Lebensmittel- Und Umweltanalytik Mit Der Hplc Tips Tricks Und Beispiele Fur Die Praxis

Lebensmittel- und Umweltanalytik mit der HPLC: Tips, Tricks und Beispiele für die Praxis R. Galensa et al. WILEY-VCH ...

Author: R Galensa

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Lebensmittel- und Umweltanalytik mit der HPLC: Tips, Tricks und Beispiele für die Praxis

R. Galensa et al.

WILEY-VCH

R. Galensa, U. Engelhardt, M. Bahadir, H. Bohm

Lebensmittelund Umweltanalytik mit der HPLC

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R. Galensa, U. Engelhardt, M. Bahadir, H. Bohm

Lebensmittelund Umweltanalytik mit der HPLC

0 VCH Verlagsgesellschaft mbH, D-69451 Weinheim (Bundesrepublik Deutschland), 1995

Vertrieb: VCH, Postfach 101161, D-69451 Weinheim (Bundesrepublik Deutschland) Schweiz: VCH, Postfach, CH-4020 Basel (Schweiz) United Kingdom und Irland: VCH (UK) Ltd., 8 Wellington Court, Cambridge CB1 lHZ, (England) USA und Canada: VCH, 220 East 23rd Street, New York, NY 10010-4606 (USA) Japan: VCH, Eikow Building, 10-9 Hongo 1-chome, Bunkyo-ku, Tokyo 113, Japan ISBN 3-527-28747-7

R. Galensa, U. Engelhardt, M. Bahadir, H. Bohm

Lebensmittelund Umweltanalytik mit der HPLC Tips, Tricks und Beispiele fur die Praxis

4b

VCH

-

-

Weinheim New York Base1 Cambridge . Tokyo

Prof. Dr. R. Galensa PD Dr. U. Engelhardt Institut fur Lebensmittelchemie TU Braunschweig Schleinitzstr. 20 D-38106 Braunschweig

Prof. Dr. Dr. M. Bahadir Dr. H. Bohm Institut fiir Okologische Chemie und Abfallanalytik TU Braunschweig Hagenring 30 D-38106 Braunschweig

Das vorliegende Werk wurde sorgfaltig erarbeitet. Dennoch iibernehmen Autoren und Verlag fur die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlagen sowie fur eventuelle Druckfehler keine Haftung.

Lektorat: Dr. Steffen Pauly Herstellerische Betreuung: Dipl.-Wirt.-Ing. (FH) Bernd Riedel

Die Deutsche Bibliothek - CIP Einheitsaufnahme Lebensmittel-Umweltanalytikmit der HPLC : lips, Tricks und Beispiele fiir die Praxis I R. Galensa ... Weinheim ;NewYork ;Base1 ; Cambridge ;Tokyo : VCH, 1995 ISBN 3-527-28747-7 NE: Galensa Rudolf 0 VCH Verlagsgesellschaft mbH, D-69451 Weinheim (Federal Republic of Germany), 1995

Gedruckt auf saurefreiem und chlorfrei gebleichtem Papier Alle Rechte, insbesondere die der Ubersetzung in andere Sprachen, vorbehalten. Kein Teil dieses Buches darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form - durch Photokopie, Mikroverfilmung oder irgendein anderes Verfahren - reproduziert oder in eine von Maschinen, insbesondere von Datenverarbeitungsmaschinen, verwendbare Sprache ubertragen oder ubersetzt werden. Die Wiedergabe von Warenbezeichnungen, Handelsnamen oder sonstigen Kennzeichen in diesem Buch berechtigt nicht zu der Annahme, daR diese von jedermann frei benutzt werden durfen. Vielmehr kann es sich auch dann um eingetragene Warenzeichen oder sonstige gesetzlich geschutzte Kennzeichen handeln, wenn sie nicht eigens als solche markiert sind. All rights reserved (including those of translation into other languages). No part of this book may be reproduced in any form - by photoprinting, microfilm, or any other means - nor transmitted or translated into a machine language without written permission from the publishers. Registered names, trademarks, etc. used in this book, even when not specifically marked as such, are not to be considered unprotected by law. Satz: Mitterweger Werksatz GmbH, D-68723 Plankstadt Druck: Strauss Offsetdruck GmbH, D-69509 Morlenbach Bindung: Wilh. Osswald GmbH+Co KG, D-67433 NeustadtMreinstr.

vorwort

Die Hochleistungsflussigkeitschromatographiehat sich in den letzten 10 Jahren zur vielleicht verbreitetsten Analysentechnik entwickelt. Abb. 0-1 zeigt die weltweiten Verkaufszahlen bis 1989. Daraus resultiert eine hohe Nachfrage an Schulungskursen und Informationen uber dieses Analyseverfahren. Aus der Zusammenarbeit bei entsprechenden GDCh-Fortbildungskursen zwischen dem Institut fur Lebensmittelchemie und dem Institut fur Okologische Chemie und Abfallanalytik der TU Braunschweig entstand das vorliegende Buch. Es gibt einen Einblick in die Theorie und Praxis der HPLC, wobei bevorzugt der Anwender und Praktiker angesprochen werden soll. Deshalb werden theoretische Grundlagen auf das zum Verstandnis Notwendige reduziert und so einfach wie moglich dargestellt. Wo immer es geht, werden praktische Hinweise gegeben, die aus jahrelangen Erfahrungswerten im ,,Kampf" mit dieser Technik resultieren. Der erste Teil des Buches befast sich mit der chromatographischen Theorie sowie mit den einzelnen Bausteinen und Einsatzmoglichkeiten der HPLC. Ebenfalls wird ein kurzer Uberblick uber komplementare Techniken, wie z. B. die Capillarelektrophorese, gegeben. Im zweiten Abschnitt werden 23 Applikationen aus dem Lebensmittel- und aus dem Umweltbereich vorgestellt. Diese Anwendungen sind erprobt und detailliert beschrieben, damit sie sowohl praktisch, wie auch geistig nachvollMillion S T ,

C

1985

1986

1987

1988

lQ89

Year Abb. 0-1: Angaben iiber den Verkauf analytischer Gerate (aus: Linxheid, M . , Fresenius J . Anal. Chem. 1990,337,648-661).

VI

Vorwort

zogen werden konnen und vielleicht Anregungen zur Losung eigener, ahnlich gelagerter Probleme geben. Die Auswahl sol1 einen weiten Bereich uberstreichen. Es wurden deshalb Beispiele gewahlt , die spezielle apparative, chromatographische und/oder besondere Aufarbeitungsmethoden enthalten. Gerade die Aufarbeitung des Probenmaterials entscheidet oft schon uber den Erfolg oder MiBerfolg einer Analyse, weshalb der Erlauterung der entsprechenden Schritte besondere Aufmerksamkeit gewidmet wurde. Zur Unterstreichung, da13 auch in diesem Bereich der Chemie das Bewuatsein fur die eigene und fur die Gefahrdung der Umwelt gesteigert werden muB, wird ein ausfuhrliches, allgemeingultiges Kapitel uber den Umgang mit gefahrlichen Stoffen vorangestellt. Konsequenterweise werden bei den Applikationen ebenfalls entsprechende Hinweise gegeben. Braunschweig, im September 95

R. Galensa

Danksagung

Die Herausgeber und Autoren danken allen, die zu diesem Buch durch vielfaltige Anregungen und Hilfestellungen beigetragen haben. Besonders hervorzuheben sind Herr Ralf Lippold von der Chemischen Landesuntersuchungsanstalt Freiburg, Herr Dr. Jochen Rosenboom vom Gemeinschaftlichen Chemischen Untersuchungsinstitut fur die Stadte Wuppertal und Solingen und Herr Prof. Dr. Bernd Luckas vom Institut fur Ernahrung und Umwelt der Friedrich Schiller-Universitat Jena, die uns mit einigen interessanten Applikationen versorgt haben. Den Herren Dip1.-Ing. (FH) J. Hamann und B. Rother danken wir fur die Optimierung der IC- und einiger HPLC-Applikationen, sowie Herrn Dr. R. Kreuzig fur wertvolle Ratschlage. Frau Carola Balcke danken wir fur die Anfertigung von zahlreichen Abbildungen.

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Inha1tsverzeichnis

Abkiinungen. Akronyme. Begriffe

1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10

2 2.1

2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.2.1 2.2.2.2 2.2.2.3 2.2.2.4 2.2.3 2.2.4 2.2.5

..................

XI11

Gefahrstoffverordnung UndArbeitssicherheit . . . . . . . . . 1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Gefahrstoffverordnung (GefStoffV) . . . . . . . . . . . . . . 2 Aufbau eines Chemikalienkatasters . . . . . . . . . . . . . . 4 Prufung des Einsatzes alternativer Arbeitsweisen und Ersatzstoffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Gefahren bei der Untersuchung von Proben . . . . . . . . . . 7 Allgemeine Laboranweisungen . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 MAK.. BAT- und TRK.Werte. Ausloseschwellen . . . . . . . 11 Gefahrensymbole und WS-Satze . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Reduzierung der Schadstoffbelastung in Abwasser und Abluft . 18 VVV (Vermeiden. Vermindern. Verwerten) von Laborabfallen und Losungsmittelruckgewinnung . . . . . . . . . . . . . . . 19 Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Theoretischer Teil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Anwendungsbezogene theoretische Aspekte der Chromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chromatographische KenngroSen . . . . . . . . . . . . . . . Diffusionseffekte. Bandenverbreiterung . . . . . . . . . . . . Van Deemter-Kurve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bandenverbreiterung aul3erhalb der Trennsaule . . . . . . . . Verschiedene Kombinationsmoglichkeiten in der HPLC . . . . Normalphasen- und Reversed-Phase-HPLC . . . . . . . . . . Ionenchromatographie (IC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ionenaustausch-Chromatographie(HPIC) . . . . . . . . . . . IonenausschluB-Chromatographie (HPICE) . . . . . . . . . . Ionenpaar-Chromatographie (MPIC/RPIPC) . . . . . . . . . . Detektoren fur die Ionenchromatographie . . . . . . . . . . . HPLC-Biosensor(Enzymreaktor)-Kopplungen . . . . . . . . . LC-GC-Kopplungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . HPLC-MS-Kopplungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

23 23 23 26 26 28 29 29 31 31 34 35 36 37 39 41 49

X

lnhaltsverzeichnis

3 3.1 3.2 3.3

Komplementarmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Automatische Mehrfachentwicklung bei der D C . . . . . . . . Capillar-Elektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Supercritical Fluid Chromatography (SFC) . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

51 51 53 60 63

4 4.1 4.2 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.4 4.5 4.6 4.6.1 4.6.2 4.6.3 4.6.4 4.6.5 4.7 4.8 4.0

Module . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pumpen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gradientensysteme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Probenaufgabe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Manuelle Injektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Automatische Injektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Microboretechnik . Praparatives Arbeiten . . . . . . . . . . . Trennsaulen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phasenmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Detektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . UV/VIS-Dete k toren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Dioden- Array- Detektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Brechungsindex-Detektoren (RI-Detektoren) . . . . . . . . . Elektrochemische Detektoren (ELCD) . . . . . . . . . . . . Fluoreszenz-Detektoren (FLD) . . . . . . . . . . . . . . . . . Fittings Verschraubungen. Verbindungsleitungen . . . . . . . FlieBmittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Datenauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

65 65 71 74 74 75 76 76 78 80 82 85 88 90 92 95 99 106 107

5

Fehlermoglichkeiten und Fehlerbehebung (Troubleshooting)

109

6 6.1 6.2

. ......................

HPLC-Applikationen 115 Validierung von Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 Probenvorbereitung mittels Festphasenextraktion . . . . . . . 118 Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

7 7.1

HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich . . . . . . 121 Bestimmung von Flavonolglykosiden in Tee und Teeprodukten oder ahnlichen Erzeugnissen . . . . . . . . 121 Bestimmung von Catechinen und Alkaloiden in Tee oder ahnlichen Erzeugnissen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 Nachweis von Sulfonamiden. N4.Acetylmetaboliten. Chloramphenicol und Nicarbazin in Fleisch und lnnereien . . 129 Bestimmung von Ruckstanden von Oxytetracyclin. Tetracyclin und Chlortetracyclin in Muskulatur und Niere . . . 136

7.2 7.3 7.4

.

lnhaltsverzeichnis

7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10 7.11 7.12

Bestimmung von diarrhetic shellfish poisoning in marinen Lebensmitteln . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bestimmung von Konservierungsstoffen in Lebensmitteln und Kosmetika . . . . . . . . . . . . . . . . Nachweis eines Grapefruitzusatzes zu Orangensaft . . . . . . Bestimmung von schwefliger Saure in Bier und anderen Getranken mittels HPLC-Biosensorkopplung . . . . . Bestimmung von Siirjstoffen . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nachweis von Mais und Hirse als Malzersatzstoff in Bier . . . Bestimmung von Kohlenhydraten durch Benzoylierung . . . . HPLC-Untersuchungen iiber Chlorogensaurelactone in Rostkaffee . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

XI 142 146 151 155 159 162 166 171 176

8 8.1 8.2 8.3

Zusammenstellung einiger amtlicher Methoden Amtliche Methodensammlung nach 0 35 LMBG AOAC-Methodensammlung . . . . . . . . . . Schweizerisches Lebensmittelbuch . . . . . . .

........ ........ ........ ........

179 179 180 183

9 9.1 9.2

HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich . . . . . . . . Bestimmungvon Nitrophenolen in Regenwasser . . . . . . . . Bestimmung von Sprengstoff-Ruckstanden in Oberflachengewassern und Grundwasser . . . . . . . . . . Bestimmung von Triazin-Herbiziden in Grund- und Trinkwasser . Bestimmung von Pflanzenschutzmitteln (PSM) in Trinkwasser mittels HPLC-MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAH) nach Trinkwasserverordnung (TVO) in Grund- und Rohwasser . . . . . . . . . . . . . . . Bestimmung von Anionen in Deponiesickerwassern . . . . . . Bestimmung von Anionentensiden in Klarschlammen . . . . . Bestimmung von Phenylharnstoff-Herbiziden in Eluaten aus Bodenproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bestimmung von 16 polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAH) nach USEPA in Bodenproben . . Bestimmung von Aldehyden und Ketonen in Dieselmotoremissionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAH) in Dieselmotoremissionen . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

185 185

9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 9.10 9.11

........................ ...............................

190 194 198

203 207 211 216 222 228 233 238

Weiterfuhrende Literatur

241

Sachregister

243

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Abkurzungen, Akronyme, Begriffe

Absorption (absorbance) Aufnahme von Licht durch eine Substanz, z. B. in einer Detektorzelle Affininatschromatognphie Trennung von Substanzen aufgrund spezifischer Wechselwirkungen mit der stationaren Phase AMD (Automated Multiple Development) automatische Mehrfachentwicklung bei der Dunnschichtchromatographie APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) Ionisierungstechnik bei der LC-MS-Kopplung Absorption units (Absorptionseinheiten) bei der UV/ AU VIS Detektion Auflosung, chromatographische beschreibt das AusmaB der Trennung zweier Komponenten AusschluRchromatographie (SEC - size exclusion chromatography) Trennung nach abnehmender MolekulgroBe Bandenverbreiterung (Peakverbreiterung) Zunahme der Halbwertsbreite von Peaks wahrend der chromatographischen Trennung CE Capillar-Elektrophorese (capillary electrophoresis): Uberbegriff fur elektrophoretische Techniken, die in englumigen Kapillaren durchgefuhrt werden CFFAB Continuous Flow Fast Atom Bombardment; LC-MSInterface chemisch gebundene Phasen stationare Phasen, die durch chemische Reaktionen einer Substanz mit einem Tragermaterial hergestellt werden DAD Photodiodenarray-Detektor Detektoren Anzeigegerate zum Nachweis der Substanzen am Ende der chromatographischen Trennung Dispersion Peakverbreiterung in der Saule bedingt durch Stofftransportphanomene Drift langfristige Anderung der Basislinie EC elektrochemischer Detektor (HPLC)

XIV ECD

Abkiirzungen, Akronyme, Begriffe

elektrochemischer Detektor (HPLC) Elektroneneinfangdetektor (electron capture detector) in der G C EDDY-Diffusion Term der van Deemter-Gleichung. (Beschreibt die Durchmischung von Substanzen in den Hohlraumen der stationaren Phase) FlieOmittel (= mobile Phase) bei der Chromatographie Eluent Eluotrope Reihe Zusammenstellung von FlieBmitteln, geordnet nach Elutionskraft. Gilt nur fur die spezifizierte Phase, also an A1203anders als bei RP-Material Elutionsprofil Zeitabhangiges Konzentrationsprofil einer Substanz beim Verlassen der Saule Reaktion eines bereits derivatisierten Kieselgels (z. B . Endcapping RP-18) mit kurzkettigen Silanolen. Dadurch wird die Zahl der freien OH-Gruppen und damit die Polaritat vermindert elektroosmotischer FluB EOF electrospray interface ESI fast atom bombardment; Ionisierungsart bei der MassenFAB spektrometrie FID Flammenionisationsdetektor (GC, SFC) Fourier Transformations Infrarot Spektroskopie FTIR Gaschromatographie GC Gradientenelution Arbeitsweise bei der HPLC, bei der die FlieBmittelzusammensetzung geandert wird height equivalent to a theoretical plate; Bodenhohe HETP high performance thin layer chromatography; HochleiHPTLC stungsdunnschichtchromatographie hyphenated methods Ausdruck fiir Kopplungsmethoden (LC-MS, GC-MS etc.) Ionenaustausch-Chromatographie chromatographische Trennung von Ionen an Ionenaustauschern als stationarer Phase Ionenpaar (ion pair) ungeladenes Paar aus einem Anion (A-) und einem Kation (K'), das in organischen Eluenten loslich ist Ionenpaar-Chromatographie chromatographische Trennung von Ionen durch Zusatz von Ionenpaar-Reagenzien zur mobilen Phase isokratisch HPLC-Arbeitstechnik mit konstanter FlieOmittelzusammensetzung

Abkiirzungen, Akronyme, Begriffe

xv

Kapazitatsfaktor (k’-Wert) beschreibt das AusmaB der Retardierung einer Substanz Matrix Medium (Lebensmittel, Wasser, Bodenprobe), aus dem die Analyten isoliert werden miissen moving belt interface; veraltetes Interface zur LC-MSMBI Kopplung MEKC Micellare elektrokinetische Chromatographie NMR Nuclear Magnetic Resonance NP Normalphase; HPLC an Kieselgelphasen Octadecylsilan; stationare Phase in der RP-ChromatoODS graphie, hergestellt durch Derivatisierung von Kieselgel mit C-18-Ketten Particle Beam (PB) Interface zur LC-MS-Kopplung PTFE Polytetrafluorethylen (Teflon) Rauschen (noise) Schwankungen des Detektorsignals: meist bedingt durch elektronische Effekte Wiederherstellen; beschreibt bei Saulen z. B. SpiilvorRegenerieren gange, durch die die ursprungliche Trennleistung wiederhergestellt wird Retentionsvolumen Volumen von der Injektion bis zum Peakmaximum Retentionszeit Zeit von der Injektion bis zum Peakmaximum Reversed Phase Chromatographie (RPC) Chromatographie an Umkehrphasen, d. h. an lipophilen Phasenmaterialien (z. B. silanisierten Kieselgelen oder druckstabilen Polymeren) a. die Fahigkeit eines Phasensystems, zwischen zwei SubSelektivitat stanzen zu unterscheiden, bzw. b. die Fahigkeit eines Detektors, nur bestimmte Substanzen zu detektieren Supercritical Fluid Chromatography: Chromatographie SFC mit iiberkritischen Gasen als mobiler Phase Supercritical Fluid Extraktion; Extraktion mit iiberkritiSFE schen Gasen Solid Phase Extraction = Festphasenextraktion SPE alle Volumina einer HPLC-Anlage nach der ProbenaufTotvolumen gabe, die keine stationare Phase enthalten Zeit, die eine Substanz, die keine Wechselwirkung mit Totzeit der stationaren Phase hat, von der Injektion bis zum Peakmaximum braucht UVNIS-Detektor photometrischer HPLC-Detektor

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1 Gefahrstoffverordnung und Arbeitssicherheit 1.1 Einleitung ,,Die Aufgaben der Analytischen Chemie haben sich in den letzten Jahren stark verandert und erweitert. So ist die Analytische Chemie von einer lediglich retrospektiv betrachtenden zu einer diagnostizierend gestaltenden Wissenschaft geworden und spielt eine immer wichtigere Rolle bei der Charakterisierung und Beschreibung von sich verandernden chemischen und biologischen Systemen. Die Gesellschaft und die ihr dienende Technik benotigt analytische Aussagen in allen Bereichen der Naturwissenschaften, im Umweltschutz, in der Biologie, Medizin, Pharmazie, Pharmakokinetik, in den Geowissenschaften, in der chemischen und biologischen Prozepkontrolle, den Nahrungswissenschaften, der Forensik und den Materialwissenschaften" [ 1-11. Diese umfassende Aufgabenstellung wird in analytischen Laboratorien rnit Hilfe verschiedener Verfahren und unter Einsatz z. T. extrem gefahrlicher bzw. toxischer Substanzen bearbeitet, wenn auch das Gros der Arbeitsvorgange nicht problematischer ist als in anderen chemischen Laboratorien. Die Riickstandsanalytik von phenolischen Verbindungen beispielsweise, wie sie als Metabolite von Pestiziden im Boden vorkommen, erfordert in der Regel eine Derivatisierung rnit Diazomethan zu den entsprechenden Ethern zur Verminderung der Polaritat des Metaboliten, um diesen rnit Hilfe der GC/ MS-Kopplung spezifisch nachweisen zu konnen. Diazomethan wie auch andere Methylierungsmittel sind ebenso extrem reaktiv gegenuber Biomolekiilen (z.B. DNA), was fur ihre mutagenen und cancerogenen Wirkungen verantwortlich ist. Bei Analysen mittels HPLC spielen allerdings die Derivatisierungsreaktionen eine weit untergeordnetere Rolle als in der GC-Technik, was naturgemaD zu einer Erhohung der Arbeitssicherheit beitragt. Es darf jedoch nicht ubersehen werden, daD in keinem analytischen Labor nur das eine oder andere Verfahren zum Einsatz kommt. Der rnit HPLC beschaftigte Analytiker arbeitet zur gleichen Zeit auch mit GC-Methoden, oder im gleichen Laboratorium sind andere Beschaftigte rnit solchen Techniken befafit, so daD die Gefahrenpotentiale auf alle Beschaftigten einwirken konnen. Ein anderes Problem stellen die zu bestimmenden Analyte dar. Die ,,Dioxin-Analytik" ist hier ein herausragendes Beispiel. Fur die Qualitatssicherung des Dioxinnachweises werden die Probenextrakte mit I3C-markierten und an den 2, 3, 7, 8-Positionen halogenierten Dibenzo-p-dioxinen und -furanen als interne Standards dotiert. Nach einem komplizierten Clean-up werden die

