identificados aún.

fZ1D

La producci ón de RNAr requiere de sucesos de escisión

Concepto principal • El RNAr grande y el pequeño se liberan por escisión a partir de un RNA precursor común.

26.21 La producción de RNAr requiere de sucesos de escisión

69 7

i8S

5.8S

28S

-~ 18S

~

5.8S

28S

~

Endonucleasa

-+-

3'-5' exonucleasa

--.

5'-3' exonucleasa

A partir de un producto primario de transcripción se generan RNAr eucarióticos maduros por sucesos de escisión y recorte.

RNAI DNA P1 P216S RNAr

23S RNAr

SS RNAt

t1t2

30S RNA

L

Productos

l

16S RNAr RNA!

23S RNAr

l

SS RNA RNA!

Los operones rrn de f. coli contienen genes para RNAr y RNAt. La longitud exacta de los productos de t ranscripción depende de qué promotores (P) y terminadores (t) se usen. Cada RNA producido debe liberarse del transcrito mediante cortes a ambos lados.

698

Los principales RNAr se sinterizan como parte ,:; productO único de transcripción primaria proce. · para generar Jos productos maduros. El prea.. contiene las secuencias de los RNAr de 18S, 5 28S. En eucariotas superiores, el precursor se !: bra de acuerdo con su velocidad de sedimemac. como RNA 45S; en eucariotas inferiores es pequeño (3 5S en levaduras). Los RNAr maduros se liberan del precurso: una combinación de sucesos de escisión y rea.: nes de recorte. En la se muestra ::. general de las levaduras. Puede haber variadoel orden de los sucesos, pero básicamente pank: reacciones similares en todas las eucariotas. l a yor parte de los extremos 5' se genera directaJr _ por un suceso de escisión, en tanto que casi i los extremos 3' se generan por escisión segui-.: una reacción de recorte 3'5 '. Muchas ribonucleasas han sido implicadas . procesamiento de RNAr, incluido el exosoma. es un ensamblaje de varias ex:onudeasas que - ~­ bién participa en la fragmentación del RNAm (\ tla sección 7.13, La fragmentación del RNAm imT"" múltiples actividades). Las mutadones en enz.indi,viduales no impiden el procesamiento, lo ... _ sugiere que sus actividades son redundames } se pueden usar diferentes combinaciones de esC!ll nes para generar las moléculas maduras. Siempre hay varias copias de la unidad de tr.; cripción para RNAr, las cuales se organizan e repeticiones seriadas (véase la sección 6. 9, Los "' nes repelidos para RNAr mantienen una secue:constante.) El RNA SS se transcribe a partir de genes se¡l.a dos por la polimerasa ffi de RNA. En general, dit.. genes se agrupan, pero están separados de los R."" principales. (En el caso de las levaduras, un ger " se vincula con una unidad de transcripción ma: pero se transcribe de manera independiente.) En la organización de los precursores en las ~ z terias hay diferencia; la secuencia correspondieal RNArde 5.8$ forma el extremo 5' del RNAr gre de (235, esto es, no hay procesamiento entre e secuencias). En la se muestra qu e precursor también contiene el RNAr de SS en t.. o dos RNAt. En E. coli, los siete operones rrn es·: dispersos en el genoma; cuatro loci rrn comiener> -.gen de RNAt entre las secuencias de RNAr de y 23S, y los otros loci nn contienen dos genes RNAt en esa región. Puede, o no, haber genes a dona les de RNAt emre la secuencia 55 y el extre:-3'. Asi, las reacciones de procesamíemo requeric..... para liberar los productOs dependen del conteni dellocus rrn en panícular. En el procesamjento de RNAr en procariotas eucariotas, las protemas ribosómicas, y posiblem~-

CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

re otras, se unen al precursor. de manera que en el sustrato para el procesamiento no está el RNA libre, más bien un complejo ribonucleoproteínico.

RNAsno

5'

CajaC

AUGAUGA

Se requieren RNA pequeños para el procesamiento del RNAr

Caja O NNNNNN CUGA

!

Apareamiento de bases

5' RUGAUGA

Conceptos pñncipa\es • Se requiere el grupo C/D de los RNAsno para modificar la posición 2' de la ribosa con un grupo metilo. • Para modificar la posición 2' de la ribosa con un grupo metilo se requiere del grupo C/D de RNAsno. • Para convertir la uridina en seudouridina se necesita el grupo H/ACA de RNAsno. • Para generar una estructura usual, sustrato de la modificación, en todos los casos, la base del RNAsno se aparea con una secuencia de RNAr que contiene la base diana.

NNNNNN "NNNNNN RNAr

!

CUGA

Metilación

5 bases de la caja D 5' RUGAUGA

El procesamiento y modificación del RNAr requiere de una clase pequeña de RNA llamada RNAsno (RNA nucleolares pequeños), de los cuales hay 71 en el genoma de las levaduras (S. cerevisiae), los cuales se vinculan con la proteína fibrilarina, componente abundante del nucléolo (regjón del núcleo donde se transcriben los genes de RN Ar). Para escindir al precursor de RNAr se requiere de algunos RNAsno; un ejemplo es el U3, necesario para el primer suceso de cone en levaduras y organismos del género Xenopus. ~o se sabe qué participación tiene en la escisión, pero podría requerirse para el apareamiento con la secuencia de RNAr y formar una estructura secundaria reconocida por una endonucleasa . Para las modificaciones que se hacen en las bases del RNAr, se requieren dos gnlpos de RNAsno, cuyos miembros se identifica n pur secuencias conservadas muy cortas y características comu nes en las estructLUas secundarias. El grupo C/D del RNAsno permite añadir un grupo metilo a la posición 2' de la ribosa. Hay> 100 grupos 2'- 0 - metilo en localizaciones conservadas en RNAr de vertebrados. Ese grupo toma su nombre de dos secuencias cortas conservadas llamadas cajas C y D. Cada RNAsno conliene una secuencia cerca de la caja D, complementaria de una región del RNAr de 18$ o 28$ metilada. La pérdida de un R.~Asno impide la metilación en la región del RNAr de la que es complementario. En la se sugiere que el RNAsno aparea sus bases con el RNAr para crear una región rloble que se reconoce como sustrato para la meúlación, la cual ocurre en la región de complementariedad, en una posición fija a cinco bases de distancia

¿NNNN NNNNI'JN ¡•

CUGA

,

NNNNNN RNAr metilado

Un RNAsno aparea sus bases con una región del RNAr que se va a metilar.

o11 e

o11

HN :-'4'CH 5 1

11

"'c.g~N, 1 §CH o"' 1

Uridlna

Sin tetasa de seudouridina

,.....e

HN 3 2

1-t-JH 131

1

0 ~c~ ~ ~cH 1

Seudouridina (1¡1)

La uridina se convierte en seudouridina por sustitución del enlace Nl-azúcar con el enlace es-azúcar y rotación de la base respecto del azúcar.

del Lado 5' de la caja D. Es posible que cada suceso de metilación sea cspeciíicado por u o RNAsno diferente, de los cuales se han caracterizado -40, hasLa ahora. No se han caracterizado las metilasas, de modo que es posible q ue el RNAsno mismo provea pane de la acLividad de metilasa. Otro grupo de RNAsno participa en la síntesis de la seudouridina. En el RNAr de las levaduras hay 43 moléculas 1.J1 y -100 en el de Jos vertebrados. La símesis de la seudouridina implica la reacción que se muestra en la , en la cual se rompe

26.22 Se requieren RNA pequeños para el procesamiento del RNAr

699

RNA-RNA. Como en las reacciones de escisió!' RNAsn tal vez actúa en forma de w1a ribonucleo~ teína específica que contiene proteínas y RNA. B _ cueme qu e el RNA de la panícula aparee sus bases una secuencia corta en eJ RJ~A sustrato (aunque r: único mecaJúsmo de acdón).

Resumen

RNAr 5'

RNAsno 5'

ANANNA Caja H

ACANNN

CajaACA

Los RNAsno H/ACA tienen dos secuencias cortas conservadas y dos estructuras en horquilla, cada una con regiones complementarias del RNAr en el tallo. La seudouridina se forma por conversión de una uridina impar en la región complementaria del RNAr.

el enlace Nl del ácido uridilico a la ribosa, la base gira y es se reúne con el azúcar. La formación de seudouridina en el RN'Ar necesi La a l grupo H/ACA de -20 RNAsno, los cuales se nombran por la p resencia de un uipleLe de ACA a tres nucleó~idos de distancia del extremo 3' y una secuencia parciaJmente conservada (la caja H} que yace e ntre dos estructuras de tallo-asa-horqu illa. Cada uno de esos RNAsno tiene una secuencia complementaria del RNAr en el tallo de cada horquilla . se muestra la estructura que se En la produciría por apareamiento con el Rl'lAr. En cada región de apareamiento hay dos bases no apareadas, una de cuales es una uridina que se convierte en seudou ridina. Los RNAsno H IACA se vinculan con una proreíDa nudeolar llamada Garlp necesaria para la formación de la seudouridina, pero se desconoce su función. Las simetasas de seudourid.ina conocidas son proteinas que actúan sin un cofactor RNA. No se han idenrificado las sintetasas que podrían participar en la síntesis de scudourid.ina mediada pot RNAsno. La panicipación de RJ~Asn U7 en la generación del extremo 3' y de R.t'fAsno en el procesamiento y mod.ificadón del RNA.r es compatible con el punto de vista expresado en el Capítulo 27, RNA catalítico, de que muchos de los sucesos de procesamiento deJ RNA, si no es que todos, dependen de interacciones 700

CAPÍTULO 26 Corte. empalme y procesamiento del RNA

Por el cone y empalme se eliminan imronesunen exones en la secuencia madura del RNA. cuando menos cuatro tipos de reacción, segt:observa por sus requerimientos in vitro y los _duetos intermedios que generan . Los sistema5 el u yen inrrones nucleares eucarióticos, intronc los grupos I y n e intrones de RNAt. Cada reac. implica un cambio de organización en una mole~ individual de RNA y, por tanto, es un suceso ocurre en configuración cis. El cone y empalme del pre-RNAm sigue preferidas, pero no obligatOrias. Sólo se requic.secuencias de consenso muy cortas, el resto de. trón parece carecer de importancia. Todos los s;. de escisión Y son ta l vez equivalentes, igual que 3 '. Las secuencias necesarias se derivan de la re=GU-AG, que describe los extremos de l intrón . .:. in trones de mamífero también se requiere el siti ramificaciól1 UACUAAC de las levaduras o una c:uencia de consenso menos conservada . La reacc con el sitio de corte y empalme 5' implica la forr dónde un lazo que une el extremo GU del imrt través de un enlace 5'-2' con la A de la posición fío el sitio de ramificación. El extremo 3'-0B del e· ataca entonces el sitio de corre y empalme 3 manera que los exones se ligan y el intrón se li'(l_ como lazo. Ambas reacciones son u·ansesterifica" nes que conservan los enlaces. En varias etapas la reacción se requiere de h idrólisis de ATP, J' blememe para producir cambios conformador.a en el RNA, los componentes proteínicos, o ambLa formación de lazos se encarga de la selección siúo de corte y empalme 3', en tanto que facHproteínicos producen patrones altern os de con empalme que estimulan el uso de un nuevo sil· bloquean el de un sitio predeterminado. El cone y empalme del pre -RNAm implica formación de un empalmosoma, partícula grar que ensambla secuencias de consenso en una e formación reactiva . El empalmosoma se forma JT' a menudo por un proceso de definición de intron_ el cual implica el reconocimiemo del sitio de cor~~ empalme s ·, el de ramificación y el de corte y e"'palme 3' . Una vía altema implica la defi.nicióPexón, que incluye el reconocimiento inicial de sitios 5' de corte y empa lme del intrón sustrato '

siguiente intrón. Su formación pasa por una serie de etapas, del complejo E (de asignación) , que con tiene RNPsn Ul y factOres de con e y empalme. a los complejos A y B como componentes adicionales. El empalmosoma contiene las RNPsn U l , U2, U4/U6 y U5, así como algunos facwres de corte y empalme adicionales. Las RNPsn U 1, U2 y U5 contienen cada uno un RNAsn único y varias proteínas: la RNPsn U4/U6 contiene dos RNAsn y varias proteínas, a lgunas son comunes a todas las partículas de RNPsn, que recon ocen secuencias de consenso. El RNAsn U 1 aparea sus bases con el sitio de corte y empalme 5', la RNAsn U2 con la secuencia de ramificación y el RNPsn U5 actúa como sitio de corre y empalme 5'. Cuando U4 libera a U6, el RNA sn U6 aparea sus bases con U2, lo cual pue de dar lugar al centro catalítico para el corte y empalme. Un conjunto alternaLivo de RNPsn proporciona fundones análogas pa ra corte y empalme de la subclase Je intrones dependiente de Ul 2. Las moléculas de RNAsn pueden tener Eu ncioncs cuasi catalíticas en el corte y empalme, otras de procesamiento. En el nucléolo, do!) grupos de RNAsno se encargan del apareamiento con el RNAr en sitios modificados; los RNAsno del grupo CID indican sirios diana para la metiladón y los del grupo ACA idenrifican s itios en que la uridina se conviene en seudouridina. El corte y empa lme suelen ser imramoleculares, pero e n uipanosomas y nematodos ocurre ~:n configuracióntrans (corte y empalme intermoleculares). Este proceso implica una reacción emre un RNA SL pequeño y e l pre-RNAm. El RNA SL simula un RNAsn Ul y puede combinar la función de propoJjonar d exón con las fun ciones de U l. En los gu~a no~ hay dos tipos de RNA SL, uno se utiliza para .:ortc y empalme del extremo 5' de un HNAm y el :~rro, para conc y empalme en un sitio interno. Los imrones del gr upo n comparten con los in·rones nucleares e l uso de un lazo como intermedio, '1ero pu eden realizar la reacción como propiedad aulocatalizada del RNA. Dichos inrrones siguen la ·egla GT-AG pero forma n una estructura secu ndaria ..a racterística que mantiene los sitios reactivos de .:one y empalme en la aposici ón apropiada. El corte y empalme del RNAt de las levad u ras mplica reacciones de endonucleasa y ligasa separaJas. La endonu cleasa reconoce la estrunura secun.1aria (o terciaria ) del precursor y fragmen ta ambos _·memos del inrrón: las dos mitades de RNAr libe-adas por pérdida de un intrón, se pueden ligar en .-esencia de ATP. La capacidad de terminación de- la polimerasa ~ de RNA no ha sido ca ra cterizada a(m, y los extre""10~ 3' de sus produc10s de transcripción se gene-

ran por escisión. La secuencia AAUAAA localizada de l l a 30 bases en flujo ascendente respecto del sitio de escisión proporciona la señal para la esci sión y la poliadenilación. Una endonucleasa y la polimcrasa poli(A) se vinculan en un complejo con oLr os factores que confieren especificidad para la señal AAUAAA. la transcripción termina cuando una exonuclcasa que se une con el extremo 5' de la cadena de RNA naciente creada por la esdsión, se empareja con la polimerasa de RNA.

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Bll

El corte y empalme del pre-RNAm proceden a través de un lazo

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701

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At

lCIIIM

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la RNPsn U1 inicia el corte y empalme

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702

CAPÍ TULO 26 Corte, em palme y procesamiento del RNA

111

El complejo E puede formarse por definición intrón o exón

~

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Bll

Un aparato alternativo de corte y empalme utilb diferentes RNPsn

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m

El corte y empalme está relacionado con la exportación del RNAm

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las reacciones de corte y empalme en configuración trans utilizan RNA pequeños u de

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CAPÍTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

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fE

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Referencias

705

RNA catalitico ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción 111!1 Los intrones del grupo 1 realizan autocorte y em palme por transesterificación Los únicos factores necesarios para el autocorte y empalme de los intrones del grupo 1 in vitro son un catión monova· lente, un catión bivalente y un nudeótido de guanina. • El corte y empalme ocurren por dos transesterificaciones, sin necesidad de ingreso de energía. • El extremo 3'-0H del cofactor de guanina ataca al extremo 5' del íntrón en la primera transesteriñcac:ión. El extremo 3'-OH generado al final del primer exón ataca la unión entre el intr6n y el segundo exón en la segunda transesterificaci6n. El intrón es liberado como molécula lineal que se convierte en circular cuando su extremo 3'-0H ataca un enlace en una de las dos posiciones internas. El enlace interno G414·A16 del intr6n puede también ser atacado po1 otros nudeótidos en una reacción de corte y empalme en configuración trons.

Los intrones del grupo I forman una estructura secundaria característica Los intrones del grupo 1 forman una esrructura secundaria con nueve regiones dobles. Las porciones medulares de las regiones P3, P4, P6 y P7 tienen actividad catalltica. Las regiones P4 y P7 se forman por apareamiento entre secuencias de consenso conservadas. • Una secuencia adyacente a P7 apa rea sus bases con la secuencia que contiene la G reactiva.

Las ribozimas tienen varias actividades catalíticas • Cambiando el sitio de unión del sustrato de un intrón del grupo I es posible introducir secuencias alternas que mteractúan con la G reactiva. Las reacciones siguen la cinética l'nzimática usual de baja velocidad catalítica. las reacciones que utilizan enlaces 2· -OH podrtan haber sido la base de la evolución de las actividades catalíticas originales del RNA.

Algunos intrones del grupo I codifican endonucleasas que fomentan la movilidad • Los intrones móviles pueden insertarse en n:Jevos sitios. los intrones móviles del grupo 1 codifican una endonuc\E.>a· sa que produce rotura de la doble cadena en un sitio diana. El intrón se transpone al sitio de la rotura de la doole cadena por un mecanismo de replicación mediaoo por ONA.

Los intrones del grupo II pueden codificar proteínas multifu ncionales . • Los intronl's del grupo 1! pueden ser sujetos de autocorte y empalme in vitto, pero suelen ser auxiliados por actividades protelnicas codificadas en el intrón.

706

• Un solo marco de codificación especifica a una proteína con actividad de transcriptasa inversa y madurasa, un segmento de unió11 de ONA y una endonucleasa de DNA_ • la transcriptasa inversa genera una copia de DNA a partir de la secuencia del RNA, que se transpone por ur. mecanismo similar al del retroposón. • La endonucleasa escinde el ONA diana para permitir la inserción del transposón en un nuevo sitio.

Algunos intrones de autocorte y em palme requieren de madurasas . • Los intrones de autocorte y emoalme pueden necesnar actividades de madurasa codificadas en su interior para ayudar al plegamiento en la estructura catalítica activa.

La actividad catalítica de la ribonucleasa P se debe al RNA • La ribonucleasa P es una ribonucleoproteina en la cual ~ RNA tiene actividad catalltica.

Los virioides tienen actividad catalítica • Virioides y virusoides forman una estructura en cabeza ~ martillo con actividad de autoescisión. Se pueden generar estructuras similares para el apareamiento de una cadena de sustrato fragmentada p:.una cadena de enzimas. Cuando una cadena enzimática se introduce en una célw puede aparearse con una cadena sustrato diana, que después es escindida.

La edición de RNAocurre en bases individuales .. Los receptores de apolipoproteína B y glutamato preser.;: desaminaciones especificas de sitio catalizadas por desaminasas de citidina y adenosina, que cambian la secuencia de codificación.

La edición del RNA puede dirigirse por RNA guías · La intensa edición de RNA en mitocondrias de tripanoscse debe a inserciones o deleciones de uridina. • El sustrato de RNA aparea sus cases con un RNA guía eambos lados de la región por editar. • EL RNA guia proporciona el molde para la adición (o. cemenos frecuencia, la deleción) de uridinas. • La edición es catalizada por un complejo de endonuclea;: actividad de transferasa de uridilo terminal y ligasa de F

El corte y empalme de proteínas son autocatalíticos • Una inteina tiene la capacidad de catalizar su propia eliminación de una proteína, de manera que las exteina.; los flancos se conecten. • Corte y empalme de las proteínas se catalizan por la inte< • Casi todas las inteinas tienen dos actividades independientes, corte y empalme de proteínas Yuna endonucleasa que vuelve a casa.

Resumen

Introducción :..a idea de que ~ólo las

proteínas tienen actividad n..zimática estaba profundamente arraigada en la oquímica (jncluso los devotos de la función proínica llegaron a pensar que ¡sólo ellas tenían la e introducen cambios en bases 'ldíviduales o se agregan bases en posiciones espe$Jcas de un RNAm; dicha inserción de bases (muy - menudo moléculas de uridina) ocurre en varios ;enes de las miLOcondrias de cienas eucariotas ineriores; a semejanza del conc y empalme, implica

la rotura y reunión de enlaces entre n ucleótidos, pero también requiere de un molde para codificar la información de la nt.eva secuencia.

Los intrones del grupo I realizan autocorte y empalme por transesterificación (onC•'IllOs

¡lrindpales

• Los únicos factores necesarios para el autocorte y empalme de los intrones del grupo I in vitro son un catión monovalente, un catión bivalente y un nucleótido de guanina . • El corte y empalme ocurren por dos transesterificaciones, sin necesidad de ingreso de energía. • El extremo 3'-0H del cofactor de guanina ataca al extremo 5' del intrón en La primera transesterificación. • El extremo 3'- OH gener:~do al final del primer exón ataca la unión entre el intrón y el segundo exón en la segunda transesterificación. • El intrón es liberado como molécula lineal que se convierte en circular cuando su extremo 3'- OH ataca un enlace en una de las dos posiciones internas. • El enlace interno G414-A16 del intrón puede también ser atacado por otros nucleótidos en una reacción de corte y empalme en configuración trons. Los intrones del grupo 1 se encuentran en dj ver~a~ localizaciones, además de presentarse en genes que codifican el RNAr en los núcleos dt- los eucarioras inferiores TeLrahymena chermop/lila (un ciliado) y Physarum polycephah1111 (un moho de lama). Son comunes en los genes de mítocondrias micóticas, están presentes en tres genes del fago Ttl y también se encuentran en bacterias. Los intrones del g rupo I tienen una capacidad intrínseca de a u t o corte y empalme (propiedad que también poseen los in· trones del grupo rr anñlizados en la sección 26.11 , Los intrones del grupo ll presentan aULocorte y empalme a través de la formación de lazos) . El autoconc y empalme como propiedad de losproductos de transcripción de los genes de RNAr se descubrió en T. thermophila. Los genes de Jos dos principales RNAr siguen la organización usual, en la cual ambos se e~-presan como parte de una unidad de transcripción com(m. El producto es un R.l\fA precursor 35$ con la secuencia del RNAr pequeño en la parte 5' y la del más grande (26$) hacia el extremo 3'. En algunas cepas de T. thermoph1la la secuencia que codifica el RNAr de 26$ se interrumpe por un intrón cono único. Cuando el RNA precursor de 35$ se incuba in vitro, el corte y empalme ocurre

27 2 Los intrones del grupo I realizan autocorte y empalme por transesterificación

707

Exón 1

lntrón Exón 2 ;"\. "JC\. ,'A~ 1 - " '\.1 1:.1'

Transcripción

Corte y empalme

l

.1 -

'""

Electroforesis en gel

ANA de 35S-i

l

--------=--- + Formación de un ciclo

1 + lntrón circular

-~

lntrón lineal - -

En el género Tetrohymena, el corte y empalme del precursor del RNAr de 35S puede seguirse por electroforesis en gel. La eliminación del intrón se revela por la aparición de una banda pequeña de movimiento rápido, y al tornarse circular, se desplaza más lentamente en la electroforesis, como se observa por una banda más alta.

como reacción autónoma. El intrón es escindido del precursor y se acumula como fragmento lineal de 400 bases, que posteriormente se conviene en un RNA circular. En la se resumen esos sucesos.

La reacdón requiere sólo de un catión monovalenre. un catión biva!ente y un cofaccor ltucleocídico de guanina. No se puede sustituir ninguna base con G. pero no es necesario un tl'ifosfaro, pueden utilizarse todos, GTP, GDP, GMP y la guanosi na misma, de manera que no hay un requerimiento neLO de energía. El nucleótido de guanina debe tener un grupo 3'- 0H. La trayectoria del nucleótido de guanina Puede seguirse con una ma rca radioactiva. La radioactividad empieza por penetrar el fragmento lineal escindido del inrrón y la molécula de G se conecta con el extremo 5' del imrón por un enlace fosfodiéster normal. En la se muestra que ocurren tres reacciones de transferencia. En la primera, el nucleótido de guanina se comporta como cofactor que proporciona el grupo libre 3'-OH. que ataca el extremo 5' del inuón. Esta reacción crea el enlace G-intrón y genera un grupo 3'-0H en el extremo del exón. la segunda transferencia implica una reacción química similar, donde ese 3' -OH ataca después al segundo exón. Los dos productos de transferencia se conectan, no se han observado exones libres, de manera que su unión puede ocurrir como parLe de la misma reacción que libera el imrón. El 708

CAPÍTULO 27 RNA catal\tico

intrón se libera corno molécula lineaL pero e tercera reacción de transferencia se conviene circular. Cada etapa de la reacción de autocorte y emp me ocurre por una transestcrificación, en La cua _ éster fosfaw se conviene directamente en otro, hidrólisis intermedia. Los enlaces se intercamb = de manera directa y se conserva la energía, o queJa reacción no requiere de entrada de ene::_ ni hidrólisis de ATP o GTP. Si ninguna de las rer ciones consecutivas de transesterificación imp un cambio neto de energía, ¿por qué la reacC' de cortt:! y empalme avanza hasta tem1in arse ~ se equilibra entre el producto con corre y empa:.;, y el precursor, que no ha sufrido esos cambios::. concentración de GTP es alta en relación con 1a RNA y, por tanto, hace avanzar la reacdón; un cJbio en la estructura secundaria del RNA impid\" reacción inversa. El sistema in vitro no incluye proteínas, den~.­ ra que la capacidad de corre y empalme es int1insec;: RNA Este último forma una estructura secunda terciaria específica en la cual los grupos imp of1~ te se yuxtaponen, de manera que el nucleótidt. guanina puede unirse en el sitio específico y J pués ocurren las reacciones de rotura de enlac reunión que se muestran en la Figura 27 .2. A ... que es una propiedad del RNA mismo, la reacces asistida in vivo por proteínas, que estabilizarestructura del RNA. La capacidad de participar en esas reacdL de transferencia reside en la secuencia del im: que sigue siendo reaClivo después de ser escind como molécula lineal. En la se resu~ • sus actividades. El imró n puede hacerse circu lar cuando la G terminal ataca alguna de las dos posiciol'les cerca-· al extremo 5'; el enlace interno se rompe y em ces el nuevo extremo 5' se transfiere al extrc 3' -OH del intrón. La {onnación primaria de un , suele involucrar una reacción entre la G414 term'.. y la A IG, que es la reacción más frecuente (apa: como tercera transferencia en la Figura 27.2). í menos frecuencia, la G4 1'1 reacciona con U20; ce reacdón genera un imrón circular y un fragmLlineal que representa a la región 5' original (de bases de longitud para atacar A 16 y de 19 para at.:. U20 ). El fragmcmo 5' liberado contiene el nucleó· original de guanina agregado. Cualquiera de los ciclos puede regenerar · molécula lineal in vitro mediante hidrólisis esp. fica del enlace (G 414-A 16 o G414 -U 20) que lo h.: cerrado, fenómeno que se conoce como formac inversa de un ciclo. La molécula lineal generada . reversión de la formación primaria de un ciclo en A

.mtiene activa y puede dar lugar a una formación .:undaria de ciclo por ataque de U 20. El producto final de las reacciones espontáneas 'teriores a liberación del intrón es el RNA L-19, llécula lineal generada por reversión de la forma -.:ular más cona. Dicha molécula tiene una activi.:.J enzimática que le permite catalizar la extensión .. ribonucleótidos conos (no se muestran en la fi:a, pero véase la Fig. 27.8). La reactividad del intrón liberado va más allá ~revertir la reacción de formación de un ciclo; la _idón del oligonucleótido UUU reabre el dclo pri.uio por reacción con el enlace G~ 14 -N 6 • El UUU Je simula e l extremo 3' del 15-mer liberado por wrmación primaria de un ciclo) se convierte en exrremo 5' de la molécula lineaJ formada. Esta es :oa reacción intermolecu lar y, por tan to, demuesJ la capacidad de conectar dos moléculas de RNA

Pnmera transferencia El e)(lremo 3'-0H de G ataca al S' del intrón G-QH 5' 3' pG.OH

ni rOn

s·

Exón A

Yp

=8= 3•

y

. p ==Ex=ó=n

pN¡¡NpNpNpN¡>Np)(¡)XpXpXpXpX

'

t

1.

pNpNpNpNpNpN·OH

l

pGpXp)(¡)XpXpXpX

G-P

·P====

•

Segunda transferencia El e)(lremo 3'-0H del exón A ataca al S' del B

+

~ereme s.

Esta serie de reacciones muestra vívidamente :.>e la actividad autocatalítica refleja la capacidad :-neralizada de la molécula de RNA de formar un otro activo que pueda unirse a cofactores de gua-na, reconocer oligonucleótidos y conjuntar grupos .:activos en una conformación que permita romper \'Oiver a unir los enlaces. Otros intrones del grupo 1 1 han sido investigados con tanto detalle como el del ~nero Tetrahymena, pero en generaL sus propiedades •n similares. La reacción de aurocone y empalme constiru~ una propiedad imrínseca del RNA in vitro, pero nasta qué punto participan las proteínas in vivo? _,s sistemas mitocondriales proporcionan ciertos ;dicios de la participación de las proteínas, en los .Jales. el corte y empalme de los inttones del grupo 1 ¿quieren de los productos que actúan en configu:.actón trans de otros genes. El gen murado cyllB de ·eu.rospora crasa constituye un ejemplo notable de efectos en el co rte y empalme de varios intrones "'litocondria les del grupo l. ¡El producto de ese gen ruece ser la sintetasa de tirosil-RNAt mitocondrial!, 1 cual se explica por el hecho de que el intrón puee adoptar una estructura terciaria similar a la deJ :-.:-.!At estabilizada por la sintetasa y que fomenta la eacción catalítica. Esta relación enrre la sinrerasa y el corte y emalme es compatible con la idea de que este último se riginó como una reacción mediada por RNA. postejorroente auxiliada por proteínas de unión de R.NA ·ue originalmente tcrúan otras funciones. La capad.:ad de autocorle y empalme in vin·o puede ser la inte·acdón bioquímica básica. La estructura del RNA crea 1sitio activo, pero sólo puede funcionar eficazmente i11 vivo cuando lo asiste un complejo proteínico.

G-P

~

.....•...

·01-!

•

Tercera lranslerencia El extremo 3'-0H del intrón ataca el enlace a 15 b ases del extremo

s·

- OH

G·P

p

El autocorte y empalme se debe a reacciones de transesterificación en las cuales hay un intercambio directo de enlaces. Los enlaces generados en cada etapa se indican mediante recuadros sombreados.

Los i ntrones del grupo I forman una estructura secundaria característica Conceptos principales • los intrones del grupo I forman una estructura secundaria con nueve regiones dobles. • Las porciones medulares de las regiones P3, P4, P6 y P7 tienen actividad catalítica. • Las regiones P4 y P7 se forman por apareamiento entre secuencias de consenso conservadas. • Una secuencia adyacente a P7 aparea sus bases con la secuencia que contiene la G reactiva.

Todos los intrones del grupo I pueden organizarse en una estructura secundaria característica de nuese muestra un ve hélices (Pl-P9). En la modelo de la estrucwra secundaria del in{rón del género Tecrahymena. Dos de las regiones de bases aparcadas se generan por apareamiento entre los elemcmos de secuencias conservados que son comunes a los imrones del grupo l. La P4 se estructura

27.3 Los intrones del grupo I forman una estructura secundaria característica

709

El extremo 3'-0H de G4t<~~ ataca a pAtS o pU20 S'G .. UUUpA 16CCUpU20UG

/

Exón 1 r

G·OH

p

5' CUCUCU Primera 5' UGCGGG 3' 3' GGGAGG transferencia 3' ACGCCC 5' IGS O

P5

~

Formación de un ciclo

G4t4pA tscCUpU2ouG

j~

P2

P4

P3

"

Exón 1

P6

P7

Exón2

"" P8

~ pg

S Inversión de la formación de un ciclo

H20

R

Se forma 2 bp en el extremo 3' del intrón

~ Los intrones del grupo I tienen una estructu; cundaria común formada por nueve regiones de pares de F.· Las secuencias de las regiones P4 y P7 se conservan, de que identifican a cada uno de los elementos de secuencíz : R y S. Ent re el extremo del exón izquierdo y la IGS del ill:se crea Pl por apareamiento; la región intermedia entre:pg se aparea con el extremo 3' del intrón.

pA 15CCUpU 20UG

Prcduotos

ANA

5'UAGUC3' 3' AUCAG 5'

l-15

ANA L-19

Reacción en configuración trans G

414

16

20

UUUpA1SCCUpU 20 UG

pA CCUpU UG uuu ~

El intrón escindido puede formar círculos mediante uno de los dos sitios i nternos para la reacción con el extremo 5' y reabri rlos por reacción con agua u oligonucleótidos.

a pa rtir de las secuencias Py Q, y la P7, de R y S. La secuencia de otras regiones de bases apareadas varía en funci ón de los intrones individuales. El análisis de mutaciones identifica un "núcleo" de intrón que conlicne P3, P4, P6 y P7 que constituye la región mínima susceptible de llevar a cabo una reacción catalftica. La longitud de los inrrones del grupo 1 varía ampliamente, de modo que las secuencias de consenso se localizan a distancia considerable respecto de las uniones de corre y empalme reales. Algunas de las reacciones de apareanúemo se re· lacionan directamente con el cambio de las uniones de corte y empalme a una conformadón que sopone la reacción enzimática. La Pl incluye el extremo 3' del exón izquierdo. La secuencia del intrón que se aparea con el exón se denomina IGS, o secuencia guía interna (nombre que refleja el hecho de que originalmente se pensaba que la región 3' imnediata

710

CAPÍTULO 27 RNA catalítico

a la secuencia IGS, mostrada en la figura, se apaba con la unión de cone y empalme 3', uniend los dos enlaces. La interacción es posible, per parece indispensable). Una secuencia muy cona ocasiones de apenas dos bases, entre P7 y P9, apa. sus bases con la secuencia inmediatamente amea la G reactiva (posición 414 en el género Terr.: mena) del extremo 3' de l intrón. Las propiedades de las mutaciones que ac-_ en configuración ds y que impiden el corte y elLmt:: de inrrones del grupo I, destacan la importadel apareamiento de las bases para crear la es;: tura central necesaria del RNA. Dichas mutad han sido aisladas en los intrones mitocondria.ctravés de mutanres que no pueden elimina.r tL..... trón in vivo, y se han aislado para el intrón de. _ nero Tetrahymena por transferencia de la reac.:de corte y empalme a un ambiente bacterian• estructura que se muestra en la pe::seguir la reacción de cone y empalme en E. ce: imrón de autocone y empalme se localiza en _ _ tío que interrumpe el décimo codón de la secu~­ de codificación de la galactOsidasa ~. de modo la proteína puede ser traducida con éxito a par: un RNA sólo después de eliminado el imrón. La síntesis de la galactosidasa ~ en este ~ ma indica que el cone y empalme puede darse condiciones bastante distantes de las prevaleciten el género TeLrahymena o jncluso in vitro, re-

-

..

-~

-

El RNA catalilico tiene un sitio de unión de guanosina y uno de unión de sustrato 3'

~Transcripción ..

1 •

Sitio de unión de guanosina 5' cucucu Sitio de unión de sustrato GGGAGG

UUUACCU 1 Incluye A16 y u2o

• Corte y empalme ' Traducción

La primera transferencia de G-OH ocupa el sitio de unión de G: el exón S' ocupa el sltfo de unión de sustrato 3' 3'

Galactosidasa ~~ Pacas azules generadas por tinción de galactosidasa ~

J

La colocación del intrón de Tetrahymena en la :..~encia de la galactosidasa ~ da lugar a un análisis para ~utocorte y empalme en la Escherichia coli. La síntesis de ..3etosidasa p se analiza por la adición de un compuesto que - : orna azul por acción de la enzima. La secuencia es llevada :3bo por un bacteriófago, de manera que las placas azules contienen bacterias infectadas) indican que el corte y -:~alme fue exitoso.

-=

Jo que podría interpretarse en el sentido de que aurocone y empalme puede ocurrir. en la célula ;.:teriana. Otra posibilidad es que haya proteínas 'cterianas que ayuden a la reacción. Aplicando este análisis se pueden producir mudones en el intrón para ver si impiden la reacción. ..!S mutaciones de las secuencias de consenso del _~upo 1 que alteran el apareamiento de sus bases de~nen el con e y empalme, pero pueden revenirse -ediante cambios compeu satorios que restablezcan cho apa reamiento. Las mutaciones de las secí.tencias de consenso mespondiemes en los imrones miLocondriales del _:upo 1 producen efectos similares. La mutación de :1a secuencia de consenso puede ser revenida por ' de una secuencia de consenso complementaria modo de restablecer el apareamiento; por ejem.o, las mutaciones de la secuencia de consenso R Jeden compensarse mediante mutaciones de la !'cuencia de consenso S. Juntos, esos resulrados sugieren que la reacción e corre y empalme del grupo 1 depende de la for•ación de una estructura secundaria entre pares e secuencias de consenso en el intrón. El prindio establecido en esta obra es que las funciones de :s secuencias distantes del sitio del corte y empalme son .~cesarias para fonnar el sirio accivo que hace posible el utocorte y empalme.

La segunda transferencia de G414 ocurre en el sitio de unión de G; el exón 5' está en el sitio de unión del sustrato

G S'

j

-+

CUCUCU G GGGAGG

G GGGAGG

5'

G

+

CUCUCU -

3'

la tercera transferencia de G414 ocurre en el sitio de unión de G; el extremo 5' del intrón está en el sitio de unión del sustrato G

G

G

~

UUUACCU GGGAGG

GGGAGG

G UUUACCU La escisión del i ntrón del grupo I del RNAr del género Tetrahymena ocurre por reacciones sucesivas entre los ocupantes del sitio de unión de guanosina y el de unión de sustrato. El exón izquierdo es rosado, y el derecho, púrpura.

Las ribozimas tienen varias actividades catallticas Conceptos pñncipates Cambiando el sitio de unión del sustrato de un intrón del grupo 1 es posible introducir secuencias alternas que interactúan con la G reactiva. Las reacciones siguen la cinética enzimática usual de baja velocidad catalítica. • Las reacciones que utilizan enlaces 2' -OH podrían haber sido la base de la evolución de las actividades catalíticas originales del RNA.

2.7.4 las riboz.imas tienen varias actividades catalíticas

711

;

..

Contactos encontrados antes de la unión del sustrato

... .....

3' G-OH

5' pCCCCC -OH 3'

GGGAGG==-5

C5 se aparea C(;" el sitio IGS cerc<: del extremo 5' e-:. ANA

3' G-OH

5' pCCJ CC-OH 3'

GGGAGG-

Contactos encontrados después de la unión del sustrato

t

3' G C-OH

GGGAGG-

la posición de la IGS de la estructura terciaria cambia cuando se forma Pl por la unión del sustrato.

5

5'

712

CAPÍTULO 27 RNA catalítico

Transferencia de Ca 3' -G; liberac.:-de 4

c

3' G t C-OH

5' pC<;:C~O-OH 3'

GGGAGG~ s

La actividad catalítica de los imrones del grupo I fue descubierta por su capacidad de autocone y empalme, pero éstos pueden presentar otras reacciones catalíticas i11 virro; todas estas reacdones se basan en transesterificaciones y se analizan de acuerdo con su relación con la reacción de corte y empalme en sí. La actividad catalítica de un intrón del grupo I es conferida por su capacidad de generar una estructura secundaria y una terciaria en panicular, las cuales dan lu gar a sitios activos equivalentes a los sitios activos de una enzima convencional (pro· teinácea). En la se ilustra la reacción de corte y empa lme de conformidad con dichos sitios (es la misma serie de reacciones mostrada antes, en la Fig. 27 .2). El sitio de unión del sustrato se forma a partir de la hélice PL en la cuaL el extremo 3' del primer intrón aparea sus bases con la IGS en una reacción intermolecular. Las secuencias de P7 forman un sitio de enlace de guanosina que podría ser ocupado por un nuclcótido de guanosina übre o por lamolécula de Gen la posición 414. En la primera reacción de transferencia es utilizado por el nucleótido de guanosina libre, pero posteriormente lo ocupa G414 • Mediante la segunda transferencia se liberan los exones unidos, en tamo que la rercera crea el intrón circular. La unión con el sustrato implica un cambio de conformación; antes. el extremo 5' de IGS está cerca de P2 y P8, y después, cuando se fo rma la hélice P 1, se acerca a bases conservadas que yacen

G-OH ataca el enlace CpC

t

3'G·OH

Se une otro C5 ; .E. reacción de transferencia se invierte

Se libera C 6 con generación de ANA l-19

: , •... . GGGAGG-=5 El RNA lineal L-19 puede unirse a Cen el s'7" unión de sustrato; el extremo G-OH 3' reactivo está loca . .: en el sitio de unión Gy cataliza reacciones de transferenr.: · convierten dos oligonucleótidos C5 en un C, y un C6• entre P4 y PS, reacción representada en la por contactos que se detectan en la estrucsecundaria. En la estrucLUra terciaria, los dos 5 comactados alternativamente por Pl tienen:;entre sí, lo cual implica un movimiento susta· en la posición de P l. El RNA L· 19 se genera por la apertura de. trón circular (mostrado en la última etapa dz reestructuraciones intramoleculares incluidas ::: Fig. 27.3); aún conserva capacidades enzima· que simulan las implicadas en la reacción ori~ de corte y empalme. La función de la ribozimade ser analizada en cuanto a su capacidad de ucon una secuencia intramolccular complemer.:.: de IGS en el sitio de unión de susuaw, en tarenlaza con el G414 terminal o un nucleótido G en el sitio de unión de G. En la se ilustra el mecanism el cual el oligonucleótido es se extiende has~

i!t!JC•-'h:flt-.iF}[!!j)Lü!l'ii Endorribonucleasa especifica de secuencia

KM

Recambio (/mtnuto)

3'

Enzima

Sustrato

(mM)

.··...

Virusolde de 19 bases lntrón L-19 RNA de ribonucleasa P Ri bonucleasa P completa Rlbonucleasa T1 Galactos1dasa p

ANA de 24 bases cccccc pre-RNAt pre-RNAt

0.0006

0.5

0.04 0.00003 0.00003

1.7 0.4 29

GpA lactosa

0.05 4.0

5 700 12500

l

G-OH

5 ' - cu!o.=3' GGGAGG 5'

__.. 5'=CUCU-OH +

l

5'G =3' Ugasa de ANA

3'

\.

....

Gp

5'=-Y-ÓH ~xxxx 5'

--..

S'=Y

,3'

+ G

Las reacciones catalizadas por RNA tienen las mismas características que las catalizadas por proteínas, aunque su velocidad es menor. la K,., señala la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, que es una medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato. El número de recambio aporta la cifra de moléculas de sustrato transformadas por un solo sitio catalíticc en la unidad de tiempo.

Fosfatasa

.

.!-oH

'Y.

5' UCUp 3' GGGAGG 5'

--..

S'UCU·OH 3'

\

Las reacciones catalíticas de la ribozima impli transesterificaciones entre un grupo del sitio de unión del .strato y otro del sitio de unión de G.

.3'1

ar una cadena C6 al adosarse al sitio de unión del Jsrraro, en tanto G ~ ocupa el sitio de unión de G. r reacciones de transesterificación, se transfieren C de C~ a la G 3' terminal, y después, de regrea una nueva molécula de Cs. Las reacciones de ·ansferencia adicionales llevan a la acumulación .x oligonucleótidos de citosina más prolongados, :acción q ue constituye una catálisis reaL pues el _\¡A L-19 se mantiene sin cambios y está disponible ~ra catalizar a varios sitios. La ribozima se compor.:: como transferasa de nucleótidos. En la se definen otras reacciones -:zímáticas. La ribozima puede comportarse como 'ldorribonucleasa espeófica de secuencia aprove1ando la capaddad de IGS para unir secuencias •mplememarias. En este ejemplo une un sustrato ·remo que contiene la secuencia CUCU y no la ccue ncia aná loga contenida generalmente en el ·.tremo del exón izquierdo. En el sitio de unión G Jy un nucleótido que contiene guanina y que ata: a la secuencia CUCU precisamente de la misma :maque el exón suele ser atacado en la primera ..acción de t ransferencia, de modo que csdnde la .cuencia diana en una molécula 5', y que simu- el exón izquierdo, y una molécula 3' que porta 41

una G terminal. La especificidad de la ribozima puede modificarse por mmación del elemento IGS, dé manera que reconozca secuencias complementaria~ de la nueva secuencia :le la región IGS. La modificación de IGS puede usarse para cam· biar la especificidad del sitio de unión de sustrato y permitir que otras dianas de RNA ingresen, de modo d e generar una actividad de Jigasa. Un H.NA que termina en un 3'-0H se une al sitio sustrato y otro. terminado en la molécula 5'- G, se acopla al sitio de unión G. Un ataque por el hidroxilo en el enlace fosfato conecta l3.s dos moléculas de RNA con pérdida de una molécula de G. La reacción de fosfarasa no tiene relación directa con la~ reacciones de transferencia de corte y empalme. Una secuencia oligonuclcotídica complementaria de IGS. termi nada en un 3' fosfalo, puede se r atacada por G'114, que se a<.ljudica el fosfato; a continuación se Libera un oligonudeólido con un extremo 3'-0H. El {osfato puede entonces transferirse a un oligonucleótido que termina en 3'-0H (revirtiendo eficazmente la reacción) o, de hecho, a agua (con liberaáón de fosfato inorgánico y conclusión de una reacción auténtica de fosfatasa). Las reacciones caralizadas por el RNA pueden ser descritas en la misma forma que las reacciones cnzimáticas usuales según la cin ética de MichaelisMcntcn. En la se analizan las reaccion es caralizadas por el RNA. Los valores de KM para dichas reacciones son bajos, de modo que im plican que el RNA se una con su sustrato con alta especificidad. El número de recambio es bajo, lo cual refleja baja velocidad catalítica. De hecho, las moléculas de ~~A se comportan en la misma forma general definida para las enzimas, c1unqu e son relativamente 27.4 Las ribozimas tienen varias actividades catalíticas

71 3

9

·o-r-o-cH2

ÓH~ OH

OH

[

t.I:G

OH

G

NH2

e

A

GU

Ge

La unión de glucosamlna 6 fosfato provoca el autocorte y empalme del ANA G

GO A u

UU AA A

e cG

"

GA

OG

~8

AU Región

A U

A U

~~

!

eG

Cu

G

t1

U

G CG

lJ A e G medular de {')GC u

A

oAA

l.i, A C,G

U U~

UA A ~O

e

AU laribozima G

s1GG.UCJ:f..,N,ss~Aljg .. CGCCc& UGACGA.G.G--¡¡; ¡fo

Q¡

A

Au GcG U

cP GI\A

't; GUAAG

Codon • de 1n1c1o ' ' "

,

ACAUaAUCUIJ ..Nss-..AUG ....3

GO

gg UA

AQ.eA

~

G.

~A

U€:()AG

En la región 5' no traducida del RNAm hay una ribozima que codifica la enzima productora de la glucosamina-6-fosfato. Cuando Glc-6-P se une a la ribozima, escinde el extremo 5' del RNAm, lo desactiva, e impide que siga produciendo la enzima.

lentas respecto de los catalizadores proteínicos (en los cuales las cifras de recambio norma les van de 10 3 a 106 ) . Con el descubrimiento de que las ribozimas pued en ser reguladas por ligandos, se ha logrado ampliar de manera importante sus actividades (véase la sección 13.7, Las moléculas de RNA pequeñas pueden regular la naducdón). En la se resume la regulación de un ribointerruptor . El metabolito pequeño GlcN6P se une a una ribozima y la activa para escindir el RNA en una reacción iolramolecu lar con el fin de regular la producción de G 1cN6P; la ribozima se localiza en la región 5' no traducida del RNAm , que codifica la enzjma involucrada en la producción de Gl cN6P, y la escisión impide la traducción. ¿Cómo proporciona el RNA un centro catalítico? Esta capacidad parece razonable si se piensa en un centro activo en cuya superficie se c:>..'}lone una serie de grupos activos en una relación fija. En una proteín a, los grupos activos son proporcionados por las cadenas latera les de los aminoácidos. notablemente variadas, que incluyen grupos iónicos positivos y negativos, así como hidrófobos. En un RNA. las moléculas disponibles están más restringidas, constituidas sobre todo por los grupos expuestos de las bases nitrogenadas. La conformación secundaria/terciaria de la molécula, que pro714

ú\PÍTULO 27 RNA catalitico

porciona una superficie de grupos activos cap-2 de man Lener un ambiente en el que se rompe;¡ laces que se forman en otra molécula, da luga;: conservación de regiones cortas en una estrucespecífica. Parece inevitable que la interacción ~ el RNA caLalítico y el susLra to de RNA dependa del apareamiento de bases para crear el amb1t:-Los cationes divalenLes (por lo general Mg2- · importantes en la estructura, y su elen estar pre tes en el sitio activo. donde coordinan las posid de los diversos grupos; participan de manera dL--... en la actividad endonucleolítica de la ribozima. virusoides (véase sección 27 .9, Los virioides tieactividad catalítica). Las implicaciones evolutivas de esos descu. miemos son intrigantes . La capacidad de (rag!Y. ración del aparato genético, en el cual hay RN.-:. todos los componentes, pero las proteínas re~­ reacciones cata lfticas. siempre ha sido un enirParece poco probable que los primerísimos siste:de replicación tuvieran tanto ácidos nudeicos C' proteínas. Supóngase, entonces, que los primeros sisre-contenían sólo un ácido nucleico con replicac propia y actividades catalíticas primitivas, j t· mente las necesarias para formar y romper en~? fosfodiéster. Si se supone que la participación de enlaces 2'-0H en las xeacciones de escisión acw:

~ro viene

de esas actividades catalíticas primitivas, e podría argumentar que el ácido nucleico origina l :-:-a RNA. porque el DNA carece del grupo 2~-0H . por tanto, no podría dar lugar a tales reaccio'es. Las proteínas podrían haberse agregado por !.1 capacidad para estabilizar la estructura del RNA. _a mayor versatilidad de las p roteínas. que pudo :oberles permitido presentar reacciones catalíticas, ondujo en un momento dado al complejo aparato :.e la expresión génica moderna.

Exón

,.

lntrón

Sitio diana

Exón

.

•....•.... •.••....•

ANA

La endonucleasa

Algunos i ntrones del grupo I codifican endon ucleasas que fo mentan la movilidad Ccn•.~ptos

escinde el sitio diana

l

El intrón se replica y : después se inser;a

principales

• Los intrones móviles pueden insertarse en nuevos sitios. • Los intrones móviles del grupo I codifican una endonucleasa que produce rotura de la doble cadena en un sitio diana. • El intrón se transpone al sitio de la rotura de la doble cadena por un mecanismo de replicación mediado por DNA.

:íertos imrones de los grupos 1 y Il contienen mar.:us de lectura abiertos que se traducen en proteínas. _a expresión de las proteínas permite al intrón ser :6vil (ya sea en su forma original de DNA o como :opia DNA del RNA). e insertarse en un nuevo sirio ~enómico. Los intrones de los grupos T y Ir están -my dispersos, se encuentran tanto en procariotas :amo en eucariotas. Los del grupo l migra n por me:anismos mediados por DNA. en tanto que los del ;:upo TI hacen lo p ropio por mecanismos mectiados or el RNA. La movilidad del ihtrón rue detecta da por pri'1era vez por cruces, en los cua les los alelas del gen n portante difieren en cuamo a su posición en el 'ltrón . Los pol.imorfismos de la presenda o ausencia e intrones son comunes en mitocondrias micótl.:..as, lo cual es compatible con el punto de vista de ~e esos intrones se originaron por inserción en el .:en. Un análisis de recombinación en cruces que ::1plican un gran gen de RNAr de la mitocondria _e levadura arroja un poco de luz en el proceso -nplicado. Este gen tiene un intrón del grupo 1 con una se• .lencia de codificadón, el cual está presente en alguas cepas de levaduras (llamadas w'). pero ausente n otras (w-). Las cruzas genéticas entre organismos r y w- son polares, su progenie suele ser w•. Si se piensa en la cepa w como donadora y la ,-como receptora, se llega a la idea de que en las

.... ... .. ........ ..... ... Un intrón codifica una endonucleasa que provoca una rotura de doble cadena en el DNA. La secuencia del intrón se duplica y después se inserta en el sitio de rotura.

cruzas w• con w- se genera una nueva copia del intrón en el genoma w , de modo que la progenie es totalmente w•. Para abolir la polaridad pueden ocurrir mura dones en cualquier progenitor, y los murantes muestran segregación normal con, un número equivalente w' y ro- en la progenie. Estas mutaciones indican la naruraleza del proceso. Las mmacione~ en la cepa CJr ocu rren cerca del sitio en que se insenaría el intrón, en tanto que las de la cepa w·. yacen en el marco de lectura del intrón e impiden la producción de la proteína . Esto sugiere el modelo de la , donde la proteína codificada por el intrón en una cepa co+ reconoce el sitio donde debería insertarse el intrón en una cepa ro-. y hace que se herede de ma nera preferencia l. ¿Cómo actúu la proteína? El producto del intrón w es una endonudeasa que reconoce al gen w- como diana para una rorura de doble cadena. La endonu deasa reconoce una secuenda diana de 18 bp que contiene el sitio en que se inserta el intrón, de modo que ésta se escinde en cada cadena del DNA, a una distanda de dos bases del extremo 3' del sitio de inserdón. Así, los sitios de e~cisión están separados por 4 bp y generan cadenas únicas que sobresalen . Este tipo de escisión se relaciona con la ca racterística de los transposones cuando migran a nuevos sitios (véase Cap. 21, Transposones). La rotura de la doble cadena probablemente inicie un proceso de conversión génica. en la cual la secuencia del gen w• se copia para SU)tituir a la del gen w-. La reacción implica transposición por un mecanlsmo de duplicación, y tiene lugar sólo en el ámbito del

Z1 .5 Alguhos intrones del grupo I codifica n endonucleasas que fomentan la movilidad

715

DNA. La inserción del intrón interrumpe la secuen-

cia reconocida por la endonucleasa, de modo que se garantiza la estabilidad. Muchos il1trones del grupo I codifican endonu cleasas que les confieren movilidad. Hay varias familias de endonucleasas cuya característica común es la secuencia de aminoácidos LAGLIDADG, cerca del sitio activo. Los intrones simila res suelen portar endonucleasas bastante diferentes en cuanto a los detalles de la inserción; por ejemplo, la endonucleasa codificada por el intrón tb del fago T4 escinde un sitio diana situado a 24 bp en flujo ascendente respecto del sitio en que se inserta el intrón mismo. La disociación entre las secuencias del intrón y la endonucleasa destaca por el hecho de que las mismas secuencias de endonudeasas se encuentran en las il1teínas (secuencias que codifican para protemas de autocone y empalme; véase la secdón 27 .12, El corre y empalme de las proteínas es aurocatalítico). La variación en las endonucleasas significa que no hay homología entre las secuencias de los sitfos diana, que son de los más largos y, por tanto, de los más específLcos que se conocen para ntalquier

Exón

lntrón

Exón

...~~".J"'J~""-.

l

e:;:,¡ Endonucleasa/ transcriptasa inversa

-

DNAc sintetizado-

-¡ l

E . 1

' 1ntton del RNA es el molde

... ?~~)0~

~(j'i

!

,"IV~-i"VJ'EI DNA sustituye al RNA

~-!

. TI\YW\J',J\. El intrón se recombina La transcriptasa inversa codificada pot un inttón permite insertar una copia del RNA como sitio diana generado por una rotura dicatenaria. 716

CAPÍTULO 27 RNA catalítico

endonucleasa (con un rango de 14 a 40 bp). La pecificidad garantiza que el intrón se perpetúe s por inserción en un sirio diana único, y no en punto del genoma, lo que se llama a loj amier. del intrón. Los intrones que portan secuencias que r difican endonucleasas se encue n tran en dive bacterias y eucariotas inferiores. Estos resul'a refuerzan el punto de vista de que los imrones portan secuencias de codificación surgieron e elementos independientes.

1JD Los intrones del grupo II pueden codificar proteínas mu ltifuncionales Conceptos principales • Los intrones del grupo U pueden ser sujetos de autocorte y empalme in vitro, pero suelen ser auxiliados por actividades proteínicas codificadas e- intrón. • Un sólo marco de codificación especifica a una proteína con actividad de transcriptasa inversa y madurasa, un segmento de unión de DNA y una endonucleasa de DNA. • La transcriptasa inversa genera una copia de DNA
Los intrones móviles del grupo II mejor carac zados codifican una sola proteína en una regiéPintrón más allá de su centro catalítico. La pro .~ típica contiene actividad de transcriptasa in ~ terminal N, que es un dominio cenn-al vinn _ con actividad auxiliar de plegamiento del ir·· en su estructura activa (se llama madurasa; se la sección 27. 7, Algunos imrones de auto_ y empalme requieren de madurasas), un d01::. de unión al DNA y un dominio de endon.uc terminal C. La endonudeasa inida la reacción de Liar sición y tiene la misma participación en el re: a casa que su contraparte en un intrón del grl.. La transcriptasa inversa genera una copia de D. partir del intrón insertado en el sirio de alojamfc La endonucleasa también escinde sitios diana ·· cid os al sitio de alojamiento, pero no idénticos mucho menos frecuencia, lo cual lleva a la inse~ del imrón en nuevas localizaciones. En la se ilustra la reacción de ;:-: posición de un intrón del grupo U tfpico. La e nucleasa efectúa una rotura de la doble cade~

~: sitio diana; para su actividad, requiere tamo del .ominio de la proteína como del RNA del imrón. =.! dominio de la proteína escinde la cadena no co:ficadora del DNA, y el imrón del RNA en realidad :sdnde la cadena en sentido normal: mediante esta eacción, el intrón se insena direc1amente en un irio diana del DNA. El imrón del RNA proporciona un molde para la ntesis de DNAc. Casi todos los intrones del grupo TI _enen actividad de rranscriptasa inversa específica de 1trón, la cual genera tma copia del in trón del DNA resulta en la inserción del intrón en un sitio diana, omo DNA de doble cadena. El mecanismo simula .a transposición de retrovirus, en la cual el RNA es n imermediario obligawrio (véase la sección 22.2, :1 ciclo vital de los retrovirus implica sucesos ~irn.i.3res a la transposición). El tipo de retrotra nspo~i­ ..;ón implicado en este caso simula el de un grupo e relroposoncs que carecen de LTR y generan el xtremo 3' -O.H, necesario para la cebación, haciendo na hendidura en la diana (véase la Fig. 22.20 de la .:cción 22.12, Las UNES utilizan una endonucleasa ara generar un extremo de cebación) .

Algunos intrones de autocorte y empalme requieren de madurasas Concepto principal • Los intrones de autocorte y empalme pueden necesitar actividades de madurasa codificadas en su interior para ayudar al plegamiento en la estructura catalítica

activa. .... unque los intrones de los grupos 1 y II tienen la .3pacidad de auwcorte y empalme in vitra, en con..iciones fi siológicas suel en necesi tar la ayuda de zoteínas. Ambos tipos de intrón pueden codifica r Ktividades de madurasa, las cuales se requ ieren 11ra ayudar a la reacción de corte y empalme. La actividad de madurasa es parte del marco .e lectura abierto único, codificado por el imrón . el ejemplo de los imrones que codifican endoucleasas de alojamiento, el producto proteínico nico tiene actividad tamo de endonudeasa como e madurasa. El análisis de las mutaciones muesua ue ambas actividades son independientes. El análisis esrruclltral muestra que las activida~s de endonucleasa y madurasa son proporciona-as por diferentes sitios activos de la proteína. cada no codiftcado por un dominio independiente. El jo de endonucleasa se une con el DNA, a dife_ncia del de madurasa, que hace Jo propio con el .trón del RNA. En la se muestra la es-

tructura de una de esas proteínas unida al DNA. Un rasgo característico de la endonucleasa es la presencia de hélices a paralelas que contienen secuencias LAGUDADG, marcas de referencia que conducen a los dos aminoácidos catalíticos. La actividad de madurasa está localizada a cierta distancia, en la superficie de la proteína. Los intrones que codifican madurasas tal vez no sean susceptibles de autocorte y empalme eficaz sin acrividad proteínica. De hecho, la madurasa es un factor de corte y empalme específicamente necesario para el de la secuencia que la codifica, dado que facilita el plegamiemo del centro catalítico con el fin de formar un sitio activo . La coexistencia de actividades de endonucleasa y madurasa en la misma proteína sugiere una vía para la evolución del intrón. En la se sugiere que el intrón se originó en un elemento independiente de autocone y empalme, al cual la inserci ón de una secuencia de codificación de una endonucleasa le dio movilidad. No obstante, dicha inserción podría haber alterado la capaddad de la secuencia del RNA para plegarse en la estructura activa, lo que presionaría para que ciertas proteínas ayudaran a restablecer la actividad de plegamiento. La incorporación de una secuencia de ese tipo en el imrón mantendría su independencia. Algunos intrenes del grupo n que no codifican actividades de madurasa pueden tener proteínas comparables, codificadas por secuencias del genoma del hospedador, lo cual sugiere una posible vfa para la evolución de factores de corte y empalme generales. El factor podría haberse originado como madurasa que facilitara específicamente el corte y empalme de un intrón en panicular. La secuencia de codificación se aisló

=:l

Hélices de endonucteasas

Sillos activos de aminoácidos

...... Sitio activo de la madurase~

Un intrón de alojamiento codifica a una endonudeasa de la familia LAGLIDADG que también tiene actividad de madurasa. Las secuencias LAGLIDADG son parte de las dos hélices o: que terminan en los aminoácidos catalíticos, cerca del DNA dicatenario. El sitio activo de la madurasa se identifica mediante una molécula de arginina en otra parte de la superficie de la proteína.

Zl.' Algunos intrones de autocorte y empalme requieren de madurasas

717

..... lntrón

!

Endonucleasa

El intrón transporta la endonucleasa

El gen de madurasa se Inserta en el intrón

El intrón porta la endonucleasa y la madurasa

El intrón se originó como una secuencia de codificación independiente para un RNA de autocorte y empalme. La inserción de la secuencia de endonucleasa creó un intrón móvil de alojamiento. La inserción de la secuencia de madurasa incrementó entonces la capacidad de las secuencias del intrón para plegarse en la estructura activa para corte y empalme.

del intrón en el genoma del hospedador y entonces evolucionó para actuar en una gama de sustratos más amplia que la secuencia del intrón original. El gen catalítico del intrón podría haber evolucionado hacia un RNAsn.

1J11 La actividad catalítica de la ri bonucleasa P se debe al RNA Concepto principal • la ribonudeasa P es una ribonucleoproteína en la cual el RNA tiene actividad catalítica.

Una de las primeras demostraciones de las capacidades del RNA provino de la disección de la ribonucleasa P. endonucleasa de procesamiento del RNAt de E. coli, que puede ser disociada en sus dos componentes, el RNA de 375 bases y el polipéptído de 20 kD. En las condiciones originalmente utiliza718

CAPÍTULO 27 RNA catalítico

das para caracterizar la actividad de las enzima vitro, ambos componentes fueron necesarios ; escindir el sustrato RNAL Sin embargo, un cambio en las condicione-: nicas (aumento de la concentración de Mg 2·) r. que el componente proteínico sea superfluo,¡el RNA sólo puede cata/izar la reacción! Analizand resultados como si el RNA fuese una enzima, (."' uenzima"' cataliza la escisión de múltiples sustra y si bien la actividad catalítica reside en el RK-. componente proteínico aumenta mucho la ve. dad de la reacción, como se observa en el increrrto del número de recambio (véase la Fig. 27.1 L Las mutaciones del gen del RNA o de la pr na suelen desactivar a la ribonucleasa P in viv: modo que se ha llegado a saber que ambos corr: nentes son necesarios para la actividad natura_ la enzima. La hipótesis original fue que la pr• na proporcionaba la actividad catalitica, en tz el RNA tenía alguna participación accesoria. ejemplo, facilitar el plegamiento del sustrato r:_ algunas secuencias cortas complementarias dt regiones expuestas del RNAt), ¡pero esas fund se revierten!

E11J Los virioides tienen actividac catalítica Conceptos principales • Virioides y virusoides forman una estructura en cabe== de martillo con actividad de autoescisión. • Se pueden generar estructuras similares para el apareamiento de una cadena de sustrato fragmentac por una cadena de enzimas. • Cuando una cadena enzimática se introduce en una célula. puede aparearse con una cadena sustrato dia-: que después es escindida.

Otro ejemplo de la capacidad del RNA para ac como endonucleasa proviene de RNA (-350 ba de plantas pequeñas que presentan una reacc de escisión propia . No obstante, como en el .::: del intrón del grupo I del género Tetrahymena . diante ingeniería es posible obtener estru<.:turas incidan en sustratos externos. Estos RNA de plantas pequeñas fo rman r~­ de dos grupos generales, virioides y virusoides.:.. virioides son moléculas de RNA infecciosas actúan de manera independiente, sin ser enea~ lados por alguna cubierta proteínica, a diferede los v irusoides, similares en cuanto a organ ción, pero son encapsulados por virus de pJan:...; empacados con un genoma vírico. Los virus~.;;_ no pueden replicarse de manera independiente

4uieren de la asistencia del virus; en ocasiones se les jenomina RNA satélite. Virioides y virusoides se replican a través de círculos giratorios (véase la Fig. 16.6). La cadena de RNA empaquetado en el virus se denomina cadena ;¡ositiva, y la complementaria, generada durante la :eplicación del RNA, se llama cadena negativa. Se encuentran multímeros tanto de cadenas positivas como de negalivas. Ambos ripos de monómem se .::eneran por escisión de la cola de un círculo giracrío; los monómeros circulares de cadena positiva 'e generan por ligadura de los exlremos del menómero lineal. Ambas cadenas de virioides y virusoídes, pocjtiva y negativa, presentan a urocorte y empa lme '1

Las cabezas de martillo de consenso llenen tres asas de tallo y bases conservadas Tallo 3 3' 5' Escisión CG AU / GNCGAA NNNNNN CNGA cNNNN N Tallo 2

G N AG

que genera extremos 5'-0H y 2'-3' fos : >diéster cfclico. Algunos de los RNA se escinden ··¡ vitro en condiciones fisio lógicas, otros hacen lo <\ropio sólo despu és de un ciclo de ca lentamiento enfriamiento, lo cual sugiere que el RNA aislado .iene una conformación inapropiada, pero puede $enerar una conformación activa cuando se desna•urali7.a y renaturaliza. Los virioides y los virusoides que presentan es...:sión propia, forman una estructura secundaria #en '"!lartilllo'' en el sitio de escisión, como se muestra . n la pane superior de la . La secuencia Je dicha estructura es suficiente para la e!>cisión. ::uando las secuencias circundantes presentan deedóo, se obvia la necesidad de un ciclo de calentaniento-enfriamiento y el RNA pequeño se corta y empalma espontáneamente a sí mismo, fenómeno ~ue sugiere que las secuencias más allá del martillo uelen interferir con su formación. El sitio activo es u11a secuencia de sólo 58 nuJeótidos. La cabeza del martillo contiene tres regiones de tallo-asa, cuya posición y tamaño son cons•antes, y 13 nucleótidos conservados, casi todos en ·egiones que se conecta n con el centro de la estrucura. Las bases y los ta llos dobles conservados gene~an un RNA con capacidad intrínseca de escisión. También puede generarse un martillo activo nor apareamicmo de un RNA que representará un ado de la estructura y otro que representará al otro. :=n la parte inferior de la Figura 27.16 se muestra un jemplo de un martillo generado por hibridación de _na molécula de 19 bases con una de 24. El híbrido ·mula la estructura del martillo, con omisión de las Jsas T y m. Cuando se agrega el Rl~A de 19 bases .l RNA de 24, se produce la escisión en la posición ·propiada del manülo. Se puede considerar que la cadena superior (24 :~ses) de ese híbrido incluye el "su!>tratON, y la in~rior (19 bases), la "cn1.ima". Cuando se mezcla el "'~A de J 9 bases con un exceden te del RNA de 24,

Tallo l

Sitio catalrtico Por interacción entre dos moléculas de RNA complementarlas se pueden crear cabezas de manillo

vitro, reaccíón fomentada por caliones metálicos

~iva lentes,

u\

Cadena sustrato

Ce G

ESCISI · "ón

'd(J / AA, u \ PPPGQG C C QA C U Q.G A G HO C G C G GA

l

C)OH

CA G C U C G Gppp

Gu Gu

Cadena enzimática A

Los sitios de autocorte y empalme de virioides y virusoides tienen una secuencia de consenso y forman una

estructura secundaria en cabeza de martillo, la cual también puede generarse por apareamiento entre una cadena de sustrato y una de "enzima".

se escinden copias múlriples de este (¡)timo, Jo cual sugiere que hay un deJo de apareamiento de 19 y 24 bases, escisión, disociación de los fragmeows eliminados del RNA de 19 bases y apareamiento de este último con el nuevo sustrato de 24 bases. El RNA de 19 bases es, por tanto, una ribozima con actividad de cndonucleasa. Los parámetros de la reacción son similares a los de otras catalizadas por el RNA (véase Fig.la 27.10). La estructura crista lina de una cabeza de martillo mue$tra que forma una estructura en V compacta, donde a su vez yace el centro catalítico, según se ilustra esquemáticamente en la . La participación de un ion Mg 2" localizado en el sitio catalítico es crucial en la rracción: lo ubica la dtidina diana y la citidina de la base del rallo 1; también puede estar conectado con la uridina adyacente . Extrae un protón del extremo 2'-OH de la citidioa diana y después ataca directamente el lábil enlace fosfodiéster. Las mulaciones en la secuencia de cabeza de martillo que afeelan el estado de transición de la reacción de escisión ocurren tanto en el sitio activo como en otras localizaciones, lo cual sugiere que puede haber cambios estructurales sustanciales antes de la escisión. Es posible diseñar combinacion es enzima-sustrato que formen estructuras en cabeza de martillo, 27.9 Los virioides tienen actividad catalítica

719

5' 3' ge

Tallo2

§8 2

e 3' 5' A G

e u

~ ~ _AeGG Tallo 1 A e u

¿ ~GUe Tallo3g ~

G

A

U A

e A

Mg

G

e u

Sillo catalltlco

Una ribozima en cabeza de martillo da lugar a una estructura terciaria con fo rma de V, en la cual, el tallo 2 se inserta sobre el 3; entre los tallos 2, 3 y 1 yace el centro catalítico que contiene un ion magnesio que inicia la reacción hidro lítica.

que se hayan sido usadas para demosrrar que la introducción de las moléculas apropiadas de R.t'{A en una célula permite que la reacción enzimática ocurra in vivo. Una ribo1ima diseñada en esa forma, properdona esencialmente una actividad similar a la de restricción, altamente especínca, dirigida contra un RNA diana. Al poner la ribozima bajo el control de un promotor regulado. se puede usar en la misma forma que las cadenas no codificames (por ejemplo), específicamente para eliminar la expresión de un gen diana en circunstancias definidas.

(exones) del DNA deben ser reconectadas e.¡;: RNA, proceso que sigue siendo de transferencic información. en el cual la secuencia de codificac real del DNA se mantiene sin cambios. Los cambios en la información codificada p ONA ocurren en circunstancias excepcionales. bre todo en la generación de nuevas secuencias codifican inmunoglobulinas en mamíferos y a· Dichos cambios tienen lugar específicamente el' células somáticas (linfocitos B), donde se sinte\L... las irununoglobulinas (véase Cap. 23, Diversidad munüaria). Dura me el proceso de reconstrucc de un gen de inmunoglobulin a, en el DNA de inclividuo se genera nueva infonnación, y la in. mación codifi cada en el DNA es cambiada por mutación somática. La información del DNA sL siendo transcrita fielmente en el RNA. La edición del RNA es un proceso en que la formación cambia en el ámbito del RNAm; es reve .: por circunstancias en que la secuencia de codi:_ ción de un RNA dit1ere de la del DNA a partir cual fue transcrito. La edición del RNA ocurre dos circunstancias diferemes, cada una por d.ife~ tes causas. En células de mamífero se dan caso< sustitución de una base individual del RNAm · produce un cambio en la secuencia de la prme codificada. En las mitocondrias de tripanoso.Los cambios son más extensos en los productc · transcripción de varios genes, en cuyo caso se a,._~ gan o eliminan bases sistemáticamente.

1=1 gen de

ap~llpoprotelna

8 tiene 29 ex~mes

La edición de RNA ocurre en bases individuales Concepto priucipal • Los receptores de apolipoproteína B y glutamato presentan desaminaciones especificas de sitio catalizadas por desaminasas de citidina y adenosina, que cambian la secuencia de codificación.

Un axioma primordial de la biología molecular es que la secuencia de un RNAm sólo puede representar Jo que está codificado en el DNA. El dogma central contemplaba una relación lineal en la cual una secuencia continua de DNA se transcribía en una de RNAm, que a su vez, se traducía directamente en una proteína . La presencia de genes interrumpidos y la eliminación de intrones por corre y empalme del RNA introduce un paso adicional en eJ proceso de expresión génica, las secuencias de codificación 720

CAPÍTULO 27 RNA catalítico

CAA El codón 2153 codifica la glutamina

CAA

~n _____ UAA

El RNAm escindido y empalmado en el hígado codifica para una proteína ~ 4563 aminoácidos

El RNAm intestinal tiene un codón UAA que termina la síntesis en el aminoácido 2155

La secuencia del gen de la apo-B es la r : ~ en el intestino y el hlgado, pero la del RNAm se modific.= un cambio de base que crea un codón de terminaciór :intestino.

En la se resumen las secuencias del de la apolipoproteína B y el RNAm en el imes _oo y ellúgado de los manúferos. El gen oma tiene n solo gen (interrumpido), cuya secuencia es idén~-a en todos lo!> tejidos, con una región de codifica:i.ón de 4 563 codones. Este gen se transcribe en un =t.'I1Am, el cual se traduce en una proteína de 518 k.D, ue representa la seruenda completa de coclificadón :n e l hígado. Una forma más corta de la proteína de -2 50 kD ..e sintetiza en el intestino, la cual consta de la mitad ::rminal N de la proteína completa y se rraduce a ~rtir de u n RNAm cuya secuencia es idéntica a la ~epá tica, excepción hecha de un cambio de C por U :n el codón 2 153. Dicha sustitución pasa e l codón : AA para g lumrnina hacia e l codón ocre UAA para e rminación. ¿A qué se debe esta sustitución? No hay un gen exón a lterno en el genoma para codificar la nueva ecuencia, y no se ha descubierto ningú n cambio en ~~ patrón de corte y empalme. La conclusión obli ~ada es que ha habido un cambio directamente en a secuencia del transcri to. Otro ejemplo son los receptores de glu tamato del :erebro de rata. La edición en una posición cambia ..m codón de gluramina del DNA por un codón de ar:inina del RNA, cambio que afecta la conductividad ~el conductO y, por tanto. tiene un efecto importante -:o el control del flujo iónico a través del neurotrans;;üsor . En o tra posición del receptor, un codón de :rginina se conviene en un codón de lisina. El suceso de edición en la apo-B hace que C2153 ;e cambie por U; ambos cambios en el receptor de ..lutamato son de A a I (inosina). Estos sucesos son 't?saminaciones en las cuales se elimina el grupo a mi10 del anillo nuclcotídico, sucesos catalizados por :azimas llamadas dcsaminasas de ciridina y adeno,ina, respectivamente. Este tipo de edición parece .enc r lugar principalmente en el sisLema n ervioso . qay 16 dianas (potenciales) para la desamín asa de jtosina en Drosop7lila melm10gaster, y todas corres'"~Onden a genes implicados en la neurotransmisión. En muchos casos e l suceso de edición cambia un :rninoácido de una posición funcionalmeme imparame de la proteína. ¿Qué controla la especificidad de una reacción ·e edición? Las enzimas que llevan a cabo la des2minación como tal. a menudo son muy específi cas; ~.or ejemplo, la desaminasa de adenosina mejor ca·acterizada actúa en c ualquier molécula A, en una ·egión dicatenaria del RNA. Las enzimas de edición •e relacionan con las desaminasas genera les, pero .,resentan o tras regiones o subu nidades adicionaes que controlan su especificidad. En el ca!>o de il edición de apo-8, la su bunidad cata lítica de un complejo de edición se re laciona con la desaminasa ~en

lntrón Exón

La edición del RNAm se produce cuando una desaminasa actúa sobre una adenina en una región dicatenaria de RNA apareada de manera imperfecta. de ci tidina bacteriana, pero p resenta una región de unión al RNA adicional que ayuda a reconocer el silio dian a especifico para la edición . Una enzima especiaL la desaminasa de adenosina, reconoce los si tios diana del receptor de glutamam del RNA y se presentan sucesos simil ares en un receptor de serotonina del RNA. El complejo puede reconocer una región pan icular de la estructura secundaria de manera análoga a las enzimas de modificación del RNAt, o bien reconocer directamente una secuenóa nucleotídica. El 'Perfeccionamiento de un sistema in vi/ro para el suceso de edición de apo-B sugiere que una secuencia relativamente pequeña (- 26 bases) que rodea a l sitio de edidón constituye una <Jjana suficiente. En la se muesrra que en el caso del RNA de GluR-B, se forma una región de pares de bases necesaria para el reconocimiento de la diana enrre la región editada en el exón y una secuencia complementilria del imrón de Oujo descendente. Se necesita un patrón de apaream ie nto erróneo dentro de la región doble para el reconocimiento espeáfico. Así, d iferentes sistemas de edición pueden tener diferentes r eq uisitos de especiticidad de secuencias en sus sustratos.

La edición del RNA puede dirigirse por RNA guías Conceptos principales la intensa edición de RNA en mitocondrias de tripanosomas se debe a inserciones o deleciones de uridina. • El sustrato de RNA aparea sus bases con un RNA guía en ambos Lados de la región por editar. • El RNA guía proporciona el molde para la adición (o, con menos frecuencia, la deteción) de uridinas. • La edici6n es catalizada por un complejo de endonucleasa, actividad de transferasa de uridilo terminal y ligasa de RNA.

27.ll La edición del RNA puede dirigirse por RNA guías

721

entre el DNA genómico y el RNAm muestra qu~ hay segmenro mayor de siete nucleótidos repre5-.. ~ tado en el RNAm que no haya sido modificado.· insertan series de uridinas de hasta siete bases. _~ dónde proviene la información para la inser.:espedfica de uridina? Cn RNA guía contiene~ secuencia complementaria de la del RNAm co;-n tamente editado. En la se obsen--a _ modelo de su acción en el gen del citocromo ::: especies de Leishmania. La secuencia de la parte alta de la figura c .. tra el transcripLo originaL o RNA preeditado. :.. espacios indican el sirio de inserción de las i:.l¿ en el proceso de edición, que para crear la seC1_•. cia válicla-oe· RNAm en esa región, deben ser _ uridinas. El RNA guía es complemen rario del RNAr lo largo de una distancia significativa que inC:._ la región editada y la rodea . Por lo general, la e plcrnentariedad es más extensa en el lado 3' J: región editada y bastante corra en el lado 5' . El rr reamiento entre el RNA guía y el preeditado espacios donde las moléculas de A del RNA gu:a apareadas, no encuentran complemento en el ? preeditado; el RNA guía proporciona un molde:: permite a las moléculas faltames de u insert
OLro tipo de edición se revela por cambios secuenciales notables en los productos de varios genes de mitocondrias de los Lripanosomas. En el primer caso por descubrir, la secuencia de la subunidad II de la proteína oxidasa de citocromo experimenta un cambio de marco respecto de la secuencia del gen coxll. Las secuencias del gen y la proteína. incluidas en la . se conservan en varias especies de tripanosomas. ¿Cómo actúa ese gen? El RNAm de coxll tiene un inserto de cuatro nucleótidos adicionales (todos u1·idinas) en torno al sitio de cambio del marco de lectura; con la escisión se restablece el marco de lecLura apropiado, se inserta un aminoácido adicional y cambian los aminoácidos a uno y otro lado. Con esa secuencia no es posible descubrir un segundo gen, y debe concluirse que las bases adicionales se insertan durante o después de la mmscripeión. En Jos genes de SV5 y los paramixovirus causantes del sarampión se encuentra una discrepancia similar entre el RNArn y las secuencias genómicas, en cuyo caso implica la adición de moléculas de G en el RNAm. En otros genes, la edición de secuencias de RNA es similar, e incluye deleciones, así como adiciones de uridina. El caso extraordinario del gen coxTII del T7ypanosoma brucei se resume en la

Más de la mitad de las moléculas del RNAm consca de uridinas no codificadas por el gen. La comparación

1 S

S

L G

1

K V E

AUA UCA AGU UUA GGU AUA AAA GUA GAG

N A

LJ V G V M

AC , U

GUA GGU GUA AU

Codificado en la secuencia de DNA del genoma

Cambio de marco de lectura

AUA UCA AGU UUA GGU AUA AAA. GUA GAU IJGU P.UA CCU GGU AGG UGU AAU

1

S

S

L

G

1

K

V

D

C

1

P

G

R

C

N

Secuencia del ANA Secuencia de la proteína

El RNAm para el gen coxii de los tripanosomas tiene un cambio de marco respecto del DNA; el marco de lectura correcto se crea por la inserción de cuatro uridinas.

UAL'AUGUUUUGL UGL'' IUAUUAUG UGAUUAl!GGLtUUUGUUU tUUAUUGYUAU 1 UUUAGAUUUAUUUAAUUUGUUGALI

A

1

QJ

4Qilír 'JUUAUUUGU~UAAUUUUUUUGUUUUGLGUU cGGUUUAG~u•U•UUGJUGUUGUUGUUUUGUAUUA

Parte de la secuencia coxiii del RNAm de T. brucei muestra muchas uridinas no codificadas en el DNA (rojas) o eliminadas del RNA (marcadas con T) . 722

CAPÍTULO 27 RNA catalítico

Genoma

AMGeGGAGAGAAAAGAAA

ANA preeditado AAAGCGGAGAGAMAGAAA

ANA preednado AAAGeGGAGAGAAAAGAM ANA gula

A G G e TTrAAeneAGGnGmAnAeGAGTATATGG

l

Transcripción

A G G C UUUAAeUUeAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG

¡

Apareamiento con el ANA guia

A G G e UUUAACUUCAGGUUGUUUAUUAeGAGUAUAUGG

AUAUUeAAUAAUAAAUUUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAGUUCAGUAUAeACUAUAAUAAUAAU

¡

Inserción de uridlnas

ANA m

AMGeGGAGAGAAAAGAAAUUUAlJGUlJGUeuUUUAAeUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG

ANA guía

AUAU UCAAUAAUAAAUUUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAGUUCAGUAUACACUAUAAUAAUAAU

1 ,l lllllll .

¡ ANAm

Liberación de RNAm

AAAGCGGAGAGAAAAGAAAUUUAlJGJI..GL..e UUUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG

El RNA preeditado aparea sus bases con un RNA guía a ambos lados de la región por editar. El RNA guía proporciona un molde para la inserción de uridinas. El RNAm producido por las inserciones es complementario del RNA guía.

La especificación de la secuencia final editada .,uede ser bastante compleja. En este ejemplo se evi.3 una porción larga del producto de transcripción 10r inserción de un total de 39 moléculas de U, ,ue parece necesitar dos RNA guías que actúan en rios adyacentes; el primero se aparea en el sitio · y la secuencia editada se conviene entonces en .n sustrato para edición adicional por el siguiente 1NA guía. los RNA guías se codifican como unidades de :anscripción independientes. En la e muestra un mapa de la región importante del :::NA mitocondrial del género Leishmania que in_.uye el "gen" del citocromo b que codifica Ja se::-Je ncia preeditada y dos regiones que especifican "'~A guías. Los genes para las principales regiones _e codificación y otros RNA y sus RNA guías e-stá.a ~rercalados.

En principio, una mutación en el "gen" o uno .:e sus Rl'IA guías podría cambiar la secuencia pri~.aria del RNAm y, por tanto, también la secuen-~a primaria de la proteína. Por criterios genéticos, :ada una de esas unidades podría considerarse como .:mslitutiva de parte del "gen''. Las unidades se exresan de manera independiente, de modo que deerían complementarse en configuración trans. Si ,ubiera mutaciones, se necesitarían tres grupos de

1Jw -':'~"~JlE:~l Genes 12S

9S MURF3 Coiii C\~ MUAF4 MURFl N01Co11MURF2Col ND4

NOS

El genoma de especies de Leisflmania contiene genes que codifican RNA preeditados intercalados con unidades que codifican los RNA guías necesarios para generar las secuencias RNAm correctas. Algunos genes tienen varios RNA guías. El CyB es el gen para el citocromo b preeditado, y CyB-1 y CyB-2 son genes para los RNA guías implicados en su edición.

complementación para codificar la secuencia primaria de una sola proteína. La caracterización de intermediarios editados en parte sugiere que la reacción p rocede a lo largo del RNA preeditado en dirección 3'-5'. El RNA guía determina la especificidad de las inserciones de uridina por su apareamiento con RNA preeditado. La edición de uridinas es catalizada por u n complemento enzimálico de 20S que contiene una endonucleasa, una transferasa de uridilo nuclear 27. 11 La edición del RNA puede dirigirse por RNA guias

723

···········• ~ E ndonucleasa 5' :::=:="""""======

======3'

~

T ransterasa de uridilo terminal/ TU Tasa)

~ Ligasa de ANA 5' ======u======3' La adición o deteción de moléculas de U se debe a escisión del RNA, eliminación o adición de U, y ligadura de los extremos. Las reacciones son catalizadas por un complejo de enzimas dirigido por un RNA guía.

(TUTasa) y una ligasa de RNA, como se ilustra en la ; se une a! RNA guía y lo utiliza para aparearse con el RNAm preeditado. El susrraw RNA es csdndido en un sitio que (supuestamente) se identifica por ausencia de apareamiento con el RNA guía, se insena o elimina una uridina para el aparcamiento de bases con el RNA guía. y después, se liga el susuaw RNA. El rrifosfaro de uracilo (UTP) constituye la fuente del fragmento uridilo que se agrega por actividad de la TUTasa; no se sabe si esa actividad o la de una exonucleasa independiente se encarga de la deleción. (En algún momento se pensó que el segmento de moléculas de U en el ex cremo del RNA guía podría proporcionar la fu ente de U añadido o un vertedero para los eliminados, pero la transferencia de moléculas de U al RNA guía parece ser una reacción aberrante que no se encarga de la edición.)

El corte y empalme de proteinas son autocatalíticos Conceptos principales Una inteína tiene la capacidad de catalizar su propia eliminación de una proteína, de manera que las extelnas de los flancos se conecten. Corte y empalme de proteínas se catalizan por la inteína. • Casi todas las inteínas tienen dos actividades independientes, corte y empalme de proteínas y una endonucleasa que vuelve a casa.

724

CAPÍTULO 27 RNA catalítico

l t

Proteína inteína

escindida

~ ~ En el corte y empalme de proteínas, las e>-:~ nas se conectan por eliminación de la inteína de la prote•.--

El corte y empalme de proteínas tienen el mis efecto que el correspondiente del RNA, una secutcia representada en el gen no está represemada : : la proteína, cuyas partes se nombran por analt.: con el corte y empalme del RNA: las exteín as ~ las secuencias representadas en la proteína madt.-_ y las inteínas. las secuencias que se eliminan mecanismo de eliminación de la inteína es comr tamentc diferente del de corte y empalme del R'· En la se muestra que el gen se trad u en un precursor proteínico que contiene la inter:de modo que ésta será posteriormente escindida la proteína. Se conocen casi 100 ejemplos de e
:onexión N-0 o N-S acilo. Después, ese enlace es atacado por la cadena lateral-OH o -SH del primer ~minoácido de la segunda exteína, el resultado será a transferencia de la exteína 1 a la cadena latera 1del :minoáddo terminal de la exteína n_ Por úlrimo, la .isparagina terminal e de la inteína forma un ciclo y ,._.¡ NH termina l de la exteína Il ataca el enlace acilo "Jara sustituirlo con un enlace peptídico convendo'lal. Cada una de esas reacciones puede ocurrir de nanera espontánea a velocidades muy bajas, pero m aparición en forma coordinada, suficientemente ~ápida como para lograr el corte y empalme de la 1roteína, requ iere de catálisis por la inteína. Las inceínas tienen rasgos característicos. Se en:ucnrran cumo inserciones en el marco de lecrura je las secuencias de codificación, y se reconocen (Omo tales por la presencia de genes homólogos o-1ue ca recen de la inserción . Tienen una serina o jsteín a terminal N (para proporcionar la cadena atera l -XH) y una asparagina terminal C. La inteína :pica porta una secuencia de - 150 aminoácidos en ·1 extremo terminal N y casi 50 en el terminal C. Js cuales panicipan en la catalización de la reacción 1e cone y empalme de proteínas. La secuencia del .entro de la inteína puede tener otras funciones. Una característica extraordinaria de muchas nteinas es su actividad de endonudeasa de aloja'lliento, la cual escinde un DNA diana para crear un ~iúo donde pueda insertarse la secuencia de codi:.lcación de la inreína del DN A (véase la Fig. 2 7.12 1e la sección 27.5, Algunos intrones del grupo r cojifican endonucleasas que fomentan la movilidad). :.as actividades de corte y empalme de las proteínas de la endonucleasa de alojamiemo de una inteína ·on independientes. En realidad se desconoce la conexión entre esas ios actividades en una inteína, pero se han sugeri .:Jo dos tipos de modelo. Uno supone que original•lente había cierta conex ión emre las actividades, '~ero desde entonces se tornaron independientes y algunas imeínas han perdido la capacidad de enlonucleasa de alojamiento. En el otro, las inteínas ·ueden haberse originado como unidades de corte - empalme de proteínas, que en su mayor parte ueron invadidas después por endonucleasas de aloamienro (se desconoce la razón), lo cual es comatible con el hecho de que las endonucleasas de 3ojamiento parecen haber invadido también otros lpos de unidades, incluidos, sobre todo. los imrones el grupo l.

Resumen .=1 autocorre y empalme constituye una propiedad Je dos grupos de imrones muy difuncüdos entre las

X=SoO

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Los enlaces se reestructuran mediante una serie de transesterificaciones que involucran a los grupos -OH de serina o treonina, o al grupo -SH de la cisteina, hasta que las exteínas se conectan mediante un enlace peptídico y la inteína con un extremo (-circular es liberada.

eucariotas inferiores, los sistemas procarióticos y las mil.ocondrias. La información necesaria pa ra la reacción reside en la secuencia del intrón (aunque en realidad, proteínas in vivo facilitan la reacción) . Para los intrones de los grupos I y JI, la reacción requiere de la formación de una estructura secundaria/terciaria específica que implica secuencias de consenso corras. El RNA del intrón del grupo J crea una estructura en que la secuencia del sustrato es mantenida por la región IGS del intrón. en tanto que otras secuencias conservadas generan un sitio de unión del nucleótido guanina, todo eUo, por transeslerificación, que implica una molécula de guanosina como cofactOr. No se requiere ingreso de energía. La guanosina rompe el enlace en la unión 5' exón-intrón y se enlaza con el intrón; el hidroxilo del extremo libre del exón ataca entonces la unión 3' exón-intrón. El intrón se torna cíclico y pierde la guanosina y las l 5 bases terminales. Una serie V

l Resumen

725

de reacciones relacionadas puede catalizarse a través de ataques por el fragmento terminal G-OH del intrón en enlaces fosfodiéster internos. Proporcionando sustratos apropiados ha sido posible obtener ribozimas por ingeniería, las cuales realizan diversas reacciones cataliücas, incluidas aC[iVidadcs de transferasa de nucleotidilos. Algunos intrones mitocondriales de los grupos I y II tienen marcos de lectura abiertos. Las proteínas codificadas por los inrrones del grupo l son endonucleasas, que producen escisiones dicatenarias en siLios diana del DNA; la escisión inicia un proceso de conversión del gen, en el cuaL la secuencia del intrón mismo se copia en el sitio diana. Las proteínas cod ificadas por imrones deJ grupo n incluyen una actividad de endonucleasa que inicia el proceso de transposición y una de transcriptasa inversa que permite obtener una copia del intrón mismo en el sitio diana. Dichos intrones posiblemenle se originaron por procesos de inserción. Las proteínas codificadas por ambos grupos de intrones pueden incluir actividades de madurasa, que facilitan el corle y empalme del intrón por estabilización de la formació n de la estructura secundaria/terciaria en sitio activo. El componente RNA de la ribonucleoproteína ribonucleasa P lleva a cabo reacciones catalíticas. Los RNA virusoídes son susce ptibles de autocorte y empalme en una estruerura "en cabeza de martillo'', estructura que puede formarse entre un RNA susrrato y un RNA ribozima, lo cual permite dirigir la escisión en secuencias muy específicas. Dichas reacciones sustentan el punto de vista de que el RNA puede formar sitios activos específicos con actividad catalítica. La edidón del RNA cambia la secuencia de un RNA durante su transcripción o después de ésta, que son cambios necesarios para crear una secuencia de codificación significativa. En sistemas de mamífe ros se presentan sustituciones de bases individuales que asumen la forma de desaminaciones, donde C se convierte en U, o A en l. Una subunidad cata lítica relacionada con la desaminasa de citidina o adenosina actúa como parte de un complejo más grande con especificidad para una secuencia cüana en particular. Las adiciones y delecíones (casi siempre de uri dina) se presentan en las mitocond.rias de tripanosomas y en paramixovirus. Las reacciones extensas de edición ocmren en los t.ripanosomas, en los cuales, hasta la mitad de las bases de unRNAm provienen de la edición. En Ja reacción de edición se usa un m o lde constituido por un RNA guía complementario de la secuencia del RNAm. La reacdón es catalizada por un complejo enzimático que incluye una 726

CAPÍTULO 27 RNA catalítico

endonucleasa, una nansferasa de uridjna tery una ligasa de RNA. que uti.lizan nucleótidos · como fuente de adición o liberan nucleótidos.c.. didos después de la deleción. El corte y empalme de proteínas constituye: _ reacción catalítica derivada de reacciones de :· : ferencla de enlaces que no requiere de íngre.:energía.la enteína cata liza su autocone y emr= fuera de las exteinas de los flancos. Muchas im~ tienen una actividad de endonucleasa de alojarr to indep endiente de la actividad de corte y em~ de las proteínas.

Referencias

fiiJ

Los intrones del grupo J realizan autocorte y empalme por transesteriflcación

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EIJ

los intrones del grupo li pueden codificar proteínas multifuncionales

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IJI

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fiiJ

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EJim

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z..

728

CAPÍTULO 27 RNA catalítico

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Cromosomas ESQUEMA DEL CAPÍTULO • Las bandas tienen un menor contenido de G·C que los espacios intermedios (interbandas). • los genes se concentran en las interbandas. ricas en G-C.

Introducción Los genomas víricos están empaquetados en sus cubiertas

m;:~)

• La longitud del DNA que se puede incorporar a un virus depende de la estructura de su casco. • El ácido nucleico del casco está muy condensado. • Los virus de RNA filamentosos condensan el genoma de RNA conforme ensamblan el casco a su alrededor. • Los virus de DNA esférico insertan el DNA en una cubierta protelnica preensamblada.

los sitios de expresión génica de los cromosomas en escobillón muestran asas que se extienden a partir de su eje.

6JRl]

Los cromosomas politénicos forman bandas los cromosomas politénicos de los dípteros tienen una serie de bandas que se pueden usar como mapa citológico.

los cromosomas politénicos se expanden en sitios de expresión génica

El genoma bacteriano es un nucleoide • El nucleoide bacteriano es -80"fo DNA en cuanto a masa, y puede ser desplegado por agentes que actúan en el RNA o las proteínas. • las proteínas que condensan el DNA no han sido identificadas.

las bandas son sitios de expresión génica en cromosomas politénicos que se expanden para dar lugar a "abultamientos".

El cromosoma eucariótico es un dispositivo de segregación

El genoma bacteriano está superenrollado • El nucleoide tiene -100 dominios independientes superenrollados negativamente. • la densidad promedio del superenrollamiento es -1 superhélice/100 bp. El DNA eucariótico tiene asas y dominios unidos

Los cromosomas en escobillón se extienden

Un cromosoma de eucañota se mantiene en el huso mitótico por unión de microtúbulos al cinetócoro, que se forma en su región centromérica. Los centrómeros a menudo tienen heterocromatina rica en secuencias de DNA satélite.

a

un bastidor

Los centrómeros pueden contener DNA repetitivo

• El DNA de la cromatina de interfase está superenrollada en forma negativa en dominios independientes de -85 kb. • Los cromosomas en metafase tienen un bastidor de protelnas al que se unen las asas del DNA.

• Los centr6meros de los cromosomas de eucariotas superiores contienen grandes cantidades de DNA repetitivo. Se desconoce la función del DNA repetitivo.

f1D Secuencias específicas unen el DNA a una matriz de interfase • El DNA está unido a la matriz nuclear en secuencias específicas llamadas MAR o SAR. • las MAR son ricas en A· T. pero no tienen una secuencia de consenso especifica.

La cromatina se divide en eucromatina y heterocromatina • Los cromosomas individuales se observan sólo durante la mitosis. • En la interfase, la masa general de la cromatina está en forma de eucromatina, con empaquetamiento menos compacto que los cromosomas en mitosis. • las regiones de heterocromatinas se mantienen densamente empaquetadas durante la interfase.

fl!ID

Las secuencias de DNA de los centrómeros de S. cerevisiae son cortas • En S. cerevisioe, los elementos CEN se identifican por la capacidad de permitir que un plásmido se segregue de manera precisa en la mitosis. Los elementos CEN consisten en las secuencias cortas conservadas CDE-1 y CDE-Ill, las cuales flanquean una región CDE-III rica en A-r.

El centrómero se une a un complejo proteínico • En CDE-11 se forma un complejo proteínico especializado alterno a la estTUctura usual de la cromatina. • El complejo proteínico CBF3 que se une a CDE-III es indispensable para la función del centrómero. las proteínas que conectan esos dos complejos podrían proporcionar la conexión para los microtúbulos.

Los cromosomas tienen patrones de banda

Los telómeros tienen secuencias de repetición simples

• Ciertas técnicas de tinción nacen que tos cromosomas parezcan una serie de estrías llamadas bandas G.

• Para la estabilidad del extremo cromos6mico, se requiere el telómero.

Continúa en la siguiente página 729

• Un telómero es una repetición sencilla en la que una cadena rica en C+A tiene la secuencia c.,(A/T),_.. ~

Los telómeros sellan los extremos de los cromosomas • la protelna TRF2 cataliza una reacción en que la unidad repetida 3' de la cadena rica en G + T forma un

asa por desplazamiento de su homóloga en una región de flujo ascendeme respecto del telómero.

gEJ

• El componente RNA de la telomerasa tiene una secuencia que se aparea con repeticiones ricas en e+ A. • Una de las subunidades protelnicas es una transcriptasa inversa que utiliza al RNA como mole¿ para la slntesis de la secuencia rica en G+ T.

los telómeros son sintetizados por una enzima ribonucleoproteínica

~

~

Los telómeros son indispensables para la supervivencia Resumen

• La telomerasa hace uso del 3'- OH de la cadena telomenca G + T para cebar la síntesis de repeticiones seriadas de tipo TTGGGG.

ED

en el espacio disponible. Este fenómeno contrasta :.

Introducción

En la organización de todo material genético celular es evidente un principio general. se trata de un a masa compacta confinada en un volumen limitado, y sus diversas actividades, como repUcación y transcripción, deben tener lugar en ese espacio. Por olra pane, la organización del material debe ajustarse a transiciones entre un estado de inactividad y otro de aclividad. El estado condensado del ácido n udeico resulta de su unión con proteínas básicas, cuyas cargas positivas neutralizan las cargas negativas del ácido nucleico. La estrucmra del complejo nudeoprQ[eÍníco depende de las interacciones de las proteinas con el DNA (o RNA). El empaquetado del ONA, en fagos, virus, células bacterianas y núcleos de eucariotas, resulta en un problema común. La longitud del DNA (o en el caso de algunos virus, el RNA) como molécula extendida rebasarfa con mucho las dimensiones del compartimiento que la co ntiene, de modo que tendría que comprimirse exageradamente para caber

la imagen llpica del DNA de una doble hélice extend:'.pero su deformación estructural al plegarse eu una jcJr más compacta es la regla, más que la excepción. La magn itud de La discrepancia entre la lon~ tud del ácido nucleico y el tamaño de su compatimiento resulta evidente a partir de los ejemp resumidos en la . Para bacteriófagos virus de eucarioras, el genoma de ácido nucleic ya sea ONA o RNA monocate nario o dicarena r: efectivamente llena el receptáculo (que puede s. cilíndrico o esférico). En compartimientos de bacterias o células e<_carióticas es diffcil calcular con exactitud la discepancia, pues el DNA está conten ido en una zorcompacta que ocupa sólo parcialmente el comp~­ miento; el material genético asume la forma de n ucleoide en las bacterias y de masa de cromatina ~ núcleos eucariólicos de interfase (emre divisiones La densidad del DNA en esos compartimíeot es alta, de -1 O mg/ml, en una bacteria, de -l 00 m~ mi en un núcleo eucariótico, y en la cabeza del faf T4, de >500 mg/ml. Tal concentración en solucif ...

Longitud

Compartimiento

Forma

Dimensiones

Tipo de ácido nucleico

TMV

mamento

0.008 X 0.3 ¡.tm

Un ANA monocatenarlo

2 ¡.tm = 2.64 kb

Fagofd

filamento

0.006 X 0.85 j.lm

Un DNA monocatenario

2¡.tm = 6.0 kb

Adenowus

icosaedro

0.07 ¡.tm de diámetro Un DNA d1catenano

11 ¡1m= 35.0 kb

Fago T4

icosaedro

0.065 X 0.10 !Am

Un DNA dicatenario

55 ¡.tm = 170.0 kb

E. coli

cilindro

1.7x0.65¡.tm

Un DNA dlcalenario

1.3 mm= 4.2 x 103kb

Milocondria (humana)

esferoide en oblea

3.0 X 0.5 !lm

-1 o DNA dicatenarlos idénticos

so ¡.tm = 16.0 kb

Núcleo (humano)

esleroide

6 !Am de diámetro

46 cromosomas de DNA dicatenario

1.8 m

=6 x 1os kb

La longitud del ácido nucleico es mucho mayor que las dimensiones del compartimiento circunda nte.

730

CAPÍTULO 28 Cromosomas

sería equivalente t.l un gel de gran viscosidad. Se desconocen las implicaciones fisiológicas, como su efectO en la capacidad de las proteínas para hallar sus sitios de unión en el DNA. El empaquetamiento de la cromatina es flexible y cambia durante el ciclo celular eucariótico. En el momenro de la división (mitosis o meiosis). el material genético se empaqueta todavía más densamente, de modo que los c romosomas son iden tificables. La compresión global del DNA suele describirse mediante la r azón d e e mpaque, que corresponde a la longirud del DNA dividida entre la longitud de la unidad que la contiene. Por ejemplo, el cromosoma humano más pequeño contiene -4.6>< 107 bp de ONA (-10 veces el tamaño del ge noma de la bacteria E. coli), Jo cual equivale a 14 000 micras (= 1.4 cm de DNA extendido). En el momenlo de la mayor condensación de la mito~is, el cromosoma tiene -2 1.1 de longitud, así que la razón de empaque del DNA en el cromosoma puede Jlegar hasta 7 000. Las razones de empaque de las estructuras globales más amorfas del nucleoide bacteriano o lacromatina eucarióuca no pueden ser tan exactas, pero el resultado pumual usual suele ser que los cromo· somas en mitOsis tengan un empaquetado cinco o diez veces más denso que la cromatina de interfase, lo cual indica una razón de empaque típico de l 000 a 2000. Una cuestión importante aún sin respuesta se refiere a la especificidad del empaquetado. ¿El DNA se pliega en un patrón particular o es diferente para cada copia del genoma? ¿Cómo cambia el patrón del empaque cuando se replica o transcribe un segmento del DNA?