2

1 Gefahrstoffverordnung und Arbcitssichcrheit

"C- bzw. "C-markierten Kongenere rnit Hilfe der GUMS (SIM) bestimmt. Hier mu13 der Analytiker besondere Gefahrstoffe in hoheren Konzentrationen (Standards) handhaben: Stoffe, die anderswo wegen ihrer Gefahrlichkeit (Toxizitat) verboten sind. Gleiches gilt etwa bei der Bestimmung von Methylquecksilber, bleiorganischen Verbindungen, Cadmiumchlorid u. a., um diese Beispiele auch auf die anorganische bzw. Elementanalytik auszudehnen. Kann sich der Analytiker beim Umgang rnit gefahrlichen Standards und Reaktanden noch besonders schutzen, indem er die Arbeiten unter eigens dafur ausgelegten Abzugen in speziellen Sicherheitslaboratorien (,,DioxinLabor") ausfuhrt. so wird er in vielen Fallen rnit gefahrlichen Substanzen konfrontiert, ohne da13 er daruber immer Kenntnis erlangt: bei den Proben. Erhalt ein Umweltlabor eine Abfall- oder Altlastenprobe mit dem Auftrag, darin neben einer Reihe von Parametern auch die ,,Dioxine" zu bestimmen, so sind die Mitarbeiter gewarnt. Sie werden die Proben rnit der genugenden Vorsicht behandeln, um sich und ihren Arbeitsplatz vor einer Kontamination zu schutzen. Erhalt das Labor jedoch diese Probe ohne diesen besonderen Zusatzauftrag, so ist zwar dieselbe Menge an ,,Dioxinen" in dieser Probe enthalten, aber sie wird wie jede andere dioxinfreie Probe behandelt. Es ware wahrscheinlich unrealistisch, zu verlangen, jede unbekannte Analysenprobe als dioxinkontaminiert zu behandeln. Die Analysen waren unbezahlbar, und nur wenige Laboratorien konnten die Investitionen tatigen, um sich zu Sicherheitshochburgen aufzurusten. Dennoch zeigt dieses Beispiel, daS immer mit genugender Vor- und Umsicht umgegangen werden muB, damit aus Sorglosigkeit keine toxikologischen und Gesundheitsprobleme entstehen. Neben diesen chemischen Gefahrenpotentialen sind in Abhangigkeit von den durchgefuhrten Analysen bzw. eingesetzten Methoden rnit ionisierenden Strahlen (Rontgenquellen, (13Ni in Elektroneneinfangdetektoren, 'H und "C als offene Strahlungsquellen rnit Inkorporationsmoglichkeit), Enzymen (ELISA, Immunoassays), Mykotoxinen und Mikroorganismen etwa bei Proben aus Sanierungsfallen zu rechnen. Daher kommt der Gefahrstoffverordnung als einer Sammlung zwingend zu befolgender Regeln zum Schutz der Gesundheit der Beschaftigten am analytischen Arbeitsplatz wie auch zum Schutz der Umwelt eine grol3e Bedeutung zu.

1.2 Gefahrstoffverordnung (GefStoffV) Die am 01.11.1993 in Kraft getretene Novelle der Gefahrstoffverordnung gliedert sich in neun Abschnitte und sechs Anhange [l-21:

1.2 Gefahrstoffverordnung(GefStoffV)

3

1. Zweck, Anwendungsbereich und Begriffsbestimmungen 2. Einstufung von Chemikalien 3. Kennzeichnung und Verpackung beim Inverkehrbringen 4, Verbote und Beschrankungen 5. Allgemeine Umgangsvorschriften fur Gefahrstoffe 6. Zusatzliche Vorschriften fur den Umgang mit krebserzeugenden und erbgutverandernden Gefahrstoffen 7. Behordliche Anordnungen und Entscheidungen 8. Straftaten und Ordnungswidrigkeiten 9. SchluSvorschriften Zweck der Gefahrstoffverordnung ist es, durch Regelungen uber die Einstufung, Kennzeichnung und Verpackung von gefahrlichen Stoffen, Zubereitungen und bestimmten Erzeugnissen sowie uber den Umgang mit Gefahrstoffen den Menschen vor arbeitsbedingten und sonstigen Gesundheitsgefahren und die Umwelt vor stoffbedingten Schadigungen zu schutzen, insbesondere die Gefahren erkennbar zu machen, sie abzuwenden und ihrer Entstehung vorzubeugen, soweit nicht in anderen Rechtsvorschriften besondere Regelungen getroffen sind. Wahrend der zweite Abschnitt der GefStoffV kaum Bedeutung fur das analytische Labor hat, ist im dritten Abschnitt die Kennzeichnung (Etikettierung) von Gefahrstoffen wichtig. Der vierte Abschnitt enthalt Herstellungs- und Verwendungsverbote fur verschiedene Chemikalien, funfter und sechster Abschnitt enthalten Vorschriften fur den Umgang mit Gefahrstoffen im allgemeinen sowie mit krebserzeugenden und erbgutverandernden Gefahrstoffen im speziellen. Diese drei Abschnitte sind deshalb von besonderer Bedeutung. Die Regelungen des siebten bis neunten Abschnitts besitzen fur das analytische Labor nur eine geringe Bedeutung. Die GefStoffV umfal3t im dritten bis funften Abschnitt meist abstrakte Begriffe, deren Inhalt bereits in anderen, schon langer existierenden Regeln, Richtlinien und Verordnungen detailliert aufgefuhrt ist. Insbesondere die Pflicht zur regelmal3igen Unterweisung, Angaben uber hygienische MaBnahmen und Vorschriften zur Lagerung von Gefahrstoffen finden wir auch in den Unfallverhutungsvorschriften (UVV), - den Laborrichtlinien, - der Verordnung uber brennbare Flussigkeiten (VbF) und den entsprechenden Technischen Regeln (TRbF), - der Druckbehalterverordnung und den entsprechenden Technischen Regeln (TRG), - den Technischen Regeln uber gefahrliche Arbeitsstoffe (TRgA). -

4

1 Gefahrstoffverordnung und Arbeitssicherheit

Nach der Veroffentlichung der GefStoffV wurden weitere Technische Regeln (Technische Regeln fur Gefahrstoffe, TRGS) erlassen, die zum Teil die TRgA ersetzt haben. Eine dieser Technischen Regeln ist die TRGS 451: ,,Urngang mit Gefahrstoffen im Hochschulbereich", in Instituten also, in denen die Analytik oft einen Arbeitsschwerpunkt darstellt [l-31.

1.3 Aufbau eines Chemikalienkatasters Die GefStoffV schreibt in (5 16 (3a) vor, vorhandene Gefahrstoffe in einem Kataster zu erfassen. Es erweist sich als vorteilhaft, dieses Kataster mit Hilfe der EDV zu fuhren. Das Kataster muB von jeder Chemikalie folgende Daten enthalten:

- Bezeichnung - Kennzeichnung (Gefahrensymbol, WS-Satze) - Menge (zumindest die Groflenordnung) - Arbeitsbereiche, in denen mit dem Gefahrstoff umgegangen wird (z. B. Labornummer) Da grundsatzlich davon auszugehen ist, daB alle venvendeten Chemikalien auch gelagert werden, sind auch die Angaben zur Lager- und Wassergefahrdungsklasse empfehlenswert, um Zusammenlagerungsverbote leicht zu uberblicken. Zum schnelleren Suchen empfiehlt es sich, die CAS-Nummer sowie ggf. die Summenformel mitzuerfassen. Die genannten Daten lassen sich von fast allen Chemikalien schon vor der Bestellung aus den Chemikalienkatalogen der Hersteller entnehmen. Diese Kataloge werden heute teilweise auch auf elektronischen Datentragern (Diskette, CD-ROM) angeboten. Die Vorteile der Datenverwaltung per EDV gegenuber den fruher ublichen Karteikarten liegen auf der Hand: -

-

die Moglichkeit des automatischen Suchens nach verschiedenen Parametern (z. B. Suchen des Chemikaliennamens, insbesondere aber auch Suchen von bestimmten R- und S-Satzen, Gefahrensymbolen etc.) die Moglichkeit des automatischen Sortierens die Moglichkeit des Erstellens von Inventarlisten der verschiedenen Laboratorien

Entscheidend fur die Arbeitssicherheit im Umgang mit Chemikalien ist die richtige Etikettierung der Chemikaliengebinde. Wahrend die GefStoffV nur die Etikettierung von Gefahrstoffgebinden vorschreibt, ist es dringend zu

1.4 Priifung des Einsatzes alternativer Arbeitsweisen

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empfehlen, alle Chemikaliengebinde zu etikettieren. Dabei sind Art und Umfang der Etikettierung von der Aufbewahrungsdauer abhangig. Chemikaliengebinde, die sich im Arbeitsgang befinden, brauchen nicht etikettiert zu werden, wenn die standige Uberwachung durch eine Person gewahrleistet ist. Die Gebinde der Chemikalien, die bereitgestellt werden, mussen mindestens mit dem Chemikaliennamen und dem Gefahrensymbol gekennzeichnet werden. Dabei gilt als Bereitstellung ein Aufbewahrungszeitraum von 24 Stunden, langstens aber bis zum Ende des folgenden Arbeitstages. Alle Chemikaliengebinde, die langer aufbewahrt werden (und das sind fast alle!), mussen mindestens mit dem Chemikaliennamen, den Gefahrensymbolen sowie den R- und S-Satzen (Zahlen und Text) gekennzeichnet werden. Weitere Angaben sind empfehlenswert, wie z. B. Lagerklasse, Wassergefahrdungsklasse, Labornummer. Auf dem Markt werden Etikettierungsprogramme angeboten. Ein hoher Preis sowie teilweise bestimmte Anspriiche an die Hardware stehen der Verbreitung dieser Programme entgegen. Mit geringem Aufwand kann jedoch auch das fur das Chemikalienkataster genutzte Programm zum Drucken von Etiketten umgestaltet und genutzt werden. Anstelle von selbstklebenden Etiketten hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Etiketten auf normales Schreibpapier zu drucken, und sie mit einer Klarsichtfolie auf die Gebinde aufzukleben. So ist gewahrleistet, daB die Schrift nicht durchTropfen und Spritzer, die auf das Etikett gelangen, verwischt wird. AuBerdem lassen sich diese Etiketten ohne groBen Aufwand wieder ablosen, wahrend normale Klebeetiketten oft Klebereste hinterlassen, die nur schwer zu entfernen sind. Die richtige Etikettierung schutzt nicht nur denjenigen, der mit der Chemikalie umgeht, sondern sie erleichtert auch die Entsorgung nicht mehr benotigter Chemikalien.

1.4 Priifung des Einsatzes alternativer Arbeitsweisen und Ersatzstoffe § 16 Abs. 2 und 4 der GefStoffV fordert vom Arbeitgeber, die Moglichkeit des Einsatzes von alternativen Stoffen rnit geringerem gesundheitlichen Risiko zu priifen. In der Analytik bedeutet eine derartige stoffliche Anderung einen gravierenden Eingriff in erprobte oder genormte Analysenverfahren. Da jedoch viele Untersuchungen nach gesetzlich vorgegebenen Analysenvorschriften (z. B. DIN, DEV, DFG u. a.) durchgefuhrt werden mussen, ist es fur das einzelne Laboratorium oft schwierig, Alternativverfahren einzusetzen. Es gibt dennoch Moglichkeiten, diesem gesetzlichen Gebot nachzukommen. In der organischen Ruckstandsanalytik werden z. B. noch haufig chlorierte Losungsmittel bei der Probenaufarbeitung verwendet. Durch vergleichende

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I Gefahrstoffverordnung und Arbeitssicherheit

Untersuchungen konnte gezeigt werden, daS bei der Pflanzenschutzmittelanalytik nach der DFG S19-Methode ein Ersatz von Dichlormethan durch nichtchlorierte Losungsmittel durchaus moglich ist [ 1-4, 1-51. Da das Abweichen von bestehenden und erprobten Analysenverfahren nicht zu Lasten der Analysenqualitat gehen darf, mussen derartige Neuerungen durch aufwendige Arbeiten zur analytischen Qualitatssicherung begleitet werden. Hier sind insbesondere die Gremien gefordert. Analysenvorschriften fur behordliche Uberwachungszwecke zu erarbeiten und auf ihre Zweckma13igkeit hin zu bewerten. Neben dem Bereich der reglementierten Uberwachungsanalytik gibt es jedoch einen weiten Bereich von analytischen Verfahren, die durch den Analytiker im Labor meist in Anlehnung an die Literatur durchgefuhrt werden. Unter Berucksichtigung der hohen Anspruche an die Analytik sollten hier die wichtigsten Forderungen der GefStoffV bei der Entwicklung und Durchfuhrung von Analysenverfahren berucksichtigt werden. Ein wichtiger Grundsatz sollte es sein, den Gesamtumsatz an Chemikalien zu minimieren. Dies bedeutet den verstarkten Einsatz von Mikromethoden, Minichromatographiesaulen und Kartuschen unter Berucksichtigung der Reprasentativitat der Laborprobe. Die Festphasenextraktion wie auch der Einsatz der Microbore-Technik in der HPLC sind Beispiele dafur, wie der Einsatz von Losemitteln minimiert werden kann. Das als ,,Zuricher Modell" an der Universitat Zurich eingefuhrte, praktisch sonderabfallfrei gestaltete Praktikum [ 1-61 kann fur analytisch arbeitende Laboratorien als Vorbild dafur dienen, daS bei konsequenter Uberprufung aller Arbeitsvorschriften im Labor groBe Einsparungspotentiale an Chemikalien, Energie und Wasser vorhanden sind. Gleichzeitig werden damit Probleme der Abfallentsorgung und der Arbeitsplatzhygiene (MAK) entscharft. Sind Arbeiten mit groSeren Losungsmittelmengen nicht zu umgehen, mussen diese in Abzugen durchgefuhrt werden. So konnen Soxhlet-Extraktoren, Siiulen zu Clean-up-Zwecken und komplette Chromatographieanlagen (z. B. Gelpermeationschromatographie, GPC) in Abzugen aufgebaut werden. Tischabzuge stellen eine relativ preisgunstige Alternative dar. Die positiven Auswirkungen auf die Konzentrationen von Schadstoffen am Arbeitsplatz sind beim Einsatz von moglichst geschlossenen Systemen am starksten zu verzeichnen. Der Einsatz von Losungsmitteln in Kalt- oder HeiSextraktoren (z. B. Soxhlet-Extraktor), d. h. in Glasapparaturen mit Schliffverbindungen fuhrt zu Verlusten und damit zu einer Kontamination von Laborraumen. Neben den Problemen der Arbeitsplatzhygiene stellt die Abfallentsorgung der Losungsmittel einen kritischen Bereich dar. Hier kann der Ersatz von Losungsmitteln durch neue, zu evaluierende Extraktionstechniken, wie die uberkritische Fluidextraktion (SFE), einen moglichen Losungsweg darstellen. Uberall dort. wo eine grol3e Probenanzahl mit Hilfe einer uberschaubaren Anzahl von Analysenmethoden untersucht wird, ist es besonders vielver-

1.5 Gefahren bei der Untersuchung von Proben

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sprechend, alternative Arbeitsweisen und Ersatzstoffe einzufuhren. Das weitere Vordringen von Laborrobotern, Automaten und von Computersteuerungen im Bereich ,,automatisch" arbeitender Analysenlaboratorien kann vorteilhaft rnit Vorgaben der GefStoffV in Einklang gebracht werden.

1.5 Gefahren bei der Untersuchung von Proben In analytisch arbeitenden Laboratorien hat man in der Regel rnit vielen unterschiedlichen Arbeitsvorgangen und Methoden zu tun. Je nach inhaltlicher Ausrichtung des Labors werden physikalische, biochemische, anorganischund/oder organisch-chemische Analysenverfahren durchgefuhrt. Bei der oft groBen Anzahl von Untersuchungsparametern, die bei zu bearbeitenden Proben bestimmt werden, liegt das Gefahrdungspotential, das von der Probenbearbeitung durch das Laborpersonal ausgeht, vor allem in der sehr grooen Anzahl verschiedener Arbeitsschritte. Der Unsicherheitsfaktor Mensch spielt deshalb gerade in analytischen Laboratorien auch bei gut ausgebildetem Personal eine nicht zu vernachlassigende Rolle. Die Erstellung von Betriebsanweisungen stellt eine wichtige Maonahme dar, um sicherheitsrelevante Arbeiten rnit Chemikalien im Sinne der GefStoffV fur Arbeitnehmer ungefahrlicher zu gestalten. An dieser Stelle sollte erwahnt werden, dal3 die ,,Gute Labor-Praxis" (GLP) [ 1-71 mit ihrem Konzept der ,,Standard Operation Procedure" (SOP) eine entsprechende Absicht wie die GefStoffV verfolgt. Allerdings steht hier die Analysenqualitat bzw. die Produktqualitat im Vordergrund. Es sollten zumindest folgende ,,Betriebsanweisungen fiir Arbeiten mit Chemikalien " ausgearbeitet werden: - Abfullen von Losungsmitteln (Lagerhaltung, Losungsmittel fur den taglichen Gebrauch) - Handhabung besonders gefahrlicher Losungsmittel (Ersatz von Benzol, Testen von Diethylether auf Peroxide etc.) - Arbeiten rnit Chemikalien unter kritischen Bedingungen (Nutzung elektrischer Heizquellen zusammen rnit Liisungsmitteln, Rotationsverdampfer, Arbeiten rnit offener Flamme, Arbeiten im und auBerhalb des Abzugs etc.) - Herstellung von Standardlosungen (Handhabung von reinen Substanzen wie PSM, PAK und Nitrosaminen) - Aufarbeiten von Reststoffen, Vorbereitung fur die Entsorgung So wie Betriebsanweisungen im Bereich des Umgangs rnit Chemikalien einen Faktor zum sicheren Arbeiten im analytischen Labor darstellen, so konnen Betriebsanweisungen fur die Geratenutzung direkt oder indirekt zur Steige-

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1 Gefahrstoffverordnung und Arbeitssicherheit

rung der Sicherheit beitragen. In diesem Bereich konnen folgende Beispiele fur Betriebsanweisungen aufgezeigt werden:

- Diagnose-/Not-Aus-Anweisungen fur komplizierte Analysensysteme, um bei Abwesenheit des Bedieners eine ,,Notfallbedienung" zu gewahrleisten - Benutzerhandbucher fur verschiedenste technische Gerate (Wartung, Storungen, Reparaturen, Service u. a.) Bei der Bearbeitung von Proben unbekannter Herkunft sind alle jeweils notwendigen Sicherheitsaspekte zu beriicksichtigen, insbesondere das Tragen von Handschuhen beim Umgang mit Abwasserproben (krankheitserregende Bakterien) und Deponieproben (hochtoxische Verbindungen). Gerade in den hoch arbeitsteiligen Untersuchungslaboratorien werden z. B. in Umweltproben eine ganze Reihe von Parametern bestimmt. In diesem Zusammenhang ist durch ein geeignetes Probenbegleitscheinverfahren sicherzustellen, dalS jeder, der mit der Bearbeitung der Proben zu tun hat, uber mogliche, von der Probe ausgehende Gefahren informiert ist. Besondere Gefahrenmomente miissen an den Probenbehaltnissen deutlich gekennzeichnet werden. Zusatzlich kann die Erstellung einer Arbeitsanweisung an das Laborpersonal fur ,,besondere Proben" hilfreich sein. Gefahrstoffe in Proben stellen in Abhangigkeit von den jeweiligen Ruckstandsgehalten einen Problembereich sowohl fur die Probenbearbeitung als auch fur die Entsorgung dar. Besonderer Beriicksichtigung bedurfen: Dioxine und Furane (chloriert und bromiert) chlorierte Umweltchemikalien (z. B. PCB, Chlorphenole, PCP) - pathogene Mikroorganismen - Arzneimittelruckstande - Radioisotope - Pestizide - toxische Elemente -

Im analytischen Labor gibt es eine Reihe spezieller Gefahrenmomente, die zur Freisetzung von Gefahrstoffen fuhren konnen. Fur alle als kritisch zu beurteilenden Arbeitsbereiche sollten detaillierte Betriebsanweisungen geschrieben werden, so da13 sich das Laborpersonal in der taglichen Arbeit an einem schriftlich fixierten ,,Sicherheitsleitfaden" orientieren kann. Hierzu zahlen exemplarisch: -

Glasbruch in elektrisch beheizten Apparaturen mit der Gefahr des Laborbrandes (z. B. bei Soxhlet-Apparaturen) Trockenschranke zur Trockengewichtsbestimmung mit der Gefahr der Freisetzung fluchtiger toxischer Bestandteile (AnschlulS an die Entluftung)

1.6 Allgemeine Laboranweisungen

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- Arbeiten unter vermindertem Druck rnit der Gefahr der Implosion (Glasgerate mit unbeschadigter Oberflache, wirksamer Splitterschutz an Rotationsverdampfern) - Arbeiten mit konzentrierten Sauren und anderen atzenden Stoffen (haufige Gefahrenquelle im analytischen Labor, besonders der Schutz der Augen durch Schutzbrillen oder Gesichtsschilde ist angezeigt) - Transport von Chemikalien und Proben in geeigneten Transportbehaltern (Sicherheitsverpackung bei hochtoxischen Substanzen) - Ansetzen von Standardlosungen und Arbeiten rnit hochtoxischen Verbindungen (halogenierte Dioxine und Furane)

1.6 Allgemeine Laboranweisungen a) Aus Sicherheitsgrunden ist es verboten, im Labor allein zu arbeiten. - Bei einem eventuellen Unfall, Verletzung oder Vergiftung mu13 Erste Hilfe geleistet bzw. Hilfe geholt werden. - Da man rnit anderen zusammenarbeitet, ist man durch deren Unachtsamkeit ebenso gefahrdet, wie die anderen durch die eigene Unachtsamkeit . b) Personliche Indispositionen konnen zu einer Erhohung der Gefahren beitragen. - Krankheiten durch Schwindel, Krampfe, Ohnmacht - Schwangerschaft c) Man arbeitet rnit Chemikalien, die nach GefStoffV als Gefahrstoffe gelten. - Giftigkeit (akut oder chronisch) - Brennbarkeit - Explosivitat - atzende Wirkung d) Man arbeitet rnit verschiedenen Arten von Apparaturen, die zur Erhohung des Gefahrenmomentes beitragen konnen. - elektrische Gerate - Glasgerate - Gasbrenner (offene Flammen) Es ist daher dringend erforderlich, daS die Laborrichl inien fur I ie Arbeitssicherheit unbedingt eingehalten werden. Hierzu gehoren zurnindest:

Verbot der Nahrungsaufnahme und des Rauchens - Im gesamten, genau festzulegenden Laborbereich durfen Nahrungsmittel und Getranke weder aufbewahrt noch verzehrt werden. -

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1 Gcfahrstoffvcrordnungund Arbeitssicherheit

- Die Aufbewahrung von Speisen und Getranken in Chemikalien- oder LaboratoriumsgefaBen ist nicht erlaubt. Insbesondere bei Proben in Getrankeflaschen kann es leicht zu Verwechslungen kommen. - Im analytischen Laboratorium gilt ein absolutes Rauchverbot. - Voraussetzung fur die Unterweisung von Mitarbeitern ist die Kennzeichnung von Raumen (Labor-, MeB- und Buro- bzw. Aufenthaltsraume) rnit einer genauen Definition der Nutzung. -

Einhaltung von Hygienemafinahmen Nach Beendigung der Laborarbeit sind die Hande grundlich rnit Wasser und Seife zu waschen. Labor- und StraBenkleidung mussen getrennt aufbewahrt werden. Da man in den Arbeitsbereichen im Labor immer rnit einer Kontamination von Arbeitsflachen und Geraten rechnen muB, sollten in regelmaBigen Zeitraumen die Arbeitsflachen und Gerate gereinigt werden. Durch Analyse von Wischproben kann der Kontaminationsgrad des Labors kontrolliert werden [l-81.