Los genomas víricos están empaquetados en sus cubiertas Conceptos principales • La longitud del DNA que se puede incorporar a un virus depende de la estructura de su casco. • El ácido nucleico del casco está muy condensado. • Los virus de RNA filamentosos condensan el genoma de RNA conforme ensamblan el casco a su alrededor. • Los virus de DNA esférico insertan el DNA en una cubierta proteínica preensamblada. Desde la perspectiva del empaquetado de cada secuencia, hay una diferencia importante entre un genoma celular y un virus. El tamaño del genoma celu lar es esencialmente indefinido, pues el número y localización de las secuencias individuales puede cambiar por duplicación, deleción y reestructura-

ción, o sea que se reo_uiere de un método generalizado de empaquetamiento del DNA insensible al comenido o la distribución total de la secuencia. Por el conrrario, dos instrucciones definen ]as necesidades de un virus. La cantidad de ácido nucleico por empaquetar depende del tamaño del genoma y debe adaptarse a una de cubierta ensamblada por una o varias proteínas codificadas por los genes víricos. El aspecto superf1cial de una panícula vírica es falazmente stmple; el genoma de ácido nucleico esrá contenido en una cá p s ide, o estructura simétrica, o casi simétrica, ensamblada a partir de una o una~ cuantas proteínas. A la cáps1de se unen (o se incorporan a ella) otras estructuras, las cuales se ensamblan a partir de proteínas diferentes y que son necesarias para la infección de la célula hospedadora. La estructura de la partícula vírica es muy compacta, ya que rara vez el volumen interno de la cápside es mucho mayor que el del ácido nucleico que contendrá; la difcrenda suele ser menor del dobk y a menudo, el volumen interno es apenas mayoT que el del ácido nucle~co. En su forma más extrema, la restricdón de que la cápside se ensamble con proteínas codificadas por el viru~, indica que roda la cubierta se construye a partir de un solo tipo de subunidad. Las reglas de ensamblaj e de subunidades idénticas en estructuras cerradas restringe la cápside a uno o dos tipos. En el primer caso, las subunidades de proteína se apilan secuencialmente en (orma helicoidal para constituir una estructura filamentosa o cilíndrica, mientras que en el segundo, forman una cubierta seudoesférica, una estructura similar a un poliedro con s imetría icosaédrica. Algunas cápsides víricas se ensamblan a panir de más de un tipo <.le subunidad proteínica, y si bien esto amplía los tipos exactos de estructuras que se pueden formar, las cáps.ides víricas aún se apegan a las clases generales de filamentos cuasi cristalinos o icosaedros. Hay dos tipos de soluciones al problema de cómo construir una cápside que conrcnga un ácido nucleico: • La cubierta proteínica se puede ensamblar en LOmo al ácido nudeico, de modo de con densar el DNA o el RNA por interacciones proteína-ácido nudeico durante el proceso de ensamblaje. • La cápside se puede construir a partir de esos componentes en forma de cascarón va cío, en el cual se insertará el áddo nucleíco, que se condensa conforme entra. En los virus de RNA monocatenario, la cápside se ensambla en romo a l genoma según el principio de que la posición del .'VVA demro de la cápside es de-

28.2 Los geno mas víricos están empaquetados en sus cubiertas

731

El ANA se enrolla en una hélice

(l

~

La procabeza 1tiene un centro de proteína

o

La procabeza 11 está vacía

1 (

Se 1nicia el empaquetamiento deiDNA

~

El casco se expande conforme aumenta el DNA

Partfcula de fago madura

G7J

732

El casco alcanza su tamano

Mediante apilado de subunidades proteínicas en el virión se crea una vía helicoidal para el RNA del TMV.

completo~

terminada directamente por su unión con las proteínas de la cubierta. El ejemplo mejor caracterizado es el de TMV (virus del mosaico del tabaco), en el cuaL el ensamblaje se inicia con una horquilla doble que yace en la secuencia del RNA. A partir de ese centro de nucleación, procede de manera bidireccional en el RNA hasta llegar a los extremos. La UJ1idad de la cápside es un disco de dos capas, cada una de las cuales comiene 17 subunidades proteínicas idénticas. El disco es una esrrucrura circular que, al interactuar con el RNA. forma una hélice. En el centro de nucleación, la horquilla de RNA se inserta en el orificio central del disco y éste cambia de conformación, a una estructura helicoidal que rodea al RNA. Se agregan discos adicionales, cada uno de los cuales lleva una nueva cadena de RNA hacia su orificio central. El RNA se enrolla de fo rma helicoida l dentro de la cubierta de proteína como se ilustra en la Las cápsides esféricas de los virus de DNA se ensamblan de forma diferente, siendo el ejemplo característico los fagos lambda y T4, en cuyo caso, una cubierta vacfa se ensambla a partir de un pequeño conjumo de prOteínas. A continuación, elgenoma doble se inserta en la cabeza, proceso que se acompaña de un cambio estructural en la cápside. se resume el ensamblaje del En la virus lambda, el cual empieza con un pequeño casco que contiene una proteína Nmedular" y que se transforma en un casco vacío de forma característica. En ese pumo se inicia el empaquetado del DNA, el casco aumenta de tamai1o, aunque conserva la misma forma, hasta que toda la cabeza se sella por la adición de la cola.

Se une la cola

CAPÍTULO 28 Cromosomas

~

La maduración del fago lambda pasa por var~ etapas. La cabeza vacía cambia de forma y se expande cuar: se llena de DNA. las micrografías electrónicas muestran .:: partículas al inicio y al término de la via de maduración. Fot:graña superior reproducida de Cue, D. y Feiss, 1"1. 1993, Prc:. Natl. Acad. Sci. USA, 90:9290·9294. Copyright 1993, Natio-:: Academy of Sciences U.S.A. Imagen cortesía de Michael :: Feiss, University of Iowa. La imagen inferior es cortesía :~ Robert Duda, University of Pittsburgh. Un DNA dicatenario que cubre distancias cona es un cilindro bastante rígido que de todas formo debe comprimirse en una estrucwra compacta parajustarse al interior de la cápside. Sería bueno sabesi el empaquetado implica un enrollado ligero dt' DNA dentro de la cabeza o si necesita flexionar.,. abruptamente. La inserción del DNA en una cabeza de fag implica dos tipos de reacción, translocación y cor densación, ambas desfavorables desde el punto u. vista energético. La uanslocación es un proceso activo en el q1 e el DNA es llevado al interior de la cabeza por umecanismo dependiente de ATP; el mecanismo u~.­ lizado es común para muchos virus que se replicamediante enrollamiento circular para generar larga colas que contienen multímeros del genoma vín -

co. El ejemplo mejor caracterizado es el del fago lambda, cuyo genoma es empaquetado en la cápsi de vacía por la enzima te rminasa, proceso que se resume en la La tcrminasa fue detectada por primera vez merced a su participación en la generación de extremos del fago lineal de DNA por escisión en sitios cos (nombre que refleja el hecho de que genera extremos cohesivos con colas complementarias de w1a sola cadena). El gcnoma del fago codifica dos subunidades que constituyen la terminasa, una de las cuales se une a un sitio cos, punto en que se une a la otra subunidad, la cual corta el DNA. La terminasa se ensambla en un heterooligómero dentro de un complejo que también incluye IHF (factor de integraci6n del hospedador, dímero codificado p or el genoma bacteriano). Después se une a una cápsíde vacía y ap rovecha la hidrólisis de ATP para imp ulsar la translocación a lo largo del DNA, hasta llevarlo al inrerior de la cápside vacía. Otro método de empaquetado utiliza un componente estructural del fago. En el fago <¡>29 del Bacillus subtilis, el motor que insena el DNA en la cabeza es la eslructura que la conecta con la cola y que actúa como motor rotatorio, cuya acción efectúa la translocación lineal del DNA al interior de la cabeza del fago. El mismo mowr se usa para expulsar el DNA y la cabeza dd fago cuando infecta a una bacteria. Se sabe poco del mecanismo de condensación en una cápside vaóa, excepto que ésra contiene "proteínas internas", así como DNA. Una posibilidad es que proporcione alg(m tipo de "bastidor" donde se condensa el DNA (sería la contraparte del uso de proteínas en la cubierta de los virus vegetales de RNA). ¿Qué ran específico es el empaquetado? No puede depender de cicnas secuencias porque deleciones, inserciones y susliwciones no pueden interferir con el proceso de ensamb laje, La relación entre el DNA y el casco ha sido direaamente investigada para determinar cuá les de sus regiones pueden enlaza rse en forma cruzada con las proteínas de la cápside. La sorprendente respuesta es que todas las regiones del DNA son casi igualtememe susceptibles, es decir, que cuando se inserta en la cabeza, sigue una regla general para la condensación, pero el patrón no es determinado por secuendas específicas. Estos diferentes mecanismos de ensamblaje de virus llegan todos al mismo fin: el cmpaquelado de una molécula unkatenaria de DNA o RNA dentro de La cápside. No obstante, algunos virus tienen genomas que consran de mud1as moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, los reovirus contienen diez segmentos de RNA dicarenario que deben empacarse en la cápside, para lo cual pueden ser necesarias secue ncias de seguimiento e~pecíficas en los seg -

Un circulo rodante genera multrmeros lambda

La 1erm1nasa se une al

SIIIO cos

en el DNA

Se escinde et DNA

La terminase rec luta la cápside

,.,.,... G

La terminasa transloca al DNA en el interior de

\

ATP -tADP

La proteína terminasa se une a sitios específicos en un multimero de genomas víricos generales por replicación de un círculo rodante. Corta el ONA y se une a una cápside vírica vacía, para después utilizar la energía de la hidrólisis de ATP con el fin de insertar el DNA en la cápside.

memos de modo de ga ramizar que el proceso de er_samblaje elija una copia de cado molécula diferente para forma r un conjunto completo de información genérica. En el caso más sencillo del fago <¡>6, que empaqueta tres diferentes segmentos de RNA de doble cadena en una cápside, los segmentos deben unirse en un orden específico; como cada u n o es incorporado a una cápside, desencadena un cambio en su conformación que crea sitios de unión para el siguiente segmento. Algunos virus vegetales tienen múltiples divisiones, sus genomas están formados por segmemo5, cada uno de los cuales se empaqueta en una cápside d1[erence. Un ejemplo es el virus del mosaico de la alfalfa (AM V), que tiene cuatro RNA unicatenarios diferentes, cada uno empacado de manera indepemlíente en una cubierta constituida por La misma subunidad proteínica. Una infección exitosa depende del ingreso de un RNA de cada tipo a la célula. Los cuatro componentes del AMV constan de panículas de diferentes tamaños, o sea que la misma proteína de la cápside puede empacar cada RNA en su propia partícula característica, fenómeno que 28 2 Los genomas víricos están empaquetados en sus cubiertas

733

difiere del empaquetado de un segmento único de áddo nucleico en una cápside de forma fijas. La vía de ensamblaje de los virus cuyas cápsides tienen sólo una forma auténtica puede ser desviada por mutaciones que dan lugar a la formación de partículas m onstruosa s aberrantes. en las cuales. la cabeza es mayor de lo usuaL Esas mutaciones muestran que una proteína de la cápside, tiene capacidades imrínsecas para ensamblarse en un tipo particular de estructura, pero el tamaño y la forma exactos pueden variar. Algunas de esas mutaciones ocurren en genes que codifican fa ctore s d e ensamblaje necesarios para la formación de la cabeza, pero que no son parte del casco. Tales proteínas auxiliares limitan las opciones de la proteína de la cápside, de manera que se ensambla sólo a lo largo de la vía deseada. En el ensamblaje de la cromatina celular se emplean proteínas comparables (véase Cap. 29, Nucleosomas).

Si bien las bacterias no muestran estructuras con las características morfológicas definidas de los cromosomas eucarióticos, de rodas formas Jos genomas

están organizados en cuerpos definidos. El mate. · genético se ve como un conjumo bastante copacw (o una serie de conjuntos), que ocupa cas: 33% del volumen de las célula. En la muestra el cone delgado de una bacteria en el 0. es evidente dicho nucleoide. Cuando se lisa E. coli, se liberan fibras en fo:::de asas unidas a la envoltura rota de la célula. Cor puede observarse en la , el DNA de es-asas no muestra una forma extendida dicatena-sino compacta, por su vínculo con proteínas. De E. coli se han aislado varias proteínas unión con el DNA que superficialmente se asemeo2 a las proteínas de cromosomas eucarióticos. ¿Q criterios deberían aplicarse para decid ir si u na p: teína que se une al DNA tiene participación estr tural en los nucleoides? Debería haber cantida..;. suficientes como para que se una a tOdo el genor y las mutaciones de su gen deberían modifica r ._ alguna forma la estructura o las funcio nes vin ct. ~ das con la supervivencia del genoma (por ejem1 segregación a célu las hijas). Ninguna de las posi~ proteínas cumple aün las condiciones genéticas. La proteína HU es un dímero que tal vez e densa el DNA al envolverlo en una estructuras~­ lar a una burbuja y que tiene relación con JRF, G. presenta actividad estructural para la formadóro un complejo proteínico en reacciones especializa de recombinación. Las mutaciones nulas en c~...,; quiera de los genes que codifican las subunidade5 HU (JzupA y -B) tienen poco efecto. pero la pérd' de ambas funciones da Jugar a un fenotipo sensi' al frío y cierta pérdida de la estructura helicoida. el DNA. Esos resultados dan lugar a la p osibilid;..

Un corte delgado muestra el nucleoide bacteriano como masa compacta en el centro de la célula. Imagen cortesía de Molecular and Cell Biology Instructional Laboratory Program, University of California, Berkeley.

El nucleoide se vierte fue ra de una E. coli lisz:. en forma de asas de una fibra . Fotografía t> G. M urti/Pb:-~ Researchers, Inc.

El genoma bacteriano

es un nucleoide Conceptos principales El nudeoide bacteriano es -80% DNA en cuaento a masa, y puede ser desplegado por agentes que actúan en el RNA o las proteínas. • Las proteínas que condensan el DNA no han sido identificadas.

734

CAPÍTULO 28 Cromosomas

de que intervenga de forma general en la condensación del nucleoide. La proteína Rl (también conocida como H-NS) se une al DNA interactuando preferentemen te con secuencias plegadas. Las mutaciones en su gen han res u hado en diversas [ormas (osmZ, bg!Y. pi!G). cada u na identificada como regulador aparente de tln sistema diferente . Dichos resultados tal vez reflejen el efecto que H l produce en la topología local del DNA que incide en la expresión génica dependiente de un promotor en particular. Sería de esperar que la ausencia de una proteína necesaria para la estructura del nudeoide tuviera graves efecros a la viabilidad, ¿por qué entonces los efectos en las deleciones de los genes para Jas proteínas HU y Hl son relativamente restringidos? Una explicación es que dichas proteínas son redundantes, y una sola puede sustituir a las ouas, de manera que se necesitarían deledones en todas ellas para modificar notoriamente la estructura del nudeoide. Otra posibilidad es que aún no se han identificado las proteínas encargadas de las principales caracreríslicas de la integridad del nucleoide, el cual se puede aislar directamente en forma de compJejo de sedim entación muy rápida constituido por -80% DNA por masa. (Los complejos análogos en e u ca riotas tienen - 50% DNA por masa; véase la secdón 28.4, El genoma bacteriano está superenrollado); puede ser desplegado por tratamiento con reaClivos que actúan sobre el R.t~A o las proteínas, cuya posible participación en la estabilización de esta estructura es evidente; el papel del RNA ha sido bastante refractario al análisis .

En un DNA cerrado natural cuyo superenro llamicnto es negativo, el intercalado de bromuro de etidio elimina primero las superhélices negativas y después introduce superhélices positivas. La cantidad de bromuro de etidio necesaria para llegar a un superenrollamiento de cero es un parámetro de la densidad original de las superhélices negativas. El nucleoide compacto presenta algunas hendiduras durante su aislamiento, las cuales también pueden generarse por tratamientos limitados con desoxirribonucleasa, con lo cual, sin embargo, el bromuro de etidio no pierde su capacidad de introducir superhélices positivas. Esta capacidad del genoma de conservar su respuesta al bromuro de etldio ante las hendiduras significa que debe tener muchos d omini os cromosómicos independiemes, y que en cada dominío, el superenrollamiento no resulta afecrado por lo que sucede m los otros. Esta autonomía sugiere que la estructura del cromosoma bacteriano tiene la organiL:ación general que se muescra esquemáticamente en la Cada dominio consta de un asa de DNA cuyos extremos se aseguran de alguna forma (desconocida) que no permite que se propaguen los sucesos rotativos de un dominio a otro. En los primeros informes se sugería que los dom.inio.s constan de - 40 kb de DNA, pero en análisis más recientes se sugiere que pueden ser más pequeños. de - 1 O kb cada uno, o -400 dominios en el genoma de E. coli. Los extremos de Jos dominios parecen distribuidos de manera aleatoria, y no localizados en sitios predeterminados del cromosoma.

El genoma bacteriano está superenroltado Conceptns principales • El nucleoide tiene -100 dominios independientes superenrollados negativamente. • La densidad promedio del superenrollamiento es -1 superhélice/100 bp.

El DNA del nud eoide bacteriano aislado in vitro se cornporra como una estructura doble cenada, a juzgar por su respuesta al bromuro de etidio. Esa peque· ña molécula se intercala entre pares de bases para generar giros superhelicoidales positivos en moléculas de DNA circular u cerradas", esto es, en moléculas donde ambas cadenas tienen integridad covalente. (En las moléculas circulares "abiertas" que incluyen una hendidura en una cadena o en moléculas lineales, el DNA puede rotar libremente en respuesta a la intercaladón, aliviando así la tensión.)

un mecanismo desconocido El asa consta de DNA dicatenario condensado por proteínas básicas

s-

f

J'" ,.v,.~

~,flo'

,..

~

,.

,.f

El genoma bacteriano consta de un gran número de asas de DNA dicatenario (en forma de fibra); cada una de las cadenas se ancla en la base para formar un dominio estructural independiente. ~8.

El genoma bacteriano está superenrollado

735

No comprimida, la vía está superenrollada en el espac1o y crea tensión la vla comprlmlda está superenrollada en torno a las proteínas, pero no crea tensión Una su perhélice si n restricción en la vía del DNA crea tensión, pero ésta no se tra nsmite a lo largo del DNA cuando una superh élice se restringe por unión con proteínas.

La exis tencia de dominios independientes podría pcrmilir que se mantuvíeran diferentes oerados de supcrcnrollamiento en regiones diferentes del genoma, que tal vez sea importante al considerar las diferentes susceptibilidades de ciertos promotores bacterianos ame el superenrollamiento (véase sección J 1.15, El supcrcnrollamiemo es una característica importante de la transcripdón). Como se muestra en la , en el genoma, el superenrollamiento puede, en principio, asumir una de dos formas: • Si un DNA superenrollado está libre. su vía no tiene restricciones y las superhélices ne gatjvas generan un estado de tensión por torsión que se trasmite libremente a lo largo del DNA en un dominio, tensión que se alivia por el desenrollamiento de la doble hélice, como se describe en la sección 19 .12, El superenrollamiemo afecta la estructura del DNJ\. El DNA se encuentra en equilibrio dinámico emre el estado de tensión y el de desenrollado. • El superenrollamiento puede constreñirse si las proteínas se unen al DNA para mamenerlo en una configuración tridimensional panicular. en cuyo caso, las superhéllces estarán representadas por la vía que sigue el DNA en su vínculo fijo con las proteínas. La energía de la interacción enr.re las proreínas y el DNA superenrollado esrabiliza el ácido nucleico. de manera que no se transmita tensión por la molécula. ¿ln vivo las superhélices del DNA de E. coli están comprimidas o la doble hélice está sujeta a la tensión por torsión característica del DNA libre? Las mediciones del supercnrollamiemo in vitro se enfrentan al problema de que las proteínas que comprimen podrían haberse perdido du rante el aislamiento. En

73 6

CAPÍTULO 28 Cromosomas

varios enfoques se sugiere que. in vivo. el DNA est~ sometido a estrés por torsión. Uno de los enfoques es determinar el efect de las h endiduras en el DNA. Las superhélices t: comprimidas se liberan por medio de hendidura$ en tamo que las comprimidas no resultan afeaadas. Las hendiduras liberan -50% del superenn.Uamienro general. lo cual sugiere que casi la mita deJ !>uperenrollamiento se transmite como tensió·· a lo largo del DNA, y la otra mitad es absorbida pl" la unión con proreínas. En otro enfoque se utiliza el psoraleno. reacth de enlace cruzado, que se une más fácilmente a DNA <:uando se encuentra bajo tensión por torsiór: La reacción del psoraleno con el DNA de E. coli o. vivo corresponde a una dens idad promedio de ugiro superhe)icoida l negaLivo/200 bp (cr = -0.05 1. También es posible analizar la capacidad de !;;. células de formar estructuras alternas de DNA, P• • ejemplo. para generar estructu ras crucifo rmes esecuencias palindrómicas. A partir del cambio de: número de enlaces que se requiere para llevar l cabo tales reacciones, es posible calcular la dens.dad del superenrollamiento original, abordaje qu sugjere u11a densidad promedio de cr =- 0.025 o u; giro superhelicoida l negativo/lOO pares de bases. Por tanto. las superhélices crean tensión por torsión i11 vivo; podría haber variaciones acerca de univel promedio, y es difícil medir la variedad predx de densidades. No obstante, es obvio que el nivel ba'ta para ejercer efectos significativos en la cstructu:: del DNA, por ejemplo, para ayudar a su disolución e~ regiones específicas. como orígenes o promotores. Muchas de las características importantes de _ estructura del nucleoide compacto aún no han sid establecidas. ¿Con qué especificidad se coostrun los dominios? ¿Yacen las mismas secuencias si~n-­ pre en las mismas localizaciones relativas o puedt variar los contenidos de dominíos en partícula:¿Se mantiene la imegridad del domínio? El anális bioquímico por sí mismo no puede responder r · completo a esas preguntas. pero es posible diseñe técnicas selectivas adecuadas, y las propiedades L. _ los mutames estructurales deberían llevar a un aD.?lísis molecular de la construcción del nucleoide.

El DNA eucariótico tiene asas do mi ni os unidos a un bastidor Conn•ptos pnncipale,s • El DNA de la cromatina de interfase está superenrollado eforma negativa en dominios independientes de ~ss kb. • Los cromosomas en metafase tienen un bastidor de proteínas al que se unen las asas del DNA.

La cromatina de interfase es una masa enmarañada de DNA que ocupa gran pane del volumen nuclear. a diferencia de la otra estructura tan organizada y reproducible de los cromosomas mitóticos. ¿Qué controla la distribución de la cromatina de interfa se en el núcleo? El aislamiento del genoma como cuerpo compacto único proporciona ciertas pruebas indirectas de su naturaleza. Aplicando la misma técnica perfecdonada para el aislamiemo del nucleoide bacteriano (véase la sección 28.4, El genoma bacteriano está superenrollado). es posible lisar los núcleos sobre un gradiente de sacarosa. de modo de liberar el genoma de forma que pueda conectarse por centrifugación. Después de aislarlo de Drosophila me/(mogasrer. es posible visualizarlo corno una fibra de pliegues compactos (de 1O nm de diámetro) constituida de DNA un ida a proteínas. El superenrollamiento medido por su respuesta al brom uro de etidio corresponde casi a una superhélice negativa/200 bp. Esas supcrhélices pueden eliminarse mediante hendiduras de desoxirribonucleasa. si bien el ONA conserva la forma de la fibra de 1O nm. lo cual sugiere que el superenrollarniento se debe a la disposición de la fibra en el espacio. y que representa la torsión presente. La relajación completa de las superhéüces implica una hendidura/85 kb. de modo de ident ificar la longitud promedio del DNA "cerrado". Dicha región podría conslituir un asa o dominio de características similares a los identificados en el genoma bacterian o. Las asas se observan directamente cuando la mayor pane de las proteínas es extraída de los cromosomas mitóticos. El complejo resultante consta de DNA vinculado con -8% del contenido de pro• los teína original. Como se observa en la cromoso mas sin proteínas adoptan la forma de un b astid or centra l rodeado de un halo de DNA. El bastidor en metafase consta de una red densa de fibras. del cual emana DNA. aparentemente en forma de asas de 1Oa 30 pm (30 a 90 kb) de longitud promedio. El DNA puede ser digerido sin afectar la integridad del bastidor. que consta de un conjunto de proteínas específicas. lo cual sugiere una forma de organización en la cual asas de DNA de -60 kb se anclan en un bastidor proteináceo central. El aspecto del bastidor simula un par de cromá tides hermanas m itóticas, e l cual suele tener una conexión muy estrecha (aunqu e en ocas iones las hermanas están separadas) y estar unido sólo por unas cuanras fibras. ¿Podría ser ésta la estru ctura encargada de mantener la forma de loo; cromosomas durante la mitOsis? ¿Podría generarse por unión de los componentes proteínicos que suelen asegurar las bases de las asas en la cromatina de interfase?

Los cromosomas sin histonas constan de un bastidor proteínico al que se anclan Las asas de DNA. Reproducida de Ce/1, vol. 12, Paulson, J . R.• y laemmli, U.K.• The strudure of histone... .., pp. 817-828. Copyright 1977, con autorización de Elsevier. Imagen cortesía de Ulrich K. laemmli, University of Geneva. Switzerland.

Secuencias espedficas unen el DNA a una matriz de interfase Conceptos principales El DNA está unido a la matriz nuclear en secuencias específicas llamadas MAR o SAR. Las MAR son ricas' en A-T. pero no tienen una secuencia de consenso específica .

¿Se une el DNA al bastidor me
?8.ó Secuencias especificas unen el DNA a una matriz de interfase

73 7

Se prepara el núcleo

l Escisión con nucleasas de restncc1ón

Extracción de histonas

Fragmentación de todo el DNA con desoxirribonucleasa

) ~'--"'

,'"'

.~ M AR

-

Matriz

1

Adición +de DNA

Ex1racci6n y análisis de DNA

las regiones vinculaoas con la matriz se pueden identificar por caracterización del DNA retenido por la matriz aislada in vivo o por identificación de los fragmentos que pueden unirse a la matriz de la que se ha eliminado todo el DNA.

Los abordajes in vivo e in vifl·o se resumen en la . Ambos se inician por aislamiento de la matriz como preparado nuclear crudo que contiene proteínas nucleares y cromatina. de modo que entonces se pueden usar diferentes tratamientos para caracterizar el D NA de la matriz o identificar el que puede unirse a ella. Para analizar el MAR existente, es posible descondensar las asas cromosómicas por extracción de las proteínas, y al eliminar aquéllas mediante un t(atamiento con nuclcasas de restricción. quedan sólo secuencias MAR in vivo (supuestas) unidas a la matriz. El abordaje complememario consiste en elinúnar todo el DNA de la matri 7 por tratamiemo con una desoxirribonuclcasa. momento en que se puede esrudiar la capacidad de los fragmentos aislados del DNA para onirse a la marriz in vin·o. Las mismas secuencias deberían vincularse con la matriz in vivo o m vitro. Una vez que se ha identificado un MAR potencial. se puede determinar el tamaño de la región mínima necesaria para el vin culo in vitro mediante de leciones, lo cual permitirá identificar proteínas que se unen a las secuencias MAR.

738

CAPÍTULO 28 Cromosomas

Una característica sorprendente es la falta dt: conservación de secuencia en fragmentos MAR : suelen ser -70% ricas en A-T, pero carecen de secuencias de consenso desde otros puntos de vista. Sin embargo. otras secuencias interesantes se encuentran a menudo en la cadena de DNA qut: contiene la MAR. Los sitios de acdón en configuración cisque regulan la transcripción son frecuentes, y suele haber un sitio de reconocimiento de la topoisomerasa U en MAR. Por ello es posible que esta última de~empeñe más de una función , pub proporciona un sitio de unión con la matriz y contiene ou·o donde se efectúan cambios topo lógico.. del DNA. ¿Cuál es la relación entre el bastidor de cromosomas de las células en división y la mau-iz de las células de interfase? ¿Las mismas secuencias de DK.; están unida s a ambas estructuras? En varios casos los mismos fragm entos de DNA que se encuen trar: en la matriz nuclear in vivo pueden recuperarse de: bastidor en metafase, y los fragmentos que contienen secuencias MAR pueden unirse a un bastido; en metafase, de manera que parece probable que el DNA contenga un solo tipo de sitio de unión. Er. células de interfase, el sitio de unión se conecta cor la matriz nuclear, en tamo que en células mit6tica5 hace Jo propio con el bastidor del cromosoma. La marri7 nuclear y el bastidor cromosómio constan de diferentes proteínas, si bien hay algunos componentes comunes. La topoisomerasa JI es ur destacado componente del bastidor cromosómico . constiruyenre de la matriz nuclear, lo cual sugien. que el control de la topología es importante en ambos casos.

Ell

La cromatina se divide en eucromatina y heterocromatina

Conceptos pñncipJles • los cromosomas individuales se observan sólo durante la mitosis. En la interfase, la masa general de la cromatina está en forma de eucromatina, con empaquetamiento menos compacto que los cromosomas en mitosis. las regiones de heterocromatinas se mantienen densamente empaquetadas durante la interfase.

Cada c1omosoma tiene un solo DNA dicatenaric.. muy largo, lo cual explica porqué la replicación cromosórnica es semiconservadora, como la molécula de DNA individual. (Esto no n ecesariamente sería el caso si un cromosoma porta muchas moléculas independientes de DNA.) El DNA dicarenario únicc se pliega en una fibra que recorre continuamente e~

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Un corte delgado a través de un núcleo teñido con el colorante de Feulgen muestra la heterocromatina como regiones compactas agrupadas cerca del nucléolo y la membrana nuclear. Imagen cortesía de Edmund Puvion, Centre National de la Recherche Scientiñque.

Las cromátides hermanas de un par mitótico constan cada una de una fibra (-30 nm de diámetro plegada compactamente dentro del cromosoma). Imagen cortesía de Daniel L. Hartl. Harvard University.

cromosoma, de modo que m lo que se refiere a la cromatina de interfase y la estrucrura del cromosoma mirótico, se tiene que explicar el empaquecado de una sola molécula de DNA exn·emadamente larga en una forma en que pueda transcribirse y replicarse, así como adoptar cíclicameme la forma más y menos comprimida. Los cromosomas eucarióticos individuales en-

mm a escena brevemente durame el acto de la división celular, sólo entonces pueden verse como unidades compactas. La es una microorafía electrónica de un par de cromátides hermana; captadas en m erafase. (Las crornátid es hermanas son cromosomas producidos por el suceso de replicadón previo, aún un idos en esa etapa de la mitosis.) Cada una consta de una fibra de - 30 nm de ctiámetro y tiene aspecto nudoso. El DNA está de cinco a diez veces más condensado en los cromosomas qu e en la cromatina de interfase. Sin embargo, durame la mayor parre del ciclo vital de la célula eucariótica, su material genético ocupa una zona del núcleo donde no se pueden distinguir cromosomas individuales. La esrructura de la cromatina de interfase no cambia visiblemente entre d ivisiones, no hay una roLUra evidente durante el periodo de replicación, cuando la cantidad se duplica. La cromatina es fibrilar. si bien es difícil discernir en detalle su configuración general en el espado, pero es similar, o idénúca, a la de los cromosomas mitóticos. Como puede observarse en el cone nuclear de la . la cromatin a se divide en dos tipos de material:

• En casi todas ~as regiones, las fibras están menos densamente empacadas que en los cromosomas mitóricos, material denominado e ucromatina, que parece relarívameme disperso en el núcleo y que ocupa la mayor parte de éste en la Figura 28.12. • Algunas regiones de la cromarina están muy densamente empaquetadas con fibras, lo cual les confiere un estado comparable al de los cromosomas durame la mitosis, material denominado heterocromatina. que por lo general está en Jos cemrómeros, pero también en otras localizaciones. Experimenta el ciclo celular con relativamente pocos cambios en cuando a condensadón. ErÍ la Figura 28.12 forma una serie de cúmu los bien definidos, pero a menudo ias diversas reoioo nes de heterocromatina se acumulan en un cromocentro, densamente 1eri ido. (Esta descripción se aplica a regiones que siempre son heterocromáticas y constituyen la denominada heterocromatina constitutiva; además, hay o tro tipo de heterocromatina, ]a heterocromatina faculta Liva, en la cual, algunas regiones de la eucromati na se convienen a un estado heterocromático.) Las mismas fibras transcurren de manera continua entre eucromatina y heterocromatina, lo cual implica que esos estados representan diferentes orados de condensación del material genético; d~ la misma forma, las regiones eucromáticas se encuen tran en diferentes estados de condensación durante la interfase y la mitOsis. Así. el material genético se organiza de modo que permita mantener estados alternativos en la cromatina y cambios cíclicos en el empaquetado de la eucromaLina entre la interfase y la división. En el Capít ulo 30, Control de la estructura de la cromatina, se describe la base molecular de esos estados.

28.7 la cromatina se divide en eucromatina y heterocromatina

739

La condición eslrucmral del material genérico se conelaciona con su actividad. Las caraCEerísticas comunes de la heterocromatina constitutiva son: • Está permanentemente condensada . • A menudo consta de múltiples repeticiones de unas cuantas secuencias de DNA que no se transcriben. • La densidad de los genes en esa región ha disminuido mucho respecto de la eucroma · tina. y los genes se t rastocan a ella o cerca de ella, a menudo desactivados. • Se replica tardíamente en la fase S y su recombinación genética es menos frecuente, lo cual tal vez resulte de su estado condensado. Hay algunos marcadores moleculares de los cambios de propiedades del DNA y sus con1ponemes proteínicos (véase la sección 31.3, La heterocromatina depende de interacciones con histonas), entre ouos, acetilación reducida de proteínas histonas, aumento de la metilación de Lma proteína histOna e hipermetilación de bases citidina en el DNA. cambios moleculares que dan lugar a la condensación del mateJiaL de lo que depende su inactividad. Au nque Jos genes activos están contenidos en la eucromatina, sólo una pequei'i.a parte de sus secu encias se transcribe en cualquier momentO, de modo que la localización en la eucromatina es nece· saria para la expresión genética, pero insuficiente.

Los cromosomas tienen patrones de banda

Ha.sta que no se perfeccionó esta témica, los cromosomas sólo se distinguían por sus dimensiones generales y la local ización relativa de su centrómero, pero las bandas G permiten identificar a cada cromosoma por su patrón de bandas caracte rístico que permite identificar· la rranslocación de un cromosoma a otro por comparación con el conjunto diploide original. En la se muestra ur: esquema de las bandas del cromosoma X hu mano· estas bandas son estructuras grandes. cada una de - 10 7 bp de DNA, posiblemente con muchos ciemo~ de genes. La técnica de bandas es de una utilidad práctica enorme, pero el mecanismo sigue siendo ur misterio. Todos lo que se sabe es que el colorante liñe los cromosomas no tratados de manera más • menos uniforme. Por ramo, la generación de banda~ depende de una diversidad de tratamientos quemodifica la respuesta del cromosoma (supuestamente por extracción del componente que se une a l colorante desde las regiones sin bandas) . Se pu ede;:, generar bandas similares mediante tratamien to! variados. La única característica conocida que distingue a las bandas de las interbandas es que las pri mera~ tienen un menor contenido de G-C, que es u n resultado peculia r. Si hay -lO bandas en un cromosoma grande, con UJ.1 contenido r:oral de - 100 Mb el cromosoma se divide en regiones de - 5 Mb de longitud que alternan con Jas del con tenido baj1 (bandas) y elevado (interbandas) de G-C. Los gent"~ (identificados por hibtldación con RNAm) tienen: ~ tendencia a localizarse en las regiones interbandas

Conceptos principales • Ciertas técnicas de tinción hacen que los cromosomas parezcan una serie de estrías llamadas bandas G. • Las bandas tienen un menor contenido de G-Cque los espacios intermedios (interbandas). • Los genes se concentran en tas interbandas, ricas en G-C.

Como resultado del estado tüfuso de la cromatina. no se puede determinar direetameme la especificidad de su organización, pero sí investigar si la estructura del cromosoma (mitó tica ) es ordenada. ¿Siempre yacen secuencias panicu lares en sirios particulares o el plegamiento de la fibra de la estructura global es algo más aleatori o? En el ámbito del cromosoma, cada miemlno del conjunto tiene una uluaestructura diferente y reprodudble , Cuando son sometidos a cienos tratamiemos y después se tiñen con el coiorante químico Giemsa, los cromosomas generan una serie de bandas G. En la se presenta un ejemplo de los cromosomas h umanos. 740

CAPÍTULO 28 Cromosomas

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Las bandas Ggeneran una serie lateral cararuñstlca de bandas en cada miembro del conjunto cromosómioc Imagen cortesía de Lisa Shaffer, Washington State Universi~ ­ Spokane.

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Banda p22.3 p22.2 p22.1 p21 p11.4 p11.3 p11.2 Centrómero q12 q13 q21

q 2

2 3 4

5 6 7

8

q22 q23 q24 q25 q26 q27 q28

El cromosoma X humano puede dividirse en regiones distintas según su patrón de bandas. El brazo corto es p, y el largo, q; cada brazo se divide en regiones más pequeñas, subdivididas. En este mapa se observa una estructura de baja resolución; a mayor resolución, algunas bandas se subdividen adicionalmente en bandas más pequeñas e interbandas (p. ej ., p21 se divide en p21.1, p21.2 y p21.3).

fenómeno que respalda a una organización depen diente de secuendas largas. La secuencia del genoma humano confirma la observación básica. En la se muestran claras fluctuaciones del contenido de G-C cuando e1 genoma se divide en ramas pequeñas (segmentos o tramos de DNA). El promedio de 41% de G-C es común en los genomas de manúferos. pero hay regiones con apenas 30% o hasta con 65%. Cuando se revisan tramos más Largos, hay menos variaciones . La longitud promedio de las regiones que contienen >43% ele G-C es de 200 a 250 kb.lo cual adara que la estructura de bandas o interbandas no representa segmentos homogéneos que alternen en cuanto a contenido de G-C, si bien las bandas contienen una mayor cantidad de segmentos con contenido bajo de G-C. Los genes se concentran en regiones con un contenido más alto de G-C. Todavía se desconoce cómo afecta el conrenido de G-C a la estructura cromosómica.

Los cro mosomas en escobi llón se extiende n Concepto principal • los sitios de expresión génica de los cromosomas en escobillón muestran asas que se extienden a partir de su eje.

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Contenido de G-C En distancias cortas hay grandes fluctuaciones en cuanto a contenido de G-C. Cada barra muestra el porcen taje de fragmentos de 20 kb con el contenido determinado de G-C.

Sería exLremadamenre útil localizar la expresión génica en S'LJ estado natural para observar qué cambios estmcturales se relacionan con la transcripdón. La compresión del DNA en la cromaüna, aunada a la dificultad de identificar genes paniculares en su in terior. hace imposible visualizar la transcripción de los genes activos individuales. La expre~ión génica se observa directamente en ciertas circunstancias desusadas, en las cuales, los cromosomas se encuentran muy extendidos, de modo que se facilita distinguir loci individuales (o grupos). La diferenciación lateral de la estructura es evidente en muchos cromosomas cuando apenas llegan para la rneiosis. etapa en la que simulan una serie de cuentas ensartadas en un hilo; las cuentas son gránulos intensamente teñidos que apropia damente se nombran cromómeros. Sin embargo, en general hay poca expresión génica dmante 1a meiosis, y no es práctico utilizar ese material para identificar las actividades de cada uno de los genes. Una drcunmmcia excepcional que permite estudiar el material es la constituida por los cromosoma s en escobillón . mejor caracterizados en ciertos an fibios. los cromosomas en escobillón se forman durante una meiosis inusualmente larga que puede durar íÍncluso varios meses! Durante ese periodo, los cromosomas se mantienen en una forma no distendida, visible con el microscopio de luz; en un momento posterior de la meiosis, recuperarán su tamaño compacto normal. Así, el estado de extensión brinda esencialmente una versión no plegada del estado normal del cromosoma. los cromosomas en escobillón son bivalentes meióticos, cada uno constiLUido por dos pares de cromátides hermanas. En la se muestra un ejemplo en que dichos pares casi se han separa 28,9 Los cromosomas en escobillón se extienden

7 41

Un cromosoma en escobillón es un divalente meiótico en el que dos pares de cromátides hermanas se mantienen juntas en el quiasma (indicado con flechas). Imagen cortesía de Joseph G. Gall, Carnegie Institution.

que sugiere que representan material cromosóruk expulsado de esa organización más compacta u cromómero. Las asas están rodeadas por una matriz de ~ bonudeoproteínas que contienen cadenas redt formadas de RNA, y a menudo es posible defi r una unidad de rranscripción por el aumento en .:. longitud de la RNP que se mueve en torno al a·' véase el ejemplo de la Por tanto, el asa es un segmento expulsado c-.. DNA en proceso de transcripción activa. En cien casos se han identificado las asas que correspondea genes en panicular; la esrrucLUra del gen transcr.· y la naturaleza de su producto pueden analizars. in situ.

fE

Los cro mosomas politénicos fo rman bandas

Concepto principal

• Los cromosomas politénicos de los dípteros tienen una serie de bandas que se pueden usar como mapa cito lógico.

Un asa del cromosoma en escobillón es rodeada por una matriz de ribonucleoproteina. Reproducida de Gall, J G. et al. Mol. Bíol. Ce//. Diciembre 1999. 10:4385-4402. Imagen cortesía de Joseph G. Gall, Carnegie Institution.

do, de manera que se mantienen juntos sólo por los quiasmas. Cada par de cromátides hermanas forma una serie de cromómeros elipsoidales, de-l a 211m de diámetro. conectados por una cadena muy fina que contiene dos cadenas hermanas dobles de DNA y transcurre en forma continua por el cromosoma. a través de los cromómeros. La longitud de los cromosomas en escobillón en la lagartija acuática Norophthalmus viridescens va de 400 a 800 ¡.¡m, frente a la variación de 15 a 20 ].liD que se observa más tarde en la meiosis, de modo que su empaquetamiento es - 30 veces menos estrecho. La longitud toral del conjunto total de cromosoma en escobillón es de 5 a 6 mm y se organiza en -5 000 cromómeros. Los cromosomas en escobillón toman su nombre de las asas laterales que abandonan los cromómeros en ciertas posiciones (simulan un escobillón. que es un objeto extinto). Las asas se extienden por pares, una a panir de cada cromátide hermana. las asas forman un continuo con la cadena axil, lo 742

CAPÍTULO 28 Cromosomas

Los cromosomas de los núcleos de interfase de alg•~­ nos tejidos de la larva de mosca díptera son mucr mayores respecto de su estado normal, tamo en díametro como en longitud. En la se muestra un ejemplo de un conjumo cromosómico de · 3 glándula salival de D. melanogaster, cuyos miembrc se denominan cromosomas politénicos. Cada miembro de l conjunto politénico consta .... una serie visible de bandas (más apropiadamente llamadas cromómeros. aunque es un término pocusado} que van de -0.51-lm de ancho la más grande a - 0 .05 pm la más pequeii.a (ésta es distinguib.t sólo por microscopia electrónica) y que contiener la mayor parte de la masa del DNA; se tiñen inter.sameme con los reactivos apropiados. las regione-o in[ermedias son menos susceptibles a la tindón y Se denominan interbandas. El conjunto de D. mei.·nogasier riene -5 000 bandas. Los centrómeros de los cuatro cromosomas de D. melanogaster se suman para formar un crornocentro constituido sobre todo por heterocromatina (e;el macho inclu ye el cromosoma Y completo}. A es.t respecto, -75% del conjunto de DNA haploide ~ organiza en bandas e interbandas alternadas. co:una longitud de -2 000 pm. Extendido, el DNA llegaría a los -40 000 ¡Jm, de manera que la razón de empaquetado sería de -20, con lo que se demuestra vividamente la extensión del materia l genétic respectO de los esrados normales de la cromatina át interfase o cromosomas mitóticos.

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Los cromosomas politénicos de D. me/onogaster forman una serie alternante de bandas e interbandas. Imagen cortesía de José Bonner, Indiana University.

¿Qu é estructura tienen esos cromosomas gigantes? Cada uno es producido por replicaciones sucesivas de un par diploide en sinapsis, pero las réplicas no se separan, se mantienen unidas en estado extendjdo. Al inicio del proceso, el contenido de DNA de cada par de sinapsis es de 2C (donde C representa el contenido de DNA del cromosoma individual), que entonces se duplica hasta nueve veces, para llegar a un máximo de 1 024C. El número de duplicaciones es diJerente en los diversos tejidos de las larvas de D. melanogaster. Cada cromosoma se ve como un gran número de fibras paralelas longilUdinales, muy condensadas en las bandas y menos en las interbandas. Es posible que cada fibra represente un solo cromosoma haploide (C), lo cual da lugar al nombre de politénico, el grado de politenia corresponde al número de cromosomas haploides comenidos en el cromosoma gigante. El patrón de bandas es característico de cada cepa de especies de Drosophila. El número constante y la disposición lineal de las bandas se observó por primera vez e n el decenio de 1930, cuando se detectó que form an un mapa citológico de los cromosomas. Las reestructuraciones, como dclcciones, inversio · nes y duplicaciones, resultan en modificaciones en el orden de las bandas. El arreglo lineal de las bandas es equipa rable al correspondiente de los genes, de modo que las reestructuraciones genéticas, según se observa en un mapa de enlace, pueden correlacionarse con las estructurales de Jos mapas citológicos. En última •nstancia, se puede localizar una mutación determinada en una banda en panicular. El número total de genes de D. melanogaster supera al número de bandas, de manera que probablemente hay genes múltiples en casi todas las bandas. La posición de genes específicos en el mapa dtológico suele determinarse directamente por la 28.~

Célula dlanéL_

1~\ Las zonas negras corresponden a granos de plata e identifican los sitios en que hubo hibridación de la sonda Mediante hibridación in situ es posible identificar bandas individuales que contienen genes particulares.

técnica de hibridación in situ. cuyo protocolo se resume en la . Una sonda radioactiva que repre~enta a un gen (con mucha frecuencia un don de DNAc marcado, derivado del RNAm) da lugar a la hibridación con el DNA desnaturalizado de los cromosomas politénicos in situ. Mediante autorradiografía se identifican las posiciones de los genes correspondientes por la superposición de granos en una o varias bandas específicas; véanse los ejemplos de la . Recientemente las sondas f1 uorescentes han sustituido a las radioactivas, que facilitan la determinación directa de la banda en la que yace una secuencia en panicular.

Los cromosomas politénicos se expanden en sitios de expresión génica Concepto principal • Las bandas son sitios de expresión génica en cromosomas politénicos que se expanden para dar lugar a "abultamientos".

Una de las características intrigantes de los cromosomas politénicos es que los sitios reactivos son visibles. Algunas de las bandas pasan transitoriamente por un estado de expansión en el cual simulan un a bultamiento en el cromosoma, cuando material

Los cromosomas politénicos se expanden en sitios de expresión génica

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·. El cromosoma IV del insecto C. tentans tie--= tres anillos Balhiani en la glándula salival. Reprod1.1cido de Ce . vol. 4, Danehol:, 8., et al., Transcription in polyte.'1e chromos:mes .. ., pp. 1-9. Copyright 1975, con autorización de Elsevie· Imagen cortesía de Bertil Daneholt, Medical Nobellnstitute. Vista amplificada de las bandas 87 A y 87C en que se observa la hibridación in situ con DNA marcado, extraído de células con choque térmico. Imagen cortesía de José Bonner, Indiana University.

cromosórnico es expulsado desde el eje . En la se observan abultamiemos muy grandes (llamados anillos de Balbiani). ¿Cuál es la nalUraleza del abultamiento? Consta de una región en que las fibras cromosómicas se desenrollan respecto de su estado usual de empaqueta· miento en las bandas, aunque mamienen su conti· nuidad con el eje cromosóm.ico. Los abultamientos suelen emanar de bandas únicas. si bien, cuando son muy grandes, como los anillos de Balbiani, el au mento de volumen puede ser de tal magnitud, que oculta la disposición de las bandas subyacemes. El patrón de abultamientos se relaciona con la expresión génica. Durante el desarrollo de las larvas. los abultamientos aparecen y remiten con un patrón definido, específico de tejido, de manera que, en un momento dado, se observa un patrón característico en cada tejido. Los abultamientos son inducidos por la hormona ecdisoma, que controla el desarrollo en el género Drosophila e induce algunos directamente, m ientras que otros. son inducidos de manera indi recta por los productos de los primeros. Los abultamientos son sitios en que se está SÍI1Ceti· zando RNA. El concepto aceptado hél sido que la expansión de la banda es consecuencia de la necesidad de relajación de la estructura para sintetizar RNA. Por tanto, es posible considerar a los abultamientos como consecuencia de la transcripción, un gen activo único puede generar un abultamiento. 744

CAPÍTULO 28 Cromosomas

Los sitios de abultamiento difieren de las banda• normales en la acumulación de proteínas adicionales, por ejemplo, la polimerasa II de RNA y otra . vin culadas con la transcripción. Las caracLerísticas de los cromosomas en escob:Uón y politénicos sugieren una conclusión genera Para ser transcrito, el material genético se disperSE respecto de su estado usual de empaquetado densr la duda es si esa dispersión en el ámbito macrosco· pico del cromosoma emula los sucesos que ocurre:. en el ámbito molecular de la masa de eucromatú1a de interfase ordinaria. ¿Las bandas de un cromosoma politénico tíene:un significado fundonal? Es decir, ¿corresponde ' cada banda a un tipo de unidad genética? Se podría pensar que la respuesta es inmedjaLamenLe evidente a partir de la secuencia del genoma de la mosca porque mediante el mapeo de interbandas con la secuen<:ia sería posible determinar si en a lguna "' tipo de identidad es fijo , pero hasta ahora no se h¡¡ encontrado un patrón que apunte a un significad1 funciona l de las bandas.

El cromosoma eucariótico es un dispositivo de segregación Conceptos principales • Un cromosoma de eucariota se mantiene en el huso mitótico por unión de microtúbulos al cinetócoro, que se forma en su región centromérica. • Los centrómeros a menudo tienen heterocromatina rica en secuencias de DNA satélite.

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Mtcrotúbulos

Los cromosomas sufren tracción hacia Los polos a través de microtúbulos que se unen a los centrómeros. Las cromátides hermanas se mantienen juntas hasta la anafase, mediante protefnas (cohesinas). EL centrómero se muestra aquí a la mitad del cromosoma (metacéntrico), pero puede localizarse en cualquier sitio, a todo lo largo, incluso cerca del extremo (acrocéntrico) y en el extremo (telocéntrico).

Durante la m itosis, las cromálides hermanas se cürigen a polos opucsLos de la célula, movimiento que depende de la unión de los cromosomas a los microtú bulos, conectados a los polos en el otro extremo. (Los microtúbulos constituyen un sistema filamentoso celular que se reorganiza durante la mitosis, de manera que conecre los cromosomas con los polos de la célula.) Los sirios de las dos regiones en que se organizan los extremos de los microtúbulos, cerca de los centriolos, en polos y cromosomas, se llaman MTOC (centros de organización de microtúbulos). En la se ilustra la separación de las cromátides hcrmanac; conforme avanza la mitosis de metaiase a telofase. La región del cromosoma encargada de su segregación en la mitosis y la meiosis se llama centróm ero. La región centromérica de cada cromátide hermana está sujeta a tracción por los microtúbulos hacia el polo opuesro. y para opo nerse a esa fuerza motriz, las proteínas "goma". llamadas cobesi nas, mamient::n juntas a las ero m á ti des hermanas . Inicialmente, las cro mátides hermanas se separan en sus centrómeros y después se suel tan completamente una de otra durante la anafase, cuando las cohesinas se fragmentan. El cenrrómero es sometido a tracción hacia el polo durante la mitosis y el cromosoma adherido a él es Narrastrado'', de modo que éste constituye el dispositivo de unión de gran número de genes con el aparato para la división. Dicho aparato contiene el sitio en que las cromátides hermanas se mantienen jumas antes de la separación de cromosomas individuales, que en la fot~grafía de la Figura 28.11 se muestra como una región comprimida que conecta los cuatro brazos del cromosoma; las cromátides hermanas se encuentran en la etapa de metafase de la mitosis. El cenrrómero es indispensable para la segregación, según se observa por el comportamiento de los cromosomas que se han roto. Una sola rotura

genera un sitio que retiene el centrómero y un fragm ento acéntrico. que carece de él. Este último no se une con el huso mitótico y, como resultado, no puede incluirse en ninguno de los n úcJeos de células hijas. (Cuando el movimiento cromosómico depende de cemrómeros bien definidos, sólo p uede haber un cemrómero por cromosoma, pero si las translocaciones generan cromosomas con más de un centrómero, en la mitosis se lorman estructu ras aberrames debido a que los dos cemrómeros de la misma cromátide hermana han sido arrastrados hada cüfercntes polos. rompiendo así el cromosoma_ No obstante, en algunas especies los cenu-ómeros son "dift1sos", y la situación, diferente. En el ámbito molecular sólo se han analizado centrómeros bien definidos.) Las regiones que flanquean a l centrómero suelen ser ricas en secuencias DNA satélite y presentan una cantidad considerable de heterocromatina. pero todo el cromosoma está condensado, de manera que la heterocromatina centromérica no es de inmediato evidente en Jos cromo:;ornas mJtóticos, pero puede observarse mediante una técn ica que genera bandas e_ En el ejemplo de la , todos los cenLrómero~ se muestran como regiones de tindón intensa. Aunque esto es común, la heterocromatina no es identificable en torno a todos los centrómeros conoddos, lo cual sugiere que probablemente es in dispensable para el mecanismo de división. La región del cromosoma en que se forma el ccmrómero se define por secuencias de DNA (si bien se ban definido en muy pocos casos}. El DNA centromérico se une a proteínas es-pecíficas encargadas de establecer la estructura que une el cromosoma con los microtúbulos. estructura llamada cinetócoro, que es un objetO fibroso de tinción intensa con diámetro o 1ongiwd de -400 nm. El cinetóco ro proporciona el MIOC de un cromosoma.

28.12 El cromosoma eucariótico es un dispositivo de segregación

745

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Las bandas C generan una tinción intensa en los centrómeros de todos los cromosomas. Imagen cortesía de Lisa Shaffer, Washington State University-Spokane.

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1

Proteínas de unión con el centrómero El centrómero se identifica por una secuencia de DNA que se une a proteínas específicas. Dichas proteínas no se unen a los microtúbulos, sino que establecen el sitio en que las proteínas de unión de microtúbulos, a su vez, se unen .

La muestra la jerarquía de organización que conecta el DNA centromérico con los microtúbulos. Las proteínas unidas al DNA centromérico se adh ieren a otras que. a su vez, se unen con los microtúbulos (véase la sección 28 .15. El cemrómero se une a un complejo proteínico).

Los centl'ómeros pueden

contener DNA repetitivo Conceptos pnncipales • los centrómeros de los cromosomas de eucariotas superiores contienen grandes cantidades de DNA repetitivo. Se desconoce la función del DNA repetitivo.

7 46

CAPÍTULO 28 Cromosomas

Para que el centrórnero funcione, el DNA debe k bastante largo. (Los elementos conos bien definidt de Saccharomyces cerevisiae pueden ser una excer ción a la regla general.) Los casos en que es pos.ble comparar secuencias específicas del DNA ct la región centromérica, suelen incluir secuend ? repetitivas. Hasta ahora, S. cerevisiae es el único caso en qu e1 DNA cemromérico puede identificarse por su capacidad de conferir estabilidad en plásmidos. S~r embargo, con la levadura Schizosaccharomyces pom:· de sólo tres cromosomas, se ha utilizado un enfoq ~ relacionado, y la región en que se encuentra ca~ cemrómero se identificó por deleción de la ma~ · parte de la secuencia de cada cromosoma para cree. un minicromosoma estable. Mediante ese aborda·: se localiza a los centrómeros en regiones de 40 a 1 ~ kb, que consisten en DNA parcial o completamen: repetitivo, No se sabe bien a bien qué tanto de cae.· una de esas regiones más bien largas se necesi· para la segregación de cromosomas en la mitosis la me!osis . Los intentos para local iza r funciones centrorr:e· ricas en cromosomas del género Drosophila sugiere que se dispersan en una gran región conslituida r 200 a 600 kb. El gran tamaño de ese tipo de ce:-trómero sugiere que es posible que contenga n rías funciones especializadas, incluidas secuen C'~ necesarias para el ensamblaje del cinetócoro y e apareamiento de cromátides hermanas. En el género Ambidopsis, el tamaño del cetrómero es comparable; cada uno de los cinco cr mosomas tiene una región cent.romérica en la cu_ prácticamente se ha suprimido l.a recombinadóque ocupa >500 kb. Obviamente incluye al cen tr> mero, pero no se cuenta con i11formadón direc- ~ respecto de cuánto se necesita de él. En esas regi nes hay genes expresados, lo cual hace dudar r<::' pecw de si toda la región es parte del centrómer En el centro de la misma se encuentra una serie ~ 180 bp repetidos, el tipo de est1·ucrura que suele n . Jacionarse con Jos centrómeros. Es muy pronto par· decir cómo se relacionan dichas estructuras con función del cennómero. En los primates, el segmento primario que L . cluye la heterocromatina de los centrómeros es DNA a satélite, que consta de arreglos seriados ... unidades de repetición de 170 bp. Hay varian i~ significativas entre las repeticiones, si bien las : . cualquier centrómero tienden a relacionarse me~ entre sí que con miembros de la familia de otr.;. localizaciones. No hay duda de que las secuenc.= necesarias para la función del cenrrómero resideen bloques de DNA satélite a., pero no se sabe esas mismas secuencias satélite a llevan a cabo _ función o llevan incrustadas ouas secuencias.

TCACATGATGATAmGATTTTAnATATTTTTAAAAAAAGTAMAAATAMMGTAGmATTTTTAMAAATAAAAmAAMTA mCACAAAATGAmCCGM AGTGTACTACTATAAACTAAAATAATATAAAAAnTTTTTCATTTTTTATTTTTCATCAAATAAAAATTTTTTATTTTAAATTnATAAAGTGTTTTACTAAAGGCTT CDE-1 CDE-11 SG-90 bp, >90% A + T CDE-111

Por las homologías de secuencia entre elementos CEN de levaduras es posible identificar tres regiones conservadas.

Las secuencias de DNA de los centrómeros de S. cerevÍsiae son cortas Conceptos principales • En 5. cerevisiae, los elementos CEN se identifican por la capacidad de permitir que un plásmido se segregue de manera precisa en la mitosis. • Los elementos CEN consisten en las secuencias cortas

conservadas CDE-I y CDE-III, las cuales ft.anquean una región CDE-III rica en A-T.

Si una secuencia centromérica del DNA se encarga de la segregación, cualquier molécula que porte esa secuencia debería Lrasladarse apropiadamente en la división celular, en tanto que cualquiera que caredcra de ella, debería fracasar en la segregación. Este pronóstico se ha usado para aislar el DNA centromérico en la levadura S. cerevisiae. Los cromosomas de las levaduras no muestran cinetócoros visibles comparables con los de eucarioras superiores, pero de todas formas se dividen en la mitosis y se segregan en la meiosis por los mismos mecanismos. La ingeniería genética ha permitido producir plásmidos de levaduras que se replican como las secuencias cromosómicas (véase la sección 15.8, Los orígenes de la replicación pueden aislarse en las levaduras), pero son inestables en la mitosis y la meiosis y desaparecen de gran parte de las células porque se segregan de manera errática. Los frag mentos de DNA cromosómico que contienen centrómeros se han aislado por su capacidad de conferir estabilidad mirótica a esos plásmidos. Un fragmento de regiones de DN A centromérico (CEN) se identifica como la secuencia mínima susceptible de conferir estabilidad a tal plásmido . Otra forma de caracterizar la función de esas secuencias es modificarlas in vitro y después reintroducirlas en la célula de la levadura, donde, en el cromosoma, sustituyen al cenuómero correspondiente, Jo cual permite que las secuencias necesarias para la fu n dón del CEN se definan directamente en el contexto del cromosoma.

Un fragmento del CNE derivado de un cromosoma puede sustituir al cemrómero de orro cromosoma sin consecuencias aparentes, lo cual sugiere que los cemrómeros son imercambiables, se utilizan sendllamente para unir el cromosoma al huso y no se reladonan con la distinci6n entre un cromosoma y otro. Las secuencias requeridas para la función cen tromérica entran en una banda de -120 bp; la región centromérica está empaquetada en una estructura resistente a la nucleasa y se une a un solo microrúbulo, de modo que la región centromérica de S. cerevisiae se puede aprovechar para identificar a las proteínas que se unen a l DNA del cemrómero y a las que conectan al cromosoma con el huso. Como se resume en la , en la región CENse pueden distinguir tres tipos de elementos de secuencia: • El eleme nto dependiente del ciclo celular (CED)-r es una secuencia de 9 bp que se conserva con variaciones menores en el límite izquierdo de todos los c~ntrómeros. • El CDE-ll corresponde a una secuencia >90% rica en A-T, de 80 a 90 bp, que se encuentra en todos los cenrrómeros, cuya función podria depender de su longitud, más que de la exactitud de la secuencia. Su constitución recuerda algunos DNA repetidos, conos y seriados (satélites) (véase la sección 6.12, Los satélites de los artrópodos tienen repetidones idénticas muy cortas) en los que la composición de las bases podría causar algunas distorsiones características de la estructura doble helicoidal del DNJ\. • El CDE-ID es una secuencia de ll bp muy conservada en el límite derecho de todos los centrómeros . Las secuencias a uno y otro lado del elemento están menos conservadas, y probablemente también sean necesarias para la función del centrómero. (El CDE-Ill podría tener más de 11 bp si resulta que las secuencias de los flancos ~on esenciales.) Las mutaciones en CDE-1 o CDE-Il reducen, pero no desactivan, la fun ción del centrómero, a diferencia de las mutaciones puntuales del CCG central de CDE-lTI que desactivan por completo al centrómero.

23. t. Las secuencias de DNA de los centró meros de S. cerevisioe son cortas

74 7

aD

El centrómero se une a un complejo proteínico

Conceptos principales • En CDE-II se forma un complejo proteínico especializado alterno a la estructura usual de la cromatina. • El complejo proteínico CBF3 que se une a CDE-III es indispensable para la función del centrómero. • Las proteínas que conectan esos dos complejos podrían proporcionar la conexión para Los microtúbulos.

¿Es posible identiiicM las prote[nas necesarias para la función de secuencias CNE? Hay varios genes en que las mutaciones afectan la segregación cromosómica y cuyas prOteÚ1as se localizan en los cemrómeros. La contribución de dichas proteínas a la estructura centromérica se resume en la Una estructura especializada de croma tina se sintetiza en la región CDE-II por su unión con una proteína llamada Cse4 que simula una de las h.iswnas que constituyen las subunidades básicas de la cromatina (véase la sección 31. 3, La heterocromatina depende de las interacciones con las histonas}. Una proteína llamada Mif2 puede también ser pane de ese complejo, o cuando menos, conectarse con él. Las Cse4 y MiJ2 tienen comrapanes localizadas en centrómeros eucarióticos superiores, CENP-A y CENP-C, lo cual sugiere que esa imeracción puede ser un aspecto universal de la estructura del cen trómero. La interacción básica consiste en el plegamiento del DNA en la región CDE-11 en tomo a un agregado proteínico; la reacción probable1,11ente se facilita con la aparición de un plegamiento irmínseco en la secuencia CDE-U. El CDE-f se une por medio del homodímero CBFt iJ.1teracción no esencial para e] funci0namienLO del centrómero, pero si no ocurre, disminuye la

CDE-1

CBF1

~::fSJZ\.fi' ~ Ctf19

f$'

Microtúbulos

Mcm21 Okpt

CDE-11 ~ Cse4 CBF3

l¿_"\L_"'C/ V ~ CDE-111

El DNA en CDE-II se enrolla en torno a un agregado proteínico que incluye Cse4p. El CDE-III está unido a CBF3, y el CDE-I, a CBF1. Esas proteínas se conectan a través del grupo de Ctf19, Mcm21 y Okpl. 7 48

CAPÍTULO 28 Cromosomas

fidelidad de la segregación cromosómica -lüx. 1.::complejo de 240 kD de cuan-o p roteínas llamad CBF3 se une a GDEffi, interacción, ésta sí, indispensable para la fundón del centrómero. Las proteínas unidas en CDE-1 y CDE-111 esta ~ conectadas entre sí y también con la estructura prcteínica enlazada en CDE-il por otro grupo de prote.J· nas (Ctfl9, Mcm2L OkpJ ). La conexión con el ro.:crorúbulo suele ser Uevada a cabo por ese complej< El modelo general sugiere que una estructu:-:proteínica que simula el bloque de estr uctura no:~ mal de la cromatina (nucleosoma) localiza alcor-p lejo qt1e se encuentra en el centrómero. El plegamiento del DNA en dicha estructura permite a }¿ proteínas unirse con los elementOs de Jos flan n para fo rmar parte de un solo complejo. Algunos d(' los componentes de éste (ral vez no los que se unedirectamente con el DNA) vinculan el centrómei con el microtúbulo. La estTuctura de los cinetóa ros probablemente siga un patrón similar y utilice compuestos relacionados en una amplia varieda • de organismos.

BID

Los telómeros tienen secuencias de repetición simples

Conceptos pñncipales • Para la estabilidad del extremo c(omosómico, se requiere el telómero. Un telómero consiste en una repetición sencilla en la que una cadena rica en C+ Atiene la secuencia C..,1 (A/ T),_..

Otra característica esencial de todos los cromosoma es el telóJnero, que "sella" su extremo. Se sabe qtn: debe ser una estructura especial porque los extremos cromosórnicos generados por rotura son "pegajosos" y tienden a reacciona r con otros cromosoma ~ en tanto los extremos naturales son esrables. Para identificar una secuencia telomérica s ~ pueden aplicar dos criterios: • Debe yacer en el extremo de un cromost-ma (o cuando menos en el extremo de UJ~.: molécula de DNA lineal auténtica). • Debe conferir estabilidad a una molécu.¿ lineal. El problema de encontrar un sistema que ofre:ca un análisis de la función ha llevado nuevamen:t al ámbito molecular utilizando levaduras. Todos ll. plásmidos que sobreviven en las levaduras (porqut poseen elementos ARS y CEN) son moléculas Ot DNA circulares, los lineales son inestables (porqu ~ se han degradado). ¿Una secuencia telomérica at; -

téntica de DNA podría conferir estabilidad a un plásmido lineal? Es posible idemificar los fragmentos de DNA de levaduras que demostradamcme se localizan en los extremos cromosómicos mediante dicho análisis, además de que una región del extremo de una molécula conocida de DNA lineal natural, el DNAr cxtracromosómico del género Tetrahymena, puede tornar estable un plásmido lineaJ de leva dura. Las secuencias teloméricas se han caracterizado a partir de una amplia variedad de eucariotas in[eriores y superiores. El mismo tipo de secuencia se encuemra en plantas y seres humanos, de modo que la construcción del celómero pa rece seguir un princip io casi universal. cons ta de una larga serie de secuencias repe tidas, seriadas y canas; dependiendo del organismo, pueden ser de l 00 a l 000 repeticiones. Todas la s secuencias teloméricas se pueden expresar con la lórm ula general C,(A /T)mdonde n> l y m, de 1 a 4 . En la se muestra un ejemplo genérico. Una propiedad inusual de la secuenda telomérica es la extensión de la cadena rica en G-T, para la cual, de 14 a 16 bases suelen constituir una sola cadena . La cola G se genera. quizá, debido a una fragmentación limitada específica de la cadena rica en C-A. Algunos indicios respectO de la forma de actuar de un telómero dependen de algunas ciertas propiedades in usuales de los extremos de las moléculas de ·DNA lineales. En una población de tripanosomas, varía la longitud de los extremos. Cuando se hace seguimiento a una célu la clon, el telómero crece de siete a 10 bp (una a dos repeticiones) por ge neración. Todavía más revelad or es el destino de los telómeros ciliados introducidos en las levaduras. Después de la replicación en éstas, se agregan repe-

ticio11es teloméricas de levaduras en los extremos de las repeticiones. de especies de Tetrahymena. La adición de repeticiones teloméricas en el excremo del cromosoma en cada ciclo de replicadón podría resolver el problema de la replicación de las moléculas de DNA lineal descrito en la sección 16.2, Los extremos del DNA lineal son un problema para la replicación. La adición de repeticiones por símesis nueva contravendría la pérdida de repeticiones resultante de la falta de replicación hasta el extremo del cromosoma. La extensión y el acortamiemo estarían en equilibrio dinámico. Si los tclómeros se prolongan (y aconan) conti nuamente, su secuencia exacta puede no ser de importancia. Todo lo que se requiere es que eJ e~tremo sea reconocido como un sustrato adecuado para la adición, lo cua l explica cómo funciona el telómero ciliado en las levaduras.

CCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAA GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT

1

CCCCAACCCCAACCCCAAS'

OGGGTTGGGGTTGGGGTIGGGGTTGOGGTTGGGGTT3'

Un telómero común tiene una estructura de repetición simple en la que una cadena rica en G-T va más allá de la cadena rica en C-A. La cola G es generada por una fragmentación limitada de la cadena rica en C-A.

AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG

. CO

.••• •.

... •. .·

•• 2

...

~-· :.

~··

La estructura cristalina de una secuencia corta de repetición del telómero humano forma tres cuartetos G apilados; el superior contiene la primera G de cada unidad de repetición y se apila sobre cuartetos que contienen la segunda G (G3, G9, Gl5 1 G21) y la tercera G (G4, GlO, G16, G22).

Los telómeros sellan los extremos de los cromosomas Concepto principal

• La proteína TRF2 cataliza una reacción en que la unidad repetida 3' de la cadena rica en G+ T forma un asa por desplazamiento de su homóloga en una región de flujo ascendente respecto del telómero.

Los fragmentos teloméricos aislados no se comportan como si tuvieran DNA monocatenario, má5 bien muestran movilidad elecrroforética aberrante y otras propiedades. Las bases de guanina tienen una capacidad in· usual para relacionarse emre sí. La cola monocate· na.ria rica en G del telómero puede formar "cuartetos" de moléculas de G, cada uno de los cual e~ contiene cuatro guaninas que fo rman enlaces d€ hidrógeno para formar una estructura plana. Cada l8.17 Los tetó meros sellan los extremos de Los cromosomas

749

En el extremo del DNA cromosómico se forma un asa. Imagen cortesía de Jack Griffith, University of North Carolina at Chapel Hill.

fllf!ftll

TRF2

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~

1

/.NiVNl\IAr'-¡JI~ _ ~_ Extremo S' 1

? ,

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\

~

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-IUV/v/'Uy

El extremo 3' del telómero de una sola cadena (TIAGGG). desplaza a las repeticiones homólogas del DNA dicatenario para formar el asa. La reacción es catalizada por TRF2.

guanina proviene de la posición correspondiente de una unión de repetición sucesiva TIAGGG. En la se muestra una organización basada en u na estructura cristalina reciente. El cuarteto ilustrado representa un vínculo entre las primeras guan inas de cada unidad de repetición y se apila sobre otro cuarteto que üene la misma organiza dón. pero se forma a partir de la segunda guanina de cada unidad de repetición . Una serie de cuartetos como éste podría api1arse en forma helicoidal. y si bien la formación de esa estructura da fe de las 750

CAPÍTU LO 28 Cromosomas

Los telómeros son sintetizados por una enzima ribon ucleoproteínica

Conceptos principales

5

~

propiedades desusadas de la secuencia rica en G vill·o, no demuestra, por supuesto, si el cuarteto se forma i11 vivo. ¿Qué características del telómero se encarga de la estabilidad del extremo cromosómico? En __ se observa que en el telómero se·fon~: un asa de DNA. La ausencia de cualquier extren: libre podría ser la característica clave para la estabL..zadón del ex tremo de1 cromosoma. La longitudpr medio del asa es de 5 a l O kb en células animale<: En la se muesn·a que el asa se ffJI:-ma cuando el extremo 3' del telómero de unas~. .: cadena (TIAGGG)n desplaza a la misma secuenc: en una región del telómero de flujo ascenden ~~ Esw convierte a la región doble en una estrucu.:· . del tipo del asaD, en la cual, una serie de repetic nes de TTAGGG se desplaza para formar una regicde una sola cadena y la cola del telómero se apart con la cadena homóloga. La reacción es caralizada por la proteína u unión del relómero TRF2, que con otras proteína_ crea un complejo que estabiliza los extremos cr mosómicos. Su importancia en la protección de : extremos depende de que la deleción óe TRF2 ~ lugar a reestructuraciones croroosórnicas.

• La telomerasa hace uso del3'-0H de la cadena telomérica G + T para cebar la sintesis de repeticiones seriadas de tipo TIGGGG . El componente RNA de la telomerasa tiene una secuencia que se aparea con repeticiones ricas en e+ A. • Una de las subunidades proteínicas es una transcriptasa inversa que utiliza al RNA como molde para la síntesis de la secuencia rica en G+ T.

El telómero tiene dos funciones: • La primera es proteger el extremo crom • sómico; cua1quier otro extremo del DK:-. por ejemplo, el generado por una rotu r-= dicatenaria, se conviene en blanco de 1· sistemas de reparación. Las célu las tiene q~ ser capaces de distinguir al telómero. • La segunda es permitir que el relómero extienda, de lo contrario, se hará más cor. con cada ciclo de replicación (porque l a~.. plicación n o puede iniciarse en el extren:. mismo).

Las prorefnas que se unen al telómero constitu yen la solución para ambos problemas. En }as levaduras, diferentes conjuntos de proteínas resuelven cada problema, pero ambos se unen con el relómero mediante la misma proteína, Cdcl3: • La proteína Sml protege contra la fragmentación (espedficameme contra cualquier extensión de la fragmentación de la cadena C-A que genera la cola G. • Una enzima telomerasa extiende la cadena rica en C-A. Esta actividad depende de dos proteínas con actividades auxiliares. como el control de la longitud de extensión. La telomerasa utiliza el extremo 3'- 0H de la cadena telomérica G + T como cebador de la síntesis de repeticiones seriadas TTGGGG, actividad que só lo necesi ta GTPd y TTPd. La telomerasa es una gran ribonucleoproteína que consta de un molde de RNA (codificado por TLCL) y una proteína con actividad catalítica (EST2). El componente de RNA corto ( 159 bases de longitud en el género Tetrahymena y 192 en el P..up/otes) incluye una secuencia de 15 a 22 bases, la cual es idéntica a dos repeticiones de la secuencia de repetición rica en C. Este RNA proporciona el molde para la síntesis de la secuencia de repetición rica en G. El componente proteínico de la telomcrasa es una subunidad catalílica que sólo puede actuar en el molde de RNA provisto por el componente de ácido nudcico. En la se muestra la acción de la telomerasa, enzima que avanza de manera discontinua; el molde de RNA es ubicado en el cebador de DNA. se agregan varios nucleóridos al cebador y después, la enzima se transloca para volver a empezar. La telomerasa es un ejemplo especialiLado de una transcriptasa inversa. enzima que simetiza la secuencia de DNA. en un molde de RNA {véase la sección 22.4, El DNA. vírico es generado por transcripción inversa). No se sabe cómo se ensambla la cadena complementaria del telómero {rica en C-A). pero se especula que podría sintetizarse mediante el extremo 3'-0H de una horquilla terminal G-T como cebador de la síntesis de DNA.. La telomerasa sintetiza las repeticiones individuales que se agregan a los extremos cromosómicos, pero. en sí, no controla el número de repeticiones. Otras proteínas participan en la determinación de la longitud del lelómero y pueden ser identificadas por los mutantes ESTl y EST3 de levaduras, en los cuales, la longitud del tclómero ha sido modificad<1. Estas proteínas pueden unir telomerasas, e influyen en la longitud del telómero controlando el acceso de la relomerasa a su sustrato. Se han encontrado proteínas que se unen a los telórneros en células de mamíferos, pero poco se sabe sobre su función.

Unión: el molde de ANA se aparea con el cebador de DNA 1 cebador de DNA

\

3'

' lTGGGGTJ:'GaGGTIG 3' AACCCCA. CCCCAN. ::X:CI\AC 3'

j

5'

S'

molde de ANA Polimerización: El molde de ANA dirige la adición de nucleótidos al extremo 3' del DNA 3'(dGTP

5' ...ITQGGGrrGGGGTTGe:t 3' ...AACCCCAACCCCAACC:CCAAC 5' 3' La polimerización continúa hasta el final de la regíon molde

3' 5' ..TIGGGGTIGGGGTIGGGG- rG

3' ...AACCCCA ·,cCCCAACr<::CAM AAC 3' 5' Trans•ocaCI()n· la enzima se lraslada al extremo 3' del molde

3'

5' ~ ..TIG_GGGtrGCiGGTIGGGG 3' ._.AACCCC S'

M 3'

C.

:::C~~'\C.

J

5'

~----------~~--~ La telomerasa se ubica a sí misma por apareamiento de bases ent~e el molde de DNA y el cebador de DNA unicatenario, que sobresale; agrega bases Gy Tal cebador, una a la vez, según el molde. El ciclo se inicia nuevamente cuando se ha agregado una unidad de repetición.

Cada organismo presenta un rango característico de longitudes teloméricas; son largos en los mamíferos (en general. de 5 a 15 kb en el ser bumano) y conos en las levaduras (unos -300 bp en S. cerevisiae). El mecanismo de control básico es que la probabilidad de que un telómero sea un sustrato de la telomerasa aumenta conforme se abrevia su longiwd; no se sabe si esto es un efecto continuo o si depende de que la longitud se reduzca respecto de alguna cifra crítica. Cuando la telomerasa actúa en un telómero, puede agregar vanas unidades de repetición. La forma intrínseca de acciÓI! de la en zima es disociar, después de agregar una repetición; la adición de varias unidades de repetición depende de orras proteínas que hacen que la telomerasa !leve a cabo más de un ciclo de extensión. El número de repetinones agregadas no influye en la longirud del telómero mismo, más bien es controlado con proteínas auxiliares que se vinculan con la telomerasa. Las características mínimas requeridas para que exista como cromosoma son:

2&.18 Los telómeros son sintetizados por una enzima ribonucleoproteínica

751

• Telómeros para asegurar la supervivencia. • Un cenrrómero para mantener la segregación. • Un origen para iniciar la replicación. Todos esos elementos se han conjuntado para estructurar un cromosoma artificial de levaduras (YAC), método que permite perpetuar secuencias ajenas, de ahí que el cromosoma sintético sea estable sólo si tiene más de 20 a 50 kb de longitud. Se desconoce el fundamenro de dicho efecto, pero la capaddad de construir un cromosoma sintético permite investigar la naturaleza del dispositivo de segregación en un ambiente controlado.

Los telómeros son indispensables para la supervivencia EnLOdas las células en proceso de división se observa actividad de telomerasa, la cual suele interrumpirse en aquéllas con diferenciación terminal que no se dividen. En la se muestra que si la telomerasa presenta mutación en una célula en esas condiciones, los telómeros se acortan gradualmeme en cada mitosis. Un ejemplo de los efectOs de ral mutación en las levaduras se ilustra en la en la cual, el telómero se acona de 400 a O bp en -120 generaciones. La pérdida de telómeros produce efectos nocivos. Cuando la longitud del telómero llega a O, a las células se les dificulta dividirse con éxito. Los intentos de división por lo general causan roturas y translocaciones de cromosomas, proceso que resulta en una mayor tasa de mutaciones, que en las

Telómero

Telómero

~ -=== ~

===~:==~ ~

L----- - - - - La mutación en la tetomerasa hace que tos telómeros se acorten en cada división celular. En un momento dado, la pérdida del telómero da lugar a rotura y reestructuración de los cromosomas. 752

CAPÍTULO 28 Cromosomas

trl1 de tipo silvestre trl1-deficiente

600

500 400 300

200

100

Divisiones 40

80

120

40

80

120

La longitud del telómero se mantiene en -35( bp en la levadura de tipo silvestre, pero por una mutación er el gen trt1 , que codifica el componente de RNA de la teto merasa, rápidamente acorta sus telómeros a una longitud de e Reproducida con autorización de Nakamura, T. M., et aL 1997 Science. 277:955·959. e 1997 AAAS. Imagen cortesía de Thcmas R. Cech and Toru Nakamura, University of Colorado.

levaduras se vincula con pérdida de la viabilidad · ocupación del cultivo predominantemente por células senescentes (alargadas, que no se dividen y que. en última instancia, mueren). Algunas células broran del cultivo senescente porque han adquirido la capacidad de extender su5 telómeros por una alternativa a la actividad de la telomera5a. Las supervivientes entran en dos gru pos, en uno de lo~ cuales, los cromosomas se han tomado circu lares, carecen de telómeros y, comt resultado, son independientes de la telomerasa . E otro grupo utiliza un entrecru;,:amiento inequitativo para extender sus telómeros ( ) . Eltelómero es una estructura de repetición, de manera que es posible que dos de ellos se alineen de manera errónea cuando los cromosomas se aparean. La recombinación emre regiones desiguales genera un entrecruzamiento inequitativo, como se muestra ames en la figura 6.1, en cuyo caso. la longitud de un cromosoma recombinante aumenta. mientras que la del otro disminuye. Las células suelen suprimir el entrecruzamiento inequitauvo por sus consecuencias potencialmente nocivas mediante dos sistemas. uno de eUos. proporcionado por las proteínas de unión con relómeros. En .as levaduras, la frecuencia de recombinación enrre telómeros aumenra por deleción del gen tazl que codifica una proteína reguladora de la actividad

de telomerasa. El segundo es un sistema general qu e repara el apareamiento erróneo. Además de corregir pares de bases apareadas erróneamente que podrían surgi r en el DNA, e~ t e sistema suprime la recombinación entre regiones erróneamente apareadas, como se muestra en la figura 28. 34, incluidos los telómeros. En caso de mutación. un mayor porcentaje de las levaduras con deficiencias de telomerasa sobrevive a la pérdida de los telómeros porque la recombinación entre ellos genera algunos cromosomas con telómeros más largos. Cuando se cullivan células eucarióticas. suelen dlvidirse Lln número fijo de generaciones y después. entran en senescencia, tal vez por una declinación de la longitud del telómero por la falta de expresión de la telomerasa . La célula entra en una crisis que algunas superan, pero por lo general estas últ imas presentan reestructuraciones cromosómicas resultado de la fa lta de protección de los extremos cromosómicos. Dichas reestructuraciones pueden dar lugar a mutaciones que conrrib~tyen al estado tumorigénico. La ausencia de expresión de la relomerasa en esas circunstancias se debe a una falta de expresión del gen, y la reactivación de la enzima es uno de los mecanismos por lo que dichas células pueden sobrevivir de manera continua en cultivo (que obviamente no era una opción en los experimentos con levadu ras en los cuales había antecedentes de deleción del gen).

m:D

Resumen

El material genético de todos los organismos y virus adopta la forma de nucleoproteínas estrechamente empaquetadas. Algunos genomas víricos se insertan en vtriont's preformados, en tanto que otros ensamblan una cubierta proteínica en torno al ácido nudeico. El genoma bacteriano forma un denso nucleoide de -20% de proteína por masa, pero se desconocen los detalles de la interaccíón de las proteínas con el DNA. El DNA está o rganizado en -100 dominios que mantienen un superenrolla rnienro independiente, con una densidad de superh élices no resrríngidas correspondiente a -1/100 a 200 bp. En eucarioras, la cromatina de interfase y los cromosomas de merafasc pa recen organizados en grandes asas, cada una de las cuales puede ser un dominio superen rollado de manera independiente. las bases de las asas se conectan a un bastidor de metafasc o a la matriz nuclear mediante sitios específicos del DNA. Las secuencias con transcripción activa residen en la eucromarina, que constituye la mayor pane de la croma tina de interfase. Las regiones de he -

L'St's~léMfiti€;)"~1

apareamrenlo erróneo supr.men el entrecruzamlemo entre tel6melros

Se prot!uce entrecruzamoenro cuanoo 1\0 se ,...r~:~::: epa r= a= el= apa = re= amr =-e~:=n= to=e= rró=neo ===

X

El entrecruzamiento en las regiones teloméricas suele ser suprimido por los sistemas de reparación de apareamiento erróneo, pero puede ocurrir cuando se presenta una mutación. El suceso de entrecruzamiento inequitativo extiende el telómero de uno de los productos, permitiendo que el cromosoma sobreviva en a1,.1sencia de la telomerasa.

tero cromatina están empaquetadas -5 a 1Ox, más compactadas. y son inenes en cuamo a la transcripción. Toda la cromatina se empaqueta densamente durame la división celular. cuando es posible distinguir cada uno de los cromosomas. La producdón de bandas G mediante tratamiento con el colorante Giemsa es indicio de la existenda en los cromosomas de una infraestructura reproducible. Las bandas son regiones muy grandes (-107 bp) que pueden utilizarse para localizar translocaciones cromosómicas u otros cambios comiderables en la estructura. Los cromosomas en escobillón de los anfibios y los politénicos de los insecws tienen estructuras inusualmcmc amplias, con razones de empaquetamiento <100. Los cromosomas politénicos de D. melanogaster se dividen en casi 5 000 bandas, cuyo tamaño varía en magniwd con un promedio de - 25 kb. También se o bservan regiones con actividad transcripcion al en estructuras aún más desplegadas (con ''abultamientos'') donde se expulsa material del eje del cromosoma, proceso que podría simular los cambios que ocurren en menor escala cuando se transcribe una secuencia en la eucromatina. La región cenrromérica contiene el dnetócoro, encargado de unir el cromosoma con el huso mirótico. El centrómero suele estar rodeado de heterocromarina. Las secuencias centroméricas se han identificado sólo en la levadura S. cerevisiae, donde constan de elementos conservados cortos, CDE-I y CDE -m . que se unen a CBFI y al complejo CBF3, respectivamente, así como una región Larga, rica en A-T. llamada CDE- rr. que se une a Cse4 para formar una estructura especializada en la cromatina . Otro gmpo de proteínas que se une a ese ensamblaje proporcion a la conexión con los microtúbulos.

2&.2v Resumen

753

Los telómeros proporcionan estabilidad a los extremos de los cromosomas, y casi todos los conocidos constan de múltiples repelidones, en las cuales una cadena tiene la secuencia general C,(A/T)m, donde n>l y m= 1 a 4. La otra cadena G 11 (T/A) 11, tiene un extremo único que sobresale y aporta un molde para la adición de bases individuales en un orden definido. La enzima relomerasa es una ribonucleoproteína cuyo componente RNA proporciona el molde para la síntesis para la cadena rica en G, con lo cual se resuelve el problema de la imposibilidad de replicación en el exrremo de una cadena doble. El telómero estabi liza el extremo del cromo soma porque la cadena ú nica colgan te G,(T /A) 111 desplaza del lelúmero a su homóloga en uni dades de repetición p revias hasta forma r un asa, de manera que no haya extremos libre s.

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Nucleosomas ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción

fi1EI

UD EL nucleosoma es la subunidad de la cromatina • La nucleasa de micrococos libera los nucleosomas de la cromatina como partlculas de 115. • Un nucleoso ma contiene -200 bp de DNA y dos copias de cada histona medular (H2A, H28, H3 y H4). • Et DNA envuelve la superficie externa del octámero de proteínas.

El DNA está enrollado en la estructura de los nucleosomas

• Las fibras de cromatina de 10 nm se despliegan a partir de fibras oe 30 nm y constan de una cadena de nucleosomas. • las fibras de 30 nm tienen seis nucleosomas por giro organizados en un solenoide. • la histona Hl es necesaria para la formación de la fibra de 30 nm.

•·

• >95'1o del DNA se recupera en nucteosomas o multímeros

Los nucleosomas tienen una estructura común

6111

i!llD ¿Los nucleosomas yacen en posiciones específi cas? • Los nucleosomas pueden forma rse en posiciones especificas como resultado de la estructura local del DNA o de las proteinas que interactúan con secul?ncias específicas. • la causa m~s frecuente de la posición del nucleosoma es el \Imite impuesto por las proteínas que se unen al ONA. • E.l posicionamiento influye en qué regiones del DNA quedan en el enlace y qué cara del DNA se expone a la superficie del nucleosoma.

La estructura del DNA varía en la superficie del nucleosoma • El DNA te da 1.65 vueltas al octámero de histonas. • La estructura del ONA se modifica de manera que tiene un número mayor de pares de bases por giro en la parte media, pero menor en los extremos.

BD La periodicidad del DNA cambia en el nucleosoma • Con el cambio en bp por giro se absorben -o.6 giros negativos del ONA, de 10.5 en solución a un promedio de 10.2 en la superficie del nucleosoma, lo cual explica la paradoja del número de enlaces.

fJ!D1 ¿Los genes transcritos se organizan en nucleosomas? • los nucleosomas se encuentran a la misma frecuencia cuando los genes transcritos o no transcritos son digeridos con nucleasa de micrococos. • Algunos genes intensamente transcritos parecen casos excepcionales desprovistos de nucleosomas.

Organización del octámero de histonas • El meollo del octamero de histonas está constituido por un tetr~mero, H3 2·H4 2 vinculado con dos dímeros H2A·H2B. • Cada histona presenta interdigitación intensa con su contraparte. • Todas las histonas medulares tienen el segmento estructural de pliegue. Las colas terminales N salen del nucleosoma.

La replicación de la cromatina requiere del ensamblaje de los nucleosomas • Los oct¿meros de las histonas no se conservan durante la replicación, a diferencia de los dímeros H2A-H2B y los tetrámeros H3¡"H4r • Hay diferentes vías para el ensamblaje de los nucleosomas durante la replicación e independientemente de ésta. • Para eliminar al ensamblaje de los nucleosomas, se requieren proteínas accesorias. • El CAF·l es una protelna de ensamblaje que se vincula con la subunidad PCNA del replicosoma; es necesaria para el depósito de los tetrámeros H3 2-H4 2 después de la replicación. • Para el ensamblaje independiente de la replicación se puede usar una proteína de ensamblaje diferente y una variable de la histona H3.

cuando la nucleasa de micrococos escinde el DNA de la cromatina. • La longitud del DNA por nucteosoma varía de tejido a tejido en un rango de 154 a 260 bp. • El DNA de los nucleosomas se divide en DNA medula· y DNA de enlace, dependiendo de su susceptibilidad a la nccleasa de micrococos. • El DNA medular tiene una longitud de 146 bp y se encuentra en las part!culas centrales producidas por digestión prolongada con la nucleasa de micrococos. • El ONA de enlace es la región de 8 a 114 bp susceptible de escisión temprana por la enzima. • Los cambios en la longitud del DNA de enlace explican las variaciones de la longitud total del DNA nucleosómico. • la H1 se vincula con el DNA de enlace y podría encontrarse en el punto en que el ONA entra y sale del nucleosoma.

La vía de los nucleosomas en la fibra de cromatina

fiiD

Los octámeros de histonas son desplazados por la transcripción • En un sistema modelo, la polimerasa de RNA desplaza a los octameros de hislonas durante la transcri pción, pero éstos Contintía en lo siguiente página

757

se unen nuevamente con el ONA tan pronto como ha pasado la polimerasa. Los nucleosomas se reorganizan cuando la transcripción pasa a través de un gen.

fDD

fmJ

el paso de una señal de activación.

Los sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa reflejan cambios en le estructura de la cromatina • En los promotores de los genes expresados hay s':-

El desplazamiento del nucleosoma y su reensamblado requieren factores especiales

•

Se necesitan factores auxiliares para que la polimerasa de RNA desplace a los octámeros durante la transcripción y para que después, las histonas se reensamblen en nucleosomas.

•

Los aislantes impiden la acción de los potenciadores y de la heterocromatína

. •

Los aislantes pueden impedir el paso de cualquier efecto activado r o inactivador desde los potendadores, silenciadores y LCR. Los aislantes suelen constituir barreras para evitar que la heterocromatina se expanda.

Los aislantes pueden definir un dominio • los aislantes son estructuras especializadas de !a

cromatina con sitios hipersensibles. Dos aislantes pueden proteger de todo efecto externo la región que los separa.

fl!m

Los aislantes pueden actuar en una dirección

•

Algunos aislantes tiene direccionalidad, de modo que pueden detener el paso de los efectos en una dirección, pero no en la otra.

Introducción La cromatina tiene una organización compacta en que casi todas las secuencias del DNA son esrructuralmente inaccesibles y están inacllvas desde el punto de vista funcional. En esta masa se encuentra la parte más pequeña de las secuencias acdvas. ¿Cuál es la estructura general de la cromatina y cuál la diferenda entre secuencias activas e inactivas? La elevada proporción general del empaquetad o del material genérico sugiere de inmediato que el DNA no puede empacarse directameme en la estructura general de la cromatina, debe haber jemrquías de organización. Bl diseí1o de la subunidad fundamental de la cromatina es el mismo en rodas las eucariotas; el nucleosoma

consta de -200 bp de DNA organizados en un octámero de proteínas básicas, pequeñas, cuya estructura simula cuentas. Los componentes proteínicos son las histonas, que forman una porción medular, y el DNA se encuemra en la superficie de la panícula. Los nucleosomas son un componente invariable de la eucromatina y la heterocromatina en el núcleo de imerfase, así como de Jos cromosomas mitóücos. El nucleosoma constituye el primer nivel de organización, con una razón de -6 de empaque. Sus componemes y estrunuras están bien definidos. El segundo nivel de organización es el enrollado de la serie de nuclcosomas en una disposidón heli· coidal para consLituir la fibra de -30 nm de diáme758

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

Los aislantes pueden variar en potencia • Los aislantes difieren en cuanto a eficacia para ir:-

hipersensibles. Estos sitios son generados por la unión de factore. de transcripción que desplazan a los octámeros rl: histonas.

Los dominios definen regiones que contie;~ genes activos • Un dominio que contiene un gen transcrito se de=-~

-.m

por su mayor sensibilidad a la fragmentación por ..= desoxirribonucleasa I.

Una LCR puede controlar a un dominio

•

.

Una LCR se localiza en el extremo 5' del dominio consta de varios sitios hipersensibles.

fD1I ¿Qué constituye un dominio regulador? Un dominio puede tener aislante, LCR y sitio de r a la matriz. asl como unidades de transcripción.

IUlJ Resumen

tro de Ja cromatina de interfase y los cremoso-~ mitóticos (véase Fig. 28.11 ). En la cromatina. la -_ zón de empaque del DNA es de -40. La estruc:de esa fibra requiere de proteínas adicionales, p. no ha sido bien definida. La proporción final del empaquetado depr del tercer nivel de organización, el empaque¡.: de la propia fibra de 30 nm. lo cual resulta en ._ razón general de empaquetado de -1 000 en la • croma tina, intercambiable cíclicamente con e los cromosomas miróticos, que alcanza una ra. genera l de -1 O 000 . En general, la beterocroma· tiene una razón de cn1paque de -10 000, ram la interfase como durante la m itosis. Para caracterizar los sucesos involucrados eempaque, la replicación y la transcripción del': se necesita dilucidar estos niveles de organizaG Se supone que el vinculo con proteínas adiciona o la modificación de las proteínas cromosóm' existentes se relaciOnan con el cambio de la esr::-_ cura de la cromatina, pero no se conocen las día específicas para el control del empaquetado óc~ Tanto replicación como transcripción implica"' desenrollado del DNA y, por tamo, deben inc. un despliegue de la estructura que permüa a enzimas importantes actuar sobre él, lo cual p blemente implicaría cambios en todos los nin: de organización. Cuando se replica la cromatina, los nude• mas deben replicarse en ambas moléculas hijas ·

::ue además de preguntarse cómo se ensambla el 1ucleosoma mismo, se debe inquirir qué pasa con as otras proteínas de la cromauna. La replicación • Jmpe su estructura, indicio de que representa un roblcma para las regiones de mantenimiento de '"-Struclllra específica y ofrece la oportunidad de mo~ificarla.

La masa de cromalina contiene hasta el doble de "'~roteinas que el DNA,

y casi la mirad de esa masa pro.eínica se encuentra en los nucleosomas; la masa del :\NA representa
111

El nucleosoma es la subunidad de la croma ti na

Concepto~

prinrirJales

• La nucleasa de micrococos libera los nucleosomas de La cromatina como partículas de 115.

• Un nucleosoma contiene -200 bp de DNA y dos copias de cada histona medular (H2A, H2B, H3 y H4). • El DNA envuelve La superficie externa del octámero de proteínas.

:uando se suspenden en una solución de poca po.encia iónica. los núcleos de interfase se hinchan y ·ornpen para liberar fibras de cromatina. En la se muestra un núcleo lisado con fibras dirigidas -¡ exterior. En algunas regiones, las fibras constan je material muy compacto. pero en las que se han rxrendido, se observa que están constituida!. de parlettlas bien definida~. los nucleo!>omas. En regiones

la cromatina que se derrama de los núcleos lisados consta de una serie de partículas muy compactas. l a barra mide 10 nm. Reproducida de Cell, vol. 4 Oudet. P., et al., Electron microscopic .. . pp. 281-300. Copyright 1975, con autorización de Elsevier. Imagen cortesía de Pierre Chambon.

la digestión de la cromatina con nucleasa de micrococos libera nucleosomas individuales. la barra mide 100 nm . Reproducida de Ce//, vol. 4 Oudet. P., et al., Electron microscopic... pp. 281-300. Copyright 1975, con autorización de Elsevier. Imagen cortesía de Pierre Chambon. especialmente extendidas, los nucleosomas están conectados por una cadena fina que corresponde a una cadena dohle de DNA libre. Una cadena doble continua

de DNA lrai!scurre por la serie de partículas. Si se trata la cromatina con la endonudeasa conocida como nucleasa de micrococos. que cona la cadena de DNA en la unión entre nudcosomas. se pueden obtener nucleosomas individuales; primero libera grupos de panículas y después nudeosomas independientes, que en la se ven como panículas compactas que se sedimen1an a - 11 S.

Elnucleosoma contiem -200 bp de DNA vinculadas con un octámero de histonas que co11Sla de dos copias de cada una de las hlstonas m edulares conocidas como 29 ? El nucleosoma es la subunidad de la cromatina

759

Eje de simetría H2A X 2 =28 kD

Q0 H28 X 2 =28 kD H3 X 2 = 30 kD

H4x 2

Proteína= 3.12 nm· Radio de giro

=22 kD Octámero de histonas

=

200 bp de DNA 130 kD Protefna total= 108 kD Longitud =67 nm

o-H1

ONA:5 2o~ =24kD

7

Dos giros de DNA, cada uno de 2 nm de diámetro, ocupan la mayor parte de la altura (6 nm)

11 nm

Los dos giros del DNA del nudeosoma es-EL nucleosoma consta de masas casi equivalentes de DNA e histonas (incluida Hl). La masa pronosticada del nucleosoma es de 242 kD.

muy juntos.

-El DNA ''sale"

~~--~~==--==~~~ B

______

Los sitios de 80 bp de separación en el DNA lineal se encuentran cerca del nucleosoma Las secuencias de ONA que yacen en dif~:?­ giros, rodea ndo al nucleosoma, pueden quedar muy junP....: EL nucleosoma puede ser un cilindro con el DNA organizado en dos giros en torno a su superficie.

H2A, H2B, H3 y H4, cuyo vínculo se ilustra esque-

máticamente en la . Con este modelo se explica la estequiometría de las histonas medulares de la cromatina: H2A, H2B, B3 y H4 están presentes en cantidades equimolares, con dos moléculas de cada una por cada -200 bp de DNA. Las histonas H3 y H4 son de las proteínas más conservadas que se conocen, lo cual sugiere que sus func iones son idénticas en todas las eucariotas. Los tipos H2A y H2B pueden reconocerse en todas las eucariotas, pero muestran variaciones de secuencia apreciables, específicas de cada especie. La h istona H l es un conjunto de proteínas estrechamente reladonadas con variantes apreciables entre tejidos y especies, y su panicipadón es diferente de la de las histonas medulares; por otra parte. la cantidad equivale a la mitad de la cantidad de una histona medular, además de que se puede extraer más fácilmente de la cromatina (en general con una solución salina diluida [0.5 M]) . La H1 se puede eliminar sin afectar la estructura del nucleosoma, lo cual sugiere que su localizadón en la partícula es extema. 760

CAPÍ TULO 29 Nucleosomas

La forma del nucleosoma corresponde a u r. co o cilindro plano de 11 nm de diámetro r : al tura . La longitud del DNA es de -34 nm, e¿ doble de la circunferencia de la partícula y sigue vía simétrica que rodea al octámero. En la se muestra un esquema de la vía del DNA e asa helicoidal que da dos giros en torno al ocrá,.,... cilíndrico. Nó tese que el DNA "entra" y "sale nucleosoma en punros cercanos. La histona E vez se localice en esa región (véase la sección .= Los nucleosomas tienen una estructura comú..Si se analiza este modelo en función de m: : transversal del nucleosoma, se observará, corr la , que las dos circunferencias de : yacen cerca una de la otra. La altura del cilin:de 6 nm, de los cuales, 4 son ocupados por do- _ del DNA (cada uno de 2 nm de diámetro). El patrón de dos giros posiblemente teng¿ secuencias func ionales . Un giro en torno al :1: soma requiere de -80 bp de DNA, por lo cu.: puntos separados por 80 bp en la doble hélice en realidad pueden estar cerca de la superfi.:--. nucleosoma, como se ilustra en la

Porción

Sedimentación

Porción

superior- - - - - - - - + inferior

Monómeros Dfmeros

\rrrmeros

\¡e~mer

Extracción de DNA y electroforesis

La nucleasa de micrococos digiere la cromatina los núcleos y produce una serie multimérica de bandas de JNA que pueden ser separadas mediante electroforesis en gel. :magen cortesía de Markus Nolt. Universitat Zürich. =r¡

a.

.J:J

El DNA está enrollado en la estructura de los nucleosomas

e

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Conceptos principales

'g> 1 000 o

• >950fo del DNA se recupera en nucleosomas o

...J

multímeros cuando la nucleasa de micrococos escinde el DNA de la cromatina. • La longitud del DNA por nucleosoma varia de tejido a tejido en un rango de 154 a 260 bp.

:::uando se digiere la cromatina con la enzima :1ucleasa de micrococos, el DN A es escindido en "'1últiplos integrales de una unidad de longiLUd. El ~accionamiento por electroforesis en gel revela la escalera" que se representa en la . Ta les :sea leras tienen - 1O escalones y la unidad de longiud determinada por los incrementos entre pelda:os sucesivos, es de -200 bp. En la se muestra que la escalera es -~nerada por grupos de nuclcosomas, que cuando .: fracdonan sobre un gradiente de sacarosa, arro~n una serie de picos bien definidos que correspon~n a monómeros, dímeros. trímeros y asf sucesi ameme. Cuando se extrae DNA de las fracciones y ~so mete a electroforesis, cada fracción resulta en :1a banda de DNA cuyo tamaño corresponde a un eldaño de la escalera de la nuclcasa de microcoIS . El nucleosoma monomérico contiene DNA de na unidad de longitud, el dímero de nucleosomas

800

600

400 200

Cada multímero de nucleosomas contiene el número apropiado de unidades de longitud de DNA. En la fotograña, las bandas artificiales simulan una escalera de DNA. la imagen se estructuró utilizando fragmentos de PCR cuyo tamaño corresponde al de las bandas reales. Imagen cortesía de Jan Kieleczawa, Wyeth Reserch.

contiene el doble de la unidad de longitud de DNA, y así sucesivamente. Cada peldai1o en la escalera representa al DNA derivado de un número definido de nucleosomas,

de modo que se considera que la escalera de 200 bp de cualquier cromatina indica que el DNA está organizado en nucleosomas. La escalera microcócica se genera cuando la enzima torna soluble en ácido (degradado hasta pequeños fragmentos) a sólo -2% del DNA del núcleo. Asf, un pequeño porcentaje del DNA atacado

específicamente, quizá represente regiones especialmente susceptibles. 29.3 El DNA está enrollado en la estructura de los nucleosomas

761

Cuando la cromatina se escurre del núcleo. a menudo se observa una serie de nudeosomas contctados por una cadena de DNA libre (cuentas ensartadas en un hilo), no obstame, la necesidad de compactación del DNA in vivo sugiere que probablemente haya poco DNA libre (si acaso). Este pumo de vista es confirmado por el hecho de que puede recuperarse >95% del DNA de la cromatina en forma de escalera de 200 bp. Así pues, casi todo el DNA debe estar organizado en nudeosomas. Es muy probable que en su estado nawraL los nucleosomas estén empaquetados estrechamente. con paso directo del DNA de uno al siguieme. Quizá la generación de DNA libre se deba a la pérdida de algunos octámeros de hislOnas durante su aislarniemo. La longitud del DNA del nucleosoma varía. en cierta forma. de la cifra "mual" de 200 bp. la cromatina de cualquier t ipo celular tlene un valor promedio característico (±5 bp) . No rmalmente. el promedio es de entre 180 y 200. pero hay extremos, apenas 154 bp (en un hongo) o hasta 260 bp (en espermatozoides del erizo de mar). El valor promedio puede ser diferente e.n cada tejido del organismo adulto, y tal vez haya diferencias entre diferemes panes del genoma en un solo tipo de célula. Las variaciones del genoma promedio incluyen secuendas repetidas seriadas, como los grupos de genes de RNA de SS.

flll

Los nucleosomas tienen una estructura com ún

Conrept os principales • El DNA de los nucleosomas se divide en DNA medular y DNA de enlace, dependiendo de su susceptibilidad a la nucleasa de micrococos. 4 El DNA medular tiene una longitud de 146 bp y se encuentra en las partículas centrales producidas por digestión prolongada con la nucleasa de micrococos. • El DNA de enlace es la región de 8 a 114 bp susceptible de escisión temprana por la enzima. los cambios en la longitud del DNA de enlace explican las variaciones de la longitud total del DNA nucleosómico. • La Hl se vincula con el DNA de enlace y podría encontrarse en el punto en que el DNA entra y sale del nucleosoma. Una estructura común subraya la cantidad variable de DNA contenida en los nucleosomas de diferentes fuentes. El vínculo del DNA con el octámero de hjstonas forma una panícula medular que contíent 146 bp de DNA, independientemente de la longitud del DNA del nucleosoma. La diferencia de 762

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

Pares

de bases 180 160 140

Tiempo de digestión La nucleasa de micrococos disminuye la te-de los monómeros de nucleosomas en pasos bien de=-lmagen cortesla de Roger Kornberg, Stanford U ni versi~ ~­ of Medicine. longitud total del DNA por nucleosoma se sur.. ne a esta estructura medular básica. La panícula medular es defin ida por los e _ de la nucleasa de micrococos en el nucleosom.; nomérico. La reacción inicial de la enzima es" entre nucleosomas. pero si se le pennire con- después de que se han generado monómen. giere algo del DNA del nucleosoma individua: una reacción e11 que el DNA es "recortado" .:: extremos del nuclcosoma. La longitud del DNA disminuye en etapas definidas. como se muestra en la . Enúcleos del hígado de rata, los nucleosomas r: méricos tienen inicialmente 205 bp de DNA • después del primer paso, e11 algunos monómelongitud del DNA ha disminuido a - 165 bp acaban por disnúnuir a la longitud del DNA partícula medular, 146 bp. (El cemro es razor ~ menle estable, pero la digestión continua gent.~ "producto limítrofe de digestión", en el cual, ICK mentas más largos del DNA central son de l4o los más pequeños, apenas 20 bp.) Este análisis sugiere que el DNA de los nu somas puede dividirse en dos regiones: • DNA medular. con una longitud inva:de 140 bp, y relativamente resisrem'" digestión por nudeasas. • DNA de enlace, que constituye el res· la unidad de repetición. Su longitud de apenas 8 bp a tantos como J 14 bnucleosoma.

El tamaño bien definido deJa banda de DNA generada por la escisión ímcial con la oucleasa de micrococos sugiere que la región inmediatamente disponible para la enzima está restringida y representa sólo pane de cada DNA de enlace. (Si la totalidad de éste fuese susceptible, la banda fluctuaría emre 146 y >200 bp.) Sin embargo. una vez que se ha hecho un co1te en el DNA de enlace. el resto de la región se torna susceptible y puede eliminarse relativamente rápido por acción enzimárica adicional. En La se representa la conexión entre los nuclcosomas. Las partículas medulares tienen propiedades parecidas a las de los nucleosomas mismos. si bien, son más pequeñas. Su forma y tamaño soo similares a los de los nucleosomas, lo cual sugiere que la geometría esencial de la partícula depende de las interacciones entre e l D NA y e l octá mero de pr oteínas. Las paniculas medulares se obtienen más fácilmente como grupo homogéneo. de modo que paTa estudios estrucwrales, a menudo se prefieren a los preparados de nucleosomas (que tienden a variar, pues es diffcil obtener una preparación en que no haya habido un recorte terminal del DNA) . ¿Cuáles son las características físicas de la región medular y la de enlace? Estos térmi11os se introdujeron

como definiciones operativas para describir las regiones m manto a su susceptibilidad relativa al tratamiento con nucleasas, pero dicha descripción no tiene implicadones acerca de su estruCtura real. de ahí que la mayor parte del DNA medular se encorva sobre el nudeosoma. en tanto que las Tegiones terminales de la porción medular y la de enlace están más extendidas (véase la sección 29.5, La estructura del DNA varía en la superficie del nucleosoma). La existencia del DNA de enlace depende de factores diferentes a las cuatro histonas medulares. Los experimentos de reconstitución in vitro muestran que estas últimas tienen una capacidad intrín seca para organilar el DNA en partículas medulares, pero no forman nudeosomas con la unidad de Iongil ud apropiada. El grado de superenrolJarniento del DNA es un factor importante. La histona Hl y las proteínas no histonas, o ambas, influyen en fa longitud del DNA de enlace vinculado con el octámero de histonas ~n una serie natural de nucleosomas. Las "proteínas de ensamblaje" que no forman parte de la estrucrura del nucleosoma, participan i11 vivo en la estructuración de los nudeosomas a partir de histonas y DNA (véase la secdó n 29.9, La replicación de la cromatina implica el ensamblaje de los nudeosomas). ¿Dónde está la histona H 1? Se perdió durante la fragmemadón de nucleosomas monoméricos, y si bien se puede retener en monómeros que aún tienen 165 de bp de DNA, siempre se pierde con la

Mononucleosomas Nucleosomas recortados

Partículas medulares

la nucleasa de micrococos corta inicialmente entre los nucleosomas. los mononucleosomas suelen tener -200 bp de DNA. los cortes terminales disminuyen la longítud del DNA primero a -165 bp y posteriormente generan partículas medulares de 146 bp.

reducción Onal a la partícula med\.1lar de 146 bp, lo cual sugiere que la Hl podría localizarse en la regjón del DNA de enlace. adyacente al DNA medular. Si la Hl está localizada en el DNA de enlace, podría "sellarlo" dentro del nucleosoma por unión con el punto en que el ácido nucleico entra y sale (véase la Fig. 29.4). la idea de que Hl yace en la región de unión de nucleosomas adyacentes es compatible con los antiguos resultados de que es la que más fácilmente se elimina de la cromaúna, y que la cromatina, sin H 1, es más fácilmente Hsolubilizada"'. Además, es más fácil obtener una fibra estirada a manera de cuentas ensartadas en un hilo cuando se ba eliminado la Hl.

Bll

La estructura del DNA varía en la su perficie del nudeosoma

frmc~p1os

principales

• El DNA le da 1.65 vueltas al octámero de histonas. • la estructura del DNA se modifica de manera que tiene un número mayor de pares de bases por giro en la parte media, pero menor en los extremos.

La exposición del DNA en la superficie del nudeosoma explica porqué es accesible a la escisión por cierras nucleasas. La reacción con las nudeasas que atacan a cadenas únicas ha sido especialmente informativa . Las cm.imas desoxirribonucleasas I y ll hacen hendiduras de una sola cadena en el DNA; fragmentan un enlace en una cadena. pero la otra se mantiene intacta en ese punto, de modo que los efectos no son visible en el DNA de doble cadena_ Sin embargo, con la desnaturalización se liberan fragmentos conos y no cadenas únicas de longitud total. Si el DNA ha sido marcado en sus extremos, se pueden identificar los fragmentos terminales por autorradiografia, según se resume en la . Cuando el DNA está libre en solución. pre-

29.5 la estructura del DNA varia en la superficie del nucleosoma

763

Hendidura Electroforesis

MarcaS'

Marca 5'

-

--

Fragmento marcado

)1

Cuando se desnaturaliza el DNA para dar cadenas únicas, se revelan hendiduras en el DNA de doble cadena por La presencia de fragmentos. Si el DNA se marca (digamos en los extremos 5', sólo los fragmentos 5' serán visibles mediante autorradiografía). El tamaño del fragmento identifica la distancia de la hendidura al extremo marcado.

Los sitios para las hendiduras yacen a intervalos regulares a lo largo del DNA medular, como se observa en el producto de digestión de núcleos por la desoxirribonucleasa I. Imagen cortesía de leonard C. Lutter, Henry Ford Hospital, Detroit, MI.

senta hendiduras (relativamente aleatorias). El DNA de los nudeosomas también puede ser modificado por las enzimas que le hacen hendiduras, pero sólo a intervalos regulares. Cuando los puntos de corte se determinan mediante DNA con marca radioactiva en Jos extremos, y después el DNA se desnaturaliza y somete a electroforesis, se obtiene una escalera del tipo que se muestra en la 764

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

El intervalo entre peldaños sucesivos de la escalera es de O a l l bases, y la escalera abarca todó la distancia del DNA medular. Los sitios de escisióJ: se numeran de SI a 513 (Sl está a -10 bases de. extremo 5' marcado, 52, a -20 bases, y así sucesivamente); las posiciones respecto de la hélice de DNA se ilustran en la No todos los sitios se cortan con igual frecueuda en algunos casos el cone es bastante eficaz, mientras que en otros, es apenas perceptible. Las enzimas desoxirribonudeasas I y II generan la misma escalera, si bien con algunas diferencias en cuanto a la intensidad de las bandas, lo cual demuestra que e: patrón de corte representa una serie única de diana5 en el DNA, determinada por su organización, cor. sólo una ligera preferencia por sitios particulares impuesta por cada enzima. El mismo patrón de corte se obtiene por escisión con un radical hidroxilo, lo cua apunta a que el parrón refleja la estructura del pNA mismo. más que preferencia de secuencias. La sensibilidad del DNA nucleosómico a las nucleasas es análoga a un experimento de rastreo, a5: que la falta de reacción en sitios diana específi cos es atribuible a la estructura del nucleosoma, en el cual ciertas posiciones del DNA se hacen inaccesibles. Hay dos cadenas de DNA en la partícula medular, de modo que en un experimento de marcado de extremos se incluyen los dos 5' (o 3'), uno en cadá cadena. Así. el patrón de corte incluye fragmento5 derivados de varias cadenas, lo cual se ilustra er. la Figura 29.11, en que cada fragmento eliquetadc proviene de una cadena diferente. El corolario es. que en un experimemo, cada banda marcada puede representar de hecho dos fragmentos generados por cone a la misma disrancia de cualquiera de los. extremos marcados.

¿Cómo, entonces, deberían interpretarse las preferencias definidas en siúos específicos? Un punto de vista es que la vía del ONA en la panícula es simétrica (casi un eje horizontal a través del nucleosoma, como se ilustra en la Figura 29.4); por ejemplo, si la desoxirribonudeasa l no generara un fragmento de 80 bases, ello significaría que la posición a 80 bases de distancia respecto del extremo 5' de cualquiera de las cadenas no es susceptible a la emima. El segundo esquema de liberación utilizado en la Figura 29. J3 reOeja ese punto de vista e identifica a 57 como sitio O, o centro de simetría. Cuando el DNA se inmoviliza sobre una superfide plana, los cortes resultan en sitios con separa ción regular. La sugiere qt1e dicho fe -

nómeno refleja la recurrencia del sitio expuestO con la periodicidadhclicoida[ de la [orma B del DNA. La periodicidad del cone (espaciado entre puntos de escisión) coincide con la periodicidad estructuxaL de hecho e'l reflejo de ella (el número de pares de bases por giro de la doble hélice), es dedr, la distanda entre sitios corresponde al número de pares de bases por giro. Las mediciones de ese tipo sugieren que un valor promedio para el DNA helicoidal de tipo B doble es de 1O. 5 bp/giro. ¿Cuál es la naturaleza de los sitios diana del nudeosoma? En la se muestra que cada sitio tiene de rres a cuatro po~iciones en que ocurre el corte, esto es, el sitio de corte se define ±2 bp, por lo cual representa una cadena cona de enlaces, en ambas cadenas, que está expuesta a la acción de la nucleasa en tres a cuatro pares de bases. Las intensidades relativas indican que se prefieren cienos sitios a otros. A partir de ese patrón, se puede calcular el p unto ''promed io" que se corta. En los extremos del DNJ\, los pares de sitios de 51 a 54 o deSlOa Sl3, distan entre sí 10.0 bases cada uno, micmras que en el centro de la partícu la, la separación de los sitios en tre 54 y 510 es de 10.7 bases (este análisis rrata con posiciones promedio, de manera que los sitios no necesariamcmc están separados por un número entero de bases). La variación rn la periodicidad del corte en el DNA medular ( 10.0 en los extremos, 10.7 a la mitad) significa que su periodicidad estructural difiere. El DNA tiene más bp/giro que la cifra correspondiente en solución en la pane media, pero menos bp/giro en los extremos. La periodicidad promedio sobre el nuclcosoma es de sólo 10.17 bp/giro, significalivamenre menor que la de 10.5 bp/giro del DNA en solución. La esrructura cristalina de la parúcula medular sugiere que el DNA se organiza en una superhélice plana de 1.65 giros en tOrno al octámero de histonas. El grado de inclinación de la superhélice varía,

Vtsta lateral

Vlsta superior

Dos esquemas de numeración dividen el ONA de la partícula medular en segmentos de 10 bp. Los sitios pueden numerarse de 51 a 513 a partir de un extremo. o tomando 57 para identificar la coordenada Ode la simetría doble, que puede numerarse de -7 a +7 .

las posiciones más expuestas del ONA se presentan con una periodicidad que refleja la estructura de la doble hélice. (Para mayor claridad se muestran los sitios de sólo una cadena.)

SS 54

El análisis de alta resolución muestra que cada sitio de la desoxirribonucleasa I consta de varios enlaces fosfodiéster adyacentes, susceptibles, según se observa en este ejemplo de sitios 54 y 55 analizados en partículas medulares con marca en los extremos. Imagen cortesía de leonard C. lutter, Henry Ford Hospital, Oetroit, MI. 29.5 La estructura del ONA varia en la superficie del nucleosoma

765

y eula pane media es discontinuo. Las regiones de gran curvatura se disponen de manera simétrica en las posiciones± l y ±4. que corresponden a 56 y $8, $3 y S 1 1 respectivamente, y son los sitios menos sensibles a la desoxirribonudeasa l. Una estructura de aira resolución del centro del nudeosoma muestra en detalle cómo se distOrsiona la estructura del DNA. Gran pane del superenrollado ocurre en los 129 bp cenuales. que hacen 1.59 giros superhelicoidales izquierdos con un diámetro de 80 Á (sólo cuatro veces el diámerro de la cadena dicatenaria del DNA). Las secuencias terminales de cualquier extremo hacen sólo una pequeña contribución a la curvatura general. EstOs 129 bp centrales se encuentran en forma de DNA -B, pero con una curvatura sustancial. necesaria para formar la supethélice. El surco mayor se dobla suavemente, pero el menor tiene ensortijados abruptos. cambios de con(ormación que explican porqué la parte central del DNA delnucleosoma no suele ser diana para la unión de proteínas regula doras, que suelen unirse a las partes terminales del DNA central o a las secuencias de enlace

La periodicidad del DNA cambia en el nucleosoma

El grado de superenrollamiento de los nuc;~ sornas individuales del minicromosoma se pue medir como se ilustra en la . En prirr término, las superhélices libres del minicromoso:mismo están relajadas, de manera que los nuclecmas forman una cuerda circular con una densi ... superhelicoidal de O. A continuación se e>.:uaen ocrámeros de hisronas, con lo cual se libera al n~· para que siga una vía libre. Las superhélices , estaban comprimidas en el minicromosoma apa cerán en el DNA desproteinado como - 1 giro, \ se puede medir el número total de superhélices • el DNA de SV40. La cifra observada se aproxima al número nucleosornas; el resultado será inverso cua!' los nucleosomas se ensamblan in vitro en un D_ de SV40 supcrenrollado, pues la formación de C? nucleosoma elimina -1 superhélice negativa. Así pues, el DN A sigue una vía en la superf del nucleosoma que genera -1 giro de superhé negativo cuando se elimina la proteína de rest:ción, si bien la vía que sigue el DNA correspor a -1.67 giros de superhélice (véase la Fig. 29discrepancia que a veces se denomina paradoja número de enlace. L1 discrepancia se explica por la diferencia er las 10.17 bp/giro promedio del DNA nucleosóm

Conce¡J(O principal,

Con el cambio en bp por giro se absorben -o.6 giros negativos del DNA, de 10.5 en solución a un promedio de 10.2 en la superficie del nucleosoma, lo cual explica la paradoja del número de enlaces.

La comprensión de la estructura del DNA nucleosómico tiene lugar cuando se comparan los pronósticos para el superenrollado de la vía que sigue el DNA con las mediciones re a les del superenrollado del DNA n ucleosómico. Gran parte de los trabajos sobre la estructma de los conjuntos de nucleosomas se ha hecho en el virus SY40, cuyo DNA es una molécula circular de 5 200 bp con una longitud de contorno de -1 500 nm. Tanto en el virión como en el núcleo infectado se empaqueta una serie de nucleosomas. que juntos se denominan minicromosoma. Como se aísla normalmente, la longitud del contorno del minicromosoma es de -210 run, que corresponde a una razón de empaquetado de -7 (esencialmente la misma que la de -6 del nucleosoma mismo) . Los cambios en la concentración de sales pueden convertirlo en un hilo de cuentas flexible, con una proporción mucho menor de empaquetado general. lo cual subraya el punto de que. in vilro, las tiras de nudeosomas pueden asumir más de una forma, dependiendo de las condiciones. 766

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

Minicromosoma superenrollado

1 Tratamiento con ~ topo1somerasa

Mínicromosoma relajado

¡

Eliminación de protefnas

DNA superenrollado

las superhélices del minicromosoma de sv~-: . pueden relajar para generar una estructura circular cuya pér: • de histonas genera entonces superhélices en el DNA libre.

· las 10.5 bp/giro del DNA libre. En un nucleoso de 200 bp se tienen 200/10.17 = 19.67 giros . .:uando el DNA se libere del nudeosoma, tendrá 200/10.5 = 19.0 giros. La vía del DNA en que el enrollado es menos compaclo, sobre el nucleosoma. absorbe -0.67 giros, lo cual explica la discrepancia entre la vía física de -1.67 y la mecUción de -J .o -giros superhelicoidales. De hecho, algo de la tensión por torsión en el DNA de los nucleosomas depende del aumento del número de bp/giro; sólo queda el resto para medirse como superhélice. ~a

Organización del octámero de histonas ·

En un modelo simétrico del nucleosoma, el tetrámero H3¿·H4~ constituye el centro de la estructura. En la parte superior se observa un dímero H2A-H2B; el otro está debajo.

Hasta ahora se ha analizado la estructura del nucleosoma desde la perspectiva de su organización en el DNAde la superficie, pero desde la perspectiva de Las proteinas, se necesita saber cómo interactúan las histOnas entre sí y con el DNA. ¿Heaccionan apropiadamente sólo en presencia de DNA o poseen una capacidad independiente para formar octámeros? La mayor parte de las prueba,s acerca de las interacciones histona-histona provienen de su capacidad para formar complejos estables y de experimentos de enlace cruzado con el nucleosoma. Las histonas medulares forman dos tipos de complejos; H3 y H4 forman un tetrámero (rl3 2-H42), l12A y H2B forman varios complejos, en particular un dímero (H2A-H2B). Se puede obtener octámeros de histonas íntegros por extracción de la cromatina o (más cUfídlmente), al permitir que las histooas se vinculen in vitro, en contlidones de concentración a1ta de sales y proteínas. El octámero suele d~sociarse para generar un hexámero de histonas que ha perdido un dímero H2A-H2B, en tantO que el otro se pierde separadamente en ese pumo, con lo que queda un tetrámero H3?.·H42 , fenómeno que apunta a uoCI forma de organización en que el nucleosoma tiene un "meollo" central constimido por el tetrámero H3 2 -H4.2; in vitro, este tetrámero puede organizar al DNA en partículas que m uesuan algunas de las propiedades de la partícula medular.

Los estudios medl<~nte enlaces cruzados amplían esas relaciones para mostrar qué pares de histonas están cerca uno del otro en el nudeosoma. (Un pro blema con rucha información suele ser que sólo Ul1 pequeño porcentaje de las proteínas tiene enlaces cruzados, de modo que es necesario ser cauto al decidir si los resultados tipifican a las principales interacciones.) A partir de esos datos, se ha construido un modelo de la organización del nucleosoma, esquematizado en la Mediante estudios estructurales se ha mostra do que la forma globaJ del octámero de histonas es similar a la de 1a panícula medular, lo cual sugiere que las interacciones hisrona -histona establecen la estructura general. Las posiciones de cada una de ellas han sido asignadas a regiones de estructura octamérica con base en su comportamienro al imeracmar }' en respuesta a enlaces cruzados. La estructura cristalina (con una resolución de 3. 1 Á) sugiere el modelo que se muestra en la para el octámero de histonas. El rastreo de las vías de las columnas polipeptídicas individuales de la estructura cristalina sugiere que las histonas no sólo se organizan como proteínas globulares individuales, sino que cada una se interdigita con su comraparte, H3 con H4 y 1I2A con R2B. AsC en el modelo se distingue el tetrámero H3 2 -H4 2 (blanco} de los dímeros H2A-H2B (azules), pero no se muestran las histonas aisladamente. En la parte superior se representa la misma perspectiva esquemática de la Figura 29.17. El tetrámero H3 2 -R41 contribuye al diámetro del octámero y asume la forma de una h erradura. Los pares H2A-H2B se acoplan como dos dímeros, pero en esa imagen sólo se observar uno. La vista lateral representa la misma perspectiva de la Figura 29.4, en la cual se d istingue la participación del tetráme-

Conceptos principales

EL meollo del octámero de histonas está constituido por un tetrámero, H32-H4a vinculado con dos dímeros H2A-H2B. • Cada histona presenta interdigitación intensa con su contraparte. • Todas las histonas medulares tienen el segmento estructural de pliegue. Las colas terminales N salen del nucleosoma.

'' .7 Organización del octámero de histonas

767

Los pares de histonas forman una "mitad de nucleosoma" ' +7

o

La superposición de los pares de histonas muestra organización simétrica

Modelo tridimensional de la estructura cristalina del octámero de histonas, con el tetrámero H3z·H41 en blanco y los dímeros H2A-H2B en azul. Sólo uno de los dímeros HsA-H2B es visible en la imagen superior, el otro está escondido debajo. La vía potencial del DNA se muestra en la parte superior como un tubo estrecho (de una cuarta parte del diámetro del DNA); en la vista lateral son las líneas paralelas de un haz de 20 Á de ancho. Imagen cortesía de E. N. Moudrianakis, Johns Hopkins University.

ro H3 2 -H4 2 y de los dímeros H2A-H2B separados. La proteína forma un tipo de carrete, con una vía superhelicoidal que podría corresponder al sitio de unión del DNA, enrollado casi 2 giros completos en un nucleosoma. El modelo muestra una doble simetría en torno a un eje que correría en forma perpendicular en la vista lateral. En la se resume una vista más detallada de las posiciones de las histonas (con base en una estructura cristalina a 2.8 Á) . La imagen superior muestra la posición de una histona de cada tipo respecto de un giro en torno a un nucleosoma (numeradas de O a +7). Las cuatro histonas medulares muestran un ripo similar de estructura, en que 3 a hélices se conectan con dos asas, a lo que se le llama pliegue de histonas. Las regiones interactúan para formar heterodímeros con forma de lúnula; cada uno se une a 2.5 giros de la hélice doble 768

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

H2A H2B H3

H4

Las posiciones de las histonas en una v';::o desde arriba muestran los pares H3-H4 y H2A-H2B en una m'::: de nucleosoma; en la imagen inferior se percibe la organizar:simétrica por la superposición de ambas mitades.

de DNA (H2A -H2B se une a +3.5 - +6; H3-H4 _ une a +0 .5 - +3 en la circunferencia que se ilusm: La unión ocurre en gran parte de la columna : enlaces fosfodiéster (compatible con la necesid; _ de compactar cualquier DNA indepenclientememe .:.. su secuencia) . El tetrámero H\-H4 2 se forma p interacciones entre las dos subunidades H3, cor:: puede observarse en la pane inferior de la figura Cada una de las histonas medulares tiene :__cuerpo globular que contribuye a la masa proteír.J.:.. central del nucleosoma, además de una cola te~­ nal N flexible con sitios para modificación, que P'den ser importantes para la función de la cromat:::" La posición de las colas, que contribuyen co11 cas·

N

N

Los cuerpos globulares de las histonas se localizan en el octámero de la partícula medular. No obstante, se desconoce la localización de las colas terminales N, que portan los sitios para modificación, que podrían ser más flexibles.

La fibra de 10 nm está parcialmente desenrollada; se observa que está constituida por una cadena de nucleosomas. Imagen cortesía de Barbara Hamkalo, University of California, lrvine.

La vía de los nucleosomas en la fibra de cromatina Conceptos principales Las fibras de cromatina de 10 nm se despliegan a partir de fibras de 30 nm y constan de una cadena de nucleosomas. • Las fibras de 30 nm tienen seis nucleosomas por giro organizados en un solenoide. La histona H1 es necesaria para la formación de la fibra de 30 nm.

N

N

Las colas terminales N de las histonas están desordenadas y salen del nucleosoma entre giros del DNA.

25% de la masa proteínica, no está tan bien definida, como se indica en la . No obstame, Las colas de H3 y H2B se pueden observar pasando entre giros de la superhélice de DNA y extendiéndose fuera del nucleosoma, como se muestra en la . Cuando las colas de histonas se emrecmzan con el DNA por irradiación UV, se obtienen más productos con nudeosomas que con partículas medulares, lo cual podría significar que las colas entran en contacto con el DNA de enlace. la cola de R4 parece hacer contacto con u n dímero H2A-H2B de un nucleosoma adyacente, que podría ser una característica importa nte en la estructura global.

Cuando se revisa la cromatina bajo el m icroscopio electrónico, se observan dos tipos de fibras, de lO y 30 nm, descritas por su diámetro aproximado (que en la fibra de 30 nm en rea lidad fluctúa entre - 25 y 30 nm). La fibra de 10 nm es eSl'ncialmente una cuerda continua de nuclcosomas que, de hecho, en oca siones transcurre de forma continua por una región más distendida en que se observan los nucleoso mas como un hilo de cuentas. según se indica en el ejemplo de la . La estructura fibrilar de 1O nm se obtiene en condiciones de escasa fortaleza iónica y no requiere de la presencia de la histona H1, lo cual signirica que. estrictamente, es una función de Jos nucleosomas mismos, que en esencia puede ser observada como una serie continua de nucleosomas, como se muestra en la No se sabe si tal estructura existe m vivo o es simplemente una consecuencia de su despliegue durante la extracción in vitro. Cuando se visualiza la cromatina en condicio nes de mayor fortaleza iónica, se obtiene la fibra de r 9.S La vía de los nucleosomas en la fibra de cromatina

769

La fibra de 10 nm es una cadena continua de nucleosomas. La fibra de 30 nm es un listón helicoidal constituido por dos hileras paralelas de nucleosomas enrollados er un solenoide.

La estructura de la fibra de 30 nm está enrollada. Imagen cortesía de Barbara Hamkalo, University California, Irvine.

30 nm, como en la , en la cual se muestra que la fibra tiene una estructura enrollada subyacente; presenta -6 nucleosomas por giro, es decir, una razón de empaquetado de 40 (esto es. en cada pm del eje de la fibra están conten idos 40 pm de DNA); en este caso sí se requiere la presencia de Hl. Esta fibra es el constituyente fundamental de la cromatina de interfase y los cromosomas en mitosis. La disposición más probable para el empaquetado de los nucleosomas en la fibra es la de un solenoide, en el que los nucleosomas giran con una trayectoria helicoidal y se enrollan en torno a una cavidad 770

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

central. Las dos formas principales de un solenoide son un solo inicio, que forma un arreglo lineal único. y dos inicios, en que efectivamente hay una doble muestra tm hilera de nucleosomas. La modelo de dos inicios, sugerido por datos recientes de enlaces cruzados mediante los cuales se identificó una doble pila de nucleosomas en la fibra de 30 nm: esto es sustentado por la estructura cristalina de un complejo tetranucleosómico. Las fibras de 30 y 1O nm pueden convertirse de manera reversible merced a cambios en la fortaleza iónica, lo cual sugiere que la disposición lineal de los nucleosomas de la fibra de lO nm desaparece al enrollarse dentro de la estructura de 30 nm er: condiciones de mayor forta leza iónica y en presencia de IIl . Si bien la presencia de esta última es necesaria para la formación de la fibra de 30 nm, la información acerca de su localización es controvertida . La relativa faci lidad con que se extrae la cromatina parece apuntar en el sentido de que se encuentra en la parte externa del eje de la fi bra superhelicoidal. No obstante, mediante datos de difracción y por e: hecho de que es más difícil encontrarla en fibras de 30 nm que en las de 1O nm que la retienen, se argu menta respecto de una localización interna. ¿Cómo se pasa de la fibra de 30 nrn a las estructuras específicas q1.1e se muestran en los cromosomas mitóticos? ¿Hay alguna especificidad adiciona~ en la disposición de la cromatina de interfase? ¿Tienen las regiones paniculares de fib ras de 30 nm una relación fija entre sí o su disposición es aleatoria?

1111

La replicación de la cromatina requiere del ensamblaje de los nucleosomas

C~ncepto~

No replicado

No replicado Replicado

pñncipales

los octámeros de las histonas no se conservan durante la replicación, a diferencia de los dímeros H2A-H2B y los tetrámeros H3 2-H4,. Hay diferentes vías para el ensamblaje de tos nucleosomas durante la replicación e independientemente de ésta. • Para eliminar al ensamblaje de los nucleosomas, se requieren proteínas accesorias. • El CAF-1 es una proteína de ensamblaje que se vincula con la subunidad PCNA del replicosoma; es necesaria para el depósito de los tetrámeros H3 2-H42 después de la replicación . Para el ensamblaje independiente de la replicación se puede usar una proteína de ensamblaje diferente y una variable de la histona H3.

En la replicación del DNA se separan sus cadenas y. por tanto, debe alterarse inevitablemente la estructura del nudeosoma. La transitoriedad del suceso de replicadón constituye un problema importante para d análisis de una estructura en particular durante dicho proceso. La estructura del triplete de replicadón es característica; es más resistente a la nucleasa de micrococos y es digerida en bandas que difieren de tamaño respecto del DNA del nucleosoma. La región que muestra esa estn.tctura alterada se confina a la vecindad inmediata del triplete de replicación, lo cual sugiere la participación de un gran complejo proteíníco, pero los nucleosomas se vuelven a formar más o menos inmediaramentt! detrás de él. conforme se traslada. La replicación de la cromatina no implica ningún periodo prolongado durante el cual el DNA carezca de histonas, una vez que se ha replicado, los nucleosornas se regeneran rápidamente en ambos productos de la replicación. Este punto se ilustra mediante la micrografía electrónica de la . que muestra una cadena de DNA con replicaeón recieme, ya empaquetada en los nucleosomas de ambos segmentos de las cadenas dobles hijas. Así pues, ramo el análisis bioquímico como la visualización del triplete de replicación sugieren que la alteradón de la estructura del nucleosoma se limita a una región corta, inmediata al triplete, el cual. al avanzar, desintegra los nucleosomas. pero éstos se forman otra vez rápidamente en las cadenas do · bies hijas. conforme el rriplete avanza. De hecho, el ensamblaje de los nucleosomas tiene enlace directo con el replisoma, que está replicando el DNA .

El DNA replicado se incorpora de inmediato a los nudeosomas. Imagen cortesía de Steven l. McKnight, UT Southwestern Medica[ Center at Dallas.

¿Cómo se relacionan las histonas con el DNA para generar nuclcosomas? ¿Las hisronas forman previamente un octámero de proteínas alrededor del cual el DNA forma después una cubierta, o se enS<Jmbla el octámero de histomts sobre el DNA a partir de histonas libres? La muestra que para el ensamblaje de los nucleosomas se pueden usar dos vías in vitro, dependiendo de las condiciones. En una de ellas, un octámero preformado se une al DNA, y en la otra, primero se une un tetrámero de H\-H4 2 y después se unen dos dímeros H2A-H2B. Ambas vías tienen relación con reacciones in vivo. La primera refleja la capacidad de la cromatina de remodelarse por movimientos de los octámeros de histonas a lo largo del DNA (véase Ja secdón 30.3. El remodelado de la cromatina es un proceso activo). La segunda representa la vía utUizada en la replicación. Las proteínas accesorias ayudan a las histonas en su. vinculación con el DNA. Los candidatos para esa función se pueden identificar mediante extractos que ensamblan hisronas y DNA exógeno en los nucleosomas. Las proteínas accesorias pueden ac· tuar como ''chaperones moleculares'', que se unen a las histonas para liberar controladamente histo· nas o complejos de h.istonas (H32 -H42 o H2A-H2B) hacia el DNA; esto podría ser necesario porque las histonas, como proteínas básicas. tienen una elevada afinidad general por el DNA. Las interacciones

mencionadas permiten a las hisronas formar nucleosomas sin ser atrapadas en o~ros intermediarios cinéticos (esto es, otros complejos que resultan de La unión homogénea de las histonas al DNA). Los intentos de producir nucleosomas in vitro empiezan con el análisis de un proceso de ensamblaje entre el DNA libre y las histonas, si bien in vivo, los nudeosomas se forman sólo cuando el DNA se

29.9 La replicación de la cromatina requiere del ensamblaje de los nucleosomas

771

------------------~

El octámero se El octámero ensambla sobre el DNA preformado se une H4

La conservación del octámero pronostica que los nucleosomas contienen exclusivamente histonas antiguas o nuevas

H3

Meollo H3-H4 H4

H3

Octámero nuevo Octámero antiguo conservado Enlaces cruzados de histonas, extracción de octámeros y análisis de la densidad

Octámero antiguo

Octámero nuevo

Ligero

In vitro, el ONA puede interactuar directamente en un octámero de histona integro (en enlace cruzado). o bien ensamblarse con el tetrámero H3lH4z, después de lo cual se agregan dos dímeros H2A·H2B.

replica. Se ha perfeccionado un sistema que simula ese requisito con extractos de células humanas que replican el DNA de SV40 y ensamblan los productos en la cromatina. La reacción de ensamblaje ocurre preferentemente en el DNA en proceso de replicación. para lo cua l se requiere un factor auxiliar. el factOr de ensamblaje de la cromatina (CAF) -1. que consta de >5 subunidades con una masa rotal de 238 kD. El antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA). factor de progreso de la polimerasa de DNA, recluta al CAF-1 para el triplete de replicación; con esto se logra el enlace entre la replicación y el ensamblaje de nucleosomas. de modo de asegurar que los nucleosomas se ensamblen tan pronto como el DNA se haya replicado. El CAF-1 actúa de manera esrequiomérrica y por unión con H3 y H4 recién sinreúzadas, lo cual sugiere que se forman nuevos nucleosomas, primero por ensamblaje del letrámero H3 2 -H42 y por la adición posterior de los dímeros H2A·H2B. Los nudeosomas que se forman in vitro rienen una longitud de repetición de 200 bp, pero carecen de rus772

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

Si se conservaran los octámeros de histo-:. los octámeros antiguos y nuevos tendrían bandas de difere -~ densidades al ocurrir la replicación de los octámeros pesa:en los aminoácidos ligeros.

tonas H L Jo cual sugiere que sin H 1 se puede log~' el espaciamiento apropiado. Cuando se replica la cromatina. se replica ucadena de DNA ya vinculada con. nucleosomas, Jo cu da origen a dos cadenas hijas dobles. ¿Qué pasa e los nucleosomas preexistentes en ese punto? ¿L octámeros se disocian de histonas en histonas bres para ser utilizadas de nuevo, o se mantier:e ensamblados? La integridad del octámero se pm: estudiar por los enlaces cruzados de las histonas . .=. las siguientes dos figuras se comparan los posib resultados de un experimento en que se culti· células en presencia de aminoácidos pesados ¡:::.< identificar las histonas ames de la replicación; C!: pués se permite que ocurra la replicación en presc cia de aminoácidos ligeros. En ese punto, los oc-_ meros de histona presentan enlaces cruzados , centrifugan en un gradiente de densidad. La muestra que si se han conservado los octárr ros originales, se encontrarán en una posiciór. alta densidad, de modo que los nuevos ocupa--la posición de baja densidad. Pero esto no llega ocurrir. En la posición de alta densidad se encuer poco materiaL lo cual sugiere que los octámero~

Histonas antiguas

Histonas recién Sintetizadas

1. El triplete de 2. El tetrámero de replicación avanza histonas es desplazado y hacia el nucleosoma se desensambla

Siguiente nudeosoma

y

las histonas recién sintetizadas se ensamblan

Tetrámeros H3-H4

t

Desensamblado y reensamblado pronostican que los nucleosomas contienen tanto histonas antiguas 1 como nuevas, ya sea preensambladas de manera l sistemática o aleatoriamente

Ormeros H2A·H2B

00

t Sfntesis durante la fase S

H3 y H4 antiguas, H2A y H2B nuevas

Disposición aleatoria

Enlaces cruzados de histonas, extracción de octámeros y análisis de la densidad

Pesado --------i~ Ligero

Cuando los octámeros pesados se replican con aminoácidos ligeros, los nuevos octámeros presentan bandas difusas entre densidades pesadas y ligeras, lo cual sugiere que ha habido desensamblado y reensamblado.

histonas no se conservan. Los ocrámeros tienen una densidad intermedia, y en la se muestra lo que sería el resultado esperado si se hubieran liberado las histonas antiguas y después reensamblado con histonas recién sintetizadas. El patrón de desensamblado y reensamblado ha sido difícil de caracterizar en detalle, pero en la se muestra un modelo funcional. El triplete de replicación desplaza a los octámeros de histonas, que después se disocian en tetráme ros H3 2 -H4 2 y dímeros H2A-H2B. Esos tetrámeros y dímeros "antiguos'' entran a un fondo de reserva que también incluye "nuevos" tetrámeros y dúneros que se ensamblan a partir de histonas de recien -

3. los tetrámeros H3-H4 se unen a cadenas dobles hijas

4. Los dímeros H2A·H2B se unen

CAF

El paso del triplete de replicación desplaza los octámeros de histonas del ONA, que se desensamblan en tetrámeros H3H4 y dímeros H2A-H2B. Las histonas recién sintetizadas se ensamblan en tetrámeros H3-H4 y dímeros H2A-H2B. Los tetrámeros y dímeros antiguos y nuevos se ensamblan de manera aleatoria con ayuda de CAF-1 en nuevos nucleosomas, in mediata mente detrás del t riplete de replicación .

te síntesis. Los nucleosomas se ensamblan a -600 bp detrás del triplete de replicación, proceso que se inicia cuando los tetrámeros H3 2 -H42 se unen a cada una de las cadenas dobles hijas, ayudados por CAF- 1. Dos dímeros H2A-H2B se unen entonces a cada tetrámero H3 2-H4 2 para completar el octámero de histonas. El ensamblaje de tetrámeros y dímeros es aleatorio respecto de subunidades "antiguas" y "nuevas", lo cual explica los resultados de la Figura 29.29. El tetrámero H3 2-H42 "antiguo" podría ser un vínculo transitorio con una cadena simple de DNA durante la replicación; de hecho, tal vez tendría más probabilidades de mantenerse dentro de la cadena líder para su reutilización. Es posible que los nucleosomas se escindan y vuelvan a ensamblar de forma similar duranle la transcripción (véase la

29.9 La replicación de la cromatina requiere del ensamblaje de los nucleosomas

773

sección 29 . 1 1, ¿Los genes transcritos se organizan en nucleosomas?). Durante la fase S (periodo de replicación del DNA) en un ciclo celular eucariótico, la replicación de la cromatina implica la síntesis de sufidemes proteínas lústonas como para empaquetar todo el genoroa, básicamente debe simerízarse la misma cantidad de histonas que las ya contenidas en los uucleosomas. La síntesis de RNAm de hiswnas es conrrolada como pane del ciclo celular y aumenta enormemente en la fase S. La vía para el ensamblaje de la cromatina a partir de esa mezcla equívaleme de histonas .::~ntiguas y nuevas durante la fase S se le denomina vía de replicación acoplada (RC). En otra vía, llamada vía independiente de las replicaciones (RI), se ensamblan nucleosomas durante otras fases del ciclo ce lular, cuando no se está sin tetizando DNA. Esto resultaría necesario como resultado de daños en el DNA o porque los nucleosomas se desplazan durante la transcripción. El p roceso de ensamblaje debe tener necesariamente algunas diferencias respecto de la vía acoplada a la replicación porque no puede vincularse con el aparato respectivo. Una de las caracrer(súcas más interesantes de la via independiente de la replicación es que utiliza variantes de algunas de las histonas diferentes de las utili1.adas durante la replicación. L.3 variante de hisrona H3.3 difiere de la histona H3 altamente conservada en cuatro aminoácidos; la primera sustituye lentamenre a la H3 en células en proceso de diferenciación que no tienen ciclos de replicación. Esto sucede como resultado del ensamblaj e de nuevos octámeros de histonas para sustituir a lo!> que han sido desplazados con el DNA por cualquier motivo. El mecanismo que se utiliza para asegurar el uso de H3.3 en la vía independiente de la replicación es diferente en dos casos investigados. En Jos protozoarios del género Tetrahymena el uso de hisLOnas depende exclusivamente de su disponibilidad. La histona H3 se sintetiza sólo durante el ddo celular, en tanto que la variante de reposición se sintetiza sólo en células sin replicación. En el género Drosophila, sin embargo, hay una vía activa que asegura la utilización de H3.3 por la vía independiente de la replicadón. Nuevos nucleosomas que contienen H3.3 se ensamblan en Jos sitios de transcripción, supuestamente sustituyendo a nudeosomas desplazados por la polimerasa de RNA. El proceso de ensamblaje discrimina entre H3 y H3.3 con base en sus secuencias, excluyendo espeáficameme la utilización de H3. Por el contratio, el ensamblaje acoplado a la replicación hace uso de ambos tipos de H (aunque R3. 3 está disponible en concemradones mucho menores que H3. y, por tanto, entra sólo a un pequeü.o porcentaje de los nucleosomas). 77 4

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

Probablemente el CAFl no participa en el ; samblaje independiente de la replicación. (Taml>. hay organismos como las levaduras y los del géce Arabidopsis, para los cuales el gen no es indispe:;-: ble, lo cual implica el uso de procesos alternatien el ensamblaje acoplado a la replicación.) ·_-proteína que puede participar en el ensamblaje dependiente de la replicación se denomina l:IJ? cuyo agotamiento en sistemas in virro para el esamblaje de nucleosomas inhibe la formaciórnucleosomas en el DNA no replicado, pero m el que está en proceso de replicación, 1o cual in<.. que, de hecho, las vías uti lizan diferentes mecamas de ensamblaje. la HIRA acrúa como chapepara facilitar la incorporación de hiswnas en nucleosornas. vía que supuestamente se en car-,., en genera l, del ensamblaje independiente de la · p licación; por ejemp lo, es necesaria para la dese ~ densación del núcleo del espermatOzoide, cuar las protarninas son susutuidas por las histonas p.: generar cromatina competente en la rep1icac. después de la fecundación. El ensamblaje de los nucleosomas que con:· nen una alternativa de H3 también ocUI·re en centrómeros (véase la sección 31.3, La heteroc matina depende de las interacciones con hiswna El DNA cemromérico se replica tempraname:' durante la fase de replicación del ciclo celula; diferencia de las secuencias hercrocromáticas .::: cundantes, que se replican después; véase la k ., ción 15. 7, Cada cromosoma e ucariótico contkmuchos replicones). Se inhibe la incorporación H en los centrómeros y en )U lugar, en las célu-.: eucariotas superiores, se incorpora una prote!: llamada CENP-A (en el género Drosophila se Ua~ Cid y en las levaduras Cse4). Esto ocurre en la · de ensamb laje independienLe de la replicación z. pa recer porq u e la vía acoplada a la replicación . inhibe clurame un lapso breve, mientras se rep~- ~ el DNA cemromérico.

¿Los nucleosomas yacen

en posiciones específicas? Conceptos pñncipales • Los nucleosomas pueden formarse en posiciones especificas como resultado de la estructura local del DNA o de las proteínas que interactúan con secuencia~ específicas. La causa más frecuente de la posición del nucleosoma es ellfmite impuesto por las proteínas que se unen al DNA. • El posicionamiento influye en qué regiones del DNA quedan en el enlace y qué cara del DNA se expone a tz superficie del nucleosoma.

Se sabe que los nuclcosoma~ pueden reconstituirse in vitro, independientemente de la secuencia del DNA, pero esto no significa que su formación in vivo sea así. ¿Yace siempre una secuencia de DNA en particular en cierta posición in vivo respecto de la tOpografía del nucleosoma, o están los nucleosomas dispuestos en forma aleatoria en el DNA, de manera que una secuencia específica pueda presentarse en cualquier localización, por ejemplo, en la región medular en una copia del genoma y en la región de eolace en orra? Para responder a esta interrogante es necesario usar una frecuencia definida de DNA, más precisamente, se tiene que determinar la posición de un punto definido del DNA respecto del nucleosoma. Bn la se ilustra el principio de un procedimiento para lograrlo. Supóngase que la secuencia de DNA se organiza en nucleosomas sólo con cierta configuración, de mane ra que cada sitio del DNA siempre se localice en una posición panicular delnucleosoma. Ese tipo de organización se llama posicionamiento del nucleosoma (o. a veces, fases del nucleosoma). En una serie de nuclcosomas en posición, las regiones del DNA de enlace constituyen sitios únicos. Considérese la secuencia nada más para un nucleosoma. La escisión con nucleasa de micrococos genera un fragmento monomérico que constituye una secuencia específica. Si el DNA se aísla y escinde con una enzima de restricción que tiene sólo un sitio diana en ese rragmento, podría cortarse en un punto único, lo cual resultaría en dos fragmentos, cada uno de tamaño único. Los productos de la doble digestión, por enzimas de restricción y microcódca, se separan por elecLToforesis en geL Para identificar el fragmento correspondieme en el producto de la doble digestión, se usa u na sonda que representa la secuencia de un lado del si rio de restdcción, técnica llamada de marcado terminal indirecto. Reviniendo el argumento, la identificación de una sola banda demuestra que la posidón del sitio de resu-icción tiene definición exclusiva respecto del extremo del DNA del nucleosoma (según se define por el corre de la nucleasa microcócica). Así. el nucleosoma tiene una secuencia de DNA única. ¿Qué pasa si los nucleosomas no yncen en una sola posici6n? Ahora, los DNA de enlace constan de diferentes secuencias en cada copia del genoma, de modo que el sitio de restricción yace en una posición diferente cada vez; de hecho, se encuentra en tOdas las localizaciones posibles respecto de los extremos del DNA nucleosómico monomérico. La muestra que la doble escisión genera entonces una amplia extensión, del fragmento más

El posicionamiento ubica la secuencia diana (roja) en una ubicación exclusiva

La nucleasa de micrococos libera monómeros

=

-·

La enzima de restricc16n corta en la secuencia diana

El fragmento tiene un corte de restricción en un extremo, un corte m1crocócico en el otro extremo: la electroforesis resulta en una banda ún1ca

El posicionamiento del nucleosoma coloca sitios de restricción en ubicaciones únicas respecto de los sitios de enlace escindidos por la nucleasa de micrococos.

pequeño derecrable (casi 20 bases) a la longirud del DNA monomérico. Al describir esos experimentos se ha tratado a la nucleasa de micrococos como una enzima que escinde el DNA en las regiones de enlace expuestas sin ningún tipo de especificidad de secuencia. En realidad. la enzima tiene la misma especificidad de secuencia, no obstante que se desvía hacia la selección de secuencias ricas en A-T. Por tanto, no es posible suponer que la existencia de una banda específica en la técnica de marcado indirecto del extremo represente la distancia a partir de un corte 29.10 ¿Los nucleosomas yacen en posiciones específicas?

775

En ausencia del posicionamiento de un nudeosoma, en todas las localizaciones posibles de diferentes copias del genoma yace un sitio de restricción . Se producen fragmentos de todos los tamaños posibles cuando una enzima de restricción corta en un sitio diana (rojo) y la nucleasa de micrococos corta en las uniones entre nucleosomas (verde) .

por la enzima de restricción a la región de enlace. ¡Más bien podría representar la distancia del corte por la enzima de restricción a un sitio de escisión preferido por la nudeasa de micrococos! Esta posibilidad se controla mediante el tratamiento del DNA desnudo exactamen te en la misma forma que la cromatina. Si hay sitios prefe1idos por la nucleasa de micrococos en la región específica, habrá bandas específicas, patrón que entonces se compararía con el generado a partir de la cromatina. Una diferencia entre el patrón de bandas del DNA de control y el de la cromatina proporciona pruebas del posicionamiento de los nucleosomas. Algunas bandas presentes en el producto de digestión del DNA de control pueden desaparecer del correspondiente del nudeosoma , lo cual indica que no se dispone de posiciones pa ra escisión preferenciaL Por otra parte. pueden aparecer nuevas bandas en el producto de digestión de los nucleosomas, cuando por la organizaáón de éstos, se hacen accesibles de manera preferencial nuevos sitios. El posicionamiento de los nucleosomas podría lograrse por cualquiera de dos formas: • Intrínseca: cada nucleosoma se deposita específicamente en una secuencia particular del DNA. Esto modifica el punto de vista 176

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

del nucleosoma como unidad susceptib: , formarse entre cualquier secuencia del: y un octámero de histona. • Extrínseca: el primer uucleosoma de . región se ensambla preferentemente er sitio particular. Un punto de inicio prefe:cial para el posicionamiento del nucleoses resultado de la presencia de una r~ de la que se excluyen los nucleosomas _ región excluida proporciona un límite .: restringe las posiciones disponibles pa:: nucleosoma adyacente, de modo que ~ tonces se ensamblaría secuencialmente serie de nucleosomas con una longiwc repetición definida. Ahora queda claro que el depósito de octámerr histonas en el DNA no es aleatorio respecto G~ secuencia. El patrón es intrínseco en algunos ce en los cuales depende de características estruc'-.les del DNA, y es extrínseco en casos en que pro.:: de las interacciones de otras proteínas con el D. las histonas, o ambos . Ciertas características estructurales del D a[cctan la ubicación de los ocrámeros de histc_ dadas las tendencias intrínsecas de aquél para ~ garse en una dirección más que en otra; así, J~ giones ricas en A-T se locali7.an de manera q. surco menor vea hacia el octámero, en tanto qL regiones ricas en G-C se disponen de manera el surco menor señale hacia fuera. Los segm~ largos de dA-dT (>8 bp) evitan el posicion~-:: en el giro superhelicoidal central del meollo. ..no es posible sumar todos los efectos estrucru:~ importantes y así pronosticar completamente l:= calización de la secuencia específica del DNA res: to del nucleosoma. Las secuencias que hacen q-:. DNA adopte estructuras más extremas pueden Jii: efectos, como la exclusión de nucleosomas, ci-; forma que podrían incidir en los límites. Es frecuente que los nucleosomas se posi d :_ cerca de los límites. Si hay alguna variante econstrucción de los nucleosomas, por ejemp! la longitud del DNA de enlace varía unos lO w especificidad de la localización se reduciría, ale.:. dose del primer nudeosoma definido en ellí~ En ese caso podría esperarse que el posiciona.rllie se mantuviera rigurosamente sólo con una re!¿cercanía al límite. La localización del DNA en los nucleos• puede describirse de dos formas. En la • se muestra que el posicionamien to traducdcdescribe la posición del DNA respecto de los lli::del nudeosoma. En particular, determina qt<e cuendas se encuentran en las regiones de err. Un cambio de 10 bp enelDNA lleva el siguiente=a una región de enlace. Así, en el posicionan:. .::

Giros 3-4 en la reg1ón de enlace

,-!-, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 ¡;v- 1\. r. r,.r\.r...rv:-v;v> Giros 2-3 en la región de enlace

¡-1-, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1Q 1112

/V • t\: VVV\.1" 1'\.'V

El posicionamiento traduccional describe la oosición lineal del DNA respecto del octámero de histonas. El desplazamiento del DNA por cambios de 10 bp cambia las secuencias de las regiones de enlace más expuestas, pero no altera la cara del DNA protegida por la superficie de las histonas ni la que est~ expuesta al exterior. El DNA ya está enrollado sobre los nucleosomas; para mayor comodidad se muestra en forma lineal.

Factores

Superficie del octámero

~

El posicionamiento rotativo describe la exJosición del DNA en la superficie del nucleosoma. Cualquier ":"lOvimiento que se aleje de la repetición helicoidal (-10.2 bp/ giro) desplaza al DNA respecto de la superficie de la histona. -OS nucleótidos del interior están más protegidos contra las ;ucleasas que los del exterior.

:raducdonal se determina qué regiones son más ac..:esibles (cuando menos, a juzgar por la sensibilidad a la nucleasa de micrococos). El DNA yace en el exterior del octámero de his~onas, de modo que uno de los lados de cualquier

secuenda específica es ocu ltado por las histonas. en tanto que el otro es accesible. Dependiendo de su posidonamiemo respecto del nudeosoma, un sitio en el DNA que debe reconocer a una proteína reguladora podría ser inaccesible. o estar disponible; por tanto, la posidón exacta del octámero de histonas en relación con la secuenda del DNA puede ser importante. En la se muestra el efecto del posicio namiento rotat ivo de la doble hélice en cuamo a la superficie del octámero. Si se mueve el DNA un número parcial de giros (imagínese el DNA rotando respecto de la superficie de la proteína). habrá un cambio en la exposición cie secuencias al exterior. El posicionamiento traduccional y rotativo puede ser importante para controlar el acceso al DNA . Los casos de posicionamiento mejor caracterizados involucran la limitación específ1ca de los nudeosomas en los promotores. El posicionamiento traduccional, la exclusión de los nucleosomas de una secuencia en particular, o ambos procesos. pueden ser necesarios para permitir que se forme un complejo de transcripción. Algunos factores reguladores pueden unirse con el DNA sólo si se excluye un nucleosoma para dejar acce~o libre al DNA, y ello crea un límite para el posicionamiento traduccional. En otros casos, los factores reguladores pueden volver a unirse con el DNA en la superficie del nucleosoma, pero el posicionamiento rotativo es importante para garantizar que se exponga la cara del DNA con los puntos de comacto apropiados. En la sección 30.4, La organización de los nudeosomas puede cambiarse en el promotor, se analiza la conexión entre orgaruzación de nucleosomas y transcripción, pero por ahora nótese que los promotores (y algunas otras estructuras), a menudo tienen regiones cortas que excluyen a los nucleosomas. Dichas regiones por lo general forman un limite, cerca del cuaJ se restringen las posiciones de los nucleosornas. Mecliante un rasrreo de una región extensa del genoma de Saccharomyces cerevisíae (con mapeo de 2 27 8 nucleosomas en más ele 482 kb de DNA) se demostró que. de hecho, el 60% de los nudeosomas tiene una posición específica como resultado de efectOs ümítrofes. casi siempre por tos promotores.

SIIJ

¿Los genes transcritos se organizan en nudeosomas?

Conceptos principales • Los nucleosomas se encuentran a la misma frecuencia cuando los genes transcritos o no transcritos son digeridos con nucleasa de micrococos. • Algunos genes intensamente transcritos parecen casos excepcionales desprovistos de nudeosomas.

29. 1 ¿Los genes transcritos se organizan en nucleosomas?

777

Las unidades de transcripción del DNAr de genes nucleolares aislados alternan con segmentos de DNA no transcritos. Reproducida de Miller O. L. y Beatty. B. R. 1969. Science. 164: 955-957. Imagen cortesía de Osear Miller.

Un minicromosoma de SV40 puede ser transcrito. Reproducida de J. Mol. Bio. VoL 131, Gariglio, P. et al., The template of the isolated ... p. 131. Copyright 1979, con autorización de Elsevier. Imagen cortesía de Pierre Chambon.

Los intemos por observar a los genes durante la transcripción han dado resultados controvertidos. Las siguientes dos figuras ejemplifican cada extremo. La cromatina con transcripción intensa se ve bastante extendida (demasiado como para ser cubierta por nucleosomas). En los genes con tr'aJ15cripción intensa que codifican RNAr, ilustrados en la , el empaquetamiento extremo de las polimerasas de RNA dificulta la observación del DNA, y no es posible medir directamente las longitudes de los productos de transcripción del RNAr, dado que el RNA es compactado por pro teínas, pero se sabe (por la secuencia del RNAr) qué tan largo debe ser el producto de transcripción. La longitud 778

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

del segmento de DNA transcrito que se mide por · longitud del eje del "árbol de navidad" es de -85 de la longitud del RNAr, lo cual significa que el D.·está casi totalmente ex Lendido. Por otra parte, los complejos de transcripción · los minicromosomas de SV40 se pueden extraer _ células infectadas; contienen el complemento us;..: de l1istonas y presentan una estrucrura tipo cue.. ras ensartadas. Se puede observar que las cader :. de RNA se extienden a partir del minicromosor.; · como en el ejemplo de la . lo cual apL La a la transcripción puede continuar mientras DNA de SV40 se organiza en nucleosomas. Ob\ 2 meme. el minicromosoma SV40 se transcribe e menor intensidad que los genes de RNAr. La transcripción implica el desenrollamier, del DNA, y puede implicar el despliegue de la 6~ · en regiones res tringidas de la cromatina. Un pu!lde vista simplista sugiere que se necesitará cie"espacio" para el proceso. Las características de cromosomas politénicos y en escobillón descritas - el Capítulo 28, Ct'omosomas, dan indicios de que expresión génica se relaciona con una organizad estructura l más expansiva. Al reflexionar acerca de la transcripción deben tenet en mente el tamaño relativo de la ~ 1imerasa de RNA y del nucleosoma. Las enzin: _ eucarióticas son proteínas grandes con .rn,últir subunidades. por Jo general >500 kD que seco.,... pararán con los -40 kD del nucleosoma. E:! se ilu stra el enfoque de la polimerasa _ DNA respectO del DNA de los nucleosomas. Inc so sin un conocimiento profundo de la inreracé es evidente que implica abordar dos organis1r comparables. Considérense los dos giros del DNA en torn nucleosoma. ¿Tendría suficiente acceso la poli~ rasa del RNA al DNA si el ácido nudeico se co~ nara a esa v.ía? Durante Ia transcripción, canforla polimerasa de RNA se mueve sobre el molde une estrechamente con una región de -50 bp ~ incluye un segmento local, no enrollado. de - 12 La necesidad de desenrollar el DNA hace pare.:· poco p robable que el segmento involucrado e;: reacción de lapolimerasa de RNA podría manten, se en la superficie del octámero de histonas. Por tanto. parece inevitable que la t.ranscrip{" implique un cambio estructural. de modo qut' primera pregunta acerca de la estructura de un; ~ activo será si el DNA en proceso de transcripc se mantiene organizado en nucleosomas. Si se .__ plazan los octámeros de bistonas ¿se mantiene:"' algun a manera aunados al DNA transcrito? Un abordaje experimental es el de digerir la e matina con nucleasa de micrococos y, después. pzar una sonda de alguno o algunos genes espeá t>

Promotor

Terminador

Nucteosoma ensamblado en una localización específica

La polimerasa de RNAaune

ar promotor

La polimerasa de ANA transcribe hasta el terminador

-

El nucleosoma se encuentra en una nueva posición

La polimerasa de RNA es comparable en tamaño al nucleosoma, y podría tener dificultades para seguir al DNA en torno al octámero de histonas. Imagen superior, cortesía de E. N. Moudrianakis, Johns Hopkins University. Imagen inferior, cortesía de Roger Kornberg, Stanford University School of Medicine.

para determinar si los fragmentos correspondientes están presentes en la escalera usual de 200 bp a la concentración esperada. Las conclusiones de esos experimentos son limitadas pero importantes. Los genes que están en proceso de transcripción contienen nucleosomas con la misma frecuencia que las secuencias no transcritas. Por tanto, los genes no necesaria_m ente adoptan una forma alternativa de orgaruzación para ser transcritos. No obstante, tal vez el gen transcrito promedio tenga sólo una polimerasa de RNA en un momento dado, por lo cual no revela qué está pasando en los sitios realmente afectados por la enzima. Quizá conservan sus nucleosomas; es más probable que los nucleosomas se desplacen de manera temporal, conforme la polimerasa de RNA pasa a través de ellos, pero se forman de nuevo inmediatamente después.

Los octámeros de histonas son desplazados

por la transcripción Cone~:ptos

principales

• En un sistema modelo, la polimerasa de RNA desplaza a los octámeros de histonas durante la transcripción, pero éstos se unen nuevamente con el DNA tan pronto como ha pasado la polimerasa. • Los nucleosomas se reorganizan cuando la transcripción pasa a través de un gen.

Un protocolo para estudiar el efecto de La transcripción en los nucleosomas muestra que el octámero de histonas es desplazado del DNA y se vuelve a unir en una nueva posición.

Los experimentos para comprobar si una polimerasa de RNA puede transcribir directamente a través de un nucleosoma sugieren que el ocrámero de histonas es desplazado por el hecho de la transcripdón. En la se muestra lo que sucede cuando la polimerasa de RNA del fago T7 transcribe un fragmento corto de DNA que contiene un solo núcleo octamérico in vitro, el cual se mantiene vinculado con el DNA pero en una localización diferente; es muy probable que se vuelva a unir con la misma molécula de DNA de la que fue desplazado. se muestra un modelo para En la el avance de la polimerasa. El DNA se desplaza conforme la polirnerasa entra al nucleosoma, pero la enzima ll ega a un punto en que e l DNA hace retroceder sus asas y se vuelve a unir, formando una región cerrada. Conforme la polimerasa avanza más. crea superhéUces positivas desenrollando el DNA; el efecto puede ser muy notorio. pues el asa cerrada es de sólo -80 bp, de manera que cada par de bases a través del cual avanza la polimerasa hace una adidón sigruficativa al superenrollamiento. De hecho, la polimerasa avanza fádlmeme los primeros 30 bp hada el nucleosoma, pero después lo hace en forma más lenta, como si su avance fuera cada vez más difícil. Cada lO bp ha y pausas, lo cual sugiere que la estrucmra del asa impone pausas relacionadas con la rotadón en cada giro del DNA. Cuando la polimerasa ltega el punto medio del nucleosoma (las bases por añadir a continuación se encuentran sobre todo en el eje de la simetría doble), se reanuda

?9. 2 Los octámeros de histonas son desplazados por la transcripción

779

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o El DNA es desplazado del octámero y forma un asa cerrada

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La torsión delante de la polimerasa de ANA desplaza al octámero que se reinserta detrás de la polimerasa

Reprimido

780

Expresado

Reprimido

la polimerasa de RNA desplaza al DNA del octámero de histonas conforme avanza. El DNA se enrolla nuevamente y se une (a la polimerasa o al octámero). para formar un asa cerrada. Conforme la polimerasa avanza, genera un sobreenrollado positivo adelante, desplazando al octámero que mantiene contacto con el DNA, la polimerasa o ambos, y se inserta detrás de la polimerasa de RNA.

Las secuencias génicas URA3 se fusionan e:un promotor GAL1 regulado y una secuencia de DNAri bosómic: El URA3 tiene nucleosomas posicionados en forma transicio- ; antes de la transc.ripción. Cuanoo se induce la transcripc' : controlada por un promotor inducible. las posiciones de t:: nucleosomas son aleatorias. Cuando se reprime la transcripciélos nucleosomas recuperan su posición específica. Reproduc':: de Suter, 8., et al. 1997, EMBO J. 16: 21 50-2160. Co pyri~ -­ ~ Oxford University Press. Imagen cortesía de Fritz Thom~! ETH Zurich.

el movimiento y la polimerasa avanza rápidamente, lo cual sugiere q ue el punto medio del nucleosoma marca el sitio en q ue el octámero es desplazado (tal vez porque el superenrollado positivo ha llegado a un nivel crítico en el cual se expulsa al octámero del DN A). De esra forma se libera la tensión delante de la polimerasa y se pe rm ite que avance. El octámero se un e después al DNA, detrás de la polimerasa. y ya no co nsti tuye un obstáculo para su avance. Es posible que el octámero cambie de posióón. incluso sin haber perd ido contacto con el DNA. ¿El octámero se libera como unidad íntegra? El entrecruzamiento de las proteínas del octámero no crea un obstáculo para la transcripción, la cual puede continuar incluso si los enlaces cruzados son lo suficientemente extensos como para asegurar que se hayan enlazado las regiones centrales de las bistonas medulares, de ahí que la transcripción no implique disociadón del octámero en las histonas que lo componen, y no es probable que necesite un mayor despliegue de la estructura central. La adición de la histona Hl a ese sistema, sin em bargo, causa una rápida declin ación en la transcripción , lo cual

sugiere dos conclusiones. El ocrámero de histona (ya sea que se conserve o se desplace ) actúa coJL unidad íntegra, y puede ser necesario eliminar la E . de la cromatina activa o modificar de alguna forme. sus interacciones. Por tamo, una polim crasa de RNA pequeiu puede desplazar a u n solo nucleosoma, que vuel· -: a formarse detrás de ella durante la transcripción. p... supuesto, la situación es más compleja en un núclt ~ eucariótico. La polimerasa de RNA es mud1o mayorel obstácu lo al avance es una cadena de nucleosoma· conectados. y para superarlo se necesita que factore adicionales actúen en la cromatina (ver Capítulo 3L Control de la estructura de la cromaúna). La organización de los nucleosomas puede se modificada por la transcripción. En la ~ observa lo que le sucede al gen URAJ de las levaduras cuando se transcribe estando controlado por U'" promotor inducible. El posicionamiento se anali::? con la nuclcasa de micrococos para revisar los sitit de escisión respecto de un sitio de restricción en ~ extremo S' del gen. Inicialmente, el gen m uestra u:> patrón de n uclcosomas organizadas desde el prorm ·

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

wr a una distancia significativa a través del gen; el posicionamiento se pierde en las regiones 3'. Cuan do el gen se expresa, un extenclido general sustituye al patrón de posicionamiento de los nucleosomas, lo cual indica la concentración de nucleosomas en la misma, pero ya no están organizados en fase, lo cual, a su vez, sugiere que la transcripción destruye el posicionamiento nucleosómico. Cuando se restablece la represión, el posicionamiento aparece en un lapso de 10 rninuro!! (aunque no completo). El resultado lleva al imeresante punto de que se pueden ajustar las posiciones de los nucleosomas sin replicación. En el modelo de uniJicación se supone que la polimerasa de HNA desplaza a los octámeros de bistonas conforme avanza. Si el DNA que viene de trás de la polimerasa está disponible, el octámero se vuelve a u n ir ahí. (Es posible, o tal vez probable, que el octámero nunca pierda totalmente el contacto con el DNA, pero sigue siendo un enigma cómo un octámero podría mantener el contacto con el DNA sin desplegarse o perder componentes, cuando un objeto incluso de mayor tamaño que él avanza a través del DNA. Ta l vez el ocrámero sea "envia do atrásH haciendo contacto con la polímerasa de RNA.) Si el DNA no escá disponible tal vez porque otra polimerasa continúa inmediatamente después de la primera, el octámero podría desplazarse permanentemente y el DNA mantenerse extendido.

El desplazamiento del nucleosoma y su reensamblado requieren factores especiales Concepto principal • Se necesitan factores auxiliares para que la polimerasa de RNA desplace a los octámeros durante la transcripción y para que después, la~ histonas se reensamblen en nucleosomas.

El desplazamiento de los nucleosomas respecto del DNA es clave para todas las etapas de la t ranscripdón. El inicio del proceso e~ lo que se ha caracterizado mejor. Los promotores activos están marcados por sitios h ipersensibles a la deso'
puede cambiar en el promotor) . Esto significa que la polimerasa de RNA inicia la síntesis de ésta en una cadena corta de DNA no obstaculizada por los nucleosomas. Para que siga avanzando durante la elongación, deben de!>pla7arse los ocrámeros de hístonas delante de ella, pero para evitar que el DNA quede desnudo tras los octámeros, deben formarse nuevamente después de la transcripción. La transcripción ín virro por la polimerasa U de RNA se necesita la llamada proteína Iacilitadora de la transcripción de la cromalina (FACT), que se comporta como factor de elongación durante la transcrípción. (No es pane de la polimerasa de RNA. pero se vincula con ella especfficamente durante la Iase de elongación de la transcripción.) La FACT consta de dos subunidadcs bien conservadas en todas las eucariotas y se vin cula con la cromatina de Jos genes activos. Cuando se agrega FACT a nucleosomas aislados, conduce a la pérdida de los dimeros H2A-H2B, razón de que durante la transcripción ín. vitro, los nucleosomas se convienan en "hexasomas". Esto sugiere que la FACT es parte de un mecanismo para el desplazamiento de ocrámeros durante la transcripción, aparre de que podría participar en el reensamblado de los nucleosomas después de la transcripción, ya que ayuda a la formación de nudeosomas a panir de histonas medulares. Esto sugiere el modelo de la , en la cual, la FACT saca de un nucleosoma el complejo H2A-H2B trente a la polimcrasa de RNA y facilita su inserción en un nudeosoma que se está rcensamblando detrás de la enzima. Seguramente se nece~itan otros factores para llevar a cabo el proceso. Dicha proteína faciita dora también es necesaria para otras reacciones en que los nucleosomas pueden desplazarse, incluidas replicación y reparación del DNA. Para mantener la integridad de la cromatina en regiones en proceso de transcripción. se requiere de Otros facwres , tal ve t. porque también participan en el desensamblado y rcensamblndo de los nucleosomas, pero no hay todavía información detallada acerca de sus funciones .

Los aislantes impiden la acción de los potenciadores y la heterocromatina Conceptos pñnc.ipales ' Los aislantes pueden impedir el paso de cualquier efecto activador o desactivador desde los potenciadores, silenciadores y LCR. • Los aislantes suelen constituir barreras para evitar la dispersión de la heterocromatina.

29.14 Los aislantes impiden la acción de los potenciadorés y la heterocromatina

781

Transcripción --..

]]~JJ~ H2B H2A

,Y

} FAC T libera el dfmero H2A·H2B

~....._,~~ ] Otros factores libe ran H3·H4

La pofimerasa de ANA se m1..1eve a · fo largo del DNA libre ]

Un potenciador activa a un promotor Potenciador Promotor

Transcripción Un aislante bloquea la acción del potenciador Potenciador Aislante Promotor

Un potenciador activa a un promotor en s.._ alrededores, pero un aislante localizado entre ambos pu~~ impedírselo.

Un aislante activo es una barrera para la heterocromatina

J Transcripción El nucleosoma se reensambla

Los octámeros de histonas se desensamblan antes de la t ranscripción en proceso para eliminar nucleosomas y se forma n nuevamente después de la t ranscripció n. La liberación de dímeros H2A-H2B probablemente i nicie el proceso de desensamblado.

Los elementos que evitan el paso de los efectos activadores o desactivadores se llaman aislantes, y tienen una de dos propiedades clave, o ambas: • Cuando un aislante se coloca entre un promotor y un potenciador, impide que el potendador active al promotor. El efecto del bloqueo , lo cual podría se muestra en la explicar cómo la acción de un potenciador se limita a un promotor en particular. 782

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

La heterocromatina puede dispersarse a pede un cen tro y después bloquear a cualquier promotor que .:...bra. Un aislante puede ser una barrera para la propagación e~ _ heterocromatina, que permite al promotor mantenerse acti :

• Cuando un aislante se coloca entre un geactivo y la heterocromatina constituye !! barrera que protege al gen contra el efecrc • desactivación. que se propaga desde la hetercr malina. (La heterocromatina es una regi ... de la cromatina inactiva, resultado de su é"tructura de orden superior; véase la secdc~ 31.2, La heterocromatina se propaga a p~­ de un suceso de nucleación.) El efecto :barrera se muestra en la Algunos aislantes poseen ambas propiedaée y otros sólo una, o bien, funciones de bloquee. · barrera pueden están separadas. Aunque ambas a.:tividades posiblemente sean mediadas por cambi en la estructura de la cromatina, tal vez impliqt:e.efectos diferentes; en cualquier caso, el aislante C::fine el límite para los efectos a largo plazo. ¿Cuál es el objetivo de un aislante? Una h=ción imponante podría ser contrarrestar las accio::e indiscriminadas de los potenciadores sobre los pr ·

motores. Casi todos Jos potenciadores actúan cerca de algún promotor, y un aislante puede restringirlo impidiendo que Jos efectos rebasen cierto punto, de modo que sólo pueda actuar en un promotor específico. Asimismo, cuando un gen está cerca de la heterocromaLina, un aislante puede impedir que sea desactivado inadvertidamente por la dispersión de la heterocromarina. Los aislantes, por tamo, actúan como elementos que hacen más precisa la regulación génica.

Los aislantes pueden definir un dominio Concepto principal • Los aislantes son estructuras especializadas de la cromatina con sitios hipersensibles. Dos aislantes pueden proteger de todo efecto externo La región que los separa.

Los aislantes se descubrieron durante el análisis de la región del genoma de Drosophíla melanogascer que se resume en la . Dos genes para la proteína Hsp70 (proteína de choque térmico) yacen en una región de 18 kb que constituye la banda 87A7, en cuyos extremos se encuentran las estructuras especiales ses y ses' (estructuras especializadas de cromatina). Ambas constan de una región muy resistente a la fragmentación por desoxirribonudeasa 1 y a uno y otro lado hay sitios hipersensibles espaciados casi cada 100 bp. El patrón de escisión de dichos sitios se altera cuando los genes son activados por un choque térmico. Los elementos ses aíslan a Jos genes hsp70 de los efectos de las reg iones circundantes. Si se toman unidades ses y se colocan a cada lado de un gen blanco, éste funcionará en cua lquier punto del genoma en que se coloque, incluso en sitios en que, por con·

texro, normalmente sería reprimido, por ejemplo, en regiones heterocromáticas. Las unidades ses y ses' no parecen participar ni positiva ni negativam ente en el control de la expresión génica, sino que apenas restringen los efectOs del paso de una región a la siguiente. No obstante, si regiones adyacentes ejercen efectos represivos, estos elementos ses podrían ser necesarios para bloquear la dispersión de tales erectos y, por tanto, tal vez serían esenciales para la expresión génica. En ese caso, la deledón de raJes elementos podría eliminar la expresión de los genes adyacentes. Los elementos ses y ses' tienen diferentes estructuras y no parecen apoyarse en la misma base para su actividad aislante. La secuencia clave de estos elementos ses es una tira de 24 bp que se une al producto del gen zw5. La propiedad aislame de ses' reside en una serie de repeticiones CGATA, que se unen a un grupo de proteínas relacionadas llamado BEAF-32. La proteína muestra una localización

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28kb

B7A6

87A7

350 bp res1stente

++

se115ible

87AB

hsp70 hsp70

ses

~·

1 sensible

ses'

200 bp resistente

++ 1 ~· ~

sensible

sensible

Estructuras especializadas de cromatina, que incluyen sitios de hipersensibilidad, marcan los extremos de un dominio del genoma de D. melonogaster y aislan a los genes intermedios de los efectos de las secuencias circundantes.

Una proteina que se une al aislante ses' se localiza en interbandas de cromosomas politénicos del género Drosophilo. La tinción roja identifica el ONA {las bandas) en ambas muestras, superior e inferior; la tinción verde identifica a BEAF32 (a menudo en interbandas) en la muestra superior. la coincidencia de las dos marcas se señala con amarillo (es decir, BEAF32 está en una banda). Reproducida de Cell, vol. 81, Zhao, K., Hart, C. M., y laemmli, U. K., Visuolizotion of chromosomol... pp. 879-889. Copyright 1995, con autorización de Elsevier. Imagen cortesía de Ulrich K. laemmli, University of Geneva, Switzerland. 29. b Los aislantes pueden definir un dominio

7&:

definida en el núcleo, pero los datos más notorios provienen de su localización en cromosomas politénicos. En la se muestra que el anticuerpo contra BEAF-32 tiñe -50% de las interbandas de los cromosomas politénicos. lo cual sugiere que hay muchos aislantes en el genoma, y que BEAF32 es una parte común del aparato aislante. Esto implícaría que la banda es una unidad funcional y que las interbandas a menudo tienen aislantes que impiden la propagación de puntos de activación o desactivación. Otro ejemplo de un aíslante que define a un dominio es la LCR de la p-globina de pollo (grupo de sitios hipersensibles que controlan la expresión de todos los genes de la B-globina; véase la sección 29.20, Una LCR puede controlar a un dominio). El sitio hipersensible más alejado hacia la izquierda de la LCR de la B-globina de pollo (HS4) es un aislante que marca el extremo 5' del dominio funcional y restringe la actividad de la LCR a los genes de globina del dominio. Un gen rodeado de aislames suele estar protegído contra la propagación de efecws de desactivación desde las regiones circundantes. La prueba consiste en insertar DNA por transfección en un genorna en localizaciones aleatorias. La expresión de un gen de la secuencia insertada a menudo es errática, y si bien en algunos casos -se expresa apropiadamente, en otros se extingue . No obstante, cuando los aislantes con funcíón de barrera se colocan a ambos lados del gen, en el DNA insertado, por lo general su expresión es uniforme en todos los casos.

SD

Los aislantes pueden actuar en una di rección

_Concepto pñncipal • Algunos aislantes tiene direccionalidad, de modo que pueden detener el paso de los efectos en una dirección, pero no en la otra.

Los aislantes pueden tener propiedades direccionales. Las inserciones del transposóngypsy en ellocus yellow (y) de D. melanogasler provocan la pérdida de la función del gen en algunos tejidos, no así en otros. El motivo es que el locus y es regulado por cuatro potcnciadores, como se muestra en ia . Donde quiera que se inserte gypsy, bloquea la expresión de todos los potendadores que separa del promotor, pero no de aquéllos ubicados del otro lado. La secuencia encargada de ese efecto es un aislante que yace en un extremo del uansposón, el cual actúa independientemente de la orientación de su inserción. 784

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

Posiciones de potenciado res para tejidos específicos ala cuerpo cerdas garras hoja cutícula tarsales

Exón 1

Exón 2

.w. Inserción del aislante y patrón de expresión

+

+

+

+

+

+

+

.,.

+

+

El aislante del transposón gypsy bloquea "" acción de un potenciador cuando se coloca entre potenciacy promotor.

Algunos de los potenciadores se encuentra en flujo ascendente respecto del promotor y otros ~~ flujo descendente, de manera que el efecto no puo;;de depender de la posición respecto del promot• tampoco es necesario que haya transcripción a tr.:vés del aislante. EstO es diffciJ de explicar en funci¡; de modelos de asa para la interacción potenciad C'"promoror, la cual pronostica esencialmente lar. peninencia del DNA interpuesto. El modelo obn que viene a la mente es un mecanismo de rastreo en que alguno de los componentes debe moverse eforma unidireccionaL del porenciador al promot o~ pero es difícil hacer coincidir ese punto de vista o las caracterizadones previas de la independencia e los potenciadores respecto de tales efectos. Las proteínas que actúan sobre el aislante ha:sido identificadas por la existencia de otros dos l e~ que afectan la fu nción del aislante en forma iran: Las mutaciones en su(Hw) suprimen el aislamiem de modo que y se expresa en tOdos los tej idos a pes3del aislante, lo cual sugiere que codifica una prote: na que reconoce a l aislante y que es necesaria par~ su acción. El su(Hw) tiene un segmento de DNA codedo de zinc; el mapeo de los cromosomas politér..:cos muestra que está unido a gran número de sido~ El aislante contiene doce copias de una secuenct~ de 26 bp que se une a Su(HW). Las manipulacionC' muestran que la potencia del aislan te depende dt número de cop ias de la secuencia de unión . El segundo locus es mod(mdg4), en el cual lamutaciones producen el efecto contrario, com. en la pérdida de direccionalidad. Ta les mutaciLnes aumentan la eficacia del aislante por extensiór de sus efectos, de manera que impida la utilización de los potenciadores a ambos lados. El su(Hw) es epi~­ tático respecto de mod(mdg4), es decir, que en um doble mlltante se observa sólo el efecto de su(Hu

Fab-7 Control iab-5 iab-6 iab-7 transcripcional

l

AS

Abd-8

l l

AS

A7

Mod{mdg4)

Delación de Fab-7

1 Periferia nuclear

¡ l

Control /ab-5 transcripcíonal

En la periferia del núcleo se encuentran complejos Su(Hw)/mod(mdg4) que pueden organizar el DNA en asas que limitan las interacciones potenciador-promotor.

lo cual implica que mod(mdg4) actúe a través de su(Hw). La participación básica de la proteína de üpo silvestre dellocus mod(mdg4) es, por tanto. imponer direccionalidad a la capacidad de su(Hw) de aislar promotOres dentro de esos límites. Por tanto, la unión de su(Hw) con el DNA. seguida de la unión de mod(mdg4) con su(Rw), da lugar a un bloqueo unidireccional de la aclivación de un promotor, lo cual sugiere que el aislante unjdo por su(Hw) puede extender la inactividad en ambas direcciones. pero mod(mdg4) detiene el efecto de dispersión en una dirección. Tal vez haya una direccionalidad intrínseca en la cromatina que finalmente resulte en la incorporación de su(Hw). mod(mdg4) o algún otro componente, en una orientación, supuestamente en virtud de la interacción con algún componente de la cromatina que, en sí, tenga orientación preferencial. Se ría necesario revertir cualquier direccionalidad de esas características en el promotor. Es posible que los aislantes actúen haciendo cambios en la estructura de la cromatina. Un modelo proviene de la observación de que los sitios de unión de Su (Hw) y mod(mdg4) están presentes en >500 locali:zaciones de un genoma del género Drosophila. Sin embargo, la visualización de los sitios en que las proteínas se unen al núcleo muestra que se localizan a -25 sitios definidos en torno a la periferia del núcleo, lo cual sugiere el modelo de la , en el cual, las proteínas Su(Hw) unidas en diferentes sitios del DNA se conjuntan por enlace con mod(mdg4). El complejo Su(Hw)/mod(mdg4) se localiza en la periferia nuclear. El DNA unido a él se organiza en asas, de las cuales podría haber -20 en un complejo promedio. Las interacciones potendador-promotor deben ocurrir sólo dentro de un asa y no pueden propagarse entre ellas.

AS

iab-6

1

iab-7

Abd-8

J

A7

AS SimUla A7

El Fob-7 es un elemento limítrofe necesario para la independencia de los elementos reguladores iab-6 e iab-7.

fE

Los aisla ntes pueden variar en potencia

Concepto principal • Los aislantes difieren en cuanto a eficacia para impedir el paso de una señal de activación.

En ocasiones, los elementos con dHerentes p ropiedades de acción en configuración cis se combinan para generar regiones con efectos reguladores complejos. La región Fab-7 es definida por delecio nes en el locus bithorax del género Drosophila, que comiene una serie de elementos reguladores en configu ración ds que controlan las acüvidades de tres unidades de transcripción. La pane importante dellocus se ilustra en la . Los elementos reguladores iab-6 e iab-7 controlan la expresión del gen adyacente Abd-B en regiones sucesivas del embrión (segmentos A6 y A7). Una deJedón de Fab-7 hace que A6 se desarrolle como A7 y no en la forma acostumbrada; este efecto dominante sugiere que iab- 7 ha tomado el control sobre iab -6, lo cual se puede interpretar en función de las moléculas por el supuesto de que Fab -7 proporciona un límite que impide que iab-7 actúe cuando iab-6 suele estar activo. Como otros elementos Limítrofes (aislantes), el Fab-7 contiene una estructura distintiva de ero2i.l, 1/ Los aislantes pueden variar en potencia

7 85

marina marcada por una serie de sitios hlpersensibles. En cuanto a su capacidad para proporcionar un límite, la región puede dividirse en dos tipos de elementos por deleciones más pequeñas y por análisis de fragmentos. Una secuencia de -3.3 kb se conduce como aislante cuando se coloca dentro de otras estructuras, una secuencia de -0.8 kb se conduce como represor que actúa sobre iab -7. La presencia de esos dos elementos explica la compleja conducta genética de Pab-7 (que no ha sido descrito con deta11e). Los efectos de sustituir otros aislantes con Fab-7 permiten profundizar en la acción del elemento límite. El efecto de Jlab-7 no es más que evitar interacciones enrre iab-6 e iab-7. No obstante, cuando se cambia Pab-7 por un aislante diierente [de hecho, un sitio de unión para la proteína Su(Hw)), se observa un efecto más fuerte: iab-5 toma el control de iab-7. Cuando se usa un elemento se~, el efecto se extiende hasta iab4, lo cual sugiere un esquema en que Jos elementos más fuenes pueden bloquear la acción de secuencias reguladoras que yacen más lejos. Esta conclusión introduce una dificuJtad para explicar la acción de los elementos límite, los cuales no pueden actuar en esa forma simplemente impidiendo la transmisión de los efectos más allá del lúnite, lo cual apunta en contra de modelos basados en el simple rastreo o en la inhibición de la propagación lineal de efectos estructurales, además de sugerir que puede haber algún tipo de efecto competitivo en que la fortaleza del elemento determine qué tan lejos puede llegar su efecto. La situación se complica aún más por la existencia de elementos antiaislante que permiten a un pmenciador superar Jos efectos del bloqueo de un aislante, lo cual nuevamenre sugiere que aquellos efectos son mediados por algún tipo de control sobre la cstructUJa local de la cromatina.

Los sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa reflej an ca mbios en la estructura de la cromatina Conct!ptos pnncipales En los promotores de los genes expresados hay sitios hipersensibles. • Estos sitios son generados por la unión de factores de transcripción que desplazan a los octámeros de histonas.

Además de los cambios generales que ocurren en regiones activas, o potencialmente activas, se pre sentan modificaciones estructurales en sirios espe786

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

cíficos vinculados con el inicio de la transcripción o con ciertas características estructurales del DNA. Esos cambios se detecraron por primera vez merced a los efectOs de la djgestión con concentractone~ muy bajas de la enzima desoxirribonucleasa I. Cuando digiere a la cromatina, como prime; efecto introduce roturas en sitios hipersensibles específicos de la cadena doble. La susceptibilidac a la desoxirribonucleasa 1 refleja la disponibilidac. del DNA en la cromaúna, por lo cual se toman ese-: sitios como representativos de regiones cromática ~ en que el DNA esrá panicularmentc expuesto porque no se encuentra organizado en la estructura usual de nucleosomas. Un si tio hipersensible típi0 es 100 veces más sensible a 1 ataque de las enzima< que la mayor parte de la cromatina. Esos sitios también son llipersensibles a otras nucleasas y agemeoqu[micos. Los sitios hlpersensiblcs se crean debido a la e~­ tructura de la cromatina (específica de tejido). s~ localización puede determinarse por la técnica do:: marcado terminal indirecto, presentada ames en C". contexto del posicionamiento de los nuclcosoma5 Esa aplicación de la técnica se recapitula en la . En este caso se utiliza la escisión p desoxirribonucleasa r en el silio hipersensible pa;: generar un extremo del fragmento y su distancia S: mide desde el otro extremo, generado por la escsión con una enzima de resLricción. Muchos de los sitios hipersensibles tienen relación con la expresión génica. Todo gen activo tie~c un sitio, o más de uno, en la región del promotc-:-

Casi todos los sitios hipersensib!es se encuentran s6lo : la cromati11a de las células en que está expresándose gen vinculado, no cuando el gen está inactivo. l~"" sitios hipcrsensibles 5' aparecen antes de que se in..cie la transcripción, y para la expresión génica Y.: requieren las secuencias de .DNA contenidas en : sitios hipersensiblcs, como se observa por análi~ .­ de mutaciones. Una región sensible a nudeasas, parricuJarme:--te bien caracterizada, yace en el minicromosorr; SV40. Un scgmemo cono cercano al origen de ..z replicación, apenas en flujo ascendente respecto Ce promotOr de la unidad de transcripción tardía, , escindido preferencial mente por la desoxirribon:..cleasa I, la nuclcasa de micrococos y otras nuclea$:. (incluidas las enzimas de restricción). El estado del minicromosoma SV40 puede eservarse al microscopio electrónico. Hasta en 2(' de las muestras se observa un "espacio" en la orf: nización del nucleosoma, el cual es evidente en .Ese espacio es una reglón de -20 ... de longitud (casi 350 bp), con nucleosomas a une otro lado. El espacio visible corresponde a la regi

Sitio hipersensible

El minicromosoma de SV40 tiene una brecha de nucleosoma. Imagen cortesía de Moshe Yaniv, Pasteur Institute.

Extracción del DNA

Escisión con enzima de restricción

-=Eiectroforesis y mancha con sonda para una región adyacente al sitio de restricción

! -300

La banda consta de un fragmento cortado en un extremo por la desoxirribonucteasa 1 y en el otro por una enzima de restricción

-50 Región tardía de SV40 Punto de inicio Sitios de escisión

1

Gen de J3-globina

El marcado terminal indirecto permite medir la distancia entre un sitio hipersensible y la desoxirribonucleasa desde un sitio de corte por restricción. La existencia de un sitio de corte en particular para la desoxirribonucleasa 1 genera un fragmento bien definido, cuyo tamaño identifica la distancia del sitio hipersensible a la desoxirribonucleasa 1, desde el sitio de restricción.

El segmento de SV40 incluye sitios hipersensibles, regiones sensibles y una región protegida del DNA. El sitio hipersensible de un gen de la p-globina de pollo incluye una región susceptible a varias nucleasas.

sensible a nucleasas, lo cual muestra directamente que la mayor sensibilidad a las nucleasas se relaciona con la exclusión de nucleosomas. Un silio hipersensible a las nudeasas no necesariamente lo es de manera uniforme. En la se muestran dos mapas que ilustran este fenómeno. Dentro del espacio de -300 bp del SV40 hay dos sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa J y una región UprotcgidaH; esta última posiblemente refleje la relación de las proteínas (no histOnas) con el DNA. El espacio se relaciona con elementos de la secuencia del DNA necesarios para la función del promotor. El sitio de hipersensibilidad del promotor de la ~ - globina es digerido preferentemente por varias enzimas, entre otras, desoxirribonucleasas I y II y nucleasa de micrococos. Las enzimas tienen sitios

preferidos de escisión que yacen en puntos ligeramente diferentes de la misma región general. Así, a una región que va de -70 a -270 de preferencia acceden las nucleasas cuando el gen es susceptible de transcripción. ¿Cuál es la estructura del sitio hipersensible? Su accesibilidad preferencial a las nucleasas indica que no está protegido por octámeros de histona, pero eso no necesariamente implica que esté libre de proteínas. Una región de DNA libre puede ser vulnerable al daño y, en todo caso, ¿cómo podría excluir a los nucleosomas? Se supone que el sitio hipersensible es resultado de la unión de proteínas reguladoras espeóficas que excluyen a los nudeosomas. De hecho, la unión de tales proteínas tal vez constituya la base para la existencia de la región protegida dentro del sitio hipersensible.

-300

-200

-100

o

100

Posic1ón respecto del punto de inicio

29.18 Los sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa reflejan cambios en la estructura de la cromatina

787

Es posible que las proteínas que generan sitios hipersensibles sean factores reguladores de vaJios d.pos, pues dichos sitios se relacionan con los promotores, otro tipo de elementos que regulan la transcripción, los orígenes de la replicación, los centrómeros y los sitios con otro significado estructural. En algunos casos se vinculan con una organización más amplia de la estructura de la cromatina. Un sirio hipersensible puede constituir un límite para una serie de nucleosomas en posición. Los sitios hi~ persensibles vin culados con la transcripción pueden ser generados por factores de transcripción cuando se unen al promotor como parte del proceso que los hace accesible a la polimerasa de RNA (véase la sección 30,4, La organización del nucleosoma puede cambiarse en el promotor} . La estabilidad de los sitios hipersensibles se re~ vela por las propiedades de Jos fibroblastos de pollo transformados con virus de tumor sensibles a la temperatura . En esos experimemos se aprovecha una propiedad inusual, pues aunque los fibroblasros no pertenecen a la línea eritro ide, la transformación de las células a temperatura normal lleva a la activación de los genes de globina, que así activados, son sitios hipersensibles. Si la transformación se hace a una temperalur<.. mayor (no permirida) , los genes de globina no se activan, y los sitios hipersensibles no apa recen. Cuando los genes de globina se han activado por transformación a baja temperatura, pueden desactivaxse por elevación de ésta, aunque se mantienen cuando menos du rame las siguienres 20 replicaciones ce lulares. Este resultado demuestra que la adquisición de un sitio hipersensible es sólo una de las características necesarias para jniciar la transcripción, e implica que los sucesos involucrados en el establecimiento de un sitio hipersensible sean di[erentes de los encargados de perpeLUarlo. Una vez que se ha establecido el sitio, se perpetúa por replicación si no se presentan las condiciones necesarias para la inducción. ¿Podría ser necesaria alguna intervención específica para suprimir un sitio hipersensible?

Los dominios definen regiones que contienen genes activos Concepto principal Un dominio que contiene un gen transcrito se define por su mayor sensibilidad a La fragmentación por la desoxirribonucleasa l.

La estructura de una región del gcnoma que contiene un gen activo, puede estar alterada. El cambio de estructura precede a la ruptura de la estrucwra

788

CAPÍ1ULO 29 Nucleosomas

del nucleosoma y es diferente de ésta, que pod:- ~ ser secundaria al verdadero paso de la pol imer~ · sa de RNA Un índice del cambio de la cromatir transcrita depende de esa mayor susceptibilidad 2 fragmentación por desoxirribonucleasa 1, que deti:a un dominio cromosómico, región de estrucn.... alterada que incluye cuando menos una unidad transcripción activa y que llega a extenderse m .a (Nótese que el uso del térm ino "dominio" no inn ca necesariamente una conexión con los domi o estructurales identificados por las asas de cromat_ o los cromosomas.) Cuando la cromatina es digerida con desoxirbonudeasa I, podría degradarse a un material St 1 ble en ácido (fragmentos muy pequeños de D~ ­ y la reacción general avanzaría en función del r centaje de DNA modificado de esa forma . Cua· sólo el 10% del DNA total se ha vuelto soluble en ác se pierde más del 50% del DNA de ungen activo, la ::: sugiere que los genes activos se f ragmentan de mm;c

preferencial. El destino de los genes individuales se rasr: _ con una sonda específica por cuantificación de cantidad de DNA que sobrevive para la reacd protOcolo incluido en la . El princ: es que la péfdjda de una banda en panicular ir ca que la región correspondiente del DNA ha S" fragmenrada por la enzima. En la se muestra lo que sucede los genes de la ~ - globina y con un gen de ov búmina en la cromatina extraída de los eritroc de pollo (los genes de globina se expresan y el ge~ ovoalbúmina está inactivo). Los fragmentos de : tricción que representan genes de ~ - globiua se r den rápidamente, en tanto Jos que represeJJtaf' gen de ovoalbúmina muestran poca fragmentac (de hecho, el gen de ovoalbúmioa, es digerido <~ misma velocidad que la mayor parte del DNA..1. Por tanto, la mayor parte de la cromatim relativamente resistente a la desoxirribonuck ~ I y contiene genes no expresados (así como a: secuencias). Un gen se torna relativamente suscer;a la enzíma de manera específica en el tejido en qt

expresa. ¿Es la susceptibilidad preferencial una cara_ rística sólo de los genes de e.h.'Presión más bien a a: como el de la globina, o de todos los genes acti· Los experimentos mediante sondas que r epre tan a todo el grupo de RNAm celulares sug!t que todos los genes activos, ya sea que codlfiq RNAm abundantes o raros, son preferiblem c_ susceptibles a la desoxirribonucleasa T (aunque variaciones en el grado de susceptibilidad). Lus • nes que rara vez se expresan posiblemente ter._ muy pocas moléculas de polimerasa de RNA -

Digestión de la cromatina con desoxirribonucleasa 1

~

~

~

~ a

Electroforesls de los fragmentos y desnaturalización del DNA: sonda para genes expresados y no expresados

Ovoalbúmina de control

b

Sonda 1• -

-

Sonda2

O .01 .05 .10 .50 1.0 1.5 J.Jg/ml Desoxirribonucleasa

En células eritroides del adulto, el gen de la del adulto es muy sensible a la digestión por deso>
Comparación de Intensidades de bandas en preparados en que la cromatina fue digerida con concentraciones crecientes de desoxirribonucleasa

Desoxirribonucleasa La sonda i de DNA se digiere de manera preferencial

Desoxirribonucleasa La sonda 2 de DNA no se dig1ere de manera preferencial

La desoxirribonucleasa I se puede medir mediante una sonda específica, por determinación de la tasa de desaparición del material con hibridación.

realmente se involucren en la transcripción en un momento dado; ello implica que la sensibilidad a la desoxirribonucleasa J no proviene del acto de la transcripción. más bien es una característica de los

genes que pueden ser transcritos. ¿Cuál es la extensión de la región preferentemente sensible? Esto puede determinarse mediante una serie de sondas que representan las regiones de los flancos. así como la unidad de transcripción misma. La región sensible siempre abarca toda la región transcrita; una región adicional de varios kb a cada lado mostraría un nivel intermedio de sensibilidad (tal vez como resultado de efectos de dispersión) . El con cepto crítico implícito en la descripción del dominio es que la región de al La sensibilidad a

la desoxirribonucleasa 1 cubre una distancia considerable. A menudo se piensa en la regulación como dependiente de sucesos que ocurren en un sitio definido del DNA, por ejemplo, de la capacidad de iniciar la transcripción en el promotor, pero incluso si esto [uera válido, tal regulación debería determinar un cambio de mayor envergadura en la estructu ra, o bien ir acompañada de él. Esta es una diferencia entTe eucariotas y procariotas.

Una LCR puede controlar a un dominio Concepto printipal • Una LCR se localiza en el extremo 5' del dominio y consta de varios sitios hipersensibles.

Todo gen es controlado por su promotor, y algunos genes también responden a los potendadores (que contienen elementos de control similares, pero más alejados), según se describió en el Capítulo 24, Promotores y potenciadores, pero esos controles locales no son suficientes para todos los genes. En algun os casos, un gen yace en un dominio de varios genes. todos bajo la influencia de elementos regu ladores que actúan en el dominio completo. Esos elementos 29.20 Una LCR puede controlar a un dominio

789

HS4 HS1

kb

Genes de globina

20

40

60

80

Un dominio de globina es marcado por sus sitios hipersensibles en ambos extremos. El conjunto de sitios del lado 5' constituye a La LCR y es indispensable para la función de todos los genes del grupo.

se identificaron por la incapacidad de una región de DNA, que incluye un gen y todos sus elementos reguladores conocidos, para expresarse apropiadamente cuando son introducidos a un animal a ma nera de transgén. El ejemplo mejor caracterizado de un grupo de genes regulados es el de los genes de la P-globina de mamífero. Recuérdese de la Figura 6.3, que los genes de a y ~- globina en mamíferos se encuenuan como grupos de genes relacionados que se expre san en diferentes momentos durante el desarrollo embrionario y el adulto. Esos genes están provistos de un gran número de elementos reguladores analizados en detalle. En el caso del gen de la P-globina humana del adulto, las secuencias reguladoras se encuentran en los extremos 5' y 3' del gen, e incluyen elementos positivos y negativos en la región del promotor, así como elementos positivos adicionales en el gen y en Oujo descendente respecto del mismo. Sin embargo, un gen de la ~ -globina humana que contenga todas esas regiones de control, nunca se expresará en un ratón transgén.ico en un orden de magnitud del ámbito de tipo silvestre, pues se requiere de alguna secuencia reveladora adicional. Las reservas que proporcionan una función reguladora adicional son identificadas por los sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa 1 que se encuentran en los extremos del conjunto. El mapa de la muestra que los 20 kb en flujo ascendente respecto del gen épsilon contienen un grupo de cinco sitios, y que hay un sitio a 30 kb en flujo descendente del gen~ . Con la Lransiccción de varias estructuras en células de la eritroleucemia del ratón, se muestra que las secuencias entre los sitios hipersensibles individuales de la región 5' se pueden eliminar sin mucho efecto, pero que la eliminación de cualquiera de los sitios reduce el nivel general de expresión. Los sitios 5' son los principales reguladores, y el grupo de sitios hipersensiblcs se lJama región de control del locus (LCR); no se sabe si e l sitio 3' 790

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

tiene alguna función. La LCR es absolutamente cesaria para la expresión de cada uno de los ge:dc globina del grupo, aparte de que cada ger. regulado adicionalmente por sus propios conr:-~ específicos, algunos de los cuales son autónol!:. La expresión de los genes e y y en conjunción : -LCR parece intrínseca a esos loci, en tanto que o~ ­ controles parecen depender de la posición en el i:-po, lo cual sugiere que el orden génico en un gr_es importante para la regulación. Toda la región que contiene los genes de gloty que se extiende aún más, constituye un d omir cromosómico, que muestra mayor sensibilidad : digestión por la desoxirribonucleasa I (véase la ? 29.52). La del.eción de la LCR 5' restablece la re. tencia normal a la desoxirribonudeasa en roe ~ región. Dos modelos de funcionamiento de una !.:proponen que su participación es necesaria pare ~ tivar al promotor, o bien, se necesita para aume:: su velocidad de transcripción. La naturaleza eJ. ?de las interacciones entre la LCR y los promm -individuales no es todavía muy clara. ¿Este modelo es aplicable a otros grupos de = nes? Ellocus de globina a tiene una organiza'-" similar de genes que se expresan en diferentes menros, con un conjunto de sitios hipersens:: en un extremo del grupo y mayor sensibilidc . la desoxirribonuclcasa I en toda la región. Só: conoce un pequeño número de casos en que - LCR controla a un grupo de genes. Uno de esos casos impLica que una LCR cont: genes en más de un cromosoma. La T"'2LCR reg. coorclinadameme a un grupo de genes disperso, 120 kb del cromosoma 11 por interacción cor. _ promotores; también interactúa con el pro moto: _ gen de IFNy en el cromosoma 1O. Los dos tipo-; . interacción constituyen alternativas que co.r:np; ~­ den dos destinos celulares diferemes, esto es, e~ grupo de células la LCR causa expresión de los gt en el cromosoma ll, mientras que en el otro, !:,;: que se exprese el gen del cromosoma 10.

=

¿Qué constituye un dominio regulador? Concepto

principal

• Un dominio puede tener aislante, LCR y sitio de uni(la la matriz, así como unidades de transcripción.

Si se conjuntan los diversos tipos de estructuras~ ­ contrados en d.ilerenres sistemas, se puede pe:-1..;~ acerca de la posible naturaleza de un dominio e: mosómico. La característica básica de un dornir regulador es que los elementos reguladores pue:.

actuar sólo en unidades de transcripción del mismo dominio, t:l cual podría comener más de una unidad de transcripción, un porenciador, o ambos. En la se resume n las estructuras que podrían participar en la deftnidón de un dominio. Un aislante detiene el paso de los efectos activadores o represores. Eo su forma más simple, un aislante bloquea cualquier tipo de efecto de paso, pero puede haber relaciones más complejas en que el aislante bloquee sólo un tipo de efecto. acrúc de manera direccional, o ambos. Se supone que la acdón de los aislantes afecta la estructura de la cromatina de orden superior, pero no se conocen los deta lles ni la variedad de tales e rectos. Un sit io d e un.ió n a la matriz (MAR) puede encargarse de unir la cromatina con un sitio de la periferia del núcleo (véase la St'cción 28.6, SeC\lencias específicas unen el DNA a una mat riz de interfase). D ichas secuencias posiblemente se encargan de crear dominios físicos del DNA que adoptan la forma de asas que salen de los sitios de unión, de manera muy parecida a un modelo de acción de aislante. De hecho, algunos elementos de MAR se comportan como aislantes en experimentos in vitro, pero parece que su capacidad de unir el DNA con la matriz se puede separar de su función de aislame. de manera que no es una simple acci6n de causa y efecto. No sería sorprendente que el aislante y los elementos de un MAR se vincularan para mantener una relación entre electos reguladores y estructura fisica. Una LCR actúa a distancia y cualquiera de los genes puede necesitarla en un dominio por expresar (véase la sección 29.20, Una LCR puede controlar u n dominio). Cuando un domin io tiene una LCR. su función es esencial para todos los genes del mismo, pero 1as lCH no parecen ser comunes. Para su funcionamiento podrían necesitarse varios tipos de estructuras en configuración de acción cis. Como se definió originalmente, la propiedad de la LCR yace en el sitio hipexscnsible similar a un potenciador, necesaria para la actividad completa de Jos promotores del dominio. La organi7ación de dominios puede llegar a explicar el gran tamaño del genoma. Para que tal estructura funcionara, se requeriría cierta cantidad de espado, por ejemplo, para permitir que la cromatina se descondensara y se hiciera accesible. Aunque las secuencias exactas de gran parte de la unidad podlian no tener importancia, tal vez emraría en acción la selección en cuanto a cantidad global de DNA en su interior, o cuando menos para evitar que diversas unidades de transcripdón estuvieran demasiado cerca.

Aislante

MAR LCR

Potenciador

~'-A Unidades de transcripción

Los dominios pueden poseer tres tipos de siti
E

Resumen

Toda la cromatina cucatiótica consta de nudeoso mas. Un n ucleosoma conli ene una longitud característica de DNA. por lo general -200 bp, que se ubican en torno a un octámero que contiene dos copias de cada una de las histonas H2A, H2B, ID y H4. Una proteína Hl aislada se vincula con cada nucleosoma. Virtualmente todo el DNA genómico se organiza en nucleosomas. El tratamiento con nllcleasa de micrococos muestra que el DNA empaquetado en los nucleosomas puede dividirse en dos regiones deo;de el punto operativo. La nucleasa digiere rápidamente la región de enlace, si bien la región medular de 146 bp es resistente a esa digestión. Las histonas H3 y H4 son las más conservadas y un tetrámero H3 1-H4 2 contribuye al diámetro de la partícula. Las hlstonas H2A y H2B se organizan como dos dímeros H2A-H2B. Los octámeros se ensamblan por adición sucesiva de dos dímeros H2AH2B al núcleo H3 2 -H42 • La vía del D.NA que rodea al octámero de histonas crea -1.65 superhélices. El DNA "entra'' y ''sale'' del nucleosoma en la misma zona, y podría ser sellado por una histona H L La elim inación de las histonas medulares linera -1.0 super hélices. La diferencia puede exp licarse en gran parte por un cambio en la pendiente hellcoidal del DNA, de un promedio de 10.2 bp/giro, en forma de nucleosoma, a 10.5 bp/giro, cuando está Ubre en solución. Hay variaciones en la estructura del DN A de una periodicidad de l 0.0 bp/giro en los extremos del nucleosoma a 10.7 bp/giro en su parte central, así como enroscamientos en la vía del DNA sobre el nudeosoma. Los nucleosomas están organizados en una fibra de 30 nm de diámetro. cCin seis por giro, y una razón de empaquetamiento de 40. La eliminación de Hl permite a esta fibra desplegarse en una de 10 nm que consta de una cadena lineal de nucleosomas. La fibra de 30 nm probablemente conste de la fibra de 10 nm enrollada en un solenoide con dos inicios. 29.2:2 Resumen

791

La fibra de 30 nm es el constituyente básico de la eucromatina y la heterocromatina; las proteínas no hlstonas se encarga11 de la organización adicional de La fibra en la cromatina o la ultraestrucrura del cromosoma. Hay dos vías para el ensamblaje de los nucleosomas. En la vía acoplada a la replicación, la subunidad de avance de PCNA del replisoma recluta a CAF-1, que es un factor de ensamblaje del nucleosoma, el cual facil ita el depósito de tetrámeros H\ -H4 2 en las cadenas hijas dobles resultantes de la replicación. Los tetrámeros pueden producirse por rotura de los nucleosomas existentes por el triplete de replicación o como resultado del ensamblado de histonas recién sintetizadas. Fuentes similares proporcionan los dfmeros H2A-H2B, que después se ensambLan con el tetrámero H3 2 -H42 para completar el nucleosoma. Dicho tetrámero y los dímeros I-I2A-H2B se ensamblan en forma aleatoria, de modo que los nuevos nucleosomas pueden incluir tanto las histonas previas como las de reciente simesis. La polimerasa de RNA desplaza a los octámeros d.e h istonas durante la transcripción. Los nucleosomas vuelven a formarse sobre el DNA después de que ha pasado la polimerasa, a menos que la transcripción sea muy intensiva (como en el DNAr), en cuyo caso, pueden desplazarse por completo. La vía independiente de la replicación para el ensamblaje del nucleosoma se encarga de sustituir los octámeros de histonas desplazados por la transcripción. Utiliza la variante de histona H3.3 y no H3. Para el ensamblaj e de nucleosomas en secuencias de DNA centroméricas después de la replicación, se usa una vía similar, con otra alternativa de H3. On aislante bloquea la transmisión de efecws de activación y desactivación en la cromatina. Un a islante localizado entre un potenciado r y un promotor impide que el primero active al segundo. Dos aislantes definen la región intermedia como un dominio regulador; las interacciones regulatmias dentro del dominio se limitan a él, de modo que queda aislado de los efectos externos. La mayor parte de los aislantes bloquea el paso de los efectos reguladores, en cualquier sentido, pero algunos son direccionales. Los aislantes suelen bloquear tanto los efectos activadores (interacciones porenciador-promotor} como los dcsacbvadores (mediados por dispersión de la heterocromalina), pero algunos se limitan a uno u otro. Se cree que los aislantes actúan por modjficación de la estructura. de la cromatina de orden mayor, pero se desconocen los detalles. La actividad génica se vincula con dos tipos de cambios de sensibilidad a las nucleasas. La cromatina susceptible de transcribirse tiene generalmente mayor sensibiUdad a la desoxirribonucleasa I, lo cual refleja un cambio en la estructura en una región 792

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

amplia, que puede definirse como dominio, y~­ contiene genes activos o potencialmente activos.=. sitios rupersensibles del DNA ocurren en local;:: dones bien definidas y se identifican por una~~­ slbilidad mucho mayor a la desoxirribonudeax Un sitio hipersensible consta de una secuencia - 200 bp a partir de la cual se excluyen los nuó: somas, por la presencia de otras proteínas, ader.: de que forma un límite que puede hacer que nucleosomas adyacentes tengan restricciones . cuanto a posición. El posicionamiento de los nuc:.::somas puede ser importante para controlar el a ce de proteínas reguladoras al DNA. Hay sitio.s hipersensibles en varios tipos de guladores; Jos que regulan la transcripción inclu: promotores, potenciadorcs y LCR, a diferencia ' otros, que incluyen orígenes para la replicació!'l centró meros. Un promoror o potenciador actúa bre un solo gen, pero una LCR contiene un gn.de sitios hipersensibles y puede regular un do mi= que contenga varios genes.