Benutzung der personlichen und gebaudeseitigen Schutzeinrichtungen Eine Schutzbrille mit Spritzschutz oben und an den Seiten sowie rnit bruchsicheren Glasern ist im Labor grundsatzlich zu tragen. - Laborkittel aus Baumwolle oder anderen schwerentflammbaren Materialien, dazu allgemein Kleidung aus ebenfalls schwerentflammbarem Material, insbesondere rnit geringem Kunstfaseranteil. Der Kittel ist stets geschlossen zu tragen und sollte aul3erhalb der Laboratorien (Sozialraume, Bibliothek etc.) nicht getragen werden. - Tragen von geschlossenen Schuhen rnit rutschfester Sohle (keine Sandalen, Pumps etc.) - Bei Bedarf Benutzung von chemikalienbestandigen Schutzhandschuhen. - wichtig: Schutzhandschuhe sind potentiell immer kontaminiert. Darum durfen damit Gegenstande, wie z. B. Turklinken, Telefone, Treppengelander etc. nicht beruhrt werden, um eine Ubertragung von Kontamination zur ungeschutzten Haut zu vermeiden! - Ein korrekt benutzter Abzug bietet den groBtmoglichen Schutz vor Gefahrdungen. - Vor Beginn der Arbeitsaufnahme sollte sich jeder uber Lage und Funktion der Sicherheitseinrichtungen informieren: - Notausgange, Fluchtwege - Feuermelder, Alarmanlagen, wichtige Telefonanschlusse - Feuerloscher, Loschdecke, Not-Aus-Schalter - Erste-Hilfe-Kasten, Augenspulflaschen, Notduschen -

1.7 MAK-, BAT- und TRK-Werte, Ausloseschwellen

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Richtiger Umgang rnit Chemikalien Die meisten Chemikalien, insbesondere alle unbekannten, sind als Gefahrstoffe anzusehen und entsprechende Sicherheitsmafinahmen einzuhalten. - Es ist verboten, Flussigkeiten rnit dem Mund zu pipettieren. - Hautkontakt mit Chemikalien ist strikt zu vermeiden. - Chemikalien sollten nach Moglichkeit in der Originalverpackung belassen werden, ansonsten durfen sie nur in geeigneten, korrekt beschrifteten Gefafien aufbewahrt werden. Auf keinen Fall diirfen Chemikalien in Behaltern aufbewahrt werden, die ublicherweise zur Aufnahme von Nahrungsmitteln bestimmt sind. - Vorratshaltung von Chemikalien uber die standig benotigte Menge hinaus sollte vermieden werden. - Beim Transport glaserner Chemikalienbehalter ist die Bruchgefahr zu beachten. Flaschen durfen nie am Hals getragen werden. Nach Moglichkeit sollten Chemikalienbehalter in Eimern, Korben etc. transportiert werden. - Entnommene Chemikalien diirfen nicht wieder in das VorratsgefaB zuruckgefullt werden. - Beim Umgang rnit brennbaren Fliissigkeiten sind alle Zundquellen, insbesondere offene Flammen, aus der Umgebung zu entfernen. - Auch kleinere Brande in chemischen Laboratorien konnen gefahrliche Folgereaktionen mit dort gelagerten Chemikalien bewirken. - Die Herstellung von und der Umgang rnit Explosivstoffen im Sinne des Sprengstoffgesetzes (d. h. Initialzunder wie Schwermetallazide etc.) ist verboten. -

1.7 MAK-, BAT- und TRK-Werte, Ausloseschwellen Die Maximale Arbeitsplatzkonzentration (MAK ) ist die Konzentration eines Stoffes als Gas, Dampf oder Schwebstoff in der Luft am Arbeitsplatz, bei der im allgemeinen die Gesundheit der Arbeitnehmer nicht beeintrachtigt wird. Die Technische Richtkonzentration ( T R K ) ist die Konzentration eines gentoxischen Stoffes als Gas, Dampf oder Schwebstoff in der Luft am Arbeitsplatz, die nach dem Stand der Technik erreicht werden kann, die jedoch nichts daruber aussagt, ob dabei die gentoxische Wirkung wirklich auch ausgeschlossen ist. Der Biologische Arbeitsplatztoleranzwert(BAT) ist die Konzentration eines Stoffes oder seines Umwandlungsproduktes im Korper oder die dadurch ausgeloste Abweichung eines biologischen Indikators von seiner Norm, bei der im allgemeinen die Gesundheit der Arbeitnehmer nicht beeintrachtigt wird. Die Ausloseschwelle ist die Konzentration eines Stoffes in der Luft am Arbeitsplatz oder im Sinne des BAT-Wertes im Korper, bei deren Uberschrei-

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1 Gefahrstoffverordnung und Arbeitssicherheit

tung zusatzliche MaBnahmen zum Schutze der Gesundheit erforderlich sind. Der Uberschreitung der Ausloseschwelle steht es gleich, wenn ein unmittelbarer Hautkontakt besteht. Die Unterschreitung der Ausloseschwelle kann in Laboratorien unterstellt werden, wenn alle Arbeiten mit Gefahrstoffen (Abwiegen, Abmessen, Umfullen, Reinigen, Entsorgen, Erfassen von Dampfen) unter einem Abzug rnit moglichst weit geschlossenem Frontschieber durchgefuhrt werden und die erforderliche personliche Schutzausrustung (insbesondere Schutzhandschuhe) getragen wird. Gerade die zahllosen Gerate in vielen analytischen Laboratorien lassen es aber nicht mehr zu, daB alle Arbeiten in Abzugen durchgefuhrt werden konnen. Hier ist es notwendig, alle Geratebereiche, in denen Schadstoffe freigesetzt werden konnen, mit einer separaten Absaugung (z. B. direkte Schlauchverbindung zum Abluftsystem) zu verbinden. Gerade in den analytischen Laboratorien, in denen rnit besonders gefahrlichen Stoffen (z. B. Dioxinen) gearbeitet wird, muB uberlegt werden, ob die vorhandenen Abzuge nicht besser durch neuartige Spezialarbeitsplatze ersetzt werden. Diese ebenfalls abgesaugten, aber zusatzlich mit einem Luftschleier arbeitenden Systeme halten nicht nur die Schadstoffe wesentlich besser zuruck, sondern kommen zugleich mit geringerem Luftbedarf im Vergleich zu Abzugen aus. Dadurch konnen bei gleicher Abluftmenge mehr Arbeitsplatze rnit einer hoheren Arbeitssicherheit ausgerustet werden. Besteht der Verdacht, daB die Ausloseschwelle einer Substanz uberschritten wird, fordert die GefStoffV die Messung der Stoffkonzentration. Da diese Messungen, die nur von Personen oder Firmen durchgefuhrt werden durfen, die die notwendige Fachkunde besitzen, relativ teuer sind, sollte man vor der Messung grundlich uberlegen, ob dieses Geld nicht besser fur moderne Technik ausgegeben werden sollte, um die Uberschreitung der Ausloseschwelle sicher zu vermeiden. 1st nicht sicherzustellen, daB die Ausloseschwelle bestimmter Stoffe und Stoffgruppen uberschritten wird, die im Anhang VI der GefStoffV aufgelistet sind (z. B. Benzol, Benzo(a)pyren, Cadmium oder Blei), mussen die Mitarbeiter einer arztlichen Vorsorgeuntersuchung unterzogen werden. Auch durch diese Untersuchungen entstehen Kosten, die durch den Einsatz modernster Technik zu vermeiden sind. Auf die Einhaltung der Beschaftigungsbeschrankungen fur besondere Personengruppen ist dringend zu achten. Dies betrifft insbesondere

- Schwangere und stillende Frauen, - Frauen im gebaflahigen Alter, - Jugendliche und Auszubildende. Grundsatzlich gilt, dalJ diese Personengruppen keinen Umgang rnit besonders gefahrlichen Chemikalien haben durfen (z. B. explosionsgefahrliche, hochentzundliche, sehr giftige, krebserzeugende und fruchtschadigende Chemika-

1.8 Gefahrensymbole und R/S-Satze

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lien). Ausnahmen bestehen nur, wenn die Ausloseschwelle nicht iiberschritten wird und fur Jugendliche und Auszubildende der Umgang mit bestimmten Gefahrstoffen fur die Ausbildung erforderlich ist.

1.8 Gefahrensymbole und WS-Satze Nach 0 3a ChemG werden gefahrliche Stoffe und gefahrliche Zubereitungen mit bestimmten Gefahrlichkeitsmerkmalen bezeichnet :

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explosionsgefahrlich brandfordernd hochentziindlich leichtentziindlich entziindlich sehr giftig giftig mindergiftig (gesundheitsschadlich) atzend reizend sensibilisierend krebserzeugend fruchtschadigend erbgutverandernd sonstige chronisch schadigende Eigenschaften besitzend umweltgefahrlich

Zur Beschreibung und leichteren Erkennung der Gefahrlichkeit solcher Stoffe und Zubereitungen gibt es europaweit abgestimmte, verbindliche Gefahrensymbole, die in der Abb. 1-1gezeigt werden. Auf die besonderen Gefahren und Empfehlungen im Umgang mit Gefahrstoffen machen neben den Gefahrensymbolen die sogenannten R- und SSatze im Klartext aufmerksam. R-Siitze sind Hinweise auf besondere Gefahren (Risiken), S-Satze die dazu gehorigen Sicherheitsratschlage (Sicherheitsempfehlungen) , bei deren Befolgung die Risiken minimiert werden. Von einern Stofs konnen gleichzeitig mehrere Risiken ausgehen. Diese werden durch eine Anhaufung einschlagiger R-Satze zum Ausdruck gebracht. Es gibt auch die Kombination von R-Satzen, wenn aus einem Verhalten das nachste gefahrliche folgt, wie 2.B. R 14/15 reagiert heftig mit Wasser unter Bildung leicht entzundlicher Gase (Na, LiAlH4 etc.). Gleiches ist naturlich auch bei den S-Satzen gegeben.

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1 Gcfahrstoffverordnung und Arbeitssicherheit

E Explosionsgefahrlich

O m Brandfordernd

Atzend

Reizend

Fm

F + M Hochentziindlich

Leichtentziindlich

T + M Mindergiflig

Gifiig

Radioaktiv

Umweltgefahrlich

Sehr Giftig

Abb. 1-1: Gcfahrensymbolc nach ChemG.

Fur schwangere Frauen und Frauen im gebarfahigen Alter sind von besonderer Bedeutung die R-Satze 45, 46, 47 (kann Krebs, vererbbare Schaden, MiBbildungen verursachen) und die zugehorige Sicherheitsempfehlung S 53 (Exposition vermeiden - vor Gebrauch besondere Anweisung einholen). Eine Auflistung aller R- und S-Satze ist im folgenden wiedergegeben.

Hinweise auf die besonderen Gefahren (R-Sake und deren Kombinationen) R1 In trockenem Zustand explosionsgefahrlich. R2 Durch Schlag, Reibung, Feuer oder andere Zundquellen explosionsgefahrlich. R3 Durch Schlag, Reibung, Feuer oder andere Zundquellen besonders explosionsgefahrlich. R4 Bildet hochempfindliche explosionsgefahrliche Metallverbindungen. R5 Beim Erwarmen explosionsfahig. R6 Mit und ohne Luft explosionsfahig. R7 Kann Brand verursachen. R8 Feuergefahr bei Beruhrung mit brennbaren Stoffen. R9 Explosionsgefahr bei Mischung mit brennbaren Stoffen. R 10 Entzundlich. R 11 Leichtentzundlich. R 12 Hochentzundlich. R 13 Hochentzundliches Flussiggas. R 14 Reagiert heftig mit Wasser. R 15 Reagiert mit Wasser unter Bildung leicht entziindlicher Gase.

1.8 Gefahrensymbole und RIS-Satze

R 16 R 17 R 18 R 19 R 20 R 21 R 22 R 23 R 24 R 25 R 26 R 27 R 28 R 29 R 30 R 31 R 32 R 33 R 34 R 35 R 36 R 37 R 38 R 39 R 40 R 41 R 42 R 43 R 44 R 45 R 46 R 47 R 48 R 14/15

R 15/29 R 20121

R 21/22

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Explosionsgefahrlich in Mischung rnit brandfordernden Stoffen. Selbstentzundlich an der Luft. Bei Gebrauch Bildung explosionsfahigerheichtentzundlicher Dampf-Luftgemische moglich. Kann explosionsfahige Peroxide bilden. Gesundheitsschadlich beim Einatmen. Gesundheitsschadlich bei Beruhrung rnit der Haut. Gesundheitsschadlich beim Verschlucken. Giftig beim Einatmen. Giftig bei Beruhrung rnit der Haut. Giftig beim Verschlucken. Sehr giftig beim Einatmen. Sehr giftig bei Beruhrung rnit der Haut. Sehr giftig beim Verschlucken. Entwickelt bei Beruhrung rnit Wasser giftige Gase. Kann bei Gebrauch leicht entzundlich werden. Entwickelt bei Beruhrung rnit Saure giftige Gase. Entwickelt bei Beruhrung rnit Saure sehr giftige Gase. Gefahr kumulativer Wirkungen. Verursacht Veratzungen. Verursacht schwere Veratzungen. Reizt die Augen . Reizt die Atmungsorgane. Reizt die Haut. Ernste Gefahr irreversiblen Schadens. Irreversibler Schaden moglich. Gefahr ernster Augenschaden. Sensibilisierung durch Einatmen moglich. Sensibilisierung durch Hautkontakt moglich. Explosionsgefahr bei Erhitzen unter EinschluS. Kann Krebs erzeugen. Kann vererbbare Schiiden verursachen. Kann MiSbildungen verursachen. Gefahr ernster Gesundheitsschaden bei langerer Exposition. Reagiert heftig mit Wasser unter Bildung leicht entzundlicher Gase . Reagiert rnit Wasser unter Bildung giftiger und leicht entzundlicher Gase. Gesundheitsschadlich beim Einatmen und bei Beruhrung rnit der Haut. Gesundheitsschadlich bei Beruhrung mit der Haut und beim Verschlucken.

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1 Gefahrstoffverordnungund Arbeitssicherheit

R 20/22 Gesundheitsschadlich beim Einatmen und Verschlucken. R 20/21/22 Gesundheitsschadlich beim Einatmen, Verschlucken und Beruhrung rnit der Haut. R 23/24 Giftig beim Einatmen und bei Beruhrung rnit der Haut. R 24/25 Giftig bei Beruhrung rnit der Haut und beim Verschlucken. R 23/25 Giftig beim Einatmen und Verschlucken. R 23/24/25 Giftig beim Einatmen, Verschlucken und Beruhrung rnit der Haut. R 26/27 Sehr giftig beim Einatmen und bei Beruhrung rnit der Haut. R 27/28 Sehr giftig bei Beruhrung rnit der Haut und beim Verschlucken. R 26/28 Sehr giftig beim Einatmen und Verschlucken. R 26/27/28 Sehr giftig beim Einatmen, Verschlucken und Beruhrung rnit der Haut. R 36/37 Reizt die Augen und die Atmungsorgane. R 37/38 Reizt die Atmungsorgane und die Haut. R 36/38 Reizt die Augen und die Haut. R 36/37/38 Reizt die Augen, Atmungsorgane und die Haut. R 42/43 Sensibilisierung durch Einatmen und Hautkontakt moglich. Sicherheitsratschlage(S-Satze und deren Kombinationen) Unter VerschluB aufbewahren. Sl Darf nicht in die Hande von Kindern gelangen. s2 Kuhl aufbewahren. s3 Von Wohnplatzen fernhalten. s4 Unter ... aufbewahren (geeignete Flussigkeit vom Hersteller s5 anzugeben). Unter ... aufbewahren (inertes Gas vom Hersteller anzugeben). S6 Behalter dicht geschlossen halten. s7 Behalter trocken halten. S8 Behalter an einem gut gelufteten Ort aufbewahren. s9 Behalter nicht gasdicht verschliel3en. s 12 Von Nahrungsmitteln, Getranken und Futtermitteln fernhalten. S 13 Von ... fernhalten (inkompatible Substanzen vom Hersteller S 14 anzugeben). Vor Hitze schutzen. S 15 S 16 Von Zundquellen fernhalten - nicht rauchen. Von brennbaren Stoffen fernhalten. S 17 Behalter rnit Vorsicht offnen und handhaben. S 18 Bei der Arbeit nicht essen und trinken. s 20 Bei der Arbeit nicht rauchen. s 21 Staub nicht einatmen. s 22 GaslRauchlDampWAerosol nicht einatmen (geeignete BezeichS 23 nung(en) vom Hersteller anzugeben).

1.8 Gefahrensyrnbole und R/S-Satze

S 24 S 25 S 26 S 27 S 28 S 29 S 30 s 33 s 34 s 35 S 36 s 37 S 38 s 39 S 40 S 41 S 42

s 43 s 44 s 45 S 46

s 47 S 48

s 49 S 50 S 51 S 52 s 53

s 112 s 31719

17

Beriihrung mit der Haut vermeiden. Beriihrung rnit den Augen vermeiden. Bei Beruhrung mit den Augen grundlich rnit Wasser abspulen und Arzt konsultieren. Beschmutzte, getrankte Kleidung sofort ausziehen. Bei Beruhrung rnit der Haut sofort abwaschen rnit vie1 ... (vom Hersteller anzugeben). Nicht in die Kanalisation gelangen lassen. Niemals Wasser hinzugieaen. Maanahmen gegen elektrostatische Aufladungen treffen. Schlag und Reibung vermeiden. Abfalle und Behalter mussen in gesicherter Weise beseitigt werden. Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen. Geeignete Schutzhandschuhe tragen. Bei unzureichender Beluftung Atemschutzgerat anlegen. SchutzbrillelGesichtsschutz tragen. FuBboden und verunreinigte Gegenstande rnit ... reinigen (vom Hersteller anzugeben). Explosions- und Brandgase nicht einatmen. Beim RauchernNerspriihen geeignetes Atemschutzgerat anlegen (geeignete Bezeichnung(en) vom Hersteller anzugeben). Zum Loschen ... (vom Hersteller anzugeben) verwenden (wenn Wasser die Gefahr erhoht, anfugen: Kein Wasser verwenden). Bei Unwohlsein arztlichen Rat einholen (wenn miiglich, dieses Etikett vorzeigen). Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt zuziehen (wenn moglich, dieses Etikett vorzeigen). Bei Verschlucken sofort arztlichen Rat einholen und Verpackung oder Etikett vorzeigen. Nicht bei Temperaturen uber ... "C aufbewahren (vom Hersteller anzugeben). Feucht halten mit ... (geeignetes Mittel vom Hersteller anzugeben) . Nur im Originalbehalter aufbewahren. Nicht mischen mit ... (vom Hersteller anzugeben). Nur in gut gelufteten Bereichen verwenden. Nicht groaflachig fur Wohn- und Aufenthaltsraume zu verwenden. Exposition vermeiden - vor Gebrauch besondere Anweisung einholen . Unter VerschluS und fur Kinder unzuganglich aufbewahren. Behalter dicht geschlossen halten und an einem kuhlen, gut gelufteten Ort aufbewahren.