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Referencias

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BJD

los aislantes pueden definir un dominio

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BID

Los aislantes pueden actuar

en una dirección

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-

los aislantes pueden variar en potencia

Artículos de investigación Hagstrom, I< .• Muller, M., and SchecU, P. (1996). Fa,b· 7 functions as a chromatin domain boundary ro

794

CAPÍTULO 29 Nucleosomas

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Una LCR puede controlar a un dominio ~rtlcúlos dt> reV1sió 1 13ulger, M. and Groud.ine. M. (1999). Looping versus l.inking: 10ward a model [or long-distance gene activation. Genes/Jev. 13. 2465-2477. Grosvcld. F .• Amoniou, M., Ben·y. M., De Boer. E., Dio. N.. Ellis, J .. Fraser. P.. Hanscombe, O.• Hurst, J .. r lmam, A. ( 1993). The regulaúon of human globir gene switching. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 8 T3iol. S.. 339, 183-191.

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m

¿Qué constituye un dominio regulador?

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Referencias

795

Control de la estructura de La cromatina ESQUEMA DEL CAPÍTULO m:1 Introducción

Las desacetilasas se relacionan con los represores

II!D La cromatina puede tener estados alternativos

• La desacetilación se vincula con la represión de la actividad génica. Hay desacetilasas presentes en complejos con actividad

• La estructura de la cromatina es estable y no puede modificarse con la alteración del equilibrio de los factores de transcripción y las histonas.

repre~ora.

Las metilaciones de histonas y de DNA están relacionadas

EL remodelado de la cromatina es un proceso activo • Hay varios complejos de remodelado de la cromatina que utilizan la energía provista por la hidrólisis del ATP. • Los complejos SWJfSNF, RSC y NURF son muy ~randes todos y comparten algunas subunidades relacionadas. • Un modelo de remodelado no tiene en sí especificidad para algún sitio diana particular, sino que debe ser reclutado por un componente del aparato oe transcripción.

• La metilación de ONA y de histonas es una característica de la cromatina inactiva. Los do~ tipos de episodios de metilación pueden estar relacionados.

II!ii!]

• La acetilación de histonas se relaciona con la actividad

La organización de los nucleosomas puede cambiar en el promotor

génica. • La metilación de DNA y de histonas se relaciona con la heterocromatina.

• Los activadores esoedficos de secuencia reclutan complejos de remodelado a los promotores. El factor puede liberarse una vez que se ha unido el complejo de remodelado. • El promotor MMTV requiere un carnbio del posicionamiento rotativo de un nucleosoma que permita que un activador se una al ONA sobre el nucleosoma.

mD La activación del promotor comprende una serie

La modiñcación de las histonas es un episodio clave

ii!m

ordenada de episodios El complejo de remodelado puede reclutar al complejo de acetilación. .. La acetiladón de histonas puede ser el suceso que mantenga al complejo en estado activado.

• Las hístonas se modifican por metilación, acetilación y fosfori lación

Se encuentran algunos segmentos comunes en las proteínas que modifican la cromatina

ci rcunstancias • Ocurre acetilación de histonas de manera transitoria durante la replicación. • La acetilación de histonas se vincula con la activación de la impresión génica.

• E, dominio cromo se encuentra en varias proteinas de la cromatina que tienen efectos de activación o represión sobre la expresión de los genes. • e: dominio SET es parte del sitio catalítico de las transferasas de metilos de proteínas. • El dominio bromo se encuentra en una variedad de proteínas que interactúan con la cromatina y sirve oara reconocer sitios acetilados en las histonas.

II!D Las acetilasas se relacionan con activadores • La cromatina desacetilada puede tener una estructura más condensada. • Los activadore~ de la transcripción se relacionan con actividades de acetilasa de histonas en grandes complejos. las acetilasas de histonas varían en su especificidad diana. • La acetilación podría afecta r la transcripción en una forma cuantitativa o cualitativa.

La fosforilación de las histonas afecta La estructura de la cromatina • Al menos dos histonas son dianas de La fosforilación, tal vez con efectos contrarios.

IIi!!l Ocu rre acetilación de histonas en dos

796

Los estados de la cromatina se interconvierten por modificación

mB

Resumen

Ell

Introducción

Cuando se aborda la transcripción en términos de interacciones del DNA. factores de transcripción individuales y polimcrasas de RNA. se llega a la descripción precisa de los sucesos que tienen lugar in vitro, pero carece de una característica importante de la transcripción i11 vivo. El genoma celular está organizado en nucleosomas, pero en general se impide la iniciación de la transcripción si la región del promoror está empacada dentro de los nudeosomas. En e:;te sentido, las histonas actúan como represores generalizados de transcripción {una idea bastante antigua). si bien se ve en este capítulo que también parúcipan en interacciones más especificas. La activación de un gen requiere cambios en el estado de la cromatina: el tema esencial es cómo tienen acceso al DNA promotOr los factores de transcripción. La estmclu ra local de la cromatina es parte illtegral del control de la expresión génica. Los genes pueden estar presentes en una de dos condiciones estructura les. Se han encontrado genes en estado "activo" sólo en las células donde se expresan. El cambio de estructura antecede al acto de la transcripción e indica que el gen es "transcribible". Esto hace pensar que la adquisición de una estructura "activaN debe de 'ier el primer paso en la expresión génica. Los genes activos se encucnrran en dominios de la eucromatina con susceptibilidad preferencial a las nucleasa) (véase la sección 29.19, Los dominios definen regiones que contienen genes activos). Se crean sirios hipersensibles en los promotores ames de que se active un gen (véase la sección 29.18, Los sitios hiperscnsibles a la desoxirribonucleasa cambian la estructura de la croma rina). En fech a más recientf.! se ha visto que hay una conexión cen:ana y cont in ua entre la iniciación de la transcripción y la estruct ura de la cromarina. Algunos activadores de la transo-ipción génica modifican de manera directa las histonas; en panicular, la acetilación de histonas se relaciona con la activación génica. Por e l contrario. algunos represores de la transcripd6n acttían por desacetilación de histonas.

Sitio diana está libre cuando la concentractón de proteínas es baja

De este modo. un cambio reversible en la estructura de las histOnas en la vecindad del promotor participa en el control de la expresión génica, lo que tal vez sea pane del mecani~mo por el que un gen se mantiene en estado activo o inactivo. Los mecanismos por los que se mantienen re giones locales de cromatina en estado inactivo (silente) tienen relación con el medio por el que se reprime cada promotor. Las proteínas involucradas en la formación de la hererocromatina actúan en la cromatina a través de las histonas. y las modificaciones de las histonas pueden ser una característica importante de la interacción . Una vez establecidos. dichos cambios en la cromatina pueden persistir a través de las divisiones celulares y crear un estado epigenético donde las propiedades de un gen son determinadas por la estructura autOperpetuante de la croma tina. El nombre epigenética re[leja el hecho de que un gen pudiese Lener una circunstancia heredada (puede ser activa o inactiva) que no depende de su secuencia. Sin embargo, se pueden conocer mejor las propiedades cpigenéticas por las estructuras autoperpetuames denominadas priones (agentes infecciosos proteináceos).

La cromatina puede tener estados alternativos Concepto pñncipal • La estructura de. la cromatina es estable y no puede

modificarse con la alteración del equilibrio de los factores de transcripción e histonas. Se han propuesw dos tipos de modelos para explicar cómo cambia el estado de expresión del DNA: en equilibrio o en cambio discontinuo. En la se muestra el modelo en equilibrio. Aquí el único factor pertinente es la concenrración de la proteína represora o activadora. que produce un equilibrio entre las formas libre y unida al DNA. Cuando la concentración de la p roteína es suficiememente alta, ocupa su sitio de unión al DNA

El

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La concentración atta ...,_.de proteínas prop1cia · la unión al DNA diana 1

Concentracíón de proteínas En un modelo en equilibrio el estado de un sitio de unión en el DNA depende de la concentración de la proteína que se le une. 30 . ~

La cromatina puede tener estados alternativos

797

y altera el estado de expresión del ácido. (Es posible que la unión reprima o active cualquier secuencia diana particular.) Este tipo de modelo explica la regulación de la transcripción en células bacterianas, donde la expresión génica depende de manera exclusiva de las acciones de cada una de las proteínas represoras y aclivadores (véase el Capítulo 12, El operón). Puede predecirse si se tra nsctibe un gen bacteriano a partir de la suma de concentraciones de varios factores que activan o reprimen a l gen individual. Los cambios de estas concentraciones en cualquier momento modificarán el estado de expresión de manera acorde. En la mayor parte de los casos, la unión a proteínas es colaboradora, de modo que una

vez que la concentración alcanza un nivel lo suficientemente alto, hay un rápido vínculo con el DNA que origina un cambio en Ja expresión del gen . Ocurre una siruadón difereme con la cromatina cucariótica. Los primeros experimentos in vitro mostraron que se puede establecer un estado activo o inactivo, pero esto no se afecta por la adición posterior de otros componentes. El facLOr de transcripdón TFmA, indispensable para que la potimerasa de RNAni transcriba los genes del RNAm 55, no puede activar sus genes diana in vitro si están combinados con histonas. Sin embargo, si el factor está preseme ante DNA libre, forma m1 complejo de transcripción, y después, la adición de histanas no impide que el gen se mantenga activo. Una vez que el factor

:.:::::;> La polimerasa de ANA y los factores no pueden tener acceso al DNA

!"

J

se ha unido, permanece en el sitio; esto permite que una sucesión de moléculas de la polimerasa de RNA inide la transcripción. El que el factor o las histonas lleguen al sitio de control en primer término puede ser el punto determinante. En la se muestran los dos tipos de circunstancia que pueden encontrarse en un promotor euca.riótico. En el estado inacrivo, hay nucleosomas que impiden que se unan los factores basales y la polimerasa de RNA. En el estado activo, e l aparato basal ocupa el promotor, al que los octámeros de histanas no pueden unirse. Ambos tipos de estado son estables. Se observa una situación similar con el complejo TFrrD en los promotores de la polimerasa IT de RNA. Un p lásmido qt\e contiene un promotor de adenovirus se puede transcribir in vitro por la actividad de la polimerasa U de RNA en una reacción que requiere TF 0 D y otros factores de transcripción. El molde puede ensamblarse en nucleosomas si se adicionan histonas. Si se agregan las histonas antes del TF0 D, no puede iniciarse la transcripción. No obstante, si el TF0 D se agrega primero, el molde puede aun ser transcrito en esa forma de c,romatina. Por lo tanto. el TF0 D puede reconocer el DNA libre pero no puede hacer lo mismo con el DNA de los nudeosomas o actuar sobre él. Sólo el TF0 D debe agregarse antes de las histonas; los otros factores de transcripción r la polimerasa de RNA se pueden agregar después, lo que permite suponer que la unión del TF 0 D al pro· motor crea una estructura a la que se pueden unir otros componentes del aparato de transcripción. Es importante señalar que en estos sistemas i11 vitro se utilízan canrfdades desproporcionadas de componentes, que pueden crear situaciones no natura.les. Por lo tanto, la mayor importancia de estos resultados no es que demuestren el mecanismo utilizado in vivo, sino que establecen el principio de que Los factores de transcripción o nucleosomas pueden formar estructuras estables que no pueden cambiarse tan sólo con La modificación del equilibrio con los componentes libres.

El remodelado de la cromatina es un proceso activo Conceptos princ1pales

Si los nucleosomas se forman en un promotor, los factores de transcripción (y la polimerasa de RNA) no pueden unirse. Si los factores de transcripción (y la polimerasa de RNA) se unen al promotor para establecer un complejo estable de inicio, se excluyen las histonas.

798

CAPÍTULO 30 Control de La estructura de la cromatina

• Hay varios complejos de remodelado de cromatina que utilizán energía provista por la hidrólisis del ATP. • Los complejos SWI/SNF, RSC y NURF son todos muy grandes y comparten subunidades relacionadas. • Un complejo de remodelado no tiene en sí especificidad para algún sitio diana particular, sino que debe ser reclutado por un componente del aparato de transcripción.

r

El proceso general de inducción de cambios en la estructura de la cromatina se denomina remodelado d e cromatina, que consta de mecanismos para remplazar hístonas y depende del aporte de energía. Muchos contactOs proteína-proteína y proteína-DNA necesitan modificarse para que se liberen histonas de la cromatina. No hay traslados sin costo; debe proveerse energía para alterar estos contactos. En la se ilustra el principio de un modelo dinámico, por un (actor que hidroliza el ATP. Cuando el octámero de hisronas se Libera del DNA, se pueden unir otras proteínas (en este caso, factores de transcripción y polimcrasa de RNA). En la se resumen los tipos de cambios de remode lado de la cromatina que pueden describirse in vitro: • Los octámeros de histonas pueden desplazarse por el DNA y cambiar la relación entre el ácido nucleico y las proteínas, lo quemodifica la posición de una secuencia panicular sobre la superflcie del nucleosoma. • El espaciamiento entre octámeros de hiswnas puede cambiar, de nuevo con el resul tado de que se alteran las posiciones de cada secuencia con relación a la proteí na. • El cambio más extenso es cuando un octámero puede desplazarse por completO del DNA para generar una brecha sin nucleosomas. El uso más común del remodelado de la cromatina es cambiar la organización de los nucleosomas en el promotor de un gen que se va a transcribir. Esro se requiere para permitir que el aparato de transcripción tenga acceso al promotor. Sin embargo, también se necesita remodelado para permitir otras manipulaciones de la cromatina, incluidas las reacciones de reparación del DNA dañado. El remodelado adopta más a menudo la forma de desplazamiento de uno o más octámeros de histonas. Esto puede detectarse por un cambio en la escalera de la nucteasa de micrococos, donde se ha perdido la protección contra la escisión. A menudo, esto da origen a la creación de un sitio que es hipersensible a la escisión por la desoxirribonucleasa l (véase la sección 29.18, Los sitios hipersensibles a la desoxirribonuclcasa cambian la estructura de la cromatina). A veces hay cambios menos notorios, por ejemplo, que incluyen una modificación en la posición rola ti va de un solo nucleosoma; esto puede detectarse por la pérdida de la escalera de lO bases de la desoxirribonucleasa l. Así, los cambios en la estructura de la cromatina pueden ir desde alterar la posición de los nucleosomas hasta retirarlos. El remodelado de cromatina lo realizan grandes complejos que aprovechan la hidrólisis de ATP para proveer la energía. El meollo del complejo de remode lado es su subllnidad de fosfatasa del trifosfato

de adenosina. Los complejos de remodelado suelen clasificarse de acuerdo con el tipo de subunidad de fosfatasa del trifosfa10 de adenosina; aquellos con subunidades de fosfatasa del trifosfato de adenosina relacionadas se consideran pertenecientes a la misma familia (por lo general algunas otras subunidades son también comunes). En la se conservan los nombres. Los dos tipos principales

r.:-

Complejo de remodelado - Se desplaza el octámero

~]]))D] ~ ATP --+ ADP+P

Se unen los factores

] D'jj~rñJ El modelo dinámico para la transcripción de la cromatina depende de factores que pueden aprovechar la energía provista por la hidrólisis del ATP para desplazar nudeosomas de secuencias específicas del DNA.

Los nucleosomas se deslizan

Se ajusta el espaciado

El nucleosoma se desplaza

-+

Jllm l

~ t

Las secuencia cambia de posición

El espaciamiento se hace uniforme

Brecha de DNA libre

Los complejos de remodelado pueden hacer que los nucleosomas se deslicen por el DNA, pueden desplazar a los nucleosomas del DNA o reorganizar el espaciado entre los nucleosomas.

30.l El remodelado de la cromatina es un proceso activo

799

:ñ:.

-

Tipo de complejo SWI/SNF

ISWI

Otras

Levaduras

SWI/SNF RSC

ISW1 ISW2

Complejo INOSO SWRI

Moscas

dSWI/SNF (brahma)

NUAF CHRAC ACF

Seres humanos

hSWI/SNF

RSF hACF!WCFR hCHRAC WICH

NuRO Complejo INOSO SRCAP

WICH

Mi-2

Rana

CHRAC ACF Los complejos de remodelado pueden clasificarse por sus subunidades de fosfatasa del tri fosfato de adenosina.

de complejos son SW1/SNF e ISW1 (las siglas ISWI se refieren a SWJ de im itación). Las levaduras ti.~nen dos complejos SWI/SNF y tres complejos ISW1. Se encuentran también complejos de ambos tipos en la mosca y el ser humano. Cada tipo de complejo puede emprender una variedad diferente de actividades de remodelado. El primer complejo de remodelado identificado fue SWI/ SNF, nombre que refleja el hecho de que muchas de !>US subunldades son codificadas por genes identificados en un principio mediante mutaciones SWI o SNF en Sacc11aromyces cerevisiae. Las mutaciones de estos lod son pleiotrópicas y la variación de defenos es similar a la que muestran los mutan tes que perdieron la cola del dominio carboxilo terminal (CTD) de la polimerasa de HNA Il. Estas mutaciones también muestran interacciones genéticas con las mutaciones de genes que codifican los componentes de la cromatina, en panicular S!Nl, que codifica una proteína no hisrona, y SIN2, que codifica la hisLOna H3. Se requieren los genes SW1 y SNF para la expresión de una variedad de 1oci individuales (se afectan -120, o 2%, de los genes de S. cerevisiae). La expresión de estos loci puede requerir que ~1 complejo SWl/SNF remodele la cromatina en sus promotores. El complejo SW1/SNF acrl!a en forma catalítica in vih·o y hay sólo -150 complejos por célula de levadura. Los genes que codifican las subunidades SWI/ SNF no son esenciales, lo que indica que la levadura debe de tener también otras formas de remodelado de la cromatina. El complejo RSC (que remodela la estructura de la cromatina) es más abundante y también indispensable Actúa en -700 loci diana . Los complejos SWI/SNF pueden remode1ar la cromatina in vitro sin pérdida globa l de híswnas, o 800

CAPÍTULO 30 Control de la estructura de la cromatina

pueden desplazar a los octámeros de histona. Ambos tipos de reacción tal vez pasen por el mismo proceso intermedio donde se altera la estructura de un nucleosoma diana, lo que lleva a la reconstitución d<> un nucleosoma (rernodelado) sobre el DN A original, o al desplazamiento del ocrámero de histonas hacia una molécula diferente de DNA. El complejo SWl/SNF altera la sensibilidad de los nucleosomas a la desoxirribonucleasa I en el sitio diana e induce cambios en los contactos proteínaDNA que persisten después que se ha liberado de los nuclcosomas. La subunidad Swi2 es la [osfatasa del trifosfato de adenoc;ina, que aporta la energía para el remodelado por SWI/SNF. Hay muchos contactos entre el DNA y un octá mero ele histonas; 14 idenliücados en la estructura cristalina. Todos estos contactos deben romperse para que pueda liberarse un octámero o moverse a una nu e va posición. ¿Cómo se logra esto? Se pueden descartar algunos mecanismos obvios, porque se sabe que no se genera D NA de cadena Única durante el remodelado (y no hay actividades de helicasa vinculadas con los complejos). La creencia actual es que los complejos de remodclado en las clases SWI e TSWI aprovechan la hidrólisis del ATP para hacer girar el DNA en la superficie del nucleosoma. Las pruebas indirectas permiten suponer que esw crea una fuerza mecánica que permite a una pequeña región del DNA liberarse de la s u perfide y después volver a ubicarse. Una reacción importante catalizada por coulplejos de rcmodelado incluye el deslizamientO de los nucleosomas. Se observó por primera vez que la familia ISW r afecra el posicionamiento de los nucleosomas sin desplazar a los octámeros. EstO se logra por una reacción de deslizamiento donde el octárnero se mueve a lo largo del DNA. El desliza miento se impide si se retira la cola N Lerminal de la histona H4, pero no se sabe con exactitud cómo actúa dlcha estructura a ese respecto. Los complejos SWI/SNF tienen la misma capacidad; se impide la reacción con la introducción de una barrera en el DNA. lo que hace pensar que hay una reacción de deslizamiento, donde el oCLámero de histonas se traslada más o menos en f01ma continua por elDNA sin perder comacm en ningún momenro. Un enigma acerca de la acción del complejo SWl/SNF e~ su tamaño completo. Tiene ll subunidades con un peso molecular combinado de -2 x 10 6 • Esto hace muy pequeña a la polirnerasa de RNA y el nucleosoma, lo que dificulLa comprender cómo todos estos componentes pudiesen interactuar con el DNA detenido en la superficie del cromosoma. Sin embargo, se puede enconuar un complejo de Lranscripción con actividad completa, llamado holoenzima polimerasa n de RNA, que contiene la

polimerasa de RNA misma, todos los factores TFu excepto TBP y TF11 /\, y el complejo SWl/SNF, que se vincula con la cola CID de la polimerasa. De hecho, casi todo el complejo SWI/SNF puede estar presente en los preparados holoemimáticos, lo que sugiere que el remodelado de la cromatina y el reconodmiento de los promotores tienen lugar en forma coordinada por un solo complejo.

La organización de los nucleosomas puede cambiar en el promotor

1. El factor especifico de secuencia se une al DNA

.7 2. El complejo de remodelado se une al sitio a traves de un factor / "' Comple o de r mo1elado

C011ceptos principales Los activadores especlficos de secuencia reclutan complejos de remodelado a los promotores. El factor puede liberarse una vez que se ha unido el complejo de remodelado. • El promotor MMTV requiere un cambio del posicionamiento rotativo de un nucleosoma que permita que un activador se una al DNA sobre el nucleosoma.

¿Cómo se dirigen los complejos de rcmodelado a sitios específicos de la cromatina? No contienen en sí subunidades que se unan a secuencias específicas de DNA, lo que hace pensar en el modelo que se muestra en la , donde son reclurados por acrivadores o (a veces) por represores. La interacción emre los factores de transcripción y los complejos de remodelado da indidos clave de su forma de acción. El factor de transcripdón Swi5 activa el locus HO en levaduras (nótese que Swi5 no es miembro del complejo SWIISNF). El Swi5 entra a los núcleos cerca del final de la mitosis y se une al promotor HO. Después recluta SWJ/SNF al promotor. A conrinuación, se libera Swi5, que deja a SWI/SNF en el promotor. Jo que significa que un (actor de transcripción puede activar un promotor por un mecanismo de "batear y correr", donde su función se cumple una vez que se na unido el complejo de remodelado. Se descubrió la participación de los complejos de remodelado en la activación génica porque dichos complejos son indispensables para que ciertos factores de transcripción puedan activar sus genes diana. Uno de los primeros ejemplos fue el factor GAGA, que activa al promotor de hsp70 de Drosophila in vitro. La unión de GAGA a cuatro sitios ricos en (CT), en el promotor altera los nucleosomas, crea una región hipersensible y hace que los nucleosomas adyacentes se reacomoden de manera que ocupen posiciones preferentes más que aleatorias. La escisión es un proceso que depende de la energía y que requiere el complejo de remodelado NURF. La ~.4

Un compl ejo de remodelado se une a la cromatina gracias a un activador {o un represor).

organización de los nucleosomas se modifica para crear un límite que determine las posiciones de los nucleosomas cercanos. Durante este proceso, GAGA se une a su sitio diana y a l DNA; su presencia fija el estado remodelado. El sistema PT-fO fue uno de los primeros en los que se demostró que hay un cambio en la organización de los nucleosomas durante la activación génica. En el promotor PH05 el regulador de bELH, PH04, rcspond~ a la privación de fosfatos con la inducción de la rowra de cuatro nucleosomas en una posición precisa. Ese episodio es independiente de la transcripción (se presenta en un mutante TATA) y de la replicación. Hay dos sitios de unión para PH04 en el promotor. Uno se localiza entre los nucleosomas, que se puede unir por el dominio de unjón a DNA aislado PH04, y el otro yace dentro del nucleosoma y no puede reconocerse. La rotura del nucleosoma para permitir la unión del DNA en e l segundo sitio es indispensable para la activación génica. Dicha acción requiere la presencia del dominio de activación de la transcripción.

La organización de los nucleosomas puede cambiar en el promotor

801

La secuenda del aclivador de VP16 puede sustituir a la correspondiente PH04 en la escisión del nudeosoma. Esto hace pensar que la rotura tiene lugar gracias a interacciones proteína-proteína que involucran a la misma región qlle hace contactos proteína-proteína para activar la transcripción. En este caso, no se sabe qué complejo de remodelado participa en la ejecución de los efectos. Una búsqueda de posiciones de nudeosomas del genoma de levadura mostró que la mayor parte de los sitios donde se unen factores de transcripción están libres en el nucleosoma. los promotores de la polimerasa Il de RNA por lo general tienen una región sin nucleosomas -200 bp en sentido ascendente respecto del punto de inicio, que es flanqueado por los nucleosomas ubicados a cada lado. Sin embargo, no siempre tienen que excluirse los nudeosomas para permitir la iniciación de la transcripción. AJgunos acrivadores pueden unirse al DNA en la superficie de un nucleosoma. Los nucleosomas parecen ubicados de manera predsa en algunos elementos de respuesta de hormonas esteroides, de manera que se puedan unir a los receptores. La unión a receptores tal vez altere la interacción del DNA con las hisronas y pudiese incluso llevar a la exposición de nuevos sitios de unión. Podría requerirse el posicionamiento exacto de los nucleosomas. ya sea porque el nucleosoma "presenta" el DNA en una fase de rotación particular, o porque hay interacciones proteína-proteÚla entre los activadores y las

NFi Receptor Receptor de l)ormona de hormona

V

r¡\l(N/}\{i\y}\~/

histonas u otros componentes de la cromatina. De algún modo, se ha dejado de ver a la cromatina sólo como una estructura represiva y ahora se ana lizan cuáles interacciones entre aclivadores y cromatina pueden necesitarse para la activación. El promotor MMTV representa un ejemplo de la necesidad de una o rganización Jlucleosómica específica. Contiene ur~ conjunto de seis sirios palindrómicos en parte, cada uno unido a un dímero del receptor de la hormona (HR), que constituye el HRE. También tienen un sitio de unión aislado para el factor NFl, y dos sitios cercanos para el factor OTF. HR y NF l no pueden unirse de manera simultánea a otros sitios en el DNA libre. La muestra có~no la est,rucrura del nudeosoma controla la unión de los factores. El HR protege sus sitios de unión en el promotOr cuando se agrega hormona, pero no afecta a los sitios sensibles a la nucleasa de micrococos, que marcan ambos lados del nudeosoma. Esto permite <;uponer que HR se une al DNA sobre la superfide del nudeosoma; sin embargo, el posicionamiento rotativo del DNA en. el nucleosoma antes de la adición de la hormona permite el acceso a sólo dos de cuatro sitios. La unión a los otros dos sitios requiere un cambio en 1a posición de rotación sobre el nucleosoma, que puede detectarse por la aparición de un sirio sensible en el eje de simetría par (que está en el centro de los sitios de unión que constituyen el HRE). Se puede buscar NFI en el nudeosoma después de la inducción hormonal, de modo que dichos cambios estructurales tal vez sean necesarios para permitir la unión de NFI, quiz.ás porque exponen al DNA y e liminan el impedimento estéríco por el que el BR bloquea la unión de NFl aJ DNA libre.

La modificación de las histonas es un episodio clave Concepto pñncipal • Las histonas se modifican por metilación, acetilación y

Receptor de hormonaNF1 NF!,--Receptor \ de hormona ootáme ro ~ de histona sJ HS en el eje---L ~ OTF-"1 Receptor \ de hormona

El receptor hormonal y NF1 no pueden unirse de manera simultánea al promotor M1"1TV en forma de DNA lineal, pero pueden hacerlo cuando el DNA se presenta sobre la superficie del nucleosoma. 802

CAPÍTULO 30 Control de la estructura de la cromatina

fosforilación .

El que un gen se exprese depe11de de la estructura local de la cromatina (en el promotor) y en el do-

minio circundante. La estructura de la cromatina puede regu1arse de manera correspondiente gracias a episodios de activación individuales o cambios que afectan una región cromosómica amplia. Los sucesos más localizados implican a un gen diana individual donde se presentan cambios en la estructura de los nucleosomas y su organización en la vecindad inmediata del promotor. Cambios más generales pueden afectar regiones tan grandes como todo l~n cromosoma.

los cambios q ue a fectan a regiones grandes controlan la posibilidad de expresarse de un gen. El término silenciamiento se utiliza para referirse a la represión de la actividad de un gen en una región cromosómica local. La denominación heterocrom atina se usa para describir regiones de los cromosomas que son lo bastante grandes como para observarse con una estructura físicamente más compacta al microscopio. La base de ambos tipos de cambio es la misma: proteínas adicionales se unen a la cromatina e impiden de manera directa o indirecta la activación de los promotOres en la región por factores de transcripdón o la po limerasa de RNA. Los cambios en cada promotor controlan que la

se sintetizan las histanas). Durante el del o celular, los grupos modificantes se retiran después. La coincidencia de modificación y replicación hace suponer que la acerilación (y metilación) podrían vincularse con el ensamblaje del nucleosoma. Una especulación ha sido que la disminución de las cargas positivas en las hisronas podría aminorar su afinidad por el DNA, lo que permite controlar mejor la reacción. La idea ha perdido sustento después de que se observó que los nucleosomas p ue den reconstituirse. al menos in vitto, con histonas no modificadas. La acetilación de h istonas es indispensable para el ensamblaje de nudeosomas en las levaduras y tal vez se requiera para algunas de

transcripción se inicie en un gen panicular y pueden ser de aclivación o represión. Todos estos episodios dependen de interaccio · nes con histonas. Los cambios en la estru ctura de la cromatina se inician cuando se modifican las colas terminales Nes de las hislonas, en especial H3 y H4 . Las colas de las histonas constan de 15-30 aminoácidos en el extremo N de las cuatro histonas centrales y el extremo C de H2A . Las colas de H2B y H3 pasan entre los giros del DNA (véase la Figura 29.21 en la sección 29.7, Organización del octámero de hisronas). La muestra que se pueden m odificar en varios sitos por metilación, acetilación o fosforüación. Otras modificadones, com o una m onoubicuitinación o dimetilación también ocurren, pero no están bien descritos. La acerilación y metila ción tienen lugar en el grupo amino libre (E) de la Usina. Como se observa en La la acetilaclón retira la carga positiva que reside en la forma NH; del grupo. También ocurre metilación en la arginina. La fosforilacíón se presenta en el grupo hidroxilo de la serina y también en la treonina, lo que introduce una carga negativa en forma de un grupo fosfato. La lisina puede ser mono, di o trimelilada (wdas las forma<> con carga positiva) y la arginina puede ser mono o dimerilada (en forma simétrica o asimétrica). Estas modificaciones son transitorias. Pueden cambiar la carga de la molécula de la proteína y. en consecuencia, está n en posibilidades de modificar las propiedades funcionales de los octámeros. Las modificaciones de las histonas se vinculan con los cambios estrucwrales que se presen tan en la cromatina durante la replicación y transcripción. Pueden requerirse fosforilaciones en posidones espeáficas y en diferentes histonas para procesos particulares, por ejemplo, la posición Ser 10 de H3 se fosforila cuando los cromosomas se condensan durante la mitosis. En células en cultivo sincronizadas, tanto las histonas medulares p reexistentes como las recién sintetizadas parecen ser acetiladas y metiladas durante la fase S (cua ndo se replicad DNA y también

Sitios de modif~ación en H3

~

-

~

u

Ala !Ív Treo Lis Gln f redAia ~ Lis (SerTreo(GIU Gl 1

2

3

4

5

6

7

8

9

~

(u~-

10 11 12 13 14

Sltlos de modificación en H4

·ser Gl 2

Ar~ Gi 3

G>

4

Gl

5

r6ili Us Gl 1

6

7

8

9

!Le

~ tGt f¡ Gl

Glu

10 11 12 13 14

Las colas terminales Nes de las histonas H3 y H4 pueden acetilarse, metilarse o fosforilarse en varias posiciones.

Acetilación

CHa-~

o

La acetilación de la lisina o la fosfori lación de la serina reducen la carga positiva global de una proteína. 30.5 La modificación de las histonas es un episodio clave

803

las interacciónes proteína-proteína que tienen Jugar durante etapas más avanzadas de la reacción (véase la sección 30.6, Ocurre acetilación de histonas en dos circunstancias). Ocurre un ciclo de fo sfo r ilación y desfosiorilación en HL pero su sincronización es diferente del ciclo de modificación de las otr as histonas. En células de mamífero en cultivo se introducen uno o dos gr upos fosfato durante la fase S. No obstante, el principal episodio de la fosfodlación es la adición postelior de más grupos en la mirosis, lo que lleva al número total de hasta seis. Todos los grupos fosfato se retiran al final del proceso de d ivisión. La fosforilación de Hl es analizada por una cinasa de fase M, que provee e l desencadenamiento indispeJIsable para la mitosis. De hecho, esta enzima ahora se esrudia a men udo en términos de su actividad de

Colas terminales Nes

H3

H4

Cromatina activa

H3

H4

Cromatina Inactiva

La acetilación de H3 y H4 se vincula con la cromatina activa, en tanto la metílacíón se relaciona con la cfomatina inactiva.

Hístona Sitio H3 H3

H3 H3 H3 H4

H4 H4

H4

Modificación

Lis-4 Lis-9 Lis-9 Lis-9 Ser-10 Lls-14 Lis-79 Arg-3 Lls-5 Lis-12 Lis-16 Us-16

Acetilación

rosron1nc10n Acetilación

·'

Función Activación Condensación de la cromatina Se requiere para la metilaci ón del DNA Activación Activación Impide la metilaclón en Lis-9 Silenciamiento tetomérico

,¡ .; . . .

Acetilación Acetilaclón Acetilación Acetilación

Ensamblaje Ensamblaje Ensamblaje del nucleosoma Activación de X en la mosca

La mayor parte de los sitios modificados en las histonas t iene un tipo único específico de modificación, pero algunos sitios pueden tener más de un tipo de modificación . Cada una de las funciones se puede vincular con algunas de las modificaciones.

804

CAPÍTULO 30 Cont rol de la estructura de La cromatina

cinasa de HL No se sabe mucho acerca de la o las [osfa tasas que retiran después los grupos. La sincronización de la fosforilación principa: de Hl h a llevado a especular que participa en la condensación rnitórica. Sin embaxgo, en el género Tetrahymena (de protozoarios) es posible la deleción de todos los genes de Hl sin afectar de manera significativa las propiedades g lobales de la cromatina. Hay un efecto más bien pequeño sobre la capacidad de la cromatina de condensarse durante la mitosis. Algunos genes se activan y otros se reprimen poi e$e cambio, lo que sttgiere que hay alteraciones de la estructura local. Las mutaciones que eliminan si tios de fosforilación en Hl no tienen efecto, per(J aquellas que simulan los efectos de la fosforilación produce n un fenotipo que se parece a l de la dcleción. Esro permite suponer qu e el efecto de la fosforilacjón de H l es eliminar sus acciones sobre la estructura de la cromatina local. ¿Afectan las modificaciones de las h.istonas de: manera directa la estructura del nucleosoma o su e fecto sobre la cromatina es indirecto? No hay, de hecho, muchas p t'll ebas de algu na diferencia en las propiedades de los nudeosomas conforme a l estado de modificación de las histOn as. Sin embargo, hasta ahora se han descriw varios casos donde la modificación de las lustonas crea sitios de w1ión par" proteínas no histonas, que ca m bia n las propiedades de la cromatina. Los nucJeosomas sujetos a modificación pueden ser muy dive rsos. La modificación tal vez sea u n episocUo local. por ejemplo, restringido a los nucleosomas en el promotor. Tambien puede ser un suceso general que se extiende, por ejemplo, hasta todo un cromosoma . La muestra que hay una correlación general donde la acerilación se vincula con la cromaüna activa, en tan to la metilación se relaciona con la cromatina inactiva . No obstante, esto no es una regla simple y los sitios particulares que se modifican (así como las combinaciones de mocUficaciones específicas) pueden ser importantes, de manera que hay, sin duda, excepciones donde (por ejemplo) las h istonas meriladas en cierta posición se encuentran en la cromatina activa. Las mutaciones en u n o de los complejos de acetilasas de histonas de levaduras lienen el efecto contrario a l habitual (impiden el silenciamien ro de algunos genes); esto resalla la falta de un efecto uniforme de la acerilación. La especificidad de las modificaciones la indica e l hed10 de que muchas de los enzimas m odificantes tienen sitios diana individuales en histonas especíOcas . En la se resumen los efectos de algunas de las modificaciones. la mayor parte de los sitios modjficados está sujeLa a un solo ripo de cambio. En algunos casos, la n1odificación de un sitio

puede activar o inh ibir la modificación en otro. La idea de que se pueden usar las combinacion es de señales para definir los tipos de cromatina a veces se ha llamado código de histonas.

Ocurre acetilación de histonas en dos circunstancias Conceptos principales • Ocurre acetilación transitoria de histonas durante la replicación. • La acetilación de histonas se vincula con la activación de la expresión génica.

Todas las histonas centra les pueden acetilarse. Las principales dianas para la acetila cióo son las lisinas en las colas termina les Nes de las hisronas H3 y H4. La acetilación tien e lugar en dos circunstancias di ferentes: • Durante la replicación del DNA y • Cuando se activan los genes. Cuando se replican los cromosomas. lo que ocurre durante la fase S del ciclo celular, las histonas se acetilan de manera transitoria. La muestra que esa acetiladón ocurre antes de que las h istanas se incorporen a los nucleosomas. Se sabe que las histOnas H3 y H4 se acetilan en la etapa en que se vinculan entre sí en el tetrámero H3 2-H41 . El teuámero se incorpora entonces a los nudeosomas. Bastante poco después, se retiran los grupos acetilo. La importancia de la acetilación queda de manifiesto por el hecho de que impedirla en las histonas H3 y H4 durante la replicación causa pérdida de viabilidad en las levaduras. Las dos hisLOnas son abundantes como sustratOs, porque la levadura puede mantenerse perfectamente bien en tanto pueda acetilar cualquiera de esas histonas durante la fase S. Hay dos posibles !unciones de la acetilación : podría necesitarse para que las histon as sean reconocidas por factores que las incorporan a los nu cleosomas. o podría requerirse para el en samblaje, la estrucwra, o ambos, del nuevo n ucleosoma . Los factores que se sabe intervienen en el ensamblaje de la cromatina no distinguen entre histOnas acetiladas y no acetiladas. lo que hace pensar que es más probable que se requiera la moclifi.cación para interacciones posteriores. Se ha creído durante mucho tiempo que tal vez se requiera acetilación para ayudar a controlar las interacciones proteínap roteína que tienen lugar a meclida que las histonas se incorporan a los nudcosomas. Una prueba de tal participación es que el complejo de acetilasa de histonas SAS en las levad uras se un e al complejo de ensamblaje de la cromatina en la horquilla de replicación, donde acetila a la 16lis de la histona 4. Esto

puede ser parte del sistema que establece los patrones de acetilación de hisronas después de la replicadón. Fuera de la fase S, la acetilación de histonas en la cromatina en general tiene correlación con el estado de expresión génica. La correlación se observó por primera vez porque la acetilación de histOnas aumenta en un dominio que contiene genes aclivos y la cromatina acetilada es más sensible a la desoxiribonudeasa 1 y (tal vez) a la nudeasa de micrococos. La muestra que esto implica la acetilación de colas de histonas en los nucleosomas. Ahora se sabe que esm ocurre en gran parte por la acetilación de nuclcosomas en la vecindad del pro motor cuando se activa un gen.

La acetilacíón durante la replicación ocurre en las histonas antes de que se incorporen a los nucleosomas.

la acetilación relacionada con la activación génica ocurre por modificación directa de las histonas en los nucleosomas. 30.6 Ocurre acetilación de histonas en dos circunstancias

805

Además de los sucesos en cada promotor, ocurren cambios a gran escala en la acerilación de los cromosomas sexuales. Esto es parte del mecanismo por el que las actividades en el cromosoma X se alteran para compensar la presencia de dos cromosomas X en una especie, pero sólo uno (además del cromosoma Y) en orras (véase la sección 31.5, Los cromosomas X presentan cambios globales). El cromosoma X inactivo en mamíferos hembra tiene una H4 subacetilada. El cromosoma X superactivo en machos del género Drosophila presenta mayor acetilación de H4, lo que sugiere que la presencia del grupo acetilo puede ser un prerrequisito para una estructura activa menos condensada. En el macho del género Drosophila, el cromosoma X está acetilado de manera específica en la 16Lis de la hístona H4. La acetiltransferasa de las histonas (HAT) encargada es una enzima que se recluta al cromosoma como parte de un gran complejo proteínico. Este complejo de "compensación de dosis" se encarga de introducir cambios generales en el cromosoma X que le permiten una mayor expresión, El aumento de la acetilación es sólo una de sus actividades.

mJ Las acetilasas se relacionan con activadores Conceptos principales La cromatina desacetilada puede tener una estructura más condensada. • Los activadores de la transcripción se relacionan con· actividades de acetilasa de histonas en grandes complejos. • Las acetilasas de histonas varían en su especificidad d~na. ·

de que la acetilación se vincula con la expresión génica; de hecho, la capacidad del ácido butírico de causar cambios en la cromatina semejantes a los observados en la activación de genes constituye uno de los primeros indicios de la conexión entre acetilación y actividad génica. El gran adelanto logrado al anali7.ar la función de la acerilación de histonas fue la descripdón de las enzimas acetilantes y desacetilames y su vínculo con otras proteínas que intervienen en episodios específicos de activación y represión. Un cambio básico en la manera de ver la acetllación de histonas lo propició el descubrimiento de que las HAT no son necesariamente enzimas dedicadas vinculadas con la cromaLina; más bien resulta que los activadores de la transcripción conocidos tienen actividad de HAT. Se estableció la conexión cuando se identificó la subunidad catalítica de un grupo A de HAT como b.omóloga de la proteína reguladora Gcn5 en levaduras. Después se demostró que la Gcn.5 misma tiene actividad de HAT (con las rustonas H3 y H4 como sustratos). La GenS es parte de un complejo adaptador necesario para la interacción entre 300 potenciadores y sus promotores diana . Su actividad de HAT se requiere para la activación del gen diana. Esto permite cambiar la imagen de la acción de los coactivadores, como se muestra en la donde la polimerasa de RNA se une a un siúo hipersensible y los coactivadores son histonas acetilames en los nucleosomas de la vedndad. Se sabe hoy de muchos ejemplos de interacciones de este tipo. El Gcn5 conduce a uno de los comp lejos de acetilasas más importantes. En las levaduras, Gens es parte del complejo de acetiltransferasa Spt-AdaGcn5 (SAGA) de 1.8 MDa que contiene varias pro -

• La acetilación podría afectar la transcripción. en una fo rma cuantitativa o cualitativa.

La acetilación es reversible. Cada dirección de la reacción es catalizada por un tipo específico de en'Zima. Las enzimas que pueden acetilar h.iswnas se llaman acetiltransferasas de histonas o HAT; los grupos acetilo son retirados por las desacetilasas de histonas o HDAC. Hay dos grupos de enzimas HA T: aquellas en el grupo A actúan sobre las histonas de la cromadna y participan en e'l control de la transcripción. Las del grupo B actúan sobre h.iswnas de reciente síntesis en el citosol y participan en el ensamblado de los nucleosomas. Dos inhibidores han permitido analizar la acetilación. La tricosta.t.ina y el ácido butírico inhiben las desacedlasas de hisronas y hacen que se acumulen nucleosomas acerilados. El uso de estOs inhibidores ha servido de sustento a la opinión generalizada 806

CAPÍTULO 30 Control de la estructura de la cromatina

Coactivadores Aparato basal 1 Actlvadores J ~ PCAF

CP~300

o/ ]

Polimerasa de ANA

] Los coactivadores pueden tener actividades de HAT que acetilan las colas de las histonas nucleosómicas.

teinas que participan en la transcripción. Entre estas proteínas se encuentran varios TAFn. Además. la subunidad TAF0 145 de TFuD es una acetilasa. (La TAFnl45 de levaduras es homóloga de la TAF11250 de los mamíferos; ambas conocidas como TAFI .) Hay algunas funciones que coinciden entre TAF 0 D y SAGA, la más notOria es que las levaduras pueden mantenerse con TAF0 145 o Gcn5, pero se daña por la deleción de ambos. Esto permite suponer que una actividad de acetilasa es inctispensable para la expresión génica, pero puede proporcionarla TF,p o SAGA. Como podría esperarse por el tamaño del complejo deSATA. la aceriladón es sólo una de sus funciones, si bien sus demás acciones en la activa ción génica no están tan bien descritas. Uno de Jos primeros activadores generales en caractcri7.arse como HAT fu e la pro teína de unión de p300/CREB (CBP). (En la actualidad, p300 y CBP son proteínas diferentes, pero tienen una relación tan cercana que a menudo se consideran como un solo ripo de actividad). La p300/CBP es u n coactivadar que enlaza a un aclivador con el aparato basal (véase la Figura 25.7}. la p300/CBP interactúa con varios activa dores, como los receptores hormonales, AP-1 (c-Jun y e-Fas) y MyoD. La interacción es inhibida por las proteínas reguladoras víricas E lA de adenovirus y el antígeno T de SV40, que se unen a p300/CBP para impedir la interacción con factores de transcripción; esto explica cómo estas proteínas víricas inhiben la transcripción celular. (Esta iniciación es importante para la capacidad de las proteínas víricas de comribuir al estado tumorigénico). La p300/CBP acetila las colas termina les Nes de H4 en los nucleosomas. Otro coacrivador, PCAF, acetila de manera preferente la H3 en los nucleosomas. La p300/CBP )' TCAF forman un complejo que participa en la activación de la transcripción. En algunos casos interviene otro HAT: el coactivador ACTR. que actúa con receptores de hormonas y es en sí un HAT que actúa sobre fl3 y H4 y también recluta tanto p300/CBP como PCAF para formar un complejo coactivador. Una explicación de la presencia de múltiples actividades de HAT en un complejo de coactivación es que cada HAT tiene especifiddad diferente y que se requieren múltiples episodios de acetilación diversos para la activación. Una característica general de la acetilación es que un HAT del grupo A es parte de un gran com plejo. En la se muestra u n modelo simplificado de su comportamiento. Los complejos HA T pueden dirigirse al DNA gracias a interacciones con factores de unión al DNA. Esto determina la diana del HAT. El complejo también contiene suburúdades detectoras que alteran la estructura de la cromatina o actúan de manera directa sobre la tra nscrip ción. Es posible que al menos a lgunos de los e fectores

requieran el episodio de acetilación para actuar. La desacetilación, caralizada por una HDAC, puede actuar en forma similar. Ocurre acetilación tamo en la replicación (cuando es transitoria) como en la transcripción (cuando se mantiene mientras el gen está activo). ¿Desempeña el mismo papel en cada caso? Una posibilidad es que el efecto importante tenga lugar sobre la estructura del nucleosoma. La acetilación puede ser indispensable para "hacer más laxoH el meollo del nucleosoma. En la replicación tal vez se requiera la acerilación de hisronas para permitirles su incorporación a nuevos meollos con más facili dad. Es posible que en la transcripción se necesite un cambio similar pa ra permitir una modificación relativa de !a estructura, tal vez incluso permitir el desplazamiento del meollo de la h.istona del DNA. Otra posibilidad es que la acetilación gen ere sitios de unión para o t ras proteínas que se requieren en. la transcripción. En cualquier caso, la desacetilación revertiría el efecro. ¿Es cuantitativo o cualitativo el efecto de la acetilación? Es posible que se requiera cierto número de grupos acetilo para ejercer un efecto y en gran medida carece de importancia la posición exacta donde ocurre. Una alternativa es que cada episoctio de acetilación tenga efectos específicos. Podría interpretarse que hay complejos que contienen múltiples actividades de HAT en cualquier forma; si diferentes enzimas tienen diversas especificidades, tal vez se requieran múltiples actividades ya sea para acetilar un número suficiente de posiciones diversas o porque se necesitan sucesos individuales para ctiferemes efectos sobre la transcripción. En la replicación, parece (al menos con respeclo a la histona H4) que la acetUación en cualquiera de las dos de tres posiciones disponibles es adecuada, lo que favorece un modelo cuantitativo en este caso. Donde la estructura de la cromatina cambia para modifLcar la rra nsaipdón, la

La subunidad diana se une al DNA

La desacetilasa actúa sobre las colas de histonas

Los electores actúan sobre la cromatina o el DNA

los complejos que modifican la estructura o actividad de la cromatina tienen subunidades diana que determinan sus sitios de acción, las enzimas HATo las HDAC que acetilan o desacetilan histonas y subunidades efectoras que tienen otras acciones sobre la cromatina o el DNA. JO. 7 Las acetilasas se relacionan con activadores

807

acetilación en posiciones específicas es importante (véase la sección 3l.3, la heterocromati.na depende de las interacciones con h.ístonas)

Las desacetilasas se relacionan con los represores Concepros principales • La desacetilación se vincula con la represión de la actividad genica. • Hay desacetílasas presentes en complejos con actividad represora.

En las levaduras, las mutaciones en SIN3 y RPD3 actúan como si estos loci reprimieran una diversidad de genes. Las proteínas forman un complejo con la proteína de unión a DNA Ume6, que se une al elemento URSJ. El complejo reprime la transcripción en los promotores que contienen URSJ, como se ilustra en la , La Rpd3 tiene actividad de desacetila sa de histonas; no se sabe si la función de Sin3 consiste sólo en llevar Rpd3 al promotor o si tiene alguna otra función en la represión. Las células de mamíferos tienen un sistema similar para la represión. La familia bHLH de re guladores de la transcripción incluye acüvadores que actúan como heterodímeros, emre los que se encuentra MyoD (véase la sección 25.15, Las proteínas hélice -asa-hélice interactúan por vínculo combinatorio). Tambien comprende represores, en particular el heterodímero Mad:Max, donde Mad puede pertenecer a un grupo de proteínas muy relacionadas. El heterodímero Mad:Max (que se une a sitios específicos del DNA) interactúa con un homólogo de Sin3 (llamado mSin3 en el ratón y hSin3 en los seres humanos). El mSin3 forma par-

correfnresor ~Rpd3 (desa~lllasQ)

Ume6 S ll~ (unlón a DNA)

Un complejo represor tiene tres componentes: una subunídad de unión a DNA, un correpresor y una desacetílasa de histonas. 808

CAPÍTULO 30 Control de la estructura de la cromatina

te de un complejo represivo que incluye proteínas de unión a histonas y las desacetilasas de histonas HDAC 1 y HDAC2. Se requiere la actividad de desacetilasa para la represión. La naturaleza modular de este sistema la recalcan otros medios de empleo: tm correpresor (SRMT), que permite a los receptores de hormonas retinoides reprimir ciertos genes diana, que actúa por unión a roSin3, que a su vez lleva las actividades de HDAC al sitio. Otro medio de llevar actividades de HDAC al sitio puede ser una conexión con MeCP2, una proteína que se une a citosinas metiladas (véase la sección 24. 19, Los islotes CpG son dianas reguladoras). La falta de acetilación de histonas tambien es una característica de la heterocromatina, lo que es cieno en el caso de la hererocromatína consritutiva (goe, por lo generaL incluye regiones de centrómeros o relómeros) y la heterocroma tina facultativa (regiones que son desactivadas en una célul.; aunque estén activas en otra). Por lo general, las. colas terminales N de las hisronas H3 y H4 no están acetiladas en las regiones heterocromáticas.

1111

Las metilaciones de histonas y de DNA están relacionadas

Conceptos principales • La metilacíón de DNA y de histonas es una característica de la cromatina inactiva. • Los dos tipos de episodios de metilación pueden estar relacionados.

La metilación de histonas y de DNA se vincula cor la inactividad. Los sitios mctilados en las histona_ comprenden dos lisinas en la cola de H3 y una a:-ginina en la cola de H4. La metilación de la 9 Lis de H3 es una característica de las regiones condensadas de cromatina que incluyen la heterocromatina como se observa en s· mayor parte y también regiones más pequeñas, ql.it: se sabe no tienen expresión. La enzima rransferas.: de metilos de histonas que actúa en esta Jisina :._ llama SUV39Hl. (Se ofrece el origen de este peculiar nombre en la sección 30.13, Algunos segmem• _ comunes se encuentran en proteínas que modificala cromatina .) Su sitio catalítico tiene una regi( Uamada dominio SET. Otras transferasas de meti!• de h istonas actúan sobre la arginina. Además, put de ocurrir metilación en la 79Lis de la región cenrr..: globular de H3, que podría necesitarse para la f< -mación de heterocromaúna en los telómeros. Hasta fedla reciente se creía que la metilad• de bistonas era irreversible. No obstante, ya se id e-~ tificaron desmetilasas de hisronas, incluida una d~

metilasa espedfi ca de lisina (LSD 1) que actúa sobre K4 de la hislOna H3 y una enzima que desmetila la arginina en las hi.stonas H3 y H4. Aun no se sabe como se regula la desmelilación. Gran parte de Jos sitios de metilación en el DNA son islotes CpG (véase la sección 24.19, Los islotes CpG son dianas reguladoras). Las secuencias CpG en la heterocromatina por lo general están metíladas. Por el contrario, para que un gen se exprese es indispensable que los islotes CpG localizados en regiones promotoras sean desmetilados (véase la sección 24. l 8, La ex presión génica se vincula con la desmetilación). La metilación de DNA y de hiswnas está conectada en un circuito de reforzamiento mutuo. La metilaclón de H3 es la sefíal que redma la metilasa del DNA hacia la cromatina. El orden de los epi sodios es que la 9 Lis de H3 se d~sacetila para crear un sustrato para la metilación. La H3 se con viene entonces al estado de Me 9 Lis o Me/ Lis, que ofrece un sitio de unión para la metílasa de DNA. Algunas enzimas transferasas de metilos de histonas contienen sitios posibles de unión para el par CpG metílad o, de manera que la metHación del DNA refuerza el circuito con el fin de brindar una diana para que la rransferasa de metilos de hisronas se una. El punto importante es que u n tipo de modificadón puede desencadenar el otro. Estos sistemas están muy generalizados, como se observa por las pruebas de estas conexiones en bongos, plantas y células animales, y de la reguladón de la transcripdón en los promotores usados por las polimerasas I y JI de RNA, así como el mantenimiento de la heterocromatina en un estado inerte.

E

Los estados de la cromatina se interconvierten por modificación

El tipo contrario de episodios tiene lugar cuando se compara la activación de un promotor con la generación de heterocromatina. Las acciones de las enzimas que modifican la cromatina aseguran que los sucesos de activación sean muruameote excluyentes con respecto a los de desactivación. La metilación de 9 Lis de H3 y la acetilación de 14 Lis de H3 son mutuamente antagonistas. Las acetilasas y desacetilasas pueden desencadenar los episodios iniciadores. La desacetílación permite que ocurra la metilacíón, lo que da lugar a la formación de uo complejo heterocromático (véase la sección 31.3, La heterocromatína depende de interacciones con las histonas). La acetilación marca una región como activa (véase la sección 30.1 l. I.a activación del prommor comprende una serie ordenada de episodios).

l a activa ción del promotor co mprende una serie ordenada de episodios Conteptos principales El complejo de remodelado puede reclutar al complejo de acetilación. la acetilación de histonas puede ser el suceso que mantenga al complejo en estado activado.

¿Cómo se reclutan las acetilasas (o desacetilasas) en sus dianas específicas? Como se ha observado con los complejos de remodelado. es posible que el proceso sea indirecto. Un activador (o represor)

Estado inactivo

Estado activo Acetilasa de histonas

Conceptos plindpales • La acetilación de histonas se relaciona con la activación génica. • La metilación de DNA y de histonas se relaciona con la heterocromatina.

En la se resumen los tres tipos de diferencias observadas entre las cromatinas activa e inactiva. • La cromatina acLiva se acetila en las colas de las histonas H3 y H4. • La cromatina inactiva se meú\a en la 9 Lys de la histona H3. • La cromatina inactiva se metila en las citosinas de los pares CpG.

Desacetilasa de histonas Desmetilasa de hlstonas Metilasa de histonas

("Desmetilasa de DNA?) Metilasa deDNA

')J J~

La acetilación de las histonas activa la cromatina, y la metilación de DNA y las histonas la desactiva.

30 .11 La activación del promotor comprende una serie ordenada de episodios

809

específico de secuencia puede interactuar con un componente del complejo de la acelilasa (o desacetilasa} para reclutar un promotor. Puede haber también interacciones directas entre complejos de remodelado y complejos de mod ificación de histonas. La unión po r el complejo de remodelado SWI/SNF puede llevar a su vez a la unión por el comp1ejo de acetilasa SAGA. Luego, la acetiladón de h.istonas puede, de hecho, estabilizar el vinculo con el complejo SWI/SNF, lo que hace un reforzamiemo mutuo de los cambios de los componentes en el promotor. Se pueden conectar todos los sucesos que tienen lugar en e! promotor a la serie resumida en la . El episodio de in:iciación es ia unión de

El factor de transcripción se une a una secuencia específica

El complejo de remodelado se une a través de un factor

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J» ~

El factor se libera

El remodelado cambia la organización del nucleosoma

]l]J

1

El compleío de acetilasa se une por medio del complejo ~,., de remodelado

un componente espedfico de secuencia (que puede hallar su secuencia diana en el DNA en el contexto de la cromatina), lo que recluta un complejo de remodelado. Los cambios ocurren en la estructura del nucleosoma. Un complejo de acetilación se une y la acetilación de las histonas diana provee una marca covalente de que el sitío se ha activado. También ocurre modificación del DNA en el promotor. La metilación de la cüosina en pares CpG se vincula con la inactividad génica (véase la sección 24 .18, La expresión génica se relaciona con la desmetilación) . La base para el reconocimiento del DNA como diana de la merilación no está muy bien esclarecida (véase sección 31.8, La metilación del DNA se encarga de la impresión) . Es claro que el remodelado de la cromatina en el promotor requiere una diversidad de cambios que afectan e l nucleosoma, incluida la acetilación, pero. ¿qué cambios se requieren dentro del gen para que una polimerasa de RNA lo atraviese? Se sabe que la polimerasa de RNA puede transcribir el DNA in vitro a velocidades parecidas a la velocidad in vivo (-25 nucleótldos por segundo), sólo con un molde de DNA libre. Se han descrito varias p roteínas por su capacidad para mejorar la velocidad con que la polimerasa de RNA transcribe la cromatina in vivo. La característica común es que actúan sobre lacromatina . Un modelo actual de su acción es que se asocian a la potimerasa de R.J'\fA y viajan con ella a lo largo del molde, lo que modifica la estructura del nudeosoma por su acción sobre las histonas. Entre estos factores están las acetilasas de histonas. Una posibiUdad, es que la primera polimerasa de RNA en transcribir un gen sea la pionera de los factores de acarreo de la polimerasa que cambien la estructura de la unidad de transcripción, para hacer más fácil la actuadón de las poümerasas posteriores.

La fosforilación de las histonas afecta la estructura de la cromatina Concepto principal • AL menos dos histonas son dianas para la fosforilación, ta l vez con efectos contrarios.

la activación del promotor comprende la unión de un activador específico de secuencia, el reclutamiento y la acción de un com plejo de remodelado, y el reclutamiento y la acción de un complejo de acetilación. El orden de los episodios puede diferir, o tal vez se presenten de manera simult ánea, de acuerdo con el gen.

810

CAPÍTULO 30 Control de la estructura de la cromatina

Las histonas se fosforilan en dos circunstancias: • de manera repetida en el ciclo celular, y • en relación con el re modelado de la cromarína. Se ha sabido durante mucho tiempo que la bistona Hl es fosforilada du rante la mitosis y en fecha más reciente se descubrió que constituye un sustra-

to muy bueno para la cinasa Cdc2, que controla la división celular. Ello llevó a la especu lación de que la fosforilación tal vez se relacione con la condensación de la cromatina, pero basta ahora no se ha demostrado un efecto directo de este episodio de fosfori lación y no se sabe si tiene participación en la división celular. La pérdida de una cinasa que fosforila la histOna H3 en la 10Ser tiene efectos devastadores sobre la estructura de la cromatina. En la se compara la estructura extendida usual del conjunto de cromosomas polirénicos de la Drosophila melanogaster (fotografía superior) con la estructura que se observa en una mutan te nuclear que no tiene cinasa JIL-I (fotografía inferior). La ausencia de JlL-I es letal, pero tos cromosomas pueden visualizarse en las larvas antes de su muerte. La causa de la pérdida de la estructura es con roda probabilidad la falta de fosforilación de la h is-

tona H3 (por supuest.O, JTL-1 puede tener también otras dianas). EstO permite suponer que se requiere la losforilación de H3 para generar la estructura cromosómica más extendida de las regiones eucromáticas. La prueba que sustenta la idea de que JIL-I actúa de manera directa sobre la cromatina es que se relaciona con el complejo de proteínas que se une al cromosoma X para aumentar su expresión génica en machos (véase la sección 31.5, Los cromosomas X sufren cambios globales). Esto deja algunas impresiones contradictorias respectO de la función de la fosforilación de las histonas. Si tiene importancia en el ciclo celular, es posible que sea una señal para la condensación. Su efecto sobre el remodelado de la cromatina parece ser el contrario. Por supuesto, es posible que la fosforilación de ctiferentes histonas o incluso de diferenres aminoácidos en una de ellas, tenga efe ctos contrarios sobre la estruclUra de la cromatina.

EE

Se encuentran algunos segmentos comu nes en las proteínas que modifican la cromatina

Conceptos principales • El dominio cromo se encuentra en varias proteínas de la cromati~a que tienen efectos de activación o represión sobre la expresión de los genes. • El dominio SET es parte del sitio catalítico de las transferasas de metilos de proteínas. • El dominio bromo se encuentra en una diversidad de proteínas que interactúan con la cromatina y sirve para reconocer sitios acetilados en las histonas.

las moscas que no tienen Jll-1 cinasa presentan cromosomas politénicos anormales que se condensan en lugar de extenderse. Las fotograñas son cortesía de Jorgen Johansen y Kristen M. Johansen, Iowa State University.

Los conocim ientos que se tienen sobre los m ecanismos moleculares del control de la estructura de la cromatina se inician con mutantes que in fl uyen en el efecto de la variegación de la posición. Se han identificado casi 30 genes en el género Drosophila y se denominan de manera sistemática Su(var) aquellos cuyos productos actúan suprimiendo la variación y E (var) aquellos cuyos productos la aumentan. Recuérdese que los genes se nombran por la conducta de los loci mutantes. Las mutaciones de Su (var) yacen en genes cuyos productos son necesarios para la formación de la heterocromatina e incluyen enzimas que actúan sobre la cromaúna, como las desacetilasas de histonas, y las proteínas que se localizan en la heterocromatina. Las mutadones E (var) yacen en genes cuyos productos son inctispensables para activar la expresión génica e in-

30, U Se encuentran algunos segmentos comunes en las protelnas que modifican la cromatina

81 1

cluyen miembws del complejo SWI/SNE Por estas propiedades se infiere de inmedia to que la modifica ción de la estructura de la cromatina es importante para controlar la formación de heterocromatina. La universalidad de esros mecanismos la indica el hecho de que muchos de estos loci tienen homólogos en levaduras que muestran propiedades análogas. Algunos de los homólogos en Schizosaccharomyces pombe son clr (genes reguladores de loci crípticos) donde las mutadones afectan el silenciamiemo. Muchas de las proteínas Su(var) y E(var) tienen un segmento común de 60 aminoácidos llamado cromodominio o dominio cromo. El hecho de que este dominio se encuentre en proteínas de ambos grupos permite suponer que representa un segmento que participa en las interacciones proteú1a-proteína en la cromatina . Los cromodominios se encargan en gran parte de dirigir las proteínas hada la heterocromatina. Actúan por reconocimiento de lisinas metiladas en colas de histonas (véase la sección 31. 3, La he terocromatina depende de interacciones con las histonas y la sección 31.4, l'olycomb y Trithorax son represores y activadores antagonistas). La Su(var)3-9 tiene un cromodomlnio y también un Su(var)3 -9, un dominio potenciador de gusto Trithorax (SET), segmento que se encuentra en varias proteínas Su(var} . Sus homólogos en mamíferos se localizan en la heterocromalina del centrómero- Es la transCetasa de melilos de histonas la que

1Át~9fre<;i~

1

2

3

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Cinasa

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Acetilasa Activa

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l as múltiples modificaciones en la cola H3 afectan la actividad de la cromatina. 812

CAPÍTU LO30 Control de la estructura de la cromatina

actúa sobre 9Lis de la histona H3 (véase la sección 30.9, la metilación de histonas y de DNA están relacionadas). El dominio SET es parte del süio activo y, de hecho, es marcador de la actividad de meülasa . El bromodominio o dominio bromo se encuentra en una diversidad de proteínas que imeractó.an con la cromatina, como las acetilasas de histonas. La estructura cristalü1a muestra que tiene un sitio de unión para la lisina acetilada. El bromodominio mismo reconoce sólo una secuencia muy corta de cuatro aminoácidos que incluye la lisina acetilada, por lo que la especificidad para el reconocimiento del sitio diana debe depender de interacciones que abarquen ambas region~es . Además de las acetilasas, el bromodominio se encuentra en una variedad de proteínas que interactúan con la cromatina, como los componenres del aparare de transcripción. Esto indica que se utiliza para reconocer histonas acetiladas, lo que significa que tal vez. se encuentre en proteínas que participan en la activación génica . Aunque hay una correlación general donde la cromatina activa se acetila, en tanto la inactiva es metilada en las histonas, hay algunas excep ciones a la regla . la mejor definida es que la acetilación de 12 Lis de H4 se vincula con la heterocromatina. Puede haber modificaciones múltiples en la misma cola de histona y un a puede influir en otra. La fosiorilación de una serina en una posición puede set necesaria para la acetilación de una lisina en otra . la muestra la situación en la cola de H3, que puede existir en uno de dos estados. El estado inactivo tiene una 9 Lis metilada. El estado activo tiene una 9Jjs acetilada y una u>serfosfatada. Estos estados se pueden mantener sobre regiones amplias de la cromatina. La fosforilación de 10Ser y la me.tiladón de 9lis son mutuamenre inhibitorias, lo que sugiere el orden de episodios que se muestra en la figura. Esta situación puede hacer que la cola se mueva entre Jos estados activo e inactivo.

E

Resumen

los genes cuyas regiones de control se organizan en los nucleosomas por lo general no se expresan. En ausencía de proteínas reguladoras espeóficas, los promotores de otras regiones reguladoras se organizan por octámeros de histonas en un estado en el que no pueden activarse. Esto puede explicar la necesidad de los nuclcosomas de ubicarse de manera predsa en la vecindad de un promoror, de mane.ra que los sitios regu ladores indispensables se expongan en forma apropiada. Algunos factores de transcripción tienen la capacidad de reconocer

el DNA en la superficie del nucleosoma y puede requerirse un posicionamienLO panicular del DNA para la iniciación de la transa·ipcióo. Las cromatinas activa e inactiva n o están en equilibrio. Se requieren episodios súbitos de escisión para convenir una en la otra. Los complejos de remodelado de la cromatina tienen la capacidad de desplazar octámeros de histonas por un mecanismo que comprende la hidrólisis de ATP. Los complejos de remodelado son grandes y se dasifican de acuerdo con el tipo de sub u ni dad de fosfatasa deJ u ifosfnto de adenosina. Dos tipos frecuentes son SWT/SNF e ISWI. Una forma característica de este remodelado de la croma tina es desplazar uno o más de los octámeros de histonas de secuencias específicas del DNA, creando un limite que da como resultado el posicionamiento predso o preferente de los nucleosomas cercanos . El remodelado de la cromatina puede también comprender cambios en las posiciones de los nucleosomas, que a veces impJkan el deslizamiento de los octámeros de histonas por el DNA. La acetiladón de histOnas tiene lugar tanto en la replicación como en la transcripdón y en ocasiones es necesaria para formar una estructura de cromatina menos compacta. Algunos coactivadores que conecta n fanorcs de transcripción con el aparara basal tienen actividad de acetilasas de histonas. Por el contrario, los represore!> pueden vincularse con desacctilasas. Las enzimas modificantes pueden ser espeáficas de aminoácidos pa rticulares en histonas especificas. Los sitios más frecuentes de mocüficación se localizan en las colas te rminales N de las histonas H3 y H4 que protruyen desde los nucleosomas entre los giros del DNA. los complejos de activación (o represión) suelen ser grandes y a menudo contienen varias actividades que emprenden diferentes modificaciones de la cromatina. Algunos segment os comunes que se encuentran en las proteínas que modifican la cromatina son el cromodorn.inio (que se encarga de las interacciones proteína-proteína), eJ bromodominio (que se dirige a la Hsina acetilada) y el dominio SET (que es parte de los sitios act ivos de las rransferasa de metilos de las histonas). La modificación de las colas de hístonas constituye un desencadename de la reorganización de la cromatina. La acetilación en general se vincula con la acúvación génica. Las acetilasas de histanas se en cuentran en complejos de activación. y las desacetilasas de hislonas en complejos de inacrivadón. La metilación de las h.istonas se vincula con la inactivación génica. Algunas de las modificaciones de las histona!> pueden ser exclusivas o sinérgicas con otras.

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Las acetilasas se vinculan con activadore~

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Las desacetilasas se relacionan con represores A.rl. cutu Je rev1sión Ríchards. E. J .. Elgln. S. C.. and Rlchards, S. C. (2002). Epigenetic codcs for heterochromatin formation and silenciog: rounding up the usual suspects. Ce//108. 489-500.

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Las metilaciones de histonas y de DNA están relacionadas \rri'fulos de

1e'1

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n

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816

CAPÍTULO 30 Control de la estructura de la cromatina

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Referencias

817

Los efectos epigenéticos

son heredados ESQUEMA DEL CAPÍTULO Introducción • Los efectos epigenéticos pueden ser consecuencia de la modificación de un ácido nucleico después de que se ~a sintetizado o de la perpetuación de estructuras proteínicas.

La heterocromatina se propaga a partir de un episodio de nucleación • La heterocromatina es nucleada en una secuencia especifica y la estructura inactiva se propaga por la fibra de cromatina. • los genes dentro de las regiones oe heterocromati'la están inactivos. La long1tud de la región inactiva vaña de una célula a otra; como resultado, la desactivación de genes en esta vecindac causa un efecto de posición abigarrado. • Ocurren efectos de dispersión similares en los telómeros y los cartuchos silentes en el tipo de apareamiento de las levaduras.

La heterocromatina depende de interacciones con las histonas • La HPl es la proteína clave en la formación de la heterocromatina de mamífero y actúa por unión a la !listona 1-13 metilada. • La Rapl inicia la formación de la heterocromatina en levaduras por unión a secuencias diana específicas en el DNA. • Las dianas de Rapl incluyen repeticiones teloméricas y silenciadores en HML y HMR. • La Rapl recluta Sir3/Sir4 que interactOan con laS colas terminales Nde H3 y H4.

Polycomb y Trithorax son represores y activadores antagonistas Las proteínas del grupo Polycomb (Pc·G) perpetúan ~.on estado de represión por medio de las divisiones celulares. El PRE es una secuencia del DNA indispensable para la acción de Pc-G. • La PRE constituye un centro de nucleación a partir del cual las proteínas Pc·G propagan una estructura inactiva. No se ha encontrado una proteína Pc·G indillidual que pueda unirse a PRE. El grupo de proteínas Trithorax antagoniza la acción de Pc-G.

Los cromosomas Xexperimentan cambios globales Uno de los dos cromosomas Xse desactiva al azar en cada célula durante la embriogénesis de los mamíferos euterios. En casos excepcionales do nde hay más de dos cromosomas X, todos, excepto uno, están desactivados.

818

• El Xic (centro de desactivación de X) es una región de actuación en configuración cis en el cromosoma X, necesaria y suficiente para asegurar que sólo un cromase-. X permanezca activo. • El Xic incluye al gen Xist que codifica un RNA que se encuentra sólo en cromosomas X inactivos. • Se desconoce el mecanismo encargado de prevenir que c. RNA Xist se acumule en el cromosoma activo.

Las condensinas producen la condensación de le cromosomas • • • •

Las protefnas SMC son fosfatasas del trifosfato de adenosina que incluyen condensinas y cohesinas. Un heterodímero de las proteínas SMC se vincula con otr.:s subonidades. Las conoersinas hacen que la cromatina de enrolle en forma m~s estrecha por la introducción de superhélices positivas al DNA. Las condensinas se encargan de condensar los cromosorr<: durante la mitosis. Las condensinas específicas de cromosomas se encargan :;;~ condensar cromosomas X inactivos en C. elegons.

Una metilasa de mantenimiento perpetúa la metilación del DNA • Casi todos los grupos metilo del DNA se encuentra n en \a; dtosinas de ambas cadenas del par CpG. • La replicación convierte un sitio por completo metilado euno hemimetilado. • Una metilasa de mantenimiento conllierte los sitios hemimetilados en meti!ados por completo.

La metilación del DNA se encarga de la impresióLos aleles materno y paterno pueden tener diferentes patrones de metilación en la fecundación. • La metilación suele llincularse con la desactivación del gen. • Cuando los genes tienen impresión diferenciaL la supervivencia de los embriones puede requerir que el ale.: funcional sea prollisto por el progenitor con el alelo no metilado. • La supervivencia de heterocigotos para genes impresos es diferente, de acuerdo con la dirección del cruce. Los genes impresos se presentan en grupos y pueden depender de un sitio de control local, donde ocurre meti2· ción nueva, a menos que se ellite de manera especifica.

Un solo centro puede controlar los genes con impresión opuesta • Los genes impresos son controlados por la metilación de sitios de acción en configuración cis.

• La metilaclón pueden encargarse de desactivar o activar un gen.

Los efectos epigenéticos pueden heredarse • Los efectos epigenéticos pueden derivarse de una modificación de un ácido nucleico después de que se ha sintetizado, o por la perpetuación de estructuras proteínicas.

Los priones de levaduras muestran herencia desusada • la protetna Sup35 en su forma soluble de tipo silvestre

es un factor de terminación de la traducción. También puede existir en una forma alternativa de agregados oligoméricos. donde no es activa para la síntesis de protelnas. • La presencia de una forma oligomérica hace que la proteína recién sintetizada adquiera la estructura inactiva. .. La conversión entre las dos formas recibe la influencia de los chaperones. • La Forma de tipo silvestre tiene el estado genético recesivo psi· y la forma mutante tiene el estado genético dominante PSI'.

Introducción Concepto pñncipal • Los efectos epigenéticos pueden ser consecuencia de la modificación de un ácido nucleico después de que se ha sintetizado o de la perpetuación de estructuras proteínicas.

La herencia e pigenética describe la posibilidad de que diferentes estados, que pueden tener diferentes consecuencias feno típicas, se hereden sin ningún cambio en la secuencia del DNA. Esto significa que dos individuos con la misma secuencia de DNA en ellocus que controla el efecto p ueden mostrar dife rentes fenotipos. La causa básica de este fenómeno es la existencia de una estructura aur.operpetuame en uno de los individuos, que no depende de la secuencia de DNA. Varios tipos diferentes de estructuras tienen la capacidad de presentar efectos epigenéticos: • Una modificación covalente del DNA (metilación de una base). • Una estructura proteinácea que se ensambla con el DNA. • Un agregado proteínico que controla la conformación de las nuevas subunidades según se sintetizan. En cada caso, el estado epigenético es resultado de una diferencia en la función (por lo general inactivación) determinada por la estructura. En el caso de la metilación del DN A, una secuencia metilada puede no transcribirse, en tamo una no meritada se expresará. La muestra cómo se hereda esta circunstancia. Un alelo tiene

Los priones causan enfermedades en Los mamíferos La proteína que causa encefalopatía espongiforme ovina tiene dos formas de presentación: la PrP' no infecciosa de tipo silvestre, susceptible a las proteasas. y la PrPI< que causa enfermedad y es resistente a las proteasas. La enfermedad neurológica se puede transmitir a los ratones mediante la tnyección de la oroteina PrP~< purificada. El ratón receptor debe tener una copia del gen PrP que codifica la proteína de ratón. La proteína PrPS< puede autoperpetuarse y hacer que la protelna PrP, recién sintetizada, adopte la forma oe PrPs. en lugar de la forma PrPc. Múltiples cepas de Prf'$< pueden tener diferentes conformaciones proteínicas.

Resumen

una secuencia metilada en ambas cadenas del DNA. en tamo el otro tiene una secuencia no metilada. La replicación del alelo metilado crea cadenas hijas hemimetiladas que recuperan el estado metilado gracias a la intervención de una enzima metilasa,

Alelo metilado

Alelo no metilado

Replicación

l +

t

Metilaciót,

La replicación de un sitio metilado produce ONA hemimetilado, donde sólo una cadena progenitora está metilada. Una metilasa de perpetuación reconoce los sitios hemimetilados y añade un grupo metilo a la base en la cadena hija, lo que restablece la situación original donde el sitio está metilado en ambas cadenas. Un sitio no metilado se mantiene sin me titar después de la replicación. 31

1

Introducción

819

constitutivamente activa. La replicación no afecta el estado del alelo no metilado. Si el estado de metilación afecta la transcripción, los dos alelos clifieren en su estado de expresión génica aunque sus secuencias sean idénticas. Las estructuras autoperpetuantes que se ensamblan en el DNA suelen tener un efecto represor al formar regiones heterocromáticas que impiden la expresión de genes en su interior. Su perpetuación depende de la capacidad de las proteínas en una región heterocromática de mantenerse unidas a esas regiones después de la replicación y luego de reclutar más subunidades proteínicas para sostener al complejo. Si cada una de las subunidades se distribuye al azar en cada par de cadenas hijas durante la replicación, las dos seguirán marcadas por la proteína, aunque su densidad disminuya a la mitad de la concentración previa a la replicación. La muestra que la existencia de efectos epigenéticos obliga a pensar que una proteína encargada de tal circunstancia debe tener algún tipo de capacidad de automoldeado o autoensamblado capaz de testablecer el complejo originaL Puede ser el estado de modificación de la pro teína más que su presencia en sí, el encargado de un efecto epigenético. Por lo generaL las colas de las rustonas H3 y H4 no están acetiladas en la heterocromatina constitutiva. Sin embargo, si la heteroa-omatina del centrómero esta aceti.lada, los genes silenciados

Helerocromatina

Eucromatina

Replicación

~

Autoensamblado de proteínas

r

1

t

La heterocromatina está formada por proteínas que se vinculan con histonas. La perpetuación por medio de (a división requiere que la proteína se relacione con cada par de cadenas hijas y luego reclute nuevas subunidades para volver a ensamblar los complejos. represivos. 820

CAPÍTULO 31 Los efectos epigenéticos son heredados

tal vez se tornen activos. El efecto tal vez se perpetúe durante la mitosis y meiosis, lo que permite suponer que se ha creado un efecto epigenético al cambiar del estado de acetilación de las hisronas. Los agregados de proteínas independientes que causan efectos epigenéticos (llamados priones), actúan por secuestro de la proteína en una forma en la que no puede mostrar su función nonnal. Una vez que se forma el agregado de proteínas, obliga a las nuevas subunidades de proteína a unirse en conformación inactiva.

La heterocromatina se propaga a partir de un episodio de nucleación Conceptos pñncipales

• La heterocromatina es nudeada en una secuencia específica y la estructura inactiva se propaga por la fibra de cromatina. • Los genes dentro de las regiones de heterocromatina se encuentran inactivos • La longitud de la región inactiva varía de una célula a otra; como resultado, la desactivación de genes en esta vecindad causa un efecto de posición abigarrado. • Ocurren efectos de dispersión similares en los telómeros y los cartuchos silentes en el tipo de apareamiento de las levaduras.

Un núcleo de interfase contiene eucromatina y heterocromatina. El estado de condensación para La heterocromaLina es similar al de los cromosomas en la mitosis. La hcterocromatina es inerte. Permanece condensada en la interfase, tiene represión transcripcional, se replica de manera tardía en la fase S y puede localizarse en la periferia del núcleo. La heterocromatina cenn·omérica consta, por lo general, de DNA satélite; sin embargo, la formación de heterocromatina no se define en forma rigurosa por la secuencia. Cuando se transfiere un gen, ya sea por translocación cromosómica o por transfeccióo e integración, hacia una posición cercana a la he terocromatina, puede tornarse inactivo como resultado de su nueva localización, lo que indica que se ha converlido en heterocromático. Tal desactivación es resultado de un efecto epigenético (véase la sección 31.1 O, Los efectos epigenéticos pueden ser heredados). Puede diferir entre células individuales en un animal y da como resultado el fenómeno del efe ct o de posición abigarrado (PEV), donde células idénticas en términos genéticos tienen diferentes fenotipos, lo que se ha descrito bien en el género Drosophila. La muestra un ejemplo del efecto de posición abigarra-

do en el ojo de la mosca. Algunas regiones del ojo carecen de color, en tanto otras son rojas debido a que el gen blanco en alguna región fue desa1ctivado por la heterocromatina cera na en unas células, pero se mantuvo activo en otras. La explicación de este efecto se m ue·s tra en la . La desactivación se expande desde la heterocromatina hacia la región adyacente una distancia variable . En algunas células llega bastante lejos para desactivar un gen cercano, pero en otras no lo hace. Esto ocurre en un cierto momento del desarrollo embrionario, después del cual todas las células de la progenie heredan ese estado del gen . Las céluJas que provienen de un ancestro donde el gen estaba inactivo forman parches que corresponden al fenotipo con pérdida de función (en el caso de blanco, ausencia de color) . Cuanto más cerca esté un gen de la het.erocromatina, mayor probabilidad habrá que sea inactivo. Esto permite suponer que la formación de la heterocromatina puede ser un proceso de dos etapas: ocurre un episodio de nucleación en una secuencia específica y después la estructura inactiva se propaga por la fibra de cromatina. La distancia hasta la que se extiende la estructura inactiva no está determi nada de manera precisa y pudiese ser aleatoria, con la influencia de parámetros como las cantidades de componentes de proteínas limitantes. Un factor que puede afectar el proceso de dispersión es la activación de los promotores en la región; un promotor activo puede inhibir la dispersión. Los genes que están más cerca de la helerocromatina tienen mayor probabilidad de ser desactivados y, por tanto, serán inactivos en un mayor porcentaje de células. En este modelo, es posible que Jos limites de una región heterocromá'tica terminen por el agotamien to del aporte de una de las proteínas que se requiere. El efecto de silen ciamiento telomérico en levaduras es análogo del efecto de posición abigarrado en el género Drosophila; los genes tnmsloca dos a una ubicación telomérica muestran laLmisma clase de pérdida variable de actividad. Esto se debe a un efecto de dispersión que se propaga d'esde tos telómeros. Una segunda forma de sile nciamiento tiene lugar en las levaduras. El tipo de apareami,e nto de las levaduras lo determina la actividad de un solo locus activo (MA T), pero el genoma contiene otras dos copias de las secuencias de tipo de apareamiento (HML y HMR), que permanecen inactivas. Los loci HML y HMR comparten muchas propiedades con la heterocromatina y podrían considerarse regiones constituyentes de la heterocromatina en miiniatura (véase la sección 19.2 2, Los cartuchos silentes en HML y HMR están reprimidos) .

Pérdida de color en parches

Ocurre el efecto de posición abigarrado en el color del ojo cuando el gen blanco se integra cerca de la heterocromatina. las células donde ese gen es inactivo producen parches blancos en el ojo, en tanto las células donde es activo producen parches rojos. la gravedad del efecto depende de la cercanía del gen integrado a la heterocromatina. Fotograña por cortesía de Steven Henikoff, Fred Hutchinson Cancer Researcll Center.

\

1 la extensión de la heterocromatina desactiva los genes. la probabilidad de que un gen se desactive depende de la distancia que lo separa de la región de heterocromatina.

31.2 La heterocromatina se propaga a partir de un episodio de nucleación

821

guiadores o proteínas que inhiben en forma direcla la transcripción. Dos sistemas que se han descrito en términos moleculares son HPl en los mamíferos y el complejo SIR en las levaduras. Aunque no hay similitudes detalladas enrre las proteínas comprendidas en cada sistema, el mecanismo general de reacción es similar: los punros de contacto en la cromatina son colas terminales N de histonas. La HPl (proteína 1 de la heterocromatina) es una de las proteínas Su(var) más importantes, identificada en un principio como una proteína que se localiza en la heLerocromatina mediante la tinción de cromosomas politénicos con un anticuerpo diri· gido contra la proteína. Después se demostró que puede ser producto del gen Su(var)2·5. Su homóloga en la levadura Schizosaccharomyces pombe es codificada por swi6. La proteína original identificada como HP 1 hoy se denomina HP1 o. debido a que desde entonces se han encomrado dos proreínas relacio· nadas, HPlP y HPly. La HP 1 conrienc un cromodomirlio cerca del extremo N y otro relacionado con él, llamado dominio de sombra crómica, en el extremo C (véase la Figura 31.6); la importancia del cromodominio queda de manifiesto por el hecho de que es la localización de muchas de las mutaciones de HPl. La mutación de una desacetilasa que acrúa sobre Ac- 14Lis de H3 impide la metilación en 9 Lis. La H3 que está metilada en 9Lis se une a la proteína HP J gracias a un cromodominio. Esto sugiere el modelo para iniciar la formación de la heterocromaLina que se muestra en la . Primero, la desacetilasa actúa para retirar la modificación en 14Lis y luego la mcrilasa SUV39Hl actúa sobre la cola de la hiswna H3 para crear la señal metilada a la que se unirá HPl. La amplía la reacción para mostrar que la interacción tiene lugar emrc el cromodom inio y la lisina metilada, que constituye un dcscncadename para la formación de cromatina

La heterocromati na depende de interacciones con las histonas Conceptos principales La HPl es la proteína clave en la formación de la heterocromatina de mamífero y actúa por unión a la histona H3 metilada. • La Rapl inicia la formación de la heterocromatina en levaduras por unión a secuencias diana específicas en el DNA. Las dianas de Rapl incluyen repeticiones teloméricas y silenciadores en HML y HMR. • La Rapl recluta a Sir3/Sir4, que interactúan con las colas terminales N de H3 y H4.

La desactivación de la cromatina tiene lugar cuan· do se agregan p roteínas a la fibra nucleosómica. La desactivación puede deberse a una diversidad de efectos que incluyen la condensación de la cromatina para hacerla inaccesible al aparato necesario para la expresión génica, la adición de proteínas que bloquean de manera directa el acceso a los sitios re-

Metiltransferasa Desacet1lasa de histonas de histonas SUV39H1

HP1

H3

Cromatina inactiva

La SUV39Hl es una metiltransferasa de histonas que actúa sobre la 9lis de la histona H3. La HPl se une a la histona metilada.

HP1

Extremo N

Cromodominio

B1sagra

Ala tArg Trec(l.is Gln Treq Ala Arg Lís Ser TreoGtu Gl

Dominio sombra

U~ .....................H3

La metitación de la histona H3 crea un sitio de unión para HPl. 822

CAPÍTULO 31 Los efectos epigenéticos son heredados

inactiva. La muestra que la región inactiva puede entonces extenderse por la capacidad de otras moléculas de HPl de interactuar emre sí. Se puede suponer la existencia de una base común para el silendamiento en las levaduras porque depende de un conjunto común de lod genéticos. Las mutaciones de cualquiera de un número de genes causan activación de HML y HMR y también alivian la desactivación de genes que se han integrado cerca de la heterocromatina telomérica. Por lo tanto, los productos de estos loci acrúan para mantener un estado inactivo de ambos tipos de heterocromatina. En la se propone un modelo para las acciones de estas proteínas. Sólo una de ellas es una proteína de unión a DNA específica de secuencia. Se trata de RAPJ, que se une a las repeticiones CHA en los telómeros, y también a los elementos del silenciador de acción en configuración cisque se requieren para la represión de HMLIHMR. Las proteínas Sir3 y Sir4 interactúan con Rapl y también entre sí (pueden actuar como un heteromultúnero). Las Sir3/Sir4 interactúan con las colas terminales N de las histonas H3 y H4. (De hecho, la primera prueba de la posibilidad de que las h.ístonas tengan una función directa en la formación de la helerocromatina provino del descubrimiento de que las mutaciones suprimen el siJenciamiemo en el mapeo de los genes HMLIHMR que codifican H3 y H4). La Rapl tiene la panicipación crucial de identificar las secuencias del DNA donde se forma la heterocromatina. Recluta Sir3/Sir4 e interactúa de manera directa con las histonas H3/R4. Una vez que Sir3/ Sir4 se han unido a las histonas H3/H4, el complejo puede polimerizarse aun más y dispersarse a Jo largo de la fibra de cromatina. Esto puede desactivar la región, ya sea porque la cobertura misma con Sir3/ Sir4 tiene un efecto inhibitorio, o porque la unión a las histonas H3/H4 induce algún otro cambio en la estructura. No se sabe qué llmila la dispersión del complejo. El extremo C de Sir3 tiene similitud con las proteínas de la lámina nuclear (constituyentes de la matriz nuclear) y ta l vez se encargue de apuntalar la heterocromatina en la periferia nuclear. Una serie simi lar de sucesos forma las regiones silenciadas en HML y HMR (véase también la sección 19.22, Los cartuchos silentes en HML y HMR están reprimidos). Tres factores específicos de secuencia participan en el desencadenamiento de la formación del complejo: Rap l , Abfl (un factor de transcripción) ORC (el complejo de replicación en el origen). En este caso, Sirl se une a un factor específico de secuencia y recluta a Sir2, -3 y -4, para formar la estrucLUra represiva. La Sir2 es una desacetilasa de bistonas. La reacción de desacetilación es indispensable para mantener la unión del complejo Sir a la cromatina.

La HP1 se une a la H3 metilada

La HP1 se

autoagrega~

l a unión de HPl a la histona H3 metilada forma un desencadenante del silenciamiento porque se agregan más moléculas de HPl a la cadena del nucleosoma.

Colas terminales N de H3/H4

~ Rap1

se une al DNA

~ Sir3/Sir4 se une a H3/H4

~ Sir3/Sir4 se pollmeriza

~ Sir3/Sir4 se une a la matriz

La formación de la heterocromati na se inicia cuando Rapl se une al DNA. Sir3/4 se une a Rapl y también a las histonas H3/H4. El complejo se polimeriza a lo largo de la cromatina y puede conectar telómeros a la matriz nuclear.

31.3 la heterocromatina depende de interacciones con las histonas

823

La formación de la heterocromatlna en la levadura S. pombe depende de un complejo que contiene varias moléculas de Rt\Ai (véase la sección 13.10, El RNA de interferencia tiene relación con el silenciamiento de Jos genes) . Estas moléculas de RNAi se producen por la uanscripción de repeticiones centroméricas para dar RNA que son fragmentados en unidades más pequeñas. El complejo también contiene proteínas que son homólogas de las que intervienen en la formación de la heterocromatina en orcos organismos, como Argonaure, que contribuye a dirigir los complejos de remodelado del complejo de silcnciamiento inducido de RNA (RISC) hacia la cromatina. Los componentes RNAi se encargan de localizar el complejo en el centrómero. A continuación, el complejo facilita la dimetüadón de la histona H3 por una metillransferasa de histonas. ¿Cómo reprime un complejo de silenciamlemo la activ idad de la cromatina ? Es posible que condense la cromatina de manera que las proteínas reguladoras no puedan encontrar sus dianas. Lo más sencillo sería suponer que la presencia de un complejo silenciador es muruamente incompatihle con la presencia de facwres de transcripción y polimerasa de RNA. La causa podría ser que los comp lejos de silenciamiemo impidan el remodelado (y asi. impidan de manera indirecta que los factores se unan) o que oculten de fo rma directa los siúos de unión a los factores de transcripción en el DNA. Sln embargo, la situación tal vez no sea tan simple puesto que se pueden encontrar facrores de transcripción y polimerasa de RNA en promotores en la cromatina silenciada. Es posible que esw signifique que el complejo silenciador impide que los facwres actúen, n o que se unan. De hecho. puede haber competencia entre activadores génicos y los efectos represores de la cromatina, de modo que la activación de un promotor .i nhibe la d,ispersión de un complejo silenciador. Otra est.runura especializada de la cromatina se forma en el centrómero. Su naturaleza se deduce por las propiedades de una mutación en Saccharomyces cerevisiae, cse4, que altera la estructura del centrómero. La Csc4 es una proteína relacionada con la histona H3. Una proteína centromérica de manúfero, la proteína A del cemrómero (CENP-A), óene una secuencia relacionada. Las imeracciones genéticas entre cse4 y CDE-ll y entre cse4 de una mmación en el gen de la histona H4 permiten suponer que se puede formar un octámero de histonas alrededor de un meoUo de Cse4-H4 y después, los complejos cencroméricos (factores de unión medular) CBFI y CBF3 pueden unirse para formar el centrómero. Entonces, el cemrómero puede vincularse con la formación de heterocromatina en la región. En las células humanas se requiere Ja proteína espeáfica 824

CAPÍTULO 31 Los efectos epigenéticos son heredados

del cemrómero, CENP-B, para iniciar modificaciones de la histona H3 (desacetiladón de 9 Lis y 14 Lis, seguida de la merUación de 9 Lis) que desencadenan un vínculo con la proteína Swi6 que conduce a la formación de heterocromarina en la región.

Polycomb y Trithorax son represores y activadores antagonistas Con«>ptos ¡.uín,ipnlf's Las proteínas del grupo PoLycomb (Pc-G) perpetúan un estado de represión gracias a Las divisiones celulares. • EL PRE es una secuencia del DNA que se requiere para la acción de Pc-G. El PRE constituye un centro de nucleación a partir del cual las proteínas Pc-G propagan una estructura inactiva. No se ha encontrado una proteína Pc-G individual que pueda unirse a PRE. Las protefnas del grupo Trlthorax antagonizan las acciones de Pc-G.

La heterocromatina ofrece un ejemplo de la represión específica de la cromatina. Otro lo brinda la genética de los genes homeóricos en el género Drosopltila. que condujo a la idemificación de un compleJO proteínico que parece mantener ciertos genes eo un estado reprimido. Las mutames Pe muestran transformaciones de ripo celular que son equivalentes a las mutaciones de ganancia de función en los genes Anrmnapedia (Anlp) o Ultrabithorax, debido a que C5tos genes se expresan en tejidos donde por lo general esrén reprimidos. Esto implica a Pe en la regu lación de la Transcripción. Es más. Pe es el protOtipo de una clase de - 15 loci llamado grupo Pe (Pc-G); las mutaciones en estos genes por lo general tien en el mismo resu ltado de eliminar la represión de los genes homeóticos, lo que sugiere la posibilidad de que e l grupo de proteínas renga alguna función reguladora común. Las proteínas Pe actúan en grandes complejos. El PRC 1 (complejo represor Polycomb) contiene la Pe misma, varias otras proteínas Pc-G y cinco factores generales de transcripción. El complejo Esc-E(z) contiene Ese, E(z ), otras proteínas Pc-G, una pro teína de unión a bistonas y una desacetilasa de histonas. La Pe misma tiene un cromodominlo que se une a la H3 metilada, y E(z) es una metiltransferasa que actúa sobre H3. Estas propiedades sustentan de manera directa la conexión entre el remodelado de la cromatina y la represión, insi n uada en un prindpio por las propiedades de brahma, una contraparte de SW12 en la mosca. El gen brahma codifica un componente del complejo de remodelado SWI/SNF,

y la pérdida de la función de brahma suprime las mmaciones en Polycomb.

En concordanda con Ja pleiotropía de las mutaciones de Pe, la Pe es una proteína nuclear que puede vis u a \izarse en -80 sitios de cromosomas politénicos, que incluyen el gen Anlp. Otro miembro del Pc-G, polihomeótico se visualiza como un conjunto de bandas cromosómicas poli ténicas idénticas a las que se une Pe. Las dos proteínas se coinm.unoprecipitan de manera simultánea en un complejo de -2.5 x 106 D que contiene de 1O a 15 polipéptidos. Aún no se establece Ja relación en tre estas proteínas y los productos de los - 30 genesPc-G. Una posibilidad es que algunos de estos productos génicos formen un complejo represor general y después algunas de las otras proteínas se vinculen para determinar su especificidad. Las proteínas Pc-G no son represores convencionales. No se encargan de determinar el patrón inicial de expresión de los genes donde actúan. En ausencia de las proteú1as Pc-G estos genes en un inicio están reprimidos, como es lo hahirual, pero más tarde en el desarrollo se pierde la represión sin que el grupo Pc-G funcione. Esto permire suponer que las proteínas Pc-G de alguna forma reconocen el estado de represión cuando se establece y después actúan para perpetuarlo durante la división de las células hijas. La muestn un modelo donde las proteínas Pc-G se unen en conjunción con un represor, pero las proteínas Pc-G se mantienen unidas después de que ya no está disponible el represor, algo que es necesario para mantcnet la represión, de manera que si las protemas Pc-G están ausentes, el gen se activa Una región de DNA que es suficiente para perm itir la respuesta a los genes Pc-G se llama PRE (elemento de respuesta Polycomb) . Se puede definir en términos de su funcionamiento por su propiedad de mantener la represión en su vedndad dtuante el de sarrollo. El análisis de un PRE consiste en insertarlo cerca de un gen reportero con trotado por un potendador que está reprimido en las primeras etapas del desarrollo y después determinar si el reponero se expresa subsecuemememe en la descendencia. Un PRE eficaz evitará tal reexpresión. El PRE es una estructura compleja que mide -lO kb. Se han identificado dos proteínas, Pho y Pho 1, con actividad de unión al DNA en sitios dentro del PRE, pero puede haber otras. No obstante, cuando un locus es reprimido por Pc-G, las proteínas Pc-G ocupan una longitud mucho mayor del DNA que el PRE mismo. La Pe se encuentra localmente sobre unas cuantas kilo bases del DN A que rodea a una PRE. Esto hace pensar que el PRE puede ofrecer un centro de nucleación a partir del cual se propague un estado estrucmral dependiente de las proteínas

El represor se pierde pero la represión continúa

1

El represor se pierde y el gen se activa

1

Las proteínas Pc-G no inician la represión, pero se encargan de mantenerla.

Pc-G. Este modelo se sustenta en la observadón de efectos relacionados con el efecto de posición abigarrado (véase la Figura 31.4), esto es, un gen cerca de un locus cuya represión es mantenida por Pc-G puede desactivarse de manera hereditaria en algunas células, pero no en otras. En una circunstancia característica, los experimentos de enlace cruzado in vivo mostraron que la proteína Pc-G se encuentra sobre grandes regiones del complejo bithorax que están inactivas, pero se excluye la proteína de las regiones que contienen genes activos. La idea de que eso podría deberse a interacciones colaboradoras con un complejo multimérico es respaldada por la existencia de mutaciones en Pe que cambian su distribución nuclear y suprimen la posibi.lidad de que otros miembros de Pc-G se locaUcen en el núcleo. La función de las proteínas Pc-G en el mantenimiemo de la represión, en contraposición con su establecimiento, debe significar que la formación del complejo en PRE también depende del estado local de la expresión génica. Las propiedades de las proteínas individuales hacen pensar en un modelo de actuación para la unión de Pc-G a un PRE. En primer término, Pho y Phol se unen a secuendas específicas dentro del PRE. Se recluta Ese- E(z) a Pho/P.ho l ; después, se utiliza su actividad de tnetiltransferasa para metilar la 27Lis de la histona H3 . Esto crea un sitio de unión para PRC porque el cromodominio de Pe se une a Ja lisina metilada. El complejo Polycomb induce una estructura más compacta en la cromatina; cada complejo PRCl ocasiona que unos t.res nucleosomas se bagan menos accesibles.

31.11 Polycomb y Trithorax son represores y activadores antagonistas

825

De hecho, el cromodominio se identificó primero como región de homología entre Pe y Ja proteína HPl encontrada en la heterocromatina. La unión del cromodominio de Pe a 27 Lis en H3 es análoga al uso de HPl de su cromodominio para unirse a 9 Lis. El abigarramiento se debe a la dispersión de la inactividad desde la heterocromatina constitutiva y. en consecuencia, es posible que el cromodomin\o sea usado por Pe y HPl en una forma similar para inducir la formación de estructuras heterocromáúcas o inactivas (véase la sección 30.1 3, Algunos segmemos comunes se encuentran en proteínas que modifican la cromatina). Este modelo indica que se usan mecanismos similares para reprimir loci indi viduales o crear heterocromatina. El grupo trithorax de proteínas (trxG) tiene el efecto contrario al de las proteÚlas Pc-G: actúa para mantener los genes en estado actívo. Pu ede haber algunas semejanzas en las acciones de los dos grupos de proteínas · las mutaciones en algunos loci impiden el funcionamiento de Pc-G y rrx, lo que permite suponer que tal vez dependan de componentes comunes. El factor GAGA que es codificado por el gen similar a Irirhora.x tiene sirios de unión en PRE. De hecho. los sitios donde se unen las Pc-G al DNA coinciden con los sitios donde se une el factor GAGA. ¿Qué significa esto? Tal vez se requiera GAGA para que los factores de activadón. incluidos los miembros de trxG, se unan al DNA. ¿Se necesita también para que las proteínas Pc-G se unan y ejerzan represión? Todavía no se ha aclarado esto, pero tal modelo exigiría que. además de GAGA. algo más determinara cuál de los tipos alternativos de complejo se ensambla después al sitio.

Los cromosomas X experimentan cambios globales Concepto~ princip¡¡te,~

• Uno de los dos cromosomas X se desactiva al azar en cada célula durante la embriogénesis en mamíferos euterios. • En casos excepcionales donde hay más de dos cromosomas X. todos. excepto uno, están desactivados. • El Xic (centro de desactivación de X) es una región de actuación en configuración ds en el cromosoma X, necesaria y suficiente para aseguraf que sólo un cromosoma X permanezca activo. • El Xic incluye al gen Xist que codifica un RNA que se encuentra sólo en cromosomas Xinactivos. • Se desconoce el mecanismo encargado de prevenir que el RNA Xist se acumule en el cromosoma activo.

826

CAPÍTULO 31 Los efectos epigenéticos son heredados

Mamíferos Desactiva un X femenino

Moscas Doble expresiónde X masculino

Gusanos La mitad de la expresión dedos X femeninos

X X

X y

Se usan medios diferentes de compensación de dosis para hacer equivalente la expresión del cromosoma X en machos y hembras. El sexo planrea un problema interesante para la regulación génica debido a la variación en el número de cromosomas X. Si se expresara¡1los genes ligados a X de manera equitativa en cada sexo. las hembras tendrían el doble de cada productO que los machos. La imponanda de evitar esta siruación la demuestra la presenc1a de una compens ación de dosis. que equilibra el grado de expre~ión de los genes ligados a X en los dos sexos. Los mecanismos usados en diferentes especies se resumen en la • En los mamíferos, uno de los dos cromosomas X femeninos se desactiva por completo. El resultado es que las mujeres tienen sólo un cromosoma X activo. circunstancia que es igual a la observada en los machos. El cromosoma X activo de las hembras y el cromosoma X único de los machos se expresan en el mismo grado. • En el género Drosophíla, la expresión del cromosoma X masculino único se duplica con relación a la expresión de cada cromo soma X femenino. • En el Camorhabdiris e/egans, la expresión de cada cromosoma X femenino es de la mitad con relación a la expresión del cromosoma X masculino único. La característica común de todos esws mecanismos de compensación de dosis es que el cromosoma entero es dia11a de la regulación. Ocurre un cambio global que afecta de manera cuantitativa a LOdos los promotOres en el cromosoma. Se sabe mucho acerca de la desactivación del cromosoma X en hembras de mamíferos. donde rodo el cromosoma se torna heterocromático. Las propiedades dobles de la heterocromatina son su estado condensado y la inactividad vinculada. Se pueden dividir en dos tipos. • La h eterocroma tina constitutiva con tiene secuencias específicas sin función de codificación, que en general incluyen DNA satélite y a menudo se encuentran en los

cenuómeros. Estas regiones son invariablemente hetcrocromáticas por su naturaleza intrínseca. • La heterocromatina facultati va adopt:a la forma de cromosomas íntegros que son inactivos en un ünaje celular aunque se pueden expresar en otros. El ejempllo por excelencia es el del cromosoma X de rnanúferos. El C(Ornosoma X inactivo se perpetúa en un estado heterocromálico, en tanto el cromosoma X activo es parte de la eucromatina. Por tanto, parcicipan secuerzcias de DNA idénticas en ambos estados. Una vez que .se ha establecido el estado de inactividad, l.o heredan las céltllas descendientes. Éste es un ejemplo de herencLa epi genética, porque no depende de la secuencia del DNA. La manera básica de ver los crornosomas X de la hembra del mamífero proviene de la hipótesis del X único planteada en 1961 . Los ratones hembra heterocigotos para las mutaciones en el color de la piel ligadas al cromosoma X tienen un fenotipo abigarrado, donde algunas áreas son de tipo silvestre pero otras son productO de mutación . La mueslra que esto puede explícarse si' se desactiva

Ambos cromosomas X son activos en la célula precursora Color de cubierta de tipo silvestre Color de cubierta de tipo mutado

1

e= :::::::o:>

Un cromosoma X \ desactivado en cada ce lula alelo activo~

-

- alelo activo

uno de Los dos cromosomas X al azar en cada eNu la de una

Se produce abigarramiento ligado a X por la desactivación aleatoria de un cromosoma X en cada célula precursora. las células donde el alelo+ se encuentra en el cromosoma activo tienen un fenotipo silvestre; Las células donde el alelo - está en el cromosoma activo presentan el fenotipo mutan te.

peqHei1a población de precursores. Las células donde se desactiva el cromosoma X portador del gen de tipo silvestre dan origen a una progerúe que eKpresa sólo el alelo murante en el cromosoma activo. Las células derivadas de un precursor donde se desactivó el otro cromosoma tienen un gen silvestre de tipc1 activo. En el caso del color de la piel, las células derivadas de un precursor particular se mantienen juntas en un parche del m ismo color, que crea el panón de abigarramiento visible. En ouos casos, cada una de las células en una población expresará uno u otro de los aleJos ligados al cromosoma X; por ejemplo, en h eterocigotos para ellocus G6PD ligado a X, cualquier eritrocito panicular expresa sólo una de l.as dos formas alélicas. (Ocurre desactivación aleatoria de un cromosoma X en mamíferos eute1ios. En los marsupiales, la selecdón es dirigida: siempre el cromosoma X heredado del padre es el que se desactiva.) La desactivación del cromosoma X en hembras se rige por la regla n-1: no obstante, h
Un solo locus en el cromosoma X es suficiente para su desactivación . Cuando ocurre una translocaci ón entre el cromosoma X y un autosoma, ese !ocus está presente en sólo uno de los productos recíprocos y es el único que puede desactivarse. Cuando se comparan diferentes translocadones es posible ubicar este locus denominado Xic (centro de desactivación de X). Una región clonada de 450 kb contiene todas las propiedades del Xíc. Cuando esta secuencia se inserta como uansgén en un autosoma, éste se ve sujeto a desactivación (en un sistema de cultivo celular). El Xic es un locus que actúa en configw·adón cis y contiene la inlon:nación necesaria para contar los cromosomas X y desactivar todas sus copias excepto una. La desactivación procede desde Xic por todo el cromosoma X. Cuando Xic está presenLe en una translocación cromosoma X-autosoma, la desactivación se extiende a las regiones auwsómicas (aunque el efecto no siempre es completO). Ellocus Xíc contiene un gen llamado Xist que se expresa sólo en el cromosoma X inactivo. La conducta de ese gen es en efecto la opuesta a la de todos los demás loci en el cromosoma, que están apagados. La deleción de Xist impide que se desactive un cromosoma X. Sin embargo, no interfiere con el mecanismo de recuemo (porque o tros cromosomas X 3 ~. :.-

Los cromosomas Xexperimentan cambios globales

82-

Ambos cromosomas X expresan Xist: el ANA es inestable

<=:;::::)

e= :----)

El ANA se estabiliza y cubre a un cromosoma

El X activo cesa la slntesis de Xist de ANA X activo X inactivo (

(

:::=J

Las condensinas producen la condensación de los cromosomas

¡f

La desactivación de X comprende la estabilización del RNA de Xist, que cubre al cromosoma inactivo.

pueden desactivarse). De este modo, se pueden distinguir dos características de Xic: uno o varios elementos no identificados necesarios para el recuento y un gen Xist requerido para la desactivadón. En la se üusua la fundón del RNA y el gen Xist en la desactivación del cromosoma X. El gen Xist codifica un RNA que carece de un marco de lectura abieno. El RNA Xist Hcubre" al cromosoma X a partir del cual fue sintetizado, lo que permite suponer que tiene una actividad estructural. Antes de la desactivación de X, es sintetizado por ambos cromosomas X femeninos. Después de la desactivación, el RNA se encuentra sólo en el cromosoma X inactivo. La tasa de transcripción se mantiene igual antes y después de la desactivación, por lo que la transición depende de los episodios que riencn lugar después de la transcripción. Antes de la desacrivadón de X. el RNA Xist decae con una vida media de casi 2 h. La desactivación de X es mediada por la estabilización del RNA Xist sobre el cromosoma X inactivo. El RNA Xist muestra una distribución puntiforme a lo largo del cromosoma X, lo que permite suponer que el medio de estabilización puede ser el vínculo con proteínas que forman estructuras particulares. No se sabe aún si oLros [actores pueden participar en esta reacción y cómo el RNA Xist se limita a la dispersión en configuración cis por el cromosoma. las características especiales del cromosoma X inactivo, que incluyen una fa lta de acetilación de una histona H4 y metiladón de las secuencias CpG (véase la sección 24.19, Los islotes CpG son dianas reguladoras), al parecer 828

surgen más tarde como parte del mecanismo de desactivación. La regla n-1 sugiere que la estabilización del RNA Xist está "predeterminadaH y que algún mecanismo de bloqueo impide la estabilización en un cromosoma X (que será el X activo). Esto significa que, si bien Xic es necesario y suficiente para desactivar un cromosoma, los productos de otros locí pueden ser necesarios para el establecimiento de un cromosoma X activo. El silenciamiento de la expresión de Xist es indispensable para el X activo. la deleción del gen de la metiltransferasa del DNA impjde el silendamientO de Xíst, tal vez porque es necesaria la metiladón en el promotor Xist para q ue cese la transcripción.

CAPÍTULO 31 Los efectos epigenéticos son heredados

Conr.cptos pdncipale5

• •

• •

Las proteínas SMC son fosfatasas del trifosfato de adenosina, que incluyen condensinas y cohesinas. Un heterodlmero de las proteínas SMC se vincula con otras subunidades. Las condensinas hacen que la cromatina se enrolle en forma más estrecha por la introducción de superhélices positivas al DNA. Las condensinas se encargan de condensar los cromosomas en la mitosis. las condensinas especificas de cromosomas se encargan de condensar cromosomas X i nactivos en C. elegans.

Las estructuras de cromosomas enteros reciben la influ encia de las interacciones con proteínas de la fa milia de SMC (d e man tenimiento estructura l d e cro mosomas) . Hay fosfatasas del nHosfato de adenosln a que entran en dos grupos fu ncionales. Las conden sinas participan en el control de la estructura global y se encargan de condensar cromosomas compactos durante la mitOsis. Las co hesinas participan en las conexiones entre cromátides hermanas que deben liberarse en la mitosis. Ambas constan de dímeros formados por proteínas SMC. Las condensinas forman complejos que tienen un meollo del heterodimero SMC2-SMC4 vinculado con otras proteínas (no SMC). las cohesinas tienen una organización similar basada en el meollo heterodimérico de SMC1-SMC3 . En la se muestra que una proteína SMC tiene una estructura enrollada en el centro, que es interrumpida por una región de bisagra nexible. Tanto Jos exuemos amíno como carboxUo tienen segmentos de unión a ATP y DNA. Se han

Las superhélíces interactúan

Extremo N

Sitio de unión de ATP y DNA

_, rATP

...._, \

Las regiones terminales se unen ?l,DN--6

A;{ÁrP

,..--

ATP

Sitio de unión de ATP y DNA

Las proteínas SMC forman dímeros gracias a interacciones antiparalelas entre las superhélices centrales. Am bas regiones terminales de cada subunidad tienen segmentos de unión de ATP y DNA. Las cohesinas pueden formar una estructura extendida que permite a dos moléculas diferentes de ONA enlazarse.

--- --{C,.p .....___.., l

Extremo C

Una proteína SMP tiene un "módulo Walker" con un segmento de unión a ATP y uno de unión a ONA en sus extremos, que se conectan por medio de superhélice~s enlazadas por una región de bisagra.

Condensina

,;,:-p

( 1

ATP

~TP

ATP

~r7

Cohesina

Las dos mitades de una condens ína se pliegan hacia atrás en un ángulo de 6°. Las cohesinas tienen una conformación más abierta, con un ángulo de 86° entre las dos mitades.

Las condensinas pueden formar una estructura compacta si se doblan en la bisagra, lo que hace que el ONA se torne compacto.

propuesto diferentes modelos para las acciones de estas proteínas, dependiendo de que se dimerizen por interacdones intra o interrnoleculare:s. Los experimentos con homólogas bacterianas de las proteínas SMC hacen pensar que se forma un dímero por una interacción antiparalela entre las superhélices, de manera que el extremo N de una subunidad se enlaza con el extremo C de .la otra. Es posible que la existencia de una región de bisagra flexible permita a cohesinas y condensin.as depender de un modo diferente de acción del dímero. En la se muestra que las cohesinas tienen una estructura en V con los brazos separados en un ángulo de 86°, en tanto las condensinas tienen una flexión posterior más aguda, con sólo 6° entre los brazos. Esto permite a las cohesinas mantener las cromátides hermanas juntas, en tanto las

condensinas, por otro lado, condensan un cromosoma inctividual. La muestra que una cohesina puede adquirir la forma de un dímero extendido con enlace cruzado de dos moléculas de DNA. La muestra que una condensina podría adoptar la forma de un dímero en V (en esencia, flexionado en la bisagra), que hace tracción sobre sitios distantes en la misma molécula de DNA uniéndolos y condensándola. Los experimentos hacen pensar en un modelo alternaüvo donde las proteínas de levaduras forman dímeros por las interacciones intramoleculares. Esto es, se forma un homodímero sólo por la interacción entre dos subuoidades idénticas. Los centros de dos proteínas diferentes (en este caso, SMC l y SMC3) pueden entonces interactuar en sus regiones cefálica y de bisagra para formar una estructura circular

31.6 Las condensinas producen la condensación de los crom osomas

829

Las cohesinas pueden fo rmar dímeros por medio de conexiones intramoleculares y después mult ímeros, que se conectan en las cabezas y la bisagra. Es posible que tal estructura mantenga dos moléculas de DNA juntas al rodearlas.

Las condensinas se localizan a rodo lo largo de un cromosoma mitótico. El DNA es rojo; las condensinas, amarillas. Fotografía por cortesía de Ana Losada y Tatsuya Hirano. como la que se muestra en la . En lugar de unirse de manera directa al DNA, una estructura de ese tipo podría mantener juntas sus moléculas al rodearlas. La visualización de los cromosomas miróticos muestra que las condensinas se localizan a todo lo largo del cromosoma, como puede observarse en la . (Por el conuario, las cohesinas se encuentran en localizaciones bien definidas.) El complejo condensina recibió ese nombre por su capacidad de hacer que la cromatina se condensase in vitro. Tiene la capacidad de introducir superhélices positivas en el DNA en una acción que aprovecha la hidrólisis de ATP y depende de la presencia de la

830

CAPÍTULO 31 los efectos epigenéticos son heredados

topoisomerasa T. Esta capacidad es conuolada por la fosforilación de las subunidades no SMC que tiene lugar en la mitosis. No se sabe aún de qué manera se relaciona esto con otras modificaciones de la cromatina, por ejemplo, la fosforilación de histonas. La activación del complejo de condensina de manera espeófica en la mitosis hace dudar de que también participe en la formación de la heterocromalina de inrerfase. Ocurren cambios globales en otros tipos de compensación de dosis. En el género Drosophi/a se encuentra un complejo de proteínas en los mad1os, donde se localiza en el cromosoma X. En C. elegans, un complejo proteínico se vincula con ambos cromosomas X en embriones XX, pero los componentes proteínicos se mamienen con distribución difusa en los núcleos de embriones XO. El complejo proteínico contiene un meollo de SMC y es similar a los complejos de condensina que se vinculan con cromosomas mitóticos en otras especies. Esto permite suponer que tiene una fu nción estructural que hace que el cromosoma adquiera una forma más condensada, inac1 iva. Pueden necesitarse múltiples sitios en el cromosoma X para que el complejo se distribuya por complew. El complejo se une a esos sitios y después se dispersa por todo el cromosoma para cubrirlo de manera más amplia. Los cambios que afenan a todos los genes en un cromosoma, ya sea de manera negativa (mamíferos y C. elegam). o positiva (género Drosophila) son, por tanto, una característica común de la compensación de dosis. No obstante, los componentes del aparato de compensación de dosis pueden variar, así como los medios por los que se localizan en el cromosoma y. por supuesto, ese mecanismo de acción es diferente en cada caso.

Una metilasa de mantenimiento perpetúa la metilación del DNA Conceptos pri ncipates • Casi todos los grupos metilo del DNA se encuentran en las citosinas de ambas cadenas del par CpG. La replicación convierte un sitio por completo metilado en uno hemimetilado. Una metilasa de mantenimiento convierte los sitios hemimetilados en metilados por completo. Ocurre metilación del DNA en sitios específicos. En las bacterias se vincula con la identificación del sistema de metilación de restricción bacreriana utilizado para la defensa de los fagos y rambién para distinguir el DNA replicado del no replicado (véase

Sitios metilados por completo

Metilasa nueva

~ Replicación Sitios hemimelilados 1


Metilasa de perpetuación

+

Desmetilasa

~ Metilación lllú

e;} GC

El estado de metilación es regulado por tres tipos de enzimas. Se conocen metilasas nuevas y de perpetuación, pero no se han identificado desmetilasas.

~ Replicación -

Sitto no metilado

"' ....CG. ~-

..Cji

GC

GC

+ Sitios hemimetllados

e~

'Gc

Cji: GC

El estado de los sitios metilados podña perpetuarse gracias a la acción de una enzima que reconoce sólo sitios hemimetilados como sustratos.

la sección 20.7, Control de la dirección de la reparación de apareamientos erróneos). En las eucariotas, su principal función conocida t iene relación con el control de la transcripción; la metilación se vincula con la desactivación géoica (véase la secdón 24.18, La expresión génica se vincula con la desmerilación ). De 2 a 7% de las citosinas del DNA de las células animales están metiladas (la cifra varía de acuerdo con la especie). La mayor parte de los grupos metilo se encuentra en "pares" CG y, de hecho, la mayor parte de las secuencias CG está metilada. Por lo ge neral, los segmentos C de ambas cadenas de esta secuencia palindrómica cona están metilados, lo qu e da lugar a la estructura. Dicho sitio se describe como metilado por completo. Considérense, no obstante, las conse-

cuendas de la replicación de este sitio . En la se muestra que cada par hijo tiene una cadena metilada y una no mediada . Dicho sitio se denomina hemimetilado. La perpetuación del sitio metilado depende de lo que pase con el DNA hemimetilado. Si ocu rre metilación de una cadena no metilada, se restablece la condición de metilación completa del sitio. Sin embargo, si la replicación ocurre antes, se perpetuará el estado hemimetilado en un par de cadenas hijas, pero el sitio no estará metilado en el otro par de cadenas hijas. En la se muestra que el estado de metilación del DNA es controlado por metilasas, que agregan grupos metilo a la posición 5 de la cilosina, y desmetilasa s, que retiran los grupos metilo (para describir estas enzimas de manera más f01mal se les denomina metiltransferasas). Hay dos tipos de metilasa del DNA cuyas acciones se clistinguen por el estado de metilación del ácido. Para modificar el DNA en una nueva posición se requiere la acción de una metilasa nueva, que reconoce al DNA por virtud de una secuencia específica y actüa sólo en el no metilado para agregar un grupo metilo a una cadena. Hay dos metHasas nuevas (Dnmt3a y Dnmt3B) en el ratón; tienen diferentes sitios diana y ambas son indispensables para el desarrollo. Una m etilasa de mantemmiento actúa constitutivamente sólo en sitios hemimetilados, para con ver-

3 •. 7 Una metilasa de mantenimiento perpetúa ta metilación del DNA

831

tirios en me1ilados completos. Su existenda indica que cualquier sitio metilado se perpetúa después de la replicación. Hay una metilasa de mante-nimiento (Dnrm 1) en el rarón y es indispensable: los embriones de ratón donde se ha alterado un gen no sobreviven después de la embriogénesis temprana. La metilación de mantenimiento es casi 100% eficaz, lo que asegura que la situación demostrada a la izquierda de la Figura 31.19 prevalece in vivo. El resultado es que sí ocurre la metilación nueva en un alelo pero no en el otro, esa diferenda se perpetuará a través de las siguientes divisiones celulares, con lo que se mantiene una diferencia entre los alelos que no depende de sus secuencias. La metilación tiene varios tipos de dianas. los promotores génicos son la diana mas frecuente. Los promotores son metilados cuando e l. gen está inactivo, pero no merilados cuando está ;activo, La ausencia de Druntl en el ratón causa una clesmetilación amplia en los promotores y se asume que es letal por la expresión génica sin control. El DNíA satélite es otra diana. las mutaciones en Dnmt3 impiden la metilación del DNA satélite, lo que causa inestabilidad en el cemrómero dentro del ámbito celular. Las mutaciones en el gen humano correspond~eme causan una enfermedad llamada ICF (i.nmunodefidencia/inestabilidad del cenrrómero, anomalías faciales). La importancia de la metilación se recalca en otra enfermedad humana, el síndrome de Rhett. causado por la mutación del gen para la proreínaMeCP2 que se une a secuencias CpG metiladas. Las mctilasas son enzimas convencionales que actúan sobre un DNA diana. Sin embargo, ¡puede haber también un sistema de metilación que utiliza una secuencia corta de RN A para hacer diana en una secuencia correspondiente de DNA para la rnetilación (véase la sección 13.6, Se puede usar RNA no codificante para desactivar la expresión génica). Nada se sabe del mecan ismo de operadón de este sistema. ¿Cómo se establecen y mantienen las regiones desmetiladas? Si tm sitio del DNA no se ha metílado, es posible que una proteína que reconoce la secuencia no merilada la proteja contra la metilación. Una vez que se ha metilado un sitio, hay dos posibles formas de generar sitios desmetilados. Una es bloquear la actuación de la metilasa die mante nimiento sobre el sitio cuando éste se replica. Después de un segundo ciclo de replicación uno de los pares de cadenas hijas esrará no metilado (corno se muestra en el lado derecho de la Figura 31.19). El otro es desmetilar de manera activa el sitio, como , ya sea por retiro dise muestra en la recto del grupo metilo de la cirosina o po.r escisión de la citosina o citidina metiladas del DNA para su sustitución por un sistema de reparación. Se sabe que puede ocurrir desmetilación acriva en el geno832

CAPÍTULO 31 Los efectos epigenéticos son heredados

3'

5'

~~~

Rellro del grupo metilo 5'

3'

Retiro de la base 5-Me·C 5'

Ret.iro del nucleótido 5' t

3'

Es posible que el DNA se desmetile si se retira el grupo metilo, la base o el nudeótido. El retiro de la base o el nucteótido requeriría su reposición por un sistema de reparación.

ma paterno poco después de la fecundadón, pero no se conoce el mecanismo usado. Una posibilidad interesante es que participase la AID desaminasa de hisridina; puede desaminar fragmentos C-metilados y crear un apareamiento erróneo de bases que un sistema de reparación pudiese entonces corregir a un par C-G esrándar (no melilado).

La metilación del DNA se encarga de la impresión Concepto principal • Los alelos paternos y maternos pueden tener diferentes patrones de metilación en la fecundación. • La metilación suele vincularse con la desactivación del gen. • Cuando los genes tienen impresión diferencial. la supervivencia de los embriones puede requerir que el alelo funcional sea provisto por el progenitor con el alelo no metilado. • La supervivencia de heterocígotos para genes impresos es diferente, de acuerdo con la dirección del cruce. • Los genes impresos se presentan en grupos y pueden depender de un sitio de control local, donde ocurre metilación nueva, a menos que se evite de manera específica.

El patrón de metilación de las célu las germinativas se establece para cada sexo durante la gamewgénesis mediante un proceso de dos etapas: primero el patrón existeme es borrado por una desmetila.ción de todo el gcnoma, y luego se impone el patrón específico de cada sexo. Todas las diferendas de a lelos se pierden cuando las células germinales primordiaJes avanzan durame el desarrollo del embrión; sin importar el sexo, los parrones anteriores de metilación se borran y un gen característico e!> entonces no metilado. En los machos el patrón se presenta en dos etapas. La vía de metilación caracreríslica de los espermatozoides maduros se establece en el espermatocito, pero se hacen otros cambios en ese patrón después de la fecundación. En las hembras, el patrón materno se impone durante la oogénesis cuando los oocü os maduran a través de la meiosis después del nacimiento. Como es de esperarse por la inactividad de los genes en los gametos, su estado habitual es r:netilado. Sin embargo, hay casos de dHerencias entre los dos sexos en los que un locus está no metiilado en un sexo. Una pregunta importante es, ¿cómo se determina la especificidad de metilación en los gametos masculino y femenino? Ocurren cambios sistemáticos en la embriog;énesis temprana. Algunos sitios continuarán metilados, en ramo otros serán de manera específica no metílados en las células donde se expresa un gen. Por el patrón de cambios se puede inferir que cada uno de los episodios de meülación específica de secuenda tiene lugar durante el desarrollo somático del organismo, a medida que se activan genes paniculares. El patrón específico de los grupos metilo en células germinativas se encarga del fenómeno de la impresión, que describe una diferencia de conducta entre los a lelos heredados de cada padr,e. La expresión de ciertos genes en embriones de ratón depende del sexo del progenitor del que se hei·edaron. Por ejemplo, el alelo que codifica JGL-Il (factor JI de crecimiento similar a insulina) que se hereda del padre se expresa, pero el heredado deJa madre no se expresa. El gen del lGF-ll de los oocitos está metilado pero el gen fGF-0: de espermatozoides no Jo está, de manera que los dos alelos tienen conducta diferente en el cigoto. Éste es el patt:ón más frecuente, pero la dependencia del sexo se revierte en algunos genes. De hecho, se muestra el parrón contrario (expresión de la copia materna) para IGFlJR, el receptor de 1GF-IT. Este modo de ber:encia específico del sexo requiere que se establezca el parrón de metilación de manera específica durante cada gamerogénesiis. El destino ele un locus hipotético en un ratón se ilustra en la . En el embrión temprano, el

alelo paterno no está metilado y sí expresado, y el alelo materno está metilado y es silente. ¿Qué sucede cuando ese ratón forma sus gametos? Si es un macho, el alelo aportado al espermatozoide deberá ser no metilado, sin importar si al principio lo estaba o no. As(. cuando un alelo materno se encuentra en un espermatozoide, deb~ ser desmetilado. Si el ratón es una hembra, el alelo con que contribuye al oocito debe ~er metilado; si en un principio era el alelo paterno, deberán agregarse grupos metilo. La consecuencia de la impresión es que un embrión requiere un alelo paterno para este gen. Así, en el caso de una cruza heterocigota donde el alelo de un progenitor tiene una mutación de desactivación, el embrión sobrevivirá si el alelo de tipo silvestre proviene del padre, pero mo1irá si proviene de la madre. Esre tipo de dependencia en la direccíonalidad de la cruza (al contrarjo de la genética mendeliana) es un ejemplo de herencia epfgenéti ca, donde algún factor diferente a las secuencias de sus genes mismos influye en sus efectos (véase la sección 31.10, los efectos epigenéticos pueden heredarse). Si bien los aletos paterno y materno tienen secuencias idénticas, muestran diferentes propiedades, dependiendo de qué progenitor los aportó. Estas propiedades se heredan a través de la meíosis y en las mitosis somálicas posteriores.

fmt.JnOI' Grupos metilo

1 INACTlVO

'

Alelo materno

Alelo paterno

Gametos de

1~ siguient"' tJenemoi6n

Las hembras aportan Los machos aportan oocitos espermatozoides

o bien

El patrón característico de la impresión es que un locus metitado sea inactivo. Si se trata del alelo materno, sólo eL alelo paterno estará activo y será esencial para la viabilidad. El patrón de metilación se reajusta cuando se forman los gametos, de manera que todos los espermatozoides tienen un tipo paterno y todos los oocitos tienen un tipo materno. 31.8 La metilación del DNA se encarga de la impresión

833

Los genes impresos a veces se agrupan. Más de la mitad de los 17 genes impresos conoddos en el rarón están contenidos en dos regiones particulares, cada una con genes de expresión materna y paterna. Esto hace pensar en la posibilidad de que los mecanismos de impresión funcionen por largas distancias. Se puede entender en pane esa posibilidad por las deleciones en la población humana que causan las enfennedades de Prader-Willi y Angelman. Casi todos los casos se deben a la misma deleción de 4 Mb, pero los síndromes son diferentes dependiendo de qué progenitOr conrribuyó con la deleción. El motivo es que la región con deleción contiene al menos un gen impreso por el padre y al menos uno impreso por la madre. Sin embargo, hay algunos casos excepcionales con deledones mucho más pequeñas. Se puede causar el síndrome de PraderWilli por una deleción de 20 kb que silencia genes distanres a ambos lados. 'El efeao básico de la deleción es impedir que un padre restablezca el modo paterno a un cromosoma heredado por la madre. El resultado es que los genes se mantienen en modo materno, de manera que los aletos paternos, asf como los maternos, son silentes en la descendencia. Se encuentra el efeclo inverso en aJgunas pequeñas deleciones que causan el síndrome de Angelman. La deducción es que esa región comprende algún tipo de "centro de impresión" que anúa a cierra distancia para cambiar de un tipo de progenitor al otro. La metilación también se encarga de efecros epigenéticos que regulan la expresión de genes de RNAr. El fenómeno de d omina ncia nucle olar describe la transcripción de sólo un conjunto de genes del RNAr de los progenitores, resultado de la metilación de citosinas en los promotores de los genes heredados de un progenitor y no del otro.

Un solo centro puede controlar los genes con impresión opuesta Cone>~pto~

principales

Los genes impresos son controlados por la metilación de los sitios de acción en configuración cis. La metilación puede encargarse de desactivar o activar un gen.

La impresión está determinada por el estado de me tilación del sitio de acción en configuración cis cerca de un gen diana o varios. Esros sitios reguladores se conocen como dominios con metilación diferencial (DMD) o regiones de comrol de la impresión (lCR). 834

CAPÍTULO 31 Los efectos epígenéticos son heredados

ICR

H19 Potenciador

Alelo paterno

INACTIVO

ACTIVO

El ICR está metilado en el alelo paterno, donde Jgf2 es activo y H19 es inactivo. El ICR no está metilado en el alelo materno, donde lgf2 es inactivo y H19 es activo.

Alelo paterno

Alelo

materno

El CTCF se une al ICR sin melilación

lgf2 INACTIVO Se bloquea el potenciador

El ICR es un aislante que impide que un potenciador active a lgf2. El aislante actúa sólo cuando une GCF al ONA no metilado.

La deleción de esos sirios elimina la impresión y los loci diana actúan entonces igua l en los genomas materno y paterno. La conducta de una región que c.:onliene dos genes, Ig./2 y H/9, ilustra las formas en que la rn.etilación puede controlar la actividad génica. La muestra que estos dos genes reaccionan en forma optlesta al estado de metilación en el TCR localizado entre ellos. La ICR está metilada en el alelo paterno. El H /9 muestra la respuesta cal'acterística de desactivación. Sin embargo, nótese que el Tgf2 se expresa. La situación inversa se encuentra en el alelo materno, donde la ICR no está metilada. El Hl9 se expresa entonces, pero el Tgf2 está desactivado. El control de Igf2 lo ejerce una fundón aislanre de la ICR . La muesua que cuando la fCR no está metilada se une a la proteína CTCF, lo que crea una función de aislame que bloquea a un potenciador y le impide la activación del promotor de Jgf2. Éste es un efecto muy poco común, donde

la metilación activa de manera indirecta a un gen al hloquear a un aislante. La regulación de H19 muestra la dirección más habitual del controL donde la metilación crea un estado de impresión inactivo. Esto podría reflejar un efecto directo de la metilación sobre la actividad del promotor.

Los efectos epigenéticos pueden heredarse Concepto principal • Los efe ctos epigenéticos pueden derivarse de una modificación de un ácido nucleico después de que se ha sintetizado. o por la perpetuación de estructuras proteínicas.

La berencia epigenétíca describe la posibilidad de diferentes estados, que pueden tener diversas consecuencias fenotípicas, de heredarse sin ningún cambio en la secuencia del DNA. ¿Cómo puede ocu rrir esw? Los mecanismos epigenélicos se dividen en dos clases generales: • El DNA puede modificarse por la unión covalente de una molécu la que después es perpetuada. Dos aletos con la misma secuencia pueden tener diferentes estados de metilación. que les confieren propiedades diversas. • Puede eStablecerse un estado de proteína de autoperpetuación que tal vez comprenda el ensamblaje de un complej o proteínico, la modificación de una o varias proteú1as es pecíficas o d establecimiento de una conformación protemica alternativa. La metilación establece la herencia epigenética, en tanto la rnetllasa de mantenimiento actúe de manera constitutiva para restablecer el estado metílado después de cada ciclo de replicación, como se muestra en la Figura 31.19. Se puede perpetuar un estado de metilación por medio de una serie indefinida de mitosis somáticas, lo qu e tal vez sea Llna Situación "predeterminada". La metilación también puede perpetuarse a través de 1a meiosis: por ejemplo, en el hongo del género Ascobolus hay efectos epigenéticos que pueden transmitirse tanto por medio de mitosis como de meiosis, por mamenimiemo del estado de metilactón. En las células de los mamiferos se crean efectos epigenéticos porque la reestructuración del estado de metílación es diferen te en la meiosis de mad1os y hembras. Las situaciones donde los efectos epigenéücos parecen mantenerse mediante estados proteínicos se conocen menos bien en términos moleculares . El efecto de posición abigarrado muestra que la hete-

rocromatina constitutiva puede extenderse a una distancia variable y después se perpetúa a uavés de las divisiones somáticas. No hay metilación del DNA en el género Saccharomyces y una cantidad cada vez menor en el género Drosophila y, como resultado, es probable que la herencia de estados epigenéticos del efecto de posición abigarrado o el silencia miento telomérico en estos organismos se deban a la perpetuación de estrucwras proteínicas. En la se consideran dos posibilidades e;.,..rtremas para el destino de un complejo pro teínico en la replicación. • Un complejo podría perpetuarse a sí mismo si se escinde en forma simétrica, de manera que el complejo mitad se vincule con cada cadena doble bija. Si los complejos mitad tienen la capacidad de nuclear la formación de complejos totales. se restablecerá el estado original. Esto es básicamenre análogo al mantenimiento de la metilación. El problema con este modelo es que no hay motivo evidente por el que Jos complejos proteínicos actúen de esa manera . • Un complejo podría mantenerse como uni· dad y segregarse a una de las dos cadenas hijas dobles. El problema con este modelo es que requiere el ensamblaje de un nuevo complejo en el orro par nuevo de cadenas hijas y no es evidente por qué debería su ceder.

Autoperpetuación

Segregación

¿Qué sucede con los complejos proteínicos en la croma ti na durante la replicación? 31.1 O Los efectos epigenéticos pueden heredarse

83 5

Las colas de histonas se acetílan en la cromatina de los pmgenitores

------,

~~~~~k~k~k~~~~~~~~k~~~~~~~~M

.

,. .

Los meollos acetllados se distribuyen en forma aleatoria durante la replicación Ac;

~

AoAc Ac

Ac

Ae

Ac

AC Ac Ac Ac Ao Ac Ac Ar; Ac Art Ac Ac

M

AcAc

Ac

Ac

M

¿Qué se encarga de restablecer el estado acetilado?

AeAe AoAc Ao AcAcAc Ac AcAc AG AcAo AoAo~Ac AcAc AoAoAc Ac AcMAcAc

Los meollos acetilados se conservan y di!;tribuyen en forma aleatoria en las fibras de cromatina hijas durante la replicación. Cada fibra hija tiene una mezcla de meollos antiguos (acetilados) y nuevos (sin acetilar).

Considérese ahora la necesidad de perpetuar una estructura heterocromática constituida por complejos proteínicos. Supóngase que una proteína se distribuye más o menos de manera continua en una banda de heterocromarina, como se muestra en la Figura 31.4. Si se distribuyen subunidades individuales en forma aleatoria a cada cadena doble hija en la replicación, los dos constituyentes comi.nuarán marcados por la proteína, aunque su densidad disminuirá a la mitad de su concentración ames de la replicación. Si la proteína tien•e una propiedad de autoensamblaje que hace que las nuevas subunidades se asocien a ella, se restablecerá la situación original. En términos básicos, la existencia de efectos epigenéticos obliga a considerar que una proteína encargada de tal drcunstancia debe tener ailJÚ11 tipo de capacidad de automoldeado o aurormsamblaje. En algunos casos puede ser el estado de modificación de la proteína, más que la presencia de la proteína en sí lo que se encarga de un efecto epigenético. Hay una correlación general emr'e la actividad de la cromatina y el estado de metiJa,:::ión de las hisrona~, en particular H3 y H4, que ocurre en sus colas terminales N. La activación de la transcripción se vincula con la acerilación en la vecindad del promotor; y la represión de la transcripción se vincula con la desacetiJacióo (véase la sección 30. 7, Las ace836

CAPÍTULO 31 Los efectos epigenéticos son heredados

tilasas se vinculan con los activadores). La correlación más notoria es que el cromosoma X inactivo en células femeninas de mamífero está subacetilado en la histona H4. La inactividad de la heterocromati na constitutiva puede requerir que las histonas no se acetilen. Si una acetiltransferasa de histonas se apuntala en una región de heterocromatina telomérica en las levaduras, los genes silenciados se tornan activos. Cuando la levadura se expone a la tricostatina (un inhíbidor de la desacetilación) , la heterocromatina centro:rílérica ~e aceLila y los genes silenciados en regiones cenrroméricas pueden tornarse activos. El efecto puede persistir incluso después de que se ha retirado la cricostatina. De hecho. puede perpetuarse a través de mitosis y meiosis, lo que permite suponer que se ha creado un efecw epigenético al cambiar el estado de acelilación de las histonas. ¿Cómo podría perpetuarse el estado de acetilación? Supóngase que el tetrámero H3 2 -H4 2 se distribuye en forma aleatoria a dos cadenas hijas. Esto crea la situación que se muestra en la , donde cada par de cadenas hijas contiene algunos ocrámeros de histo· nas acetilados por complero en las colas H3 y H4, en tamo orras están por completo desacetiladas. Para contribuir a un efecto epigenético, debería suponerse que la presencia de algunos octámeros de histo· nas por completo acetilados ofrece una señal que hace que los octámeros no acetilados se acetilen. (La situación real es tal vez más complicada que la mostrada en la figura, porque ocurren acetilacio· nes transitorias durante la replicación. Si tan sólo se revienen después del depósiro de histonas en los nucleosomas, esto tal vez sea irre levante. Otra posibilidad es que se impida la desacetilación usual en lugar de, o además de, inducir la acerilación.)

Los priones de Las levaduras muestran herencia desusada Conceptos principales • La proteína Sup35 en su forma soluble de tipo silvestre es un factor de terminación de la traducción. • También puede existir en una forma alternativa de agregados oligoméricos, donde no es activa en la síntesis de proteínas. • La presencia de la forma oligomérica hace que la proteína recién sintetizada adquiera la estructura inactiva. • La conversión entre las dos fo rmas recibe La influencia de los chaperones. La fo rma de tipo silvestre tiene el estado genético recesivo psi- y la fo rma mutante tiene el estado genético dominante PSI·.

Estado (psr): ocurre la terminación Sup35 (psi)

Terminación

Estado (psr]: la proteína funciona de manera normal

~ Estado [PSI ]: todas las protelnas entran a un estado mutante Sup35

r Estado [PSI+]: sin terminación

Sup35 (psi]

= = =='-( El estado de la protefna Sup35 determina si ocurre term inación de la traducción.

Uno de los casos más claros de la dependencia de la herencia epigenética del estado de la proteína lo constituye la conducta de los priones, que se han descrito en dos circunstancias: por efectos genéticos en levaduras y como agentes causales de enfermedades neurológicas en mamíferos, incluidos los seres humanos. Un efecto epigenético notorio se encuentra en las levaduras, donde se pueden heredar dos estados diferentes que se ubican en un solo locus genético, si bien la secuencia del gen es la misma en ambos estados. Los dos estados diferentes son [psi·] y [PSI']. Ocurre un cambio de condición con baja frecuencia como resultado de la transición espontánea entre los estados. El genotipo [psi] se ubica en el locus Sup35, que codifica un factOr de terminadón de la traducción. Eo la se resumen los efectos de la proteína Sup35 en las levaduras. En las células de tipo silvestre, que se describen como [ps¡-], el gen está activo y la proteína Sup35 termina la síntesis de proteínas. En las células de tipo murante [PSJ+l el factor no funciona , lo que hace que la síntesis de proteínas no termine de manera apropiada. (Esto se detectó en un principio por los efectos letales de la mayor eficacia de los supresores de codones ocre en las cepas [PSI+].) Las cepas [PSr] tienen propiedades genéticas inusitadas. Cuando una cepa [psi·] se cruza con

la proteína Sup35 recién sintetizada cambia al estado [PSI•] por la presencia de una proteína preexistente [PSI'].

una [PSJ'"], toda la progenie resulta [PSJ+]. Éste es un patrón de herencia que se esperaría de un agente extracromosómico, pero el rasgo [PSJ+] no puede localizarse en ninguno de esos ácidos nucleicos. El rasgo [PSJ+) es metaestable, lo que significa que aunque es heredado por casi toda la progenie, se pierde a un ritmo alto, compatible con la mutación. Se muestra una conducta similar también en ellocus URE2, que codifica una proteína requerida para la represión de ciertas enzimas catabólicas mediadas por el rútrógeno. Cuando una cepa de levadura se conviene a un estado alternativo, llamado [URE3] , la proteína Ure2 ya no es funcional. El estado [PSJ+] está determinado por la conformación de la protema Sup35. En una célu la (psi-] de tipo silvestre, la protema muestra su función normal. En una célula [PSJ+], no obstante, la proteína está presente en una conformación alternativa, donde ha perdido su función normal. Para explicar el predominio unilateral de [Psr·] sobre [psi·] en cruzas genéticas, se debe suponer que la presencia de la proteína en escado [PSI+] hace que todas las proteínas en/a célula entren a ese estado. Esto requiere una interacción entre la proteína [PSJ+ ] y la proteína recién 31.11 Los priones de las levaduras muestran herencia desusada

83 7

sintetizada, lo que ta l vez refleja la generación de un estado oligomérico, donde la proteína [PSI"'] tiene una función de nucleación, como se ilusu·a en la Una característica común a las proteínas Sup35 y Urc2 es que cada una consta de dos dominios que actúan de manera independiente. El dominio terminal e es suficiente para la actividad de la proteína. El dominio terminal N es suficiente para la formación de las estructuras que hacen inactiva a la proteína. De este modo, la levadura donde el dominio termi nal N de Sup35 tiene deleción no puede adqui rir el estado [PSJ+) y la presencia de un dominio terminal N [PSJ+] es suficiente para mantener una proteín a Sup35 en el estado de [PSI+] . La característica crítica del dominio terminal N es que es rico en glULamina y asparagina . La pérdida de funció n en el estado [PSl+] se debe al secuestro de la proteína en un complejo oligomérico. La proteína Sup35 en las células (PSr} se agrupa en lod bien definidos, en tanto la proteína en las células [psi-] se difunde en el citosol. La proteína Sup35 de las células [Psr~] forma fibras arniloides i11 vitro, que tienen un característico comenjdo alto de estructuras en hoja p. Se sugiere la participación de la coniormación proteínica (más que su modificación covalente) por los efectOs de los traswrnos que afectan la estructura de las proteínas. Los rratamienros de desnaruralización causan pérdida del estado [PSr-]. En panicular, el chaperón Hspl04 participa en la herencia de

Proteina [psr)

Protelna

(PSI~]

Conversión In vltro

-+

Incorporación al liposoma

J

!

Fusión delliposoma con la levadura ¡ps;-¡

~

~

(!) ~ La levadura se mantiene [psr]

~

La levadura se torna [PS/') ~.,._

~ La proteína puriñcada puede convertir el esta· do [psi·] de las levaduras al [PSI']. 838

CAPÍTULO 31 Los efectos epigenéticos son heredados

[PSI''l Sus efectos so n paradójicos. La deleción de HSP/04 impide el mantenimiento del estado [PSr] y la sobreexpresión de Hsp 104 también causa pérdida del estado lPST•], lo que hace pensar que se requiere Hspl04 para algún cambio en la estructura de Sup35 necesario para adquüir el estado [Psr·¡. que deb~:: ser transitorio. Utilizando la capacidad de la Sup35 de formar la estructura inactiva in vicro, es posible ofrecer una pmeba bioquímica de la panicipación de la proteína. En la se ilustra un experimento notOrio, donde la proteína ~e convirtió a la forma inactiva in vitro, se colocó denrro de liposomas (donde, en efectO, la proteína es rodeada por una m~m­ brana artificial) y después se introdujo de manera directa a las células por fusión de Jos liposomas con [ps¡-] de levaduras. Las células de las levaduras se convirtieron a [PSI' ]. Ese experimen to relu ta todas las objeciones que surgiero.n a la conclusión de que la proteína tiene la capacidad de conferir el estado epigcnético. Los experimen tos donde se aparcan células o donde se LOman extractos de una para tratar a otra. siempre son susceptib les a la posibilidad de que se haya transferido un ácido nudeico. No obstante. cuando la proteína por sí misma no conviene células diana (aunque la proteína convertida al estado inactivo lo puede hacer), la única diferencia es el tratamiento de la proteína, que debe, por tanto. encargarse de la conversión . La capacidad de la levadura de formar el estado de prion [?Sr] depende de los antecedentes genéticos. La levadura debe ser [PJN.} para que se fom1e el estado [PSr]. El propio estado fPJN•] es un estado epigenét ico. Puede crearse por la formación de priones a partir de eualqu1era de dife1·emes proteínas. Esas proteínas comparten la característica de Sup35 de tener dominios ricos en Gln/Asn. La sob reexpresión de esos dominios en las levaduras estimula la fo rmación del estado [PSJ+l, lo que sugiere que hay un modelo común para la formación del estado de p rión, que involucra la agregación de lo~ dominios Gln/ Asn a La estructura amiloide de a utop ropagación . ¿Cómo influye la presencia de una proteína Glo/ Asn sobre la formación de prioncs por otra? Se sabe que la formación de los príones Sup35 es específica de la proteína Sup35, esto es. no ocurre por agregación cruzada de ou-as proteínas. Esto permite suponer que las células de levadura pueden contener proteínas ~olubles que amagonizan la formación de priones. Estas proteínas no son específicas de un prión. Como resultado, la introducción de cualquier dominio protefnico Gln/ Asn que interactúe con esas proteínas disminuirá la concentración. Esto permite que otras proteínas Gln/Asn se agreguen m.ás con más facilidad.

S!D

Los priones causan enfermedades en los mamíferos

Conceptos principales

-

La proteína que causa encefalopatía espongiforme ovina tiene dos formas de presentación: la PrPc no infecciosa de tipo silvestre susceptible a las proteasas, y la PrP 5' que causa enfermedad y es resistente a las proteasas. • La enfermedad neurológica puede transmitirse a los

ratones mediante la inyección de la proteína PrP5' purificada. El ratón receptor debe tener una copia del gen PrP que codifica la proteína murina. La proteína PrPSc puede autoperpetuarse al hacer que la proteína PrP, recién sintetizada, adopte la forma de Prpsc en lugar de la forma PrP'. Múltiples cepas de PrPSc pueden tener diferentes conformaciones proteínicas.

Se han encontrado enfermedades por prion.es en ovejas, seres humanos, y en fecha más reciente, en vaca.s. El fenotipo básico es una ataxia, trastor· no neurodegenerativo que se manifiesta por una imposibilidad de mantenerse erecto. El nombre de esta enfermedad en ovejas, encefalopatlía espongiforme ovina, refleja el fenotipo: el anjmal se talla contra las paredes para mantenerse erecto. La encefalomielitis ovina puede perpetuarse por la inoculación de ovejas con extractos histicos de animales infectados. la enfermedad kuru se encontró en Nueva Guinea, donde pareció perpetuarse por el canibalismo. en particular por la ingestión de cerebros. las enfermedades en poblaciones occidentales con un patrón de transmisión genéüca incluyen el síndrome de Gerstmann- Straussler y la enfermedad relacionada, de Creutzfeldt-Jakob (CJD )I, que ocurre en forma esporádica. En fecha más reciente, una enfermedad que simula CJD parece haber sido transmitida por el consumo de carne de vacas que sufre la enfermedad de "las vacas locas". Cuando el tejido de ovejas infectadas por esta encefalitis se inocula a ratones, aparece la enfermedad en un p eriodo que va de 75 a 150 días. El componente a.ctivo es una proteína resistente a las proteasas codi.ficada por un gen qu e normalmente se expresa en el cerebro. la forma de la proteína en el cerebro normal, llamada PrPc es sensible a las proteasas. Su conversión a la forma resistente, llamada PrP5<se vincula con la aparición de la enfermedad. La preparación infecciosa no tiene ácidos nucleicos detectabl!es, es

sensible a la irradiación UVa longitudes de onda que dañan a las proteínas y tiene una baja jnfecli· vidad (una unidad infecciosa/ 10 5 proteínas PrP~<), que corresponde a una herencia epigenética donde no hay cambio en la información genélica (porque las células normales y enfermas tienen la misma secuencia génlca PrP), pero la forma PrP5< de la proteína es el agente infeccioso {mientras que PrPc es inocua). La forma PrP5< tiene un alto contenido de hojas~, que forman una estructura fibrilar amiloide ausente en la forma PrPc. La base para la diferencia entre las formas PrPsc y PrPc parece radicar en un cambio de conformación, más que en alguna alteración covaleote. Am· bas proteínas están gl ucosiladas y unidas a la membrana por un enlace GPI. El análisis de la infectividad en ratones permite estudiar la dependencia de la ~ecuencia proteínica. la m t~estra los resul tados de algunos experimentos determinantes. En circunstan cias normales, la proteína PrP5< extraída de un ratón infectado induce la enfermedad (y a la larga, la muerte) cuando se inyecta a un ratón recepror. Si el gen PrP es "puesto fuera de combate", el rar.ón se hace resistente a la infección. Este experimento demuestra dos cosas. Primero, Ja proteína endógena es necesaria para una infección, al parecer porque provee la materia prima natural que se convierte en el agente infeccioso. Segundo, la causa de la enfermedad no es el retiro de la fo rma PrPc de la proteína. porque un ratón sin hPc sobrevive de manera normal; la enfermedad es causada por una

Una proteína Prp 5< puede infectar sólo a un animal que tiene et mismo tipo de proteína PrPc endógena. 3~.12

Los priones causan enfermedades en los mamíferos

839

ganancia de !unción en PrP5' . Si e l gen PrP se altera para impedir que ocurra el enlace GPl. los ratones infectados por PrP5' no padecen la enfermedad, lo que hace pensar que la ganancia de función implica una función de señal alterada para la que se requiere el enlace GPI. La existenda de barreras de espede permite construir proteinas h.J1)lidas para definir las características requeridas para la infectividad. las preparadones originales de la encefalopaúa espongiforme ovina fueron perpetuadas en varios tipos de animales. pero no siempre se pueden transferir con facilidad. Por ejemplo, los rawnes son resistemes a la infección por priones de cricero, lo que significa que PrP5< de cdceto no puede convenir la PrPc de ra rón en PrP5<. La situación cambia, no obstanLe, sl el gen de ratón PrP es sustituido por un gen PrPde criceto (esto puede hacerse mediame la introducción de un gen PrP de criceto al ratón con PrPpuesw fuera de. combate) . Un ratón con un gen PrP de cdceto es sensible a la infección por un PrP5' de criceto. Esto permite suponer que la conversión de la proteína PrPc celular a l estado Se requiere que las proteínas PrP5< y PrPc tengan secuencias apareadas. Hay diferentes "cepas de PrP5<" que se distinguen por periodos de incubación característicos después de su inoculación a ratones. Esto implica que la proreína no se restringe tan sólo a estados alternarivos de PrP' y PrP5 <, sino más bien que puede haber múltiples estados de Se. Estas diferencias deben de depender de alguna propiedad de autopropagación de la proteína más que de su secuencia. Si la conformación es la característica que distingue a Prp$' de PrP'. debe haber múltiples confonnaciones, cada una con una propiedad de automoldeado cuando convierte PrPc. La probabilidad de conversión de PrPc. a p¡psc se afecta por la secuencia de PrP. El síndrome de Gerstmann-Straussler en seres humanos es causado por un cambio de un solo aminoácido en PrP, que se hereda como rasgo dominante. Sj se hace el mismo cambio en el gen PrP del ratón, el animal presenta la enfermedad. Es ro sugiere que la proteína m utante riene una mayor probabilidad de conversión espontánea al estado Se. De manera similar, la secuencia del gen PrP determina la suscepl'ibilidad de las ovejas a presentar la enfermedad en fonna espontánea; la combinación de aminoácidos en tres posiciones (codones 136, 154 y 171) derermina la susceptibilidad. El prión ofrece un caso extremo de herencia epigenética, donde el agente infeccioso es una proteína que puede adoprar múltiples conformaciones, cada una con propiedad de automoldeado. Es posible que esa propiedad participe en el estado de segregación de la proteína. 840

CAPÍTULO 31 Los efectos epfgenéticos son heredados

Resumen la formación de la heterocromatina ocurre por proteínas que se unen a regiones cromosómicas específicas (como los telómeros) y que interactúan con las histonas. la formación de una estructura inactiva puede propagarse a lo largo de la hebra de cromatina desde un centro de inicíación. Ocurren episodios similares en el silenciamiento de loci de tipo de apareamiento inactivos en levaduras. Las esrructuras represivas que se requieren para mantener los eslados inactivos de genes paniculares son formadas por el complejo de proteína Pc-G en el género Drosopltila, Comparten con la heterocromatina la propiedad de propagarse a partir de un cenero de iniciación. La formadón de hetexocromatina puede iniciarse en ciertos sltíos y después propagarse por uoa distancla que no está determinada con precisión. Cuando se ha establecido un estado heterocromá lico, se hereda a través de divisiones celulares posteriores, lo que da origen a un parrón de herencia epigenética, donde dos secuencia s idénticas de DNA pueden vincularse con diferentes estructuras proteínicas y. por ramo. tener capacidades diversas de expresión. Esw explica la aparición del efecro de posidón abigarrado en el género Drosophila. La modifirnción de las colas de histonas es un desencadenanre de la reorganízadón de la cromatina. La acelilación se vincula en general con la activación génica. Se encuentran acetilasas de histonas en complejos tle activación, en tanto las desacetiJasas de hisronas se encuentran en con1plejos de desactivación. La metiladón de histonas se vincula con la desactivación géníca. Algunas modificaciones de histonas pueden ser exclusivas o sinérgicas con otras. La cromatina inactiva en relómeros de levaduras y loci de tipo de apareamiento silente parecen tener una causa común, que comprende la interacción de ciertas proteínas con las colas terminales N de las histonas H3 y H4. La formación del complejo inactivo puede iniciarse por la unión de una proteína a una secuencia específica del DNA; los otros componentes pueden entonces polirnerizarse en forma colaboradora a Jo largo del cromosoma. La desactivación de un cromosoma X en las hembras de mamíferos (euterias) ocurre en forma aleatoria. Bllocus Xic es necesario y suficiente para contar el número de cromosomas X. La regla n-l asegura que se desactiven todos los cromosomas X, excepto uno. X1c contiene el gen Xist que codifica un RNA que se expresa sólo en el cromosoma X inactivo. La estabilización de Xist del RNA es el mecanismo por el que se distingue el cromosoma X inacrivo.

La met\Jación de1 DNA se hereda de manera epigenética . la replicación del DNA crea productos hemimetilados y una metílasa de mantenimiento restablece el estado de metilación completo. Algunos episodios de metilación dependen del origen parental. Espermatozoides y ooci,tos contienen patrones diferentes y específicos de metilación, con el resultado de que los aletos maternos y pa1rernos se expresan de manera diferente en el embrión, lo que causa la jropresión donde un alelo no metilado heredado de un progenitOr es esencial porque es el único alelo activo, el alelo heredado del otro

progenitor es silente. Los panoues de metilación se reStablecen durante la for:madón de gametos en cada generación.

Los priones son agentes infecciosos proteináceos que ocasionan la enfermedad de encefaJopatía espongiforme ovina y padecimientos relacionados en los seres humanos. El agente in feccioso es una va riante de una protcfna celular normal. La form a Prrsc tiene una conformación alterada de a u tomoldeado: la forma normal, PrJ>c, no adopta por lo general esa conformación, pero sí lo hace en presencia de PrP5<, Un efecto similar se encarga de la herencia del elemento [PSTJ en las levaduras.

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Artículos de investigación Basler, K.• Oe~Lh, B., Stott, M .. Wt:\ldway, D .. Walchli, M .. Groth. D. F., McKinll.'y. M. P.. Prminer. S. B.. cllld Weissmann. c. (1986). SLrapit• and tl'llular PrP isnfnrms are cncodcd by the samr chromosomal gene. Ce// 46. 417-428. But'lrr. H. et ,11. ( 1993). Mict• dt•void uf Prl'
Glosario El abigarramiento dl'l lcnotipo e' producto dt' j!l'llntipo dur,mh· d dt•sarrollu 'ornállco.

tambio t'll d

Un alelo t'~ 1111.1 de varia\ forma' altt•rnativa~ de un gen qut• orupa un h•<us dt·tt·rminadcl en 1111 l romo,oma.

Un abultamiento t'' 1,1t•xpan~i6n de un.1 ~dtkna eh· un rromo,o· 111.1 pnlit..:nico rl'i,H.ionad.t nm la ~Íillc\i~ de HNA t•n al¡.;ún loms dt• la lllt~lllcl.

St· dil't· qut• un lvms tit·m· altlos múltiples t·uando se han t'nt:ontr,Hio má~ de do~ lonna~ aldita\. C.1d,1 ,1ldo puede dar lugar a 11 n lenotipo dift•reme.

1.1 abundancia tilo un RNAm e' l'l nlirnero promt•dio dt• mnléuJ)a, lklr rdula.

La rcgulacicín alosterica t·~ la capaudad dt· 1111.1 proteína de cam· bi.u su Cllllformadcín t'll un ,¡¡¡u (Y por tanto. \U anividad). t·onw rt·sultado dt• la union dt• una pt·c¡u<·tia mn)¡:cula a un se· gundo sitio lotali1ado t'll ntra pilrtt· dt· la protl'Ína.

1111

l.a~ <.:ll/1111.1\ acetiltransferasas de las !listonas (HAT) mndilica11 a )a, hhtona' agrt•¡tandn ¡:rupo\ atetilo; al¡.:uno~ roattiv,tdttrt'' dt· la tramuipdcín J>re~t·ntan attividad de HAT.

El acido desoxirribonucleico ( DNA 1 t'' uua nwkutl,1 dt• ,iddn nudl'itn t'omtituida pnr un.l cadena lar~a de nuclecítido' pulimcri/Min' ldt•suxirrihol. En d DNA dt· tadt·na dliplt-". las dn~ t•s· tnltllltd\ "' manttl'llt'll juma~ );lr.:tda' a lo\ t·nlau·, de hitlru¡.;cnn t'lllll' ll
por el AMI'ddit"o: la tran'-Cripdún de

\1'

m·<·c~ita

para qut· la RNA pulimer,h,l inirit· t'n E. <"Oii.

llllll ho~ opcnme~

Un \Ítio de actuación en ds alrcta !,1 actividad scílo ck J,l\ \l'Cltt'll· da' ~nhn· \11 propia molt'tul,1 dt· DNA (n RNAt; t''la propÍI'di!d sudt· indir.tr qllt' l'l 'itio no codilka proteína\. Un producto de actuación en trans put'tlt• funriclltNA diana. lo cual implic¡¡ qm· \t' tr.11.1 dt· un.1 protdna dil11~ihk o RNA. La adenilato ciclasa t·~ tma t'nlilll
844

CAPÍTULO 31 Los efectos epigenéticos son heredados

La amanitina (d nomhn· complt·tu l'' Cl·amanitina) e~ un m· til)lépttdo dicíclico. ckrivddo dd hongo \.CIIl'nmo Amcmita pltalh•iJc•l, qut• inhtht• la tran~criptiún por til"rta~ RNA polimt·rasas eucarilitka'. t·n c'¡wcialla polimcra~a 11 de RNA. f:l L'ntlún ámbar ,.~ l'l tripktl' UAG. uno de los tre~ codoncs dC' tnminación cnn qut• tonrluyt• la ~Ílllt'\h dt· proteínas.

Un aminoacii- RNAt e' 1111 RNAt t•nlcllaclo .:t un aminoátido. El ~rupu COOH dl'l aminu.itido w llllt' c1l grupo UH de las posiciolll'~ 3' o 2' ck la ha~e tt·rrninal cid RNAt.

En t•l análisis de la huella digital dd ONA se l'Valúan las dikrcndas l'nlrt' lo' indiv1duo' dt• Jo, fragmt•ntn~ generados por mar cn7imas dt· rt•stncoc'ln p.rra dividir 't•rciont·~ que contkm·n 'l'l'lH·ncia!> brt·ve\ rt'pt•tida~. o por PCR. l.a' longitudes de la~ rt·¡.;inne~ rqwtidas ~on ünira\ para tada individuo, de dhí que 'l' pueda aprovl·char la prt•wnda dl' 11n ~ubgrupu l''P<'CÍfico en t·ualqurcr pi!r de 111d1vidu"' p.ua ddinir \U ht'remia wnnín tpor t'jl'mpln. una rdacion padre-hijol. El análisis de la matriz genHica sintética (SGA) e~ una l~tnica auwmática dt• la~ lc\adura' t'n gl'madon por la que una mutadtíu 'e truJa ron una t'\lrllrtur.t tk casi S 000 mutacione~ tll' ddedun pard dt·tt·rminar \i t;\la~ intt·rartt'tan para <·aus,u un fenot ípo rnon.1l \intét ico. Un anda (a nll'nudoll/i t¡ u e \l' forma l'n la pordc'ln nH·di,l de 1.1 tC:lula; t•n la división reluJar. d,1 origen al tabique. L3 prirnl'ra de las pwtcína~ por inrorporar t'' la Ft~Z. quC' dio lug.tr .11 nomhn· ori~tinal de anillo Z. Un antiaislante e~ una wt'lll'Jil'i.t t¡ue permitt· a 1111 poll'lll 111 vt·nn·r el C'IC'CIO de 11n ahlantc. El anticodón t'S una sel uenda mnut h-ollt!lt ,¡ dd R mentaría del codón del Ri'\Am qut· 1" "'' 1 amino-ácido apropiado t'll rnptu t • 1

Un anticuerpo ,., una proteína pnuludda por lo' linlodtn~ B qut· ,e: junta <1 un antÍ¡;t•no 1'11 panicular. Lo~ antintt·rpo' ~l' ~inlt'· ti7,11l ya sea tundo\ c1 u11<1 membrana o de lonn.1 'ccretora. ltl' pn~lucido~ dur.mtt' un<~ re~put'Sta inmunitaria atk¡ukren lund
El autoensamblaje '><' rdkrt· a la capacidad de un,1 proteína (o compkjo de protdna') pnutám·a de cualquil'r rstru<.1ura hiológka que nmrrl' utando la~ molécula~ choc.111 t•ntrc sí y st• um·n.

Un t~ntigeno ,., un.1 moli·~..·u l a qm· put•tk unir~<· t·~¡wcílicamt'llll' a un rt•tc:ptor tk antí¡:t'nn,, tomo un antkucrpn.

Fl control ¡¡utólogo dcscrib<.• la anión del producto de un ¡:en que inhil.w tcnnnol .nHú~trno ne).!.tti'-'O) o activ.l (control autógeno pmitivu) la l'Xprt·\iún del gt·n qut• lo wdifila.

r1 1ntigeno ele tnsplante t'~ una protdna mditilad.t por un lc'm.< tk hi'>tnt:nntp.uihilidatl mayor, pn·wntt' t·n tnda' 1,1, rdula~ dt• mamílrru'>. y t¡Ul' pc!rtiupa t'll íntt'rau·inllt'' t·ntrt· linfodhl'>. l.a~ tadt·na' antiparalelas tk la hl'lilt• dúplt-x \l' nr¡:ani1an ron orít'tllaliont''> npue,ta,, dl' m.mt'ra qm· d extrt:mo 'l' dt· una \l' .tlillt'.l ron d r dt· 1.1 otra.

1.1 anti-Sm "' un antÍ'lll'ro autoinmunitarío <Jlll' ddim· al epítnpo '>m. ,., comun ,1 un ~rupn de protdna~ que'~' t'lltUl'lltran l'll ,nRNP y qut· particip.mt·n el ronl' y t•mp.tlmc del RNA.

1-.1 mt·tanhmo antitermin.acion ,., 1111 rnt•canbmu dt· h.1t1aía~ anudead.ls <..Ht·u·n de nurknidc, pt•ro ~~~ form.1 t'' \llllil,u a 1.:~ tk J;¡, l•attaí,l\ nawralt''· 1·1 aparato bas.1l de transcripción t·~ l'l wmpkjo tk !.:Jt tort'' dt· tr.l11\t riprh1n qm· ~e t'J1,,lmhl,1 en el promotor antn tk quc '" un.1 la RNA pnlimt•rJ~J

H ap;areamiento de bues dnniht· la~ imt·r,1rdom·, l'~pt't'ífitil' (t omplcmt·ntaria~ 1 dt· atknina ron timma o de ¡.:u.:~nina t·nn cilll\Íllil. t·n 1111J hditt' dupkx dt• DNA (la limina ,., 'mtituida por d ur.1cilt• t•n d f{NA dt· ht;lite dúpkx). l:l apareamiento de los cromosomas ,•., d acoplamknto de lm trulll~ .11 itudo dl' la mdo~b. Un lpa!l'lft1tento erróneo dt''>t:riht· 1111 'itio t!d I>NA t•n t•l qut· un par dt· ha'''' nn cumple ron t•l t'~tJUt'ma 11\Ual tlt' G-C tt A-T. Puede ~l'r taU'\ado por la íncorpt>r.Jdún de 1111.1 ha~t· ern'111eJ duran~t· 1,1 n•plkación o por \\1 mutadon. ARS 1-n lil\ kvadura,, d XXX t'\ 1111o dt· Jo, ~itio~ dt· ori¡.:en tk lil

Lm mutante~ aYlrulenlos de una h.Kteria o un virus han perdido

la rapandad dt• inktt.U dt• m,ult'ra prll barteria~ o virus. 1.<~~

bases

modificad~~

\otl tod,t'\, excepdún hed1a de JJ, tuatn> panir dt• l.:J\ ntalt·~ '>l' !>ÍillCti/a d DNA !T. C, A. G) o d RNA (U. C. A. <.i); ..on productos dt• rambios posintétiros t•n l'l ando nurkito. U!>Uale~. a

Un bastidor tic uomo~oma l'' Ulhl ntruttllr,l protl'ináceJ que a\umt·la lonna dt· un par dt• uomátidas lwrnt.ulJ~ qut• St' gt•m·ra tu.mdo Jo~ crnmo~oltl.J\ tart·u·n Jt· h1~1ona~. Un btvilentl! n la C\tntnura t1lll' cnnttt·m· la\ cuatro (do~ rque~emativa~ tk tadJ tWIIIo~mn,l homúlo~o) la mt•io'>i~.

crnm.ítida~ almitiar~t·

Un marc~1 dt· knura bloque~o no put•dt• tradmir~t· cn prutdna por IJ pn·~en
t'\lfllllttra \t'C\tndari.1. Fl bruo Keptor tld RNAt t·~ 1111.1 estruttura dúplex y curt.:J qtn• tl'rrmna t•n la \Ctut•mia CCA ,1 la qut· ~t· t•nlaJ:a un anúno.íddo El br.azo adicional del RNAt ~t· t'lllltt·ntra t'ntrt' lo~ bra:w~ T 'i't y anucot!tín; e' d de lon~ítutlmá~ variahlt- dd RNAI, de ~ ,¡ 21 ha'~''· l.os RNAt '~' denomitMn de cl:t\t' 1 cuando cart•n•n tld hra111 y dt· da~t· 2, t'n ra,otontrario. El brazo ¡nticodon dl'l RNAl t•s una c~trutlllra prominente for nwtl,t por 1111 tallo y un la1o qm· muc~tr.1 t'l triplcte Jnticutlon l'll Unl'Xtrl'lllll.

n·plit'aciún. Lt tarat1t·rí,titJ ulmtm dt· la' tlikn·ntt''> ,,.,.u,·nua'> ARS e~ una \t'tiiCO
l1" bruos de un 'itio dl' uni!Ín tld fa¡:o lambda son las 'et·uc·n da~ qm· llanqm·an d dommio n•ntral. donde ocurre d pn~<.l''" dt• rt•romhinadún.

La aunu.ación tk~t nbt· 1., re¡.:uladtiu de lm opt•ronc~ l>ath:riano<; pcll el control de la lt'rmin.Jci6n dt· la transcripción en el ~itin lcltali.cado autt''> del priml'r gen t'\tructur.:JI. Un aunu.ador ,., una \t'l"lll'lllÍa de ternunacitin dondt· oturrt· 1,1 a te nuadútt. lo'> ~itit" ott \ll ll ubil'auont'' dt• un f.:Jgn lamhd,1 y de un crommoma batteriano do111k la rt•¡·omhin.:tcit'm ínH·~ra t•l la~o a 1 nnmosuma hartcriano o In elimiJIJ. Fl ilutoemp.alme desuibc la rapaddaú del intrún dt• retirar\C de un RI\A por 1111•1 ,1cción catalítica que depende súlo de la sccut·n' i.1 dt• RNA del intrún.

846

Glosario

La cadena pesada de lnmunoglobulinas es uno dt· dos tipo' dt•

!>ubunitlad t'n un tetrám(·ro de anticlll·rpos. Cada antirttt'rJli.' ticm· do~ Ciltit'nas pesada~ . Elt·xtremo N dl' la cade11.1 ¡w~1da forma partt· dd \itio dt· reconocimit·nto del antÍ).!ellll. t•n tatllo qm· l'l n:.lrt•mo e dt•tt·rmin.1 la \ttbdase (isotipo). F.n tl'rmÍilll'> ¡.:enerales. la cadena retrasada del ONA debe crt'ft'r ~·n tliretcion 3' a 5'; se \intt•tiza dt• m.ml'ra dhcontinua l'omo fragmentos wrtos ( 5' · 3') qut· de~put's st· um·n en forma t·ovakntc. Una cadena dt· DNr\ sobregir1da tit•nt· má~ part·s dr ba~t·s por que d pronwdio u~u.1l ( 1O bp = 1 ¡¡iw). t·~to t'S, el t•tuolla· dn de las do~ tadcnas de DN A e\l<Í m.is aprt'tatlo. lo que t rt·.1 tt·mi
El brazo O del RNAt lit·nt· un dt·vadu
La uimiucion de un• sou udenil tk~triht· la G1patidad tk lc1 protema RnA para <(Ut' 1111a ,ola cadt·u,1 de DNA tksplan· a ~u hom<'>lo¡.:a t'n un.1 e'tntt.tur,l dítplt•x; t'~to es, la t.ltkna lllli
po contit•nc dos cadenas ligeras. El extrt·mo N de la cadena ligera forma partt· dt·l sitio dt' n·conodmiento dd antí¡.:enu.

Una prutdna bl.IP llt'll<' un dominio dt· umon dc DNA ba\lt.t atlyan•ntt• al ~e!!mt•nto dt· dinwrizacion t'll rremallera de 1.1 lt·u dna. 1.d ud~nil codificador• del UNA tiene la mt~ma ,t',·uemia '1"' l'l f{NAm y se rt•l,1Ctona con la \CCut·nd.l de proteínas tJUl'" reprl'\l'llld por d uídigo gt•ni•tku. La Ccildenil en sfntido opuesto del ONA e~ comp!t?mcntan de la t'adcna t'on ,cmido. y l'~ la que hatl' las Vt'C<'S dt· mol.!< p.ua la sínte~h del RNAm.

1.•1~ cadenas dt• los cnmw,omas

polit~nkus w nbst•rvan tomo n·giom•s tlen~a~ qut• nmticnc:n la mayor parte dd DN A: incluyt·n Jo:l'lll'~ al'\ ivos.

cadenas C w gennan por técnít·a, de tindt"111 que reat·donan los rentrínneros. lJUt' ~e Vt'll romo punto' intt'tl'>antt•ntt' tt'· iiido\. I~H

n111

la~ cadenas G ~t· ¡:t·m·ran t'n lo~ crmno~oma' eut\Hiútko~ por tl-rnic,u dl' tint'iún y ,1paren·n comn 1111<1 sc:rit· dt· t•striadnne' 1,1tt•r.1lc~. Se u,.111 para lc1 tt·aliJ:adón tk cariutipm iidt•ntifkadán dt• numo,oma' y su' n·~inm·~ por l'l patrt'm dt• hantlt't>).

l.a~ cadenas pesadas y las cadenas ligeras de una cadena de DNA th'¡pft'" \l' rdtt•ren el Ja\ dift'fl'nl'Í,J\ dt• tit-nsidad ljlll' rt'\Uit.lll dt• 1,1 ,1,Íflll'trÍJ dt• la rt'Jirc~t·ntill'itín de 1.1'> ba\t'S en .unha,. dt• modo tjlll' llllol t'$ rica en ha\l'$ T y G y la orra l'n ba~t'\ e y A. E~ln otune en alguno~ DNA ,,lldite y mitoumdrial.

Una caja CAAT t'~ p.utt' dt• 1111.1 ~~·rut·nda conwrv,1t1a ubitada <"11 llujo a"·t·ndt•nte rt•s¡wcto de lo\ punttl~ d~· inido t.k IJ~ unidade!> dt· tramcripdún en IJ'> l'm,uiotas: w n•ronoce p()t un .:ran t:nJpn tk f.1e1ort'' dt• transcripdún. ta caja GC t'~ un t•h:nwnto promotor común poi 11 olllstituido por 1.1 st·cut•ncia GGGCGG. ~ec:uenti.l tlt· DNA (operador) tlt· -lO bp rew· tl
L1 cajil SOS l''> l
lJ caja TATA t·~ un uct.inwro nm~t·rv.uiu, rico t'n A·T, qut· w t'lllltt·ntra ta'>i 2 o; bp anlt'S dl'lpunto tk in ido dt· l ad.1 unidad dt· tr.m~cripdún dt· la ¡JOlinwra~l JI dt• RNA t'utariótit:a; pJnidpa t•n el po,idtmamit'rUn dl' !.:1 t•nzilllil JMr.l d inicio Olrret111. Se tk~t·riht· romo cambio df clases J u11a modilKJtion en la l'!>· trllt'tUrJ dd ).!l'n de 1¡: dondt• l'.ltllhia l'l dominio C dt• la t\ldt•na pt•sada. pero l'l dominio V ¡wnnanett' igu.1L St• rt•quit•rt• dt· un cambio pr09ramado del marco df lectura p.u.1 la <'Xprc~ión dt• l.t'> ~t·ntt•ntia' prutt•ímt.1~ todtfitad.1' m.í~ aliJ dt· un ~itio espt•dliro d(llltk orurre un c,1mllio dd m.Jrol de lectttr.l dt• + 1 o -1 l'll algun.1 frt'l'llt'nda típira.

lus cambios de marco son nHlldcionc' tauo;ada) por dl'ledont•, u imc:rdont'' qut· nu ~un múltiplos dt• pan·~ de ba~l' trt·~- Modili t\m d marro t'n Qllt' lo~ tripletcs ~~· tradutt•n en pmtl'Ína~.

la c;,dena líder tkl DNA ~~· ~íntt•tiJ:a dt• mJnera continua t'tl d1 recdón 5' a 3•.

1...:1 capacidad dt procesamltllto de~rrilll.· la rap.Kid.td de unJ t'll· Jima para hacer mültipl<·~ ddo~ catalítitu~ con un solo moldt•. t'll lugar dt• di~udarst• dt•s¡mC:~ de rada ciclo.

la udellil ligera (ll de la~ inmuno¡:lobulina\ es uno dt• do'> tipo' de ~ubunidJdr-; de un tetrámero de: anticuerpo~. Cacla anlltll<'r

1...:1 cápsfde t'S 1,1 t'ttbkrta protl'Ínka rka.

t'xt~·ma

dt• una partícul.t ví-

l::n la captura de exones sc inserta un frilgnwmn dd ¡:•·noma t•n

un vet·tor t·uya fundún dt•pcnde de la empalme por el fragmento.

pwvi~it'on

dt· uui•nw' dt•

El cargador de pinza t'~ un complejo proteínico de 5 sul>umdadt·, cncar¡:ado dt• car¡.:ar la pinz,1 1} sobre l'l DNA en la hort¡uill.l dt· rl'plil',Kión. El nwddn de cartucho p.:~ra l'l tipo de apart•,uniento dt· las leva· duras dt•st·tibe un ~ulu sitio anivo (t'artucho activo) y dos ropias dt·sactivada~ dl'I/Nm (canud1t.1' silente~) . El tipo de apareanúcnw r.tmbia cuando elt·,utudw artivo dl' un tipo es sustituido por un r.utudw silent(• dt'l otro tipo. UtM cascada t'S un.1 'etuenna de ~un·~'"· ,,1da uno c\lirnul<~do por d previo. En la re¡;uladon dt· la tramni¡x-ión. wrno w ub\t'rv,l en la e~pllrulad!ln y l'i dt·~arrollo ck fa¡:o.; líticns, ~ignifil'a qut• \l' 1hvide t'll do) l'tapa'>. y t•n r,1da unJ dt• dlas. uno de hl\ ¡!t'llt'' t•xprt'sado~ tlltlilka un regulador nt•t'esariu p.1r.1 t'xpresar d (¡)~ ):C:tlt'~ dt• J,l ~i).!llit'ntt' elapJ. El casco e' d domhtiu dt• union al DNA del repre'or la,·. Un casquete t'' la '''trttctm.1 dt•l RNAm t'Ulariótictlt'll ~u t•xrrcmo 5' que ~e introdu~e después dt· la tramttipdún debido a l en· lan· dt'lln~fato tt•rnun.¡l dt• 5' liTP a la (la,l' tcrmin.lltk RNAm . laG ailatlida (y en ot·asiont·s al~unas otras IMSt'S) t·st.í nwtilada. lo cual d,1 lu~ar J una e~trul'lura nm la forma 7MeG5'ppp5'Np. Uu casquetf O en elt·xtn·mo 5' dd RNAm tiene met ilu t'll la 7 -¡.:uanina.

~ólo 1111 ~rupo

Un casquete 1 en d ntrcnlll 5' dd RNAm lit'lll' Jtrupos metilo en la 7-¡.:uanina termin,tl y la po'iidt'lll 2'·0 dt• la si¡!uientt• hase. Un casquete 2 tit•nt• tres grupo~ mt•tilo (7-¡.:uanina. ~•sidtin 2'-0 de 1,1 ~iguicntt' haw y N'· adl•nina) en el extn·nw 5' dt'l RNAm. J·l CD3 n

1111

complejo tlt'

¡mHt'ÍnJ~

"inculado

nlll

Ja., radenas

u y 13 tkl rt'l'l'ptnr dt• antí¡:t·nos de 1,1 rdul,, T. Cadu ulmpkjo nm~ta dt• una radt•nJ 15. r. y. y do'>~. Un cebador es una '>l't·ucnti.J brl've (a menudo de RNA) que se aparca ton una t'.Hkna dl' DNA y propordona un extremo lihrt· J' -OH domk la I>NI\ polimera'>a in ida la ~íntt•,h dt• una radt'na de 1ft-~nx irríb<.llludt•otidn~. Una celula 8 t'' un linfodto qut· produn· antíntt•rpo!>. El

de~rro­

llo tle lao, télul,1~ B ocurrt• prindpalmente en la mt•dula ósea.

Unc1 célula de memoria e' un linfocito ntímulc~du durante la re~pue\ta immmitaria prim.uia ant(' un antí¡.:t·no qut• ~e at1iva r.ipid.tm~·ntc: t•n J.¡ t'Xpo~ifion '>uh~iguit·ntl' .1 dicho antí~teno. la~ ll'lul.1., tk mt•mori.:J re~pondcn m.ís r.1ptd.mwntt• a lo\ antí¡.:enUll t(Ut' la~ t·élul,1~ no t'XJillt'~tas anlt'!>. Una célula T auldllar t·~ un linfocito T que .:Jrtiva a lo~ macrófa).!o' y t•,timula 1,1 prolif<•ratión dt• rl'lulas B. ,1\Í mmo la producdón dt• antkltt•rpo~. la~ cdula~ T au,.iliart·~ ~udt·n l'XfHt'..ar C04 en '>U ~upc:rfilic. pao no CD8. Una célula T cltotoxfca t'~ 1111 línfudto T (en ~wneral CD s·) qul' pm·<.k t''itimular~e para que a~~·~íne célula' que ronticnt'n t'llll'' Jl.liÚ~(·no~ intrarl'lulares. nmw virus. l.ao; c~tulas T \on linfocitos de linaje T (límicos) qm· pueden suhdi\•idirst• t•n varios tipo~ lundonales; pnnan Tt·R ( rt't eptm de rélula~ T) y pJrticipan eu la respu<.'sta inmunitari,J nH'tlt.hl.t por et;lulas. El centro d~ nuducion dt'l TMV (virm tld ntc".l'l" es una horquilla düpkx donde \l' inid.l d t'll\,JIIIII ll'lllJ de cobertma mn RNA

Un centro de organización de microtúbulos (MTOC) t'' un dominio del qur t•man,lll rnicrotúhulo'>. En células anirnalc,, el Ct'ntrosnma t'~ l'l principal n·ntro organlLadnr de micrntúbulo~.

sm smtidl). Al wdún UAA se k llama uut:. y al UAG, ámhar, ~l'gún el nombrt• de la~ muta.cioiW\ 'in ~entido en las que originalmcnt<• ~t· idcntifitaron.

Fl centrómero t'\ u u dominio .111go\tu di.' un crommoma qur incluye d sitio dt• uniún lcinrtorornl ,¡( huso rnitótico o llll'iótko. 1:1 tt'ntrónH'ro está wn'>tituuh• por \l'tm•ncia\ únita~ dt• DNA y proteínas qut• no'~' c:nwrntran en tllra~ parte\ dl'l trwnosoma.

La~

Los chaperones son una cla'e de protdnas qm• 'e unt·n a protl'Ína' no totalmt•ntt· plt'gada~ o t'll!>amblad,l'> p.ua ayudar a su plq¡amit:mo o impnli r su agrq¡aciún. rl cinetocoro e~ un llr¡;(anclo vinculado con la '>ll¡>t'rlidt' de un cetllrilmt"ro qut: unt: un nnmn'>l>lll.l ,1 lo~ micrnrúhulns dl'l hu~o mihítko. Cada tromn~oma rnitútito tnntit'm· do~ tiOt'l!ll'nro~ "ht·rmano'> • qut• w ubican t•n '>itio~ oplll'!>IO'> dt• su tent nimero y '>l' orit'ntant•n dilt'tdorw\ npue~ta'>.

El circulo rodante l'' 1111.1 forma dt· replital'itin dondt· una horquiII.J tk rcplkaciún rodt:a a un moldt: drcular un númnn inddinido dt' vcCt''>; la r.ltkna dt: DNA redén '>tnleti7.ada t•n tad.J vudta dt•'>plala a Id ¡m•via. lo tu al da lugar a una tola qul' induye un.1 ,t·rit· lifll·al dt• ~~·cu~:nria~ ('Orupleml'ntaria~ rt:spt'cto dt: Id t·adena dn ui,H 1kl moldt·. La tonfi¡;(ural'i1in cis de,uihc d
~itins

en 1.1 mhma molécula

Un 'itio o mut.ll'Í«>Il cis -dominant~ in' ''k ,o lo 1'11 l.h prnpicdadt·~ dt· '" prup1a mokcula de DNA. St• 11\J la dominam1a-til par.1 indkar qut' un \Hin no codilita un prudurto di!u\ihk tUna rar.l t•xn·pción t'~ que una protdna e:' ,is-dominalltt' t'u,mdo ~t' vt• obligada a actuar ~úln \ohn·l'II>NA o RI'\A a partir tkltual fue 'intl'ti.tada. 1 Un cistrón es la unidad gt'nftita ddinída por Id prueba de nunpkmt•ntaciún; e' t•quivakntc a 1111 ¡:t•n. H citotipo e~ un,¡ L.HJrterísrira del dropla~IIIJ qut• cllt'cta [,, anivid.HI dd ell'nll'nto P. Elelt'l'l!l dd dtotipo ~t· ddw a la prescnda o auwnda dt: un rrprt''l>r dl' tran~posicit'm propordonado por 1.1 madre al ovodto. La~ prutdna~

dt· clase U del MHC con,tituyen un tipo importantt· dt• molt;cula' tld M IlC. En la mayor partt· dl' lo' t.,,o,, e~ra' prott'inas prcst'ntan prptido~ a lo' linfocito~ T auxili.~rt·~ CD4+. Lo~ p(·ptido\ de unión dt• dc1'>t' 11 de MIIC ~lll·len ~cr produddos por 1r.t¡:meJitafión proll·olítica t'll t•ndo~oma' y li\O\Ollla'>. Lo~

coactivadores '"" tactorl's nect:~arin~ para la tran~cripciiln qut• 1111 '~' um·n .ti DN A. pero ~e rt:t¡lllt'ren p.1r.1 que lo\ activa· don'' interacnkn ton h'' faetort•s dt· transLTlpdtin ha,al (unión a DNA). Un dominio codificador e~ un.t partt: dcl¡;t'n qut· reprt'\t:nta una '>t'Cllt'IKia proteínica. El código genético e' (d mrrespondt·nda (•ntrt· lo~ [)NA (o RNA) y los amino.íddo\ dt· la~ proteínas.

triplrte~

dd

Un código silencioso e' un dominio tk todilkatiún tlomk lc1 mut.tdún no cambia la ~t·cucncia dt• la proteína. Un codón I.'S un tripktt' de llltdecítido\ que noáddo o una scilal de terminaliún.

rcprt'~t·ma

a un illlli-

1:] codón de iniciación e' u11 wdún especial (en ¡.:ent:raL AUGl que \e U!>a para inida1 la ~ínte\b dr una prutdna. Un codón de termín¡ción es 11110 de tre~ Lriplete~ (UAG. UAA o UGAl que provoca la taminadún de la síntt·~i' dt: proteína~. Tradidondlmente sr ks ha dado también el nombrt· de c.1donrs

848

Glosario

proteínas cohesinas lorman u11 complejo latl'ral que mantit•ne jumas a las crom.ítidas hermana~ en l'l wmplejo sinaptnnl-mico. Jnduyt:n al¡;(unas protl'Ínas SMC Uno.~ e~tructura

cointegrada se prnducr por la fu,ión de do~ replicones, uno qut• onginahncntt' pu~t·e un transposón. y ntro que car<•n• tk d: l'l u•intc~radu tknt: copias de transposón en Jmba~ uninllt'' dc lo' replitOilt''· orkntada~ como rcpcticinnt·' directa~.

La cola de poli(A)

nílico

que~~·

~'' un lra~mt:nto dt· -200 une alt·xtrl'mo 3' dl'l RNAm

tM~n

di.' ,1cido adt·de su ~ín­

de~¡>ués

tt·~is.

U11.1 rl'lation colineal de~criht· la rt•pre~entadún 1:1 de UllJ ~c­ cucmia dt• triplt•tt:~ dt• nutkútidm t'll una \l'lllt'llcia de amino.il ido\. La compensación de dosis dt·'>lril>t: lm mt•tani,mo' empleados paro.~ corupt·m,lr una dbcrt'panda por la prest•ncia de do~ cromo'"111•1' X en un 'e""· pero \!Íio uno t'll el otro. Un complejo abierto dl·~•rilw la t•tapa inicial dt· la tramcriprión tuando la pnlimt:ra'a dl'l R"'r\ han• c¡ul' do, tadt•na~ di.' DNA ~~· \t'part'n para lurmar la •t>urhuja dt• transnipdún". Un complejo de iniciación t'll la ,¡lltl''>iS prutl'Ínica haueria11a rnntit•nt· una ~uhunitlad ribo\Úinita pc:qu~:ñ,t. factort'\ de inidadcin r llll amiwlacii-RNAt iniciador unido al RNAm l'n un codún dt· inid,tciún AUG. En la transcripcitin eucaritítit.l. d complejo d~ preiniciación de~­ crill!.' t•lt·n\.:Jmhlaje de facwn•, 1k tram
1:1 complejo de prerreplicación n una comllinadon de protcín,¡~­ DN A t•n el ori¡:t·n dt· S. ¡'t'rn'I.Hüt' lll'l't''>Jria par,t la replicacilln dt•l DNA. El compkjo tontit·ne ORC. t:1k6 y !,1, protc:ínas MCM. E:l complejo mayor d~ histocompatibilidad (MHC) t'~ un dominio tromos6miw Cll)'l" gt•nn partidpan t•n la lt'\(llle,ta innumit.uia. Lo~ ).!l'lll'\ l'!Hiilit.ln prott'ÍiliiS Jl.lra l,l prc'<'llt,ll ion de dntígcnn,, 'intt·,i~ de dtodna~ y complt'llll'lllo. a~í te~rnn otras fun ciont''· J:l MIIC t'~ alt.mwntc polimé>rlito. 1"'gene' y las proteína~ dl'l MHL se dividt•n 1'11 tre' cla~e,. I:l complrjo

posr~plicación

S. ,cr(~'ilill<'. <[Ul'

El lo~

wmi~tc

l'' un wmplejn dt· prott'Ínas-DNA t'll en t'l wmplcjo ORC unido al origt•n.

compl~jo

sinaptonémico dt•,uil>t' la t''>!rUt'Jur,l nwrlológica dt· crumo\ornJ' d111 antt· la ~inap,b.

rl complejo temario t•n !.1 inidadc'lll dt· la tramuipdim t''>tá Wlh· tituido por R:'I.A pnlimt'rasa. Ul'\,\ y un dinudt·ntido que repn·· ,t·nt.t la\ primt• ra~ do\ ba\t'' del producto tll'l RNA.

El complejo TJM rt·~itlc en la mt·mbrana interna de la~ mittll'ondria\ y \e ent.Hga dd tramportt: dt' las proteínas del ~~patio intcrmt·mhrJnoso ,11 intt·rior dt· to' urganl'los. El complejo TOM reside en 1,1 nwmhrana t')!.tt'nl.l dt• la rnitmondria y~·· l'n('.uga dt• importar 1,1, proteú1a~ dd ciwsnl al espado l[lll' \epara la~ membrana~. l.a complementación ín vítro n un análhb funlional qul' ¡>t:rmitl' idt•ntilitJr lo\ compom·ntt'' de un (Hon•so. J.a rt·atdún ~~· n•con~tn r ye utiliLando extracto~ dt• una célula mulantr. ~t· han t·~tudiado fraccitliWS dt· c.élula~ de tipo siiVt'\tre en cu,1111o al rc~tat>kdmknto de la actividad.

La complementación mteralética de~uihe el cambio en la~ propicdade~ dt· una proteína h~:ttrumulrim(;rica por la intl.'racdún de ~ubunidadt·s cotlific.tdas por du~ alelos mutant<·s dtkrcntes; la proteína mixta put>de ser má~ o menm activa qut· 1,1 constituida por \uhunidadt·s dt• sólo uno 11 otro tipo. Para ntr.l c.1u~.1 de wmplt'mt'ntad1ín intt'r,Jiélica. véa~e tranwt:f'>it'>n. 1~1 complementación negativa CICltrre cuando la romplementacitín intt·r.tll-lira pt:rmitt' qut: una subunidad mutadd ~uprima la actividad de una '>Uhunidad naturalt·n una proH•úta mullimérka.

St· dirt> Qllt' dos llllltcldonl''> st· compl~mentan cuando una télula diplnidt:. heterodgnta para cada mutación. product· un ft•nutipu naturdl. los pare' de ba"'' compl~m~ntarios w delim·n por la' n·arcioncs de apart:amit:mo en lt" áudos nudeiws dt: héli<'e düplex (A wn Ten l'l I>NA, U t•n l'l RNA y C con G). La~ proteínas condenstnas ~nn tnn~tituyt'nte\ de un wmplejo que~~· unt: a los uomo,oma~ para d.11 lugar a Id towkmadún y prt•pararlos para la nwio~h o mito~h; \Oll micmhrm dt: la familia

los corn:·cu~. dt· mvdo qut· los primero~ s~ rl'viert.UI dllh'~ tft· <(Ut' se dgrt'guc una 'uhunidad a una cadena polimC:nta La corrección quimica es un meuu1brno de rt'\'i'>itin por t'lt u.11 lil'ne lugar un 'ucc~o de correnión dt'~Jnlé~ dt•la adit ii111 dt· 1111.1 ~ul>unidad incorrt·<·ta a un,t cMiend polimérica. al revt•rtir"· la n·at'dón de adit iún. Un com~presor c~ntral es una pequdia molécula qut• tft·st•nt.ldcua la reprl'sicín de (,J transnipcuín uniéndo~t· a una proteína rc){uladora. F.l corte y empalm~ alternativo dt·!>aihe la síntesis de di!t'rt:nlt'~ productos de RNA a partir de uno ~oJo por cambim en d u~o de las uniones dt· empalme. El corte y ~mpalme d~ las prot~ínas es d pWl'l'~o autl' rt'tir,t dt• un,t proteína y Id\ exteina\ dl' C.ldol lado ~e wm•tt.m por 1111 t·nlal'l' peptídico e~tándar. 1:1 cort~ y ~mpalm~ del RNA t'\ l'l prore~n dl' inci,iún cont·~ en un RNAm tontinuo.

SMC dt· proteína~.

La cosupresión dt·\uitl!.' la c,1pacidad de un transgl'n lpor lo ge-

La conjugación e\ un pron·su t'n el que dos rélula~ l'lltran en t.olllacto y ~e transliert:n matl'rial ¡:t:nrtiro. En la' bactt•ria~. t'l DNA e\ tramft:ridu dt• unJ el-lula donadora a una n·n·ptora, mit•ntra~ qu~: t:n los protozoario~. d I>NA pa\.:1 dt· una télula a la otra.

rrt·~pondicntt·.

Un duminio constante (dominio C) dt• un.l iJununoglohulina. o rccepwr dt' la Lélula T. e~ la partt• que meno' v.uí,Jt•n la '('l'Ucnda 1lt• aminoácido\ t•ntrt• difert·ntt'' molél'ula~. Lo\ dominios con~tante~ son codilil.tdm por ~egmt·nto' del gt·n C. los domi· llill\ C dt• Cadt•na Jlt'Sada idt•ntilÍlan a( tipo dl' inllllHIOglobulina y adquiert·n funnnnt·~ ekctoras. El contexto de un codón en el RNAm \t' rt'liere a qut• la~ ~l'cuen­ da' vt•dna\ put•dt•n tambiar la l'licada ron que un aminoacilRNAt recorJOL~ a MI t·odlin o se lha p,u,¡ tt:'rrninar la 'íntt•,is de pmtt·ína~.

Un contratranscripto t'~ una molécula dt> RNA qur impidt• que un n·badur de RNA inide la transcripd<ío por aparcamiento dt· ba\c' ¡·on t'l echador. 1·1 control del entrecruzami~nto limit,J c:l número dt· \lll't''o~ de reromhin.1ción dt• crumcboma<; t•n la ml'io~i~ a uno o do~ por par dt· homúln¡;:o'>. El dmninio de control d~l locus (LCR) w nt:cesita para la t•xprcsit'ln dt: vario\ !(t'lll''> l'n un dominio. Se dkt· que un pl.i,mido t•stá t>ajo control de coplu multlpl~s cuando el sistema dt• 1 ontrol ¡wrmitt· qm· t•xhta m.h de una copia por félula bat'lt'riana individual.

nnal en planta\l de inhibir la exprt·,iún del gt•n endógeno coLa cremallera de leudna e' un ~t·gmt·nto de dimnilaciún qut' ~e t'lltut·ntril 1'11 una dast• dt: fat·torr~ de tran\Cripci<Ín.

Las cromátldas ~on topias dl' un trorno~oma produddas por replícaciún. htl' olpdatÍ\'0 \Ueie ll\.tr\e para desrribir a Ladd lUid dt: la~ n>pia~ t:n t•l pt'riodo previo a '>ll St'paración t•n la siguiente divi~ión t"dular. l.a cromatina dl',uihe clt'\lado dl'l DNA nudt"ar y las Jlrotdna' dur,1ntt• la interfa~t· (t·ntrc mitosis) dd rido celular t·ucariútico. vinculada~

El cromocentro ~'' un agreg,Jtlo dt: ht·tcrocromatina dt· diferentes frOIIIO~OU\il\,

Lm cromómeros '>011 gr.ínulo~ intt:mamt·ntt· tt·ñido~ y visibks en (¡,, uomosnm.t\ t'n determiuad.h wndidmw~. t·n t·~¡wcial <'n la~ prim~:ra' t·tapa~ de la meiosis. cuando podría part·n·r que un l'romo~ullld l">tá ton~lituido por una ~t·rie de nomtimern~. Un cromo\oma t'S una unidad definida dl'l¡¡t·noma que porta mutho\ ~~·nt·~. CJda cromu\oma t'\t.l cor~>tituido por unJ molrullc~ muy ¡{ratuk ck DNA dúplex y una ma'a ra~i t•quivakntt· dt• prvtt•ína'; ~l' vt: t'OlliO t'lllidad morfológica \IÍio durantt: la divi,iún celular. Un cromosoma de horquillas multlples (t:n una hatlt'rial til.'ne m.i' dt' un conjunto de horquillas dt· rt:plkadon porque un segundo in ido tit•m· lugar antt·~ dt• qut' concluya el primer ctclo dt• rt·plifaciún.

con apart·amit·nto

Un cromosoma dtc~ntrico t's d producto dt· la lu,icín tk dos (ragmt:nh•' cromuMímicos. cada uno (1111 un telllrcínwro; t'S inestable. y put•d<· rornpt'r't' cuando 1'" dm rt'ntr6mt·ros 'L' \!lllll'ft•n a trat·dún hacia polos opue~to~ duramt· la mitmb.

La cordlctplna t'S una 3' dt•soxiadenosina. inhibidora dt· la poli-

lo~ cromosom•s tn escobilla 'on lo~ bivalt:nte~ mdtiticos muv t:xtendido, dt· dt·rto\ ovocttns dt' .llltihio\. ·

Conv~rsión g~nHlca t·~ la altt'racilln dt· una cadena dt· un DNA het~rodúpkx para hacerla complt•mt•ntaria dt• otra t'll ( ualquirr po~idcín.

o

po~icioncs.

donde hubo

ba'>C~

t•rn)nco. Jdt•niladón del RNA. La corrección se relit•rl' a cualquier mt•t·anbmo para remediar t·rrort:~ en la \Íntt''>i~ dt: protdnas o ácido~ nucleicm; implicd el t:\l'futinio dt• rada unidad delpub tlt· que st• ha agn•gado a la t·adcna. Ll corr~cdón dnitlca l'~ un mecanismo dt' enmienda que depende d~ que lus sucesos incorrectos avanct:n má~ kntamt·ntl' que

i:l dtdo d~ ztnc t'\ un segmento de unión de DNA que tipifica una d.ht' dt' fat.tor de tran~tripd!Ín. La dtflntdon dt tKón dcscrit>t' el proceso por el <·ual '>t' rt'lone~u· u11 par dt' sitio\ dt• t•mpalme por interaccione~ qut· implitan l'l sitio 5' dd intnín y tambirn d sitio 5' del siguientt· 1ntrun t'll flujo dt'Sl't'lldl'n ll'.

Glosario

849

l.l definicion de intrón describe l'l pron:'o c:n que: un par !k 'itio~ es rt·corwddo por mtc:rat-ciones que implil:an ~cílo al sitio 5' y al punto ck ramilkaniln r.

UnJ distorsion estructural e~ elrambio t•n la nllllomladc.'m del ONA caus..1da por base~ o part"' de.· bases qm· nu \t' aju~tan a la ntrunura dúplex normal.

Un dominio dt• una proteína t'~ una pane mntim1.1 bien ddinidJ de la ~t·c.·ut·nc..la dt· .1minoáddos qm· puede reladonar~c con 1111a funCil)ll t'll panio1lar.

PI elemento de respuest.l al choque térmico (HSE) t"' cut '~'lUl'll da t•n un promotor o pott·m·iador qut> Jlli\',1 1111 ~t'll ).!l.ltll' 11t1 acth•ador inducido por el dwqut' térmitu.

L.1 degeneración de tercera base dc:,cribe d dt>cto mc..·nor <·n d 'ignififado de..• un codnn dd nuckcitido prt•,t>nte en la tc..·rrc..·ra po~idún tll'ln•dt1n.

Divergencia es la dikrcncia porn•Jllual cm la' 't'ctwnda' de nudc.·útido' cntrc dos ~c..·cut•nda~ de ONA rd.uionJda' o en la secUt'IKiJ de Jminoáddos cntre dos proteína~.

1:1 dominio A c..·s la sN·uenciil de 11 bp dc pan•s dt• bast"\ A·T fOnservad.J en d demento ARS de..· la lt•vadura. qut• incluyt> el ori~c.·n de Id rc:plicaciim.

L.l degradación de RNAm mediada por mutaciones terminadoras t'' ur1.1 vía t•n 1.1 cual 't' fragnwnta un RNAm q1u· pre,c..·n ta uru mutadiln tcrmin,uloril .mtc..·, tld ultlll!Clt'XÓn.

El ONA basura desaibt' ~c..·ntc..•nciJ~ que rw wntribuyt·n JI genotipo del organismo, sino que 'u única lundlin t·n d gc..·noma e~ 1.1 a11topt>rpetu.1dón.

F.l dominio Alu induye las partt·s dt• RNA 7S dt'l <.,RP qm· )Jcinnan con c..·l RNA Alu.

El elemento de respuesta sérica (SER) es una wuJt'nd,l ck un promotor o rdor7ador .1c..tivadJ por lat1ort·s de transt riptiún inducido~ pur el tr,Hamit:nto con 'Ul'ro. que at1ivJ J lo~ ~c.·nc·' C)lll' t•,timulan el
H degradosoma e' un rompkjo de..· ..-mimas bact..-riana~ que in· duye actividade~ ck RNAJ'J y hdicas.1, quiz.í rclacion.Jda' wn la dc..•gr adadlÍn del RNA rn.

Un DNA de cadena negativa e~ la ~ecm•nda dt• I)NA de una 'ul.1 tJdt•nJ u•mplemt•ntariil dt·l RNA dl'l ¡lt'IHHJI,l tk un virus de cadl'IIJ positiva.

Un,l deleción t'' la diminadon de..· una \l'Cut•nda d..- ONA y la u m cm dt· ''" re¡,:ionn ,¡t uJdJ~ J c...1da lado. t'Xtl'pto en t•lt a~o dt' un.1 ddt•don tt•nnin,llt•n d t•:>.trt•mo dt• un cromo">ma.

l!l ONA de cadena positiva c..•s la radt·na dt• la wnrenciJ dúpkx que n·prl'<;enta a un rctroviru' ron 1.1 nti,rna \t't·uenda qm· d RNA.

l.a deleción clona! tlt•,c..rih..- la supre,iún de: una dona dt• linfo-

H ONA heterodúplex 'e ¡.:enc:ra por o~pan·amit·nto dt• ba~c·s en· trc..• radt·na\ írnka' llllllplt·mc..·mana~ prnvcnkntes de dift'rcnte' moll-e.. ul.1~ pmgcrntor.:r~ dúplex: se prc,enta durante la recomhi· n.1don ¡;nwtica.

dto,; puedt· \t'r inducida en der1.1' t•t,1pa' dd dc:\.lrrollo de los

linfot:ito'i. or.mdo lm su amígrno c..ognadu.

rt'rt>ptort·~

de..• amígt>no de ésto'> St' urwn a

La deri11a genética aleatoria dc..·,nibc..· la llurtuación JI .11.1r ('>in prc:sión ,dc•rtiva) ck lns grado' de rnanife~tación de dos a\dm en una pohlaciún. La~

desacetilasas de las histonas (HOAC) eliminan gntpm Jct·tiln de· !J' hbtlli!J\; put·dt•n vinculars..- c..·nn rt'presort's dt• la tran~­ mpdún. Oesmetilasa n d nomhn· inlormal de una t'n7ima que.· dimina ¡:n1p1>S mt•tilo. JllH In general dd l>NA. t•l RNA o la' protl'ÍnJ~. La desnaturalización dt· !.1~ pmtdnas c.k~uihc..· 'u umvc.•rsiiÍn a partir de !,1 conlormJfÍIÍn lisinlú¡!ica cm al~una otra (dc.·5al'li· vada). Un.1 desoxirribonucleasa c.·~ llll.l c.·n¡.ima qut> atac..a c.•nlarc~ dd ONA; pucdt• c..·onJr '1ilo 1111.1 c..ac.kn.lo Jmba\. Desplazamiento de cadena l'' un modo de.· rc.•plicadón ck al¡.:unns viru' dondt· una llllt'\ J c..dckna ck DNA crl'c..·e por desplal.amienlll de.· la prc.·vi.1 ¡hnnuilo¡:a) t•n la t•,uuC1ura dúplex. F.l desplazamiento de hendidura dt·~cribt• la taparidold tk la poli· llll'fiha 1 ck ONA de.· E. c.•li dt• u"t> Id inhihinún c.kl movimiento que on1rre ru.Htdo un rihosoma llq~a a un hay un aminn.1c..·il-RNAt ..:argado corr!'sp(lndic.·nte. Una determinante antigénica es la porl'ión de un antígeno rt·w· nocida por d rl'<"l'ptor dl' antígc.•no de lo~ lt·ucocito~. Tarnhién 't' llama epítupo. Se dice qm• una hélkc: es dextrógira 5i gira en cl sentido de Ja, mancdlla' del rduj. a lo largo delc.•jt• dt• la lu~lice. Un dímero de pirlmidina sr fom1a cuandc.• la irradiación uhra\inkta gencra un t'nlatc CO\' la inc..apacidad par.1 apareJr~e dt' c..kna~ rc:pas de D. mtlanogasttr debido a que ~~~~ hítoridn' \tlll c'itC:riles (aunque dc.•sde otros punro~ de vista podrían \t'r lt'nu·

típkamentc: normales).

850

Glosario

l.
rc..·.1~odadón

c.·spt•rac.la

Una ONA polimerasa l'' una rnzima c¡u1· 'intt·tiza cadt'na(sl hijal'>) dt· ()NA (dirigid,, por 11n molde..· dt• DNA). Cualqukr en· 1ima específica puc.•dc: formar pJrH' c.k un.J rcp.uJción o dupliradún (u de.· ambas).

~t·

rl'·

1·1 dominio carboxilo terminal (CTO) de la RNA polimc.·ra\a 11 eurariútica "' fo,forila .11 inicio y ~e relacion.1 rnn lJ c..oordinadún lit· varia~ .Ktividadt•s l'on transrripdún. El dominio citoplásmico t'\ la parte dt• hran,1 que..· ~e t·xpn·~J c..·n d dto~ol.

1111.1

proteína trall\lltt'ltl·

Fl dominio externo e~ la pJrtr de la protdna dt· la nwrnhr.l!la pla\lll.Ítil'J que 'e t'litÍl'ndt" lut>ra de: la télu!J. Al introdunr,t·. d dominio t'Xtl'rno dt· la protdna ~e extiende had.l la h11 (t•quivalt·ntc..· tnpolc'>~kn dc·l extt•rior de las célula~) dt· 1111 nr¡~andn . U dominio inmunitario 1'5 1111 'e):lllt'lltn clc·l gt'noma dt· 1111 lago (jlll' Jlt'rmite ,¡ un prufago impedir tjlll' un lago c1ditional dd rnhmo tiJil> infc:rtt• a IJ baoc.·ria. E,te dominio tit·m· 1111 ¡:nt qut• tudifica al rq>rt·~or. a~í
El dominio S t'S la wcucnda de: RNA 7S dd !:>RP qut• no dona nm Alu RNA.

't:'

rda-

Un Jrt.llr~" ck dos htbridos dt•tecta la illlt>rac.dc.ín t•ntrc..• du~ protc..·ína' por mc..·dio dt· ~u taparidad Jldra NA y t•nuno de activJciim dt·la tran,crrpdc-llt. Fl ,m,íli'h \t' hall' en levadura~ utili7Jndo un gt•n rt•pnrtt•ro qul' rt•spondt• .1 la intt•rJrd(m.

El DNA recomblnante de corte y empalme t'' producto dt> uuJ unilin HollidJy qu~ St' resuelve por l'l cnrtt• ck las C.ldc..•na' \111 illlt'rt.llllhio. Amba~ cadena' dd DNA ,mtt'' dl'l punto de.· inter,ambio provit·nen dt· u u cromo~uma; t'l DNA posterior al punto ck intt·r<Jmhio proviene dd rrnmu,omJ hnmúlogo.

La edición del RNA dt·~rriht' un carnhio de "'lll!'ncia ,.n el árnhito dt•l RNA dt·,put;~ ck la tran,cripc.i6n.

1·1 ONA repetitivo ~l· wmpuna tomo unJ rt·aHitín de: re.:~sociJ­ dcín. ya que en un c..omponentc hay mutht'c..ucnciJS (n·ladonada' o idéntica~). lo cu,11Jll'rlllitt• n·a~odar t·ualqukr par dt· \l'Clll'llddS l'Oillpkllll'nl.lTia\.

1'1 efecto de posidón abigarrado (PEV) e' el stll'IH iamil'nto dt• la l'Xprt·~iún ck 1111 ~t·n UllllO r<'~lllt.tdcl Jt: 'u pw,irnidad t·on IJ lll'tt•rc><..TomatinJ.