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1 Cefahrstoffverordnung und Arheitssicherheit

s 3/9

Behalter an einem kuhlen, gut geliifteten Ort aufbewahren. An einem kiihlen Ort entfernt von ... aufbewahren (die Stoffe, mit denen Kontakt vermieden werden mul3, sind vom Hersteller anzugeben). An einem kiihlen, gut geliifteten Ort, entfernt von ... aufbewahS 3/9/14 ren (die Stoffe, mit denen Kontakt vermieden werden mul3, sind vom Hersteller anzugeben). S 3/9/49 Nur im Originalbehalter an einem kuhlen, gut geliifteten Ort aufbewahren. S 3/9/14/49 Nur im Originalbehalter an einem kuhlen, gut geliifteten Ort, entfernt von ... aufbewahren (die Stoffe, mit denen Kontakt vermieden werden muB, sind vom Hersteller anzugeben). s 7/8 Behalter trocken und dicht geschlossen halten. s 7/9 Behalter dicht geschlossen an einem gut gelufteten Ort aufbewahren. S 20/21 Bei der Arbeit nicht essen, trinken, rauchen. S 24/25 Beruhrung rnit den Augen und der Haut vermeiden. S 36/37 Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen. S 36/39 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung und Schutzbrille/ Gesichtsschutz tragen. S 37/39 Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille/ Gesichtsschutz tragen. S 36/37/39 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. S47/49 Nur im Originalbehalter bei einer Temperatur von nicht iiber ... "C (vom Hersteller anzugeben) aufbewahren. S 3/14

1.9 Reduzierung der Schadstoffbelastung in Abwasser und Abluft Die Abgabe von Schadstoffen an Abluft und Abwasser darf keine MaBnahme der Abfallbeseitigung darstellen, sondern sollte durch eine Anzahl gezielter Verfahren und Handlungskonzepte minimiert werden. Der Luftpfad ist im industriellen Bereich durch die TA-Luft geregelt, wird aber bei Laboratorien nicht uberwacht. Das Abwasser von analytischen Laboratorien, in denen rnit wassergefahrdenden Stoffen gearbeitet wird, unterliegt den abwasserrechtlichen Vorschriften des Wasserhaushaltsgesetzes (WHG). Die Uberwachung der Indirekteinleiter erfolgt durch die Kommunen. Werden Schwellenwerte oder gar Grenzwerte der Indirekteinleiterverordnung von einem Analysen-

1.10 VVV (Vermeiden, Vermindern, Verwerten) von Laborabfallen

19

labor uberschritten, kann es fur die Ursachenfindung nutzlich sein, systematisch die Schadstoffquellen zu bilanzieren, wie dies beispielhaft anhand des Abwassersystems der Chemischen Institute der Technischen Universitat Braunschweig durchgefuhrt wurde [1-91. Zur Ermittlung der Ursachen fur die haufigen Uberschreitungen der damaligen Grenz- (5 m e ) bzw. Schwellenwerte (0.5 mg/L) fur AOX wurde eine rasterformige analytische Bestandsaufnahme des Institutsgebaudes rnit Hilfe der Summenparameter EOX und POX vorgenommen. Die Einzelsubstanzen, die zu diesen Summenparametern beitragen, wurden nach Extraktion des Abwassers rnit GC-ECDFID bzw. Headspace GC/MSD weitestmoglich identifiziert und quantifiziert. Durch MaBnahmen zur Eigenuberwachung konnen so wertvolle Informationen uber Kontaminationspfade gewonnen werden. Die Verminderung der Schadstoffbelastung von Abluft und Abwasser kann danach durch eine Reihe konkreter Maonahmen erfolgen, die jedoch stark vom Arbeitsgebiet des analytischen Labors abhangen:

- Abluftfiltration in der Gaschromatographie (nicht zerstorende Detektoren wie ECD, WLD und MS sowie Split- und Septumspulung) - Benutzung von Abzugen rnit Filtereinrichtungen (z. B. Aktivkohle) fur Arbeiten mit besonders toxischen Stoffen (wie Dioxine, radioaktive Stoffe oder cancerogene Substanzen) - Einsatz von Kuhlfallen (z. B. rnit flussigem Stickstoff) in Abluftstromen von Anlagen wie Rotationsverdampfern zur Ruckgewinnung von Losungsmitteln rnit der Moglichkeit, diese zu recyclen - Elimination von CKW aus der Wasserphase der Extraktion, z.B. durch Strippen oder Adsorption an Aktivkohle (beim Chloroformeinsatz bei der Bestimmung methylenblauaktiver Substanzen (MBAS) nach DIN 38 409 H 23 etc.) - Ersatz von Wasserstrahlpumpen durch Membranpumpen bei Arbeiten rnit fluchtigen Schadstoffen, insbesondere bei halogenierten Losungsmitteln

1.10 VVV (Vermeiden, Vermindern, Verwerten) von Laborabfallen und Losungsmittelriickgewinnung Als Abfalle durfen nur solche Chemikalien gelten, die nicht wiederverwendet werden konnen. Hierbei handelt es sich in erster Linie um Probenreste sowie deren Umsetzungsprodukte. Da gerade die modernen analytischen Methoden rnit nur sehr geringen Probenmengen arbeiten, sollten auch die Abfallmengen relativ klein sein. Jedoch erfordert die Probenvorbereitung oft grooere Losungsmittelmengen, z. B. fur die Extraktion. Nach der Extraktion werden

20

1 Gefahrstoffverordnung und Arbcitssicherheit

die Losungsmittel in der Regel mittels Rotationsverdampfer abdestilliert. Soweit diese Losungsmittel nach dem Abdestillieren den Qualitatsanspruchen genugen, konnen sie wieder fur die Probenvorbereitung oder zur Reinigung von Laborglasgeraten eingesetzt werden. Gerade fur die Spurenanalyse sind die wiedergewonnenen Losungsmittel nicht mehr sauber genug. Soweit durch eine zusatzliche Destillation/Rektifikation nicht die erforderliche Reinheit erzielt wird, konnen die Losungsmittel fur diese Arbeitsschritte nicht mehr verwendet werden. Voraussetzung fur die Weitervenvendung ist jedoch, daB alle Losungsmittelreste getrennt gesammelt werden. Sind Losungsmittel erst einmal vermischt, so gelingt es nur schwer, ausreichende Qualitaten zu erzielen [l-lo]. Die mangelnde Auftrennung in Einzelkomponenten ist oft nicht in einer zu Tab. 1-1: Azcotropc iind Zcotrope hinrrcr Mischungcn ausgewiihltcr Liiscmittcl

LeFende:

0 = Azeotrop

0 @

Zeotrop widerspriichliche Literaturangaben

1.10 VVV (Vermeiden, Vermindern, Verwerten) von Laborabfallen

21

geringen Trennstufenzahl der verwendeten Rektifikationskolonne begrundet, sondern ist durch das Auftreten einer Vielzahl von Azeotropen zu erklaren. Diese sind in Tab. 1-1 dargestellt. Wie eigene Untersuchungen zeigen [l-111, ist dieses Verhalten exemplarisch fur gemischte Losungsmittelabfalle. Bei der Rektifikation mit Wasser vermischten Acetonitrils aus der HPLC wird das zugehorige Azeotrop (84 % Acetonitril 16 % Wasser) erhalten. Fur den Qualitatsvergleich wurde dieselbe Mischung aus frischen Acetonitril und Wasser angesetzt. Das recycelte Azeotrop wies im UV-Spektrum bei <220 nm eine gegenuber der Vergleichsmischung leicht erhohte Absorption auf. Im Qualitatsvergleich mittels HPLC/DAD unter Verwendung eines Gradienten fur Pestizidanalytik wiesen die Basislinien einen nahezu identischen Verlauf auf. Die durchgefuhrten Untersuchungen legen nahe, daS die Reinheit des recycelten Acetonitrils der des reinen Liisemittels sehr nahe kommt. Beispiele in der Literatur [l-12, 1-13] zeigen, dalj insbesondere bei Verwendung von Drehbandkolonnen Qualitaten fur die Recyclingprodukte erreicht werden konnen, die denen der Neuware entsprechen. Nach destillativer Aufarbeitung von Cyclohexan/Ethylacetat aus dem GPCClean-up wird ein binares Azeotrop (48152 Vo1.-%) erhalten. Aufgrund der nahezu vollkommenen Ubereinstimmung dieser Mischungszusammensetzung zum Ausgangsgemisch wurde untersucht, ob ein Wiedereinsatz in der GPC moglich ist. Es wurde uberpruft, welchen Einflulj die geanderte Laufmittelzusammensetzung auf den Zeitpunkt der Elution verschiedener CKW hat. Zu diesem Zweck wurde ein mit CKW dotierter Boden extrahiert und die Extrakte unter Verwendung der 50/50-Ausgangsmischungbzw. des erhaltenen Azeotrops durch GPC aufgereinigt. Bei Verwendung des azeotropen Gemisches kam es aufgrund der hoheren Polaritat zu einer fruheren Elution sowohl der Analyte als auch der Matrix, was normalerweise unproblematisch ist . Zur Vermeidung dieses Effektes konnen die bekannten Azeotrope (48/52) durch Zugabe der erforderlichen Menge an Cyclohexan auch auf 50/50 eingestellt werden. Dies kann ebenso beim Acetonitril-Recyclat zum Ansetzen des Gradientenbeginns bei der HPLC-Analytik (Eluent A: ublicherweise bei ca. 40-50 % , und Eluent B: 100% Acetonitril) durchgefuhrt werden. Gerade das Beispiel des Acetonitril-Recyclings aus der HPLC ist besonders geeignet , auf die vielfaltigen, noch vie1 zu wenig eingesetzten Moglichkeiten des VVV-Konzeptes (Vermeiden, Vermindern, Verwerten) im analytischen Labor hinzuweisen. Die dargestellten Ergebnisse stellen aufgrund der speziellen Belastungssituation der einzelnen Losungsmittelabfalle eine Momentaufnahme dar. Dennoch wird deutlich, daB durch einfache Aufarbeitungsschritte qualitativ hochwertige Recyclingprodukte erhalten werden konnen, die selbst den hohen Anspruchen der Umweltanalytik genugen. Recycling ist insbesondere bei hochreinen Losungsmitteln auch ein Kostendampfungsfaktor [l-11, 1-14]. Fur ein erfolgreiches Recycling ist aus den vorliegenden

+

22

1 Gcfahrstoffvcrordnung und Arbcitssichcrhcit

Ergebnissen ein unbedingtes Vermischungsverbot (nicht nur von halogenierten und nicht-halogenierten) von Losungsmittelabfallen abzuleiten, es sei denn, darj die zu envartenden Azeotrope, wie im Falle von AcetonitrilWasser bzw. Cyclohexan/Ethylacetat ebenfalls wieder eingesetzt werden konnen.

Literatur [ 1- 11 Memorundurn der deutscken Atiulytikprofessoren, Frankfurt am Main: GDCh Fachgruppe Analytischc Chcmie, 1991. [ 1-21 Vcrordnung zur Novellierung der Gefahrstoffverordnung. zur Aufhebung der Gefahrlichkcitsmcrkmalevcrordnung und zur Anderung der Ersten Verordnung zum Sprcngstoffgcsetz (Gefahrstoffverordnung - GefStoffV), Bundesgesetzblatt Nr. 57 vom 26. 10. 1993. [ 1-31 Technische Regeln fur Gefdhrstoffe (TRGS 451) Umgang mit Gefahrstoffen im Hochschulbcreich, Oktober 1901, BArbBI. 11/1991. [ 1-41 Koincckc, A., Krcuzig, R., Bahadir, M., Sicbers. J., Nolting, H. G.. Fresenius J . And. Chem. 1994.349, 301-305. [ 1-51 Andcrsson, A.. Palsheden, H..Fresenius J. A t i d . Cliem. 1991, 339, 365-367. [ 1-61 Fischer, H., Cheniie in unserer Zeir 19YL2.5, 240-256. [ 1-71 Bekanntmachung der OECD-Grundsatze dcr Gutcn Laborpraxis (GLP). Beilagc zum Bundcsanzcigcr Nr. 42 vom 2. 3. 1993. [ I 4 1 Scholz-Biittcher. B., Bahadir, M.,Hopf. H., Angew. Clwm. 1992, 104, 477-479. [ 1-91 Gunschera, J.. Lorenz, W.. Bahadir, M.,Fresenius Envir. BUN. 1992. I , 197-202. 1-10] Bittner, M.. Lorenz, W.. Bahadir, M.,Fresenius Envir. Bull. 1993.2, 653-658. 1-11] Bittncr, M.,Diplomarbcit, Okochemie der TU Braunschweig 1992. 1-121 Katusz, R. M., ct al., J. Chromutogr. 1981. 213, 331-336. 1-13] D o h , J. W.. LCIGC' Int. 1992, 5 (7), 14-15. 1-14] Nosko, S.. LahorPruxis 1991, IS (9), 723-734.

2 Theoretischer Teil

2.1 Anwendungsbezogene theoretische Aspekte der Chromatographie Unter dem Begriff Chromatographie versteht man die Trennung von SubstanZen durch Aufteilung zwischen zwei nicht miteinander mischbaren Phasen, die man als stationare und mobile Phase bezeichnet. Hierbei handelt es sich um multiplikative Vorgange, deren Resultat als Chromatogramm dokumentiert wird. In der HPLC ist die mobile Phase stets flussig. Uber die Beschreibung der Theorie der Trennmechanismen gibt es zahlreiche Abhandlungen und Bucher, z.B. [2-1, 2-21, auf die hier zur Vertiefung verwiesen sei. Im folgenden werden einige wenige grundlegende Beziehungen diskutiert, die zur Auswertung und zum Verstandnis eines Chromatogrammes wichtig sind oder die praktische Konsequenz hinsichtlich einer Ergebnisverbesserung haben konnen.

2.1.1 Chromatographische KenngroBen Die Gesamtheit aller Peaks wird als Chromatogramm bezeichnet. Bei Berechnungen wird in der Regel von einer idealen GauBkurvenform eines Peaks ausgegangen, was allerdings in der Praxis nur angenahert zu erreichen ist. Abb. 2-1 zeigt ein Chromatogramm, wobei die Bezeichnung der einzelnen GroBen in der Literatur leider nicht immer einheitlich erfolgt. InTab. 2-1 sind wichtige Gleichungen aufgelistet, die im Text naher erlautert werden: Bei den Zeitangaben unterscheidet man zwischen Totzeit (t,,,), Bruttoretentionszeit (tmJ und Nettoretentionszeit (ts). In einem Chromatogramm werden normalerweise die Bruttoretentionszeiten an den Peakspitzen ausgedruckt . Die Totzeit (t,,,) oder Durchbruchszeit gibt an, wie lange eine Verbindung bis zum Erreichen des Detektors braucht, wenn keinerlei Wechselwirkungen mit der stationaren Phase in der Trennsaule bestehen, ihr also nur das Volumen der mobilen Phase zur Verfugung steht (tmbil).Diese idealen Voraussetzungen sind eigentlich nie gegeben. Da man andererseits fur viele Berechnungen die Totzeit verwenden muB, behilft man sich mit Markermolekulen, die die 0.a. Bedingung weitgehend erfullen. Je nach Detektions- und Phasensystem mussen unterschiedliche Verbindungen herangezogen werden (Normalphasen-HPLC: z.B. n-Pentan (RI), Benzol (UV, RI); RP-HPLC: D 2 0 (RI),

24

2 Theoretischer Teil

signal

t

tmsl I

tms2

11

I

I

zeit

Start

1

ts2

I I

Abb. 21: Chromatogramm mit chromatographischen KenngriiBen.

Thioharnstoff (UV)). Ungeeignet sind Verbindungen, die aus Ladungs- oder sterischen Grunden nicht in die Poren der stationaren Phase eindringen konnen. Sie werden von dem Anteil der mobilen Phase in den Poren ausgeschlossen und erscheinen vor der eigentlichen Totzeit des Systems. Die Bruttoretentionszeit (t,J gibt die Gesamtzeit an, wahrend der sich eine Verbindung in der mobilen und idan der stationaren Phase befindet. Aussagekraftiger ist jedoch die nicht direkt ablesbare Nettoretentionszeit (ts), die aus den Wechselwirkungen zwischen der Substanz und der stationaren Phase resultiert. Sie stellt die Verweildauer in/an der stationaren Phase dar (tstationAr t,, - t,,,). Nur wenn sich zwei Komponenten in ihr unterscheiden, konnen sie getrennt werden bzw. ergeben sich auch unterschiedliche Werte fur die angezeigten Bruttoretentionszeiten. Um das Retentionsverhalten von Verbindungen besser charakterisieren zu konnen, wird oft der k’-Wert (Kapazitatsfaktor) bestimmt (Gleichung 5 , Tab. 2-1). Dieser ist von auSeren Parametern, wie FIuBgeschwindigkeit, Saulenlange und Saulendurchmesser weitgehend unabhangig und liefert damit Moglichkeiten, verschiedene Systeme zu vergleichen. Da er eine MaBzahl fur die Verweilzeit in der stationaren Phase darstellt , bedeuten kleine k’-Werte eine Elutionszeit in der Nahe der Durchbruchszeit. Hohe k’-Werte bedeuten lange Retentionszeiten und entsprechend grol3e Peakverbreiterungen. Letzteres gilt allerdings nur fur isokratische Betriebsweise. Das Verhaltnis der Kapazitatsfaktoren zweier Verbindungen in einem Chromatogramm zueinander wird Selektivitat, Trennfaktor oder relative Reten-

2.1 Anwendungsbezogene theoretische Aspekte der Chromatographie

25

Tab. 2-1: ChromatographischeBeziehungen Bezeichnung

Symbol

Beziehung

Gesarntretentionszeit (Bruttoretentionszeit) Nettoretentionszeit Durchbruchszeit relative Retention Kapazitatsfaktor

k’

Verteilungskoeffizient

K

Auflosung

R.

theoretische Bodenhohe

h

effektive Bodenhohe theoretische Trennstufenzahl

n

effektive Trennstufenzahl Lange der Trennstrecke Standardabweichung

U

Basisbreite

w,= 40

Geschwindigkeit der mobilen Phase

U

Auflosungsgleichung van Deemter-Kurve

h=A

B + -+ U

CXu

(17)

tion genannt (Gleichung 4,Tab. 2-1). Aus dem oben Gesagten ergibt sich, daB zwei Substanzen nur getrennt werden konnen, wenn dieser Wert von 1 verschieden ist. Eine gute Selektivitat bedeutet aber noch nicht eine gute (auswertbare) Trennung, sondern zeigt nur die grundsatzliche Trennmoglichkeit rnit der gewahlten mobilen und stationaren Phase an. Die Gute einer Trennung kann durch den Parameter Auflosung (R) beurteilt werden (Gleichung 7, Tab. 2-1). Hier gehen nicht nur die Peakabstande, sondern auch die Peakbasisbreiten mit ein, die fur die GroBe einer eventuellen Uberlappung der beiden Komponenten entscheidend sind. Bei R = 1,4 ist praktisch eine Basislinientrennung erreicht, was eine quantitative Auswertung (auch fur einen Integrator) wesentlich verbessert bzw. ermoglicht (vgl. Abschn. 4.9). Je schmaler die Peaks bei gleichem Maximaabstand sind, um so

26

2 Theorctischer Tcil

besser ist die Auflosung. Das oft geaul3erte Argument, eine Auflosung uber 1,5 sei sinnlos, da eine Analyse so nur unnotig verlangert wird, kann nur gelten, wenn man uber die Anzahl der vorhandenen Peaks Kenntnis hat. Jeder der Naturstoffextrakt- oder Spuren-Analytik betreibt, weiB um die wundersame Peakvermehrung aus ursprunglich scheinbar nur wenigen Komponenten. Es leuchtet ein, dal3 auf einer gegebenen chromatographischen Trennstrecke in einer bestimmten Zeit theoretisch um so mehr Verbindungen getrennt werden konnen, je kleiner die Peakbasisbreiten ausfallen. Der beliebigen Verlangerung einer Trennstrecke, z. B. durch Verdopplung der Saulenlange, stehen aber oft schon apparative Grunde, wie zu hoher Druckanstieg entgegen. AuBerdem bewirkt eine Verdopplung der Strecke nicht gleichzeitig eine Verdopplung der Auflosung, sondern erbringt nur den Faktor fl (Gleichung 16, Tab. 2-l), da Diffusionseffekte gegenlaufig wirken. Entscheidend ist es daher, die wichtigsten Ursachen der Bandenverbreiterung zu verstehen, um hier eventuell optimierend eingreifen zu konnen.

2.1.2 Diffusionseffekte, Bandenverbreiterung Fur die Peakverbreiterungen sind Diffusions- und Stromungseffekte verantwortlich. Die Bodenhohe h (Gleichung 8, Tab. 2-1) dient als MaB fur die Gesamtheit der bandenverbreiternden Prozesse. In Analogie zum fruher oft angefuhrten Vergleich mit einer Fraktionierkolonne, kann man sie sich als Strecke vorstellen, auf welcher sich das chromatographische Gleichgewicht gerade einmal einstellt. Je kleiner die Bodenhohe, urn so hoher ist bei der gegebenen Saulenlange die daraus resultierende Boden- oder Trennstufenzahl n (Gleichung 10, Tab. 2-1). Daraus folgt, dal3 grol3e Bodenzahlen entsprechend viele Gleichgewichtseinstellungen ermoglichen und somit die Bodenzahl ein MaB fur die Gute einer Saule ist. Diese wird deshalb vom Hersteller mit einem Testchromatogramm angegeben. Es ist zu beachten, daB die Bodenzahl keine allgemeine Saulenkonstante ist, sondern sich nur auf die berechnete bzw. ausgewertete Verbindung unter definierten Parametern bezieht. Wie uberall, IaBt sich auch in der Chromatographie nur Gleiches mit Gleichem oder hochstens mit geschickt Angeglichenem vergleichen. Die gegenseitige Abhangigkeit der angefuhrten Parameter wird durch die sogenannte Auflosungsgleichung angegeben (Gleichung 16, Tab. 2-1).