Una ONA replicasa t·~ lllta l'nlima que ~mtt'll/J ON A y rs t·spt·d· lit,1mentt' m·c.e~dria para la replicadún. El ONA satélite comt<~ c.ll' mue.. ha' rt'pt·tkion~~ en ~eric: (idéntifa~ o rdadonadas) de una unidad b.í~ic..a, wrta, de: repelidón.

El ONAc e\ un DNA complenlt'ntario dt· una 'ola l'adeua qut· l'orrc.•,punde a un RNA ~intctizado por transnipdt'm inH'rSJ 111 vitn,, d partir del RN i\. El dogma central ck~cribc IJ n.JturJil'/...1 b,ístCJ dt• la inlormadon ¡.!t"lltotic..a: la\ secuencias dc áddu\ nudeicos ptu·dcn pc:rpt"tll.lf'il" e intc..·rronvertir,t• por replicac..ión, transcripción y tramlnpcion inver~a. pero IJ traducdón de ándo\ nuclt·irm a proteínas l'' unidirec(lonal. pul'~ no 'e put'den rt·cuperar ~cc..uendas de áddm nudt'ico~ a panir tk \eruemia) de prutdnas. Un dominio de un nomti\Oilld puede rdair,t· ya 1t'a d una t·n tid.ul t'Structural ddinida o a un dominio t•n c:1 cual c:l 'u¡wrt>nroll,1micnto e~ indc:pt>ndiente de.• otro' dominios. o bim a 1111 domino t'Xtl'n~> que induya un ~en c..·xprt·,ado con mayor ,t·nsibilidad ,1 1,1 dt·gradadón por la en7ima DNAasa l.

El EF-Tu l'~ el fac..tor dt• dungadún q11e 1111e al .Jnllnoatll-RNAr y lo coh>tJ t'll d 'Hin A dt· un rilll>,ontJ hattt·riano.

Un elemento axial t•, 11na c..·,tnlt.tllra protl'ináu·a c.·n torno .1 !J 'l' nmdt·n,an lo\ l romn\oma' al ¡>rillllpio dt· la sinap~h.

e ual

El elemento central t'' una t"Stnlctura qut• yan· a la rnit.1d dd c.omplt·jn ~in,lpllmérnic..o. a h• largo dell'ual st• alirwan Jo, dt>· llll'llln., latrraks dl' lm t·romo"nna' hom6logo'; ntá ll•rnudo )liJt Jlfllll'Ítla\ Zip. Un elemento de control autónomo t'll d maí7., t·~ 1111 tr,ln~pn"in .Jt"tivo ton la rapJcidad de: tr.lnspont•r (t't>mp<~rar ron c..·lenwnto tk rontrolno a11túnorno). Un elemento de control no autónomo t•s un tr.1mpo"ín qllt' 1'!1 t•l rnai1 rndif!r,1 una transposasa no func.. ional; "ílo puedt" c.1U\.lr transpn~idúnt·n prt'~t·nc..ia dt> un miemhro .ltllt·momo de IJ mhrnJ 1.1miliJ qut· .Ktúc.· c:11 nmlormación tram. Un elemento de respuesta es una ~t'lllt'nci,1 t•n Ull promotor o rclor¡ador eutarioticp retonodda por 11n factor
L:.l elemento de respuesta a glucocorticoides ((,RFI c.·s una 'l'llll'll· dJ de 1111 promotor o potc.·rtCiador rcronodda por l'l rt•rcptnr de: glucorortitoidt•s y que ~t.> ac..tiva JX>r c..•st: tiptJ dt: c.•,tt•roidc.·.,.

Un elemento lateral c..•, unat·,truc..tur.1 dd complc:ju 'inaptont•mi· u> qut• ~e !orma al cnnc.lc..·rharw u11 par dt· nornátida~ ht·rntana\ c·n un cll'llll'Hto axiJI. Un elemento P t'' un tipo dl' trJil'l"~~•son l'll D. mel.m<'f!a.Hrr.

Lo' elementos de control dl'l nMÍ/ ~~~~~ unid.Hin sustc:ptiblc\ de trJIIspositi!Ín ori¡.:inalmt·ntc.· idrnlilk,ldJ\ ,ólo por sus propiedadt•' gc..·n~tit'J~. Put>tkn \t'r Jlltc'>rtoiiiJ' (n>n l"apaddad de t ran,pmil'itin inc..kp~:ndit·nte 1 " no aull·llloma~ hll\l'l'ptibks de: tr.ln,po,id
1-1 empalmosoma n un nunplc.·jo lorm.1do pnr IJ~ RNP\11 nc:ce'
l'll

una ra-

Lt encefalopatía espongiforme ovina ,., 1111.1 c..•nfnmcd.1d caus,ldcl por un agt>ntt' infc.•tTio"' t"omtituitlo por protl'Ína' (un príún).

1 ,,, endonucleasas de restricción rt•tonot·c..·ll \l'l ut'IKias l"nrta' e'pt·dlkas dl'l DNA y fra.:mt•rttJII IJ c·,truc..tur.J dc.'1pkx (en ocasione' t'll el 'ítio di,1rtJ. nt•n otro. ckpt'Jillkndo dt'l tipo). La~ endonucleasas rnmpt•n lo~ c.·niMt·~ dt· llllJ l'Jdl'rra de áddos nuddcliS; puedl'rt 'l'f cs¡wdlic..a~ ckl Rl'\A n d DNA de ca
UnJ endotoxina \l' t'lll'llt'lltra t'll la ~u¡wrficit• deJa, hac..tniJs granmt·¡.:ativa) (l'n contrapmic.itin a IJ~ t'lldotoxina~. 4uc: '"n 'l'c..rt·tada~). El LI'S l'\ un c.·jt·mplu dt• t·udotnxina. Urra enfermedad autolnmunitaria n un c.·stJdo patnlc.>gim t:n qut• la rnput·,t.J inmunitaria ~t· diri¡:t: tnntr.1 un .mJÍ¡:c..·no propio. l.a enfermedad de agalla de Crown t'' un Jumor que puedt' St'r mdutido en mucha' plant.1~ por infecdcín c..on 1.1 hac..1t·ria A!Jr"· J¡,¡
El entrecruzamiento t'' un intt·rc.-.1mhio rt'l'ÍJUOl'o ele rtl.ltl'rialc..·ntre nomo,om,l\ qut· \l' prl'\l'llt.l llur.lntt· la prolaw 1 de la nwio~i~ y \t' l'llfar¡:a dl' la recomhinadt'm ¡.:e11ética. La enzima central t·~ t•l l'Cllllpll'jo dl' ~uhunidadrs de.· RNA poliIIH'r,1'.1 nen·,aria JMr.1 la l'lon¡.tadt'>n. No im luyt• subunid.:~dt·, ddiciCIIhlk\ ni facture..'~ qut• podrian ~cr nel'c:~arim para l'l inído o la ll'mtinación . Lm rJmbim epigénicos influyen en d ll'notipo 'm modlfit,H , 1 ¡:l'notipo; ..:omhtt·n t:n mndilicacionc:' de: 1.1\ propic..'dadc..·' llc.·r• dada\ tk una l'l-lula. pe m no a·prl'sentan UIJ t•1rnhio 1'11 IJ 111fo matiun genética. Un episoma es un pl.í~m1do susrc-ptihlt> de mtc·~r.u \Jactt•riano.

A

Un epitopo (o <·piropo 1 es 1.1 porcic)rt ti<' un por lu~ rcceptort'\ de.· amige11m dl' lm I n lo 1 nomina dett'rlllill,mtt· .lnti¡.:l-nito

<.olo u o

851

El pa~o dt· escisión en un \Í\tt·ma dr reparación por t>~d~i!ln con\btt• t'n la diminación dt• una \ola tira de cadena Ú!llla de DNA pt•r la ,Kcí(on de una t•xonudt>c1,,1 5' a 3'.

do~ lo~

pronwtort·s. Lm f,1t1tlrt·~ ~.- ídentifkan como TF11X. dondt•

X t'' un.1 lt·t ra.

La escision dt· un lago o t•phoma u otra secut'IKía de\t·riht• \11 líbcr,ldún del cwmn~oma dl'l lwspedadnr como nwléu1la de DNA Jllllinoma.

Un factor de competencia nt•n·,ario para la replicaciún. \t' localiza en el núl'lt-o; '"'desactiva o dt·,truye dc~pul-s dt• un ddo dt• rt>plical'iún. Para qut" ottrrran citlm adidon.Jics dt• rt•plic<~ción . dt·bt·n provl'er~l" nue\'o~ lactorc:' de rompc.•tt·ncia.

l.a escisión imprecisa tknr lugar cuando l'l transpo~ón ~~· rt·tira dd ~itio dt• inst•rci<Ín original pero deja atrá~ algo dt• ~~~ ~t·rut•n­ da.

Un factor de ensamblaje t'S un.1 protl'Ína nen·~aria p.u.1 1,1 lorrnadtin tlt- un.1 e~truttur,1 m.1nonwletul,u. pero qul', t•n sí. no furm.1 parte dt· dkha estmctllr<:~.

escisión precisa dcsailw d n•tiro de un trarhpn.;ún m.h 1111.1 de la' \t't ut·nda' diana duplicada' del t romo\oma. lt-1111mcno qut· plll·dt· n•,tabkn·r la fu11.-itin t'11 el ~itiu donde \l' imata d t ratl\po,ol1 .

P.ua tt·rminM la ~intt·~b dl' prott•ína' y LJu~r la libt•r.Jdtín dt" la cadena pohpeptídita complt-ta y d ril>o~unra dt'l RNAm ~e requil"rl' dt• un factor de liberacion (RF) Lm lacton·, indi\'idualcs e,1.111 numt·rado\, l"ll tanto qut· lo~ t'lltJriütíco' st· llaman t•RF.

Un esp;~ciador e\ urhl \t'tllt•nd,1t'11 un gruro de ¡wm-.. t¡m· \t·parJ la\ mpia~ rt·¡wtidas de la unidad dt· transnipcit'm.

Un factor de maduración ,., una protdna tod1fkada pm un intnín de lo' ¡.:rupm 1 u IIE:; ~t' nt•te~it.l p.ui! tJilt" l"l RNA constituya la n>nformadtín .1t1iva qut' ,t• rt·quit·rt· rara l'l autm·mpalmt•.

1..1

El espaciador no tr;~nscrito t'' 1111 dominio t•ntn· unitladt'\ dt• trmN.ripdc'ln en un grupo dt· ¡¡t·rw' \eriados. 1..1 esporulación e' la ¡¡cnerddím dt· una t'!>pora por una harteria

(nu·diante wnver~iún rnorfolú¡:ka) o por unJ lt'\>Jdura (wnw ¡m1dUcto dt· la mein~i~). La eucromatina incluye )lran partt· del ¡¡cnomJ t'n el mídt•o en mterf,l,t•; prt'\l'nta menor t'IHtlllamknto que la ht'tl·rocromatin.J y cnntit•m· Id mayor 1)ar1c tk loo, !(l'nt·~ de una ~ola copia, anivos o Jlntcndalnll'ntt• activos. L,1 evolución coincidental dt·,uiht· una ~ituacíon t'll que do\ gt•t'Volutimran juntos, torno una \ola unidad.

lll''

La evolucion concertada dt•,niht· la t"apacidad dt• dm ¡:t·ne' n·· 1.1rin11adm para t>volucionar juntm, cnmn si rnn~tituyt·~t·n un \Oiu dtln. Ll exclusión aléliGl dcsaiht· Id ,..,pre,i{m de un \olo aldo t'll un linfndtn t'\llt"CÍ(ico I.JUC t:·ndilira la inmuno¡;:lohulin.t t'XJlrt''KHla por rctm,llirm·ntadím dl'l primt·r akln dt· inmtmo¡¡lnhulina t"X· pr~:~adoqut· t•vita 1.1 allivaritin dt• 1111.1 t'Opia cn l'l otro tromo'onl.l.

Un exón t'~ llldii.JUÍt"r !>l'!(llll'lllo de un ¡:t•n interrumpido repn·'-l'ntadoen d producto mJtluro dd RNA. Ll' exonucleasas fra¡¡mt"ntan los

nuckúlitlo~

uno a uno a partir del extremo dt· una t:atkna dt• polinuclt-ótidos; puetkn ~t·r l'\pe· dfita~ lliHJ lo~ l'Xtremn~ 5' o 3' dd ONA O el RNA. La' \ecucncías exteína w mantkrwn l'n la proteína madura pro-

dudda por l'l procc~amicntn dt• un y t•mpa lrrw tlt" proteínc1\.

prt:tur~cH

a

travl-~

dd tnrtt'

Un extremo de codificación M' produre durante la H·wrnhin.ldtin dt• lm gt•nt·~ tlt' inrnunoglohulinil y d rcn·ptor dt· t'dula~ T. 1m exrrt·mo' dt· wdificacitín 'on la' panes tnmindlc' dt' la' re¡:iont'\ dc coditit'ation V y J (DI !ragmcllladas. la uniún \Uh\lguit•ntl' dt· In~ t·,trt'mo~ dl' cndiliral'iún da lugar a una articui.Hilm tll" wdilililliún. Un eKtremo de señ~l '>l" produn· durant~ la retornbinadnn t!t' la inmunoglobulina y los ¡tt•rws dd rect>ptor de 1,1 célula T. Lo~ e>.tremos de Sl'ñal están dentro dt• lo~ límites del fra¡:mt·nw se¡Mrado qut• contiene la~ sccut·nda~ de ~eñal dt· n•n,mhinación. La ron~iguicnle uni(m tlt:: lo~ ntremns de ~cñc1l d,1 lu~,u a una un iún de 'eilal. Un factor basal es un factor de transcril>cilÍn requerido por la RNA pvlimcra<;a U paril fnnnar d complt:jo de inidaúún en to-

852

Glosario

Sl' rt·quit•rt· tk 1111 factor de transcripción ¡Mra que (,¡ RNA polirtll'f,1,.1 inirit· la transcripdún t'll un promotor cspt•cílico, Jll'W no~·, l'll sí pMil' dt· la l'll7ima. rl factor Rho (p) l'~ un.1 prott>ina implit.ad.1 t•n la J~htt·ntia a IJ RNA polimt•r,l\.l tlt· E...,,{¡ l'arJ linJliLar la transcripcitín t'll deno~ "tino, dt· tt•rminati6n tllam.1dt>\ \itío' dt' tt·rmin.ltion dt'pendil'nll'~ de rho).

El factor sigma t'\ la ~11humtlad dt• la polimt'rJ\d hatteriana de RNA nete~aria p.ua l.a inidadún; t·~ 1.1 inflm·nda prindpalt•n la ~l'll'Cdon

1!t>

promutort'~.

Lm factores de elongación (El· en prorariotas; eEF t'll t'llt.Uiota~)

\tlll prott•ina~ qm• ~t· \'inculan dt• ll\Jilt'ril drlita tí>ll lo~ ril'k•~o111.1' dur.ultt.' la aditit'm de tada arnino.iddo a la tJtll'r1.1 polipt·p!Ídrta. Los factores de iniciacion (IF en

pn~tariuta~;

dF t·n t'Ul'ariotilS)

,.,n protl'Ína' que ~t· vinntlau ron 1.1 o,uhunidad pt'tJlll'i'la del ribo\onl
La fijación cruzada \l' rl'lit>rt> a una posibk comecuencia dd en-

trt>l'rtllamicnto dt>,i¡;ual qut' permitl" la dhpn,iún de la mutatilín dt> un miembm dt' un ¡;rupo ~l'riatlo a través de todo d ronjulllo (o ~u dimini!dón~. L.1s ~~·cut'IKia' finalizadoras dependientes de rho son la~ que conduyt·n la trano,cripcit'm por la RNA pnlinwra~a h.lcteriana t'll prt•sencia dd lanor rho. En las levaduras, un flujo activador de corriente ascendente (UAS) l'quivale al potend,1dor en 1,1s eucariota~ m.1s elevadas y se unt" a 1.1s prott·ína~ (;Ar..t dd artivador trJmcrlpcional. él flujo ascendente identilka ~t'CUl'llt'ÜJ\ l'll dirt•uit'm de la t'"-llfl''iún oput'~ta; por t•jcmpln, d promotor l•J~1rri.¡no co,tá t'n flujo a)cendt•m•· rl'\('l'tto tk la unidad n· ~petto dd dominio t'ndilrC.ldnr. La forma 8 dd DNA l'~ un.1 hélice dúplt·x dt•rt·l'ha con dia p.ut:' de hast'' por ¡¡iw wmpletu ( 360''C) dt· la hdiu·; t'' J.¡ lt•rma t¡llt' se t•ntuenllat·n la' tondidon<.'~ fhiult",¡¡ka~ tuya ntnlllur.t lul' pmput'\ta por Cril'J.. y Wabon.

Ll fotorreactivación han· 11\0 dt· una t'll/Íma dt·¡ll'ndicntt' de la

lu7 blJnl'.J p.u.t fragmentar díni\'Ttl' tll- pirinmlina-ciclobutano fnrrnado\ por 1,1 lu7 ultraviult•ta. 1.<~

fragmentacion de cadena dúplex (DSB) tit'llt' lu¡~ar cuando arnlatlt-na\ tlt· un I>"'A dúplt-x ~t· frJ¡¡rnt·nt.1n t•n l'l mhmo ~itio. 1 a recombinacinn g<'n~tica ~t· inki.1 rm·dlante la rotur,1 d(' la~ tadcna' th'tplt-x. La n!lula tambil'u lirlll' ,¡,¡~·m,l' tk rt:p.aradútt qut> !lt•van .1 1-.1ho \ll t.ue.1 t'll rotur,1, tlt• ditha
El fragmento acéntrico tk un ntunc"oma . J!t·m·rado por rormil. t.lrt'l'l' dt· n·ntrúmt·ru y 'l' picrdt• en la divl\itín n·hlla r. Lo~

fragmentos de Okazaki ~on la~ tadt·na' hn·ve~ tlt• 1 000 .1 2 ooo hase~ ..¡uc o,e produren tlurantt· la rt•plicat;tin tll~<·tmtintt,1 : dc~pué~ ~~· lllll'll dl' ru,mer,lllWJit•ntt· t•n 1111.1 latlena íntt•¡:ra.

Los genes del choque térmico ~un un conjumo de ~1111•\ Jtlr\.Jtlo~ t'n rt·~pm· sta a 1111 ,Hrrncnto de tcmpt·r.atura (y otra' J~rt·,lout• tnntra una célula). Todo\ lo~ organi~mm lm tit·m·n; 'u' pro· dtll'tn~ ~udt'n incluir tltapt'rones. que at:ttían \ohrt· prutt·art.r' dt·,natura l iLatla~ . Los genes domésticos 'on (tt·úri<·arnt>ntt•) lo" quc \l" t•xprt·,,m t'll toda' la~ ct-hrlas porqut• provt•en funciom•s h.hica~ nt•re,;¡ria ... pJra d mantenimterllo de todm los tipm de células. Lo' genes extranucleares n·,itlt-n lucra tkl ntíclt•o. t•n orgando'> torno la' mitormuiria' y lm dnrnpla~to~ . Ln~ genes intermedios 'on !(t'nl·~ de lago~ rl'J:!Uiados por las prutdn.l', todilicad,l\ por ~t·nt•, tt.· rnprano~. Al~unJ\ protdnas nxlilitadao, por gt'lll'' intt·rnw
Ln'> genes no alélicos ~on do~ (o más) copia~ dl'l rnhmo gt·n prl''entl'' t•n lt~t·alitJtione\ díl't'l')a,, dl'l gt'ltotna (a dilcrenda de lo' a Idos, qul' \Oll t opia' tlt· 1111 mismo ¡¡t•n prm·t·nit'ntl'~ dt> dilt>rt·ntt"~ prugenilllrt>~ y t¡Ut' ~e pn·st'ntiln <·n la rni~ma localización ~·n los tromusoma~ homlÍio~o~) . Lo~ genes tardíos \l' trauo,criht•n t'uando ~e lk\'a a cabo la rl'plil•luon dd DNA; totlilican lo~ compunt•ntt:~ de la partícu la dd 1.1g().

Los genes tempranos ~~· tramnibt·n ilntt'' dt• la replicación del DNA dl"l lago; totltlit.HI r.-guladorl'~ y otra' proteína\ nece~ari.l\ Jldld la~ etapa' po,tt· riort·~ de la inft-rcitin. El genoma t'' d ronjuntt1 rompkto dt• \t'llll'llt'ia' dd matnial ¡.:ent'tico dt• un organismo. lnduyt• la \l'l'lll'Jll'ia de l·ada l'nmw~oma má~ cualtjukr llNA prt·~entc t·n or¡.:ando~.

Un genoma extracromosómico en una bacteria t:\ un (onjunto dt• con autorreplitadún que no lornr.tn parte del uomu~orn.1 hat.1eriano. én llllltlro' ta\o\, los gene~ ~on 11l'l'l'!>
Una mutatilin tlt· ganancia de función 'uelt• relt-rir~l' a 1.1 lJllt' t"au~a un .Htmt•nto dt· la actividad normaltkl¡¡en. E11 ot'a,iont·s repre~t·nta la Jdtluisidtin de ciertas prnpit:datft·~ annrrn
Una familia de genes con~ta tito 1111 conjunto de ~l'lll'~ t'n un gt·noma tJIIt' totlilkan prolt'lll.l~ rd.uionada' o itll'·ntka,, o RNA. Su~ mil'mhm' 'e dcriv,uun por duplit'Jritin dt· 1111 gcn ,lfl(t''tral. \\')lUida tlt· la .Jtumulauun tlt· ramhim tll' ~t·et•t· noa t'lltrt· la' t"opia~. Muy ,1 ml'nndt•, In' mit•rnhw' dt• 11na larnilia t'St.irt rdadmlathl\, pt·ro no \un idt'ntico~ .

Un gen t'\ 1111 \t'gnwnto dt• DNt\ qut.· e\pcrilka una radena polipc.·ptídicJ: induyl" re¡.:iont>~ pn·n·dt·nte\ o ltlll\t'cutivas a la dt· rodifit..Kitín (lídt·r y dl' n:mulqm· ). ,1o,í wrn••l.1' \t'Cuenda\ irHt>rrncdia' (irllrolle\) t'lltrt· ~cgmt·ntos de rodilil'adón indi\ idualt·s

La fase S l''> Id partt• restringida dd ddo dt· la rl'·lult~ t'Utariútica durantt· 1,1 tual tit·m· lugar 1.1 \Íilll''i' dt· DNA.

Un gen en sentido opuesto (odi!k.1 1111 RNA (t>n ~entido oput·~to) qul' tiene una wnlt'IKia complemt•ntaria dc un nNA qul' con\tituyt• \U dtana.

La fase vegetativa dt'scrihr d ¡wriodtl dt• rrt•dmientn y divi\tllll normalt'\ dr una bancriJ; t'll d ta'o dt• la tlUt' pucde producir t'\Jiora\, t'\10 wntra~ta ton l.a fa\t' tk csporuladiÍn. t"uamln 'l' t'\tán formando la~ t•spura,.

Lm genes de lujo ~(111 los qm· codilil'.m 1.1 'llltt'''' t'n ¡.:r.mtlc' cantidadt·, tk prodtll'tus con lundom·' t·~pt'll
(t>XOill'S).

Un gen estructural tot.hlil.t cualquier R:'IIA o productu protdnico diferent<' a un n•gulatlur.

La fibra de 10 nm e~ una t'\lrtll'lura lineal de nudeo~om,l\ qut· re~ulta dd dt'\jllie~ue d(' \11 l'tlllditirHI natural de t'WIUJilllJ.

Un gen regulador codifica un producto (por lo ¡:eneral Lllld protl'Ína) qut" u•mn•la la e).prt>~iún de ullo~ gt·ne' lnorm<Jim<•nte en el .irnbiw de Id transcripción).

La fibra de 30 mm es una l''pirill espt•dal dl' nucknsumas que corrt•sponde al nivel b,him de urganiucinn de lo~ nudt·u~nma~ en la cromatin.1.

Un gen V l'\ la wdilkaliún de \t"l'lll'lllÍcl\ JliHil la mayor partl' del dominio variahlt> (tt'rminal Nl Je Ull.l taclenJ de inmullll)lluhulina.

La fijttción e~ el proreso por l'l que un nm·vo alt-lo \U\tituye a aquel que antt'~ pn·dominaba t•n una publaciún.

Lns genes C codiHc,m 1.1s regiones const.Jntt'' dt' las cadenils protl'rnica~ dt• las inmuno11lobullnas.

Fl GMP-PCP , .._ 11n an,\ln~o tfd (,TP t¡nt• no ptlt"dt: hidroli7.<~r,l': '~' tllilil.a para dt'terrninar en qu.: etapa dt· 1111a rcacdún 'e requiere dt• hidrüli\b dt· liT!'. St• m.1 un gradiente de densidad para ~~·parar rnnl~nda~ con ha~l' t•n dilt:rt·nda' de dt·n,idad. Se prt'par.a a partir dt> un l'ompue~to \OIUIJJl' Jle~do, llllliO t') C\CJ. 1:1 grado de rt'SJI!lt''t.l tll' un ,i,tt·ma t•n au~enda dt> un cstímulo rom:~pondc J ~u grado basal. (El grado ba"1l de la tramcriptitin
Un grupo de compatibilidad de pliÍsmidn' umtil'nc rnit-rnbrm qut· no pu.-dcn ltll.>.i~llr {'11 la nu,rna célula l>.~tteriJna. Un grupo de complementación t'\ una 't:rit· de mutadnnt·~ qut· no punte-n tompkmentar;t• lllando ~•· e~tud1an t'n t.ollllllnJllmlt'' pareada~ en trr.1m; ddine a una unidad genétit'a {< btnin 1 Fl haplotipo <'' 1.1 comhi nación e~pt•cífica de .:~Ido• dt· un tfn minio definido dt: .1l~tin tromo,oma. t:\ tkdr. l'i)lt•rwtipo t'll miniatura. Originalml'nte 't.> utililaha p.1r,1 dt•strthtr tt>mhrn l'iont·~ tk aldo\ del MHC. pl'ro hoy ~t·put•dt· u,.tr para •h , r l•u combinaciones particulan·s tk RFLP. ~NI' y ullo m.111 "'"" "

Llosa no

853

Un hapteno t"> una mol~u1la ¡>l"QUI."t)a que actúa l'omo amíg~:no ruando se conjuga wn una protdna. La Hb anti-Lepore t''i un gen de..· fu,iún producidv por ~:ntrt•rru­ .tarmento no l'quitcltivu QUl' ronti<•m• las panl"i terminal N de la ~-glohina y terminal e dl' la S-globina t·~ un¡:~:n dt• fu~ión produddo por entrt·rru7.amiento no c.-t¡uivalentl." t•ntre 1m ¡:enes de las "y y~ glohlna~.

L.a Hb Kenia

La Hb Lepore 1."\ una globina inu~ual producto dclt•ntrcau/,1· micnro nu c.-quivalt•nte entre lo~ gl."nes ~ y o. Los gcm·, 'l' fusionan par.1 prndudr 1111a tadena que simula una 13 únif,1 con\· tituida por la ~el"lll"lllÍa tt•nninal N dl' unida a la st•t-ut'rll"ia tt•rmin.1l e dt•l\

o

L! t•nft·rnlt'dad HbH l'' produnn dt• un tra~torno en el que St' ob~l"f\'an

rantid.ldl"' dt•sprupnn:ionada' de un tetrámero mal rcspt'Chl dt· una hc..·mnglobma nnmt.1l (a1 f' 2 ).

13, anor-

Una helicasa e~ utltl enlima que utili7a c..•m•rgía pmvhta pur la hidrúli~h dd ATP para separar las cadc..·na~ dt' un áddo nudt•im dúplt·x. El 'egnu·ntn hélfce-giro-hélice dcscrihe un conjunto di." dus ht'· lict'\ a quc..· lnrma un \itio que \e une al DNA: unJ se aju~ta al \Urtu mayor del ONA y otra lo atraviesa. Fl ~q~mento helice-luo-helice (HLH) ~l' encargd de Id dimt•ri7.a· c..1on de und dast· dt• fat1on~., dt· tran~cript;ún llamado> proteínas HLH. Una protl'Ína hHLIItil'rw una \eCut'tKia bá~ica dt• unhín al DNi\ Cl'Tl'ana al 't'gnwnto tfe dimeri1ación. l.a hélice de reconodmiento t·~ una dt• la' do~ del ~l'¡,:mt·nto h¿lict'·giro-hi·lin· qllt' t'\tahlt•n· ~.:ontdtto' con el DNA c~pecílkos para ciert.l\ hast·~. lo cual detnmina la t·~pccifkidad dt• la) ~c..·· CUl'lll"Ía~ dd I>N i\ qUt' St' Ulll'll. Un \Íiin hemimetilado l'' una \enremia palindrúmita mt·tilada en \Úlo una t\1dt·na dl'l DNA. El DNA hemimetilado prt•,enta ~rupo'> metilo en una tadc..·nd de una wcut·mia diana qul' tit·nt• una dtosina t•n tada cadt•na. La herenda citoplasmlc;a es una propiedad di." lcl!. gcnt•s localil..J· t'll la\ mllutmldnas o lo~ duroplastos.

do~

La herenda matuna dt·~cribc la supervivenda prell'rc.-ncialt•n la progemc dt• m.ut·admt'\ ¡,:énit'os provistos por un prog\'llitor. La heterocromatina de,~rthe regionl') dl'l gcnoma altamente con· dt•mada' qut• no ~e t ramuibcn y pre~cntan rcpliraciún tanh.1. ld heteroc:rumatin.J pucdt• St'r dt· dos tipos. con~titutiva y fatultativa.

Ld heterocromatina constitutiva dc)cribe rl estado int'rtt• dt• ~e· cucncia~ ¡wrmam·ntcmeme no expresadas, por lo gt•nrral DNi\ satt'litt•s. La heterocromatina facultativa dt·~aibe el estado irH'rtl' de las ~ecuenda-; que tamoit:n ~e t•nwcntra en copias activas, por ejemplo. el uomo~oma X de mamífero de la) hc::rnl"tras dt' los mamíferos. Un heteromultimero e~ 11na proteínd l'Oil'itituida por )Ubunidadc) no idénticas !codificadas por difert'ntes genes). Una célula Hfr es una baneria con plásmído F integrado t'n el cromosoma. Hfr significa recombinarión de aha frecuenlia. c..·s dedr, que se transfieren genes nomosómicos dc..· una célula Hlr a una tt~lula F más a menudo que de una célula F·. L.a hibridación de\tribe el aparcamiento de RNA complementa-

rios y cadenas de:: ONA que

854

Glosario

re~ulta

en un h.Jbrido R.NA-DNA.

La hibridación dd DNA de\~ribe la rcnaturali7.<~ciún dc una t'S· tructura tiúplcx a panir de radt>na) únicas qm• se obtuvieron por dematuralilcldón del ONA de cadt•na dúpl<-x. La hibridadon in situ se lkva a t:abn por dt'Mlatur.:~lilación dd DNA dt• r~lula' comprimida) t'll una laminilla. d<· manera que \l.'cl pmihk la rt·acción al agregar RNA o DNA di." una sola cadc:· na; la ¡m·paralión agregada se marca dt• mam·r.:~ radioaniva y su hibridadc'm )t' vigila por autorradiu¡.:rafía. Fl hibridoma rorn·~ponde a una lmca u·lular l>ruducida por la fu,iún d1.· rC:Iula~ dclmklomJ um un linlodtu; c..·xprc~a mddinidanll'ntt• la~ inmuno¡:l obulin.1~ de:: amho~ padre~ . La hidropesía fetal e~ una enkrmt'dad rnort.ll producto dt• •lll~encia clt-1 ¡.t<'n dt• !.:1 hemoglobin.:1 a. Caden.1 hija o dilplex tk DNA !>l' rl'fiert• al DNi\ rt·tit:ll

1.:~

~intt'ti­

z.:~dn.

L.a hipermutación de\Cribe la intmdmdún dt' mut.:Jdollt"i \omálita~ en un ¡ten dt• inmunoglobulina n•e,tmllurado. La' mutacione' pueden cambiar la ~ecuenda del antkut·rpu corre~pondlen­ tc..·. 1."11 e,pt•cial en \ll ~itio de uninn dt• antí~t·nc>. La hlpóte5is de un solo cromosoma X dt">cri~ la ck..anivaciún dt' un rrcmw\oma X en lo~ mamífero' dt• '-t'J..U ftornenlnu.

se refiert• a la capacidad ckl RNAI de n·t:onocer má' de un rodún a l.1u\,1 tlt• ap.ul' desusado (no-G-C. no·A· T) con la tercera ba~t· dt• un etHitíll. La hipótesis del balanceo

Un.1 histona central e' uno dt• dt• lo' rualro tlpm dt• hbtonas (H2A. 1128. 113. 114) qul' )l' t·ncut·ntr.1 t'll la partícula n·rllral dt•riv.lda del nudco~oma (excluye 1,1 hi~tcma H 1). La~ histonas ~•m proteína' dt• uniiln dt• DNA tomt•rv,ltlas que forman la 'uhunidad há~ira de la nomatin.l l'll l,l\ t·urariutas. 1.,1, hi,tolla' H2A. 112B. H3. y 114 lorm.m 1111 tt'lltn> m1.1111~rico t'll tumu al ntJI ~t· enrolla el ONA para formJr un IIUt:kmoma. La hi\tuna 111 e~ c.-'tcrna respcl1o del nudeusuma .

Elle•• m HLA. prindpal cnmplt•ju dt· hblul"umpaubilldad humana. e~ un gmpo dt• gt•nc\ del crnmthonM 6 <Jllt' toclifkall proteínas p.u.ll,, prewntad{>n dt• antígeno,. dllldna' y prutt•ína\ dd tom· pkmcntu. 1a hoja de trébol describt• la l'\trunura tkl RNAt l'll do' di-

mt·n.,ione' qut· forma tuatro brazo), um dit'ntl'S.

\ll~

la1o'

torrt·~pon­

Una t'~l runurJ Holtiday c..·s una formadon illlt'rmt•dia tk la rewmhinad(m hormíloga para la que dm I>Ni\ dúpkx \t' ronet1an pur d matl'rial ¡:t·n~tico intt·rramhiado l'lltrt• do, dt• 1.:~' 1.11atro radcna~. una dt• cada par. Se ditc que tilla molén1l,1 dt• unicín ~t· rt•suclvt' cuando la~ mue~~·1' de la l''tnlrtur.1 rt'\tableft•n l,1s cadt·na~ düplc..·x dt· DNA separada~. 1.<~ hotoenzima RNi\ polimcra5a e\ la lorma comflt.'h?llte p<~ra iniciar la transcripciún: consta dt• tuatrn \Ubunidildt·~ de la en11ma mt·dular y el fal1or o.

F.l homeodominio es un segmento dt• uniún dell>Ni\ tJllt' tipilita una dasl' de factorl"s dt' tramt·ripdún . La \l'lliCilt'lJ dt• DNA que lo nKhfica ~e llama homeocaja. Un homomultimero es una pmteína romtituid.1 ptlr 'ubunidadt·., idéntit.a~.

Una horquilla de replicación es el punto t'n quc ~l' wparan la~ cadt•na~ del DNA progenitor dúplclC. dt• modo qut• la rl'plicaci<ín .wancc. Fn la horquilla se encuemra un compll'jo de protc..·ma~ que incluye DNA polimera"tl.

Huella genética t'~ un tamhio en un ¡.!en <JUC ootrr(' dur.mtt• el paso a travt'' dd t•spcrrnatozoide u ovodtu. de modo qut• de-.de !.:1~ primera' etapa-;, los alelos palerno\ y mall'rnm dd t•mbriún lit•nell dilt•rt·ntc\ pmpicdades; e~ producto dt• la mt•tilaciún del DNA.

IF-1 l'S un fat1or de iniciadón bacteriano qut• t'\lahlli7.1 l'l wmplt•jo dt' illit·iad<ín .

JF-2 t'' u11 lac:tor dt• ínidari(m ban<•rianc> qul' um· c::l RNA1 ini· dadm con t•l wmplt'jo de inidadcín. la~ o;uh· c..·n d RNAm .

IF-3 t'\ un fal'tor tic..· iniciadún bacteriano n·qucridn pur unid;uk~ 105 para uninc .:1 los sitio) dt• inkiadcín Tamh~t•n irnpitlt• que las suhunidade~ 30$ \e u11.111

a la~

~ubuni·

dadc..•' 50~. La lmpr•slón de hudlas e~ una técnica clt' rar.lltt'rilat.ion dd !>Ítiu dt• O !'loA al qut· 'l' llnt' alguna proteína en virtud di." lc1 prntt•tdtín de t•nl.ltt'' wntra d a laque de la) nudt·a"a' t•n t'\t' dominio.

Incisión t'' un pa\o en un ~i~tema dt• aparcamll'lllu errcíneo. Una t'lldunuclt'a\a re~nnou· la 1ona del DNA datiada y la ai~l.1. corlandn la radt•n.J a 11110 y otro lado.

Inmunidad adaptativa es la rcspue~ta mt·thad.J 1"" lmh>CIIo' at1r ,·adu~ JlllT su interacdón t>\¡>edfila t:un antí~~·no' ht.l n·,put·,ta ~ pcrkcll c'timuladm p.11.1 proh ft'rar y cnnvenirsc..· l'n célula\ elt'Unra,. Es la fundon t•mar¡,:,ula de la nwmoria inmunitaria. La inmunidad adquirida t'\ otra dt·nummación de la inmunid.ul adaptativ,l . Inmunidad en tos fagos ~~· n·tit·rc .1 la rapaddad d t• un prola¡:o de evitar que otro f'a¡:o c.lt-1 mimw tipo iufcl"le a una célula. b produno de la ~íntt·'i' dt• 1111 r~·prt·~or dt• lago por el gt·noma dd profago. Inmunidad en los ptásmidos w rcficrt• a '" c.apatidad para evitar que otro dt'l mi,mo tipo ~c..· e~tahlclra 1.'11 una rdula; sucll' ~er produt1o de.· intl'rkrcncia5 um la capaddad dt• rl'plicadón. Inmunidad innata ('' la re,pttl'\ta rápida nwdiada por et:lula' a través d(• rereptt>rcs no variahk' tcodifkados t'n la línc::a ger· minativa) que rt·ronoet·n patcigt•nn~ . Ld\ t~lulas de la rcspue,ta inmunitaria inr1<1ta dttúan para eliminar al patógt'no e iniciar la rt•,pucSia inmunitana ada(ltativü. Una inmunoglobutlna t'' una pmteína prndudda por R qut> 'e une a un antí¡:c.•no particular.

la~ r~lula~

La inducción ~t· rt•tit·rt· a la capacidad dt• la~ hattcriil\ (o lt·vadu· ra~) para o;mtt•ti7.U Cierta) enzima!> scilu tuarulo t'\t.Ín prt'\l'lltt'\ ~u' \ll\tratu\, aplicada a la exprrsicín gcnétka. \l' rdkrt• .1 un tamh!ut'll 1.1 tramrripcicín como rt'\Uit.ldo dt• la inlt'rdnhín tkl indmtor wn la prntl'Ína reguladora.

La Inr t') la 'C.'(Ul'tll"ia d<· un protnotm polllt·ntrt• -1 y +5; tiene

La lnduccion de un profago d<·o;crihc ~~~ in~re~u al ddn lítim (in· ft•t'l'ioso) tomo lt,ultado de la deMrucdún dd rt•prc,or li~ogénl· l"O qut• lleva .1 la ~''ri~i(m dt•l DN A del fago lihrt• dd c..romo,oma

Una inserción es la atlidon dt• 1111 fr,1¡,:nwntn de pares de ba~e~ en t•l DNA. l.as duplic:adt>llt'~ \Oil 1111a da\t' t·,pecial de inserdom·s.

hanc..•ri<~no .

Un inductor ,., una pt·qut•ña molétula que dt·wnt'adt•n,1la trammi,ic'm )ll'IH:tica por unr6n a una prntdna rt•guladora.

El término inserción de intrón dt•,crihl' la capacidad de cierto' imrones para intrndut:ir't' c..·n 1111 DNi\ diana. La rcac..·dcín l"'i t'~­ pcnfka para una \VIa St'nlt'lll"ia diana.

Lo\ Inductores gntuitos )ímul.1n aut~nlln>~ indunurt'\ dt• tran'cripti(m, ¡~t·mno '"n ""trato~ de la) cn1imd~ 111duddas.

~a

La infección lítica de una haneria por un fagn t1.·rmina t'tln la tll'strucdun dt• .1quélla y la liberad
lnfecdón tardía t·~ 1.1 partt• del del o lítico dt'l lago. dt• la rt•plka. dcín dd I>NA a la Ibis dt· la célula. Durantl" l"'óe ¡writ>dn. d DNA \l' rt•plica y w '>inteti7.111 In~ cumpunentc\ c~trutturalt•) dt• Id partkula del lago. l.a Infección temprana t') la parte del rido lítim dd fa¡:o tlt· l>NA e11tre "' ln¡:rt·~o y rt·plicación. Duralllt' dkho ¡wriotlo, d 1.1¡,:u 'intt•tila 1,1\ t'll7illlJ~ IICtc~arias para la repllcacitíu de ,u DNA . l.a información posicional describe la localindcín de 1,1) mJt"TO· 111oll-nlla' en 'itio\ partirulart'~ de un embrión. qut'. t•n ~í. pucdt• \l'r Utl.l fnrn1.1 tlt• inlormaciún heredadil. La inidad6n dt•\nltw la<; e1apas de tran~id6n ha,ta la ~íntt•sis dt·l primc..·r cnlan· t•n el RNA t' incluye la union de la RNA pnlim~:­ ra~a al promcllllT y la dimlurión dc un dominio corto dd DNA para formar cadcna' únkas. l.a inldad6n abortiva dt"5~·tibe un procc)o t'n que la RNA pt>llllll'· ra.,a inída la tran~cripción y termina antes de qut• haya dejadu al pronwwr. aunque después se reinida; pueden pmdudrw vario~ ciclo' ante\ de que prindpie la etapa de clung.ldun. Inmunidad ~e rl."tiere a la capacidad de tit·no' tr,m~posonc~ para evitar que lllros del nu~mo tipo pre~entcn tramposidón a la rnl\md mol~cula de DNA.

la "eruenria gt•nt•ral Py1 CAPy,. pmihle.

E~

l'l pmmotc>r pol ll más sendllo

Un intasoma e' un complejo de proteína~ y DNA entrt• la integra· dd lago laml>da (hll) y el !>itiu dt• in'>ertiun dd mi~mo tartP).

La integración dt• una "l't·ucnda vírka n dt• olro ONA desuibe '" inSt·rdón en l'l genmna dt' un 1111\pedadnr. tomo un donúnio unido de manera owalentt• a ~.ualquier ladt> de las sccucmia' dt• 6tl".

Unc1 integnsa <.·~ una t'lllima CJUt' \t' t•ncarga de una recmnbinannn dt' )itiu e~pedfko por la qut• ~l' in\en.l una molt.'cula de ONA t'n utra. Una inteína t'' la partc..• qttl' ~~· rt•tiril dt• una protl'Ína prnccsada por reme y empalmt• dt• prutdna~. La~ intercadenas ~on re¡tiont'\ rt•l,lt iv.lmentt' dispt·r~as de nomo\oma' politénku~ e¡ u c..· se ent uent ran l'nt rt· las radt·na,.

El intercambio de una sota cadena t•s una reacción en la qut· 1111a dt' las cadt•na~ dl' un DNA dllpll'X deja a su socia prcvic1 y. en su lugar. se apare.! c..on la tadcna complementaria 1k otril molécula. dcspla7.andu a la homc'>loga t•n la SCI(Unda ~·,tru
Glosario

855

Un intrón es un st•gmenw de 0:-.IA que se transcribe. pero des · pués st• eh mina dt'l productu dt• transcripción por corte y empal· me dt·la' ~etuenda' (t•xcmes) de uno y otro lado. Las pn\idnne\ lnvari¡bles de la~ bases del Ri\At tienen el mismo

nuclt·,íticln t·n virtualnll'ntl' todos los RNAt (>95%) . Fl moddo dt• inversión de señal dt·scribe rl mecanismo dt· la ¡.:ira\a dt• DNA. la cual u m· un mhrq.dro positivo (induciendo un ~obre¡.:iro m·~alivo mm¡ll'mador en otra parte dt'l DNA dn:ul.u n·rrado) , rom¡w amiM\ cadena' t•n una dúplex. pa'a a travl'' de la otra dltp)r)C y la~ rt·~t·lla. Un islote CpG t•n d ¡.:t·noma dl.· un mamíft:ro t:~ un fragmento dt• 1 a 2 kb. riw t•n pare\ CpG nu mctilados. lm Islotes Bam \Oil lllld \l'rtt' de \t'l.uencias lUrla' rt'petida' qut• st• t•muentr.lll en l'1 espaciador no transcriw de los ~ent•s dt•l DNAr de anfibio' dd género XmCipus. El nombre refkja ~u aisla· miento mt•dianH· 1.1 t'tllima dt• rc~tricción Baml. Los isoesquizómeros ~un cmima~ dt> rt>stricdón que fragmentan la mi\111.1 ~etut•mla dt· I>NA pero se ven afectadas de mant·ra diferente por \U t'\tado de mt.•tiladún. Lo' isómeros topológicos ~on nuMcul.ts dt• DNA idéntit'as. t' )Ctep· ro pm una dlftort•nda t•n d númt·ro de enlace<;. kilobase t'' una mt•thtl.ltk lon¡.:itud que st' puedt· mar para rdt· · rirw o~l DNA ( 1 noo pcHt'\ de hast''l o d RNA ( 1 000 hase\).

Un lipopolisacárido (LPS) es una mol¿cula que wntiene componente) lipídic.:os y azúcares; SI.' encuentra en la mc.:•mhrana t'\trrna dc.:· bactt·ria~ gramnegativas. T.tmha: n I.'S una endotoxi· na encar~ada de la inducción del thoque séptico durante una infecdún.

Una metilasa de mantenimiento agrega un grupo mc.:·tilo a un diana qur ya e)tá hemimetilado.

Una metilasa nueva agrega un grupo metilo a una '>ecuenda dia· na no mt•tilada en el DNA.

del DNA para del><:nt'adt·nar nna vfa que lleva a un t·a mhJnt·n 1.1 ~l'CUl'ncia del DNA.

1...1 lisis dt·,nihe la mut·rtc de las bactt•ria~ alt~rmino tk un ciclo dt• inft•rdcin por un lago. cuando e)t.tllan par.1 liht•rar la prQKenil' dt• un lago infrccioso (porque las en/ima\ del fa¡¡u rompen la' membr.1na' ciloplá~micas o la pared n·lular dt• la hacteria) . El mi~mo término \l' aplka tambii·n a la' n:lul,l\ t•m·,uuítira\, por ejcmpinl'uando la~ célula~ in !t-etada~ ~<111 .ltJtadcl~ por d )Í~tema inmunitario.

Una metiltransferasa es una rn1irna que agrl.'ga un grupo mt·tilu a un \11\tratn. ya ~e.1 una molécula pequeña. una protl'Ína o 1111 árido nuclrico.

La' mutaciones permeables dejan alguna función re,idual. por t•jt·mplo. ruando la proteína mutantt• t·~ pardalmente activa lt·n l'l caso de una mutación dl.• amino.íddo), o tuando 'u kttura produce una pcqueria tantcdad tlt• protl'ina dt• tipo silvt'~lrc (t·n l'l caso de una mutaciún rt·rminadora) .

La lisogeni¡ de,uihe la capacidad dt• 1111 fa¡,¡o para \ohn:vivir t•n clintt•rior de una haneria wmo rompunt•nte pmfagut·~table dr ~u ¡¡ennma . Un locus e) la posilillll donde n·~ídt· d ~en de un ra\1(11 partitular t•n un umn•l\llma. d cual puede ser ocupado por c.:ualqukra de lo~ a lelos dl'l ¡¡en. El locus H2 e) el complejo mayor dt· hbtuwmp.:~tibilidad del ra · tl)n. gmpn de gem-s del cromo\oma 17 qut• todJfit.an proteínas para pre~t·ntaciún de antígenos. dtodnas y pruteínas del complc:nwntn.

na~

La kirromlclna e~ un ilntibiútiw qut· inhilw la ~ínte'i' dt· prntl'f· al .Ktu,u ~ohrt• t•l EF· Tu.

El mantenimiento estructural de los cromosomas (SMC) de~crlhe a un grupo dt• proteína~. induida' la' wlw~lna~. que lll.llllit'lll'n juma~ a l.:J\ uom.itíd.Js hermana~. y la, wndl'll\ln,l\, qm· parti· dpan l'n la condemaci!Ín dt· los crorno,oma,,

Fl kuru e' unc1 t•nkrmedat.l m•urolti~ica humana tilu~ada por prinnt'~; puedt• \t'r pn~tlut·tu de lil ln~w~tión de 'e~o~ inlcuado,.

Un mapa de restricción e~ un arreglo lint·al ck \ilim dd l>NA fragmentadm por la al-cic'm dt• divt•f\,1\ t'n7lma' de re~triccit'ln.

Una t.ldena de ()NA laxa tiene mt·no) pJrt•s de bases por giro que l'l prnnwdtn mu.11 ( 1O ph = 1 girn). t'\lll e~. la uniún entn· la' del\ tadl.'na' de DNA e\ meno<; t•stredta. In cual. 1.'11 última imtand.1. podría llevar a que \t' 't'pararan.

El mlrc¡je terminal indirecto e~ una tl'<:nit.:J para rt:vi,ar la or· ganitatiún dciJJNA mediantt• un cnrtt· t•n un 'itio e ~¡wdfko y I.J idt·nuficdci(m de wdo' los fragnu·ntu\ 411e tonllent·n la ~t·· wt·ncla adyacente al corte; rt·vt'la la dhtancia del mrte a la(s) ~i~uit• ntrl s ) rotura(s) dd DI'\A.

Un lazo t.., 1111 domimo de una \nla cadt·na en l'll'>.trl'mo de un,l hnrt¡uilla del R~A (o I>NA tk UIIJ cadena); wrre~pundt• a la ~t'· tut•nda entre rt•pt•tkiune' invertida\ dl'i DNA dúplex. A\imi\mn. d lazo e) un pruducto mtt•rmediv dd t•mpalme dd RNA donde un t•nlan· 5' a 2' trN 1ma t'\tntllura circular con cola. Un lazo O e' un dominio dt·l DNA mitunmdrial en el que un lra¡.:mentnwrlo dt• RNA \t' apart•a wn una cadena de DNA qur dl.·,plata a l.1 original n·l.:~donada con d DNA dl.' t')e dominio. Se utili1a la mí,ma dt•twminacitin para dr~crihir el desplazamkntn de un dominio dt• uno~ tadenJ dúplex dt· JJNA por un invJ~or cnmplt•mt•ntarlo dt· t'adcma única. letalidad sintética ~i¡.:nifica que tlo, mutacione\ viabJt>, por sí mismas. al comhinar<¡e, dan lugar a mortalidad . Fl líder de un RNAm 1.'~ la ~etuenda no tradudda en el extremo 5' qt~~: pret·edt• al codcín de iniciación. El líder de una protelna e) una secuenda terminal N torta que inida d pa'o al intaior de una mt·mhrana o a trav¿s de ella. El ligamiento dt•<;crihc la tendencia de Jos genes a heretlant~ jun· tos c.:omu rl.'suh.:~du de ~~~ locali7..:Jcion en el mismo cromo)oma; se deu.•rmina por la renunbinadlm purcentualt·ntn· /oci. Una Ugasa de RNA t'' lllld ent1111a que amia t•n el conc y t>mp<~l· me del RNAm¡ldra mmtituir un enlace fosfotliéstcr rmre las do~ secuendas exúnka' gent'rada' por la fragmenta
856

Glosario

Un marco de lectura es una de la' trt'\ posible!> ronna' dt• lectura dt• una ~ccut•nda de nucleútid~. Cada rn.Jrt'u M lectura divide la ~t·tut·nua t' n una serie de triplete> su(e~ivus . Hay lrt•s martm de ll'ttura posihlt•s t'n rual4uier \l'tuemia. dc¡wndil'ndn dt•l punto de inicio. Si la primera e\trunura )l' imela t•n la pu,idún l. la \egunda lo hará t•n la 2 y. la tercera. en la 1. Un marco de lectura abierto e~ la ~t'tUl'llda de DNA t'on,lltuida por triplete) 4ue \e pueden traducir t•n amírm.iddm ,, ¡~outlr de un <.mlon dt• inkio y qut· conduycn con un t'()(lón dt· •nmina· dtin. Mediador es un gran complejo protdnit·o vintulado tnn la HNA politm•ra'a l1 hat'teriana de la' hactt·ria' y la\ lt·vadura\. Con· ticm· l.tnore~ nel'e\ario' para la transcripdün dt• mudto~ o la rnJyor p.trtt• dt• lo~ promoto re~. Una megabase wrre)pontle a un milllm dt• pare\ dt• hases de DNA.

1..1 memoria de la ctlula B 'iC encarga de la produniún rápida dt: antiluerpos durante una rc:spm·\ta inmunitaria ~ectandaria y las sub~ii(UÍt'ntt:s. L)ldt)n previa a an· tÍgt•no\. Un siliu metil~do completamente es una )ecuenda palindrcímica metilada t•n ambas cadeno~s del DNA.

~itio

l..ds protl'Ínas dl'l MHC de clase I constituyen un tipu importante dt• molt;cula~ dd MIIC . En la mayor parte de lo\ raso~. las pro· tcína\ del M lit: de da\t' I presentan péptido~ a los linlodto' cito· tc'l xíco\ CD8+. Lo~ pt;ptido~ de uni•'m dl' d.J\t• l dt· MHC en gt•ne· ro~l 'e produn·n por lragnlt'lllatión proteolítica t•n el dto~ol.

Las mutaciones inducidas \un produt1n de la atcion •lt• un mutJ·

genu. el t:ual puede in
La) mutaciones silenciosas no l'alnhian la \t·rut·nda de teína porque producen wdone~ \inc'm imm.

uno~

pro·

qut• pueden regular lil ex·

Un mutador es una muta<"illn. o un ¡.:en mutado, qut· auml'nta el grado ha~al dt• mutadonc,. Tale~ gt•ne' a mt·nudo codifico~n proteínas qut.• panicip.111 en la reJI.Jrad<Ín de daiios del DNA.

Los IJNA microsatélite cumtan dt' repetidone> de unidadi.'S ex· trt·madamt·ntt' tortJ\ (en general. dt• mt·nn~ dt• 10 hp) .

Lm mut.igenos aunwntan la lrt·utt•ntia tk la<; mutaciones por induuit'm de rambio' t·n la \t'tlll'lltl.l dd UNA cn forma directo~ o indiret1a.

los microRNA 'on RNA muy pre,icín génka.

hrew~

Una minicélula e) una t:élula bacteriana anudeada (F.. ül/i) pmdudda por una diví~icin que gl'nera un dtnpla\ma sin nútlt•o. Lm DNA minisatehte umstan de -1 O t·o¡lia' de una \et·ut•ncia dc.:· repelltmn breve. La longitud dt• la 11111cl.lll dt• n •pt•tidci n \t' midt• en Hl pare' dt• h.:~'e'. Elmímero de repetidone~ varía entre ¡.:t'lllllll.l\. la modifinción dt:l UNA o RNA induyt• totlm lm t·amllio' qut• orurn·n t•n lm nudd11ido~ dt·~pu6 de 'u inwrptlr.:ldlm miual a una cadC'th1 polinudeotídita.

Un mutante de detención lenta t'~ un mutantt' de rt·plicación drl UNA de E. coli. st·mible a la tt'lllJll'ratura. qut· puede !inaliL.ar un.t runda dt• rt·plkachin a 1.1 tem¡wratur<~ no permitida. pero no put·de inidar otra. Un mutante de detención rápida t'\ un tipo de replicación del DNA (Jn,l) tlt· la 1:'. <11/i \en\lhlt· a lil tt'lllpt•ratura qut· detiene de inmediato la replicadún del DNA tu.mdo aqu~lla llega .1 42"C.

La~ partítula~ monstruosas de los hartcríúlago' 'e !orm.m lomo rt•,ultado dt• Ull dt•fl'cto dt• emamhlajt• t•n t'l cu.1lla' pmlt'in.H dl' la ,·áp,hk forman una tahez.1 mucho mayor dt• lo nonnal.

Un.1 mutadc'ln negativa dominante re~ulto1 t•n la mutación de un j1t'n que impidt· la funci6n del producto de tipo ~ilvestre dd mismo y condm·e a la pérdidd o disminul'icín de Id actividad rrspectiva en la\ célula~ que umtit'nl'n al aldn mutantc y al tipo 'ilvl',tre. La rau'a m.i) frt'l"Uentt• t'S qut• el gt'n codifica una proteína homomuhimt'rita cuya !undlm \t' pierdt· ~¡ \CÍln una dt• 'm \ubunidatlt•s J'H'\l'llla mutadún.

Una mut~ción .iiCeleradora t'll un pwmuhlr auml'nta la vdnddad dt• trdtN:ri¡xión.

Una mutación neutr~l no llt'nt' l'lt'Clll\ ~ignJ!itativos en la ade· cuación evolutiva. y en ¡¡eneral no Jo., tit·ne t•n d fenotipo.

Una mutacion de perdida de función elimina ti .tminora la at1iVi· d.td de un gen. A llll'IIUdo e> rece~iva. pero no \ iempre

El n-formil·metionii-RNAt (RNAt,-) e\ d aminoatii-RNAt que inicia la sínt~b de protdna~ t•n la) bactl'ria\. él grupo a mino de la nwtionina estci lormilado.

UIIJ molécula de unión t'~ un par de DNA dilplt•x wnt•t1adm entrt• ~í por ÍIJit•rc.lmhiu rt•dprucu dt· matt·rial genétiw. El RNA111 monodstronico uldífica una protl'ina.

Una mutación tentificadora en un pmmntm di\minuye la velo · tid.Jd de 1ramcripd1in. Una mutación nula elunina por completo la !umaín dt' un gt·n. Uno~ mutación puntual t·' un ramhio t·n la \et'uencia dt· DNA
Una mutación somática t'' la ()lit' ot·urrt· t'll una n·lula 'om.ítit'.1 y. por tanto, ilft•rt.1 ~olo a ~~~~ n:lula~ hija'; no e' IH'rt·dada por los de,n·ndit'IIH'' dl'l microor~anismo. Una mutación terminadora o cualquier cambio t'n t•l UNA por el ruo~l \l' ,u,tltuye un cudún que t'~pt·dtica un aminoácido ton un codon dt• tt•rminadon tk la traducdlm (UAG. UGA o UAA) . l..d~ mutaciones de cambio de sentido t·ambian un solo n~tlcín, de m.mt·ra qut• caman la smtitu
La' muUciones directas dt:\Cittivan a un gt'n de tipo ~ilvt·~tn• l.a\ mutaciones esponüneas tienen lugar en au\t·nda dl.' rt·auivm a¡.:regado~ Jlclra .tuml'ntar la ta~a de rnutaLione~ corno rl'\Uitado de errore\ en la replicación (u otros sucesos involunados rn la replic.1Cit\n del DNA) o por daño ambient.tl.

1:1 nivel de fondo dt• una mutadcín dt'\triht· la vdoddad con que \e dtumulan lo~ t.1mhio' dt• \l'lUt'tll'ia t'll el gennma dt' un mi· uoorgani\nm; refleja elt'tluilibrio entre la aparicit'ln de mutado· m•s t·~pontáncas y \11 elímlnadc'm por lo\ \1\Jemas de reparaciún; t'' tararterístico de rada e\)>l'cit•. Un.J no histona t'S t·ualqukr prllll'Ína t'\trUctural 4lll' se t•m·ut·n · trt· ~:n un l"romosom.l. t•xn·ptn Ulh1 dt• 1,1s hi\tOnas.

Un mutantc no indudble t'' aqul'lt•n qut· un ¡.:en afectado, o do,. no puede expresar)e. lt)) nódulos de recombinación \OO ohjeto\
Glosario

857

EJ nucleoide e!> la \')tru<.-.ura de una célul..l procariótica que contiene el gennma. El ONA c.-stá unido a protdna~ y no rodeado por IIOJ nwmhranJ.

El nucleolo es un dominio ddinido del núcleo dond\· se producen lo~ rihmomJ\. El nucleosoma t•<; la <;uhunid;Hl t'<;tmdural b.í~kil de la cromatina wn\tituida por -200 hp dt" DNA y un o(·támt•ro dt• proteínas de tipo hi~tona. UnJ \CnH'tlria de nucleótido N e' utl.l 'ccucnda runa ~in mohk c1grcgada t•n fomh1 ah:c11oria por la l.'n"li!Jla l'll punto\ dt• l'odilkacion durantt'lcl rt't'\trU\turanón dt• gem·, dd ren·ptor dt•télula' Te inmunogluhulin,l\. Los nudt·titidos N auml.'ntan la diVt'f\idJd dt• )oc; ret't'plllT\'\ de JlltÍ¡tellO\ Una !>t"C:uctHiJ dt• nucleotldo P es una )ecuencia pcllindnímil:a cona (rt•pctldtin inwrtidJ) que o;e gcnerJ duranw IJ rcc\trut111· rad1Í11 de \egmt•nto' dd ¡;t•n J. d rcn·ptor V(O) dt• la tduiJ T y )a, inmunoglobulin.:J\. lm m•det'itidn\ P ~e generan t•n Jlllllll~ dt· 11nion de .·udilit'Jdún t u.tndo la~ proteínas RA<.. lrJgmcntJn lm t·xtrcnHl\ t•n horquiiiJ 4ue ~··generan durJntt· la rt"t'\trlll· turaciiÍn. Un nudo dd [)NA n un dominio enrollado dt• la molé< u la qut• no puede diminJT\c Mil ton,u y ree\trunurar d DNA.

1-1 número de copias de un

pl.í~mido

hJdcricl (rt•spt'<1o dd ním•t•ro de mJ bactl'riano).

n el ttUl' <;t' tlm\t'rv,l en un,l

copiil~

de origen del

crorno~n­

r:1 número de enl..lte rurrt·~p<mde al nímwro de ocasínnt•s 1'11 qut' '>l' Clltrt.•niJ/illl d<~ ladt.'llcl~ dt• Ull UNA dúplex cerrado.

Fl número de giro tltol DNA t•s el númt·m clt• pan·s dt• hil~t·s dividido t'lltre d nú1m·ro dt· pilr("\ de bJ~t·~ por ~tiro dt· 1.:~ héliH' dúph.•x.

La~ ortólogas son proteínas corre,pondientt·~ t'll dn' e'¡lecies. según ..e define por IJ homología de sus ~t'dlt'ncia~ .

medJd dt• agJlla de Cmwn en planta\ infectadas.

I.J partícula de reconocimiento de señal t:\ uu tomplcjo rihunudt•oprntcínico tllll' n·conon· ~ecuendJ' \l·ii.11 dur.mtt' la 1radut'· chín y que guí.1 al ribosnma al condurto dt• tr,1n,JocJción. 1..1 rompo,idon t.lt• dikrcnte' organi~mo' pm·tle VJriJr, pt•ro wdas tlllllit•ncn protl·ínJ~ y RNA rl'IJdunadm .

En A¡lrt'bd!'fl'rium tmn<'farims se encuentran plumidos Ri, que t.omo lo'> pla,midos Ti. pllnan gene~ qut· cJmJn t•nft-rnwdJdc' t'll plclllld~ inft'l1Jdas. La afección puede tomar la forma de las •·nfcnnedadt·~ de rJÍl vellosJ o agalla dt• Crown.

Un potenciador es una st·t.·u•·ncia dt.• at·tuadtín <'n cisque aumenta la utiliZJdón de algunos promotoreo, cu<ariúticos y puede aauar en cualquier orientaciún y dominio (il\t't•ndcme o dest.·endcnte) re~pet·to del promowr.

Una unhín plectonrmica es un dorniniv que conMa de 1111.:1 moh;cula <'nroiJJdJ )obre otra. por ejemplo, la~ l'cldcna~ del DNA dt• 1111.1 ht;lit't' duplex.

\t'

1::1 paso de una sola cadena t') un.J reJrdon t.ll,llilada por 1.1 toJlni<;omera\a de lipol, en la rual unc1 ~t't'diÍn de un DNA dt' una \Oic1 tJdena pJ~J a tr.1vés de otra tadenJ.

Fl ptiec;¡ue de t. histona ,., un ~cgmento que \l' l.'lll"Ut'ntr.t t'll l.t~ cuatro hi\ttlll.1' t"entrJlt·~ donde do~ as,l\ ulllt't1Jil trt''> hl'lke~ .tila.

Un patógeno subvirico es un agt.·nte in!ccti1J-.u m.h pt•queñn t¡ue un viru,, tllllln un virusoide.

Polandad ..e rt•licre ,JI dt'ctu de unJ mutadtín en un ¡:cn t'll l'1 't'lltidn de qutc" influyt· t'n la expresi6n (t'n la tramcripdón o traduniiÍn) dt•gt·m·s c;ubsiguiemes en IJ misma mudad de trans<TiJil'itín.

e descril)(' la rart•n(1a dt.• rt'1.1cion t•ntn· l'l comenidtl de DNA (valor C) de un organi\mo y'" pott•ncial dt.' codificJción.

La paradoja del valor

Un patrón molecular vinculado con un patógeno (PAMP) es una 1'\trutturJ mokcular dt" la sup.:rlidt· de un t'nlt' pattígt.•nu. Un PAMI' t'nJlilrtKular put·d.- c:on ...·rvJr..- t•n ¡!TJn nünlt'ro dt• t•nte~ patll~l·nn... OurJntt' una rt">put·~t.1 inmunitariJ. )Js •·éluiJ\ mediJdnr.t~ dt• la mmumdad innJtJ put•dt•n ret'lllllll'l'r lm PAMP llll'dlalltt• rt'll'JltOTt'S. la peptidasa señal ... ~ un,1 t'lllllll' t.ompum•ntt'' dt· un cnmplt•jo protdniro m.h grJntlt·.

1'1 peptidtl-RNAt t:' d RNAt al qut·

~e

El nJdun ocre es ellriplt•tt• UAA. uno de loc; tre\ nJd1me' dt• terminJt.iún cun qut• conduyt: la '>Íil\t'Sh de proteína~.

i:l ~ptido lider e' el pnldut·to ttUt' rt·~ultaría dl.' IJ traducción dt• uuJ \et· uenci.J tle rodilkaci.ín t·oncJ U\JdJ para regular IJ transt:rilKilm dt'l uperi111 triptúlanu <.ontrolando d mo\ nniento del

Lo~

nhu~oiiiJ.

El nJdún ópalo t.'' l'l triplt•tt• UGA. 11110 de lo~ trt.'~ wdtmt·s dt: terminad6n u1n quc confluye IJ sfnte~i~ de prott'Ína~. En un número n•d11d ha t•vnludunJdo par,, todiHrM 1111 amino.ídcln.

El operador,., t•l 'itin dl'l l>NA dundt• se unt· 1111.1 protl'iiiJ rt•· prt·sora p.1r.1 evitar qut· St' inicit· IJ tran!>rripcilm t.•n d prmll(llor adyan•ntt•. Un operón e' una llllÍIIJd dt• t.•xprc!>il'm y rcgulad(m ~t·n¿til'il Nl'· teri.nla c¡ue induytc" ~enl'~ <''tructurales y l'lemcntm dt• nmtrnl dd DNA ret.Oilllcidu~ pm produno~ génims reguiJdore~. Una opina ""~ un deriv.tdu dt• la arginina ~intctizado por t:t;luJJc, vegetale~ inlct"tildas en la enft•rmedad de agalla dt• Crown. El organizador nucleour es el dominio de un pona Jos gl'nes que codifican d RNAr.

El origen áón.

e~

858

Glosario

una

~et·uencia

cromo~uma

qut·

de DNA donde se inida la replica-

El püsnrido Ti e~ un c:pboma de la baneria Agr,,bút"ftn'um tumrfil·

El posicionamiento traduccional dt·~crihe la luccllil.:Jt.-.on dt> un oda mero de hhwnas en giws \Ul'l'Sivos de la hdicc dí1plcx <)lit' detenninJ qut- secut•nda~ \t' lncJiizan en rt:~iunt'' de t:nlatt'.

ha tramft·ridu la cadl.'na puli¡ll'ptídit.a nadentc dt.~pué' dt• la ~intt·~i' dd t•nlan• pt:ptídico duralllt: la \llllt'sis de la protl'ina.

Un ojo de replicacion e~ un domuuu en el que el DNA ~·· repliní en un;J llliM m.h larga sin rt•plkación.

determina qué cara del DNA t:\lará expueo,ta t'n IJ \IIJ~:rhtlt' tld n udeo~omJ .

d<'m que puna los genes encargados de la inducciiÍn dt.' la t•nfl'r-

El número d~ giros e~ el mímt.'ro de \t.'ces qut• un eje dúplex cruzJ snhn· sí ml,mn en el e~palio .

plasmidoo; octopin1 dt• A~r.,bacunum tumrfadms ponan gcnt'' que nKiiliun la ~Jiltt'\1\ de upina~ del tipu ot.1upma. Lo~ tumurc~ \1111 indifen.•ndJdo,.

El pUsmtdo fe!> un t.•pisoma libre o integrado de la E. c.,¡; que en ClJalqUJer de \U\ formas puede fomentar 1..1 conjugactón.

El periplasma (o t~pJcin pcriplá~miu1) ,.~ t•l dominio tJUt' w •·n
peroxinas \tlll In!> t.·omponentt·s prott.·ínit·m del pemxbm11a.

JI peroxtsoma e~ un orgJnclo citopl;hmilu rmlc.ulo tlt• una memhr.ma unit.l qut• contiene

cn1im.1~ mddativ.1~.

LcJ plllnl t"\ IJ 'uhunidad pulilneril.dtlcl t'll los pi/us de las bat·· tt•ria~ .

Un pflus (plurJI: pílí) t'S un apéndit't• ..u¡ll'rfidal dt• una hJctt·r~cl qm• k llt'rmitt' adhcri~e a otra~; t·~ 11n dlindrn conu. clt'lgado ~ llt'XIhlc. Ouranlt.' la cunjug¡¡dún, Jo, p11i -..· U-..111 pJra trJmknr DNA de mta bJctt·na a otra. Una pt..ca e' una zona dt•mHlada t'll un.1 r11hit:rta haoerian.t: t'' t'Tt'ada por unJ •mla paníruiJ dt· fago qut• ha pre\t.'nt.at.lo mllltlplt'S tido!> dt.• rrt•dmit'nto lítit.·o. UnJ placa clara t'S un tipo de placJ que contiem· \IÍio n·lui.J-. bilctt•riana~ lisJd.as. Un plismldo •·~ un DNA qm· pued1· n·plicJrsc.

t•xtranumu~úmku

t.irn1lar aullínumu

La poli(A) polimerHcl (PAP) <...,Ja t:nzilnil que agrt·ga IJ cadena dt• audu Jdt•níll<.u ille\trt•mu 3' del RNAm emari<Ítico Nu utiliza mnldt•. El poU(A) RNAm ,., Jqud que carere de un fragnwntu 3' 11·rmin,11

llllli(A). l.cl' polim~ras.as de RNA 'tm r:nl'imas ttllt.' ~intt.•ti.lcln RNA uuhnmlfo un moldt• dt· DNA (formJiml.'ntc desnita~ t'omu pulinll'rJ~.l~ dt• RNA dt•¡wndíentc~ de DNA). Polimorfismo (o polimorH~mo genétiru) ~e rl'!it-re c1 la apJrición \IITIUitánt'•' de alt·lu~ t'n la ¡Jobladún qut· mut'\trilll v.Jriadone~ <'11 1111.1 pos11itín dt·t<.•rminJda. La dl'linio(m originJI sc: aplic.1ha J all'lu~ qut• pmducíJn diferentes fenotÍJlO~. pero hoy tJmhkn \l' U'cl par.1 dt:,crihir t:Jmlliu~ en el DNA qm· aft't1an d pJtrc'm de n·~tritdtÍn o indu ..u IJ st•ClJcn
Un polimbosoma t'' un RNAm que ~t· lradun· simultám·amt·ntt· VJrÍU\ rihiNIIlla\.

t'll

los t.mmtlSnma' politénicos ~t· gencr.tn por rt•plkatione~ ~u­ ce~iva~ de 11n nmjunto de cromo~om.a,, \in \t'pJrauón tlt.•

¡.,,

n;plka~.

La posición del nucleosoma describe la ullkación d1· e\tJ\ l'\truttura~

en secuendcl~ dl'linidas del DNA y no en n·specto dt' la st·cut·nciJ.

punto~

aleal
E:l posicionamiento ro~cional describe la loc,tli7.adón dd Ot1dlnero dt• lmtunas re~pe<"to dr los giros de la ht-licc dúplex, lo ntJI

Un potenciosoma e\ unn,mpkjo de I'Jl'tnrt·~ dt.• transrripc:itín que t'll"'lmbla di.' maJWrJ rooperJtiva t•n un pott•ndador.

1 a predominancia nucleolar desuiht• 1,1 1ramrripci(m de genes del RNAr hcredJdm de st'1ln un prugenitllr 4t1t' ou1rn· en cierto'> t•ntrccruzamiento\.

UnJ proteína que <;<•rá illl(l\lrtJdcJ .:1 un organelu u \t'nt·tada por una preprote1na hadt:na )(' llama XXX hasta que no ~<' clitninJ 'u ~ecuencia señJI. El apelativo de pre-RNAm .,,. utili/a pJrJ de~tTibir el producto de tranS<Tipción nuclear que ~·· pmct."'.a Jlllr modifkaáón y cone y l'lllpillme para dar un RNAm. 1...1 primasa e" un tipo dt· RN,\ polimera~J ~intet i ladnrJ de segmt:nto~

curtos de RNA lJlll' rt')llkadún del DNA.

~t·

11\,uan tomo n·hadores para la

f.l primosoma dt·~•·rihc al complt•jn dt• protl'Íild~ mvohlt'radas en la Jt tividJd n·badnra que inici.1 1,1 rt•plit.at i1ín 1·n los orígenes de tipo tpX. TJmhit-n p..lrtinpa t•n t•l rl'inido dt• las horquillas de re¡)lirarión dt•tcnída<, El principio transformante t·~ l'l DNA captado por una bacteria y ClJya expre.. ión cambia despué~ la' prnpicdadt·s dt• la<; células que lo reciben.

Un prión C!> un Jgente inft•tduMI JlTtltt•ináceo que St' comporta como rasgo hereditario, aunqut• no umtkne ácido nuddco. pur ejemplo. el PrP.. cJuo;ante de IJ t•ncdalopatía e~¡xmgiformt' ovina y bovina y t•l Psi. qm· c:onfil'fl' un C\lildn heredJdo en lt:vaduras. El procesamiento dt·l RNA dc~cri ht• tambiu~ que ~t.· prescnt¡¡n dt•spués de su tramt riptiiÍn, t'ntn•
Un proceso constitutivo t'\ aquél qut• orurre todo el tiempo. sin qm· ning(m C!>tímulo o conditi(m t•xterna lo modifique. Un profago l'S un¡;t·nomJ dt• 1111 fago intt.·¡:rJdo dt" mant·ra covall.'nte como partt• lilll'c1l dd cwmo,uma hactt·nano. Una t'Jdena progenitora o düplt•x dt·i DNA wrrt•spondt: al DNA replicará.

t)lll' ~e

La prolongación del apareamiento dt•strilll' liltapacidad de la cadt·na de DNA parciahnentt• apan•ada con su wmplcmentaria en una cadena dúplex para e"tt·ndt•r el a)lart•amiento desplazando J la radena residente, de l.t qut• es honuílu¡:a.

Un promotor es un dominio del DNA donde se une la RNA polimer.asa para ini
Glosario

859

1ranscripdún e incluye dos dt'l11t'llto~ dr st·cut·rKia, d lnR y J.t taja TATA. El promotor l't"lllrc1ltkn~: por In ~cn~:ral -40 bp de lungilud. Un promotor TATA negativo nn til'ne caja TAT1\ t'll la asct·ndclllt' dt•,dc 5U pumo dt· inido.

~ubunidad

nacknt~:.

~t:c.:ut•ncia

Una prot!ína bHLH tit·m· un dominio de union dt: DNA ha,itn adyacente al -..·grnemo ht>lin.·-la7o·hélite. l..a proteína de unión a TATA (TBP) t'~ la transcripdún TF11 D qut• ~t· unt: .11 DNA.

La puromkina t'~ un antibiútiro qut· termina la ~Í111esis dt· proteína~ al ~imuleH un RNAt y t•nlJtar'e ron la cadt.'JJd proti.'Ínita

del fanor dt·

Un quiasma l'\ un 'ilio dnnde dos uomowma~ homlilu~os part•n·u haber intt•rt:.lmbiadn matt'l ial durantt' la mdmi\.

La regla n-l establen· que sólo un aomosoma e~tá anivo en las c_élulas dt• mamíf<·ros ft•menin<"; todos los demás e,tjn desactivados.

La regulación coordinada ~e refine al controloumín dt' un grupo de gene~. ~egulación negativa t·~ la qtu· comrola la expre~ión del t'Stado r;~establt•tido dt: los gt•nt'S. Se rt'llUiere una intt•rvención l'~pe­ crfica para dc~aC1rvarlos.

La replicación bidireccional dcscribt• 111 1 ~!\tema dondt· tmoriJit'n gt'nec"ra do~ horquillas de repl icadón que ~t' al(•jan dd t>ri~t·n t•u dirt·cciom·s opuestas. ~11 vi~us dt· replicación defectuosa nu pu~de Pt'TJWtu,rr un lldn mfc<:Cioso porque rarec.:e dt· algunos de lo~ gem·~ fll'(l'\•lric" (~ 11 ,. tlltudo~ por d DNA del ho~pedador en un viru~ t•n lrdmduHronl u porqul' ~\tos han mutado.

Una relajasa es una t•ntima qut• t.orta una caden,1 de DNA y ~t' une al t'xtrcmo 5' lihn·.

La replicación semiconservadora ~e lo~ra pur la separación dt• Ja, (adt·nas de un progt."nitnr dúplex: despué~. <:ada una actúa wrno moldr para la ~íntesis dt· una cad~na tomplernentaria .

110 puedt·n t•mprendn tiiJJ rel'om-

El reloj evolutivo ~t· ddinl' por la vclocidad con que se anm1ulJn la~ mutarimws en un gt•n determinado.

La replicación semídiscontinua es el modo en que continuamt'ntl" ~t· sintetiza unc1 nuevacadt•na mientra' la otra proct'de en formJ

l..d proteína de unión al poli(A) e~ aqudla qm• , ... unt• a IJ t'Jdt·na 3' dt· poli(A) en un RNAmt·urariútico.

El recambio enzimático t."~ d prnn·~> por l'l qm· un<~ l'lltima n:¡:re>cJ ,\\U fonna origi11<1l. lo qut• lt• pcnnitt• tdtali1a1 otra rt'clllÍÓn.

Una proteína naciente no ha cunduido atin ~u ~íntt·~i~: la tadt•na polipt.'ptídita st¡nrr unHIJ al ribo~uma mcdi,:mt~: RNAt.

d~:

El remodelado de cromatina dt•suil:w el desplazamiento o la reo rgani7dtión dt· lo~. I?Udt·osoma~. qut· dependil.'ntt' de e m·rgía , o<"urre en__con¡unnun ron la actrvadón dt• lm gent·s para la transnrpaon.

La proteína de unión al DNA de cadena individual (SSB) ~c une •11 L>NA dt• una sola Ccllklla y así impidt• qur éstt' fnrnw Ullcl \'\tructurd dlÍplcx.

Und proteína

r e~

un.1 de lel~ prntl'Ítla\ dl'l ribo\olliJ.

Una proteína SR tit'llt' longitud nriJbk Ar~·Scr

d~:

urr domimo riw t·n

y parudpJ t'n d tortt' y empalme.

Und proteína terminal pt·rmllt' la replirdl'iún tll'l ¡.tt'rroma de un lago lineal inidal en d 1.'\tr~:mo final. La prntl'Ína ~._. IIIH' al t'Xt remo 5' dd ~cnuma por t'nlact' covall.'ntt•, 'l' rt'ladnna u m una DNA pnlinlt.'ra~a y t·ontknl" tlllJ dto~ina qut.' sirv~ u>mo cebador. Una proteína transmembrana ~t· <''itknde a travé' dt." una hirApa dl' lípidm. Un dominiu, o dominio\, hidr~>fohn (comtituidt> tíri· tamentt• pur una
polinwra~a

El proteoma t'~ d conjunto CtlOl[lletn de proti.'Íilel~ t•xpre~ado 11m l'l gt·noma íntq;ru. AIHunns gem•, wditit:an varia' prutt'Íihh y. tollHl rt·sultado, el tJm,liro del proll'(>llld t'~ llle1yor que el núm~ro de ¡wm·'· En otcl,lone~ . d tt'rmino \t' utilita para dcsuillir l'l cumph:nwnto de prutrínJ~ t•xprl'sado por unJ célula t'll cu.1l· quirr momento.

Un provírus l'' una ~~:t·ut·ncia dllpkx de DNA intt·~rada t·n un gt·nonM t'tll'a riíJtico lJIIC rt•prt.',ent.J la 'I'C\Il'llria dd gl'noma dt· RN A dt• un rt•trovirus. La PrP l'' el n1mponentl' activo dl'l prin. Se logra alcnuar dos mutadont"'> rett'\iva~ difcn·nt~~ con rl mismo fenotipo y al determinar si t'S posible lJUe se produLca el fenotipo silvc\trt·. En tal ca~o. 'l' dice qut• Ja, mutama t•n l(lll' aumt·ntJ mucho la lrecu('ncia dt' una mutaciün n reromhiu.tción. t'll gt: · neral cuando meno~ un orden de magnitud, rt·,pecto de ~itim vecinos. Fl punto de inicio 't: refiere a la posioón dd DNA lJUC corrt''J>Otl· dt• a la primera base im:orporadcJ al RNA.

860

Glo!>ario

La razon de empaquetamiento t'~ la relaciún c11trt' la lnngintd dt•l DNA y la corrt•spondientt' de la unid.1d de la libra lJIIl' lo tontÍl'lll' . J.a, muta
ü>li

Fl receptor de la célula B t'~ t•l romplejo ren·ptnr dt• cllllÍ~t·no~ la ~upl'ffide cdular dt• lm linlodto' B: t·~t.í um,litnido pur inmllno¡.:lohulirM 11nida el lel mcrnbranc1 tllll' se llllt' dt· mam·r,l no n>Valt•ntt• c1 1.1~ tcldel1a\ l¡.:u t' !¡.:¡3.

U rec!ptor de las celulas T (TCR) t'' d rt'H'(Itor tk antígenos dt• los linlolitn~ T. ~t· l'l\Jirt·,a Cll forrnJ tloual y Sl' lllll' el un l'OIIl· plt-ju de prutl'ÍnJo; MHL dt' d,hc lo 11 y un pt;ptido dt·riv,ulu dt· ,llltÍ(otl'IIO. Un receptor tipo peaje (to/1) t'~ un rnqll11r dt• la mcmbr,ma pla~matiC'a 4Ut' 'e t'Xpn·~at·n l'1 ren·ptnr dt· lo~ lagodtos ~otra~ u·lul.1~ r CJIIl' pJrtidpa en IJ' 'l'ii.1ll'\ dur.mte la fl'\f)\1('\IJ inmullliMicl mnata. Lo~ TLR tíem·n rdadcínton n·et•ptort·~ IL-1. l.t" receptores de esteroides '"11 lc!ctort'' dt· tran,cripcíún qut• 'l' .ll'th·an por la unión de 1111 li¡.:a11do t'Steroidt•. Un ,lltt''" tlt• recodífícacion tit·ne Ju~ar nrandu l'l 'ígnifkadn de un n>dón o 1111.1 ~~·rit• dt• tndom·~ 1111 l'\ l'l prono\titado por l'l tiÍtligll gent~títo; podría tratar\t' dt· intt•racdone' t'ntn· d aminoadi-RNAt y d RNAm mmlilíradm por d ribmom,\ L,J recombinacion especifica de sitio tknl" lu~ar t'lllrt' d~h ~t·· t'lll.'lldel~ t'Spt•cílka~. por t•jt•mpln. la iml'gradón o t'\t·isi
La recombínacion homóloga tmplka un mtt·rc,lmbio n·cíproco 1k 'l'lllt'ncia~ de ONA. por t•jemplo. t'lllfl' do' uomo,..ma~ qut· ('llt'lltJII con In' mi,mn~ /c>t'l g<'nko~ .

Un remolque t'S unJ ~ecut'n
La rep~ración del apareamiento erróneo mrrigt• bases rt•dentl'mente m~ertadas cuya correspondt•ncia no es apropiada. El pror~!>t? cornge prc~ert·ntt:mt·n~t· la ~ecucncia de la cadena hija. al d1stmgmr t•ntn· l'Sta y la qut· lt• dio origen, en occ~,iones con base en su e~tado dt· mctilatión. La ~~paración por escision describt' un tipo tk ,i,tt·ma dt· rl"paranon dond~· u_nJ cadt·na de ONA t'" retirada directamemr. y dt•spués \U\tiluldJ por rc.,íntr~i' utilizando le1 tadena t·ompkmcntaria como molde. La reparación por recombinación t·~ un modt'lo de· llt•nado dt• un e~pacio ~·n _una catl~rra dt• DNA dúplex por rt'l'llJll'ra
La repetición terminal larga (LTR) t'\ 1,1 ,ecurncia lJUI.' se repítt• t·n cada t'xtrt·mo del proviru~ (St'C'ut·nda rt·trovírica inte~rada).

La recombínación no reciproca e·' produtto de unart>r t'n l'l apart·amit·nto y entrnru7amit•nto, cuando 'itio' no t·quivalentes participan en 1111 \Ufl"So de rl'cumhinadtin: produce un remmbin.ullt' ron 11na ddt•tiún dt• lllelteri,ll y otro ton unc1 duplicación.

La~ r!peticiones diree1as ~on setut·ndas idéntitas (o muy rl'lacionadas) pri.'Sentes en do~ o rná~ copias wn la mhma otit'ntclción en un,, sola molécula dt· DNA. ·

L,J recombinaclón somática dt·,nihe el proce"> dt• unión de un gt•n \'a un gt•n C t'n un linlcK·ito para gt•nt·rar una inmunoglohulina o un ren·ptor dt: télula' T.

Las repeticiones dispersas originalmt·nte se delinicron nlllHl secuencia~ breves, qut· ~nn frecut•nte' y til'nt•n amplia distrillucit1n en el gt•numa. Tdmbien ~t' sabe hoy que wmtan de dcmt'ntns ~usn•ptible~ de lr amposrchín.

El ONA recombin¡¡nte en parche t:s prodllt'to dt' una unión HollidcJy rt'~Ul'lta por n>rtt: t..lt' la\ cadt•na' rntncambiadas. J,¡¡ porción düpkx práctkaml'nlt' no sufre c.:ambins. t"\'tepto por Ulhl ~ecut•nda

de ON A l'll una cadl'llcl que pmvknt· dd t romo~ornJ homúlogo.

La redundancia dt''t'rille l'lw!Kl'P\0 de qut' dos o rná' ¡:enes pul'· den cumplir la mbma fundún , de modo qut• ninguno e' esrn
La regla GT-AG dt·,nibe la pre~t·nda dt· t''tr" dinuckóticlm cnm· t.lllii.'S en la~ Jo, pnmeras y la~ dos última' posiciunt·~ de lm intront"s de lo~ gen~~ nutlt•arc'>.

Las repeticiones terminales invertidas son la~ ~t·cucncias mrtas relacionadas o idéntka,, presentes en oriemadún invcr~a t•n Jo~ ('Xtrerno~ de c~lgunn' transposorws.

l..a replicación dd DNA dúplex ocurrt' por síntesis dt• do~ nu<·va~ c~dcnas rm?pl~rnentdrias dt• Ja, pro~wnitora~. El dúplex pro¡.temtor t'S su~tllutdo ror un par dt" hija' dúpkx idémicas. Cdda una d.l' las_ruak~ til'ne una cadt'na pn>~t·nitora y una recit'ntcmeme Slntell_7.ada. La replicación se llama 't•miconservadora pnrqne lc1~ unr~adt."~ qut' pc:rmanecen son Ja.,. cadenas única~ del dúplex progt'nllor.

discontinua . l..a replicación unidireccional ~t· refil'fc al movimil'nto de una sola horquilla dt· replicación a partir dl' 1111 origc:n dado. El repli,cón e~ u~·•a. unrdad dd gt'noma en la mal ~e replica t•l DNA . Cada rephron contiene un urigt•n para que inide la rt·· pliradón.

El replisoma t'~ la l'~lructura muhiprotdnka que ~t· eno;ambla en la horquilla de replicación bacteriana pc1ra emprender la síntesis dd DNA: contiene DNi\ polimera~a y otra<; enzima~. Los ~itios de reposición ti<· un g<•n ~un atJucllos en qut' las mutadones modifican el amino,ícido codifirado. La f!Pr!sión de,cribt• la capdtidad de la~ bactt•ria~ d<•t•vilar la sínte\h cit." dt·~ta' l"mjmas ruando están prt·~t·mcs sus productos; de" m.mt·ra ma~ ¡.tl'ncral. ~<· rcliert' a la inltihicié>n d<· la transcripción (o traducció n) por la unión dt• la proteína rl'prc~ora a un sitio e~pct ífico dd DNA (O RNArn).

t:'

Un rep~esor trrM prott•ína qut• inh1be la exprt•sltín de un gen; pued~ 1mpedrr la transcripción uniénd!>~t· el un sitio operador en el DNA, o bien l'vitar la t re1duccitín uniéndo
La resolución

st· dl.'he a uua reatdún d<·

n·co mbinación homólo-

ga. t•ntr~ do~ l'opia~ del transposún t'n un cointegrado. La rear-

uon gt•nera los replicones dunador y diana. cada uno con una ('OJiia del tran~poslin. La attividad ~k 1~ resolvasa e~ la at1i\idad t'flLim
l.a respuesta humoral t·~ una respuc~ta inmunitaria mediada prindpalmt•nte por anticut."rpos. Se define como la inmunidad que put·de transftorirs<· de un organi~mo a otm mediant~ anticut'rpo~ sétit·os. Une1 respuesta inmunitaria <·~ la reacción dt• un organhmu antt· un dntígeno med iada por wmponente\ del sistl'ma in m unita· rio. l.a respuesta inmunitaria primaria dt' un or~ani~mo tit·m· lugar dlllt' la p.rinwra exposici
• 1

como la mmunidall qu1· nn¡medt> tramferirse de un microor¡ta· nismu a otro a trav~\ d1• anticuerpo\ séricos. Una respuesu SOS en E. úlli desnihe la imlucdón coordinada de much.:~s 1·mima~. incluida' las at1tvidade' de rcparadún. r11mn respue,ta a la irradiadún u 11tro daliu del DNA; es pmduuu de la activadon de la ilttividad dt• proteaSil por el RecA p.ua frag· mentar al rt•prt•,or Lt•xA. La rnomhinad(m de los segmento5 V. (DI del gt'n J origina una reestructur~dón no productiva ~i los ~t·gmt·nto~ gt'nic.:o~ rt·uhita· dos no están en d tllill'l'U corn·rto lm.uto de lelluril o cuando no st• produre una proteína hmd11nal

l.a rccornhinadün de lo~ '''gmt·nu~ V.(D) del gen J da lugilr a una reestructuf'idón productin tuandotudo) los segmento\ dd .:en rt't..,trut"turado ~e t'rtUtt•ntr.lll en d marro de lenura corn·t1o. Una retromutidón rt'vient· d dt•tto de una mutadón qut> ha· bía dt·sat·tivadu a un gt·n. por tanto. lo restablece a \U lurmil natural. Un retroposón t'\ un tran\pc>\Ón qut· se movJ!iza a travé~ dl" una forma HNA; l'll'lemt·nw DNA ~t· transaibe t·n RNA y despu('S, de mant·ra invntida. t•n DNA. que ~e inserta en un nut·vo \itio dd J!l'nnma. La dtkrt·nda re~pel'to dt.• Jos retmvirus e~ que el retrnpos,)n no tit•nt' uno~ (nrolol infelcio~a (vírica). Un rHrovirus 1'\ un viru~ de RNA ~usceptible de umvt·rtir 't•cuendd a DNA por traii\!Ti¡x·iún inver\.J.

)lt

La revenión supresora lntragénlu tit•m• lu¡.:ar cuando un.1 st·gun· d,l mutadtín \llprime el t•fello (k un.1 primera.

Una reversión verdadera t·~ uua mutación qut• t."Uencia ori¡.:inal dl'l DNA

re~tablt·n·

la

~~··

Los revtrtientes \l' derivan pm rt•versión de unil c~lula o un or· ganismo mutados had.J l'l ftonutipc1 de tipo ~ilvestre. RF1 t'~ el fa<.wr dt.• liberad6n bat.1t•riano qm· re1..unoce d UAA y UAG como st•ilale' JMra terminar las síntesis de proteínas. RF2 El XXX e'> el la<.1ur de libt.-rat.'tllll bat.1eriano que rt'Ulllou· d UAA y UGA como ~t-tiales ¡MrJ temlinar las ~íntesb de proteínas. RF3 El JO()( C\ un faoor de tcrminalicín en la sínte~is de prott•mas relacionado nto ~t· libt·r.:~n 1m factore~ RFI o RF2 del ribo~uma t'Uandu iJOÚJn para tt•rminar la \Íntt•si~ dt· prutcínas. Un ribolnt.trruptor es un RNA catalhicn cuya cll'tividad rt·w<mdc

a un pequt·tio lig.mdo Las ribonucluus son etmma~ QUt' fragnll'ntan el RNA; puedt.·n ser esp<'dfkas tlt.-1 RNA dt• una o do' cadenas. y t·ndonuclea~a' o exnnucleasa,. Una ribonucleoprotefna t·~ un mmplejo de RNA wn protcítwi. El ribosoma ,., un gro~n emamblaje de RNA y proteína~ donde \t' sintcti7.an protl'Ína~ bajo la dircni{m de un molde de RNArn. Los ribosomas ba<.1eriann\ \t' st·dlmentan a 70S. los eut."arilltit'o~. a 80S. Un rioosoma ~~· puede dhociar en dos subunidadt·s. Una ribozim1 e' un RNA cnn actividad catahtica. El dominio rico en leudna e~ un sc:~mcnto que- ~f' e-ncuentra en porciones extracdulares de algunas proteínas del receptor de supt'rfidc: en células de animales y plantas. El RNA 55 e' un RNA de 120 bases. componente de la subumdad grande del ribosoma.

862

Glosario

El RNA 5.8S e~ un RNA pequeño e independiente qu<· "" t·n· ntentra en la 'ubunidad grandt' de los nbo\oma' t•ucaricítkn'; e\ homt>logo del t>xtrt>mo 5' dd RNAr 2'\S bacteriilllCI. Lm RNA dtopüsmicos pequeños (RNAsc) st• Jlrl'!>t'nlan t·n l'l dtu· pla~ma (y a veces tambtén en el núcko).

JJ RNA de transferend1 (RNAt) es d internwdi,uio t'n la sílllt''Í\ dl' protdnas qu<· interpretil el código .:ent'ticu. C.1da HNAt puede eniMM\t' nm un aminoácido. El RNAt tit•nt• una \et.'lll'tlda an· ticodún. cumpkmemaria de un triplctl' (mdón) qut• reprt'Sl'nta al atnlnoát:idn. Un RNA gula t'' un RNA pcquetio t.'uya ~t·cuend,1 e~ rumplt•mt•n· taria tlt• la de un RNA que ha sido t•ditado. Sl' u\a nuno moldt· p.ua <.Jtnhiar la st·t·uencia del RNA t•ditado prt•viilmt·ntt·. por inwrdon u ddt•dón de nucleótido\. Fl RNA menujero (RHAm) c:s el pmduoo imermt•din
1:1 ANA naciente e~ una cadena de ribonudt·ntido' aun t•n prcll'l"· \O de <.mlt''ii,, dt• manera que su t•xtn•mo 3' e~t.í apan•adn
Lm RNAm ibundantes constan de un pt·queño nümt·ro dt• espc· de~ nulividuales. rada una prc\l'ntt' t'll .:ran núrnt·ru dt• t'tlpia~ pc1r <"~lula. especie~ dhtinta~ de pur c~lula; esto expli·

H RNArn escaso nmsta de gran númt•ro dt.•

RNAm. de la~ cuak\ hay muy JX)(.'JS mpia' ca t•n gran medida la romplt-jidad dt• la \l'l'IICIIltil dt'l RNA.

Una RNPhn e~ la fonna ribonudeoprotdnica dd RNAhn 1RNA nuclear heterugt'neo) donde el R..\IAhn 'e combina mn proteína\. Lm pre·RNAm no se t>Xpc1rtan hastd concluir el prucesamit•nto. de modo qut• lo~ RNPhn \e encuentran 'iÚ)o en el núclt:n. El ciclo rotuf'J·fusión· puente es un tipcl de condut.1a (.'rumosómita t'll la que una cromátida rota se une con \U hcm1ana. lnrmando 1111 "pllt'nte". Cuando los ccntrómeros se wparan en la mitn'ii'i, el crottltlsoma vut'lvt• a romperse (no nen·sariamt·ntt> t'll (') puente) y a~l. se rdnida 1'1 ciclo. Rotur¡ Y reunión dt·~uilw el modo de rc('(lmbin.ll'illn genética t•n d qut• dm mol~ntla' de DNA dúplex ~~· fra¡;mt·ntan t'll puntu~ rorrt·spondielllt·~ y dt·sput'~ se unen en fomta cnt1.1da (lo (.'Ual implila 1.1 lormall!ín dt• una longitud dt• DNA heterodúplex en torno al 'itio tk unión l. El arroninw rut tndila d ~nio de utili7adún dt• rho, la ~cue11da dt• HNA n•tonodda por d fartor dt• tenninad,)n rhn. Un dominio S l'\ una ~et.uenda implit·ada t'n d cambio dt.> dast· de inmuuoglohulina. la~ regiones S constan de scntcnda!> fl'JlC· thiva' en hl\ extrl.'tno'> 5' de 1~ segmento:. g~nicos que wc.lifican re!liom·~ lOII\Ianlt.'\ d<' las cadenas pesada~. Un sat611te crlptico es una )ecuencia de DNA satélite qm· no ~e tdt•nttfita wmn tal por un pico separado en un gradiente de dt•miclo~d; t'~to e~. st· mantiene presente en la cadena prindpal dt• DNA. Un sector t'' un plastón de células constituido por una altt•rada y su progt•nit-.

~ola

t él u la

La secuencia· lO es la ~uresi!Ín dt· cun!>t·mo centrada t'a'i 1o bp del punto dt• inido de un gen batteriano; partkipa en la dí,ohtd
La secutncb·35 t's la \Ul'esión dc cun,en'o cemrada casi 35 bp a11tt'' del punto de initin dt• 11n gen bat1erianu rdadonado t'On d rt't'onodmtt'nlllmtdal por la RNA pulimerasa. la stcutnda centrtl e~ el ~egmento de DNA comlÍn il Jos ~hiel\ dt• uruún dt• lo~ gt·nnma\ del fago lambdil y los baneriano~; t.·~ la h)(.'alitadcín del protno de rc:comhinación qut• prrmile la inte· gradón ttl'l fago lambda.

El segmento Des una ~ecut·ncia adidnnal que ,e t'll< ut·ntra t•nrr.· la~ regiones V y J de una tadt•na pe~da dt• inmunuglnhuhno~ 1os segmentos J ~n ~et·ut.·ncias de mdilicaoón t•n "" /ro dt· in. munoglobulinas y del receptor de célula' T; sr enruentran t.•ntrt" st·gmentos de ¡:t·m·s variable\ (V) y wmtantt."' (C). Lm segmentos R son las ~ecuenda~ qut• ~e n·piten en lo~ extn·· 111(1~

de un RNA retrovírico. St' · R.

La segregadón posmeiótiC~ dt·,niht• lil \t'JlaradiÍn de dos cadenas de DNA dúplex qut· tknen informJción dikrentc (crt·ada por la formación de un hett·rodtíplt•x durantt• 1,1 mcio,b) cuando una n·plicaciún ~uhsiguicnte pt·rmitt· !IU<' la~ c·atknas se separen. La selección de coplu t·~ un ti pe> dt• rel'Ombinaciün u\dda por un virus de RNA donde la RNA pc1hrncr.:~~a t·ambia dt• un molde a otro durantt' la \Ínte~is.

la teoría de selección clonal propone tiUe t'ada linfocito ex¡HCSil e<.pcdficidad de un solo rereptnr de antígenu y <Jlll' ~1Jo los fin. fcxitt" (piri· midma o pnrina). skmpn• pre~entc .

(.Ita~

Un seudogfn procesado es una mpia dt.• un gt•n de~ctivado que f.lri.'Ce de introm·~. l ' rt rontrapt.l\ilión a la cstrut'tur.J intcrrum· pida dd gt·n activo. Tall':. ~em·s :.t· originan por transcripción invt·rsil de RNAm y la imercitín de una rupia dúplex ('11 el ge· noma. Los seudogenes son compmtt•ntes dc5clctivados, pero t.'Stables. del genomil. que !K" dl'rivan pur mutad{m dt• 1111 t-:t•n activo ancestral. En general. e\tán deSilctivadu' por mutadon~ que impiden su transcripción, traductil)n o amba!>. La silendadón del RNA describe 1.1 capaddad de un RNAds de suprimir la c:xpre~ión del gen corre\pondiente de manera sistc· mática en una planta. Un silenciador ~..·~ una breve St.'t'uenda de DNA qut• puede desactivar la expresit'ín dt> un gt•n c. erra no

Una stcutnda de consenso t'S una ~~·cuencia ideali1ada dundt· t.ada po\icic1n rq1re,cnta la base que \e enntt·nua más a mt•Jlltdo cu.:~ndo w comparan muchas secut•ncias rt·alt•s.

Silenci1rnlento (~ la rt•prl'~ión de la exprcsum de un gen en un dominio localizado. por lo general remhado del cJmbio estruc· tural dt• la cromatina.

dt• wdilkadún que re·

Una secuencia de Inserción (151 e~ un pt·quetio transposcSn bat· tt•riano qut• porta súlo lo, geni'S nece\arios para su propia tram· pmicilln.

El sllenci1mlento telom~rtco dest.rihc.• la reprt•siún de la actividad de un gt•n quc ocurrt' en la vedndad dt• un tdúmero.

Un RNAs ,., 1111 RNA bactl'riano¡wqut•tin qm· at'llÍa como regulador dt• 1,1 cxpn·siún gen~tira.

Una "cuencla senal e~ un dominio corto dt· una pmtdna que la diri!ll' hada d n·tíutlo t•ndoplámlicu para \11 translot.adón wtradurcional.

H RNAm polt(A) ' ,., un RNAm ron un.1 Cildt•na 3' tl'rminal de poli(A). 1·1 RNAm poltdstrónlco incluye prt.'\l'ntan más dt· un ~t>n.

re~tiont''

Lm RNAt cogn,dos ~on los qut• rt•tollon· Ullil ami11oacii-RNAt sintt•t,l\a t·~pt.•cífka. Todo' cargan clmi~mo arni11náddo. F.l RNAt desacilado no está unidtl a ,Hninoácidos ni .:1 cadcna' pc11ipcptídica~ ponJUC ha conduido MI panilipaci(m en la sínH·~·~ de protdna~ y t·~tá listo para Sillir del ribosoma. El RNAt,... e' d RNA espedal para inic:iar la~ \Íntesis de proteínas en bat1erla~; utiliu en su mayor parte AUG. ¡x·ro pm•ck también r~pcmder a GUG o CUG. El RHAt1- t•s d RNAt especial p¡¡ra rt-sponder a lo~ wdune' dt' mictactón en las eucariotas. El RNAt."" insl'rta melioni.na en codont's intt·mos AUG.

La secuencia Shlnt-Dalgarno e~ el hexáml'ro de purinas AG· GA
La slmetria lcosddrtca t·~ mmún en lo~ virus qm• tienen cápsidcs poliédrkas.

La slnapsls describe la uni6n de dos pare~ de cromátidas her· manas (que represt•ntan uommomas homcílngo~). 1.1 cuallienc: lugar al principio de la meio,i\; la t'\lntt1ur.l rt'sultante se deno· mina bivaknte. Los codont"S sinónimos tienen el mismo significado en el código genético. los RNAt ~in!Ínimo'> pt.lflan l'1 mi~mo aminoácido y responden al mismo nldcín.

Las secuenciu conserndas. ~e idt·ntifican t·uando se comparan mtKhos <'jemph,.. e\pcóficns de ácido nucleico o de proteína y se enmcntran siemprt" las mismas b.n~ o aminoácidos individuale~ en lot.adorws e~pt.·dficas.

la slntenia describe una rdaoon entre r~giuncs cromosómic.a' de diferentes especies t•n las (.'Uale' <;e encuentran gent•, hume•· logos en el ml5mo ordt•n.

La~ secutnciu de flujo descendente avanzan más 1·n la direcci(m dt' la t•xpresion; por ejemplo, d dominio de cudifkación t'~la en lluju de!>cenclentt· rcsp('(.'tO del codón de inidacicín.

las sinteuns de 1minoadl·RNAt \1111 c.•nlimas t•ncargada) d1•l t·n lace covalente de los aminoácido' a la'> pcl'iicintlt'' 2' u \ ( 111 del RNAt.

<.loYrio

863

Un sistema de adicción e:~ un mccanbmo de SUJX'rvivencia usado por lm pl.ismidos, que dimina a la bacteria merced .J la pérdida del plásmido. El sitio A dl'l ribosoma e~ aqul'lcn que: ingresa un .JnúnoadiRNAt para aparear las ba\t'S nm l'l codtSn. 1::1 sitio de ramificación e~ una sc:cuenci.J cona ju~to antes dl'l extremo de un ii11rón. donde 'e forma t•llazo imermt•dio del t•mpalme al unir'~: .11 nudeótido 5' dd intrón en la pmiciún 2' de una adenosina. Un sitio de unión a la matriz (MAR) t'' un dominio del DNA que

se unt• a la matri7 nuclear. También unit}n de arm.JLtÍn (SAR t.