2.1.3 Van Deemter-Kurve Die Auswirkungen von Flul3anderungen auf die Bodenhohe und damit auf die Effizienz einer Analyse lassen sich graphisch in der sogenannten van Deem-

2.1 Anwendungsbezogene theoretische Aspekte der Chromatographie

27

(C)

Eddy-Diffussion

I/-\

(A)

Langsdiffussion (B) U

Abb. 2-2: Van Deemter-Kurve.

ter- oder HETP-Kurve (Height Equivalent to a Theoretical Plate) darstellen (Abb. 2-2). Sie ergibt sich als Kombination bzw. Summation von mehreren bandenverbreiternden Effekten. Aufgetragen werden die Bodenhohe h (z. B. in mm) gegen die lineare FluBgeschwindigkeit u (cm/min). a) Eddy-Diffusion oder Mehrwegeffekt Da die Saule mit Phasenmaterialpartikeln gefiillt ist, konnen die Molekiile sie nicht auf geradem Wege passieren. Unabhangig von allen anderen Effekten, sind sie zu mehr oder weniger groBen Umwegen gezwungen, die sich rein zufallig ergeben. Einige Teilchen haben ,,Gliick", andere wiederum brauchen durch ,,Irrwege" entsprechend langer bis zum Saulenende. Statistisch erhalt man hier erwartungsgemaB eine GauBverteilung. Je regelmaaiger die Saulenfullung, je regelmaoiger und je kleiner die Phasenteilchen, desto geringer ist dieser Effekt . Von der FluBgeschwindigkeit ist er weitgehend unabhangig (Term A in Abb. 2-2 und Gleichung 17, Tab. 2-1). b) Langsdiffusion Peakverbreiternd wirken sich Diffusionsbewegungen der Molekule in FlieTJrichtung oder entgegengesetzt dazu aus. In der HPLC hat dieser Beitrag im Gegensatz zur GC wegen der relativ niedrigen Diffusionskoeffizienten in Flussigkeiten keine grol3e Bedeutung. Nur bei sehr kleinen Flussen mu13 er berucksichtigt werden (Term B in Abb. 2-2 und Gleichung 17, Tab. 2-1).

28

2 TheoretischerTcil

c) Stoffaustausch Zunachst muB der Stoffaustausch zwischen mobiler und stagnierender mobiler Phase betrachtet werden. Stagnierende mobile Phase findet man in Poren und Kanalen der porosen Phasenmaterialteilchen. Molekule, die in diese Bereiche gelangen, werden nicht durch den erzwungenen Systemflulj, sondern nur durch Diffusion diese Gebiete wieder verlassen konnen. Teilchen, die nicht in stagnierende Zonen geraten, erhalten entsprechend einen Vorsprung. Je groBer der Flulj, um so deutlicher macht sich dies bemerkbar. Gunstig sind hier geringe Partikeldurchmesser (geringere Diffusionswege) und niedrigviskose Flieamittel (hohe Diffusionskoeffizienten, s. aber b)). In die gleiche Richtung zielt der Stoffaustausch zwischen mobiler und stationarer Phase, der den eigentlichen chromatographischen Selektivitatseffekt bewirkt. Die Einstellung des Gleichgewichtes, z. B. bei der Adsorption, erfolgt naturlich auch bei Molekulen derselben Sorte nicht schlagartig und gleichzeitig. Probenmolekule, die nicht bzw. seltener oder nicht in stagnierenden Zonen adsorbiert werden, sondern sich im Losungsmittelstrom befinden, erhalten wieder einen Vorsprung (Term C in Abb. 2-2 und Gleichung 17, Tab. 2-1). Alle Effekte sind additiv in Bezug auf die Bodenhohenvergroflerung (= Bandenverbreiterung) und ergeben in ihrer Gesamtheit die abgebildete van Deemter-Kurve. Aus ihr ist ersichtlich, dafl es jeweils nur einen optimalen FluS gibt (u,,,,, Abb. 2-2). Es kann sich also lohnen, den in einer Applikation angegebenen Flu13 zu variieren bzw. zu optimieren. Bei den in HPLC-Applikationen angegebenen FluBraten befindet man sich normalenveise auf dem rechten Teil der Kurve. Je kleiner die Phasenpartikel, um so geringer ist die Steigung dieses Astes bzw. des sie verursachenden Terms C (s. Text unter c). Das bedeutet, bei kleineren Partikeln kann man den Flu0 eher erhohen, ohne dabei die Bodenhohen bzw. Peakbreiten wesentlich zu verschlechtern. Dies fuhrt zu Analysenzeitgewinnen, andererseits ist wieder der Druckanstieg zu beachten.

2.1.4 Bandenverbreiterung aufierhalb der Trennsaule Hierzu tragen die Dosierschleife (vgl. Abschn. 4.3), die Verbindungsleitungen (vgl. Abschn. 4.7) zwischen Dosierventil und Saulenkopf, zwischen Saulenende und Detektorzelle sowie die Detektorzelle selbst bei. Aus dem bisher Gesagten ergibt sich, da13 diese Totvolumina, soweit nicht apparative Grunde dem entgegenstehen, zu minimieren sind. ,,Tot" bedeutet, daB diese Volumina nur zur Peakverbreiterung durch Diffusion oder ungunstige Stromungsprofile beitragen. Zur erwunschten chromatographischen Trennung konnen nur Zonen mit Phasenmaterial fuhren, welches sich ausschlieljlich in der Saule befinden sollte.

2.2 Verschiedene Kombinationsmoglichkeiten in der HPLC

29

2.2 Verschiedene Kombinationsmoglichkeiten in der HPLC 2.2.1 Normalphasen- und Reversed-Phase-Chromatographie Diese beiden Begriffe pragten die Anfange der modernen Flussigchromatographie und seien deshalb besonders herausgehoben, obwohl sie definitionsgemaB eigentlich nur noch historische Bedeutung haben. Mittlerweile existieren eine Vielzahl von Phasenmaterialien (vgl. Abschn. 4 . 9 , fur die diese begrifflich enge Einteilung nicht mehr gilt, sondern wo es flienende Ubergange gibt.

Normalphasen-HPLC Bei der Normalphasen-HPLC ist die stationare Phase polar. Die typischen stationaren Phasen sind Kieselgele (Abb. 2-3) bzw. mit polaren Resten modifizierte Kieselgele. Als mobile Phasen dienen apolare Eluenten wie z.B. Heptan (vgl. Abschn. 4.8). Als Faustregel gilt, daB die k'-Werte bei der NP-Chromatographie mit abnehmender Polaritat der mobilen Phase zunehmen. Dies bedeutet, daB eine Substanz durch Methanol z. B. schneller eluiert wird als durch Diethylether (vgl. Tab. 4-4). Geschichtlich gesehen wurde zunachst hauptsachlich diese Art von Chromatographie (mit Kieselgel als stationare Phase) eingesetzt, so daB deshalb fur sie der Begriff ,,normal" gebrauchlich wurde, im Gegensatz zu den im folgenden beschriebenen, spater entwickelten Phasensystemen. Reversed-Phase-HPLC Hierbei ist die stationare Phase apolar, wahrend die mobile Phase polar ist. Basismaterial sind meistens Kieselgele (vgl. Abb. 2-3 und Abschn. 4 . 9 , die durch Alkylgruppen ,,hydrophobisiert" werden (Abb. 2-4). Am haufigsten werden Phasen mit Octadecyl- oder auch Octylresten eingesetzt. Die RP-Chromatographie hat sich unter anderem deshalb durchgesetzt, da waBrige FlieBmittelsysteme verwendet werden konnen (vgl. Abschn. 4.8)

,,L........

Abb. 23:Kieselgelstruktur.

30

2 Thcorctischcr Tcil

I

r3

-Si-O-Si-(CB2)

I

17

-CH3

I

-3

Abb. 2-4: Reversed-Phase.

und sich das Gleichgewicht zwischen mobiler und stationarer Phase wesentlich rascher einstellt, als dies bei der Adsorptionschromatographie rnit Kieselgelnormalphasen der Fall ist. Das bedeutet, da13 RP-Systeme sich gut fur den Gradientenbetrieb eignen. Bei der RP-Chromatographie nehmen die k'Werte mit der Alkylkettenlange der stationaren Phase und rnit steigendem Wassergehalt der mobilen Phase zu. Mit steigender Polaritat der zu analysierenden Verbindung nehmen sie ab, das bedeutet, ein apolares Molekiil wird spater eluiert als ein polares. Sol1 die Elution beschleunigt werden, mu13 der organische Anteil im FlieSmittel erhoht werden. In uber 80% aller Anwendungen werden RP-Systeme eingesetzt, es gibt spezielle Werke uber diese Technik [2-31.

Reproduzierbarkeit der Eigenschaften von RP-Phasen Wegen der weiten Verbreitung sei darauf hingewiesen, dal3 RP-18-Materialien verschiedener Hersteller vollig verschiedene Trenneigenschaften haben konnen. Dies kann sich z. B. in der Umkehr der Retentionsfolge von Verbindungen auBern, was allerdings hier nichts rnit dem Namen (RP) zu tun hat. Es liegt in unterschiedlichen Ausgangsmaterialien, in der Reaktionsfiihrung bei der Derivatisierung und im sog. Endcapping begrundet. Bei der Derivatisierung mittels Alkylchlorsilanen konnen z. B. aus sterischen Griinden nicht alle Silanolgruppen des Kieselgels (Abb. 2-3) rnit C-18-Ketten verathert werden. Restliche Silanolgruppen bedeuten aber eine Restpolaritat, die sich naturlich auf die Trennung stark auswirken kann (unterschiedlich, je nach Probenmolekul). Dieser Effekt kann nutzlich sein, will man ihn vermeiden, so wird ein Endcapping des Phasenmaterials durchgefuhrt. Hierzu werden die restlichen Silanolgruppen durch Nachbehandlung rnit sterisch gunstigeren Reagenzien wie z. B. Trimethylchlorsilan abgesattigt. Belegungsgrad und Endcappingart sollten vom Hersteller angegeben sein und mussen beachtet werden. Da Phasenmaterialien im Batch-Verfahren produziert werden, kann es selbst beim gleichen Produzenten zu Eigenschaftsunterschieden des Materials kommen, wenn die Charge aufgebraucht ist, da eine vollig reproduzierbare Herstellungsweise nicht gegeben ist. Diese Ausfuhrungen gelten auch fur die entsprechenden Phasenmaterialien bei der Festphasenextraktion (vgl. Abschn. 6.2).

2.2 Verschiedene Kombinationsmoglichkeiten in der HPLC

31

2.2.2 Ionenchromatographie (IC) Die qualitative und quantitative Bestimmung von dissoziierten Ionen gehort zu den altesten analytischen Trennprozessen uberhaupt. Die schwerfallige und oft nur wenig empfindliche naBchemische Ionenanalytik erfuhr eine rasante Entwicklung mit der Einfuhrung der Ionenchromatographie (IC) durch H. Small et al. im Jahre 1975 [2-41. Insbesondere die Bestimmung von Anionen durch die Ionenaustausch-Chromatographie (HPIC) vereinfachte sich hierdurch wesentlich, wahrend die Bestimmung von Metallkationen mit den bereits vie1 langer etablierten, spektrometrischen Methoden, wie z. B. Flammenemissionsspektrometrie, AAS etc., konkurrieren muBte. Daher ist der Einsatz der Ionenchromatographie in der analytischen Praxis heute vorwiegend auf die Anionenbestimmung konzentriert. Daneben spielt die Bestimmung von organischen Ionen und in steigendem MaSe auch von Kationen Seltener Erden eine entsprechende Rolle. In der Ionenchromatographie haben sich im wesentlichen die folgenden drei Trennmethoden etabliert [2-51: 1. Ionenaustausch-Chromatographie (HPIC - High Performance Ion Chromatography) 2. IonenausschluS-Chromatographie(HPICE - High Performance Ion Chromatography Exclusion) 3. Ionenpaar-Chromatographie (MPIC/RPIPC - Mobile Phase Ion Chromatography bzw. Reversed Phase Ion Pair Chromatography) Der grundsatzliche Aufbau eines Ionenchromatographen (IC) geht aus Abb. 2-5 hervor [2-61. Die IC-Anlage besteht aus einem Vorratsbehalter mit dem Elutionsmittel, der Pumpe mit Pulsationsdampfer und Druckkontrolle, der Probenaufgabeeinheit (haufig ein Autosampler), der Trennsaule, welcher zum Schutz vor Verschmutzung eine Vorsaule vorgeschaltet ist, bei der Zweisaulen-Technik der Suppressor-Saule (optional) sowie dem Detektor und der Auswerteeinheit fur die Signalverarbeitung. Bei dem am haufigsten eingesetzten Leitfahigkeitsdetektor kommt wegen der starken Abhangigkeit der Leitfahigkeit von der Temperatur noch eine Thermostatisierung der Saulen und des Detektors hinzu.

2.2.2.1

Ionenaustausch-Chromatographie(HPIC)

Die HPIC (High Performance Ion Chromatography) beruht auf dem bekannten ProzeB des Ionenaustausches an Austauscherharzen. Von der klassischen Saulenchromatographie unterscheidet sich die HPIC durch die Verwendung

32

2 Theoretischer Teil

Vorratsbehalter fur Eluenten

Manometer

Schleifeniniektor

Vorsaule

Trennsaule

optional

Detektor m i t MeBzelIe

Ab

PC

/ Integrator

Abb. 25: Apparativer Aufbau eines Ionenchromatographen.

2.2 Verschiedene Kombinationsmoglichkeiten in der HPLC

33

reproduzierbar hergestellter Ionenaustauscherharze geringer Kapazitat mit 0,Ol-0,2 mequiv/g Harz (Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisaternit quartaren Ammonium-Gruppen fur die Anionen- und Sulfonat-Gruppen fur die Kationenaustausch-Chromatographie), den HPLC-analogen Aufbau des chromatographischen Systems, haufig die Venvendung eines Leitfahigkeitsdetektors und hierfur die Unterdriickung (Suppression) der Grundleitfahigkeit der mobilen Phase rnit Hilfe einer zweiten (Suppressor-) Saule hinter der Trennsaule (Zweisaulen-Technik, Fa. Dionex) bzw. einer elektronischen Leitfahigkeitsunterdriickung (Einsaulen-Technik anderer Hersteller, z. B. Fa. Metrohm). Die Analyt-Ionen werden mit dem Eluentenstrom in die Trennsaule transportiert und dort an den funktionellen Gruppen des Harzes gegen die ursprunglichen Gegenionen ausgetauscht. Die Eluent-Ionen konkurrieren rnit den Analyt-Ionen um die Austauscherplatze und verdrangen diese aus den Bindungsstellen, sie beeinflussen somit die Retention der Analyt-Ionen. Die Retardation der Analyt-Ionen hangt daruber hinaus von der Affinitat zum Austauscherharz und diese von der Ladungsdichte des hydratisierten Ions ab. Der AustauschprozeS ist fur jedes Ion durch ein entsprechendes Ionenaustauschgleichgewicht charakterisiert, das die Verteilung zwischen mobiler und stationarer Phase bestimmt, beispielsweise im Falle des Anions A-: E-stat

-k

A-rnobil

A-stat

-k

E-mobil

Die verschiedenen ionischen Komponenten einer Probe konnen aufgrund ihrer unterschiedlichen Affinitat zur stationaren Phase des Ionenaustauschers (unterschiedliche Gleichgewichtskonstanten K) getrennt werden. Die Art der einsetzbaren Elutionsmittel richtet sich in erster Linie nach dem verwendeten Detektionssystem. Im Fall der Leitfahigkeitsdetektion werden die Elutionsmittel in zwei Kategorien unterteilt. Diese sind bei der AnionenaustauschChromatographie: 1. Elutionsmittel fur die Zweisaulen-Technik mit chernischer Unterdruckung der Grundleitfahigkeit (Salze schwacher anorganischer Sauren, die nach Protonierung in der Suppressor-Saule nur eine geringe Grundleitfahigkeit zeigen, z. B. Na2C03und NaHCO,); 2. Elutionsmittel fur die Einsaulen-Technik rnit elektronischer Kompensation der Grundleitfahigkeit (mit moglichst geringer Eigenleitfahigkeit, wie z. B. Phthalate, Benzoate).

34

2 Theoretischer Teil

Mit diesen Systemen kann eine Vielzahl von Anionen getrennt werden. Diese sind z.B. [2-51: Halogenide:

F-, CI-, Br-, I-

0-haltige Halogenverb.:

CIO-, CIO;, CIO,, CIO;, BrO,, lo3-

0-haltige Phosphorverb.: PO;-, PO:-, PO!-, P20$-,P 3 0 g ,P4O1:-, P 0 3 fS-Verbindungen:

S2-,SO:-, SO:-,S20z,SNC-

N-Verbindungen:

CN-, OCN-, NO;, NO,, N,

Si-Verbindungen:

SiOg, SiFi-

6-Verbindungen:

B40:-, BF;

Nichtmetalloxid-Anionen: AsO;, AsO:-, SeOg-, See-

Metalloxid-Anionen:

Mae-, WOi-, C a -

Entsprechende Gesetzmafligkeiten und Vorgehensweisen gelten in der Kationenaustausch-Chromatographie. Als funktionelle Gruppen an der stationaren Phase kommen Sulfonate und als Elutionsmittel in Verbindung mit einem Mikromembransuppressor ein Gemisch aus 2,3-Diaminopropionsaure und Salzsaure (fur Erdalkalimetalle) und ohne Suppressorsiiule Gemische aus Ethylendiamin und aliphatischen Dicarbonsauren wie Wein- oder Oxalsaure zum Einsatz. Fur die Elution von Ubergangsmetallen uncl Seltenen Erden werden schwache organische Sauren als Komplexbildner eingesetzt. Kationenaustausch-Chromatographie kommt vorwiegend fur Alk ali- und Erdalkalimetalle sowie fur Amine, aber auch fur Ubergangsmetalle und Seltene Erden in Betracht. 2.2.2.2

IonenausschluB-Chromatographie(HPICE)

Die HPICE (High Performance Ion Chromatography Exclusion) dient vor allem zur Trennung und Bestimmung von schwach dissoxiierten anorganischen und organischen Ionen in Gegenwart von stark dissoziierten SubstanZen. Die letzteren werden vom Austauscherharz infolge des Donnan-Amschfusses nicht zuruckgehalten und eluieren daher innerhalb der Totzeit als Summenpeak, woraus sich die Bezeichnung dieser Method(: ableitet. An der stationaren Phase in ihrer protonierten Form (Kationenaustauscher) wird die Hydrathulle durch eine negativ geladene Schicht (analog der Donnan-Membran) begrenzt. Anionen vollstandig dissoziierter Sauren im Eluent (z. B. HCI) werden von dieser Membran abgestoBen und konnen nicht bis zur sta-

2.2 Verschiedene Kombinationsmoglichkeiten in der HPLC

35

tionaren Phase vordringen. Schwache Sauren (z. B. Essigsaure) in ihrer undissoziierten Form (im angesauerten Eluenten) konnen als ungeladene Molekule diese Schicht durchdringen und mit der polymeren Matrix des Harzes in Wechselwirkung treten. SinngemaB das Gleiche Iauft bei Anionenaustauscherharzen ab. Die unterschiedlichen Wechselwirkungen zwischen den Analyt-Molekulen und der polymeren Matrix des Austauscherharzes etwa durch Adsorption sind fur das Retardationsverhalten und damit fur die chromatographische Trennung der Analyte verantwortlich. Aber auch ein Verteilungsgleichgewicht der Analyte zwischen dem mobilen und dem im Harz eingeschlossenen Eluenten wird als ursachlich fur die Trennung diskutiert [2-71. Fur die Anionenchromatographie werden Kationen- und fur die Kationenchromatographie Anionenaustauscherharze hoher Kapazitat verwendet. Die Auswahl der stationaren Phasen (z. B. vollstandig sulfonierte Harze in der Wasserstofform) als auch der Eluenten ist sehr begrenzt. Fur die Elution von Anionen verwendet man deionisiertes Wasser (fur Carbonat), das mit Mineralsauren angesauert werden kann, um die Peakform zu verbessern (fur organische Sauren), und Basen fur die Elution von Kationen. Die HPICE kommt vorwiegend bei der Bestimmung von schwachen anorganischen Sauren (z. B. Carbonat, Borat ,Arsenit, Sulfit,Hydrogensulfid) , aliphatischen organischen Sauren (z. B. Formiat, Acetat, Butyrat, Oxalat), ein- und mehrwertigen Alkoholen sowie Aldehyden und schlieBlich mit grorjem Erfolg zur Analyse von Aminosauren im fmol-Bereich in kurzer Zeit (10-15 min) zum Einsatz [2-5 1.

2.2.2.3 Ionenpaar-Chromatographie (MPIC/RPIPC) Die MPIC bzw. RPIPC (Mobile Phase Ion Chromatography bzw. Reversed Phase Ion Pair Chromatography) wird an unpolaren (RP-Phasen) bzw. schwach polaren stationaren Phasen (Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisate bzw. Divinylbenzolharze) nach Zuruckdrangen der Dissoziation der AnalytIonen durch Ionenpaar-Bildung als Adsorptions-Chromatographie durchgefuhrt. Dem polaren Eluenten wird ein lipophiles Ionenpaar-Reagenz (quartare Ammoniumsalze fur Anionen und Alkansulfonsauren fur Kationen) zugesetzt, die mit den Analyt-Ionen ein undissoziiertes Ionenpaar bilden [281. Aber es ist ebenso moglich, daB das lipophile Ionenpaar-Reagenz durch Adsorption an die unpolare stationare Phase diese zunachst als ein Ionenaustauscherharz funktionalisiert, und die Trennung der Analyt-Ionen durch Ionenaustausch-Chromatographie herbeigefuhrt wird [2-91. Eine Klarung des tatsachlichen Trennmechanismus’ ist bis heute nicht gelungen. Zur Verbesserung der Loslichkeit sowohl des Ionenpaar-Reagenzes als auch des gebildeten Ionenpaares im waBrigen Eluent wird dieses durch polare organische

36

2 Thcorctischcr Tcil

Losungsvermittler (Acetonitril, Methanol) modifiziert. Die Peakform und die Retention der Analyt-Ionen wird wesentlich durch folgencle experimentelle Parameter bestimmt: 0 0

0 0 0

Art und Konzentration des Ionenpaar-Reagenzes in der inobilen Phase Art und Konzentration des organischen Losungsverrnittlers Art und Konzentration der anorganischen Additive (i5.B. Na2C03 bei mehrfach geladenen anorganischen Anionen) pH-Wert des Eluenten Saulentemperatur

Aufgrund dieser grol3en Variationsmoglichkeiten der Faktoren, die die Retention bestimrnen, ist die MPIC/RPIPC iiber weite Trennbereiche flexibel und wird daher als eine ernsthafte Alternative zur Ionenaustausch-Chrornatographie betrachtet.

2.2.2.4 Detektoren fur die Ionenchromatographie

In der IC komrnen im wesentlichen zwei verschiedene Detektionsarten zum Einsatz: 1. Elektrochemische Detektoren a) Leitfahigkeitsdetektor b) Arnperometrischer Detektor 2. Spektrometrische Detektoren a) UV/VIS-Detektor (direkt, indirekt) b) Fluoreszenz-Detektor 3. Andere Detektionsarten a) Brechungsindex-Detektor b) Kopplungstechniken

Der Leiqahigkeitsdetektor ist der typische IC-Detektor untl wird am haufigsten in IC-Anlagen eingesetzt. Um die Leitfahigkeit der geladenen AnalytIonen empfindlich zu messen, mul3 die Grundleitfahigkeit im Eluat der Saule gering gehalten werden, wofiir die Suppressor-Technik bzw. Eluenten geringer Eigenleitfahigkeit zurn Einsatz kommen (s. 0.). Die amperometrische Detektion wird im allgemeinen bei schwach dissoziierten Ionen (pK-Wert >7) eingesetzt, die aufgrund ihrer geririgen Leitfahigkeit mit dem Leitfahigkeitsdetektor nicht empfindlich genug gemessen werden konnen. Diese Ionen mussen sich dariiber hinaus im Detektor elektrochernisch oxidieren bzw. reduzieren lassen. Der dabei auftretende Diffusions-

2.2 Verschiedene Kornbinationsmoglichkeitenin der HPLC

37

strom wird typischerweise in der Dreielektroden-MeBzelle (Arbeits-, Referenz- und MeBzelle) gemessen. Bei der direkten UVIVIS-Detektion anorganischer Ionen ist es nachteilig, daB diese im spektralen MeBbereich haufig nicht absorbieren. Daher mussen sie zunachst mit geeigneten Chromophore enthaltenden Verbindungen derivatisiert bzw. in farbige Chelatkomplexe uberfuhrt werden, wie z. B. Schwermetall-Ionen mit 4-(2-Pyridyl-azo)-resorcin (PAR), welche bei 490-530 nm absorbieren [2-51. Allerdings konnen nicht UV-aktive Ionen auch durch die indirekte UVDetektion bestimmt werden. Dabei wird dem Eluenten eine UVabsorbierende Substanz zugegeben, deren Konzentration im Sauleneluat kompetitiv zu der des Analyt-Ions ist. Wenn der Analyt-Ion-Peak in der Detektorzelle eintrifft, ist die Konzentration des Modifiers und damit die Extinktion urn diesen Anteil geringer. Es resultiert ein Negativ-Peak [2-10, 2111. Beim Einsatz von Natriumphthalat ist die MeSwellenlange 285 nm, bei der die gebrauchlichen anorganischen Anionen, wie z.B. CI-, Br-, NO<, NO;, SO:-, keine Eigenabsorption aufweisen. Die Fluoreszenz-Detektion in der IC wird uberwiegend in Verbindung rnit der Nachsaulenderivatisierung eingesetzt, da anorganische Ionen im allgemeinen nicht fluoreszieren (Ausnahme: UO;'). Ein sehr bekanntes Verfahren der Nachsaulenderivatisierung wird bei der Detektion von primaren Aminosauren eingesetzt. a-Aminosauren reagieren bereits bei Raumtemperatur rasch rnit o-Phthaldialdehyd und 2-Mercaptoethanol zu einem Komplex, der - bei 340 nm angeregt - blau fluoresziert (455 nm) 12-12]. Diese Reaktion kann mit allen primaren Aminogruppen durchgefuhrt werden. Oxidierbare anorganische Anionen, wie z. B. I-, NO;, S20:-, konnen rnit Hilfe von Ce4+ in schwefelsaurer Losung oxidiert werden, wobei das bei 350 nm fluoreszierende Ce3+ gebildet wird. Diese Reaktion wird nach der analytischen Trennung der Anionen in einer Reaktionsschleife bzw. einem Festbettreaktor groBen Volumens (2,7 mL) durchgefuhrt und ist zeitkontrolliert (bei Nitrit und Thiosulfat bis zu mehreren Minuten) [2-131. Weniger gebrauchliche weitere Detektionsmethoden sind die Brechungsindex-Detektion, die Radioaktivitats- Detektion mit Festbettszintillatoren (fur Radionuklide in der Umwelt) und die Kopplung des IC rnit einem Atomspektrometer (AAS, ICP-OES, DCP-AES).

2.2.3

HPLC-Biosensor(Enzymreaktor)-Kopplungen

Bei der HPLC-Biosensor-Kopplung handelt es sich um eine in der Lebensmittelchemie bisher erst selten eingesetzte Methode. Sie bietet in etlichen Fallen eine Reihe von Vorteilen, eine Anwendung wird deshalb bei den Lebensmittelapplikationen beschrieben (Abschn. 7.8). Ein Uberblick uber Biosensoren

38

2 Theoretischcr Tcil

und Anwendungen im Nahrungsmittelbereich wird in [2-141 gegeben. Unter einem Biosensor wird heute meistens die direkte raumlkhe Kombination einer matrixgebundenen, biologisch aktiven Substanz mil: einem elektronischen Gerat verstanden. In der im folgenden beschriebenen Anordnung ist der Ort der Reaktion und der Detektion durch eine kurze Kapillare getrennt. In der Literatur wird deshalb meistens von einer HPLC-Enzymreaktor-Kopplung gesprochen (HPLC-IMER = HPLC-IMmobilized Enzyme Reactor). Abb. 2-6 zeigt die zugrunde liegende apparative Anordnung. Ein oder mehrere hinter die HPLC-Saule geschaltete Enzymreaktoren reagieren rnit dem Substrat und bilden eine elektrochemisch elfafibare Substanz. Aus Ethanol entsteht z. B. bei Einsatz einer immobilisierten Alkohol-Oxidase Ethanal und H2O2,welches bei 0,6 Volt amperometrisch gemessen werden kann. Es werden so die Trennleistung der HPLC mit der Spezifitat von Enzymen und der hohen Nachweisempfindlichkeit eines dektrochemischen Detektors verbunden (vgl. Abschn. 4.6.4). Deshalb reicheii oft sehr einfache Aufarbeitungsschritte (Verdunnung, Filtration) bei trotzdein hoher Ergebnissicherheit in qualitativer und quantitativer Hinsicht aus. Ein Enzymreaktor besteht aus einer kleinen Stahlkartusche, welche rnit dem gewunschten immobilisierten Enzym gefullt ist. Einige Reaktoren sind kommerziell erhaltlich (z. B. bei Biometra). Abb. 2-7 zeigt Immobilisierungsmoglichkeiten fur einen Trager mit Oxirangruppen. Immobilisierungen sind auf einfache Weise im Labor diirchzufuhren, verschiedene Tragermaterialien sind erhaltlich (z. B. VA-Epoxy, Riedel de Haen; Eupergit, Rohm). Die Fullung der Reaktoren rnit den1 immobilisierten Enzym sollte bei ca. 100 bar (10 MPa) mit einer HPLC-Saulenfullanlage erfolgen [2-151.

Pumpe 1

'

elektrochem. Detektor

Integrator Datensystem Abb. 2-6 Apparativc Anordnung bei der HPLC-Biosensor-Kopplung.

2.2 Verschiedene Kombinationsmoglichkeitenin der HPLC

Trager m i t Oxirangruppe

Enzym

39

tr&gergebundenes Enzym

Abb. 27: lmmobilisierung von Enzymen.

Durch die Kombination verschiedener Enzyme kann eine groDe Palette von Substraten sehr empfindlich nachgewiesen werden. Im eigenen Arbeitskreis wurden bisher zahlreiche Alkohole, Aldehyde, Kohlenhydrate und Sauren [2161 untersucht. Da die Standzeiten der Reaktoren oft gut sind, minimieren sich die Kosten, selbst wenn sehr teure Enzyme eingesetzt werden. Die Stabilitat der Enzyme wird durch die Immobilisierung verbessert. Limitierend sind die moglichen FlieBmittelvariationen. Sowohl die Enzyme als auch der elektrochemische Detektor benotigen wassrige Puffer, die fur die anstehenden Trennprobleme oft weniger geeignet sind. Bei einigen Applikationen werden deshalb die Pufferlosungen erst nach der Trennung mittels einer zweiten Pumpe zugemischt. Es zeigen sich auch erstaunliche Stabilitaten bei Zusatzen von geringen Anteilen organischer FlieBmittel, wie Acetonitril, hier sind aber noch weitere Untersuchungen notwendig. Neben der einfachen Probenvorbereitung sind an weiteren Vorteilen zu nennen:

- oft kurze Analysendauer, - zumeist einfach auswertbare Chromatogramme, - geringe Kosten fur die Routineanalytik, - keine Entsorgungs- oder toxikologischen Probleme, - geringe Storungen durch die Matrix, - hohe Empfindlichkeit mit Nachweisgrenzen bis in den nano- und picomolaren Bereich, - Identitatsabsicherung durch spezifische Enzymreaktionen. Aufgrund der geschilderten Vorzuge ist es zu erwarten, daB die HPLC-Biosensor-Kopplung eine vielgenutzte analytische Verfahrensweise wird.

2.2.4 LC-GC-Kopplungen Es ist ohne groBere Probleme moglich, Flussigkeitschromatographie zur Reinigung von Proben fur die GC zu nutzen. Diese ,,off-line" Kopplung besteht typischerweise aus einer HPLC-Trennung (ggf. mehrere Injektionen), dem

40

2 Theoretischer Tcil

Sammeln der interessierenden Fraktion, einem Konzentrierungsschritt, um die Nachweisgrenze zu verbessern, der Vorbereitung fur die GC-Trennung (z. B. Losungsmittelwechsel, Derivatisierung) und der eigentlichen GC-Trennung. Die wesentlichen Nachteile dieses Verfahrens liegen im Zeit- und Arbeitsaufwand, moglichen Verlusten durch den Konzzntrierungsschritt, Kontaminationsgefahr und einer ineffizienten Ausnutzung des Probenmaterials. Aus diesen Grunden ist eine direkte Kopplung angestrebt worden. Das Problem hierbei liegt darin, daB die Eluentenvolumina cler HPLC (bis zu mehreren Millilitern) deutlich groBer sind als die normalervlreise von KapillarGC-Systemen beherrschbaren Probenvolumina (meist 0,2-2 pL). Daher setzte die Anwendung solcher ,,on-line" Verfahren die En1wicklung effizienter Transfer- und Abdampftechniken fur die groaen Flussigkeitsvolumina voraus. Ein Uberblick uber die Entwicklung, die Probleme und technischen Details findet man in der Monographie von K. Grob [2-171. Die on-line-Kopplung von HPLC und Kapillar-GC wird seit etwa Mitte der 80er Jahre erprobt. Eine solche Kopplung kann in folgenden Schritten durchgefuhrt werden:

- Isolierung der interessierenden HPLC-Fraktion - Uberfuhren in den Injektorbereich des GC mit Entfernen des Losungsmittels Zur Losung der 0. a. Volumenprobleme sind verschiedene Abdampftechniken entwickelt worden, deren wesentlicher Unterschied in de:: Ofentemperatur beim Entfernen des Losungsmittels liegt:

- partiell simultanes Abdampfen (partially concurrent solvent evaporation), auch retention-gap-Technik genannt, mit einem on-column Interface - vollstandig simultanes Abdampfen (concurrent solvent evaporation) mit dem loop-type Interface Durch den Einbau eines fruhen Ausgangs fur den Losungsmitteldampf konnen Losungsmittelvolumina von 600-800 pL (retention-gap) bzw. noch groBere Volumina beim simultanen Abdampfen beherrscht werden. Partiell simultanes Abdampfen: hierbei wird die gewahlte LC-Fraktion in die Vorsaule (,,retention gap") des GC uberfuhrt. Wenn die Ofentemperatur unter dem Siedepunkt des Eluenten liegt, findet der Transfer als Flussigkeit statt, d. h. es bildet sich ein Film auf der Innenwandung der Kapillare. Nachdem die Kapillare ,,geflutet" ist, beginnt das Losungsmittel von hinten, d. h. von der Injektorseite, abzudampfen. Leichtfluchtige Prclbenkomponenten werden zunachst gemeinsam mit dem Losungsmittel verdampft , dann jedoch wieder von dem weiter vorne liegenden Anteil des Eluenten aufgefangen. Am

2.2 Verschiedene Kombinationsmoglichkeiten in der HPLC

41

Ende dieses ,,solvent trapping" ist die Substanz somit an der Stelle fokussiert , an der das Losungsmittel zuletzt verdampft ; durch diesen Effekt wird die Bandenverbreiterung minimiert. Bei dieser Technik muB eine ausreichend lange, unbelegte Kapillare als Vorsaule zur Verfugung stehen. Vollstandig simultanes Abdampfen arbeitet mit Ternperaturen, die uber dem Siedepunkt des Eluenten liegen. Hierbei wird das in die GC-Saule eindringende Losungsmittel sofort abgedampft, so daB die Fliissigkeit nur wenig in das GC-System eindringen kann. Der Transfer erfolgt uber die Probenschleife (,,loop-type interface"), in der die Fraktion gesammelt wird; nach Umschalten wird die Fraktion aus der Probenschleife mittels Tragergas in den Gaschromatographen eingebracht. Hierbei mul3 durch den Dampfdruck im GC-Ofen sichergestellt werden, daB die Fliissigkeit tatsachlich abdampft und nicht als solche zum GC-Detektor gelangen kann. Bei dieser Technik gehen fliichtige Komponenten (50-80 "C iiber dem Siedepunkt des Losungsmittels) verloren. Man kann hierbei mit kurzen Vorsaulen arbeiten, da keine Fliissigkeit in das GC-System eindringt [2-181. Die LC-Phasensysteme sind fast ausschliealich NP-Systeme. Das liegt daran, dal3 bei dieser Methodik die HPLC prinzipiell nur die Probenvorbereitung fur die Kapillar-Gaschromatographie darstellt, d. h. daB die Analyten rnit Kapillar-GC analysierbar, also ausreichend fliichtig sein miissen. AuBerdem gibt es beim Transfer polarer, waBriger Eluenten Probleme aufgrund der Benetzbarkeit und der Stabilitat der GC-Phasen gegenuber diesen. LC-GC-Kopplungen sind (noch) nicht sehr weit verbreitet, es gibt aber eine Reihe von Anwendungen. Als Applikationsbeispiele seien der Nachweis von bestrahlten Lebensmitteln [2-19, 2-20], von Mineralolen z. B. in Kakao (durch kontaminierte Sisal- oder Jutesacke) [2-211, sowie der Ubergang von Paraffin aus beschichteten Papieren auf fettreiche Lebensmittel angefiihrt [2221.

2.2.5

HPLC-MS-Kopplungen'

Die Kopplung der Gaschromatographie mit der Massenspektrometrie ist eine lang etablierte Methode. Insbesondere bei der Riickstandsanalytik im Lebensmittel- und Umweltbereich ist diese Technik zur Absicherung von Analysenergebnissen unverzichtbar geworden. Durch die Entwicklung preiswerter massenselektiver Detektoren (kleine Quadrupole, Ion trap) haben diese Gerate eine sehr weite Verbreitung gefunden. Die Kopplung von HPLC und Massenspektrometrie wird erst seit relativ kurzer Zeit von einem groBe-

' vgl. auch GIT Spezial Chromatographie 1/94, S. 5

42

2 Theoretischer Teil

ren Anwenderkreis akzeptiert. Inzwischen sind die Kopplungstechniken weitgehend ausgereift und damit auch ,,routinefahig". Das bei der Kopplung von LC und MS auftretende Hauptproblem ist dadurch bedingt , da13 bei einer in der konventionellen H P LC ublichen FluBrate von 1 mL/min, ein Gasvolumen von einigen Litern auf das Massenspektrometer einwirkt. Dieses Volumen mu13 entfernt werden, da Massenspektrometer im Hochvakuum arbeiten. Das Hochvakuum bricht bei solchen Volumina sofort zusammen, und das System ist nicht mehr melibereit. Die Situation bei Microbore-Techniken ist gunstiger fur eine direkte Kopplung, da hier wesentlich geringere FluBraten ublich sind. Urn eine Kopplung dennoch realisieren zu konnen, wurden eine Reihe von konstruktiven Anstrengungen unternommen; Tab. 2-2 zeigt die wichtigsten realisierten Kopplungen und deren Eigenschaften. Genauere Informationen konnen aus Reviews bzw. Monographien entnommen werden, z. B. [2-23 bis 2-28]. Der Aufwand, der bei der LC-MS-Kopplung getrieben werden mu13, steht in keinem Vergleich zu dem bei der GC-MS-Kopplung, bei der nur eine geheizte Transfer-Leitung benotigt wird. Dies schlagt sich auch in den Kosten nieder. Die preisliche GroBenordnung fur ein ESI/APCI- [nterface liegt bei 100.000,- DM (naturlich ohne HPLC und MS-Ausrustung). Die verbreitetsten Kopplungstechniken verspruhen (,,spray") das Lomngsmittel. Hier erfolgt die Ionisierung im Interface, und es sind keine EI-Spektren moglich. Dies ist insofern von Nachteil, als es bei E I eine Reihe von !3pektrensammlungen gibt, die eine Spektrenzuordnung durch Bibliothekssuchen erleichtern. Fur die HPLC-Seite der Kopplungen gilt, daB die Pulsationsfreiheit noch weitaus bedeutender ist als bei ,,normaler" HPLC. Wenn 12s erforderlich ist, mit sehr kleinen Fluoraten zu arbeiten (bei CFFAB oder auch bei ESI), werden deshalb auch Spritzenpumpen (,,syringe pumps") eingesetzt.

Tab. 2-2: Eigenschaften von LC-MS-Kopplungen im Uberblick

Interface-Typ

Polaritatsbereich gering

mittel

++ ++ ++

++

ESI

++ ++

++ ++

APCI

++

++

Moving Belt DLI Particle beam (MAGIC) TSP

FluBbereich hoch

mUmin 1-2 bis 0.1 0s

++ ++ ++

1-2

0,005-1

bis 2

2.2 Verschiedene Kombinationsmoglichkeiten in der HPLC

43

Die Kopplung wird im Regelfall mit differentiell gepumpten MS-Systemen durchgefiihrt. Bei der Thermospray-Technik, die hier am ausfuhrlichsten behandelt wird, reicht das aber nicht aus. Hier wird eine weitere Pumpe zur Entfernung des Losungsmittels benotigt.

Ubersicht iiber die wichtigsten Kopplungen und Ionisierungsmechanismen Das Moving-belt-Interface (MBI) Das MBI war Mitte der 70er Jahre das erste kommerziell erhaltliche LC/MS Interface. Abb. 2-8 zeigt das Prinzip. Das HPLC-Eluat gelangt uber ein geheiztes Forderband (belt) in die Quelle. Die Probe wird dabei mittels IR-Heizer getrocknet und durchlauft mehrere Zonen unterschiedlichen Drucks (s. Abb. 2-8). Das FlieBmittel wird in einer Kammer, die auf Vorvakuumdruck liegt, entfernt. Das MBI war technisch aufwendig zu realisieren und entsprechend teuer. Man konnte konventionelle EI- und CI-Spektren mittels MBI erhalten, was Bibliothekssuchen ermoglicht und von der massenspektrometrischen Seite her den Zugang zu dieser Technik erleichterte. Als weitere Ionisierungsart konnte bei Moving Belt Systemen die FAB-Ionisierung als eine ,,weiche" Ionisierungstechnik realisiert werden. MBI wies eine hohe Stabilitat nach dem Tuning auf. Gradientenelutionen waren moglich. Neben dem hohen Preis haben vor allem der enge Fliichtigkeitsbereich der Proben und Memory-Effekte die weite Verbreitung von MBI-Systemen verhindert.

5-50 Torr Transportrollen (ca. 2500 Pa) 0,1-0,5 Torr 20-1000 Torr (ca. 20 Pa) (2500 Pa 0,l m a ) Abb. 2 - 8 Moving belt Interface.

-

44

2 Theoretischer Teil

Dieses Interface ist heute lediglich von historischem Interesse und wird nur noch in sehr wenigen Laboratorien genutzt. Direct Liquid Introduction (DLI) Diese Art der Kopplung kann nur geringe FluBraten verkraften und ist daher ausschliel3lich fur die Microbore-HPLC geeignet bzw. erfordert bei konventioneller HPLC einen Stromteiler (,,Splitter") nach der Saule. Die MicroboreHPLC hat sich bislang, trotz einiger Vorteile, nicht gegenuber der konventionellen HPLC durchgesetzt und eine vergleichsweise geringe Verbreitung gefunden. Daneben fuhrte auch die Tatsache, daB mit DLI ausschlieBlich wenig polare Komponenten Spektren liefern, zu einer Einschrankung der Anwendung. Das Thermospray-Interface(TSP) Das TSP-Interface, gelegentlich auch als ,,Plasmaspray" bezeichnet, ist z. Z. noch am weitesten verbreitet (weit uber die Halfte der Routineanwendungen). Thermospray ist soweit optimiert, daB es im Routinebetrieb eingesetzt werden kann. Das Eluat der HPLC wird unter genau kontrollierten Bedingungen partiell verdampft, bevor es in die Ionenquelle des MS gelangt. Verdampft das Eluat vorzeitig, sind Leistungsverluste im System die Folge. Abb. 2-9 zeigt den Aufbau des Interfaces. Es gibt verschiedene Arbeitstechniken: Pufferionisierung: dem LC-Eluat wird ein fluchtiger Puffer (meist Ammoniumacetat) zugesetzt. Dies kann direkt oder uber eine zweite HPLC-Pumpe nach der Saule geschehen. Uber den sogenannten Vaporizer (geheizte Stahl-

Thermofuhl6r Vaporizer

evakuierter Teil '\, Thenuof uhler

Aerosol Abb. 2-9 Das Thermospray-Interface.