~t·

conon· tomo sitio de

Un sitio de unión al ribosoma e~ un.1 'l'Cuenda dt• RNAm ba<1l'riano que induye un cvdón de ir)idadún unido .J utlJ subunidJd 30S t'n la f,lse dt> iniciación de las síntc:~i~ dt· proteínas. Un sitio de unión laxa l''> cualquier seC1tt•ncia alc:.Jtoria ma a la lragmentaci{m; abarca una zona de: la qm· están excluidos Jo, nudeo~ornas. El sitio P dl'l nbosoma e~ el que: ocupa el pepthlil·HNAt. HNAt que porta l.J cadena polipeptídica narit'nte, aún apareada ron d nxión. al que 'e une en el ~itio A. Lo~ sitios de empalme son la~ 'c:ntcncias inmediata' que circund,m a los límite' exón-intr{m.

La subunidad grande del ribosoma (50S en bal'tcrias. 60S t·n eu<·arior.Jst contiene l'l sith1 .Jctivo de la tran:.fcrasa de peptidilos. que catali7.a la síntesis de enlaces pc:ptídkos. La subunidad pequeña dl'l ribo~oma ( 30S en eut·ariotest St' Ulll' al RN Am.

baUl'Tia~.

40$ en

El superenrollamiento des•.:rilll: el enrolla miento de un DNA dúplex terrado en un L'\pado. de nlilnera que CT117.d sobre su propio ejl'. Una superfamilia

un conjunto dt• g<·nes relacionados por un común. pero qul' ,1hora mue~tra variaciolll'">

l'S

~upuesto ann·~tro comiderablc~.

La superfamilia no virica de tran~J'Kl~ones dientemt·ntt' de lo~ n·troviru~.

~e:

origin6 indl·pen-

La superfamllia virica incluye tramf'~'sont•s reladonado' mn n·-

trovirus; ~on ddinidm por !>etUt'ncia' que codifican la tramcripta~a inver>a o integra~a . La supresión ocurre cuando un segu ndo suceso di mina lo~ ekctos de una mutación sin rt'V<.'rtir eltamhio original del DNA. Un supresor es una ~t·gunda mutadt'm que compen~a los efeL1u~ de una mutación primaria u que lo~ modifica. Un supresor de cambio del marco de lectura es una inserdún o dt•leción dl· una base que rt·stablt>ce la c:\trut1ura de lectura original en un gt'n que ha tt'nidn una dclcción o inserdón de una base. El supresor de mutación de sentido erróneo codifica un RNAt que ha mutado para reconocer a un codón dilerentt·. Fl RNAt supri· nw el eleuo dt• la mmal.ilm original insertando un anúnoácido dbtinto en un codón mutado.

864

Glosario

Un supresor de mutación terminadora es un gen que coditita un RNAt mutado par.J responder a uno o más de lo~ codone5 de terminadún <' insertar un aminoácido en t•se sitio.

por lo general. causa la desintegración dd mecanismo sintético. Asimismo, una terminadón e~ un segmento de DNA donde finaliza la rc:plicadón.

La transcríptasa inversa e:' una l'n7ima que utiliza un moldt• dt• RNA d~: una sola cadena para produár una mpia dt• DNA dt· •a· lkna dúplex.

El surco mayor dd DNA tit·m· 22 Á de ancho.

Un terminador (t) es una secuencia de DNA qut• hace que la RNA polinwrasa concluya la transaipdón.

Un transcriptoma l'S el conjunto compkto de molécula, d(• RNA pre,entt• en 1111.1 u; lula, tc:j ido u organismo. S u wmplcjidad st• debe sol>re todo a los RNAm. pero también incluye RNA no codifkadorcs.

El surco menor del DNA tiene un ):TO~or dt• 12 Á. La \Ínte~i' susceptible a errores \e pre~t·nta cuando el DNA incorpora ba\c~ no complememaria'> a una cadt•flcl hija. I.<~s

sustituciones neutrales t•n una proteína cau~an cambios en los aminoácido~ que no influy<'ll en su auividad.

SWI/SNF t·~ un complejo dt• rcmodclaci6n dt• cromatina; utiliza la hidrólb.is de ATP p.1ra cambiar la oryanir.ación dt• los nudeosoma~.

El T-ONA es el ~e¡.¡mt•nto del plá~mido Ti dl'l A_qrobacurium tum<'· jadm.1 qut• ~e: tramlier<" al núclt·o de la ci·lula vegetal durante la inrt•cción; porta ¡¡ent•s qm· transforman l.J l.élula vegetal. Un tabique es la estructura qut· ~e: forma l'll el centro de una barteri.t en pron·so de división y que proporciona el ~itio en que se ~c:pararán la~ b.1cterias hijas. Se ut ili1a t•l mbmo término par.J nombrar la pared cdular que: st• forma entre las célula' vcgetale~ ,11 término de la mitosis. La~ TAF ~nn sub11nidadc:\ dt• TF 11 D que ayudan a la TBP t'n su unión nm d DNA. También proveen puntos de t"nntacto para otro' cnmponeme~ del aparato de transcripción.

La talasemia es una enfermedad de los eritrocitos re,ultante de la can•ncia de una globina a o p.

Los terminadores intrínsecos !>on su~n·ptibles de conduir la trammpción por la RNA polimerasa batteriana en amcnCJ.J de cualquier factor adicional. Una enzima terminasa rragmenta multímeros de un gcnoma vírico y despu~~ utiliLa la hidrólisis dt· ATP para proporcionar la energía de tramlocadon del DNA had.J una cápside vírit:a vada a pan ir dt'l extremo t·~ondido. Una tétrada de~cribl:' la' cuatro t•spor.h ( haploidc~ ) resultante~ de la rncio'h t'n las levadura~ . (El término se u~ú originalmt·ntt• para dc:!>lrihir la t'\tructur,l enn111trada al inicio de la meio~i~. que: ahora ~e ronocc como bivalt-ntt·. y contiene la' cuatro cromátidas produdda~ por duplicad{m de un par de cromosoma' homcílogo\).

Tf11 D e~ t'l faCI<>r de tramuipciún qm· se lme a la 'etuencia TATA en !lujo aslendentc rt·~pl'CtO del punto di." inicio de los promotores de la polímerasa 11 de RNA: e~tá constituido por TBP (protl'Ína de unión a TATA ) y las subunidades TAF QUl' S<' unen a TBP. El tiempo de duplicación t'S el periodo (por lo general. en rninutosl que unc1 célula bacteriana requiere para n·prnductrse.

de una estructura de

1.!1 timocito DP es un linlocitu pmitivo dúplex, e~ dl."rir. una n:·lula T inmadura que expresa CD4 y CD8 en ~u ~upl'Tlicie. La ~elec­ dún de timodtos DP en el timo da lugar a célula' T maduras que nprc:~n CD4 o CD8.

La telomerasa es una en1ima ribonudeoproteínica Qlll' rrca unidade~ dt· rt•pctkión de una cadena en el tcl<Ímero agregando ba'e~ individuales al extremo 3' dd DNA. dirigida por una ~e­ cut·ntia dt· RNA en el compont·nte RNA de la enLima.

Los transpo,onc~ bacteriano~ qul' tran~punan marcadore' no rt·lacinnados con su fundtín. por t'jt•mplo. re~htt'ncia a fánnat•us, se nombran Tn y un número.

Un tallo e~ d st•gmento de horquilla en d RNA.

pare~

de:

basl·~

Un telómero es el extremo natural de un cromosoma; la secuencia de DNA con~ta de una unidad de: re¡lt'titiún simplt' con un extrt·mo de una '>ola cadt'll.J protuberante. Lo:. genes de lagos tempranos inmediatos dd fago lambda equivalen J la da~t· tt•mpratM de otrus lagos. Se transcriben inmediatamente después de la interan:iún ron la RNA polimerasa del hospedador. Los gt'nes tempranos retrasados del lago lambda son equivalentes a Jos genes intermedios de: otrn~ lagos. No ilU~dcn tramcribirsc ha~ta quc no S<.' hayan sintt•tizc~do las proteínas reguladoras cndifitad.ls por los gene~ tempranos inm<•diato:.. Un teratoma es un crecimiento donde proliferan dt·~organizd­ damente vario~ tipo~ de células diferendadas. entrt• otras. piel. dientes y hue,o. una Vt'7 qul' se trasplanta el embrión lt'tnprano a uno de los tejido~ de un animal adulto. La terminación prematura describe la condu~ilin dt• una protdna o de la síntt:)b de RNA ant<.'s de que la tadc:na c:st~ <·omplcta. En la síntesb de protdnc1s puedc ser <·amada por una mlltación que crea endone:~ de terminación en d dominio codititador. En la síllle~is dt' RNA st tkhc a varios sucesos que indden en la RNA polimera~a.

La t~rminación <.'S una reacdón independiente que concluy<' unJ reacción de síntesis macromolecular ln·plicación. rr,mscripcit'lll o traducción) interrumpiendo la adición dt• subu nid.Jdt·~ que.

Tolerancia e~ la falta dt• rl'Spursta in m unitaria ante un antígeno (ya sea autoantí~eno o amíg(•no l'Xtraño) por dt'lt•tión dun,1l. Una topolsomerasa de DNA e~ una l'll'l:ima qut' cambia el número de Vt'tt'' en que: dos cadt•nas se entreuuzan l'll una molt-tuld terr.Jda dt• DNA medi.Jnte <.Orte dl'l ONA. paso dc:lrnhmo a tra· vés de la rotura y rc,cllado del DNA . Una topoisomerasa de tipo I es una enL.irna qm· cambia la topología del DNA mcdiantt' rormadún de muescas y resellado ele una cadena dt• DNA. Una topolsomerasa de tipo li l'S una enzima que: camhiil 1,1 topología del ONA mecli,mtc formación de mues
RNA: es c.Jtali..:ada por J.:¡ <'llZima

tran.,cripta~a

invt'rsa.

Un transcrito t'S d RNA producido al copiar una cadena 1k ONA; podria nec<.'sitarse ¡Hnt·e~amit·nto para generar un RNA maduro. Un transcrito primario es l'l pnxiucto ori~inal dl' un RN A nomodificado que mm·~ponde a una unidad dt· tr&msrnpción. Ur1.1 n·a<"ción dt• transesterificación rompe y <~~trucwra t·nlaces químicos en una tramft•rt•ncia coordinada. de rnam·ra que no se nen·~ita energía. transfección de células cucariúticas es la adqubiciún de nm·vo.. marcadores génicos por incorporación del DNA
La

La transferasa de peptidilo conlleva la actividad de subunidad ribnsómka grande qut• simetila un t•nl.Jce p<.'ptídko tuando ~e agrega un ammoáddo a unJ cadena polipeptídica en nccimic:nto. La actividad catalítica real ('~ una de las propic:dad~s del HNAr. El dnminio d~ transferencia t'~ un St'gmc:nto en el pl,ismido F que: se requiere para la conjugación baneriana . La transformación de bacterias l'S l<J adquisilión de: nttt'Vt' mate· rial gt•nt;tko por incorporadón de DNA ,1didnnal. La transformación de células eucariútira' ~t· rcfkre a su com·c:rsiún a un <~stado d<.' crecimiento irrc:strioo en cultivo. que: ~imula un trastorno tumorigénko o idcntico ,, éste.

Un transgén t·~ un gen que se introd111:e t•n una n ;luld o animal dt•sde una ruc:ntc ('Xtema. Una transición es una mut.acilín donde una pirimidina es sustilllida por la otra. o donde una purina es suMituida por la otra. Translocación es el movimiento de un codón del ribthoma a lo largo dd RNAm después de la adición dt• cada aminoácido a la fadcna polipeptídica. La translocación dc~mbc la etapa de: impoT1acicín o l'Xportación nuclear. cuando una proteína o ~u~trato dl· RNA se traslada a travr' del p(>ro nuclear. J.a translocadón cotraduccional dt•scribe el movirnit'nto de una prntcína conforme 'e: ~íntcti7a a rravé~ de: una membrana. El ~~~rmino suele lirnitarst· a los casos en que: el ribosoma se une cll conducto. E~ta forma de tran~locadún pucdt• r<.'stringirse al retículo endoplásmico. l..1 translocadón postraduccionat es el movimiento dl' una proteína a través dl' una mt•mbrancl una VCltonduída la 'Ínt<·sis de la proteína y liberada del ribosoma. La translocación proteínica de\Cribc el movimiento de una proteína a trélvés de una membrana. ya sea .1 través de organelos en t'ucariotas o de la membrana pl,lsmc'ítica en la~ bacteria~. Cad,l tnt·mbrana a través dt· la cual se transloLan protdnc1~ ricne un conducto especializado para l'Sl' fin . El dominio transmembrana e~ la pane dl' una proteína que abarl.J la bicapa dt• la membrana: l'S hidrófobcl y en mudws ca~m cuntit•ne aproximadamente 20 aminoáddo~ qut• lorm,ln unJ hélice a.

Glosario

865

La transmisión de fosfatos d~cribe una \Ía donde un grupo fos· fato ra~a a través de una \t'rie de proteínas. La transposasa e' la adividad enzimática implicada t•n la imerdlin dt• un tran!>po~tín en un nuevo sitio.

La transposición

\l' n:tit•n• .11 movimiento dt· un trano¡posón hada un mlt'VU sitio cn e-1 ¡¡ennma.

La transposición conservadora es el movimiento dt• grandt'S denu:ntm q1w on¡.¡inalmerllt' \1.' clasificaron corno tran~posonr~ .

pero qut· .1hora l>(' l'lllhiderant'(li\nmas. El mccani~rno dt• movimicmo )t' ascmt•jc1 al de eslhiún e integración dc un rago. La transposición no rtpllcatfva de~cribc el traslado de 1111 trampo·

que tkja un 'itio donadm (por In general wn produtdún tlt· una rotura ue cadcna dúplex) y \t: muda a un nuevo sitio.

)Óil

La transposición repllcativa dc,ni!Jt: l'l movimiento de un tran\· posón por un mt'Cdlll\llltl en el qu\.' primero e-s replicado y tk~­

pués. una copia \e tranl>fkre a otro sitio. Un transposón t'\ una secuencia de DNA ~usceptible- de in\erlar\t' a sí misma (o a una rupia de sí misma) en una nueva h11.alil..adím \.'n t'l genoma. \in rdación de secuencia cnn cl sitio diJnJ.

l.a unlon paranémica describe un dominio tlundc dos secuencial> complementarias del DJIOA S(' vinculan enlorma laterolate-ral. en lugar de conl>tituir una ht;lke dúpk'x. Lcl unión terminal no homóloga conjuga t'xm·mus romos. es CO·

mún a mucha' vía' de n·paración y cierta~ vía' dt• rt·combinadt'm (wmo t•n la rccombinadón de inmunoglobulinal>). Una unión recombinante t'\ el punto t.lunue Sl' juntan dos rnuléculas dt• DNA dúplex recombinantc (oordc de un dominio ht·tcmdúpl~x).

El valor C corresponde a la cantidad total d~ ONA en el Rt'noma (pur conjunto haploidc dc cromosomas) .

Un dominio variable (dominio V) e~ un ~itio ue uniün de antígt·nt~ de una inmunu¡.:lobulina o un.1 nwlécula dt.'l ren•ptor de tdula5 T. lo!> dominio~ V c)tán formado\ por duminio~ variables dt• la\ l'alll'na~ constituyentes. ~on codificadcl\ por sc¡¡mcntu\ del !(en V y varían ampliamente entre rcn·ptnrt'\ dt' antígen~ tomo resultado de múltipks copia!> genúmita\ drlcn·ntes y de cambiof> introducido!> durante la síntesis.

El movirnientu dt· una pwti.'Ína a travél> de una bicapa de lípidm \Ut'lt• requerir un traslocón. proteína intcgral de la membrana que proporciona un wnducto para t•l de~plazamicnto de se-gmento~ pollpeptídicm a travt;s dr ell.J.

lo\ 'i~tcma~ dt· vigilancia revisan lm ácido~ nudeicos para detectar errurc!>. El término se usa en ('Uiltc>.tns dift•rt•ntes. Un ejem· plo t'S el si!>tema qUt: fragmentad RNAlm que prt·,cnta mma· done~ ~in ~cntido; otro es el cunjunto de shtema' quc reacciona a los dai'ro' sufridos por la hélice dúplex. l..d caracterÍ\tica wrním es que cl \btt·ma r<·conoce una ~ecuenda o t.·~trunura no válida y dc\erKadena una respuesta.

Ty se rdiert· altranspus1in de levadura. primcr dcmento susceptible dt• transposición idcnufkado t•n las levadura\.

Virion e~ la partícula vírica física (lnd~pendil'ntcmcnte de \u (a· pat.·idad de infectar célula5 y replicar~e).

Una transversión e~ una mutadún donde una purina e) \U\titui· da por Ulhl pirirnidina. o vkevcrsa.

U3 e~ la l>Ct'Ucncia rt.'Jl<'tidJ en e-1 extrcmo 3' dt• un RNA rt'tro· vírico. US es la vírico.

~eruenlia

rt•pt•tidJ en el extremo 5' dt· un RNA rt'tro·

l.a ultralectura tiene lugar durante la transcripdón o tradutdon cuando una RNA pulimcrasa o el ribo\oma. respectivamente. ignoran una seilcll de tcmtinatión por una muLldón del molde o la panidpación de un fa<1ur accesorio. La replicJcion de una sola copla describe w1 si~tema de control dondc hay ~ÍIIo una mpia de un n·plicón por unidad battt·rian¡:r. El crornmoma bactt•riano y algunos plásmidos prcsentcln t''te tipo de- re-guladún . La unidad celular dt·~cribt' d cstddo de una bactt•ria E.

r.Jda por una nut•va divi~ión; ~ólu ori¡H'Il uc replkadún.

~u

coli gt.'nt'·

longitud cs de 1.7 pm y tieuc un

Una unidad de transcripción es la secucnda t.•ntn· los sitio!> dt• inici,Kión y termlnadon le1d.t por la RNA polimerasa; puede incluir más de- un gen. La unión errónea de bases t•s un apareamiento entrt· dos b.Jscs que no cumple con la regla dt• Wabon-Crick. por ejemplo. adenina con dtusind, timma nm guanina. La unión estrecha de la RNA polimerasa al DNA dcscribt.• la for-

madtín de un complejo abieno (orando las han separauu).

866

Glosario

cadena~

de DNA se

Índice alfabético

Un vi rolde t') un pequeño ácido nudciro lnfercio~o quc no ticnc t'apa protcínica . la) rnut.Jdones de un Cago virulento no pueden lisogt•nia.

t'~tablt·n·r

la

Un virus auxiliar provee funt.iune~ au,cntt•s en un viru' dckctumo. lo nral permite que este último conciuya su <.ido infecdo· w durante una infección mixta. Un virus de cadena positiva tiene: un genoma de ácido nudci· en de una sula cadena cuy.J secuencia cud1fica dtrcctamente- los produe1os proteínicrn.. Un virus de transducción lleva parte del gt•rwma del hospedador t•n lugar de partc de \U propia l>CCU('Il
Ei.

L'O/i.

Un virusoide es un ácido nuddco infeccioso. pequeño. qm· Sl' enurcntra tkntro dl' la cápside de un virm vrgctal mn su propio ~wnoma.

La~ rcgiones de VNTR (númcro variable de repeticiones en tán· dem) de!>criht•n secuencias repetida~ muy cortas que incluyen micros.lt.:litt') y rnini~atélitcs.

Una zootransferencia describe cl uso de la tran\ft'rcncia de Southcm par.J probar la capaddad dt· una sonda de DNA dt.· una espede para formar híbridos cun d DNA de los genomas de una variedad de otra~ cspcdes.

Nold' Lt" mím<'m' M r-is:ln• s~dos por f y , •·nrrMpundrn a figura< y ruadros. IMflC'<,Ivamrnlt

A A. dominio, 1114 ._ l!t'llM npróllros. 490·491. 490{. 49t{ A. pnuruu. rqrtladón drl Jmoma ck b Lt1os. )97-1'18. l97{

At·llvt,.., , .• _.,.,,, twrJ apan·amlc-nto de levadwas. 488·489, 48?/ A<'U<- canaln. rormadóo.traolocón. 2ll ·2ll. 2121 Ada¡JI.thk. tnmuntd.l
A,
rnrrada dd RNAt. 179. 179[ luncuin. RNAr 11>~. 1111 11< Uf'dliOil, 1 ~4. t 54( RNAtaminna 11>7. tn-t78. 210. 210( uamluuuun. t 1>'1·170. 170[ AAG (al~ual·adrnma ~1un"clal.'l dr ONAl. SOl> 4AUAAA. <et"Utn'IS. 69V A·Bt. 187

Ahleno!>, n1.1rws dr lr<1ura tORFI WlllillllO,, 41. 41/ drtiniclón, l2. l2{ ORfl ~M ORI·2 SM

ORH.

~45

<elNtll>ll nalural. 89 ~IICI. locus lkl -ruJlCI sant~ufn..n. 28. 18{ Abund.lnma. 77CI At~l~r...tnr•\ nuu.tudnt"\. 274 Acrnlnt..X fragmentos. 519. 519{. 745 A«lllation d<' hi•lonu •nrv•mur dr la r•rr<">rón !!<'ruca. 805·SOó. 805( mudrfiudon. 801. 80lf. 804. 804{ lran, 404. 404{ A.ct1d.i.nas mutauun~ de IL.amlrio lk"l ntilrcu dl' lt•oura. 31 At1 In~. ~n. C"oludón. lnmmn y, 52. 52(

Actlv•dor~ ~telll~·""· 800 807 Jl"CiillrJII\Irt.lW' 1k hi.CIIIlol'. 806·807. 806[. 807{ .tddlcm, 64 7 Wol<'li\ador~ Vt
Ükl<11vadort•

wn<erur.ttión d" promocor proximal. l'"'"'"i.ldor. l>lt·6l2. 1>31( t.RP \'t,ISt LRP. at1.-a..tur IUIItll>ll'"'· 1>42·641. 64lf m..tU baSoJI. 646·643 647{. 6481 modelos ck t'Stlmulat.l. 649-6H, 6'SOf srnslblts • U3'ndos. rr:<.rplorcs dc CSI.t:T\llck,. 6,1-<.H. 6S~f \111 di>IOIIIIt" M J<11\'.K101t. 647 ubicuo•. 1>28·629 unión, por tltm~nros & S«Urnóa <"'ta. 627 · 628. 627(

lna""'""'"

Ad<"nuvrru•. onitl.lt1on. protnnas trnninaks. 3941'15, 19~{ rtpltadón del DNA por drsptn..mknco & cadena. 394. 3'1Sf Adkdón. SiSUmiiS, 420. 421/ AllP. ril>osllaaón. 1o~ma d•h~nu. 172 AI>PR (rihlrl. W4. ~9·t/. 1>02 Ag.llla d~ tomna. enl.rmroad. 401 -402. 4021 Ken~• de vtrutrnda. 403-404. 404[ T·DNA. grne•. 402·405. 401{. 404f II.~N'Nafl'illm I'Uiflt{ll41<'11S, enlen~d de agalla ck nrrnna, 4()J.4(lS , 402{·~04/ Asmphr•. piA•mrtlol'l. 402 Al!J'Utwml~nlns. 98·121> All> (dn.lmtn~w dr atkhna mducida por ani•ao(•rll. ~"~ Wll A•~Llm~ ~nivutadrs prot~<1or•s. 711}

hh>I<'Rci4tlorC"o. 781· 782. 782( ddlnloon. 781 rsoructwa ck wcrorn.uuw. 735. 78~f h~••·nl<-n>manna. 78l 1•n>ptrdadr\ olirTninn.>k•. 7114-78~. 784/ prc>posno. 782-783 .,.,.,. hlpt·~cn>~bl~s. 711' van.lLttln"' de lucr1.... 711~·7M. 7116( Ale~cono. flujo. 1o 1 Akhta. t'Xdu,lnn. rn'structuraclón produIImórrtw< dt• ti¡><• ,iJvt'\trc, ~7 llllprt•shm. RIC'Iilalicln dd DNA. 8l.2·1B4, IIHJ li(HI \JlVI'>Irt', 28. 28{. H tlunrlllollllt'\, 25, 25/ 1\'C"niYtlS. 25. 25/ rnúldplr~ 27· 28. 28{. VlaJtii»IIMnt Pulimorfhnu"' a g<"nn. 490-~9l . 490{. 491/ <12. protf'ÚW. 492 Alfalfa, virus dc:l mowtco (AMVl. 7B-734 AlgnrllnlfO\ rar~ ldrn1iftcodón dr l!<'llC'S, 65·61> AIO\lEnro. wntrol 107 Alqml-adrntn.l -IIJCI)Si..s. dt' DNA (AAGI. 506 11.1 "''11\ld~d ""'Ul(YS M Oif!IOilUckóUdos & IIIDAI mrtlídón M RNAm 94. 94/ '""" y cmralmt•. j!C'nt>ma humano. 84 RNA. "'" dllcrennat de la unión de rmpalmr. 685·6118. 686{. 1>37[ l•rtnr dr ronr y rmpalm~ oASfl. 685-681> Alu. l.tmill.t. 5M 5M

Arnb.Jr, wtlc'111 tn•luu tk-lo'l'minad{m UA!li. 172. ION \ll('lrr\llfe\, 206. 208 209 Amhlt-ntal. csuk. ~rnrs rrl.adorwdos ron la lt'lllflC'tdUrra, 2711-27'1 Amlnu.~udo>

.lr'<Timmaonn lntrin..-ta. 201·206. 204{.105( nnrv9, 19'1f 1\'amón M ur,a dr RNAt, 200-201. 200/. 209 R'l.x'km.adn< rodonts rrlaoooadns. l'l0-192. 19lf \li,UCtllHUk'"\, r1'4.lki,fic.At100. 212. 212{ Anllno.Kll•do. RNAc n>rni'O'idtin d~ a1runn.iddos. 1QO <»lllrul. lloCI dcftruwm. ll t cmrad.l ~ un ~nio A. 1(o? 170{ t"oonlt1trra. dC'I mmpkio tmwio, I'F·<.i, 171 171( lre111r a tmrrrmitln•. 1611· t 69. 1611( pcplldJ.llr¡tl>fera>a. •~ua en la rcacci<ín. 174. 174(

"·kull111 l"'d ""'·rriun rn d shto A. 210.21 01 \lnu.•sh: dt• cn),U't'\ pt'Jllhlku\, tran,fcrenda 'k t .ldt'llol t>nh¡lt'plldi<J. l 1>8·1 1>?. 168{ \llltl''l' de• pnHl'tnil\ lliJ. 152 UIIIUII di \11110 A 1~4. 1i-4/. l ~v unión al ~llh> P. 1~4 154{. 155[ '\llliC'M\.ol')

urga tlrl RNAI rnn ammo.iddos. 200·201 lOO(. 209 ct....- t. 201 · 202. 201(. 202! ntn1oura nu••llna. 202, 202[ ph<'~U<' & unu'on a nuo lt'titidos. 202 't'l"Ut'OCiaS diSUilll\dS 201-202

ti.>-. 11. 20t{. 202. lOlf ltlllLitCn u>n t•l RNAI. 201. 203{ dt'llnll1con, 1 \1 ,.,,,...,flmt.Jd de rcmnoctm~nto• nu:c..dlrti\IIIU'\

dr OIITt'lOOII. 201-201>. 1.04[. 205{ •hin A. 211 entrada. 1(>7 rnsrml)n. t 77·171! \dfnlnn para 1.1 lns<'rdón. 21 o. 210} AMP dtl~t·o olt11vJdm l:RP, J21 , 321{ c'lnalura. lll. 321( 111Vt'lt•\ dt• ¡¡hKo\J, 12 1 pnrteín,t lt<<'tllnra dt• 1CRP1. ~6 ~ >~nlc>ls por l¡ od.u.~ de adcnila1o. 321 Am('lhu'oruu". '>«')lm<·nlu< reglón rspecilica d<"ltrmm.)nte

..tc:l \C::\u llloJ"-ulinu d~J

nomo>11ma Y. 87, 87{ AMV I\ICU\ dt't III<....:Jrro M la alfalf.JI. 7H· 7\-4 Andaje 'oC<.UCUl1a-. •hmlUs. glc>bura d('. gent'\, 104 Anr:clman. smdromc. 8l4 An¡¡rd.>da. rrutnna. 660 Arultn loC(>Ial. 414 Anln~ t'l!lula\. rnlm>RNA. J-4! matrr1all!t'nétlro. 5. '1

8<1'""'"'-

Anti·llt\l~tntt'\,

l'l<m<"niM it'.t•

867

'"'"¡,¡,,

Anucodon.-. Vt...._. Cudun·•nuuJdón. aparnmtrnto de !14'>0 dcllnición. 130. 130{ ~ctfid~d del RNAI. lll. lll/ mutadon~. 201. 207·208. '107/ \UI'f""lrt"\, 207·203, 207f Anticuerpos definl(i,\n, 572 cslruou,.., 575·576. ~76/ lnterJcción con ant!Kenn>. H2. 572[ AntiR<'nico. drtennm.lnte (ephnpo), 575. 591 Anlígr"nns dcfimdón. 572 rxpansión clon•l. 574·H5, 574/ hllcra.dón wn In< inti, 574·575 574{ AnuparilriJ. oncniJdon, de udrnJ' JM•hnudenUUJ
adrna. 129. 129/ l39f RNA. dcwolvaciól'l de 11 UptU>Ón BáiiGI. 1111· H9. 119/ Anll·~m. 675·676

amn. llll-)39,

Antltrmuryocm

um1rol de la tran\Olpc.ión. 291, 291{ drfintCIOil 287 lall'"· 1~· HS. 154{ ca \Cada lí1lca. 35 7-158, n8[. n9{ pol~ra.sa de RNA, 291-295, 294( prutcma. ••lrn\lón de la um~d dr uan< dr unlon. 292·29\, 291( AntiTRAJ•. 1l4. 1l4f Anudcall•'· u'lula., 41 3. 41 3/ Aparramknw de l>oun bJIJncco. modiHcJcinnc• dd amimdc'm. 196· 197, 196/ rodón-•nU~,>dón. Vfált n..ton-anucodt\n, a¡wrcam~rmo dr l>i'o<'' complemwl.lrio. drhntot\n, 7, 7/ >Ulle>l\ de RNAm. H. Hf contwl .1<-1 R'IA. Hll funn.adón dd nudrn de uumnn del lf\ll"' l. 709·710 inooilY. 196, 196{ A~amlrnlo. amblo de llpo, dlubt\ n~dr~. 495.495/ rqul4d6n de ezprnión dt cndonudre~o~ KO, 494-496. 49'f Aparr•mirmos enóncos ba~ (lransicioncsl, 1'·16, 16/ errores e o la sínlcsl.S pmleintcistrma~ d~ reparaoón, <jjiO(. 501 rontn>l din·cdnn~l. '07 · ,09, ,1111/. ~09/ <..¡d11c>. SOOJ, 501 ~
DNA cenuom.;rl(o. 746 ens.Jmbl< .Ir umnauna, 774 grnom._ 80·81. 81f tanuioo de la ramiti.l. 81. 81{ Archaea, dtmcnstunes delJ!rnonu, numen> dr lrDn. 78, 78{ RNAt, rkmrn1udr ronr y rmpal~. 691·692. 691{ ARE. demt·m•"- 142, 142(. 697 ANS, clcrnemu< (sccuenda dt rrpltciC1ÓO au1ónoma1. 384-185. 385[. 49). 49)( Amópodos. OSA -alcltll' tic, rc¡x"'ltt
868

Índice alfabético

A>a:odeme. Ou1o. 258 elrmrmo promowr m cUPF), 615, 61 ' ' rl~ml·ntt)) ¡nmnuc:nr~ rn. 644 so.-..uc:ntU IOI"oldora ro (UAS). 629-630 A>c.onucclll>, !~radas. form•oón de nporu. 475. 47Sf Ascu•. 475 A""lnas. células T (crlulas T cilolóxlc.s). 573 ASF (btetor .Jicmali"o de ronr y nnpalm~l. 685·686 A~f/~P2, cumplrJn, 686 AsiA, prod u<1o mdUlcado ~"" f•gu, l55 Ast)(iau(m, 13 Asp·RNAt. stnt~ua, wntat1o wll rl IÍi. 517 AlenuacitJn ronuol. drl o~rón I'J', H5· H6. ll5f, H6f por rraducdón. H6-H8. 117/. H8f dr6nklón. 3H Alenuadurn. H.w lmnn~. t~mtlnad"'n Calenuadornl •Atcm~·. silioun la evare«bemlrnto, 449 tran•ponr dc procdn.,, 241 AUG, rod6n dr inklarlón conlrl y. 160, 160{ en rucariul~'· 163· 11>4. llllf nun••·i<'m. 211 rewnudmlrntu durame la rlonRadon. 1511· 159 sct·m·nda Shiii~·D&Igarnu. 161·162/ AultX'31alhiw. cune y rm¡~.tltne, frente a cune y empalme nudra.r. 68S. 685{ Auux-one y emp;~lme odtzadon. mvrrw. 708, 710/ prinur1a. 708 710{ de!imdon. 1>8 3 f.anorcs de madur•oon para k>s intrones, 716. 717,7171 718/ mtrnnn. dd grul><>l. lr.an\nlenftcaoon. 707· 709, 708/· 71111 dd grupo 11. 681·684 61141. 716-717. 711>{ AUiodt•'lSton de vuotdr• \' dr "ru"nd.- 719, 719{ Aut<><·nwmhla¡e dr ¡>n>lrllla\ .UI .l2~ Autógena. rt'llulaCión control dr stmest~ drl t·n...,mble ma dr latlt•Jleina r, 12'·ll6, 12~/. U6J Autt>lnrnumrana. rnlcrmcdad. 571 Auwnuma. \CCU~nlia dr rrpiiCimÓn (dt·mt·nlo' .4RS}, 384-lM~. 185(. 491, •9lf AtttónOtnos. l'lrmrmn' nltnladute\, 5411, S41/. ~42

AumrndtOjra!Ca drlnngrn del replitón. 3110. liiOf AuJUJJarn, celula• T. ~72 virus, 558 A\'iarc;, inmuno¡¡lnbuU.na~ rn<1mbk a panlr M n. roturn de doble cadena. 4<>11. 464/ Azaottdina S. 6H

B B. dlul.ls clln!ocilos Bl amrruerpos. W8 ddinioón, 572

dc,..rroUn. 595. 59'/ dilerenáación. 587. 594. 594/ expans1ón ctnnal 574-Sn. 574/ B. células, fenc'nnenu de t.. memorii, ~?4 rrcc1Hur cBCRI. 59~. 59Sf B. forma dd DNA. 8 8, hnloolt" Vl.a.c B. cclul4\ chnl~liU> BJ &dl/w •nthrU, 79 Badl/11> >Ubfl/u nJM>rut..tiun. 418·419 la<1urt\ a, 2112 grnes rrp. Iimcra'ld de RNA. 28l so¡. proltina. 420 spoOJ. pru~t·ona. 4 211 'uhumwd <Jtahura, 442 8d<1rn1ón ~ma. l01. H2 a ltaYk del DHA VlattW Tr~nsaipdón; Traduc..uón

a lra"és del ANA l'tol.lt RHA, rtjuladnr hi¡as. lormaCion dclscplo, 411412. 411[. 412{ mutacitmcs. turma celular. 412-41l. 411/ EF·TU. ~nlrada drl RNAt aml noo~dlado al shio A, 167· 168, 167{ n¡>Orulatión. mrol JMit la<101C\ o. 2Rl·286, 284f286J elCptrSÍÓO Jlttllca, H-34. l4f pruldnJ' r, 32 ), l25/ r.gul.adon. ncsativ•. 101. lOV po>lliva, 301, 301{ lanore• de imnacion. 1511. 1~8/. 164 factores a. rq¡ione• ronocrnoo. 280. 280( !agcx. Hl-152. 151/ f.Ur V~lillVi, 28) f·pCI'>lll"o· 19'> mnte a ~nomas eucarlóciros. rephcoldón. 3n grnft. 18 RNAr. 112 g~noma

nuclrotd<. H4-7l5. 714/ SUI"'rrnroll.adtl, 7lS·736, 735}. 736/ !amaño. númrro .tc genn. 78, 78/ ltsogt'mcas. .1 ~o oprronrs. contnJI dr atC"nuac1un. \ '"

Jl"logémlt>ll'> p.tlto¡;<:nn; • 79 plásmid'"· 351-H2. Hlf l)(>limrrao;a dt• RNA, 2to2·l6 1 262/ atlivadHn dt• la re1•ar•w•n. 62~·627. 626} subumdad.-s. 265·266. 266( lenninad·2117, 287/ pt>IIS<.nna,, t.uJtar)o, 114 JM>ICJt<'grtliO'>t>tiW, r«ombinactón

""1'"'·

~¡xófic•d~ SitiO, ~1)-417.416{

rii,.>W>ma. \uhuntdtltlr.. 15 3. 113/ lrolllikX~<'lÓn, 169-170. 170/ RNA rrJ!Uiador. 141 -142. 142{ KJo.Arn Od<>vtlal, 115·1l7, IJSf. 116/ de pr01emas ribosoiDicas. 114-135. 11,, RNAr. pmdlii.<~Úrt. 698·699. 698/ S
"•"''"""•~<'""· 1-4. -4/

uan\luuuon. wltaduccoorul. 246-247. 247{ pcxuaducoon•L 2•6-147. 247{ llaurnnl•fl'" Wau fallO' Balan<eo, htpolnts. 191-191. 191(. 191J nall>l.aru. •nlllc,.,, 74 l-744, 744{ ll.tm, t\lutn, 114. 114/ Banda\, lunnadfln. en nc:• dr. tlr CfOtlll>\tlhta•. 740· 741. 740/. 74\f

~. pilw,

wpdor dt puu.a. 4-40·441 sclerncín. ''~8 ~2. miOnt, síndrume, 517 lll11qucadu. marm dr lr<1 ura. U, 12{ liuvln•. hmmun• de
2Y4 Boyanle, drmldid.. 118. 118(. 120 llratt" ddllllt1tln, 41B C'l~mrnlt" IS. 525·526. S25f Dromoduoúnlo. 812 8romourJnltl, mut.lottnr' mdudd~~- 1S-16. ll>f llullncn. .kidn. onhtl>lt1C>n '"' tk-\attlíl.l"" de ltt\UH\ool\, 806 bZIP cstruetura. 66}, 661/

e

c. handO>. rn crn~rom.-roo. 745. 746/ ( • domunos temnnal~ I>NA. M4 humeudonúno, 6 5'1 pohm48 n•prr""· ll Of. U 1

e, ~··n rrwmhlnnlun

ll.l.... l ~onhhn,

mc=,·dnl\mt, rmamble en el promotor, 621·623. 622[. 6H/ lnrcracdón ce>n aohadur...... 1146·648. 647/. M&f lnt~ra«tón

ron potmciadorn, 6H kx'allu de ao.iv.oción de transcrtpuon ttrann. 1>47. 647{ pun1n dr mkio de 11 lran><Tipnon, 642 nt"<~ rlemenws dr (BLEI. 628. 650 uamcripdón. rn«anlvno. 611 Bas.al~. lolomn (laCio~ aenrrales¡. 611 B.l
a¡wrrauucnlu. VttUt A¡wrramicmo dc ~ aparrJmtenlos erróneos de uranSlooncst. 1516. 16f nmdo!lcadón en el RNAt. 194 ·196, 195/ 1wrr>dr cnm¡>lrm
w

lnldadóll dr lfnlnls de protdnas, 1tll·l62. 161(.16~ malapar~adm,

18-19 remodón. reparaoón por escbl6n en dlu&a. M

uwnllmts.

504-50~.

rrparadón IX" ""i•i•\n de 500{. SOl 81\ura, DNA 62 B(R (r«tpeor d~ célulu Bl. 5'15. 595/ BEAF· U, 7111-7114. 7M3/ P·K"I.~<1ml~sa

análisis. pau Tttr•h)._,.._ auto conr l' C'mpalm< de lntronn <:n 1! a>JJ. 710·711, 7111 mdunion. 306, 306[. 307· 308 307/ ~-glnl>ulma

A<'O. ONAs.ttl. diacstión. 7311-7119. 789/ l.CR. 789·790, 790/ pmmowr. SitiOS hlprnrnsfblr s. 787

umc~

c~drna ll~era.

lraO\crl(>liÓn rn. lO#>

en d ensamble dt Id 577. 578( ~7'J

\llllt.'\1\ de· H1m1nw~luhuhna. ~76-~77 C, ¡>.~r~duja Jd v•lm. 61 C, rl'gllltl trr~flin t't>n\I.Jllt<'J. de la tnmunOj!lul>ulma. sn H6. 576/ c. valor, W·61, 60(, tolf C/U, dr moRNA. 699, 699/ CAAT. ctjlU, 628. 628f. 629. 1>49 prolrln• dt dcsplaumtemo cCOPI. 649 Cabrza. k>ngnud dd ONA m los vtrus. 731-732.

'"'Jlll·

7l2f C•dena con srnlldo (cadena rodificadora1. 129. 129{ de'pla7~mlrnlo dr. 194. l95f pc)o)d., 120 Cadrn~s

mdl\ tdualr\ mmplememanas dr lo; ~odos nuclet<'~

lttnn.ldón del du1,1n. 12·11. ll/ rrpllae1ón 11. 11/ mrercamhl11 dl'. rucdonrs. r<'paraóón d<' rl'pll~a<1t'>tt. 512· 511, 512/. ~ llf pcwtl•~ en el letr~mrru de los eml<'uerpos, 575· 576, 576f prot~nas de 1rans!errncia dr. cat~s dr ~\llllll~tinn dr t'~tkna mdovulual. 471·4 73. 472/. 47lf Cmr~rhdb.litu ti'Sdru crom01o0ma X. rompcns.ción d< dosis, 826. lll6f amdendna•. 830 exprnión aénica, irúliSU sistemático por RNAi. }44 t~enn

csenoaln, numem. 90. 90f

t~ennma.IIO

DNA no rcpcllllHl, Ultllerudo, 62 tarnaiit•. 61/ 81. 31{ de la famoha. 111. ftl/ loM.¡¡rn rt'llul.adur 342·)43 J4l/ lm/4, gen dtan.t. 142-141. 143{ mlcroRHA. 342-343. 143{ SI RNA (RNA lidrr rmp4lmadol, 689

CAF-1 ¡raoor dr msambajr dt C1'01118tiDa 11 771. 774 Camhou de '><'IUidu tiiUIUli)IIC>, drfintOÓR. 172 RNAI. 206·107, 207{ suprr-ur", 201> 207, 207}. 209 CJn.rr. >U>4/ (' i\Cir. mc>drlo. drla¡wrum~emo ck levaduras. 488 ·•89. 48?{ (¿srtcs anl\10\ para •pareantlmlo dr levaduras, 488-489. 489/ C.squrlr o. 119 1, ll9 2, 1}9 ehmmJCtón, dcltfadanón drlllNAm. 141. 143{ Ulretnu S' drl RNAm. 118-119. 138( Cat•lauo. 24) C.ll~lhlcas. aruvtdadr,, rlht...,>ma,, 711-715, 711/-714/ C..wiDbiUict crtJcmlws, 420 CBP (prmclna de um<m J CR!lR), 807 UH, prmdna•. rect'PI•>r•" dt dlula; T, 598·599, 599/ Cd(6, pro1c!na, 387- l88 O>P (drmrnim drprndienlcs del ádo alutarJ. 747. 747{. 748 CDP (proldna de d~lazamicmo de CAATJ, 649 CC'I>.ldor, delimnon. 4l7 c('~mlcntn

tmoooón dt r~pbcación de ColEI. •22-413. 4'22[. 421/ lnldadón dr >lmriok dr DNA. 07-419, 437/. 438/ helkasas. 4111. 4311( ptinllt.a, 4l8. 438{ SSB. 08. 438/ r~phacion rn el onaen. 450·45 l. 4SO/ Celular, uesta mmunuarla). sn. 573[. 599 Cf!N. lragmtr<'. 61 5 Centrórnrro 'bandJs c. 745. 746/ dcftmción, 745 DNA repcllllvo. 746 rucartotlro. 739. 139{ <«Uen<ú• ONA. ~n S ~'""· 747. 747/ Kparaoón durante la mltosu. 74~. 745{ umón" los mlcrt:>lúl>uiO\. 745-746 746/ llflllln del tuICJII ptlltrlru
CFU,696 c-fqs. JC'O. M 1

Índice llltoJ betH o

869

c.. ,m. 'WIS, 519 Clwpc:ront" Ksp70. SIStcm.t, ll5·l21>. 225/ 226{ m~catusmu. 225-226. 225/ ll6( nmoomdnalt-s. 144 pkptnit-1110 d~ pmlt'lOIS, 221-224. 22}(. 2J4{ procdn.o. d~suaturohLa.Ja. 224 rc-nrn \lnt~tiJada. 124 s~cA. 247·249, 248{ ~cB. 247·248. 243f sistenta cbapt-ronloa, 22 5·226. 225(. 226[ Lranspone a través dr protdnu dr .ir traii\CilpctOO iiiSTFI. 650 g~nes de, 649-650 pro1einas dt R~tp70, tmn. tltMtw1411 a:J f a:J ', 78l· 78-1. 78}[ llsp70. stncm.. 225·226. 22SJ. 226/ H•J>90 mt~ma. 225-126 226{ d. ~n. 360 Cklico. AMP I'TCII<"III•I r~•l'plnr.l dC' (CRPI. lC>} <11. g.-n para h..o¡:cma 168. lNJI Jlr&>lrm• 1b!l. 111111 n4 rlll ~~n p.~ra h">¡!~oiiJ 161!. 11>8/ Cm.-nu. rorrccoón 20-1. 20-11 Cinctowrn. 745· 746. 746{ Circullos. tc<.Jiolnllla. 94, 94/ ris domm<Jnlr. mutac!o\n. 1118 l()'l, 108( setuenda\ dr DNA ok actnaolun en nflHuradí>n. lS· 36. n( 9-r. 657-6511 1>57/

astrraru pruebA (pruebA ok n>mplcmcntadónl. 15-21>. 16( Ci"nín. 21.

Cindina. .lnamln•sa d<·. lndunwn. mmaoonn somaUcas 591-S93, 592} LttumrJ~o~I0\1tUJ (CMVJ, HS Lotopwnli••· hrrenoa. 611 <..Jtorl.Umlro. domhuo 601 Cilc>tóxlcas. ctlulat T (<'tlul•saseslnu TI. S?J CJD (tnltrmedad de Creutzfcldt·J•cob). 20. K39 <·ju". ~t·n. 661 CLU<'. cambio. 11or rrcomhinadón tlt• IJNA. 587S89, 58Rf pm recombinaoón novtdOs.l. ~89- 590. 589/ 590( CLase lll reglón. 600 Clon~l. dtltc1ón. 57} ll'Orl.t dr 'l'l<'uión. 574·5n, SN(. S77 CloropLJSto divisiÓn. ftsl y fol'l'llactón de aniUo. 414. 414( DNA corCIIIat. 69 c•oluot\n. 7l hmoon en LJ loto.lrttt"t\ 7 2 gcnom.. lo9 funclonn uldoRLMia,. 71. 71/ tamailo. 71 intmnt'•. 72 protrínas lidcrl"o. 240 rtct!ptores dt tn1nsponc. TlC. 241 TOC.l43

870

Índice alfabético

serutnoa lldcr tcrmmal N 243 24lJ ..-ñ.l<"< de ""lflla<1on protc•ruc•s. l43 \Jntc'\1'- de J'Rrtcma' 2:40 Cm.~D. S88 C.MV ldtomq¡alovlrus). 235 Cnactlvadnr. uompll'jo. 630 Coacti\·cl.dur"'"l an•llltramll'raw~

dt

hislo>na~

806-1107, 11061.

S07J acu~idad~ HAT. 8()1.-ll07, IIOf>/ intcr.1cooncs dd mtnm•mo ba\dl. 64(•·647. 647/ transcrtpdón. 6H. 641/ Cockayne, "'"hnn1~ 1127 ludohtadllra cadtru (ndcru de senlldol. 129. I2Q{ H8 2S8f ¡qión drflmoon. H. Hf ""'"· de rernpl.lm. 1o~ solcnnu.os. 105 <:odofi.ador.-. e•trtmc" Sil. ~12( Código ti"MIÍ RNAr. 111·112. 181( u·,unOOmicmo Nlan«n, hipói<"IS, llll-1113. 19lf de~ncradón olr Lltt'r<-.,ra b.:nr. 191. i92193. 192{

r~pcoHc1d~d. ~0"·210

llpu >llvrmr u mutante. 207 ·208. 207( stm¡lhflcadun. 11111 . COlinnr-,. \ 'ill~ ltmr#fibr ~·,•Jllt't() ti·pr,1fluJl ap.~r llln el ~nllcotlon. 191 AUG. lnictadun. W.ur AUG. wdón dt' tnldaoon drHnidón 30 fatruh••· 19J. l98·1'l'l GUG en la >intr''' dr t>mtrmas 158 160. 160( tniOdl11lll )2 lnt~rpr.luw>, 191, 191{ rdac1undllc,.,. •nnnO.lcidol' relacinn•d•" y, 190l\Jl. 19l/ ~igmfluclu\

degomeradón de t.tem-ta t...c. 191. 19l· I9J. 192/ rmmdlfic,Jsldc\n rt'f>liullva. 5)1·516, 512(.

5)~(

ColEI. pl;Nniclu. •l
Cc>lincalodad. ll· H. )){ Cornpatit>tlkl.ld.I!OIJIO'. 421 . 421( C..:ompc-trnoa. f•ctur. umtrul de rrph(.J\Itm ruc~nóttu . \8,. 3116. 3861 lll7f MC.M. l>mttina. 3116-llll. 387/ CompleJo m•)"r .¡,. ho,tc>tolntf'.JIII>IIodad rMIICl dniiR
dasc 1 5'W C>UU<1ura. 601, 601(

orpllizadón ~niu. 601. 601( ;mtÍJI<'OOS clase U. 600, 601, 601{ rodiftcadón dr Jl"nts tkl slstrrna inmunitario, 599·1>02. 1>00/. 601/ dcflnroon. 573

6~4(

Compkmrnta
C••nu.•Jidc-\ tome• attl\·•dctrt"'\

irr '""'· 410 prueba. lS-26. 26/ Complemorn,.rltdad. mfdldón por prud>l d ok bu.,. d<"Hnidt.m. 7. 7[ ~IIIIC\i' tiC' RNAm. B, llf Complrmcntu dcfimoon. 26 fuminn~~. ,72-'7} lu<'u' MHC trrs dr. pollmerasa de RNA. hll•rnrrniU. 61'1·620, 620/ pwrnotott'' ¡>ullll. hl6·1>111. 617/ Compuntos. tran'Jlt"""'"'· mc\dulo" 1~. 525-~26. ,25(. ,261 .-.tm.·.grn 558 Condensin••. lll8·8l0 829/. IUO( Conrjo. seudoJ¡~n ¡B2 108 101[ Cunju¡¡.oón. mt'dlaci"n por ti rl.lsmldo F. l98l99. 399{ trarufcrrnda d. '<"n•c-noa'

CO\u rrrslón. l4~ Cutratlucoon~l. translcx.xión. 221·223. 123( Nl1Cm\, 246-247 247/ rrc¡urnmo<'lliOS. lB. lH( ll'I'CJIWr \RP. 2111 \t'll. gen, rdioon dr RNA. 721·722. 722[ cox111. ~n. dt• Tripw"o'a""' hnrctr. cdi
dtfirtl(lnn. 2:7'\

l't'COmbltlaclón lnmunllu1a. 58 l. ~11{ rcconoctml<"ntu drl promolor l'<'t los factotti o. 279·280. l80/ Conwrvada.. .cntcn•u• l?l Cor,.crvadnra. tran•pcKitlun. ,28 5281 Clln\tituuva. h<'lrnl<. rnutantes. lOtl }09 Cunlrourc1r1,niw 422' Controladore,, rlrmcttto" autónumc>S 540 ,41/, ~42 En. cxprnkon 11emca. 542 544, 543( Spm. e:rprestón atnica H2· 5H. ,43( dtlimocin. na lonnan rq¡ulad•. \07 Copia. dNoc>n dt rn11rnl>ul.luon. H9, ~SI>. ,SI>{ .vrw. dernrntc"· en flri'J~rh•l~ OfldwOI~tfr. 561· 51>2 561/ tr.JmcrlpUU\ 111\len.\\ 56), 563{ Copias. núm~rn. <419 Cordicrp!na. 695 Corn'«\c\n ontuca. 204. 204/ nonolo¡¡ia. 211 ddlnidon -IH· 4B mucklu ctnétlw. 210 QUIOl\Cd, 20.. 20-J/ sintrta~a de RNAt amlnoacdadn, espcctnddad dr rcwncl. 204{. 20~( Correprrsorts, 3011 Cortr y rmp.¡lmr críptiCO'<. 6 74 ddink.ióu. 670-671 , 671/ DNA rrcomt>mant<. 46} fl<'ntrkos. 672 rama rrconodrnlt'ntn 67-4-f>75 rrroncxtm~enh>. 673 ,¡tíO)

3'. 672 .-unc, 673/. 674 rrrnnorunirnto. 674-675 ~ ·. 672 unión • la< 7-1 ronr 673·674. 673( onuta77/ remnoc1m1cnro, ~74·675

ws. SitiOS. 73}

CpG

dublttn, 6 ~4. 6 ~4/

¡,¡.,,.,.

deflmdón. 19 dl"'<>ctrvadún del CTomusom.l X. 11211 dianA\ f'tllUladnc,. 171 ero. rc11t"""· llll<'<non línea. J70·171. 37 2( RNArn 368 Crnm~t>da•. deflnl<1o\n. 29. 29{ rc~rl>l
nuuttur• aO>lant~. 78~ . 78S/ cromnthdaol. 797 · 798. 7Y8{ t'itadu cptflerteiKII, 797 ruaumatlna, 739 losfonl~c1ón dr histona5. 810-811.81 IJ hrtCflN.Tmn•tina 739. 719/ inttrfase. 731-739 mod01. 786·788. 717{ fibra~