2.2 Verschiedene Kombinationsmoglichkeiten in der HPLC

45

kapillare) wird die Mischung in die Ionenquelle verspriiht . Beim Verspruhen entsteht ein Aerosol mit geladenen Tropfchen (Durchmesser ca. 100 pm). Wie bereits erwahnt , mu13 uberschussiges Lijsungsmittel durch eine weitere Pumpe entfernt werden, weil sonst das Vakuum zusammenbrechen wurde. Die Ionenbildung bei Pufferionisierungen im TSP ist prinzipiell auf zwei Arten denkbar:

1. Die Losung enthalt bereits Ionen, die dafur verantwortlich sind, daR sich beim Verspruhen in der Quelle Tropfchen mit UberschuSladungen bilden. Dann wird Losungsmittel abgegeben, bis die Feldstarke fur eine Ionenverdampfung ausreichend ist. Die freigesetzten Ionen werden ins Massentrennsystem beschleunigt. Der Vorgang gleicht einer Coulomb-Explosion und ist keine thermodynamische Verdampfung. 2. Chemische Ionisation mit NH4+in der Gasphase. Thermospray benotigt bei der Pufferionisierung polare Molekule, wenn ausreichende Nachweisempfindlichkeiten erreicht werden sollen. In der TSP-Quelle befindet sich noch ein sog. Repeller oder Collector (eine Elektrode, die gegenuber dem Massentrennsystem eingebaut wird und normalerweise auf 0-200 V gesetzt wird). Der Repeller kann durch AbstoSungseffekte die Ionenausbeute steigern. Je nachdem, ob positiv oder negativ geladene Ionen detektiert werden, erhalt er eine Spannung positiven oder negativen Vorzeichens. Bei manchen Verbindungen ist es gelungen, durch erhohte Repellerspannungen eine verstarkte Fragmentierung zu erreichen . Andere Ionisierungsarten: Die Ionenerzeugung kann auch mittels Filament (Gliihfaden, der Elektronen emittiert) oder einer Discharge Elektrode (Entladungselektrode; Nadel, mit sehr hoher Feldstarke an der Spitze, wodurch ebenfalls Elektronen emittiert werden) erfolgen. Dies ist notig, wenn man Substanzen vorliegen hat, die sich mittels Puffer nicht oder nur schlecht ionisieren lassen. Mit der Discharge Ionisierung erhalt man naturlich keine Ammoniumaddukte, was bei der Pufferionisierung haufig der Fall ist. Die Discharge Elektrode dehnt den Anwendungsbereich von TSP auf weniger polare Molekule aus. Neben anderen Parametern kommt der Temperaturkontrolle des Vaporizers entscheidende Bedeutung zu. Die eingesetzten Vaporizer haben sich im Lauf der Zeit konstruktiv stark verandert. Die Erfolge mit Vaporizern, die einfach an der Spitze zusammengequetschte Stahlkapillaren darstellten, waren oft nicht befriedigend. Inzwischen hat man bessere Vaporizer entwickelt. Fruher ging man davon aus, daS sehr kurze Aufheizzeiten uber eine sehr kurze Kapillare notig seien, um unerwunschte Pyrolysen minimieren zu konnen. Dieses stellte sich als Irrtum heraus [2-231. Der wichtigste Optimierungsparameter ist

46

2 Theoretischcr Teil

die Vaporizer-Temperatur. Man erhalt nur in einem sehr engen Temperaturbereich fur ein gegebenes LC-System aussagekraftige Spektren. Thermospray benotigt Flufiraten von 1-1,5 mL/min und ist daher fur die Microbore HPLC nicht geeignet. Die Empfindlichkeit der Messung schwankt in weiten Bereichen; es gibt Komponenten, die sehr empfindlich nachweisbar sind (z. B. einige Herbizide, Coffein), wahrend andere Komponenten unempfindlicher detektiert werden. Die Gemeinsamkeit der beiden folgenden Techniken ist, daB die Ionisierung unter Atmospharendruck erfolgt. Diese Ionisierungsarten sind nicht neu, sondern bereits lange bekannt; durch technische Veranderungen erleben sie eine Renaissance. Electrospray Ionisation (ESI) Auch bei ESI wird aus dem Losungsmittel ein Spray erzeugt. Das Eluat wird elektrisch aufgeladen. Fur das Verspruhen sind prinzipiell Coulomb-Krafte verantwortlich. Das Eluat gelangt in eine fused-silica-Kapillare, die auf einem hohen Potential liegt. Die Ionenerzeugung beruht darauf, daS ein Potential von 3-5 kV auf die aus der Kapillare in die Gasphase ubertretende Flussigkeit einwirkt, wobei geladene Tropfen gebildet werden, aus denen bei der Verdampfung Ionen freigesetzt werden. Abb. 2-10 zeigt den schematischen Aufbau eines ESI-Interface. ESI kann auch mit kleineren Flufiraten als Thermospray betrieben werden, ist somit fur miniaturisierte HPLC geeignet und kann mit Kapillar-Elektrophoresegeraten gekoppelt werden [2-29, 2-30]. Die ESI ist noch vor kurzer Zeit vor allem zu Untersuchungen von Biomolekulen mit hoheren Molekulargewichten (z. B. Proteinen oder Peptiden) benutzt worden, da man mit dieser Technik Molekulargewichte in der GroSenordnung von 100.000 D rnit hoher Genauigkeit bestimmen kann. Der Massenbereich eines konventionellen Massenspektrometers ist fur solche Massen naturlich nicht ausgelegt; derartige Molekulargewichtsbestimmungen sind nur moglich, weil Makromolekule sehr viele Ladungen zu stabilisieren vermogen. In der Massenspektrometrie wird das Verhaltnis Masse/Ladung (m/z) bestimmt. Deshalb wird ein Molekul

Skimmer Abb. 2-10: Schematischer Aufbau eines ESI-Interface.

2.2 Verschiedene Kombinationsmoglichkeiten in der HPLC

47

der Masse 100.O00, welches durch den Ionisationsprozeo 100 Ladungen erhalt, vom Massenspektrometer bei der Masse loo0 registriert. Das ESI Spektrum eines solchen Biomolekuls zeigt eine Serie von Massen, die alle das Molekulion in unterschiedlichen Ladungszustanden reprasentieren. Daraus kann das Datensystem des Massenspektrometers die Masse des Molekuls mit hoher Genauigkeit berechnen. Ein Beispiel fur ein solches Spektrum und dessen Interpretation findet sich bei [2-311. EST findet zunehmend Einsatz in der pharmakologischen Forschung und der Umweltanalytik. Seit es gelungen ist, ESI mit hoheren Fluoraten zu betreiben (1 mumin und dariiber), ist die Kopplung mit ,,normalen" chromatographischen Methoden Routine geworden.

APCI (Atmospheric pressure chemical ionisation) Diese Ionisierungsart ist lange bekannt und wurde, ahnlich wie die Electrospray-Ionisierung, in den letzten Jahren wiederentdeckt und optimiert. Heute bieten die meisten Hersteller Kombiquellen von ESI und APCI an. Abb. 2-11 zeigt den Aufbau einer APCI-Quelle. Bei der ESI-Quelle wird die Hochspannung an der vom LC-Eluat durchstromten Kapillare angelegt, bei der APCI-Quelle wird zunachst in einem Vaporizer das Liisungsmittel verdampft und dann unter Atmospharendruck eine Entladung durch eine ,,corona needle" gezundet. Dies fuhrt auch bei schlecht protonierbaren Komponenten zu einer effektiven Ionisierung und damit zu einer empfindlichen Detektion. Die Empfindlichkeit ist bei zahlreichen Komponenten besser als bei der Thermospray-Technik. Man kann davon ausgehen, daS ESI und APCI eine deutlich weitere Verbreitung finden werden und Thermospray als momentan meistverwendetes Interface ersetzen werden. Particle beam (MAGIC) Durch das Particle Beam Interface (PB), auch als MAGIC (Monodisperse Aerosol Generator based Interface for liquid Chromatography) bezeichnet, werden konventionelle EI- bzw. CI-Spektren erzeugt. Abb. 2-12 zeigt den prinzipiellen Aufbau und verdeutlicht die Funktion.

Skimmer Abb. 2-11: Aufbau einer APCI-Quelle.

48

2 Theoretischer Teil

Vakuumk-r

! Partik e l

Abb. 2-12: Aufbau eines Particle Beam Intcrface.

Das LC-Eluat wird pneumatisch in einem sogenannten Nebulizer vernebelt. Dieser ist eine von Helium umspulte Kapillare. So entsteht ein Aerosol, das zur Entfernung des Losungsmittels in eine Desolvatationskammer expandiert wird, in der durch leichten Unterdruck und Heizung das Losungsmittel abgetrennt wird. Es bildet sich ein Gemisch aus Partikeln und Losungsmitteldampf, das in einem ,,Momentum Separator" getrennt wird. Die Probenmolekule (schwerer) befinden sich innen im Expansionskegel, die Losungsmittelmolekiile aul3en. Der Druck wird hier auf ca. 10-4Torr(ca. 0,Ol Pa) reduziert, der Strahl gelangt in die heifie Ionenquelle und wird ionisiert. Ein wichtiger Nachteil von particle beam liegt darin begrundet , dal3 viele Verbindungen unempfindlicher nachgewiesen werden als z. B. durch TSF?

Continuous Flow Fast Atom Bombardment (CFFAB) Es handelt sich um eine kontinuierlich arbeitende Variante der Fast Atom Bombardment Ionisierung, die als schonende Ionisierung bei konventioneller Massenspektrometrie haufig eingesetzt wird. Das CFFAB-Interface ist nur fur Microbore-Flufiraten geeignet (Tab. 2-2), deckt aber, im Gegensatz zum DLI, einen wesentlich grofieren Polaritatsbereich ab. Auch durch CFFAB werden keine EL und CI-Spektren erhalten. Verglichen mit PB, ESI und TSP ist CFFAB eine relativ preisgunstige Realisierungsmoglichkeit fur eine LCMS-Kopplung. Kopplung mit MUMS LC-MS-Kopplungen sind keineswegs nur teure Methoden zur Molekulargewichtsbestimmung; gelegentlich wird das eigentlich erwunschte Molekulion nicht in grol3er Ausbeute erhalten [2-311. Insbesondere wenn sogenannte

Literatur

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,,Triple-stage"-Gerate (,,MS/MS") vorhanden sind, konnen zusatzlich zur Molekulargewichtsinformation charakteristische Fragmente erhalten werden. Bei dieser MeBanordnung dienen das erste und dritte Quadrupol als Massenfilter, das mittlere als StoBkammer, um Fragmentierungen zu induzieren. Im TSP-Betrieb wird, wie erwahnt, meist das Quasimolekiilion erhalten. Das MS/MS-Experiment wird im Prinzip folgendermaBen durchgefuhrt: der erste Quadrupol laBt nur eine einzige Masse durch, im zweiten Quadrupol wird ein StoBgas zugegeben, das die Fragmentierung bewirkt; die Fragmente werden dann im dritten Quadrupol nach m/z getrennt und detektiert. Aus diesen Experimenten erhalt man Strukturinformationen, die weit uber eine Bestimmung des Molekulargewichtes hinausgehen.

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50

2 Thcorctiwhcr Tcil

12-261 Arpino. F?. .2?ii.s.s Spi*ciroiii. HCI: I Y N . 8. 3s-5.5. 12-271 Linschcid. M.. Friwiicrs J. Aicd. ('lilac. 19W. 3.37. fFUI-MI. 12-281 Ycrgcy. A. .L Edmonds. C. G.. Lewis. 1. A. S.. Vestal. M. I... I.iqrriil c.liroriicitogr~i~~liyl h4ii.s.s s p w w i i i i w y - k I i t i i i p t ~ . iricd v trpplii~iiioiis.in: Mcnliwr crticilyti~~ul c.liiwi.stry: i IcrcuICS. I). (Hrsg.). New York. London: Plenum Press. IH). 12-29] Smith. R. I).. Udscth. 11. R.. Darinagit. C. J.. Edmonds. C. G.. J. C*liroiiiiitogi: 1 Y N 559, 197-208. 12-30] Johilnna)n. 1. M.. Iluang. 1;. C'.. ilcnion. J . I).. Zwcigcnhaum. J.. J. Clirrn?iut~tg~ IWN. .5.54. 3 I 1-327. 12-311 Engclhardt. U. H.. Kichnc. A.. Wiigncr-Kcdckcr. W.. ( i f 71YN.N. 8.31-8.36.

3 Komplementarmethoden

3.1 Automatische Mehrfachentwicklung bei der DC Die Hochleistungsdunnschichtchromatographie (HPTLC = high performance thin layer chromatography) kann bei einigen Anwendungen in der pharmazeutischen Analytik als Konkurrenzmethode zur HPLC bewertet werden. Auch in der Ruckstandsanalytik werden neuerdings wieder vermehrt TLC-Methoden genutzt [3-11. Wenn ein Auftragegerat und ein TLC-Scanner zur Verfiigung stehen, ist die Methode auch zur quantitativen Bestimmung geeignet.

Mehrfachentwicklung in der Diinnschichtchromatographie Ganz allgemein versteht man unter der Mehrfachentwicklung bei der Schichtchromatographie die wiederholte Entwicklung auf derselben Schicht. Das FlieBmittel und die FlieBrichtung konnen geandert oder beibehalten werden. Ein Spezialfall der Mehrfachentwicklung ist die AMD (Automated multiple development) nach Burger. Es handelt sich hierbei um eine HPTLCTechnik. Im Gegensatz zur sonst ublichen Mehrfachentwicklung bei der TLC, wird nicht die gleiche Laufstrecke mehrmals zuruckgelegt , sondern die Laufstrecke jedes Einzellaufes ist um ein konstantes Inkrement (1-3 mm) langer als die des vorhergehenden [3-21. Dies setzt die Kenntnis des jeweiligen FlieBverhaltens voraus, da die Trennstrecke uber die Laufzeit des FlieBmittels programmiert wird. Bei einem typischen, aus 25 Stufen bestehenden Gradienten beginnt man rnit Entwicklungszeiten von 0,2 min und steigert sukzessive die Zeit (z.B. 15. Stufe = 6 min, 25. Stufe = 15 min). Meist wird ein Stufengradient mit unterschiedlichen FlieBmitteln benutzt. Ein AMD Gradient auf Kieselgelplatten beginnt rnit einem polaren, stark eluierenden FlieBmittel und endet rnit einem unpolaren, schwach eluierenden FlieBmittel. Die polare Komponente steht nach der ersten Entwicklung auf der Laufstrecke im Gleichgewicht rnit dem Kieselgel. Nach jeder Entwicklung wird das FlieBmittel aus der Trennkammer abgezogen und die Schicht durch Evakuieren getrocknet (pro Trocknungsschritt ca. 3 min). Vor jedem Entwicklungsschritt wird die Schicht uber die Gasphase konditioniert ,wozu die Speicherblase und die Waschflasche dienen. Diese Konditionierung verhindert , daB bei Gemischen die Gleichgewichtseinstellung erst beim eigentlichen Lauf erfolgt , was zu einer selektiven Entfernung der polaren Komponenten und zur Ausbildung einer sekundaren Front fuhren konnte [3-21. Die Trennung erfolgt so, da13 die Komponenten ihrer Polaritat entsprechend mit der Front laufen und

52

3 Komplementarmethoden

ihre endgultige Position bei schwacherer Elutionskraft oft nach wenigen Einzellaufen schon erreicht haben. Daneben kann die Trennung durch Variation des pH-Wertes optimiert werden (alkalisch bis leicht sauer). Nach dem letzten Lauf wird die Platte Ianger getrocknet und unter Stickstoff aufbewahrt. Bei der AMD wird in Vertikalkammern auf HPTLC-Platten (20 x 10 cm) 20-30mal rnit verschiedenen FlieBmitteln entwickelt. Der Startfleck befindet sich ca. 8 mm oberhalb des unteren Plattenrandes. Fur guteTrennungen wird die Probe strichformig aufgebracht, wobei man z.B. 4 mm lange Striche (5-50 pL) in Abstanden von 6 mm auftragt [3-31. Es konnen somit bis zu 20 Proben analysiert werden, wobei jeweils Standards mitchromatographiert werden. In der einzigen kommerziell erhaltlichen AMD-Apparatur (Fa. Camag) konnen bis zu sechs verschiedene FlieBmittel genutzt werden, die uber ein 7-Wege-Ventil in einen Gradientenmischer gefordert werden (vgl. Abb. 3-1). Aus dem Gradientenmischer gelangt das FlieBmittel in die Trennkammer, wird dort eine bestimmte Zeit belassen (siehe oben), abgesaugt und die Platte mittels Vakuum getrocknet. Die AMD-Technik ist dann eine Konkurrenzmethode zur HPLC, wenn die apparativen Voraussetzungen gegeben sind, d. h., daB neben der eigentlichen Apparatur zur Mehrfachentwicklung ein Auftragegerat, rnit dem die Substanzen in einheitlichen Flecken und genau dosierbaren Volumina aufgetragen werden konnen, und ein Dunnschicht-Scanner (Remissionsspektralphotometer) rnit Datensystem fur die Auswertung der Platten zur Verfugung stehen. Der Scanner ist ein UVNIS-Photometer. Die Platten werden unter dem Spalt des Photometers rnit hoher Prazision bewegt und die Intensitat der Flecken in Abhangigkeit von der Laufstrecke gemessen (Remissions-Orts-Kurven), wobei Chromatogramme erzeugt werden, die solchen bei der HPLC stark ahneln. Durch Einsatz eines Scanners mit entsprechendem Datensystem konnen Chromatogramme bei verschiedenen Wellenlangen aufgenommen, ubereinander geplottet und integriert werden; weiterhin kann man auch Spektren der getrennten Substanzen direkt von der Platte aufnehmen und somit die entsprechenden Befunde weiter absichern. Von der Aussagekraft, nicht vom MeBprinzip, sind somit ahnliche Auswertungen wie beim Einsatz eines Dioden-Array-Detektors bei der HPLC moglich. Eine komplette Ausrustung fur die quantitative TLC rnit AMD, Auftragegerat und Scanner kostet ca. 100.000,- DM und ist damit hinsichtlich der Anschaffungskosten mit einer aufwendigen HPLC-Anlage vergleichbar. Die AMD-Technik wird seit geraumer Zeit in der Ruckstandsanalytik, z. B. von Triazinen und Chlorphenoxycarbonsaure in Trinkwasser, eingesetzt [3-31. Es sind auch Kopplungsverfahren von HPLC mit AMD beschrieben, z. B. eine Vortrennung von Emulgatoren mittels RP-HPLC (nach Kettenlange) und eine Auftrennung coeluierender Verbindungen mittels AMD [3-41. Anwendungen in der Lebensmittelanalytik gibt es zur Zeit wenige, z.B. [3-5, 3-61.

3.2 Capillar-Elektrophorese

53

Extrakt

gs m( I

Auftragegerat

7 -Wege-Ventil

Trennkammer

blase Mischer

Waschf lasche

/

/

ElUMten

Datensystem TLC-Scanner Abb. 3-1: Arbeitsschritte und Prinzip der AMD-Analytik. Die N2-Anschliisseund die Vakuumpumpe sind nicht eingezeichnet.

3.2 Capillar-Elektrophorese Die Capillar-Elektrophorese ist eine relativ neu eingefuhrte Technik, die in einigen Bereichen in Konkurrenz zur HPLC getreten ist. Derzeit fehlt es vor allem in der Lebensmittelanalytik an validierten Methoden, es ist allerdings absehbar, daB diese kurzfristig entwickelt werden. Bei der Benennung der einzelnen Techniken herrscht eine gewisse Unorganisiertheit. So wird das Akronym CE von einigen Autoren als Uberbegriff uber alle Techniken, von anderen als Bezeichnung fur die Capillar-Zonen-

54

3 Komplementarmethoden

Tab. 3-1: Begriffe und Entsprechungen bei HPLC und CE (nach [3-7, 3-81) HPLC

CE

Eluent, mobile Phase Pumpe FluBrate Injektion Saule Retentionszeit Chromatogramm

Carrier Elektrolyt Hochspannungsversorgung Elektroosmotischer Flu6 (EOF) Probenaufgabe (hydrostatisch, Elektromigration) Fused Silica Capillare Migrationszeit Elektropherogramm

Elektrophorese (CZE) benutzt . Die Akronyme HPE. (High Performance Electrophoresis), HPCE (High Performance Capillary Electrophoresis) sind z.B. alle Begriffe fur CZE. Man beachte, daO einige Bezeichnungen von elektrophoretischen Techniken (CGE, MEKC), andere vom elektrophoretischen Trennprinzip (CZE, CIEF, CITP) abgeleitet sind. Die Bezeichnungen bei HPLC und CE unterscheiden sich. Tab. 3.1 stellt diese Entsprechungen gegenuber. Das Trennprinzip der Elektrophorese ist die Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld. Es gibt eine Vielzahl von Techniken: Trager (z.B. Papier-, Dunnschicht-, Gel-) Elektrophoresen und tragerfreie Ausfuhrungen sowie unterschiedliche Trennprinzipien wie Isoelektrische Fokussierung, Isotachophoresen, Feldsprung-Elektrophorese und andere mehr. Diese Techniken werden zur Trennung von hohermolekularen Substanzen in Biochemie und klinischer Chemie haufig eingesetzt, gelegentlich aber auch in der

Puffer

Puffer

0. Hochspannung Abb. 3-2:Schematischer Aufbau eines Capillar-Elektrophorese-Gerates.

3.2 Capillar-Elektrophorese

55

Lebensmittelanalytik. Die Capillar-Elektrophorese hat mit den apparativ wenig aufwendigen Techniken (Ausnahme Free-Flow Elektrophorese) wenig gemein, auBer der Tatsache, daB eine Wanderung im elektrischen Feld stattfindet . Abb. 3-2 zeigt den schematischen Aufbau eines Capillar-Elektrophorese-Gerates. CZE: Bei der CZE ist die Kapillare mit einem einzigen Elektrolyten definierten pH-Wertes gefullt, somit herrscht beim Anlegen der Spannung uber die gesamte Trennstrecke ein konstanter Feldstarkegradient. Die Konzentration des Elektrolyten muB im Vergleich zur Konzentration der Probenmolekiile hoch sein. Die Probenmolekule wandern entsprechend ihrer Ladung und Mobilitat unterschiedlich schnell zur Kathode oder Anode und erreichen demzufolge nach unterschiedlichen Migrationszeiten den Detektor. Je nachdem, ob Kationen oder Anionen getrennt werden sollen, gibt man die Probe in der Nahe der Kathode bzw. Anode auf; in der Praxis polt man die Spannungsquelle um, da man es in der Regel mit festen Konstruktionen zu tun hat. Die Trennung wird durch den elektroosmotischen FluB (EOF) beeinfluat, der sich in Quarzkapillaren in Richtung der Kathode bewegt (Abb. 3-3).

Hoher pH-Wert

Niedriger pH-Wert Fused silica

56

3 Kornplernentarrnethoden

HPLC

CE

3

Abb. 3 4 FluBprofile bei CE und HPLC irn Vergleich.