de 1o mn. 769. 769/ dr lO nm. 7611-770. 770{ ruta dl'l nuclro\uma. 769·771. 769/ 770( lnactlvact6n, 822 Ubrudón de nuclrosumas. 75Q. 159{ masa prutrlnka. 759 rcmoddactoln. 770. 798·800. 799[. 1100[ ~amblos en 101 or~aniz4Ut~n dd nudcosuma. 799. 799[ llrnnkt6n, 799 modrlo duwulco. 799 799J promotor. 110 rrphta<~n. 7$8·7SCI rtproducctón. ensambk de nU\.lco•oma' n 1· n4. nt/-773/ 'ubunodad fundam~ntal. W.ut Nud.-osoma\ Cromatina l. lal1or de <'llYmbtajc: de (CAF·II. 771 . 774 Crnmon'ntru, 719 Cromodcrnllnl<». 812. 822. 822{ Cromómeros. 7-11

~~~~~~r•dun

runncN.)m.l~. 724·7'5~

andarn""· f11nn~ion. 736-717. 117/ \('(Uenda MAR 7l8 aJ'oltC~mirnto tndtpendirntr dt la formación drl cumple1u stnaptontmtro. .U.Y u·ntr<Ímt•m. H9. 739/ dclo de repllooón. 410~1 1. 410( .,rl"Ular~'· .-n.adrn~d<». 409 rC"mllmolltlll r.¡,.,óllca d.- \llin. 416·4 17. 416{ wndcnwción. wndrn,ln.h. 828-830 82'1{ 830{ dcllnkio\n. 7'31 DNA. 24. 24( t.lnmtutn\. ~'t61Jot UomtiiiU,, uomosóutit"'S

ctaarit'llku,, tll\pt>'lttvu de \rflregauún 7447411. 745{ 7<16/ rl'pliet>nc~. 18 3-1114. 3111[. l84( fnnnal>tm de drdllr!'ó rn d ntr~rno. t<"~írnrn". 749-no. 1~01 tu)<"- prto«'<> de p.¡rtu.l6n. 417-419. 418[ ondlvoduales. durantrla mitom. 738-739 mntabilidad. drfldcncta tn LJ r~"patddfflt drl llNA. 517 muhihmqulll.ltlc". 410-411. 410[ p.~tronC\ dr to.nda.. 740·741, 140/ 741f plumi.IW\. Nl -742. 742! pc>lntmcos, 742-741. 741(. 744{ lnmlolUtm. de •huluml~ntu!S ~n sUtOS lk rxprr\lcín arme.. 743-744. 744/ tk b.lnda~ 741·743. 741{ rrwmbtnac1tin ~pcnt-cudu- lrt4plontmku. 465·467. 466/ '<Mr<'Mat1ón. 411. 415·417. 416[ s.-llaclo rlt• rKtr~ntll\, trl(un~n". 749- 7SO. 749/.

nu{ slna~i>.

rrwrnhlnadón homóloga. 461/. 462( Cromo·sornbra. dnminlll. 822

~60-462.

id('nttfaar aenr<.l>1-64. 63/. 64/ CRP (pn>letna rrcrptora de A.MP cídiro). }6} LRP• .cll\'ador ~C1\\Iamín de la tran>Cnpoón. 323 AMP ud1
Crnmo!tómtcA. cammata. tñ.nH.a. fltlra

rnul.,ntult"\, lll

¡ofrsauucnto de-l ONA. 322. 322[ rrgoón •activa.Jora•. lll sc-ctrenctas dt ron\<'nw. 322. Ul( uhlcacinnr\ dt· In< ,j¡¡.,, de unión. 322- Jll, 121/ CTD. VId# Carbo~Uo. terminal. dominio ICTDI ctl>NA. (,9 cyL, rnutadcmc\, 16~

cyR. nunadCIIIl'\, }MI

o 1>. lazm (lazos de de. '<'IIUam. rnctolal-4 mrut.uoo del ONA. 380-381. 380(. S38 .l411t, SISttm.l. S 111 mcul•w 811. 831[ OeHfadauun. RNAm 143-144. 143/ 144[ bactenann. cn11mas. 140·141, 141/ Dq¡~osoma t-n dt'llfadadón dd RNAm N
M""""·

ok \'lru~ u>n tklcctn• en l.o tephc•dón. 558. 5)8/ odrnttOt.lti<ín de G<"n<-.. 6l. M! rnutall<>ll<'\ clr u mino dcl nwno \Ir lcnura. ) 1 31/ rt'Ctlml>inooon inmune. ~82. 582[ '><'liiCIIlll\ "" DNA. 529 tala\t'mla\,li0-111.111[ 1>. dcmrnto•. ,59·51\ll lknc.\rntaclrruntc. !.loor·. 248 Desi)lu.tle.. rntrecruzamil'ntOS ~¡¡ru¡>atnlcntcl\ .Ir arncs rlntcl\. uwllt.tllvcl\. 110. 110( lUanutdlt\IOS, 1 JO, 110/ rccstructuraocm. 109-112. 110(. 111/ ldU..a\, Y9· 100. IOOf dctlmuon. YY-100, 100[ rnmtutt!htcs. ll, tala.cmla. 110.111 . 111{ ~tlH{

DesmrtJiasa e~pedftu de llslna (lSI>il. 808-809 !K->mrtllasas. 831, U I/ IJC"snaturahudón d<'l DNA. ll. 13/ lk>rlxlmbunudraws Vlo11t I>JIIA~~ tdr\oxlrrlhtmutlt•asa\) l)c,uxlrrlbtmutlclw. ~lidu. VlHFR lrrduna\4 de dohldrulul.lto), 240 DHFR. Mcnn lll\ClntA, 539·540. 540/ floltena. IOllna. nbcxolaoón de ADP. 172 Dthtdrofolatu. rt'duoaw dr. ¡~en t~nes duridlru, 195. 19S/ Dlrn<'n». lonn•oón por not'dio dt prntdnas h~Ucr-laTO·heh«. 1160-661. 662[ Oíploodc•. lcnotipt>\. 491-492 urganO>mos. 2~ Oireoa. rcp.¡radón. ststtmas. '00-501. 500/. 508 lllrct1a\, mutatlortc\. t 6·17 D"gcnc\la, dcfimdón. 544 híbridos. SH·H'. 544( 1)1\ltK.ado\n. Vl.ur lnvrrlNl. tramlcx:ación Oi11anclas Mrn~tlrtldas. ta"' de sustltuoón neutral 107. 107{ stu~. d~ remplazo, 105·106. 10~/. 106/ \llendO>O\, 105-106, 1OS{ ta.a. 105·106, lOS/. 106{ DIVISIÓn. l't'aCctOOfS. Jtnrrad6n dd extremo }' drl RNA menu)rr•> 695-697, 695(. 696( producción dr RNAr. 697-699. 698/ OMD (domtnJos mrtllldos difcrrndalmcntr; rqionl"olk t'onlrol dr lmprakla; IRCt 1114 834[ DNA adhesión a Id mauit dr lnrrrlaK 7l7 7U 7181

Índice alfab~tico

871

DNAioWI/1 ~hamrm~

rrp<"tiuvo. 117, 1111 an.íh~l' de n"\uiccl6n. Vlasc DNA. hudla di~ilal azucar, 6 ba~ modificadas, 18·19. 111[. 19[ ll.l>ura. ~2) cad~na

individual rrplicadón. 435-437. 436/ rotura por topo1~omeras.1s upo t 479 suioM rnsamble upnnu¡•al. 118, 118/ rrtrawda. ~phcadón lol"lllldtscominua. 4l5, 4Uf <.Jdrna> polinudcolldica•. 6, 7, 1f ••denas. hija~. 8·9, 9} progrmton•. 8·9, Yf nmldr. 8·9, 9f Oflentadon anuparal~l&. 7. 7/ r.intldad rn el xrnoma Vfast C. •·alor fl'ntrumrncu. 746 tir<.:ul.u •·adrna. n('!lauva, )'17 l'•"ltiva. l97 entadrnanto~mo. 1110 jlrnoma baC1rnano. 73\·7l6, TH{. 7l6( rci>lcnw> d~ rcparatión. ~02-50~. 502/ 503[ dcn•ldad, 710·7ll dc•cnrullamiemo. gira...,, 4-4q dnnaruralización. 1 l. 1 3{ di\'IStÓn lO, 48~·486 ~n

tról.,.,

pól

..,6

endonuckaw dr r~ricd6n. 39·40, 40/

doblr ~•den.a <'QillJ>kjo dr divi>ión, 4jj l. 4111/ convrrsión a cadrn• individu.ll. 435·437. 4l6/ mtura l"'r 10p01\nmrrasas tipo 11. 47<) r<>poisomerasas dpo 11. 479, 481. 481[ rnfermC'dadrs de definen< td dt• rcparaciún. ~ 17 • 5111 emuctura. 30, 47t>·478. 476{. 4nf ~unn6tim, 1 18 exlremu 5', inidaciun de la transferencia. 400. 400[ fomw8,8 ~C'UC,, 2-) gcnvmas. JI hrrntmetilado. l80· ll\2. l110f·l82J híhndn u hctcmdúplex. 4 75 definición. 462·463 formaCión, 29- lO, 29[ rr
872

Índice alfabético

rtt¡llllla de rcphcacu>u 9·1 O, 101 huella di~Íiil1. 118 mfonnaC1~>n grnetica. H imrrción en la cal>cza dd f•8"· 732. 7 31{ hl(a>a. AMP imrrmediano. 444. 446/ Obuld. liKamt~ntn de 1<" fra11m
444.446/ hnral. intrgradóo. 557, 557[ r~mmt>ln.ación con el DNA circular. 460. "60/ lungitutJ. frente .:~1 Lilmaño del ~t.ompaniJnic:'mu. 7l0, 730/ vlru>. 730[. 7J 1 fMicrt.a] j(r"O~UCU <~lula>

anomaln. \ 3·4. ~f vtms. 4· ~. 5[ IIICIIIJ ~~rrnht•k•. IHl-8 H d•ana>. 832 Vrcwrh•l~ wl.'"iJ!I.UitT. 6 H rko<>S r¡>Jgent!uro,, !1111·!120. III9J imprnton, IIJ.l-814. 8H( llldntenímo~mo. Sl0-832. 831/ mrttld<·tnn 4 Datu, l80·lzU. 180(. Hl! mrtila\ds, llll. 811[ mnddn dnl>lr hrlí
ntuncrn de

d.,.,...,

IO"IOfll'\,

477 ·4 78

o dd an illo B. 440·~41. ~40f snhrC"w;uado1.. H. SllfH>. maynr. 7 ·8, 8( 111rnor. 7-8, 8{ mochficaC1ón rn ti promotor.lllll m<•lrrul• crrrada, núrnrno de h¡;ann~ntn. 4n. 4711 mutanlt' dc rrtraso de.- 1• sintc>l\, 447 muy rc¡X"tlllvn. 117 nn rt"IX'lllivn. 116 nudro~óm~t:o,

758, 7btl, 7611[ rnlaudnr 762. 7<>1 lon¡¡nud. 761·762. 7611. 76l núckn. 762-7t>3 OIR•IIIIM dr lonl(ltud. 762. 762/ \IIIU< dr dl\t\iOn. 764·7f>5, 765( vanaC1nnrs d~ su¡>erfklr. 761-766. 71>4(. 765( nudo•. 4110. 481 numero de turstonn (wt. 478 parrs dr balol"S, 7-8, 7/. Sf <'>prr•htidad dt rephtnaC1nn, <'ambtu de.- "'""· 58 7 ·58<), 51111/ rc.-giunr> dr>mcu1adas, 1132, Kllf renaturall.t.~nllm
'>. 522. S22/ tran>IK>SOIICS, 528-5)0, 529f rcuovínco. 5\4. 554( """'htc o de >e<'U~nüa >nrtplc, lOO 117, 118, 118( ~men<1a dC' la cod~na nJd•ficadora. 1'10 r~phcasas.

't("fUt·nl1J\

~
d< nt;is de una protdna. 4 5-47,

46/. 47/ mapro dellltvas. 61·63. 62/ fllll~tna. 314 smtt:1ii\

rc¡o.u.u1ún. 4 )0. 4lOJ '"Jllitdt DNA, rc.-pliu
sitios, d~ anuacii>n cu. 1~·36. 3V de .rtuacmn en 1rans. lS·l6. )6/ supt>rr"uroll4mknto. Vtwi Supt•rrnrolldnuruw ueiDNA ltcnu.•·~ dt· mapt"o. t:ndtmu
dl" r~'\tnnic'.n,

ttlom~rim. 749-750, 750J tc>poloaíol, manipulaoun. 477. 4 77{ IOJl, 478·479, 479} ll•ll"rll><·um. dogma <ellllal. 10·11. 11( lrdn,rrrend.J t"lltrt· lo\ ur¡,;~n~los y rl n(u.·tf'o. 72·71

unjou

control drl fat1or o, 271-272. 272/ nentalleras ~ 1euona, b6l·b6 J pol11nrr•w de RN,., 271·172. 272f.l15-277. 215{. J7M pum'" de wntaC1o. 215·277. 275{, 276{ 51, bS2·1>S l. t>Sl/ <"ip<'46-1>47 funttnn M5 dr llllfolflrlm•~nro. tt4~ homnMlominio. 658·660, 6~9/. 661Jf mdrprndrnd.o dt acttvacicln dr tl'ilD'ICrip4) -64 5, 644/ hKdll/d<Íun drl dunumn .J'th-ador dcrranscripoón. 647. b47( rt'
111KldC1Ón. +44-+45 ''""'nm I'·OH n l>rimcr. 437·438. 437[ fidrhdild dr la replicación, 02·433, 4 Hf funo<>n. 10 1.411-432 432( 111

rrpllcasa, actlvlded. 4H submmplcj"' dr La holornzlma. 4 39-440, 4)9/ VcUGID1t"OIO d~ 1.1 rcph<.·dnon. dafms en ~1 I)SA. 507 IV. >intnis dd con~plemwto dr un" c.Jdrna dañada. 507 uudeaw. aaiV!dainza drslizantr. 4-40-H l. 4-40{. 441 f prn<.annuca. 430. 4J lf rrphcac1<m. del ilNA, 430·411. 410(. 4llf rn o·l ntrrrnn 5', 194, 39·1/ 'ub<.'Qn\p1ejos. 4 19·440, 4l9f suw:l"ptibk a errore>. sn umd.1dc~ enzimáticas. líntrsl• dt L1 cadrna lidrr. 442. 44 lf ihrl.ul. ll!2 rr(liK"tJU<'in en d ungen. J.Sl UIIUIII a JriC. 448·-149 441\(

DnaB. pr01rina horquilla d.- l'l'plicJC1anuelón. 113. 114( f>SA"'~ hk>o.,rribonuclra) dcfinlnon. 1O 1 ucac•on dd sitio hlprncnslblr. 7116· 788. 787{ dii!C"tión de cmmalin•, 788· 789, 789( hrndldora5 dr cadena indi\idual en ~ 1 DNA, 763-71>4. 764[ sitln• de di\i•ión drl DNA. 765. 765/ 11. hendiduras d~ cadrna mdh1dual en d DNA. 7f>3·764 l>oblc cad<·na RN" d~ !dSRNAl. dc¡¡radaC1on dt RNAm. 141· 'U~. 144(. :WSf roturas (DSII) comp!rjo sinaptorn!mlco. formación. 46 7. 469, 468[ dlan.1, 11<'" w. 715·711>. 715[ grneradón. puntos crillcos. 589 inidadón, cambio de tltJ<• dr· aparumicntn. 4113-494, 494[ rc<"<>mbi~n homólo¡¡a, 464--165. 465{ rrcombinación inmumtarla. 5112. '82/ '"tema' de rcpara
'17! dobltu:ro (du), gen. 6116·6117 Donunanrt negativo, l 1t> I)<Jmimu V (dominio variable t. 576

Domm1"' I..TOmc...l·\dmi\Ch

mntro1 dr la LCR. 78Q. 790. 790/ d"finidún. 7'10 rurannta,, 7)6-7'17, 717/ gt•nc< aulvos. 788·789, 789{ r('!l16n de (ntnrol de locu•. 790-791. 791[ rc~uladun->. 790·791, 791( \ltUJ' a"lattlr>. 790· 791. 791/ smos de adhesión de la matnr. 790-791 791/ >UI>C'Itnrullarmcnto dcii>N,., 735, 71S/ I>NA. uni!m. VI~Dt DN,., dominios d<' unión Dominios lll<•tilado' difer~nclalment~ IDMD; rrgionn de conuol dr Impresión: ICR). 834. 1114{ D""'· wml>rn...ción. 82<>. 821>{ DP. UnlOC1IOS. W8 DrO><'T'IJti<J "'d""•'tJ
l"'trun enwnón d• dosis. 826. 826( umdensln~s. 830 tles..lrrnlln cmbnunano. h5l d~trnnina(1ón dd sno. 686, 687/ diS~~nnla dr híbndr,., ~44·545. 5441 DNA u·ruromtricu. 7_.6 menlaC1<ín. t>l5 Ytt'htr. 119 l>NAr a~rupanuenw, 1 15 genn Antp.ll24 cromo~nma

Duplica..16n arumula( ion ~k camhK,... 1 15 copia> nu alélicas, 102 evoh1t:1ón. 100-101 , 101/ formación. dt dArupamlmtos, 100. 101 del aRTUp.-tmlc.-nto de Jl<'nr< dt· Jl)obina. 10 1· 104. 102(. 103/ f«'ll<Jma humano. 1O 1 sr-gmrnrari.o. en grnoma humano, 8~·86, 85[ tándrm. 99 ta>a,, 100, 101/ ttcmr•o

de.~ 10

E E. >ilin. 169. 170(. 179 EDEN (tltmroto de tur de la U>l. 511, ~Oj df2. 165·167, 165{. lbbf dFla.

}~4

dF4A. wmrte¡o prott'imw 164·1 f>5 . 165/ rlf4E, cwnplo·JO prml'iniru, 11>4·165. 165[ ti~4F, '''"''lllquprutemico, 164·165. 165{. 166( ciF4G, """lllcjo protriDJCO, IM ·Ib~ . 11>5/ dF58. complrJ!IJ!rmdmm. 166. 1661 1'-IC (<'<>llll•lcJ" de unimt de e•unr:i), t.82. 682( H•·•·trnh>rt:"' dt· ongcn<"i de los rcpli.ones. 179· J80 179{, 180[ Elrm.,ntos mtrrpu<'""'· <(•rtn~ rt'IICtldt" !SINESJ, 563. 51>4[ largo" a·pclldu•. Vl.ut UNt:S (elrmrntos interpuestos lar¡¡<>< rep<•rldus) tnnspontt>lrs con termmaciunr• dr repeticiones tnvt"rndJ\ nnmatura IMrTl:), ... 6l

/trtlww, R24

de chnqor tc!nnico. MO rmc. 66/-662

t:lorl~.Jlitm

('W"nnal~.

H·G rstntC1ura. 171. 171/ hhcradnn.•kidofusfdico. 171-17l.l71f umún ..1 rlbosoma. 171, 171/ EF· Tu, unión di ribosoma. 171. 171/ llbl.'radon Jndo fusíduu. 171·172. 171{ trumcllsmu Nru<>somd, 170·172. 17 Jf tCJllicactlm dt· DNA. 429 """"'i' de jln>temas. 155, 155[ transcril><.inn. 261. 261[ Entbnonana el~mrnto dr d.-adrrulao{ou tEDENI.

numtro.

4)0-Q 1

811 """"~'- 4 ), 44( homrmko. 1\24 Pr·G. 824·82~. 825( Swtvurl. 811 ~rnoma. 737 a"'"'"'"· 7111. 7!15. 785/ wntrnido de DNA no T~IJ<'tlttvo, 61 rmunura de la <WtnatmJ. 785. 785[ """"'"'de gcnrs. 80, 80/ tama•)o, 61[ tam~t'lo d~ las familia.. g l. 81/ Hl.l. """· 774 hi,tmhl'. fodo>nlaoón. 811. 811[ homrodomlnlo. 1>58·660. to~9f. 660( iah·~. demento flllU1ador. 785-786. 785{ mm unidad Innata. 603. 6111/ lo<'l.l> hrrh~ra.•. 785, 825 h>n¡¡itud del r-sp.adatlnr nu tramcrito. 1l4 mapa de expresión g~nica. 94 P. drmentus. S45·54f>. S%/. 6117·68l! rt. 785/ RNA. rdldún. 721 IINAm. trall>lW.>nc. 146 traiiSJlOWines. 561·562, 561( rmhor.J>. prntemas 826 Droatc'lhc. 1 19. 119[ Os, ~l~mrntos. Hl·542. 541[ OSO. l'l'oiS< Dobk cadena ru•ur..., tOSIIt u'RNA jRNA dr dubk ,·.¡den• l. dtgtddadon de RNAnt. 343·345. 34~{. 34V Duchcnne, dlstroHa mw.o•lar. identlliradón. 61·64, 6 J,f. 64/ F(I'IIT),

f3t.,UIC"Í

b'17

.:rn, 661·662 Enrpalmr ~n <'One y empAimr alt•m•tlvo del RNA, unlnnt•• dt. 685·688. 68t>f, 687[

tfll<,

Empalmo~tUII.J

cnmiMUl<"ntr,, ,,g¡

dc.-firuuon 675. 675( formaoón 5 snRHP. f>79-Ct81, 67\lf-6811 tipo u 12. 681·6112 unión de la• prottínas REF a las uniones dr rntp.olme. 682·683. 683( Empaquetanucmo. proporción, 731, 758 Empahrutdc>. IIN" líder (SL RNA), rc.it'don de wnr y t•rnpalm~ rn rr"ru. 689·690. b89f En. demento. rxprrslón grnlca, 542·544. 543( Encadrnamlrnto dtl DNA nrn1lar. 411!1 Fndonuat1rrt." 1411 111 1 tl l rula 3'·5', 14\·1«. 1-14/

Índice

alf<Jbettco

873

I:.ndnnu,l~bn (•~"' >

!.ctmndr ma.Juru1e1n. 716.717.717/. 711J.f ~~~n~ruum d~l nu.,rnu u·Nd•>r. en lu llNI:S. ~66·S67. S66/ lnlllOOOn ¡J_, la r<'t OmNIUdÓII h4 nuc.kaw mknl(nul. ll•H"'II6n d~ m>mallna. 759. 7W(. 761 rnlucoón ¡J., JnoJ!hud .Jd rnnnómrro dr nurleotomol. 762·76). 762/ 76lf rrstrlcuón. dovl\1<111 MI ONA, W·40. 40/ '''<'Utnda trnnlrldl )', 6115·6911, f>llf>( Enduplhnnro, rru H·R) rnv.,Jtura nudeM, 228. 228{ funnont~. 2)4 h•o. 221· 228 227, 228 tran>pon" al ril~•l l'lak, fat'tliCC'S de 617, 617(. 734 Entrn:ruz.anurnto. con1ml 4611 nnxl.,lo d., fiJanc'>n. anan1~nunarouo ck 1'\"fl<'t>dnn.,. Jdrntlu,, 111>·117. 117/ bnlrrcruumlrnltK, ~1>3-~IJY dtoilgual. V14M 0..\iflu.tks. rnurllcallva. H l. 5H/ rr¡>lltofka> dd RNAI. 195·196 un ,.-n : una ~nnma. htpút~\lS, 24·2~ En7illWtko. l't'Qmblo. 432 tpuknnoodr. lactnr dr CTr.lmit•mo ILGFt. exunrprccunorn. uonn drlllftl del rt•ttplor dr 1• U>L SO. '10{ Epittrn~ll<& h<'rtno•. 11 llHI~ 1 ddmodón 819. lll~ eslado dr •u•o·~~lu•ctón dr protdnas. 815-R\6, 835(. 8)6{ hc.·tc-rocromat1na \'tou Ut>tcrt'<.rnmtltan• ímpr.-siNA. 819·820. 8111(. 111' Jlnnn~s. 820, U!> lllll. 8l7f solcm1arnJrmn lclumt'nc<•. 821 varl~c\n por efrao dr poslctóo. 820·821, &l1f Ep•gcnc.·1uo. (S1adt• th'liltHlU11. 797 l:p1grnc•uw,, dcctloS. dduuuun. S20 f.(li\Uffid\, lS). \9\ Epltu¡•• (del~mllltAnlt •nllgrmcoL ns. SQ) r R. l't"-'< Endupl~sm•w. retículo (ERI FrTC>rrs. >llll~> .¡., J)NA SII'C~I>IIhlr •· ~07 !.1>\Cm.:IS SIISt'<'Jlllhfrs a, ~0 ( Esdfm,hta tlnntt"munanc.tn. 294 •Jlolr.,am•~mn rrmnro. r~ra<1011. ~011·509.

"'11""'·

..,¡,

">09/ ~bmllcnto. '"••uonrs, ~ )8

CRP actl\'&dor. 121. 121/ JJm gen 508-~0"

S09f

tSrulón. \l>tt·mas dr rr(lolr.tinn. ~04f

874

~Ol

504. SOlf

lattor rho. 287, 21111·2'11, 289(. 1.110/ lall.!mi~nt•>. 7H ·716. 735/. 716} nutlt·mdr. 7l4· ns. 714( 1amaim, 111(. 78 ~orasa. 4111·4112. 4d2( lk RNAI. Sllll1\e•. 2113, ~01 mmant~' dna 429-~ lO llllrÓjleno. .-..a\<"7, 279 optnín RNAr. lo9R·I>II9. 698/ o~rón

rrr

contmiJl'>t alenu~onn, H~·lJ6, HS/. B6/ grnrs rsuuuuralf',, H~. 1 U/ Tntrnl di,ClO. Hll. Hll{ cnC. ~UC'IItlil 448 r. 26'1·2711

un1dadn 2M·2111>, 266( Jlmlrtna lkrA 471 prnt•fnas d., chuqu~ '""""o. 278 r•coml>lnadl>n d• alta fl't'(u•n"•· 400-401 sl l~mlllttK. 4H, 453{ rih<>wma. cslru
471 prurnnttlf'•'· 27] sRNA. 141· 1-12 142( suprrs.of dr o d~ duphcan(>n. 41 O topoi-..omrrawos. 47'1. 4110 ITan<enpelÚII. l'll uan\locaotln dt" prot<'lllól\, \1\lt'llla IDckJIC'Odi<'IIIC' dt' ~l. 24Y·HO. 249{ limón d~ la\ fra¡rm.,tllo' dr llk•••lr.t. 444. 446/ Z. amllo. lormadc'ln. 41 1·414. 414( Esmi6n. 48 J·4114. 48)/ nnprc:ti-a. 52'1· HO prtd.hmc·hta .~lt. ~01 ~04. SOl/. 504{ rsroll.Uon. Cr<>nl<><<>lna\ ~11. 741· 742 742/ E.\p.Jci~dnr n<> tran.,.·rito ddlnkión. 1 1 l. 1 14/ islotes Barn. 114. 114( lungllud. v..-iants. 114 · 115. 114/ ft'JK'tlrlUTir> lnt~nta\, ( J 4 l!spodadulT'. 1> 1~ Eq>ilnomtctna. inll•l>•oon dr lt.tnJ dt los ,.,an d~ llobiiUI. 111· 112 <'X<>""' 42-43. 41/

,.u

m1Jonc."\. núm~m

Índice alfabético

4•

dr ¡¡rn<", 711. 18(

<>rganluaón d" len Jtnr.. 51·'U. ~2f l"'"''mas. 104 stCUtllctn de lcn Jt'IIrul,niñn CdS<.dd.J, 2~ 1·28<1. 284/ . 2K4/·lflfl/ grnc·'· 418·419 prr-<"ipora. ~114 .lllto. 2114(·2811/ F dr rr>J>U"I.t. mitad"' .Jr >IIIU, 6H. 657/ rt~plurC\

aoi\·.¡cinn. por unte\111 h~tandm, 656 t>~6( rmno ~ct1vadorn, 6H-6~4. 1>~4{ dnlo< dr ttn<. MS·Mfl. 655(. 656{ tlrfimoon. 6~ 1 rnunOctmttnlo de d~ni<'IIIO\ ti~ CC'\PUtsla por á>dla<> OKilt>UWIC>no, 657-6~8. to57f 6511( SMRT. un1c\n dd Hlr"'prr\Clr, 6SI. 658{ umón d~l DNA rnmo dfmttm. 655 E"r~tomtona. mluhnu>n d~ smlr\\1 dr rruldn•-.. 210·211 E''"'' aml>rrni..S. arnrs rrl.t<Jtm.ttl<" ron Lt lrllll'""alura. 278·279 F.lfll<\, d~dc" el<- 711\l, 6~S·6~h. 6Sb( E'truttural. f>Ctltduas d~ maut~n11111c111n, dt'l
crmn.~lina.

7118. 71111/

CT(HJUlSOIUd.\

<"t'ntróntrru. 7J9. 7l9/ dispositiVO$ dr KJ1t...c1ón. 744·746. 74'(. 746/ rrphHillt,, \lll 1114 l&l/. \11'4( 455. RNA. 6'18 DI'IA. IIH lazos y dom1n101 unidos al andamio. 7)6717. 7l7f lf~n,fr.'tlon. s. 5/ cEF2. lanor d~ rlonK~oón. 17l c>.prn1<>11 Mniu. n l ... l4( rontn•l. JOl por imciamm dr ~ tr~mmpdt>n. 641·1>-42. 642/ fanorrs ddnld.lctón, 11>4·167. 165/. 166{ fcmn•, iM lanorti de lihrr~ctón. 1111111<'11\11111 ~.OrU<'IIlt.ll. 174, 174{ lrrnlc· • rroc:arlol•~ chuqu• l~rmtw. '"nlrc>l d~ los ¡:rm''· MO orgamz.oooln jlcníu. \O J ltan<mf>ctÓn RNAm. 610·611 g~n.-s

imrrrumpttlo•. l9, 41. 669 Or¡J.allllOCiÓil. JO) RNAt, 112 n•nscnpuun l4. l4/ g<'n<>mas. 117 ONA. nu r~luvu. 61·61. 62/ lt')Xtiuvu. 61·111 lrrmr a ~nomas t...etrn&noO. 177 núm~ro d~ ~nes. 79·110. 7'1/. 80} Otf1AnrltK, 49 r~lrapusonr-. 562·564. 5(>2/·564(

.,mañu.. 110·61 . 60(. 61/. 7'1. 79f ontrunn mlrn"'"' drlJintpo J. 707 nutn<'ro d~ Jlrnrs tllprcllmrraNA. 4\0·01. 411/ pc•limrra\11\ clr RNA •ctlv~iof l/57/ nhtN>no•'· lB RNAm. 1 l4. 695·696, 6'16f II(AI+. 1 lll-140, 140{ ltNAI amtn<....-t~Ju, rmr.ada .ti
1$'11 \11111\ ck llllcll.c>mrra\11,, 47'1 IWI><Tipc.ión, 611·612. 612{ 1ran•pnnr RNA. 145· 146, 145{ tr•mpo•cm<••. n 1 unu.. elulcut"~. Vt'~oUt L.cv,ulur.h f:llo><>~na. 214·2 15. 214/ rm•llfkatic\n. 212. 212{

1 \uluuun taUt'jonts •In wllda. S<'u~nt'S. 1011·109. IOtlf cUclojlo ~né1íw. 192 <<>ilnldnliAl nwm.,mr.ada. 115·116 <'111\t"rvaoon drllactur o . 2711 l(l'll.H

cturlu•t,.lll. lOO· 101 . 1011 funciones y. 87-119. Uf ~llC'S d~ ~ ~~oblnl. 1Ol-104. IOl/ miiOC\>ndr~&s.... mloíos del cot!JJO srn~oc»ómicas. 714·71 s rrwmhtnamon. 99·100, 119{. 100/ trampc"'m"' wm¡•u~•lc». H6 l:vohoUvo, rrlC>J. 10~ llKd. Jllllln. lc•rm•rión del wmpleJn 1::. f>71H>711. 117H/ ll"lllt'\ r.1ptura. 64. t.~f cndlficando pt<>t<'fnu. 44·4'. 44{ wmpltjo dr umón ck (I!Jq. 6112. 682/ <1>nstrvKión. alslaml~n1o dr JIC'n<'S. 61-64. 6lf·

,..,

con~ y

empatm.. alternativo del RNA. 46-47. 46/. 47{ tklinlrión, l8. l8{. 40~ l. 41/ dll~r~n1·66. 66{

lnmunllfl)obuluw. donuruos. ~9-50, 50/ 111'\t"Ct. 41 mul•uonn. 111. 4l rtla<1on en del\ ¡ucueina>. SO. SO/ r~Lioonadcl\, drsarrollo por tluplicaoón. 11'1 dlfcrcntt'11(~n.-s. 411

11•""'·

I.JntdÍIU, ~()

del senunw. H·4 s. 44/. 4 5( EJ<ón·nón. unión. 6112 1 •<>nu . grnr>. 68

f F, lattc>r. •'llliJIIIIdOÚn b.>
pmtrina O. aalv•dón dd oo,m ~ 450-

451, 450/ protclna P. 4SO fj¡lro, rtprtSOt 4J4, 164

F•~•"' anturnmn.truín. JS4·l~5. }~4/ ¡,.,1crta,, n 1-1~2. 1~ 11 ddo llllco anlltcrminaoc\n. H7 ·}58. 118/. Hll/ balan e~ cnn la '""ll<'ma. 161 · \62 ra\lada r"'luladnr.t. l5l-IS4. \SJ{ ""· rrfl'"''"· l711-17l. 172/ "tapas. 1, l/. \S4 rvrntos rt~~uladorn. lS4· H~. 154/ mduu1ún ITfltr\f>r d•v'"""· J6l-J62 161/ onlr.unn. tordla. l52· lS l. 112{ lrm¡>r~n• . \U. , l / rul~ JSI. lSI{ DNA. InlrJtol(ll>nlr'c"K>II. 41ll. ~81( ntt•lq!
~rnrs rsenculr$. }H. 356/ ~rn<" nn nrnctales. 15~. 1~6/

T4 mcum,mu do: rrplll.ll.Hl(l. 445·448, 447/ T4pl2, rr~ululml au1c\g<-na, l.!6·l27, U6f. ]27/ T7. ¡:rnoma. 15~. l5Sf lrdO\(Ml\lnun Mu. H0-5\2, Hl/. Hlf Farm•w\, rt>ISirnc.ia a . m•tull•>rts ~n lrJ\flOSOllt\ WlliJlU<'SI<X. 52~·526. 525.f FIN l. act1v1d~d c-ndonudr•\•'· 44 ) , 446/ 1-rnulll><" aldc>\ nniltiplc·'· 27-211. 28/ F4.•t,HTUllhl\, fa\ tut d~ tran,lri~M..il;u dt.•l tt"t c~nur dr iPRTl'), 491, 491{ Pljadón. l 04 mutannoldl, 105 Flltr.u.JC')n, •n4h~IS, mrd1nuu de la u>nlplrmrmanrdad. ll-14. 14/ Flujo ascrndrmr. H8 rlcmrnw pnomutor ~n t UP~ ). 61 ~. 61 S{ c-lt:IIIC"Uh)\. (ltUUlUtOf('\ f:O, 644

-.a ut'11<1a act•v•dura ~~~ CUAS). 1>29·610 fMti·RNAt, ~par~.mltnlo dr b.un ~rado. 197 rM•0(. ll>l( r,,.Jodtr-lcr~w "" rurlr y rmJlollmr dd RNAt. 1>9l,1>'12( Follnh~~• • .nvenlc>n d• NS<'\. ~06 fnlnrrraCIIYa
FlsA. prot•ln~. 414 FI
G

~••f"''· 15\/. n4 rvtni<>S rr¡¡ul•dnr~s. lS4·lSS. J54f ~rn(>mas .J~ la pro¡:rm~ dr los fagm. 352· l5l, lU/ A. Vt.ut A. la~

G. palrun dr b.lndas. d~ cromO>Oma.. 740·741. 740/. 741/ G l . fa~. l87. 187/ !IJ!/- ll~n. ~SJ . 56}, ~6)/ GAGA. factor. 801 CiAI_ pro•m<Jior. ~MI G•l4, protruuo. 644·1145. 1147·1>411 G•l.tnt~ni.Jo e-ngtnnma d~ manúkr<>i. 741. 741/ (irn~. llllt.-11117 (;t•n4. prnlcln~. M7 <"'n Jl. prmetna. 1211·127. Hñ/. l27/. 4-ln Gtn 4J, 11e1lhnrraWI d~ OI'IA. 447 (i~n 44. puxluml\, 447 (irn 111. Jlr<>lrtna. 4-46·447 (;~n/11, pnxluíltl\, 447 G.,n.,ralc~ fat'tores ¡factores bault'S). 611

/JI•,

<.;C'n~'

~l<JliMUin ~nKa

lannrn o . 282· 2&\. 28)/ ll~llt\. lardlt,., l5l· )14, Hlf t~mpr1nos !flrasadm o llltcnnroioo, 35 3.

151( lt't11JIIInll\, 15}. 15 }/ lnmrdl.ll"'· IH. lB/ •nft"u1unr\, 282 amll•nnmat1(m, 291 ""· n•prt''"'· 1711· l7l. l7lf lau•. JóU. lóO/

4~0

h\Ojl'noa. l9l mmunidad. lflll ruta. lSI. Hl/. l68- l70. ll>ll/ mu1aoonn. npont.;anus. 14 vlr ulc-rll•,, l60 rq>Ucadón dd trnom.t. drcuiOl rodantts. 187(. 397· 3118 n . IIUIIeridlaentl~en. 4·S, S/ T4. ~~~noma. H~. 156/ dt-.arrnllu lluw, l5~- H6, 157/

.a<.1iv.,..
Índice alfabf'ti
87S

~nn. codlll~adon

hwrr 1 protrina., 24·25. 25/ con mkio. •h.-nuuvtx 4 5-46. 46( RNA.l5. 25/ lckntlfkacwn. 67 o~inralidad con \U~ l>mltlna>. U·H HJ compltmrmarlos. 26 wnu·Niln. rl·mmhmad(tn g.-nlicocoón Wo~st Du¡>htdrifin duplicados. dlfrrrn
rstnoalrs. num.-ro. 89·91, 90(. 91{ rstructuralr•. 102 ViaJt lollttrihff(l(. ~~""~ rxpr.-..d•"- núm.-m. 9\ l'lu:ariota,, KO mt"d>oon, 91-94, Y~( ruranuclrarrs (,11 fomw 1ná' "mpl<-. 18 funoonal.-s lrrntt a no lunCIOn.tn 102 luncoonts. rnlundanoa. 91

tdcnt1fh.•n•m ronw-rvatlón. dt <'Xt>t>tS. 6\-64. 61(-65( tlr 5 dr mrtllannn y activadun. 6 H 110 dlditltS, t'XUIIC\, 116 no trammlt>s, 777-778, 771!/

numc•rc., hat1t"rlas. 77·79, 78/ Jlftrrntrs. eSptClt"S. 711, 78( Ofll•nlsnw"- 77. 77/ ruunc>t•'- 79·110. 79{. 80( genuma. humano. 81·8~ 8~( raton, lll. Uf tamal\u dtl grnuma 78, 78f produlltl' prutrllllcltS 2 "'lactonado> dt-am>llo por duph .lolcrcnn••· 4l·45. 44/ Uf tipos. núm.-ro. R1-81. 81{. 82( tr.lll\Cf'IIO\, 777·77t.. 778/ unid•.! uJd>fkad<>ra. 2. 31 Grnn a¡m¡pamttntos control. roonhnación. 104. 104( lfrHmnón. QQ CHliUCIOn. 99·1 00. 99/, 100{ prup(lsltn. lOl· \04 rc:f"'structunlouoin. dl<"l>lat1nn dt" hl>tuna>. 1105. 805/ altrmauva. 46. 46( an.íll\1' >l"ernJtltt> "'" RNAt. l4-4 baorn.s. 1l .lnrrlana. l02 ctlui.J> rucanóucas. J02 rsltUC1ura dr la crom•ttn• 797

'""'"'¡"

dr"Nlrrollo t"mhmm.Jntt. , 4

dtSmt"nlaoón 6)2·6 H. 6l2f. 6H( diJ!.<"tlc\n fl"'lcrrm1•1. 7118·7119 739/ En. rltmrnto. 542·544. S4lf rtapas dr la trolllSCrip.-lón Vlut TrUlSCTÍpdón rucarlótka. control por LJ inldaoón dr transnip
876

Índice alfabético

inac11v•o•ln por RNA ant...,naidu, Hll- B9. H9f mu~ slkndosas. 105 novrlr<, 92-Y1, 92{ númt-nl, 9) proctSO dr dos c:tSt"· B-l5. 14/ Spm. tlrmt:nto, 542· 544, 54 Jf visuah7~ntín dlt<'Mol, 741 Grnr•. familia' tl~nnldón.

s t. '1'>

dtvtr~tnda

.Ir srcurndas rrprtidas. vd0<1dad dr smtltUt1ón nrutral, 107, ICI7f ¡¡.-noma humann. 84-8~ miembro~.

99

nínneru. wn•r)n dd g~numd. 111. 81{ rrt.<.1onn c:ntn· ntlt"nthrt~. 9-9 \C'Udot!t'nrs. 1011- 109 suprrfamoha\, 51 <.ic':ncU<• htstona. le tnlnrrnaoon dogma c.-ntral. 10-11 11/ uprnlón unodlr«cional. 11 posicional. H "'mcnoa\ dr N'<'\ drl llNA. 6 "'rumbinam\n, mnvcl'lt\n a~mca. 116 <..ienrti<.o n~lll<'.

1119·ll S altttadtm..- nporddl"s, 1'17-199, 197{.

IYS/ •ntlmdonrs. Vla" Anllulllnnt•, utdun~•- Vlau Codtlllt"\ lirnrndnn. JO evoluunn. 1Yl nwru" de lcnurs. ll-ll punto dr lnldn tl)n. 30 rotura. 190 umveNiut.tl. 191-192 hg•ml.-ntn. 24 ltX'U'•- 24 m•P"' de ligamotntn. 56 nupro. nuniwtjlltt"\ 121 · 12~. 124{. 125( RFLP. Sll-60 S9f

<..rnoma hattrnano. nudroock 7l4·7l~. 7l4/ ronttrudo. l. ss. 57-~8. 58( dr6maon ~6 di>tnbudón dt' In~ ptntS. IIS·86. 8Sf DNA. 11 txtracmntO\. 114/ majlC'n división dr mtrlcclón. S6·, h¡¡amlento. ~6 'l<'ntrnda. n mini~tt'lltr\, viabilidad. 124. ll4/ número de ~lit>. ~6 OIJandos. VIo~~~ tolftbim .Mlt<>umdrias. 11<'"""'"' DNA. 67-69. Mf. 69{ poltndal. S6 ...-ruenctas. núm.-n> dr gtn<'S. 77. 77/ umañu. 12. 12/ romplqldacl ~nltlca. 61 nP«its dtkrtntn, 78. 71/ filo.dJk...,nt.-.. 6tl-61 , 601.61/ ltmgltud dd DNA no ttptiiUVO 62 numrru rlt" larmlw> tk gcnc• 81.1111 numero dl• ~CO("\ 78, 78( pruporctón dt ~cnrs un15. 12. 12} varidt'it'>n imll> tdual 57-S8. 58(

vrncu. 11 vuoidr. 19·20. 20/ ~rrnlnal. lfnta. patrc\n. ST7 ~inaks. «lulas. m.-tilat. 83? GGQ. tltmtnto, 174 Gir.os.1 dtSI'ntoll•tnlento d~l ONA. -149 tSiructura. 4111 mndrln dr inYrf\hln tlr St"tidl, 4R 1·4112, 432/ rcc•mblo enLomátit'<>. 482 Giros. numrro tk IW), 478 C.lcfii(•P. aliiVdoon dc la riht>7Jnld qur divide al RNA. }40, l41f rrgut.Jcttin. 714-71 ~- 714.f Gln/Asn. prntrin1. prión. lonnacltín, KJII Ghtblna grn

a ddn '"""' en l~\ tala\t"flli.l\, 11 0·111. 111{ tlur•ntt" rl dn•rn>lln. 101-102, 102{ exollt<. 51. 51{ lon(lltud dr los lntmnr< 41 atuUJ>Ontocntos• ..voluunn. 111·112 fornuC16n pnr doplirKión. 101·104. 101(. 10\f ji . 110·111. 111{ dílcrcnda. rntrr 1•< Mptdr•. ·U. 41( durante ti dr\41rrnllu. 101-102, 102/ nunn. H. SI/ funn~ttnn tlt· a~rllpllntlt•ntttS, 102-103, 103{. 109 lnn~titud tle lostntrnnM. 41·42 mapa dr rrstricdón. 40, 41[ teUdOJ!tnt\, 109 dfvrrgrnna, 105-106. 105{. 106/ evoiu, rn'ef'lnrn. aMI•act•">n ptlr unión a ligando.. 656, 656( drdm dr /tnt, 655-6~6 6~6{ Glurola...s. rnw-r;tónolt ha...-... 506, S06{ GluCOSol. amv1dor dr 11 CRP. 121. \22f Gh•ro•lla"'' t"!"'rulón por f'SCI\Ión m dfulas de Uldmík-. 504-~0~. ~OS/ Gluwmato. ~47 Gratuito-,, induoo"''· l07 GRE (rlrmrnto dt r~putsta 1Im ¡¡Jucoconlculdr! 1. 6-49 GT-AG. n.-gla. 671 GlT' htdrohsl• actindun rn trJII>lt>
.-ntrada al sitio A. 167· 161!. 167{ protrina> de unión . .-n .. \lntMK dt pn11clnas. 179 GTPa-... c.-mm. 179 Guamna. r. nucltótido. rn R."atdón de auto conr y mtpalmr. 708. 708/ GUC. rodón. tn slnttst< dr pmtclrun. 158-160. 160/ Guía. lnttrrw s~cu.-noa UG!>t. 710. 711 Rl'A. 722-724, 721{. 724{

H H. •nu¡t~no 1•nn~no 01. 28 11. cad.-n•. ''"'<'"'· Jllll-3119 H/A< A. ,n.,RNA, 6'1'1. 700 700( 111. prottina. 7}5 112. I [,muJia. 111, 81{ lla¡>loid~s. fcnutiplla\, a<'tltitransfrr.~sas de tHATI Hb antt-1 eporr. 111 llh Krma. 111 · 1 12 Hh lqlorr. 111 HbH !hrmo¡¡k>b!na H). 111 HDA jmetnttt dr nliatmud.-ótíd.,. dr allll drnSidad), mrdlóón dr lo< RNAm. 94. 94} II[)At. l t.ut JI monas. d<-w~rila>.n d.- IHDAC} Hd a/\V~O. tduLJ,. ntctam<mu de rtphcaoón, 4471 llrh<•w·prlmaw. con1ple1"· 441 Jlrl~ta"''

tlt"\t'nn>llamlento del ON<\ 4~~ ~16. 4lllf hu•nllm:.u. 416, 416/ <<"QUt\lto l"'ra d Lehamlrnttt. Hll. 41111 >Ubunidad. 62~·626. 6l7 llthce-Rin>·hrli« c.·lcm•:nfiK ~rOrtlllóll. 6~ 1 luncionc,, l62, 162/ rtprcr. 362. 162{ rr1116n, Cm y r~pr.-1o0r, J71 Hellcr-l.azo-hrntcln.>\ (1'""""'" HlHI .-lcnlt"ntn dt" ...Ot<'ndd 660-661. 661( fu"n•onn dr dlm "bHUf. 661-662. 662/ lltnumeuladtK. '"'"'· 8ll.IUI/ ll<moaJohfna adultt>l~ntrnttt, H2. 432.f lh·ruhdut.J\, funniltHUI

""' prntrirta A ~~~lea. ronvrrslún dr llNA de doble t•atlena a UNA d.- taden• im.livh.lual. 4l6-4l7. 416( flNA nudrOn. tran,J'O'ición. ~lO, S lO/ nu rq>lierc:nruUanuentos dr DNA. Hl> trarulrrrnda drl T· Dl'A. 40S·406. 40S/ uans¡xosoCllín dr rlrm~lll"' nu llll S66. 566[ Harncu titn¡>l'<míu. 6S llt-terocromAIIna al\lantc,. 7112 """'"'"' de •~ulaaón dt histonas. 6011 auto tns.tmbla~. 835-836. IIM.f romplrj<>$ """ """'mblajc:s. 1120. 820/ unl\lltuuva. 740. 826-827

dcftnt<mn. 119. 719, 719{ ON A wtéhtr. 117-119. 118/. 119{ extrtwOII. lnactlv.a~n ~n1Ci1, 1121. 821( farultam·a. 8l7 fonnaonn cn i.J, kv.adura'- 823-82-4. 82lf b.-rrnro.a rplae~tlc.a. 820. 620(. 621.11211. 1135Ml~ . "16/ IOit"t•tUUile\ mn l•s ht~hll115, 822·1124. 8llj, 823/ P"'~'""actfin . 1120·1121 , 1121 f llftfn>tl<'nra. pankul.a ribonudeoprotclnlca chnRNP), 66?, 669/ Hrtrrn~~nto, RNA nuclear ~hnRNAt. 669, 669/ h(l A, ¡¡rn. mut...-lnnr,, 174 HilA. l•rut.-on• htJ\prtladora. 168 h/18. ~n. mur.dOOt'S, 174 llfq. pr01tfna 142 Hfr trtrombbw~n de alu f=utnd.ll). 401 Hlbrid«tón '""'"· PNA 118 119 •drnt1tk•n•m tlr ,,.dcn4l dr aomosoma pnhtinlu>. 74l. 743{. 744( uonprofica. 61·6-4. 64( J>MIIOfiiO ck 1.J rc.teción. 1l-14. 14/ RNAm tun ONAc. 92-91, 92( thltnd<>. llllllltln del r\ladt> tran,Illl.l ~91 Hrh11d•~. dnalo\1< dr dttS. 6-45-646. 646/ dlsarnr\>a. ~44- S46. ~44{. 546( Hufr(\j¡rrw. fornwcittn dt t"nldc~~ rll DNA dt doblt" tddrna. 7, 7( llldto>p> fetdh>. 111 Horrm. clrmtnlt> Jr r<'J'Ut"\ta (IREJ 142·143. 142/ Hli•~- c.tdrn~>. tn repllc.adón del ONA. 8-9. 9/ Hijos nuclruldt,, remndrn ...dón, MukB. 418. ~18(

gen.-s, 486 Hlprmtut.aoón. dt'flnldr dr\amtnaw de cilldina r tthJccKII.-... dt ur•dlo. 591 - 591. 5921 lhprrw-nstblu. ton.a ••rliJ.adón. 801·1104, 1101/. 1104{ •ctova<1Ón dr la upraión ~nica. 1105·1106. 110'1/ IIATs. 806·807, 806[. 1107[ HDAC>, 1106-1107, 1107/ h ..rmda rp~grnltia. 816. 836[ repltcadón. 807 rrH·.-Ibtlhlad. K06 tratt\ltorl.a durantt la rrpbc.aoón. ~0'1. 80'1/ drhnldón. 7Sit ft>d<> rliaL1Úrt. t>trut1ur• dr la cromatina. 610· 811. 811/ H l. 760, 76l, 770 lllA·H211, dt'tt·n-amble, 781. 782/ dlmrru. 767, 767{. 772. 773 H1. 760, 767 113.3. Virllntt, 774 Hl,·H4" ttlt~tnt"IO. 767·768. 767{. 768{. 772. 77l 114. 761). 767 mtt"ruoonr. con la h.-trrocromatfna 1122-824. 8l2f, 823{ modlfk.clonts. 1102·1104. 1103. 1103{. 804. 1104( col.a Hl. 812.112/ losfortl.aaón. IIOl. 1103!. 1104. 1104/ mrtil.aó11. 1103. 1103[. 804. 804/

h1111.

"""'· 801. 110)/ muui.Jdón. HPI. unión. 1122. Sll/ mrtlladón dtl DNA. 808-809 nlidco. H9·760. 760{. 767-769. 767/·769/

tkCamcrtK

colocaoon. 776 lUn\trv~d•"· 77J. 772/ dr\t'n"'r"blr 771. 773/ dnplaurrutnto por transmprión, 779-7111. 779f. 780{ lnrmadt\n. 767 -769, 767/-769/ m:nsarnblr. 77l·771. 71lJ r~modt"iaciun dt- la tTt>ttwttna. 799, 799f l'"'lnnnadd, 770. 771/ RNAm. (tQ7 697/ tlt'tttmll' a cettltun do· tHAT) dttl>·adtttt"S. 80(,·807, 1106/, 807/ U"<Jtnattna a(li>·a frrntr a inactiva, 809 809{ J<"'ol\llc (HDAC) at1ovatl..rt\, 806·1107. 807{ .:runt.>una aol\·a frcntt a lnacttva. 1109. 809( rt prtwrn. IIOt.. 8011/ rn.-tlltran•l<'rl"' SU\'l9H1. 821. 812/ l'h<1JUr. 763 HLA. locus. SQ\1 HLH. pi'Oirinas. VI- H~llct-lazo-hélict. protrinO> (ptOidnü HLHI HLH ~dtmrnto htUct- lazo-11#1~¡. 651 UML, locus stlcnoamtrntu trkttntnru. 1121. 823 Upo de ·~.amiento dr las ln.,¡uras. 438439, 439{ ""ISP<~klón unldir«donat 493. 494 lll>fR. ltJC.U> \llt"noamlrnto tt'lumcnw. 821. 823 tipo> dr apartamltnto de la~ lrvaduras. 488489. 489/ transposldon unidlrt<'órtnal. 49), 4Q4 hnRNA ~RNA nudrar hetemga'nro1. 669. 669{ hnRNAr l(>arti69, 66~/ 110. cndttnudra"' drvhl4>tt dellocus MA T. -493·494. 494/ pruduwon. rq¡ui.Jdón dr. 494-496. 495} traow.np<">Ón. 4Y4-496. 495[ 11u1a dr t"'ht>l. Ntruclura drl RNA dt" tran9 por \lstenw Ruv. H2·47l. 41lf Hul,>ettrtma cen11ma u>mplrtal. 165 lh>nJrt>dtJIIIIIlHI drhniUilll MI DrM~rhlld mt/.m~.wtr. 6~8-660. 659{. 660{ pruttlna> tk mru.-m.ltt 660 rrt~lotttS helkoldalrs. 6W. 6SYf Homrótlca. taja. gcnt"s qu<" contienro¡, 658 HomóloR•· rrottnhtnadón ONA hlhrido. 46l -46l, 462/ etttrt cromommJ\ rn \lnap
Hornói<JtiOS. unlun tk <"~tr"m"' no (NHE.Il. 516· 518. 517/ lr~p2. mutKtón. 469 Hormonas w-xualrs tstrroidn• utnto activadorn. 654/ Horqutllat. rlllrtmo codltlador m m1)mblnKión tnmunr. '84·58'. 58Sf lurm.a49 Hsp40. uno6n tl~ H
Índice alfabetice

877

Hsp60, slst~m• mltoc:ondri•L 2+&

Hsp70 ~Mi. tlnttmlf!l

sa y us', 78l-784, 783/

slst~ma

m«anismo. 225-226, 225{. 226{ mitocondr\11. 2<44 Olturaku ub!CUI, 226 pJ~ttnto ck prottÚUS. 226·227 protdnu dJ&na. 221 unlón Hsp40, 226, 226/ Hsp90, slst~m.o. 225-226, 2l6f HSTF fl•ctor de control de impre~ión¡, 814. 834/ IF. Vl-lnldaoón, l«"torn fiPI IGS f~tu~noa aot1 lnteml), 7 10,713

IHP

formldón dd complqo de p¡nldón. 420. 420/ intqrldón y C'Sdslóo. 4116 s!Uos d~ unión. 487 II~ ·RNAt , slnt~tau

•nto, de cdloón. 205-206, 205{ sintrrico, 205. 205/ $11105 ll1lVOS, 205, 205{ lmd. rut.t. 603 lmpreuw. nc!Sllin. 529·530 lmpr~sK>n

ICR, 834. 834{ mculaoón del ONA. 812-834, 83l/ rcgumcs d~ control de (ICRJ, 834, 834/ In srtu, hibridación, DNA. 118·1 19 ldrnu.6cauón de bandas de trr)moromal pollttniCO$, 741, 743/. 7+&{ In vrtro. romplemcnta
878

Índice alfabético

rrgulaoón coordín.ada. 107 uruón ...,pruor-opcr.dor. 318·319 InduCidas, mutadones. 14 lnduaorcs de8nlo6n. 306 JTIIuJtOS, )07 pcquellas mol~culas lnduaor~s. control del rcprewr, 106· 308, 107{ unión. llbcrltdóo del !Tprcsor ckl operador, 314·115. 315/ 1nrpcndlrntes, rlrmrntm. &s. 559·560 lnespcd8ca, htbndad<m, 61·6-4, Mf lnfluenu, neur~mlnldasa, scllalancla. H7·H8. 218/ lnhtbtdor unidu a 11 membrana, umót• del DNA hemlmeUiado. 181· 382. 182/ lnictaaón rodón, 32 complrjo, msamble, 6ll·622, 62l/ rstablllzadón drl faetor de lnlcladón. 1 57. U7{.160 "'"cu•dón del promotor. 621·6lS. 624{. 625{ origen, ttbomtrnto. 450 metl~ción. 180-381. 180{. 381/ rcphcadón drl DNA, 177,429 rcqurrlmlentos, 4)8·439, 4)8/ Ylltnis protdnlca, bat'rvadas. 602· 604, 602{. 60 l/ mcdiada por ~lulas. 571. 57){ pnmana, 574-575, 574(. 594 propc\>lto. 572, 571 reronoomknto dt protdnas pruplllo. 571 r~urnmtrntO\ prote(mros. 573·574 s«ondarta. 575. 594 lnmumdad. rr&ión. 360 lnmunnarlo. slstcma. 570-605. ViaJot t~mb1l11 1nmumdad (rcsputsta Inmune) diversidad ~rncradón duram• l.t unión V·C. 584 586, 585{ grnerado por rccombtnlctÓII d<' lnmunOifobullnas. 580 581. 580( • panit dr mutaooncs som4tocas. 590· 591, 591/ r«>:ptor~ d<' ~lulas T. 597, 597/ g~nr<. rodíf"~dón dd locus dd romplc¡u mayor de lusto
productiva. udustón al~llca. 582-584. 581/ sceucnoo d~ conscnso. 581, 581{ lnmuno¡¡lobullnas "· 587/

·~=.

cnwmblr p1nlf d<' \cudogntcs, 591594, 593{ cadeWI~ llarras, ns-576. 576/ rns.amb&.jt por UD.IIOIII recombln•CSn novcdow. 589-590, 589/. 590[ clases, 5117·581.. 587{ D. 587/ dellmoón. 572 dommtos, uonrs. 49·50, 50/ vanables o V, 576 1!. 587/ cnsambk poc recomblruldón ICIIMtb.. 576·577 uprnlón de su~rftde, 59 S, 595{ G. 587{ gene< c. 576 ensm~ble, 5n·577, 576( polrDCloldurn. 610 V,576 M. 5116·588, 587/ recomblnadon~ Vlau lnmumtarkl. slslrm.a; Rnomblnaaón rcgión, con\lantc. H5·576, 576{ vartalde, 575· 576, 576{ ~eoón • p¡nir dr las ~lulas B. 595 Innata. inmurudad, rutas de ~ll&liuclón conservada$. 602-604. 602{. 603/ lnopona. apareaoucnto de I>Jsrs. 196, 196{ modtflauón rn d RNAt. 195, 195/ lnsrnos. gmcs, none\, 4}, 44{ Jnse:rdon sceucncfas (ekmcntos ISI definición. 524 prtmord"'lrs. 559 repcudnMi, dírcou, 524. 5l7, 527{ tcrmrn•lrs lnvrnldas. 524-525, 524/ ~udoarnrs pTO<eudos. 565. 565{ lnscraonrs de h nrctón. 16 elemcotmtronsponlbics, 16 mutldonn dr cambio dd marro de lroura. 31, 31/ revrnlentcs. 16, 17 lnsulma. sen. 5 l. 5'1./ mr. aen. boroologl.t. 56), 56 lf lntasoma en 1• rccomblnodón d<' k 486·488. 487/ lntt'Jj.radón. 150. 483, 483{ lrucgrol~. prote!niS, d<' mcmbr1n1. 2 )5 lnte~s. 485, S5l lm~lnu cn ronr y em¡N)mr protrinico. 724-725. 724/. 725{ lntrral~hca, complrmentactón. 110 rccomblnadón, COOVCI'SIÓn arniQ, 475-476, 475{ lntcrbandas cn aomosomas pollttnlc:os, 742-741. 741/ lm~rm~s. acnn. 282, 283 lmrrmitcnte, lntrrfr~na. por pQ, 294-295 Interrumpidos, 8<11~. 17·54 bale. 71

r

ditn<'nStolll'S, dtfercnct.JS, 4}-45, 44(. 45{ rucariótlcos. 669 rvoludón. 47·49 48( uones Vlt~>ot Exonn <'llJlresión. l8, 670, 670{ mtrones. Vlast lntrones orp.nludón. 40-42, 41{. 42/ MIJ. 71 >rrucnoas de nudeótidos, cxonrs. 18, 18/ introneo. 38. 38( lntrin~os. tennJnadorri (atrnuadm..,.l d~llnirlón. H3 f colr, HS-H6. H5( horquillas. 287 l811, 1.87{ Nus. factor. 294 U, r~l!lrln nca. 287·288. 287/ lntrunr' •loJ•mttnto. 716 autoc:orte y empalme, faoom dtiiGJción. 715-716.715/ estructura \e<'Urtdana. 709·711. 710{. 111! 11'"1"' 11. 707 auto cone y nnpalmc por fonnaclón de lazos, 683-684. 684/ codíflcadón de prot~írYs multilunctonalcs. 716-717.716/ 1.~<1<1fC\ de n~duraoón. 716.717. 717{. 718f C.T·AC, ttlll•. 671 rnovllldad, 715-716. 715{ mut-.ionn, 19.41 11rcxno de ddlnldón, lorm1ción dcl comple¡o e. 678·679, 678f r<'modón. V/lur RNA. rone y rmpalmr ltNA como molde para~ Ylltrsis dr D,.Ac. 717 RNAt d<' ll\ lrvadurl'. 6'10. 691/ \llt~d• restricción. 40·41. 41{ Ul2. dcpcndlmtr, 681·682 w. 71S·716, 715/ 'lntrones adquiridos'. modelo. 48 'lmmnr~ an,ntrales' modtl<>. 43 lnven.a tr~nscrtpdón. 10·12. 11{ rci>Jmlemo. cn rkntentr>!l UNES. ,66· 5f>7, 566( ~udOMrnes proc<'sados. 565, 565{ tro&n~loc.taón. 234-215. 23-4( lnven.as. transcriptas.u actividad de l1 RNAasa H, S54-55 S d<'8nlción. 552. 554 R".:Kt'!Ón dr tran'PQS!ción de lntrones snrpo n. 716·717, 716/ rcromblnación por <'lección dr copla. ,6, 556( retropos<>nn. 56 3. 56 1{ telomerasa. 751·7'2, "lf lnvcnlones a partir de rrcomblnadón tnmunltar\1, 582. 582/ ln\'tmdas, rc~nooncs. lormam>n. 590. 590{ IPTG tisoproplhlogal.tctósldo¡ 307, lll. 119 !RE rrlcm~ntu dc ""~'""''"al h•erro) 142·141. 142{ lrd P, 693. 693{ IRF~. cl<'mcntos. IM

IS,

elrtn~nto..

Vtol>t lnseroón. S«U~Det.tS

(
ISI l,....,ccptorcs, RNAt. 200·1.01 IS
J J. ~mcntos, 577, 595 JIL·I. a na Y , fosforiiAdón ck bistonas. 811. 81 1/ Jun·Fos. betenldím~m. 6<\l 1(

Kasu¡¡amldlll, lnhlbidón d" la mllnls ptotefnla.

1110 Kilol>a~l

jkb), 40

Kirromluna. 1118 Klcnow, fra¡pnentos, 412 Ku, h~tcrodlmen>, rn unión • ntrrnuK homólogoo, 517. ~17{. H8( Kuru. 20. 819

L lrK R
IIMZ. 104 mutaonnr>. wn•thunva<. lOII. 108{. 309, 110/ /11( acnmlpo 304 ~~~rón. 104, \04/ RNAm 3(1f> opcrón. induwfm, 30~-lOf>. 106/ r<&ulacilin negallva. lOS, 305/ rcpruor lnactlvaoón, 107. 307{ muto>C'ione•. 112- H 3, ll l( umc>n ONA ll7- H9, 118/

k

la~o

anmrrmln1o/ln, U9 c.tsc~da litlea. 159· 360 tcb.tmi~nw. rrphcadón ~n ~1 orill"n. 450· 451. 450{ tmnplc¡o d~ panldlin. 420. 420[
mrnr.ttalH/ LCR tf de abttn~ vtaJot Abíertc,., marcos de lcaura tORF) hloqutados. 12. l2/ deftnldón. 11 · 32 no ldcntlfludos, 12

l..c<1Ura • travls. ddlnidón. 2117 •uprHlón •in o,c:ntldo, 208·209, 208( L.cahrmOjlobina.llfn. 101 en supcrlamilia dr la ¡¡lobuu. 51, SI/ Ltulr,.atlra, Menom1. cdtoón
dc8mdón, 651 cstruuura dc h~lln~ anli~Uca . 662-663 formadón de dhncro\. 662·663, 661{ rq¡ión nca (U.R I. 604 Lrvadutas. Vc!ue t.trnbl~n Sacchoromyce< crrcvlsla~; Schl7osaccharornyt~\ pnmbc Ashl. RNAm. 146·147, 147{ ttntróm~ro. unión al complrjo priMrinico. 748 rompl~jos de rcmodrladón dr l.t croma1lna. 799-800. 800{ wnc y rmpalme del RI'IAI. 6'10, 690{ 691( d~gndadónd<'IRNAm, l4l·l44.l43{ 144/ dcmrntrl\ 7)-, 5~9-~61. SS9f- 561/ endonudón de •hoque tirmico. 650 grn~s. esenciales, nümrro. 89-90, 90( rcfi
acttVIdora en !lu¡o .uttndrnte. 629·6}0 lfdrr. otocromo el, 242. 242/ otoaomo oxldaIr•dón por ~sctsión m ~lulas dt mamllrrus. 51J.4·SO~. 50~! Ubcraoon. fadorr~ dl' tllft drllnioCJÜI de 1si¡n.aci6n de la matriz. 242-243 ¡erarquía, asl¡pwdón dr protrinas. 241 24\. 241/. 242/ termrn•l N, 240·241. 240[

Índice alfabético

879

üpndos. unoón . .x11v1dón de- la umón drl dnnmto de- r.:•punt~ 656. 656/ l.Jgcra•. cldntaJ. e-n tct,..mc-ru del anttuJC"rpo>. sn - ~76, H6/ tnsambla~ por uJU sol.t rccornbinaaón. 577. 578/. 579 famalias. 577 UNES (de-me-ntas lnttrpuc-stus lar¡os rtpttld05). 561-56). 56lf. 561/ rndonuclu-. para ~rnc-raaón de-l cxt~mo t•c-b.ldor. 566·5417. 566/ 8tnmna hu mano. S61·564 ll , 561·564 mutadonc• ••J~•mánra•. 567 lradUHÍÓII RNAm. ~Ml-567, 566/. 567( tran"TlJ>taws ln•c-na-. 561. 56)/ LaniOCtto\ Wa.stt.Imbttn B. «lul.o• Hlnfocllos 81: T ce-lula• thnlocuo. TI drwrroUo. stntC"\k de IJIM. Sllb· 587 u.knulluoón dr .-~lul" da.ana. 575 anmaduros. INnco. 574-575. ~74{ l.Jpopollsadndo tU'SI. bOl l.Jsts. 150

Usosmla

!Nian~ ron ti

cklo lltlco. t'IIJ)t crftlc&. 371· 37-1.

3711 arrullo de conarul 168 dcfinldoo. no lSI, 191 cstmctur• dtmtn(a del rrprt'"''• lbl rrprr\, ~rn<'• di 1 tlll lt\S )61${ ruta. 1118· 370, 369{ l.Jtka, íntc-..uon. HO Litim. dclo. bollan« con la h'>ogcma. e-tapa .-nuca. 373-374. 371{ UK trc-JIIón rica c-nlrut1na). 60~ L(X"U!!o

aldo.. muluplt\. 17-18, 28/ dr upo "l•cstrr. 28 28{ rrg¡on dr wutml tlCR I. 789-790, 790(. 7'11 LPS tlipopoh•a•ando). 1>111 LSDI tdr,mrula>a t•flt'CIIk• dr Llsm•l 808-!l()q LTR. 556, 557 potrna.~dor.a. 5~7

mroposones que- contscnm. St>l Ul. rc¡lón. 557 LTR·poi· LTR. 559 Lu¡o, J!tnt\ 93

M Macromokcul•r. cnwmbla¡c-. •ante-sO>, rr¡¡ui~<10n dUtog~na, 32?· ll8, U8{ M.Jd:Max. htttrodim~ro. AOII Maduradón. lanorc-s. IUtOCOnt y tmJNimc- dr cntrOltM ?16, 717, 717/. 718{ c-ndonud~uas. ?16. 717.717/. 718{ ,.,Ytl, dOáli51< donal. 518. H~f uanspo~lrn'14dón dt dosis, 826 826{ DNA mitocondrtaL 70. ?O{ sattlltr. rq~tlidontljt,..rqulc&$. 120·12 3. 121/·123/ uunc-s de- los amn. 43. 44{ gmC""S Dlfl'lt. 42. 42/ g~noma•. 117. VliJSt t11mbrln Humano, ~noma G· C, wntc-nido. 741. ?41/ mitocondnalc-•. 70-71 mrovtrus tndcltl~nu,, 56) tamaño. 8~ HPI. 822-82). 811/. 8ll{ longitud de' tspauadnrc-s no lRnKrtto.. 114 pñOII<'s. mfri'!DC"dade~. 8 39·840. 839{ rqcone. MIK. 600. 600/ ~plladón dd DNA mnocnndri.ll. 18~. 389/

880

Índice alfabético

rutas de rcpar.>oon J>OI CK1\1Hfl 504· 50~. 505( >Í5trma$. de r~PI""''" · S 1S· S 16 ck Vtjlll.lnd~ 145 145( MantC:flJIIUt'ntO ~~lit\ '13, 6 ¡4 mnJW.dr 8li ·S'l Mapc-u ~nnko. crunu.attlílts. 123· 125, 114(. 1H{ RflP. 58·60, ~9( MAI'K (protc-mdca.. lctl-.tb por mllclt!enm). 604 MatuJ de le< tu ra

mm•donc' dt..· '-•lmbtn deflnlt1ón. ll, llf du rante- la rtpllc.tNA. 412 ~rruu·, rn la smtesl\ dt• pwtcln.t~. 1~~~. 156/ prUJifdtttadas. 211·214 r«<>diRcaeion y 211. 212. 212{ S«Utnda• rrsbalddit.a), 21l·ll4. JI 3{ suprt>Or de l'ITlht<,., ll MARS trtKIOJY\ dr adhef.zt.

I0('\.1\

c•mbio dr 111'0 dr ~l"'rtaml~nt<•. 491-494. 494( rodlftacdón dr lol pr01eln1 r<'Sulador•. 490· 491. 490{ 491{ ronvc-nión drl tipo de- apa~amJc-nto en ltv1duras. 418· 489, 4&9{ división por la mdonuckua HO. 491· 494. 494/ Matrma. htrrneia. 67·68. 69{ M.ltriz. rqlnnc-~ de- adhnlón • 1.1 tMARS). 737· n8. nst. 791 Mh 1p.1rn r>l. 40 MCII. protcuta, rrn•ptor rot~m ., (prote-ína tlt tnantc-nlmlrnto dr rnltlltnol~). )8i>· 388. 587{ MI)f. protdna. pnlim••raY .Jc RNA ••r•d·• ~2S· 626. 626/ Mnhadnr<". (>48 Mrj¡~tbaJn. JMin 1Mb), 40 Mriosls bhalcntn. 29. 2'1{ 461 cronoiOfiÍa de lm e•cntos. 4b8. 4b8{ mtrnTuumlnnn. 29, 29{ na~ durmtc- la t«<mblnadón homo~. 461 461{ rvrntos dr- rttnmbm.aoon 4611· 469. 468/ ntendida. aomo..1ml\ rn riC\lbtllón. 741 ·742. 141{ bttc-rocli<Jlos. 4n sinttnll de punto dr insp«dón. 469 Mc-mbr~nas. ~rckln de pNidn•~. mcc•rusmo, 2 38· 2-10, 2 W/ postraducdnnal. \tmrtl<'lds liderr\, 140·141. l 4 0{ 11\cmona. ctlula•. sn. ~~· Mcndd. lt•yt-,., 24 Mrndcllaua , hrrenda. >ltlo' de- rr,trtcur
.n-urnn.a. 141 · 14). 142{ dr protnnAS. 1 36 ntruc1ura. crntros anivlllijA)+. J 3'1·140. 140{ trau. 697. 697{ íntrrat'dont\ mn d RNAr. 180 louh7Adc\o. 146· 147. 141{ ITlt'dH.10f1. .. J -'14, 941 monLttlstr,,ntcn. ll6 polttAI+. aisl.inuc-tuo, 140. 140( rrmnción. tnhtl>!uon dé i.J trldutrtmc<·,¡s 1 36. síntn~>

U7{ poh.,..ma, 1H -1\4. ll4{ prc--MNAm. procrwmlrnto 34. ~/ proclumcln. wn< y c-mp.thnc .le- RNA. MY punftcaoon, m~tc.,ln .1~ dnndnuu. 1-411 regic\n, co.Jift•·adma. llo no tradu<1da n UTR Sr, ll6 retrovtr1t~>. S ,2 \C"C\J("ndd dr lnldadcm. 211 «'(ucncid> dr nudemldu\ lfd. ll,/, ll6{ u~lulas c-ucanóuca.. 1 35 131·1 n . 1 Slst~ma leana•. 1l0 tran..::ripclón. 129 129{ bolctrna'. ll'·ll6. llS/. ll6f t"uc•rit'>tlu lrt'nlt a procariotiCI. 610·611 tran•ponr. 14,· 14?, 14'{ 3'. txtr<'m<>. ~70 tnpk-tc-s de- nud~tld dr 19~8. 9 , 9/ Mrtillotlonrfna, aen, tltmtniO!t dr rrspursta, 6S0·651. 650{ MrthanM>Imtnaaón. 18- 19. 18{ Mc:tíltr.tnsfc-raus. DNA. 8ll. 831{ invtníón dr basn. 506 Mnionlna tn •íntnis de protrin.a•. 1'8·1 59, 1 59{ MM·RNAt, l65·11i6, 165/. 166{

raboso""''

nr

MHC. Vt""' CompltJO mayor dr lustatocnpaubtlidad CMllCI Mkh11C'I'' Ml'm~n. ,;nit•Q~ rc..1crinn~ r-•t•htica" dt la nb<>llnw. 71l. 7 U/ Mlaci(U('.tl, nudtu. dlj¡rstil\o do.- cromatina. 759. 759{. 761. 778· 779 ttt~btlldold, 124· 125 Mln C/D, 41 ~. 41 S/ Mlnl.atur•. elc-mrntos. tr~nspunlbl~ ron te-mil n.tnonn dr rtp("ttctonn lm'trttdas lMITI:t. ~61 Miniu'lula\ 41l Mtnk rnanu•omu, pmteíru dr mantrnimimto tJirqcaciÓII, 424-415, 424( sunc-sas protcaruc•. 240 nM. rom~ 24l. 244. 244/ TOM. n>mplqo. 243·144, 241[ Mltótlc-nos. procelndniSI ..nlvada por IMAI'Kl. 1)04

MMTV, rrumuwr. 1102 "'"" '"'"'"' jttn. 784· 785, 711S{ Moldr, tadtna•. 11 9, 9/ 158, 158/ rc-mnoc:imlrnto. tnlran:~attn­ Kenn ma, r•prdtko de su genero, 82, 82{ lrlllf~Dc-1. 521 Mt•tA. producto rudlfleado por rllago. 355 MRB trlrmtnto de- ~Ut'Sia a múllipltl mtl..lln). 6~-6~1

MSH. ~astruto d~ rt'¡Wraaoa ~ 509. 591 Mspl diVISIÓn. 6J2·6H 6llf. bH{ M TO(' (n·nun' urgamt..ldun.""\ d.- lct5 nlluotubuln•l. 745 MuA. protnna. BO· SJI. SJI/ ltanq~<...-.>.1, HO·HI. SU{ MuB, prntrl!U, 531 Mud2. pro1rirw. 6n 101W<#rA, gen, S41 101wJrB. J!Cil. 541 Mwk. mu~nrs dd 1m. imc-rrupáón dr l.t SC'IUC'p<ÍÓil. 4 18. 418/

MulnnK'nas. pmtnna,, 10'1-liO. 310/ Múltfpln. copla$. mhlbaclón dr. Sl7·538. 537{ mt'laln. c-ltmmtu dC' rnpunta a tMREl. 6'0b5l 111111, IC"R, ActlVitl.adn. 507· ~08. ~08( M utaeion dr mmunodtftct<'ncta mmbmada srvrra (mnt.uicm dr SCIU). \ll.lo Mutannnts ilctuadon m m. panídon. 417·418 <Mnhln clrl marcI'"Idnc-u. 14, 5ó7 rvoluctl\n, 89 unn. l9, U favurablt\. 459 ~rutnd.l de luncion. 27 fi"RC"\ dtkrc-ntn. 26. 2t.J mdu<'raonn 16 cntmn. N . 4l IIIVC"n.l\ 16·17 nn;mo Rtn, 25· 26 16{ na_,l de- to ndo, 14 uo IJvur¡¡hlr>. 4W no lct~ln. qut provc•u lttóllldad rn C'l>nthlnacíbn. 91·92. 9 1/ nodv•>. 104. IU8. 108{ ur¡¡.Jnludón line-aL 24 ptórdlda de- la lunoón. 27 JM'MIIl'lthlr., 26 ¡lfn•uudora> dr drln1O. 710-711 stUdOf:tntS, 108. 108{ sltm~ 17. 27/ sm ~nudn dc-tlnloon. 172 drl&ndao
<'Onlrol , 105 ,,lrndn'WK, 1OS '"prnlón. 17 taws. rc-du<'Oón por ""C"IIYS de r<'paraoón. 18· 19 vrma¡osas. 104 Mutador. fc-noupo. 507 tr•n5¡><X<m ~41 Mutoit~tnt'S

.t
mn•tituu..os. lOII. l09 dr d~tnoon ltma. 4.l9-4 JO no lnduoblc-s. )08 MutSl. sastrma. 509, ~09{

My<. pmltfn.as. 661 ,662 (42prwlww. cambios del códi¡¡o Jlt'n~tro. 197

,.,,.,..,,._a

N N. nudcóddm. 585. 515{ N. ttrmlnalts rqponts. 654 n·l, rfJia, JlOir• IJWctlvadóa X aomosom&, 827• 828, 8211{ Nd<1Cnlt prot<ína ddlnltím•. 1711 traauloc•d<m <'n el ER. 2l2·2H. 2l3{ RNA. ll6 NAD (dlnudeólldo de- nlruclounldl y admlna), 172 Nlltural. srlt<'\ion. 89. 91·92. 459 N<'!Cattva ,,,.Jrn¡¡, dd UNA. 5'54· 555. SSSf. 719 wmpkna~ntaolm, ll o. liO/ rrgulac:itin. tontrnl dcljtt'n /M, 305. l05{ N<'¡¡.Jrtvo. DHA. dr detenoon fuenc-. 5'54-ns mut~ntr <)'fl8. 709 Nc-utr.tlrs. sitio.. vtlodd.d dt sullliutdón. 107. 101{

Ntttrc••P•"• a-.

NFI. unaon. nudrusonu. 802. 802[ N lontlll ·n~uonai- RNAt (RNAt,Mrtl, 1~8-159, 159/ NF· dl, lanor. 652 ruta de llpo. 60) NHEJ (unión dr ntrrmos no lk>móJososl. s16· 5111, ,17/ Nlll 1 (umou de nuenw~ no hotttói()J:os). 586 Ncmtiu•nml.l y •ckulu••. ba\o, rn okidos nudeicos. 6 Nttr<>jl~no rKaS<"z <'11 &c:hmchuJ roli. lH No diellc,l\ utpt,J> 102 No •lélim•. ll:tfl<'. unnc-s, 116 No auiÓnOOIOI. drmcnlO$ <.'Orttrolad01U. 540541. 541{ Nu lu>tmu,, prnttma,, tunnontli. 759 Nu hnn•lift~. n:n•ml)IIYolm.. v•ru~ cun rq~hc.aaón dc-fenuosa. S58. S58[ No homóloaos. unt6n dr utrrmos tNUE.Jl. ~86 No 1drnulicadu. anarco de- kctura (Uilf), 12 Nu mduobln. mutant.-s. lOI! No mrndtltona, htr.:ncaa. nu1rrna. 67·68. 69{ No pmduoavll. r«'ltrunur•oon, 581· 584 Nu rc-nprnca. rra>mbtnactón. 99-100, 100/ Nn rrptllUVc>, DNA, 61. 62{ No rcpllr•uva. triluposldon. 517-528. 528{ No lr~duc1da. rrRion (S' lrrR), 136 Nn tran'l< ntm. arnr>. nudensomas, 777-778. 771Jf Nu uan>critu, N Jiat.íador deflnldón, 11 l. 11-t/ Islote-> Uam. 114, 114[ lmtglllld, ••ria111lllr5. 114·11 S, 114{ I<'JH:ttt.IUII~\ UIIC104\. 114 No vírica su¡~rlamiUa. 56l(. 563 ~opa lana pl~smados, 402, 40 1. 403{ Not~phlhiJ/mu> nndn«>U. 113, l l l/. 11 41, 742 Ntl1.:. 631 Nudcaoon tidicas. 6 7{ lubndaoon. dp.lrnmirntn dr b.Jsn. 12·14, llf 14(

Índice alfabético

881

Nudciu». aldc. ddlnidón. 730 gcnoma baetcnal, 734-735. 734/ Nudcmdn hijos. r«ond~n...,ción. MuklJ. 418, 41 8( Nudt'\>l•r. •iumlnancia. 834 il""· 764-765. 765/ cnlar.ldor, 762, 76 3 longitud, 761-762.761/ longuud. rrducoonrs. 762, 762{ nudeo, 16l o'l(anizactón escalonada. 761-762, 761( periodtddad. 766-767, 766/ \'dOaCIOileS de superficie, 76)·766, 764/. 765{ en ... mblaje Jldl11 reproducción de uomallna. 771-774, 771/-771/ estado ntabk. 798 ntru,;ura 762-763, 162{. 76Jf genes. no lramcritt><. 777-778, 716J uan,crttos. 777-778, 778{ h1stonas «lllralcs, 7W-760. 760{. 762·763 dol>le shncrna. 768, 768/ 111.770 H2A· H28. dimcro. 767, 767/ 11). 767 1132·11·12. tetramrro. 767-766. 767{. 168( 114 767 nuclcares. 767-769, 767{·769{ ooamnn, lonnanón. 767-769. 767{-769{ libc.-radón dcla cromAuna 759, 759[ 761 morfolosfa. 760, 760( Nfl. umon, 802, 802} orga nltan dr la cromallna. 799, 799/ lrantcripdón, cambiOS r~ladonad.,., 779-781. 780/ poskionaml.-nto o a¡ustc d.- 1~5C'. 774-777. 715f-

n7f ~ucumknto indiftao ck

un r111rrmo. 775 r11rirwro, n6 lntnn-eco. 776 rntacional. 777. 177{ uaducnonol. 776-777, 777{ rren>amblajr. ractorM aux1liares. 781. 781/ tamatio fr.,nt~ a tama1io dc polimrr.aw dc RNA. 778. 179{ uniún TBP. 610-611 Nudróudo.. 6 rrparan(ln ¡x>r nclsión dr. ~00/ )0 l. SOlf Nudos dr ONA. 480, 481 Nula, mulae1ón. 16-27. 11( nut.
o O. antígeno tanúgcno HJ. 28 O. protclua. a<1ivaclón del OriN. 206. 10'1 OCT. cll-mcnto. 618 Oct-1. 629 Oct-2. 629

882

Índice alfabético

0<1npin•. plásm1dos. 402. 403. 403/. 406 Okazakl. fra~mrmo< dr6ntclóu. 4l S n. H 1 441/. 446 ll¡¡arnicnlo. h~aw de DNA. 4-11 444. 4461 SiniC'SU

<ehamiento. 443. 4451 dr.pfauumcnlo dd crhador dr RNA. 44 3. 4-45{ 446{ cxtcm1ón, 4-43, 445/ ligadura de hrndldura. 44 l. 44~/ llenado de e>pados. 44 3. 44 SJ pollmrrau central y disociación dr la pinu b, «l. 4-41/ rc:mod•ln dr RNA. 4-4 3, 4-4 5/ Oli¡¡onuci~ido C,. 712. 112[ ro. ~n. como d~ pu;~la rotura dr doble adcna. 715-716,715/ Onmscnrm, 558 Onn 1rudon dr lrrmmadón UGAJ, 111 Optradorcs cnntaoos químicos. l 14. 314/ ddimdón. 301 mu1adonr<. 108, 314. 314/ Jlalindromo. 362. l62{ prornotorc-. 320, JlOf SitiOS Jr Ullli>O C()n ef rrprc>ór. )(>.4, 365{ uníun C'OOJ)tfdli'Y.t t'On lo( d•m~ro' rC'prc~'lrc~. )64, ~6~{ u:mün ttm rl rcprnor comprtrnda ron sitios dc baJa aftnldad. J 17H9. ll8f rcaccfonc•. 313-314. 313{. 314/ Opcrón. lOO- J lO. VlaJt rambthl Opr.,dorrs amtrolr.. U3-324 dcflnlcmn. 104 lac. 30-1, 304} 0pillo)5, 401 ORC. VIliconun. sc~stro postc.-rior \112{. )8 1 38l

«lección duramt la fa.e S. 383 oril. rtamón Jt mrriaddn. 4 51 on7. 400 Ory.a sar..-a. gc.-noma. 80 Ovocito, sistc.-ma. para caraoc.-rizadón del promotor. 61 3 OJUdauvo, daño. rc:paractón. 508. 508/ emn.HI .uys. rx¡m.-s1ón. H 1 - 342. 342{ OxyS. RNArn, Hl H2

p P box. 491

P. elenu."ntm. a<11Ya<1•\n cn la llnca gcrminal. S45·H6. 545{ 546/ cnrtr y empalme. 545. 545/ dcllni1110 ollnc\nuatógcnO'I), 602, 602{ PAP li'ollmcrua dC" Poli(A) I, 139, 141. 696, 696[ Papa. v!rutdc drltuhcnulo ahusado de la tPSTV). 19-20. 20[ Par•da de tran$fcrcnC"ñaJ. 228-229, 229{ Panltul•• ~hnilarn • vinu tVl.PI. grnerac16n JXlt los dcnocnws 'fl·. 560-~61. 561/ f'a1 (SIIIO de 1'11\0illhlajc). ·151 Pató¡;rnos. patronc' rnolcnll•rts aso
~ptidilo

RNAt unido a un srupo, l ~4. 211 trandcra~ de lormadón dc c.-nla.-es prptídlcos. 168-169, 168/ inhibición por e<pan<>midna.. 178 RNAr 2lS, 182-183, 183{ Pequeños RNA oW¡IJá,mi<m IS. 684 ¡¡cneraaón del ntr<mo ) ' dcl RNAm dr las hls1onas. 697. 697/ Ul cstrunes. 26 P<"roxirus. 24 S Prroxisomas. 245-246 Prruxisómiu. srruln dc a"¡¡n.aclón (PTSI, l46 Pc.'roxlsómkos. rrttptOR.''- 246, l46f PEV (varieg.odón por cii.'Cio dc posidón ), 820821.821/ P(.RP. 603 PUO, slstc.-ma. 80 1 PH04. actlvador. 801 PHOS. promotor, 801 Plcomavirus. inlccdún. elementos !RES. 164 Plbna. 399 PiiUJ, 399 Plnu. CII'JadorarKión por rccomhlnactón, H0-511. HOf mvcrsión. )06 mrtiladón. 50 l. 50 3f modiflcadón rn RNAI. 195. 195/ Ptrrolisina. insrrdón cn codón UAG. 199 PKR. dsRNA, anr1 V/au Contruladort'S, clernrmos virus multlpanllos. 7H Plismldo CoiEI, Jlstema ck rompalibllldld. 422424, 422{ 42 3f Pl~sntidos

hactrri•s. 351- n2. 351/ copias múltiples. 193. 419 dcllolctón. 120. JH, 393 cpisoma•. ~9 3 scnomas. rccomhinadón, 416, 416/ gropos dc romp.1tíbilidad. 421 . 4ll/ incomparibdidad. 421. 421/ ""-'tienda oriC de.- F colr. 4-48

sr¡¡rq¡adón. conlrul. 419-420, 419/. 420/ sistemas d~ adlcrtón. 420, 421/ una sola copia, 393, 419-420. 419/ 420{ Plcctontntica l't.'lactón. 472 Prr"'"'O('()aWS tipo R. tr•nsfonnadón a tipo S. 3-4,4/ PNPUil ~n dqradldón d~l RNAm bKtrrlano, 141 Pt~l atr>rimasa. 444 ~"''· gc.n. homnlo¡¡ta, 563. 561{ Polandad, factor rho. 28~-290 ¡><•h(A\. )ltmdna de umón a l (PfiBPI. 139-140. 143,165,696 poll(A) (áado polladenOiC()J 137, 137/ l'oh(A¡ +, 139- 140, 140/ Poliadenlladón. degrada ció n dd RIIIAm baC1triano bao~na l. 14 1 ~n~r~oón drl utr~mo V dcf RNA mrn~oajcro, 695-697, 695{. 69tof PoliadeniiKO, 'ado lpoU(A j). 137, l ~1f l'ohClslrómt"O, RNAm rq¡toncs mtc.-rastrónkls, 136. 137/ l'olimcrasa. dc poh(A I (PAPI. 139, 141. 696. 696/ protdnas acc~S()nd~. 447 l'ohmorfi<mo tk lnn~hud de ltaMilllldo. 57 Polinucieótido. cto.asa. rn d ro"c.- v cmpalmr del RNAt. 692, 692{ Polinuclc6udos. r\tnlnura dr la cadena. to. 7 , 7{ Poli~>vtrus, inlrcclón. 16 3 PoUprote.ina.s. codlHcactón g~nlca rt'(f()vfrla. 552-553. 553/ Pobwmas tpollrrlbosonwsl. 1H -114. 114/ Polht!nic<x, croi'JKISOmaS. 742-70, 743{. 7 4-4/ Pollo. asrupamlcnto dc genes d< J. aloblna a del. 631 Polyt"Omb, pmccinas dd arupo. rt'presión, 824· 826.825/ Posicional. inlormlci<~n. H Pr>\lllva. <-.dcna, DNA. 554·5~5. 555/ Positivas. cadcnas. 718·719 Po smtcndadorn. 629-616 activación del promo1or mdcpendientc de la lO<"alización !>29. 629/ actividad aouadón c.-n m. b)J factores lim itan•~. 632 in49 frcntc.- a promotores, 630, 631 transcripción. control. 611-612. 612/ especifíddad. 6 30 Potrnclosoma, 630 pQ. 294-295 Pradc.-r-Willi. síndrome. 834 PRE ¡c.-lcmc.-nw de.- rr-.pucWt a Polyromb). 815

P.,. promotor. unión a la pollmerna dr RNA. 368. 368/ Prccebamic.-mo. 4-48-449, 448/ Prerua. csdstón. 529 Pretnic:Ydón. complej(l. 618 Preprotdna, 22 3 Prc-RNAm dcfinrclón. 669 con< y empalme. intronrs dc.-lsrupo l. 683. 6114 pr~cnto. 34. 34{ Pr
polimrrasas dc DNA, 4)0, 411/ producción RN'Ar. 698-699 rrplicadón. 377, }93 Proccsados. seud<>11cncs. 109, 565. S65/. 566 Produn1va. =~•ructuradón. '83-584. 583[ Pro!ago. dclin rción. 3~0. 483 tnduroón. Hl. 360. 514-515 PrOjcnltoras. cadenas. cn tc¡>hcadón dcl DNA. 8 -9. 9f Proararudo. cambio. drl marco dc leaura.. :U 1· 214 Prollfe.radón. antl~no nudur dr células m tPCNA ), 771 Promotores, 609-629. Vlotm! lambrlrr promotorrs cspedficos oct!vactón. por pr omotor, lndepeodl~nlc.- de.- la lonllz~ctón. 629, 6 29{ ~rirs de.- cvrniQS, 809-81 O. 81 0/ t>. klobulina. e lementos dt secutnoa cona. 627628, 627{ brpantta. pohmrra~ dc RNA l. 614-615. 615/ <aractcrvaaó n . métodm. dc •náhsls. 613-614. 614[ componcntcs sc.-cu
lndice alfabético

883

l'romotom flujo to»rrl 1 dtKmd~nu~

p.ua polim~nw d~ RN'A IU

61~·616,

616/ a 1•mcndador..•. 610. 6)1 R•n d .. m~t~lollondna. ttSU. MO/ tnici8l10n dt transcrlpaon. 102, lH·l~4. 1~4( fr~nt~

uHrrruh 61h

isloles CpG romo dianas I'C8UiadurAJ. 6 H -635. 6Hf m.ul.!lrión del DNA. M2 modulo amKa. 801·802, 801/ pollll ~trli<1Ura. 616. 616/ !.actor dt a\lgnan<>n. 6ltt 618.6171 lnt~mo upo 1. 617. 617( tnt~mo tlJIO 2. 617. 617/ J>nlimrra"' d~ RNA t. 61 t pohmtra\a
'"'"' d~ uniÓn CRP. 123 }>n.1fil1dad. 610 l'rOirína-protcin.a. lnt..rl«iones, an.ílis1s dr dos hlbridus, 64~-646. 646( PrutCIIloilil.~t"K, a~nlt!J

l.n(C'(dOSOS VtMt Pnunt•'

Proi~JIIa<,

•intr>ls. 1 ~ t • 18 ~ l1,1o~n~. 134-115. 1 H/ t udones dr- trrmm..tdón, r«onucimirn•u pur ·~ct r..- llflllttniros. 172·174. 1nt. 174/ don(IAoun. 1 H·l ~S .JJ(Ua ron rea«:ciun de transfr-rr"rtn.J drl J>CI•tidilo. 174 174{ eta""'· tn ~lung~ciún. l SS, 155/ uuoanón. l S~. 155{

.

t~rmtndo.om.t. 170·172. 171/ lnl•tlttOOII .-.u~plornictna, 21 0·211 k•"•K•m•n. meontsmus dr <'OIIIrul. 1~6. 1S6/ pr<>t~tna• d~ unibn al o:;n•. 179 nhosomicas. 114 115. Jl5f conlonnaoon. 175-176 t•nwñu de 1.1< 'ut>unt~•drs. 152·1 B. 15 lf nbcJsomas hbrn. 222. 222/ RNA. 128·129, 128/ RNAr I6S..Iuno<m. 17CJ-182, 180/. 181{ tasas de rrror, 1 ~6. 1 ~6{ tt·nmnanún. 151·1 55 agua rn rr..món d~ translr~,d dd ¡>epudlh>. 174, 174/ f.tt1nrrs dr hNraoón. 174. 174f. 175{ uhocdn<>n<". 220. 220/ l'roteinas. Yí'41<.' tamb1i11 prmdn•~ rs¡>edficas a«cwrtJs rn ensamblt del nudcusoma, 770 .u.llvitL!d
884

Índice alfabético

•gr~~aoon, ch•prron~. 224 an.ih"' dr tnleracctonrs ..n ""re. 112 an~rniajr en DNA rucannlico, 736· 737, 737/ a u lO rnsamhl.d¡e. 2.H. 224 bo~íntrs1s Vt.tu- l'rol rfn~•. slrílc'" umbur. mutaliun&alt·s.•uumuladón. 104 neutral<'>. 104 utu>ohcas. 220, 220( codificación por el ONA. I.Z colinralidad con d ~~" l2· H, Hf mnr y rmp¡lm~. 7l4·725. 724/. 72~/ dro<"· M2·1>H d~gradaunn, 215 dnnaturalludas. thapcronr•. 224 dtvcrt~rnt1a, 1()4 rsprntla~d. untc•n rrprnor/op.. radnr. l17· 1111, Hllf frn..lJc-nl'l.l:. numt:ro de:- cudonC"!Io por cad.a i111ll11Cl. transponr a lravb d .. la mrmbran• hidrófoba. 241 homornulrlmt"ro. l.ct insc-rann rn 1.1 mtmbran.J. 217. 217/. H11·240. H?/ luuhz.K1Clll, 21K·251 rr~tinnr~ hidrófohas. HS·2)ó. llS/. 216/ \rlUt'l1liJ\ dr aml.d¡t, H6·H8. 217{. H8/ '~nal dr parada d~ lrdt"lcrcnua. H6·2l7 multtlundunalr<. COO n. 716·717. 716f mulumtriU\. 109-310, UOf 111> homúl
2 )6/ SC'lU~ncias d~

andaje. 2ll• 218, l37f 238{

p.l'" .¡ trav~ de- lA m~mllr•na. \.'t.ut Jllrllalllirllln rhaprron~•. 221·221, 22l(. 224{ ¡•lel"'mirnto ~rrón~n. 224 mtrma H\p70, 226·221 r~giunrs h•drófobd.s. 2H·224. 22~/ rc)lut.dur.n. V/JU Rr)luladorn

amtno.indns, lO co mili u,, 104 tt'"rmmalt·\ N. tran~l~l<"an(m, .223 \Í11tl"ti\

tamañn t"n rucar1ota1o. 80 IIJlO l. par~da drl~ uamfrr.,ncia, 217, 2l1J IIJIO 11. wru~ndas rombmad•• srtial·an
241'>/ uniún al rtprr'<>r, rrprnnrrs. 64K·64'). M9J Jldr.imr~ws. 317 _. 'hUJS dt t.OnlroJ dt" dlhhU l4Kl ('11 OJ, llll). J~f

Proldnl,n, c.omplf'jo. un1ón con d tc-nuómt"tu. 748. 74t./ Prntt"tniC.'IH, ti.C1orn. r~Con()(Umenlt• eJe nMJnnt"' drlerminauón IH·I74,17l/ 174/

l'rotf'om• d~Hninón.

56 81·82 humatu> en <.ump.u.u.iun ron do>~rilnllinn.

~• dt

deJnt"mo. para corlc y crnpahn<e <.Id ltNAt, (>91-692. r,9Jf l'rnvtnl\. ~51-~52. 556. 557 l'rP.20

otros

~spunta

PRP, proteínas. en ""rumlu •nKNP. I>K 1 PRP2l. 111!1 Prl"'. proltln.J, 20. 839·840. 819( PrP", 20 PRTP (lo
rrrt"ilva.. 27! rr•rm.. ntn, 16. 17/ r~munaoón l"~malur•. 172 lcnnuttl(.1Ófl. prrvención. 181t 1rans1nunn. 1~-16, 16/

lr•nsvC'r\tún.

1'S

P1.J1omidna. 1nh1hil'lt.lrl dr \UllC''I-1\ prmtinic-a. 1118·11>9 169(

lnm unltari.ll innatA. 604

wudt>¡l~tln,

Rcguladnr ~.. n. 102. lOlf ltNA. Hl-347

t.6

w. gene•. o; 11 muaanunes. 470 lt~•A

pmtdna ac._1•v.uton

d.u.io del DNA.

~~"'"· 8 )'1-1140 8 )9{

~ll-514

divosión de la 1•rntcin• r~prl"SOI'a. 51~ ~div•dual. 471·473. 472/. 4H} ntla, Sil, 512 RnBC:. nna. 511, 512 Rt•(8l D. •!>tema. 470. 471. 471/ Rr< F. ruta. ~JI Rrdpnx.•. recombm.1dón. rntrt" r~I'K"'lluunr'\ dirrou. 529. H9f rntrr r~prtidonn mv~n•d•'- 52CJ. 5291 R<·wdili. 211·212,212! Rrwmhonanón. 28· lO, 29} ••t.lli•ls ¡>or enzimas ba<.1rria1w, 47}·474, 4741 d~flnM.ión, 24 rktia. 4S9, 556. ~S6/ rn~mbla¡e de lnmuno¡!lol•ultna•. dt •·adenu ¡>e.ad... 579-580, S79f t•ntrr alrlo\. 475 ··•prófica dr slóo o rsrruah/atl.l. 4112 ·497 tkflnt
ullrgranún. 467-481\ h>IS<>mcr~s. 484-486,

.a.v.

48~/

Q Q, ha't'~ ntudlh
R

sr~ul"rltla\

Protdrw,,

Prolubtranoa~hdtu·~prcnullt-ranci.J.

Q
TrcJil\ltK..Jf1()fl

'inlt"S.io\. Vlast

"'11."""''"· !18-89. 88( mtt
r. prutrtna\. l '\ l R. "''!lll..IIIU,, 5\4. 5S4/ RA(J, gn. 4ól, 461{ R.tmilludón, slllo m el conr y nn.,.lmr del ltNA, 674 Rapl. amoadon c..le fonnaunn c..lt' hC'It"tuc.:rnmatma. 82l.~Hf

RAI'l, I•d•. mut~ntn dr dctcncíon. 429 Rattm '!'a). glohuhn.J. grn. 109 u-mmm<'n-... I>NA s;,trlil~. 119. 119{ UNA. 118. 118/ SittUt~. ruanos d~ rrJ1<1k.1<'"n. llO·Ill, 121/ r~¡>etidonr> Jerárquicas. 120-12), 121/-123/ gen nmátka>. dl~r..ld•d inmunitaria, 5~·Wl. 591/ rrJilOII<" MUC. 600. 600/

~vuluot\n,

99· 1OO. \ICJI, 100/ rxtcnslún d.-1 ldónwrn. ?S2·7B. 752/ !nnMd2.f I<M.ab:~.mon. 459·460. 460{ tmdadón. a.imilación ck udrn.J mdivldual. 4 71 lnteralrllra. conversl<'•n Kéni<"~. 4n·476. 475/ n<> rt<ÍJ>mc•. '19-1 OO. 100/ n·nJll<>euoonñ ln~rnula>. 529. 52Yf rr¡wr•nnn dr horqmlla~ dr tl'plicación var.~' ~~2. 452( r<•¡wra<1on por, ~00/. 501 n•qurri.Jmt•ntos. roturas dr dttblr- ..~adcna. 41.7 !oellhuhna\, H7, n8f. S7'1 \i\tC"rn111 mmunitilrío....,,v.llón c.Jf-1 pmmutor del ~··n V 5111>. Sllh( ')Olll.dliLl de lmnunugltJhulln.,, ~76- 'i77 lllttr.

(UUII~uanon .

4'i9

vmca 558, 5511/ VlfUS tic RNA. 459 Rr(cunlnn.Jmr. unión. 4bl Rrwmhtn.J"''· rrroml>lnadón ~s¡>edlka dr s111o. 4111·48} R.,nm<'l<'lmlmto. hrlicr de. l6l Rtdundanu• 91 Rcc\lrunuractón produüova, 5111· 5114. 581f Rl:~. prmctna<, rcla.;6n mn un iont'> dt rmpalnt~. 682·683 1>113{ Re!!Jun cun,tamc ¡n·g•ún () dr inmunoglol>ullna. 575-576. 576/

hall~n.m•• o sRNA. 341· )42. ~4lf apar<'amienm mmpl.,memarto d~ haSt"S, 132. H2f lnrm.aclón dr rqión dúplr• m ri RNA .Ji• na. H9· J40, J40f t.unhau' u)nfonn•nnnaln. 1l«J-140. \40) tcona,, wchH<.loún por locus MAr. 490-492. 490{ 491 ( Reguladtllcs hlnqun1 <.••unl.:l, l24, 314/ drlimnon. l~4 dnnum<><. h. famn olr tran><Tiplilqu~. H . H{ Rcc.•rnpLJlu, \ÍttO~ ddintmln 1114·10~ diVUJI~IlCl~. 105-IOf>. lll~/ lOl>f lttUidC.l\Jnt.-s, 105 Rrn.11urall¡aoún drl ONA. 1 ), t l/ Rcnviru'. "-'Jimrmns dr RNA. 7H RtJ>ar•uon. "''~m"' dr. 'lOO·~ 1~ (~lul••~uuritíticas. 514·51~. 515/ daftn dd I>NA. 502· SOl. 501/ 503{ Jlarr' dr b.J.cs ~rrón<'<~. 18-19 Rrc,o., alllvan de ha~ invr.--tlÍn <~rr¡>lka<1Únrn F cc/t 510·511. 511/ rntura dr manufcro<, ~04 · ~5. 505{ d1mrr<» dt umidlna. ~ 1"· 516( fJ<Jtm,hlllo~h. ~0\· ~04. ~O 1{ ~04/ rula' de rrparaot>n l'l" rcplllaaun. 511· 51 l. ~12{. Sllf \U\Ct"pttblc- .1 rrror.:-s. ~07 ti¡lO\, ~00· SO l. 500( tranellttün tcrmiNIIarga !LTR1. 555 R~prUC\Oitf">. 98-116 d1rct.1as dchmnun 524 ~currad,,. 1'"' in«-rnon. ~21. 521{ rctotnhln.aCIÓn U'CtJlfONA. 61·61. 117 lt<'lllicaclón ._,.,N na. 40'1·42 5 bKI~rcwonal. 178·380, J78f 379/ ndo t>ao~rwnn. lormarínn drl ..,.o, 411·412. 411 /4121 Col E 1 DNA modacíon por creaaón del ccbadnr, 4l2·4l\, 422{ 423{ umcrnl. cnp•.u múluplts, 377 una •ola
1•nhrneraws de DNA, 4l0·4H HOf. 431/ scrn•di'<'nnunua. 434·415. 415/ rr\, drfintnón, SOl. 502/ sl\lrm"' de rrparadón. S 11-S ll, 512/. 51 3f fa~o n. 445·448. 447/ fiddod.lci. 1drnufic.cion de pwtctna. por ~~tnts mutadou·'· 507 formu. ettadón en el ori¡¡tn. 443-4~0. 448/.

449! frente a la <WI
c-sum.uicln.

\S l

v.Jr~da~

daño drlllNII. H 1·452, 4~2f dr,.-n...,mbla¡.,. complrjn llls-trr. 452·4H. 453( rU<11vao6n, 452-4H. 4H/ 1'1."Jldtanun J'K.lr rr.. umt-.maoón, 45l. 452{ ruta.. dr rrparanon 1"" rrpllcaaon. 511· sn. 512{. snr ltr, ~lrm~ntos, 452-453. 4Hf UliOIWCÍbn. )77

rnanuf~r
tmhrc.•n.1on.Jirs frC"Iltt" .1 unuJirC'(lÍonaks. 178· )79, )78/ d<'ilntl1ClD, 378. )18( m~dldtm d(llamañu dtl rrplkón. l8l. 38V rrpUwn nrrul•r. 379. }79/ <>nt!"nts. aiSlanu~mu .. n lt'V•dur••· 184·385 prmrtnas ..,..noalrs. 451 rrtnll10 (lrtOIOSOIOd, 451·4H, 452(, 4Hf St'mldU.c•.(UitliiUd , 442 llllid•n·eólkt,. notln. \114 'Offiol' ~U('artOlll'<>'> )K 1 184. }83{ 381/ drtint~,.-.n, )77 C"'t:tranomosorntcos. \92--t07 incuonp.allbthdad de pl.htnidt,_, 421.421/ hnt•afr,, cxtrrmo 5'. 393-194. 394/ ln:ntr a ttJ!Iit'\>nn drrularn. 378·179, 171l/ orígenes, l77 autorrad1ogralla. }lo(), l80f ckowft>rt"'ti~. 1711-)80. ~79{. 380/ rrromt>mae~on humólog.l. S l l tamatio, \81, 183/ rrnmn•" l77 Rrplisoma. 429, 447 RCJlfl"'j.1'UI

ausrnda de h¡¡.mdos. re('rfltoro de .,.t.. roidn. 6S8. 6S8( ddiniooo. l06 doblttn CpG mnilados. 6)5 prot.,inas del grupo Polycomb. lll4·t.26. 825/ tran~crip<.ión por dtsatttll.adon dr histon.u, 808,1108{ unlon. reprl'Yir a rná) d~ un oprr•dor, 315· 316 rrpr.,sor·oprrador, 317·1111, H8(

Índice alfabético

885

R..prnorcs ai\~mlcnto.

111 casad. linea del f~'o ).. )SQ. 160 CilSlitutiva, 109, 110/ drHolclón. )O) drsacrtllasas M 111\tonas. 80~. 803/ dim1 •362. }61/ Rt'nu. l 14, J 1Sf monumcros donunlos. 110.111. l 10/ ntructur~ 111, lllf ntUUIOOnes, 109, )fl•JI}, )1)/ ck roturo! positivo. }65· l66, 166{ núcleo tctram~nro dlmcrt>< 311. Jllf, 112{ nwnornerns 311. Jllf muranoncs, 111 . 311{ rrqu crlommro de• rrprcslctn, 11 O opcronl"'· 107·108. 307{ 0,2 lmera<'dón mn Id Jl(lllntrra~t de R.NA en P,~. 165·366, l~/ p.lMtdc'>n t•n d DNA. 317 proteínas. hom~omtnro. 660 de umón ron el prnmnlr>r, Mll-f\49, M9/ •<'l!uladorc> lt'>~· )66, )6~/ smtrSlS. )68 J68( prcvcnoon por el 11m m>. l71 ruta h"'ll•nl
P"''"""·

JI"

unión ~ la pollrnt'I'HI de RHA, l 16 de dtS<XUiaó n. J 14 Rrrrrpliadón rucarióllca. control por rl laom dtrompetrncia, l85·l86. l86/. 187/ m mio ISJtto de resolooónt. 5JS Rnbal.ldizas,
886

Índice alfabético

dcHnición, 46), H2 unión Holliday. 46l, •64/ SIDO (sitio rtfj, 5JS R~)lva.,..,

dcfimaun. 527. SU tr•nsposloón ck TilA. B··H6. SHf uniunn Kollld.y, 471·•7•. 47•1 Respuesta. elemrntos dch mci(m. 64 l r>tcruldel. mita de• dr •ltln. M7, t'>S7f gen de melakllinnrina, 6~0. b~Of p.~llndromtro<. , ,, 651{ rccunudmh:n10 utl•adt>rc~. 649 651 I>~Of cspccttictdad. 6511, 6581 ~or"' ck <'itenllSA. M11 M8f unión, aolvacll\n pnr la unlon de naando•. 656. 656( Restr1món rndonudc•w• de, dtvl\lón del ONA. 39·•0. 40( rrwmas. en sUJO< mcllladoo. 6U·61 l . 612/ mapas de apu¡Nmlmt,. dt- srncs en úndtm, 112·11 1. lllf construmón 56· S7 ckftnlción. 40, 40/ DNAc frente al DNA JICnÓmlcn, 40, 41{ pollmorflsm.,. dr slltns ck. ~. ~8f R«•truouraOón a¡¡ropamaento> de gen<'' ror entre< ruunuemo dc\IKUdl. 1lW 112. 11 0{ 111/ gen. 45Y Rcric uloendorl'!tJI, \1\tt•ma. 220 Retlnulco, Addo. 6~4 . 6~4/ RetraYd~. cadrna . roordlna
defimdon. ~~1 Dr.JfbPirr/4 tlttfmt~ttr, 561 · ~62. 561/ eltm~nros Ty rn l~aduras. HY· S61 , "9f· S61f LTR ron. 56l pi.Jntas. SI>) transcripcas.ts lnvcrs.u. 561. ~, l/ R~trorranskxaoull . YiiUt lnvcr\ot. lran-lcKa·SS7, ~57{ .fd!J, rodón de trrrnlnat1ón, SS2·SSl gemación. 5Sl. 55 lf gm. !J•l!J, tlcmcntcll Ty. 559, SW{ p.~/. ci<-mrnto" Ty. ~59. H9f genrs. codofkaclon dr poUpru~rfnu 552. 551/ genoma h umano. 5ó 1 56-4 56-4( gcnomas RNA. 555·556 marro~ lectura fl"/. ~~2 - SH rffOmbinadón ror .tn·oon de mpoa. 5St'>. H6f rctropn
558/ tn~nsfonnanln

con clcfcoos de rcpllodón.. 558, 558{ traruposloón d~~~tndirnt< de RNA. 551 virus ck cackna po4

Rcvnsión ck segundo sitio, ck una mutación. 17 RF. VillY Ubtnck>n. faoorn ck cRfl RP. . .n. mutaciones. 174 Rfl. 17l Rf2. 17) RP3. 173 Rf·C. 445 RPLP. VI= Pollmorfl\lno de longitud de fragmentO\ d< re>tricdón f RA.Pt Ri, pl.ísntidCl<, 402 Ribointrrruptor. 340. 141{. 714 715, 714{ Ribonudcasa H rn la degr..tladbn d~l RNAm h.1<1Criolnt), 141 Rtboouclrasa P IRNA•sa Pt. 707. 71R Ribnnurleaw> CRNAa\ol~j . 1O RtbonuI'RJ, 172 Rtbo\(>m.t. dctrnutm, l lf> sttiu ~unión con rl. 157. 157{ Rtbosomu ~ruvtdadcs catalítt
505. 176. 176/ mnnton"- 176-177. 177{ faao rn dr tniO.tCión. 157· 1sa. 157/. 1se¡ [ocmadón dr mlaccs ptpddlcm. 1s•-1 S5. 154(. 15~/. 175 srandr<. 1 n . 1 iniciaáón súnnis de- proteínas. 157· 158, 157(. 158f prqucllil, 11), 1 Hf RHAr. 175-177. 176{ 70S. 176·177. 176/. 178( tamaño. IS2·1H. ISlf lOS. 176. 176{

nr

tr~dumon.

ckl RI\Am lll·l H . 113/ \lti<> dc miclaeion. IJ6·1 )7 rranslocadrln. actlvacton. 172 modelo ckl estado tul>rido, 169-170. 170/. 178 unlc>n, l>loquro t'C11UJ.tdnr. ll4. 324{ la<1ure. tlr c-long~oón. 170·172. 171{ >doc.i dad dr ,rcJimt'ntanón, 1H · 1)) Rtbct\~ntrstS. rc~u1acum autÓj:rna 325-326. l2Sf. 126/ RtlKl\mntwtat fauor d• rendaje tRRfl. 174. 175/ RNA (RNAr. aJ)olrumlrnl(l de bases ron •1 RNAm en \llllr,l> de ¡mllrina\ nHciadón. 16 1·11>2, 161}. 162{ wnlormatic\n '"'truoural. 178 dcllruelt>n, H 16~

urutn"" conlormacionalcs en la \tntC\1< pmtdníu. 1111. 161{ C\troctura <.riitalioa 211 u1rcmo 3', 180 prcd\lón ele la tr1ducción. 210·211 rnnsamltnto. pequeñas mok!cuJ.s de RN A. 699·700. 699{. 700/ producdón. evtnt dlv1sión. 719, 719f MI''. fnldMión ck Lt c~lállsis. 719·720. 720{ dcllmnun, 707 reacd onrsldn~. b1oc¡uctl de la uanscrlpoón por la pctllmcraw dr RNA ha<1rnan•. 266 RIS( (compleJo !Ir (lltncl.lrnlcnto lndund<J por RNAt. lH RNA •• tivadad tdlahtlca Vlast rambtar Ribrmmas RNAa"' P. 71!1 •hlo de unión. A ~ auanoslna. 711·7 1l. 7111· 71){ '~'" el•ustrato. 711·713. 111{· 11 Jf aparcamtento dr ha>n, formadún ~~ dúpk.ll. 12· 1l. U/ uuur. 6 ambto tonformanonal con J. unsón dd \U\tralo. 712. 112{ carnl>tO\ 'ttucntiales. 105 cápslck víri
'"n

deflntdon. ) dclblr ~JdC'na td~RNAI . degradadun de RNAm. l·U·l4S. J44(. l·H/ ~drdón

"""'' md1vodualr< 720·721. 720/. 711/ defimuím. 707 mnorondrtu d., tn¡.am.,...ma. 721·122. 1221 RNA xura. 722· 724. 72Jf 724( tSttU<1Ura, rn el ••~nuatlor H7. H7f ck 1\orqulll.l. atrnuaclón. JH. Hlf lurtdlm<'\, 128. 128/ grne> •odllkadort'5. en muorondna•. 70, 70{ ~en~radóu del c~m·tno 3', 6Y4. 694{. 700 ~u!a. 722· 724. 7231. 7241 1, r~pllt.:adón de Collll, 42Z-424. 422{. 42!{ L· l9, 712. 112/ lfcler ctnpalmado. rcacdón de mrte y nnpalmt ITI/U, 689·690, 689{ lljasa. 690. 71l. 71 l/ muliloones lnmntpaubo1id.d de pl.imúdos. 421·424. nuclec>lar lltQUC'ilo. 699· 700. 699{ prt)('Csamtenlo, ctll, 624·625, 625{ upmlón t~mprana de la cadena poada. 5116·5117. 587/ rcaiOCI.idón. •n•U•b ó!Xtiro. 92·93. 9lf ITIIÓn rica en G·C, 694 rct~ulador• .ontrul dt-1 sbtema de rompattbdidad ColEI. 422·4l4. 422{ 42l/ rcpiKoA<1ón. d<>jlm.t centraL 10·11 , 11{

•nr

rctrnvtri•·~. ~~4. ~~4/

..ari'lur. VI~ Vlntst>idn (RNA sart'litcl ,cc·urndas de nudrOUdos. ucmr>. J8, l8f nttmnc>. 18. lSf 'llendamlcttto. RNA. mt<·rlcrenn•. 145 751. 564 56, >intc>i~. 258. VI•IIJit tam/11br Transcripción l>url>u¡a de transcr1pcton. n9-260. 259{. 260( rollmtrasas de RNA. 10 prurnnlu. 128·129. 1281 tipos. l'IJrttt MC'n>ajt'nl. RNA tRNAmt; Rthtlento • panu de scudosrM>. 109 U. '<'Jmntto. 6'1.¡ vucndr 19· 20. 20( v1ru<. 5 r....umbtnauón. 459 RNA. cune y rmpalm~ lllenwllvo. rcacdonrs, 46·47. 46/. 47{ u80/ cnmpiL"jo d~ untnn d¡o cxonrs. 682. 6821 romrot 670 conversión del compleJO 13 en el complejo A. 1>77·1179 drflnlción. 34. l4f. }8. 66Y ernpalmosoma. Ylaul3mpalmOO<Jma "Jl<'OIIC1dad de ltJidos. ausenóa. 672 rlapa\. 6711 expon•dón ele RNAm. 1182·681, 6821. 681{ lonnadón dr lazos. 680. 683-<>M. 684{ formación del. etJmplejo A. 677·679, 679{ eompk;o 81 . 679, 679[ mplrjo li. 677. 678[ 619/ 11rou·w de definiCIÓn. de aonrs. 678· 679. 678/ M lntrOOC$, 678-679. 678/ iruO.C.~ón por rlsnRHA U l . 676·678. 677/. 678(

I<J('•Iuo~cton 6 70. 6 70/ me14·67S wne y crn¡N>Imr. •hrmatlvo. 681·682 compunrmcs de •nRNA. 680 nuckar lrt'ntr a ¡rupo IL 685. 68Sf prt ·RHAm. etapa\. 673·674. 67lf fonnactón dr lazos. 671·1>74. 67Jf prcll"'--lllirntu. 6t.9·701 rta{aon rnrcmml~ c u lar, 688 rcaImc:. m. 688. 688{ rwu. 61!8-690, 688{ RNA•n. forrnactc\n del rmp.>lmosoma. 674· 676, 675{ ~ dr •p.1J'NfiiiC'nto. 680-681. 6M{. 681/ RNAI rndonudras.:t. !191 ·692, 691/. 692{ ela¡w de división, 692, 692{ ~ .... dt llJiol(ICln, 692, 692/ evoludón. C.91 ·692, 691/ k-vaduru, 690, 690/. 691{ l'l.'tpUaU. ~ clesplrpdas. 693, 69){ ruta. 67l. 6 72{ SiUmlOI•. tfpo<. 6 70 sitiOs. 670·671. 671/ tr.~mnterilladón, 674, 6741 Ulllnllt\, ó71·1>1l, ó72/ RNA. lntrrlrrcncla 4RNAII •n"hs1s SUiemillco de J.a nprnion sr!nlca. 144 definttton. 1·11 ~eneract(ln de siR NA. l•4. l-14{ 'tlc•nuMnfrntu ele RNA. )45 RNA. puhmerJ\a a<"tlvadón de la rtparadtln. 625·627. !>26/ alrnoa4'1<\n, ll1, H7f Bl~il/u; IU~tt/ir, 2A2 haorn.lna ca den u codlftc.doras. 266. 261>J c.1dcna• molde. 266. 266{ rstruaura. 262·2t'> l . 262{ •ubunidades. 211~·266, 266f cclul.ts en Mp~•ru~óón. 284 da'IC'S. 611 rompkJO h<>lotnnnláuro. 648. M8f Ulnfonruodón. 264-.165. 26Sf n 179· 781. 780{ Llurame 11 imctaoon camboo dr l~m.ario. 268·269. 269( romplejo. abk'rto. 268. 268[ tcntariu. 26R. 2to8/ fas~s. 274·275. l151 inldaclón abonlva, 268. 268{ llbtradón d~lla<1or o. 268·269. 268/ unión loenc. 2oíl <'tllltt'li\ ~ntral. 267 e1tructur~. 2~2 · 26~. 262{·265/. H7. H7/ factor (J, n4 wnuol de rs~~tdllcld.ld. 267. 261{ contrul d•l• untón al DNA. 211 · 272. 172{ Ubfracton. 2o8·21>9. 2614( \USIIIucton. rffOnOC\mtento elel¡>romotor. 211, 218[ factores de posk:lonamwnto, 6 19-620, 620{ úfiO 261· 262, 262/ ÚfiO T7. 261 · 262, 21>2/ funnon 10. 251 Jl('ne!. llS, llS( 1 611 promc>~or btpartna, <'>14·61 S, 615{ promotom. 61 1

n.

Índice alfabético

887

RNA.. pollmrriw. 1 {a>llt 1 tnmh~ción d..- la transcrip18·6111, 619( rr\l>lrntu a la rrntrut1uracwn. 6-17 transrnpdón, 624

tu. 611

, ""'"'· 781

promowrn en Uu¡o 4SCCndrntr )' dbc..-ndmtr. 615·616. 616{ trrmiii~L1un dr Lluan~JlCion. 694, 694/ tntdadon <.lt' la trln><Tipclón. 610 tntrracoon dr la htlkr 2. 165·166. l6t>( lrctura ..-n d orig..-n. ~e¡ 450 lrvadura\. 263, 263( ~para bllsqu..-da dt sitios d..- unkm, 270-271. 211/ prt>ttma d..- antnrrrntru~d<)n. 291-292, 291( punto>!> M rontoctu rn la unión al DNA.. 27~ 217. 275/. 276( r..-ronociml..-nto «1 promotor. wcu.-odas d..rorunliO, 272·2'74. 274{ rr¡>licactón rn ..-1 urrrm<> ~ ·. 1114 l'H/ rotura y r ...tauracton dr ..-nLun. 264. 264/ JitiO, activo, 261·264, 264/
.a.

81 O 1011111dón Cinn. 292 unlun, l l l llNA. 270, 270{. 275·277. 2n(. 276/ Llctorn auJtth,utS, 292-294. 291{. 294[ prumotor PKE. 1611. 168( t'l>ll pnmlOior, urutin rtoprnor- unl(m dd promutur, velocidad. 270·271. 270/ nrad.o. protctna MPD. 6H·626. 6l6f r..-lnictu. 269-270 IINA~s.J E. d<"l!radauon dd RNAm lt.~llrnann. 141, 141{ RNAas.J P (nbonord~aw P). 707. 713 RNA~.sas (nbonuclr•<·I\J. 10 RNAt ltobc RNA. illl~lltrrnu•IR..'IAI) RNAm. Vtwt MellSIJt'f(l, RNA (RNAm) drgrad.odón. m~s<>nUu> RNAsc (J>fi!urrin RNA ornpl.l;miwl. tJn RNAL YM.<< Tr~nsfrrTnu.l RNA (RNAI) RNAI,M95 gen. mutadoncs. 290·291 polaridad. 21111-290 sitio rut, 288-289, 289{ tntt11n~aón dr tramcripdón. 287. 288-291. 289{. 290{ d<' ONA

888

111 ""·'·

Índice alfabético

RodA. 412 Rodantc:>, orotk>J ¡¡..-ncraoun mulum~ros dr ca.kna individual, 387(. )91.· 197, 1%/ T-ONA. 40~-4()(). 40Sf prndt.K10'\, 187/. 196-197, 196/ rcpliatil\n dr los )l'rnotnas d..- k" lagos, 187(. 397-\98 vimidrs. 711-719 \'trUSta<1onal. Jlnamirnto, dtl DNA rn rl nud..-o"una. 777. 7771 Rlllura y rcunlon RAG. cat.Üt>l> dr la protrfna. ~84-~116 585(. 586( l'<'('l)mbina.ion humoiino>ctón, 29. 29/ s...cuenda' dr COnst"IUO, <'ll Rllkl, 2811·2119. J.89f Ruto dr JNirchr rono pan rcparadón por <'tdsión rn ··~lul.ts « mamlfrrm. SO,, SO~( largo p;o.ra rC'plraoón 1'"' r.osi<'m rn ctluLis de mamflrn". 50,, ~OV Ruv, sistrrm. rnolución <.lc la umón Hulllct.y. 472-471. 47l( RuvA. 471-474 RuvAB. compi<')O, 473-474, 474[ RuvB, 471-474 lU R. rr«plor trr«p~or dd 'ddo 9-
S s. faw.

311. 49 J. 774 ~ TtJIUnM. ~18. ~U(. 1>(1(1 s'~. Jlrott"ma, 271 _w,lhar&.'m).,t1 ,trn.'1ltllt n•mplr1os de rrmllllel~uun .tr La uum.atnta, 800.11001 cune) ..-mp;o.lme. del RNA. fo77 del RNA.t. 6110. 690/. b91/ DNA. anlrom..-nro. 746 '<'<'Urnóas wnas <'On.,.,rvadas. 747. 747/

grn"' •'K4, 8l4

rxune\, 4\, 44/ npr.-..odus. rnt'didcin. 94 94( rrparadón. SIS \lste!NI> llr YlgUIIlcta 144-14 5 ~rnom.. 79-110, 79/ mltoumdrl.al, 69 I">SI
.....st.

)8,,

a.

polnr~r•w

de RNA 1t 612. 611/ dr rrp.uaoón /o!S/1, 509 tipo

SAGA.. 807 SAGF (análbb ..-rial de 1• ...xpreslún scmca), 94 Satflnr. ONA .onnípodol, cortas rcpnldoMS idbttlcas. JI e¡. 120, 119/

..rntrom..-rrquias. 120-123. 121{-121[ ""llJ<'IICI.IllÚII, 120 Satthtcs. IINA. Vtatt Vtrusot<.lr• (RNA '>•lldilrl

.'>
S«. sistema. 247-249. 247/. 24a/ ~l, romplcju. 2Jl Sr<'bl. 2H·2l4, H4(. lJ9 !>rt1or. Hl!-5)9 Xt. lllllllll del ~ttk" dr unmn. 411\ S...cY, complcjo, 212 SEOS, f.omllia, 412. 4 14 Sqcmrntanü. dupllcadoncs, C'I111CIIOCM humano, 85·86. 15/ S...grrJ!adón. aotnt>Sitmtca. ol~ panldon, 417-419. 418[ mitoo:oudnal, 42-4·425. H4( ~lenomtdna RNAt, 199, 199/ S...mtronwl"ador.o, r..,ucadón, dd DNA.. 1·9,

tra•l"'"'"'"·

pn"-.."'

9/ Snnldllcontlnua, rqtlk"adón, 4l4·4H. 41Sf S...nudu. tad~ua "'" tcadcna nctvuY. 228. 218( lmdac.ión M la nansifl protcfn~u. 227221. 227/. 228( tnt<'ramon ron la SRI'. 228·229, 229/ ><'CU<'n\c11n.. hllrC\, 222. 22 2/ S...ptal. andlo. 414 S...Jllll, foruYóón (~q~Ladón) anillopc'riwtltlll. 411-412.411/ '-t..-rias. PtsZ. 41 )-414. 414[ dlvl~lón d~ dluLu bact<'rialllf hiJ.u, 411·412, 411/. 412f Pt.Z, 413-414, 414/ localización. arn ,..;,., 415, 41 , , St'ri;ol. adlísis. de Ll tllpmlón t#nlca (SAGI!), 94 s..-udugencs •JTUp;o.micntos de los arnrs dt' ~lobina. 102 · 10). 103/ callcjoncs sin Nlida PITa lA nolurión. 101- 109.

1011[ dcftnlclón.. 66. 82, 102 r..mttt.a> Jr l
procnados. 109. 565, 565[ 5..-udouridrna. \IOI<'SIS. 699-700, 699/ 'irxualts, honnuna\ cstcrotdcas. wmo iKtivadorcs, 654/

SP 1M1or dr conr t <·mp.tlmc. 6116

sn. factor dt ronc ytm¡wthnr. 677 SGA (m.ili.sls dt nwtriz tzt'Déll1·162. lfl1/. 1110.

l24 o . r.,w>rn /fd,)/IIIS Sllblr/11, 2112 "''<Jda lftlca. H4 (~Kadas, 2112·281 ntnftsurad6n. <:n lormación dd "'mt>l<'J<' at>Wno. 280. 21UI ntano ron ti DNA, liiO·l~l. 281/. 21.12/ ctón. 28l·2~6. 284/-28fl/ UlliOil ,,¡ DNA. 271 272. 27lJ ''''"tnnlln rlr los la~"'· 2~J - l113 283/ ~ntJma <•lnnt'r~~ de RNA, lfo7, 267/ tt"umuc. unu:nro dr Jt» a•r.•rncnores df' ~t"nt"' dr nc,, 27

r.

)llrnt.r dr las ltvadurJ>, 48S-411Y. ~1!9(

k>< u• H~IL. rcpr<"'rún. -4Y2· 491, -'91/ locos H\IR. represión. 4?2·491. 49\f '1110S

<.ldinlción. 104·105 d.tvergt•n
\1'11!5 (rkmtntos lntctpu("ltm ronos l'q)Ctád!Kl. 56)-564, 564( Slnónunos. 190 Slntcnla. 66-67. 67{ Sintftb. •NIISIS de INtriz gcnttica (~GA) . 91 , 91/ ttp1 lctal. 91 ~IR. prott-ÚliS. 492, 411\, 4Ylf Strl/ Sir-4. 323 srRNA 1RNA nono uurrkrcrnc ). Hl. 144. 144/ \mo. tt"t'tnnhttl.l1.1(m t"~r~dfh..a c.h·. q•Rr~aC10n cromO>ómtcd, 41 ~ -' 17. 416/ SL RNA IR NA hdt•r <1111>JimadOI. rc~L'OÚrt dr wn~ 1 ClllJ~Imc <'11 '' •"'' 689-6~0. ~'1( Srn. JlfiJit•m•'· 6711 SAoU:, puUt'UMS t lllllll1c'l1inllc."010 C'StrUltural dc;l aumrl\mna), tl28, 829{ ~MRT <~lfrr¡>~r. lt~ll. 6~8(. 1108 SNP Vto~st Un sol•> nudcoddo. polimorfismo dr (SNPJ mltNA. VliUt Pcqutt'IOS, RNA llutkarrs (SoRNA ) \IIRP 1tll0 SloufJ'I, lt7' Som.ltka rrwmhon"''""· •·xdu\Htn ~ltlica . ~8J rnmunOjllobullru~,, 576· 577 ...-Jir..-g.~lión. 67 'w>m~llcU IDULI<1tlnt" dtvrNdad rnmunnana. ~90-5~1. 591/ lnduddas por dn.1mlnasa d..- dtidln.o y Jltlf J!llcnsil.asa d..- uradlo. 591· ~91, ~92/ UN<ó, 590 SOS, uja, ~14 rrspunta. 511 ~'""· t•l•·rncmo, ex¡nc-lt>n ¡;;-mea, ~4l·544 , ~41/ ~P<>I 1 Jtrntrmo, ~~II<MIll~ prut..-ona 41'1 SR. Jr<l . 649 sRNA 1' (ll/1, 141 - 141. l4lf SRP w....- PJ
![<'"'"· 488

mul_,t,onn

ITE.

<.1..-Jinlct<ÍIL 172 RNAm. d.-gradación. 144 145 RNAI 201>· 207 206( 'IIJ'ft'\OTn, ddlnldún, 206-207. 206/ RNAt , OOITIJlC'Icnda mn ~~ RNAt d..- lipo >IJVC'Sir(', 2011·20'1. 208/

IU( /IW). ¡trll 784·711~. 785(

SIN , .. n.

49~

Sin•psls t.oparramlcnto dr aumosomasl. 461 Slnaptontmlro, ettmJ)IC'jo f..OO('X,ón con cnmn,~rnna' rn rf't'ombin•ción 4M-467. 4611( dcflnldon. 4111 rlcmcnto d..- formanon axt•l. rotur.s d..tlnhlt ··adtna. 468. 468/ tstructura C'l..-mcntos. nial("l. -'66 «ntralcs. 466. 466/ ~tcnlts, 466, 466[ noda5 o nódulos de mDtDblnodón. 466. 466{ protrinas. 466·4fl7. 466/ formaaon. 465-466 dcspuñ M la' roturas dc dobk cadm.o, 467-469, 463{ lndcpcndicnlt dt.loparT.. mit'nto de CIOIIIOIO~. 469 f't'COmblnacion 467·4611 muudonn. 41>1>·467

~u 1 HW1

JlfOI. pall~nos, 20 Suitctnas. 816·8111. 837( ~up..-rrnrullanntnlo drl ONA. estructura. 4711-478. 476/. 477/ del ONA.. 476· 4 78, 4711/. 477/ ~~norna baotriano. 7l5·7l6. 7l5f H6/ glntN, 4111-412. 4112/ tntrnducctón por lopoiwmauas. 478-479, 479{ tm•ertldu. ht....rancm. 43l. 41121 fl<'~tivu, 477 nutlr•"'•ma. 766·767. 766/ poll". srnn. 4'·47, 46/. 47/ Sup..-rvlvenda, td6mcros. 7S2-7H. 75l{. 7'Hf Suprnton. dcftníckm 17 sin smtldo. IC'ctura 1 través. 208·209. 208[ Suprrsor cambio drl m.orm d<' l<'C!ura. H. 211-214, 21 l/

ddinloon. 17 RNAt. 206 207. 20<>/ competrnc~o~ con 1"' RNAI NA. 771

lnin•nnmO*'t4:lOW' <'Ompk¡m de tran... npmon. 771. 778( "'1''"'" nur:kosómirn 7116·787, 787{ SUJX'rrnrnllamlrnto d..-1 DNA. 766-767. 766/ ll
~W IJSNP.

wntflk'JO

dtflnldón, 799-100. 800/ r«lutamlcnto. 801 unrcm, "lO, 8101 SWIS, factor dr tran<mpoón. 801 Sx l. prutctna. bll6

T T. an11Jttno. 451 T. u:tu las (hnfodto. TI

"''""'a' '' ntotóxlu,, 57 J •u•lllart\. 572 motóxlcas. 5 7J <.ltl1nioon. 572

des.~rrullu, ~98, 5911/ cxpan. 596 prutrmas <:03. S911-W9. S99J T/1, antíg..-nos. 6115-616 n . la¡:n. pt>hmtruas dc RNA. 261-262, 262/ T4. cndonudu.a V (T4 ·JldR). 506 T4. ligas.>!, 44-4 T7. l.ago. polnn<'fi&Saj d..- ltNA, 261 · 262. 262/ Tabaco. virus satrlltt de la n«rosl> del tSTNV). 12 TAI',Itlll, 621 Tal•~IIIIJ\, drlrdonrs, 110-111. 111/ T•llo-lazu. protdna dc un ión a la nrruaura (SI.BP ). 697 T~ndem. illfllpamlcntus d..mapa de restrlcdón. 112-11 ~. 1 rcpct\ckmc:,, 117-118 TAPIMEX. protcfna dr tro>nspone. 6111. 683( '" '· w:nrroda de unrím. 1>44, 644/ Tardío:>. ¡,oc:nN. 232 tal, protclna. 644, 64'1( TATA Qj.a. 619, 621. 621/. 6ll. 621. 621[ 4.'lt'ln('nto, 611 promotor<" •·arrnt<'S dt', 619 protrina de unión !TIIP I. 615, 619-621. 620(. 621/ TBP IJII'tT, Tl'C.l'JIIOT dc dlula. (TCRI

ama nr

tndice alfabético

889

T-ONA A!Jrd/Jaclmum rumt[acitns, 402·406. 403/-405/ gen~.

enfermedad de ag.t!LJ dr corona. 402403/. 404./ uan•ferenci.a. 405-406. 405/ Telomerasa en sfntcsls d• telómeros. 7SO-n2. 751/ Trlomtrico. sUen.:Umieruo, 821 Tdómero awn .. mtemo. 752-n3. 1S2f ddinlClón, 748 extensión por recornbinadón. 752-753, 751/ formación del '>CIIO dd extremo del cromosoma. 749-750, 749/. 750/ fundnncs. 750 srrucncia3 de rc~Unón simplo. 748-749. 749/ >m te:"~ pc>r la rrutma nt.onuclculliOtrino,a. 750752, 751/ rclacwn.tdos con cambio~ 1rmllcos. 278· 27Y Tempro1nos. grnn. 2112·283. lB rclrosados, gene>. 292 Tcrawmas. 402 Tercera b.uc, dc~cncroción de. 191. 192. 192/ Unnko. c:boqu.-. gen.-. d.-. 649-650 T.-nnuwaon 40~.

uxtonn alto::racionrs e>¡>or.it.lkas, 197·1911. 197/. 1911/ cambios del nurco de lenur... 114 t.ldinlción. ll. 172. 197, 197/ msemón de- amtn~ados novrdo-. 1911. 199/ rcronoctmirrUrl por lo~ f•ltorn prc)t~mt
173-174. 173{ 174{ RN Al >uprr-m I<~Ictna<. 172 lomut t.lr elon~dón. 295 ¡>ama. 283 1••lunrra.sa de RNA. 293-195, 294/ prrvrndón por fiQ, 294-1115 rrplic:.aaón dd ONA. 429 'lrHtsís dr protdnas. 155, 1Hf transcnpaón. 261. 261_( fanur p. 2117, 21111-291, 289{. 290/ Terminador~$ ll.Jo~tianos.

286·2117. 287/ dr p, 287. 288 1! a>ll. 287·2118. 287/ muinse-cos. 287-283. 287( ddlmaón, 258, 258/ dependiente> dt p. 290, 290[ Terminal. undtltran,frrasa (TUTa~at. 723-724. 724/ Trrrmnafo. ¡nordna>. m10adón vínca. 394-395. 195/ Terminasa, 712-733, 733/ Trtrada5, .ucomicetos, 475. 475/ tlept"ndtrnlt~

Tttrd/tylrtm4 rhtrwtophi/Q

c.ambios del código f!Cn~tlco. 197 intrón gru¡>o 1 auto conr y empalm~. 707-709, 708/·710[ E.coli, 710-711. 711! ~struoura ~cundaria. 709·710. 710( modificación dr hbtona~. 804 ulillzadón d~ blstonas, 774 TF. VitJU TranKTtpoón. factores d~ ITF) Tlltn1111S aqiUJtínLS, factor a. 280, 180/ Thtmrwr lht1'11fophilwt, rit.osoma, cunfonnadón estructural. 181 TI. pl~•midos, d
890

Índice alfabético

TIM. comple¡os. milocnndnaltS, 243, 244. 244/ Timtdlna. dfmrros. sisuma de r~paradon por rsmión. 516. ~16{ Tilnuta, 6, 18-19. f8/ Tiroideas. hormona,, cmno activadorr~. 654/ Tiros! na, división cu dd DNA. 48 5-4116 TI.F.620 TLR. jrrtt¡norcs tipo TuiiiP<'•JrJ). 602·604. 603( Tn. transposonr.. o transposonrs compuestos. 525-526. 525[. 526[ TnA. l.omilla, transpodo (¡~eajtl ITI..RJ. 602-604. 603{ TOM. complejo. mitnwodrial. 24l ·2-f4. 243/ hipA rnula<100r> drl g.-n. 418 To¡kmomrrasas a<~IVIddd. similitud con rrcombnut1un t~pccflica dr silio. 484-4116, 485/ tmrodu
479/ tipoL 2n. 479 DNA de cadtna Individual. -f79, -filO. 480/ tipo ll 4 79. Vlou IQ1flbiln Gtra'w1 DNA t.lr doble .:.adena. 47'1, 481. 481{ Topoló¡¡ICOS, l>. ntimtru dr (TJ. 477-478 ll'A. elem~mo d• rn1>11n1a tTREi ti SO "~- f!<'ll.. (>86 Tra. prottfna. 687 Tra2, proteína. 687 Traducaón baCieNM. O>lton". f37 umtrnJ atenuanón. B6· H8. 337(. HS/ cambio d.- muto dt- lectura. 2ll·214. 2llf terminación dtl.:ltran>cnpdón. H5. 315{ drllnidón. 111. Hl exprnión gtnla. H · 34/ fi n.allza ribo-.sómlra>. 209·211. 210{ rrgulan(m.. rel>r<"><>rc,., lll- 325. l24/ rlbo.oma, l4.. 34{ ril><...ómiro. >iuu d• inkiación. 116-137 RNAm. 129, 129{ rucariótko, 162·163 Traducdon.al. poslt,ondmirnto. del ONA en .-1 nucleosoma. 776· 777. 7nf TRAM (protrina d~ membrana rela
rnutadonn dr anuación en

confi~ur¡aón.

36,

l6f

set"uenlias
agru1>amlrnto dr DNAr, 113, 114/ apareamr~nto en la "burbuja ldr. 258. 258/ ronsmutwa. JO'i wnnol anmrrmmación. 291 , 291{ potrndadores. t>ll-t>l2. 612/ promotores. MI. 612{ traducdón. H6, B6/ drllnkión. H2 dtsplazamknto dd octÁm d~ tr~nscrlpdón. 621-622 pollmt"ra~a dr RNA. l67·269, 266( rnndeln t.ltl btdonumu. 277. lnf rll>rl ba.. l 306 nudeowmas, 777-779, 778{. 779/ prnductoo. lranscriro prlmarin. l5R promotnres, 2 58, 2 '8f pumn dr 111iao, mrum~mn hawl. 6-f2 recunodmkntn del promotor. S«Urnn•s de con<en...,, 271-274, 274[ rrlnldu. pohmrrasa de- RNA varada. 269-270 rrparadón. 625-617. 626/ r~prnlón por la d~>a<
RNAm. 129. 1211{ 1 56. 156/ St'
atenuación por ffiructura de horqullt. m el RNA. 3H. 133/ Wnlrol1raducdonal. H5. 335/ faaor p. 287, 288-291, 289/. 290/ pollmtrasa. de RNA d.- las bactrnas, 2116·287, 287[ de RNA L 694-695. 694{ d.- RNA m, 694·69,, 694/ ttrrnlnadores, 2~8. 2511f unidades. 2 58. 292 Transcnpdón. factor<' dr ITF) definldón, 101 ll'.,A. 622 TP,.B. con le pollmtr&WI de RNA. 6ll-6l1. 6Hf TP,.D, 619--620, 621 , 798 romano actlvador, 647. 647{ uruón • la ca¡a TATA. 612 T~ f. 624 0 TP0 F. 1>13 TF0 1t, 6H. 625-626, 626/ Tr,,J 614 TF13 A 617.798 TF.,B. 616·6111, 617[ 111~- 642·641, 641/ Tran~crtpluma. ,6 Tran<eriro. 38 Trarucritn~. gents. nudeosomas. 777 •778. 778/ Transducción. v~rus de. 5511·559. 558{ Traru.,..etriBcaeión autoron~ y rmpillmr del intrón grupo L 707· 709, 708/-71 Of con~ y ~mpalrnr. dt proteínas. 724-725, 725/

del RNA. 674. 674{ rucdones. caurlítlcas d< la rtbollma. 71 J . 71 3{ d.- conr y empalme. 683. 68-4/ Translecdón, 5 sistemas, para caract~oón dd promotor. 613 Trander, lll ca.rgado. Vi.ue Ammoactlado. RNAt cognado, 100 rorrrcdón dnéllca, 103-204.. 204[ COntJOO ron d RNAr 23S. 181 definición. 14 ruo acrptor. 130· 11 l. 130/. 132/ ann<-odón. llO[. n 1. 112/ D. 130/. 131. 132/ ntra, 1)0{. 131 TyC. 1 10[. 131. 132/ brazos, 130, 130/. 132/ ca.mbtos rrladonadO\ cnn la rnzuna, 202. 102[ cnnlomldOnnaL stlios aOIVO'>, 105· 206. 205/ lazos. 130. 130/ scrunddria ele hoja de 1ret.ol. 130- 11 l. 1 30/ tallos. 130. 130/ 132. 132/ trrdara con forma dr L. 1 31·132. 1 32/ rxuemo )', 194, 194{ rxttrrno 5', 194, 194/ fundón, 128-129 g~D~s afirmativos. 49 íd~ntific.aaón por las slnt~tasaJ. 101 interacaones. con ef nltowm•. 154-155. 154[. 15Sf ron el RNAs, 180 isoa«ptor, 200-20 1 modiftcanonts dr basn. 194-196, 19'/ apilr..mlrnto anucodón-codón. 196·197, 196/ mullldonrs. srotldo rnóneo. 206·207. 207[ sin -.nlit.lo, 206-207, 206/ nom~nclatura. 131 proct:$0 de atrp. 131. 100-201. 200{. 209 slnt<st.s 1 pantr de precursores m;b laTJOS, 194. 194/ SISttma dr nurn~ración. 131 slllo A. rrgfonrs protrsldas. 181 sitio E, 182 sitios d~ umón. 169. 170/ A. 154.154/. 160.tn. 178/ E, 154, 154/.178/ P. 154, 154{. J(»(), In, 178/ subunldad SOS. 1112 supresor. com~trndl con RNAt de upo silvesttt, 208·209, 20&( r~oc:tmlrnto dr codonrs sin sentido, 206-207, 206/ lamallo. ll8f tipo sllYeslro. compt"tencia con d RNAt supresor. 208-209. 208[ Transfemna. RNAm, dt.mrnto de r~spuesta al blrrro, 142·143. 142/ Transformación. 3-4 TTQIU[orm
Transgénicos. srstrmas, para caraaerizildón dr promotom. 611 Tr•n!Sicionrs (apa.reamic:nto de bües erróneo). 15-16, 16/ Tramloaoón <arnbios estructurales drl RNAt. 178. 178{ dc:!lnldón. 221 dupUcad6n r.cp~~ración, 99 fat1ores. mimrusmo n lructural 17!·174, 173 protdna control. ll2·1H, 233{ cotraducdonal, 221-223, 223[ inlciad6n. St'CUcnci.as de sct\aL 22 7-118, 127/. l28f mteracdont'l con SRP. 128-229. 219( invrm, 134·135, lW{ panlcula de rrcoDodmlento de señaL 228229, 229{ pomad.ucdonoll 2ll ruta pr~drtrrmlnada. 227, 227{ SIStemas de uanslocadón tnd~ndtemes de S« en IUDli, 249·250. 249{ nbo>ómlca, •mvaaón, 172 mod~lo d~l rnado hlbrido. 169-170. 170/. 178 >«Uenaa aleatoria rrmas, 154 1crmlnasa, 732-733, 7Hf Tr.mslocanón, protema dr membrana a.odada con ti pohp<'ptído de ITRAM). 219 Transmcmbr.-.na dominios, H5-2)(>, 2)(>[. 239, 239{ prot~fnas. 135·116. 215/. 236/ rqión, 601 Tran>IXmiblrs, eltm~ntos. VIOJt Trans¡105onrs (elementos u•nsponiblesl Tra nsposasas d~lint<•ón. ~25

prolrrenda rú. S37·538, 5l7/ transposición d• TnA, 534--516, 535/ Transposicion ron>rrvadura. 528. 528/ control de 1• frr,uenda , 537, 537f ddimción, 45~. 5H. 560 dept"ndknte de RNA. 551 formación d~ duplicados. 9Y lrecurncia, SlS lmrmtcdtanos comunes, 530-531. 530(. Bl/ mar.. S 38- 540. 539/. 540/ no replicatiYa, ~27- 528. 5lJl/. 5 H· S 34. 53 lf rt'pticotiva. 527. '27{ rointqrad<». Hl·,n, 532/ familia TnA. 534--536. 535/ TniO. 516-HII. 537{ transposours compuestos. 525-526, 526/ Transposones rompuntos. módulos JS. '25-526. 525/. 526/ Transposonrs (. 525/. 526{ drlirllción, 16. 62, 521 Drosophila mtlanogUJitr, 561·562, 561/ rlementos familias. lonnaaón. 540-542. 541/ genoma humano. 85. 85/. 563·564. 564/ "In venidos·. 521> no funcionales. 567, 567/ rc:rombmadón rrciproca ~ntrt repeticiones lnY~nidas. 529. 519[ rrcsuucturadoncs del DHA. 522, U2[. 528-530. 529/ dlreaas. SH 1ndireoas. 521 l<'pt'tlcionestrnnlnalrs invenldas. tnA. 535, 515/

SC<'\Itndas de inserción. 524-52 5. S24/ srlrcaón dd sitio drana. 5 38 transposidón ronscrvadora. S28. 528/ no replicativa. 52?-528, 528/ r~pUadva, 527, 527/.531-533, 5ll/ Transpo10nrs en disgrnnia d~ lúbridOt. 544·)45,

544/ Transvecdón. 6 31 Tt ansvrmonrs, 15 Tr aslocones comJ!onrnles, 2H, 2Hf SO Tnrostatlna. inhfbl
Tricollod•motia. 627 Tnpanosoma. mltorondnas. rdtCtón de RNA. 721-722, 722/ Tn¡>tófano control de la po>1nón dt'l ribowma. B7-:H8.

137/ pfolrina atmuadoR de u.niónlll Rl'IA en presencia de tTRAP) cnntrol del operón rrp do:: 8 rwbólu, H3-H4.

lH/ RNAt''"· control. H4, 3 34{ rrp, rontrol de la atenuación dtl OJI<'TÓO. 3J6. H6/ trp opt'rón. rtgión lldcr. conformaoonrs apareadas de furma altrmauva. 136-317. 337{ repr<sor. 319· 320 'Try¡o<¡JtOS<>mo brv«r c"xl/1, grn. de de RNA. 721 . 722{ Tumong~ntsl5, 1n1rgradón rctrovmca. 557 Tus-ter, rornplc¡o, drsensambk d~ horquilla d~ replicadón, 452·453, 453/ TUTa~a (uridll uun•lera5a t~nnlnall 723-724.

724/ 7}>. elementos. en levaduras. 559·561. 559/·561/ lranscriptasa~

mvcr.sas. 56), 563[

u U. re•lduos. en la ~dlctón de RNA. 72l·724. 724/ u. s~amemo. 694 U l. snRNA. rstructur• apilrtada, 675-676/ U1AF. !actor de ron~ y empalme. 677, 678/ U}·R. 554 U3-R- U5, ~60 U4, •nRNA, 6110 U6 IU4. snRNA. 680, 680/ UAA. codón de terminación (rodón c>CTr¡, 172 UAG. codón dr terminación (codón ámbar), 172, 199 UAS (secueDda actlvadora en Oujo asundrntel. 629-630 UBF, 615, 615/ UblquiUna. 234 UEP (unidad de pt'rtodo rvolutiYo), l O~. 106 UGA cndón d~ ltnnmación (codón Ópiilol, 172 codones. lrucr
Índice alfabético

891

Umuo·,c.. """lllcJnlpnltm~raw d~ DNA VJ. 507 Un gen:un• en.anl4. lnpo>Cnl\, 24·25 Un solo cromosom.o X. hlpollnl> de. 827. 827{ Un solo nudroudo. polllmurfl\mo de ISNPJ dellniaon. 57 lre. 58 f>O UNC:. IKiucml~ ~ DNA ur.oulo). 590 Unnl~d dr periodo evolutivo 1UEP). 105. 106 Unión d.- <"XIremu~ no hnmt\lu¡co>INI!EJI. 516·

5111. 517} Un1on. sluo de turtl definición. 411 l m1~\Hnl• rn 1.1 rt--.umbm•,1on dr )..

486·488.

6U. 6Uf

ur11e 1drmr111o dt mpum• • pro~dMs dnplcpdut. 69l. t>9lJ Ura
'""'""'~'- 591 591. 5'12/ IVTl'l. 72 t

lnf

Urel. pruleLnA. 8l6·1H8. 837/ URP lrrwrw J. 12 UndU uanYI 72l 724. 724( Unclind rdO
124{ modlflc•dón en ~1 R.NIIt. 195, 195( •nllr l<¡ur 1. ll6 UUG.
V Y. ¡cen dthlllctun. 5 7C.- 577 rnuladunt'\ soiiWnus. 590- 591. 591{ relc- dr 1.t codm. ll~ra. 577, S78f 579 rrC'QII\blryoonn sucesivas en enumbk de la ••dcna J>M~r rc~~m•hlnau(m. 5~6. 586{

Índice alfabético

IYIO'R), 124 rq¡lón lrqlón \lj en '• llllllllllfljllnl>ulino. 5n576. 576f Yar1'1!•d6n. 5}8 J)(ll' dc.-un d~ pol\ldun (I'EYI. 820-821. 821{ Yrgelatlva, fa•c. •Ir IM< 281 Vrrdadrra. n:verslun. dr In u la< hmr•. 16-17. 17{ v-{o$. ~rn. 66 3 Y¡¡¡l.Jancl•. slslc-m••· 144- 145, 1H( YlrA·YirL. "\lrml. 104·~115 404.{ Vtrka. superf1mflla. 51>2, 562} Ymunr<. 19 Y¡t(ll¡k drlluhfrdlk> dt la Pll.. ~~TV) 19·20. lO/

ten•'·

487{ rrquclimlrmos t«~~tnclaln. 41\4. 48~/ Unilan• •·<'lula. <10'1 U PI: lc.-kmc.-nto promuh>r rn llu¡o a.ccndmtrl.

892

V. rqlón lrqlón ••r1ahk). m la uununoaJobuhna. 575-576. 57c.( V. stllll'lmlo. 581 Yanal>lcdummiu ldumtntu Yt. 576 rrslonn dt rq~tlldoncs rn t¡~m de

V1nud«-\

a 719. 719{ .Jrfuunon 19·20, lOf y de VIIU..>hlt'\, IUIU di VI \IOn dC' 71 'l. 71 'JI Vuulri>(U. JieDn. t'D c-nfrmttdad de a¡¡ollla dr wruna. 4C \ 404. ~04( Y1rultnll\ mul"''""'''· li>O Vuu• llllUaUUII. pmltÍIII\ ICI'lTIIDolJn. }94-)95. 395[ rrphcaoc\n dC'IIlNA. pnr drtpl.a:r.amknto 6c
a
auxiliare•.

,,~

<'•l
rlrm<'lll
11>~

t•nwmbiC'. 731 71-4. 7l2f, 7Hf M
'"",.don. ¡>rulttnl\ lenum•le•. 194-l95. }95J p.mcul•• \lmll•rc-s • IVLPt. ,.-nerodón por In• rlcmt'Dicl' J}l. 560·561. 561( plan1u. multi¡wrula\, 7ll n-pllcaoón. 393 d....pluamtcnlu de> c•drna. l94. 3Y~( dUrlllll' t•J tl
~

r("c.unahm,ac.u'in. ~~Y lrJdu«1ón del RNAm. 16l lranodntción. H8·5W, 5~8/ lrarufum~anln 100 n. sss.

~"''

Ylrutoldeo ikNA wl~lil<'l. actividad aullllca 718720. 719[. 7l0f cabeza dr m•nlllo. 719, 719{

vn.. rnuu o. 654. 654} 1' )1111. ~n. 66)

VNTIItn:JtllnC's dr rrp<'1t
w Waüon y Cnck. mudek• dr la doble hrhcr. 11-8. 7[. 8{

X X.

c.rmUH!!-UIUd

••rlll.ulón ele' hl\wna,, lltJt, han1Lu <;. 741. 741/ mmprnsación de- dmt.. 1126. 826[ dcnsid•d d<' Rrnr.. 86 h~<'rncrOm.llln•. C'OIISUIUII•a. 826·1127 latllham·a. 827 htV rn la re¡¡IÓn t\pnlfillo cmbnunanu. 11'11>·6"7 ONIIr. •llntl"'nllenln. 115 aJobina. ¡rn. 104 tonshud dtl n¡»cildor no 1mua11o. 114. 114{ OVrte." y Cllljt;lllllt' del RNAI. 1192 Jll•llnuwn·, dl'l ~c·n RNA SS. bici \IIOJINA, 6'1'1 Xrr. •t
y Y. unmosoma. rqinii<'Spet1llll delrnnln.ll1tr de 11 masculinidad. 86·87. 87/

z l . •ndlo. lormanun . 41 J -414. 4 14(

Zrllw..llrr, •mclrurne 24\ Zm• dedm. drmc-nl<>'l
6~~(. 6~6{