Der EOF kommt durch eine Ladung an der Obefflache der Kapillare zustande, da die Fused-Silica-Kapillaren ionisierbare Silanolgruppen enthalten. Das AusmaB der Ionisierung ist im wesentlichen abhangig vom pH-Wert des Puffers. Durch die negative Ladung der Wand werden positiv geladene Ionen aus dem Puffer angezogen, wobei eine elektrische Doppelschicht entsteht. Wird nun eine Spannung angelegt, wandern die Kationen aus der Doppelschicht in Richtung der Kathode, wobei Wasser mitgezogen wird. Es entsteht eine Bewegung der Pufferlosung in Richtung der Kathode, die in der GroBenordnung von mm/sec liegen kann. Der EOF ist bei niedrigen pH-Werten deutlich geringer als bei hohen. Aufgrund des EOF ist es moglich, kationische, neutrale und anionische Spezies in einem Lauf zu analysieren, weil bei alkalischen pH-Werten der EOF groBer ist als die elektrophoretische Wanderung und somit alle Komponenten zur Kathode wandern. Eine Auftrennung neutraler Molekule ist mit der CZE nicht moglich. Der EOF mu8 bei einigen Techniken unterdruckt werden. Ein groBer Vorteil der CE gegenuber der HPLC liegt in den Fluaprofilen. Bei der HPLC liegt eine laminare Stromung (Abb. 3-4) vor, aus der eine Bandenverbreiterung im Lauf der Chromatographie resultiert, wahrend das Flu& profil der CE (angenahert ,,plug-flow") nicht zur Peakverbreiterung beitragt. CGE: Capillar-Gel-Elektrophorese Die CGE wird meist mit Polyacrylamidgelen durchgefuhrt ,typischerweise in Kapillaren mit 50-100 pm innerem Durchmesser. Isotachophorese (ITP) : In den 70er Jahren war die Isotachophorese die meistgenutzte elektrophoretische Kapillartechnik. Der Tachophor der Firma LKB war das verbreitetste kommerziell erhaltliche Instrument. Die ITP wurde als Konkurrenzmethode zur HPLC eingeschatzt, konnte sich aber nicht durchsetzen, insbesondere wegen Detektionsproblemen. Prinzip: Die Probe wird zwischen einem Leitelektrolyt (L) mit hochster elektrophoretischer Mobilitat und einem Folgeelektrolyt (T = Terminator)

3.2 Capillar-Elektrophorese

57

Zonenfolge

I

L

T

Leitfahigkeitsignal I

) I

Zeit Zonenfolge

Leitfahigkeitssignal

l l E Zeit

L = Leitelektolyt T = Folgeelektrolyt (Terminator) x, Y, Z = Analyten

Abb. 3-5:Schematische Darstellung einer ITP-’llennung mit stufenformigem Anstieg der FeldstBrken wtihrend der Trennung.

eingespritzt und aufgrund der effektiven Mobilitaten getrennt. Die Probenmolekule mussen effektive Mobilitaten besitzen, die zwischen L und T liegen. Im Gleichgewichtszustand wandern alle Ionen gleicher Ladung mit gleicher Geschwindigkeit zum Detektor (UV, Leitfahigkeit). In jeder Zone ist die Feldstarke konstant und eine sprunghafte Anderung der Feldstarke findet an den Grenzen der einzelnen Zonen statt. Abb. 3-5 zeigt die Trennung der einzelnen Substanzen und das zugehorige Leitfahigkeitssignal. Zusatzlich wurde die erste Ableitung des Leitfahigkeitssignals und die UV-Spur (254 oder 280 nm) ausgegeben. Da die Zonenlange ein Ma13 fur die Konzentration ist,

58

3 Komplementarmethoden

kann uber die erste Ableitung eine quantitative Auswertung erfolgen. Mit der ITP konnen nur Ionen mit gleicher Ladung in einem Lauf getrennt werden. Die ITP-Gerate der 80er Jahre nutzen als Trennkapillare Teflonschlauche (0,5-1 mm i. D., 10-60 cm Lange). Mit den heutigen Geraten kann ebenfalls nach diesem Trennprinzip gearbeitet werden. Es konnen beschichtete und unbeschichtete Kapillaren benutzt und der EOF kann durch Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) unterdruckt werden. Als Leitelektrolyt wird z. B. Phosphorsaure (5 mM), als Terminator Valin (100 mM, auf entsprechenden pH-Wert eingestellt) benutzt. Micellare elektrokinetische Capillar-Chromatographie(MEKC oder MECC) : Die MEKC gilt in vielen Fallen als die gunstigste CE-Methode zur Bestimmung von kleinen Molekulen. Anders als bei der ITP oder der IEF ist hier der EOF der Motor des Systems. Keine der beiden Phasen ist stationar, allerdings sind sie unterschiedlich schnell [3-91. Mizellen sind Aggregate von oberflachenaktiven Substanzen, die sowohl hydrophile als auch hydrophobe Eigenschaften aufweisen. Diese Substanzen (z. B. Na-Dodecylsulfat = SDS) aggregieren in der Pufferlosung, wenn eine

&

Detergenz Abb. 3-6: MEKC-Trennung.

-OD

Wizelle

Analyt

3.2 Capillar-Elektrophorese

59

bestimmte Konzentration (CMC = Critical micelle concentration) uberschritten wird. Der Analyt befindet sich in einem Verteilungsgleichgewicht;ein Teil befindet sich in der Mizelle, der andere Teil befindet sich frei in der Liisung. Fur eine Mizellenbildung mit SDS (anionisches Tensid) bedeutet dies, daB die Mizelle durch Elektrophorese zur Anode wandert , wahrend die G s u n g durch den EOF in Richtung Kathode bewegt wird. Die Wanderungsgeschwindigkeit wird durch den Verteilungskoeffizienten zwischen mizellarer und nichtmizellarer Phase bestimmt und liegt damit zwischen der Geschwindigkeit des EOF und der Wanderungsgeschwindigkeit der Mizellen. Abb. 3-6 zeigt das Trennprinzip schematisch. Die Trennung laBt sich beeinflussen durch den Zusatz organischer Liisungsmittel als Modifier, durch die der Kapazitatsfaktor optimiert werden kann; bei zu hohen Konzentrationen werden allerdings die Mizellen zerstort. Die Selektivitat des Systems kann uber die Temperatur (Erhohung verkurzt Migrationszeit), durch die Wahl des Detergenz, Modifikationen der Mizelle (z. B. anderes Gegenion) und die Wahl des Puffers beeinfluat werden. Elektrochromatographie (EC): Der Begriff Elektrochromatographie wird fur elektrophoretische Trennverfahren benutzt ,bei denen adsorptive Wechselwirkungen mit dem Tragermaterial im Vordergrund stehen. Man benutzt HPLC-Tragermaterialien auf Kieselgelbasis. Die Verteilung bzw. Adsorption von Neutralstoffen erfolgt hier in gleicher Weise wie bei der HPLC, wahrend fur geladene Teilchen ein Beitrag der elektrophoretischen Wanderung hinzukommt. Der Hauptvorteil der Methodik liegt in der Kombination der Selektivitat der HPLC-Materialien mit dem gunstigeren FluBprofil der CE (s.o.). Der innere Durchmesser der Kapillaren ist wegen der Jouleschen Warme auf 200 pm begrenzt . Andererseits kann man mit kleineren Partikeldurchmessern bis wenigstens 1,5 pm arbeiten [3-81. Einschrankende Faktoren bei der CE:

- Thermische Effekte

- Probenaufgabe: Es gibt die hydrodynamische Probenaufgabe, bei der durch Uberdruck, Heben des GefaBes oder Vakuum auf der Detektorseite ein Flu0 in die Kapillare erzeugt wird. Die zweite Methode ist die elektrokinetische, bei der durch kurzzeitiges Anlegen einer Spannung aufgrund von elektrophoretischen und elektroosmotischen Effekten die Probe in die Kapillare gelangt. Es treten hier bei den Ionen wegen der unterschiedlichen Mobilitaten Diskriminierungseffekte auf, weil in der kurzen Zeit von den langsameren Ionen ein vergleichsweise geringerer Anteil in die Kapillare gelangt . Solche Effekte sind fiir quantitative Bestimmungen naturlich unerwunscht, konnen aber auf der anderen Seite auch zur Anreicherung

60

3 Komplementarmethoden

bestimmter Spezies bzw. Abtrennung von Matrixbestandteilen genutzt werden. Detektoren: Die meisten kommerziellen Gerate werden rnit UVNIS-Detektoren geliefert, neuerdings auch mit DAD. Die Detektion erfolgt direkt durch die Kapillare, bei der die Polyimidummantelung an der entsprechenden Stelle entfernt werden muB. Fluoreszenzdetektion wird wegen der hohen Empfindlichkeit haufig benutzt , ist aber nicht universe11 einsetzbar. Laser-induzierte Fluoreszenz wird neuerdings vermehrt genutzt, da sie noch empfindlicher detektiert . Weitere Detektionsarten sind z. B. Leitfahigkeit, Amperometrie sowie indirekte UV-Detektion. Fur optimale Reproduzierbarkeit der quantitativen Bestimmung bietet sich der Einsatz eines internen Standards an.

3.3 Supercritical Fluid Chromatography (SFC) Einen Uberblick uber den Stand der Technik der SFC gibt [3-lo]. Im folgenden sol1 die Technik unter apparativen Aspekten kurz erlautert werden. Prinzip: Unter SFC versteht man die Chromatographie rnit uberkritischen mobilen Phasen. Die SFC steht somit zwischen der HPLC und der GC. Uberkritische Fluide haben eine hohe (flussigkeitsahnliche) Dichte, verglichen rnit Fliissigkeiten hohere Diffusionskoeffizienten und geringere Viskositaten. Gegenuber der G C ist die SFC besonders bei thermolabilen Verbindungen vorteilhaft. Hinsichtlich der Auflosung ist sie der GC unterlegen. Abb. 3-7 zeigt das Phasendiagramm einer mobilen Phase. Abb. 3-8 zeigt die wichtigsten Komponenten und Kopplungsmoglichkeiten in der SFC. Sehr wichtig ist die Druckregelung. Durch relativ geringe Druckanderungen konnen die Dichte der mobilen Phase und damit deren chromatographische Eigenschaften stark verandert werden. Bei gepackten Saulen kann die chromatographische Trennung durch Zugabe von Modifiern (z. B. Methanol) oder Modifiern mit Additiv (z. B. Methanol mit Citronensaure) variiert werden. Pumpen: prinzipiell konnen alle HPLC-Pumpen bei der SFC genutzt werden. Wenn rnit Kapillarsaulen gearbeitet wird, sind Spritzenpumpen wegen ihrer volligen Pulsationsfreiheit sinnvoll. Bei Einsatz von Kolbenpumpen ist eine Pulsationsdampfung notig. Injektoren: Die Injektion muS, wie in der HPLC auch, in ein Hochdrucksystem erfolgen, daher nutzt man haufig modifizierte Schleifeninjektoren. Beim Arbeiten mit Kapillarsaulen mu13 entweder mit sehr kleinen Probenschleifen

61

3.3 Supercritical Fluid Chromatography (SFC)

DI :k

" iiberkritische Flussigkeit

Flussigkeit PCI kritischer Punkt

Gas

Tcr TemPperatur Abb. 3-7: Phasendiagramm einer mobilen Phase. T, Druck.

=

kritische Temperatur; P,, = kritischer

GcSpritzen-, Kolben-

Of en

system J

I

Abb. 3-8: Schema einer SFC-Adage.

-

-

Koppl~gs

technlken MS, FTIB

62

3 Komplementarmethoden

(0,5pL) gearbeitet werden oder eine Injektion im ,,split mode" erfolgen, um die Saule nicht zu iiberladen. Ansonsten mu8 die Injektionsmethode modifiziert werden, z. B. durch Injektion ohne Liisungsmittel, Injektion mit Split, Injektion rnit sofortiger Entfernung des Losungsmittels, Injektion in ein retention gap [3-lo]. Mobile Phasen: Die meisten Anwendungen werden mit C 0 2 als mobiler Phase durchgefuhrt, es sind aber auch andere beschrieben (N20, NH3, Pentan, Butan, Xe u. a. m.). Die SFC mit C 0 2entspricht einer NP-Chromatographie. Als Faustregel kann gelten, daB Substanzen, die sich in Hexan gut losen auch rnit SFC/C02 chromatographiert werden konnen [3-111. Xenon ist besonders fur die IR-Detektion interessant, da es praktisch keine IR-Absorption aufweist. Momentan fehlt noch eine mobile Phase hoherer Polaritat rnit niedriger kritischer Temperatur. Am aussichtsreichsten scheint Ammoniak [3101 zu sein; allerdings ist dieses relativ aggressiv gegenuber Polysiloxanbeschichtungen der Kapillarsaulen und Dichtungsmaterialien der Apparatur. Saulen: Es konnen in der SFC sowohl gepackte als auch Kapillarsaulen eingesetzt werden. In gepackten Saulen werden z. B. Kieselgele, RP-Materialien oder druckfeste Polymere (Styrol-Divinylbenzol Copolymere) eingesetzt. Bei schwierigen Trennungen werden haufig mehrere Saulen in Reihe geschaltet . Die Kapillarsaulen sind Polysiloxanphasen rnit verschiedenen Seitenketten; auch chirale stationare Phasen sind beschrieben [3-lo]. Detektoren: Einer der Hauptvorteile der SFC gegenuber der HPLC besteht darin, daB auch GC-Detektoren zum Einsatz kommen konnen. Oft wird der FID verwendet. Als mobile Phasen werden C 0 2 , N 2 0 , SF, und Xe verwendet , was die Anwendung auf un- und mittelpolare Substanzen relativ geringen Molekulargewichts einschrankt (s. 0.).Ein GroBteil der Applikationen nutzt zur Zeit UV-Detektion bzw. DAD. Andere Detektoren wie ECD, NPD, FPD wurden ebenfalls rnit Erfolg bei der SFC eingesetzt, obwohl nicht immer die gleiche Empfindlichkeit erreicht wird. Auch FTIR-Spektrometer und Massenspektrometer finden Einsatz als Detektoren. Die Vorteile gegenuber HPLC-MS-Kopplungen liegen in der leichteren Abtrennung der mobilen Phase. Gradienten: Es ist moglich, Druck- bzw. Dichtegradienten, Temperaturgradienten (vergleichbar GC), Zusammensetzungsgradienten (vergleichbar HPLC) zu benutzen; auch Kombinationen dieser Moglichkeiten sind beschrieben. Anwendungen: Quantitative Bestimmungen rnit SFC konnen meist nicht rnit G C oder HPLC konkurrieren [3-111. Oft untersucht wurden Erdol- und Kohleprodukte, gelegentlich Pharmaka (z. B. Steroide), Oligo- und Polysaccharide, Glyceride und Fettsaureester [3-101 sowie Pflanzenschutzformulierungen und Formulierhilfsstoffe [3-111. In der Riickstandsanalytik konnen Probleme bei der Nachweisempfindlichkeit auftreten.

Literatur

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SFE: Der Begriff steht fur Supercritical Fluid Extraktion, stellt also eine Extraktionstechnik dar, mit der eine selektivere Extraktion als mit Flussigkeiten moglich ist. GroDtechnisch wird SFE seit langem zur Entcoffeinierung von Kaffee eingesetzt [3-111. Die Vorteile des Verfahrens liegen in der niedrigen Arbeitstemperatur (geeignet fiir thermolabile Substanzen), dem SauerstoffausschluDbei der Extraktion, verminderter Artefaktbildung durch mogliche chemische Reaktionen sowie der Vermeidung von Ruckstanden des Extraktionsmittels. AuDerdem sind im Falle des C 0 2 die toxikologischen Eigenschaften gunstig. Fur analytische SFE greifen die Hersteller meistens auf die Bauteile der SFC-Apparaturen zuruck.

Literatur [3-11 Sherma, J., J. AOAC International 1992, 75 ( I ) , 15-17. [3-21 Burger, K., Gewiisserschutz, Wasser und Abwasser 1988,106, 82-109. [3-31 Methodensammlung zur Riickstandsanalytik von Pflanzenschutzmitteln: Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hrsg.), Weinheim: Verlag Chemie, Loseblattsammlung seit 1969, XIV ff. [3-41 Frey, H. P.,Zieloff, K., Qualitative und quantitative Diinnschichtchromatographie,Weinheim: VCH, 1993. [3-51 Meyer, I., Tagungsband der InCom 1994, 145. [3-61 Lodi, G., Betti, A., Menziani, E., Brandolini, V.,Tosi, B., J . Planar Chromatogr. 1994, 7, 29-33. [3-7) Jandik, P., Bonn, G., Capillary electrophoresis of small molecules and ions, Weinheim: VCH, 1993. [3-81 Kuhn, R., Hoffstetter-Kuhn, S., Capillary electrophoresis: principles and practice, Berlin: Springer-Verlag, 1993. [3-91 Terabe, S., Micellar electrokinetic chromatography, Fullerton (CA): Beckman Instr., 1992. [3-101 Klesper, E., Kiippers, S . , Chromatographie mit iiberkritischen dichten mobilen Phasen (SFC), in: Anufytiker-Taschenbuch11: Giinzler, H., Borsdorf, R., Darner, K., Fresenius, W., Huber, W., Luderwald, I., Tolg, G., Wisser, H. (Hrsg.), Heidelberg: Springer-Verlag, 1993, 63-111. [3-111 Grohs, R., Tagungsbund der 11. Konigssteiner Chromatographietage, Darmstadt: GITVerlag, 1991,282-299.

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HPLC-Anlagen konnen modular zusammengestelltoder als Kompaktanlagen aufgebaut sein. Die wichtigsten Bauteile sind in Abb. 4-1 am Beispiel einer isokratischen Anlage dargestellt. Weitere, hier nicht aufgenommene Bauteile sind Entgasungsvorrichtungen (insbesondere fur Gradientenbetrieb oft unentbehrlich) , Gradientenformer und Temperiereinheiten fiir die Saule (Heiz- undoder Kuhlofen) sowie automatische Probengeber.

4.1 Pumpen Einige wichtige Begriffe: - AuslaDventil - EinlaDventil - Hinterkolbenspulung - Kolben(dichtung) - Kolbenpumpe - Kolbenspiilung - Membranpumpe - Spritzenpumpe

outlet check valve inlet check valve piston wash piston(seal) reciprocating pump drain membrane pump syringe pump

Die derzeit gebrauchlichen Einheiten fur den Druck in der HPLC sind bar, kpsi und MPa (70 bar = 1kpsi = 7 MPa). Die SI-Einheit Pascal hat sich insbesondere im angelsachsischen Sprachraum noch nicht durchgesetzt. Viele altere Anlagen in der BRD geben den Druck in bar an.

t-I Integrator/ D.taMy.ttm

Abb. 4-1: Aufbau einer isokratischen HPLC-Adage.

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Anforderungen an eine moderne Pumpe: Die FluSrate mu0 im Bereich 0,l-10 mWmin reproduzierbar eingestellt werden konnen. Dies ist f i r die quantitative Analyse von entscheidender Bedeutung . - Der Pumpenkopf soll leicht zu spulen und zu entgasen sein; das Volumen sollte relativ gering sein, damit der Eluent schnell gewechselt werden kann. - Essentiell sind obere und untere Drucklimits, die fur einen unbeaufsichtigten Betrieb, z. B. uber Nacht, notig sind. Einerseits soll die Pumpe bei Verstopfungen abschalten und keine hohen Drucke aufbauen, andererseits darf sie bei LeckagenLuft im System oder bei leerem VorratsgefaS nicht ,,trocken" fordern bzw. dieses versuchen, denn dadurch wird bei Kolbenpumpen die Kolbendichtung unbrauchbar, es kommt zu Abrieb und im schlimmsten Fall zu Beschadigungen des Kolben. Beides fuhrt zu zeitaufwendigen Reparaturen, die meist auch teuer sind. - Der benotigte Arbeitsdruck ist auch bei besseren Saulen (10.000 Boden) und normalen Flussen selten hoher als 20-25 MPa; sinnvoll ist daher ein oberes Drucklimit bei ca. 40 MPa. Manche (semi)praparativen Pumpenkopfe haben obere Drucklimits bei ca. 14 MPa, was bei MethanoVWasserGemischen und den hier erforderlichen Flussen von 10 mumin aufwarts haufig zu niedrig ist. - Der FluRbereich, in dem die Pumpe einen konstanten Flu6 liefern soll, hangt nach der van Deemter-Gleichung (siehe Kapitel 2-1) vom Partikeldurchmesser der Phase und hinsichtlich der Probe vom Molekulargewicht und der Viskositat ab, da dadurch die Diffusion bestimmt wird. Fur durchschnittliche Proben (MRbis ca. 350) ist mit linearen Geschwindigkeiten von 0,l-20 m d s zu rechnen. Da die Diffusion von Makromolekiilen gering ist, mussen Makromolekule langsam chromatographiert werden. - Moderne Pumpen liefern im Regelfall einen konstanten FluS, d. h. unabhangig vom Druckabfall im System wird eine konstante Liisungsmittelmenge gefordert. -

Verschiedene Pumpentypen im Uberblick: Man unterscheidet allgemein zwischen Nichtkolbenpumpen (non reciprocating pumps) und Kolbenpumpen, wobei letztere die deneit meistgebrauchten Pumpen sind. Der Schwerpunkt der folgenden Kurzzusammenstellung liegt bei den Kolbenpumpen. Gasbetriebene Verdrangerpumpen: Man laBt das Gas in einem druckfesten Behalter auf den Eluenten einwirken; z. B. aus Stahlflaschen. Hauptvorteil: einfach, robust, billig, kaum storanfallig. - Gradientenbetrieb nicht moglich Nachteile:

4.1 Pumpen

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- Druckbegrenzung aus Sicherheitsgrunden (20 bzw. 10 MPa) - wenn der FlieBmittelvorrat verbraucht ist, muB die Chromatographie unterbrochen werden. Gasbetriebene Verstarkerpumpen: Prinzip: Ein relativ kleiner Gasdruck wirkt auf einen Kolben mit groSem Querschnitt . Dieser hat auf der Fliissigkeitsseite einen kleinen Querschnitt, wodurch bei gleicher Kraft der Druck entsprechend verstarkt wird (maximal um den Faktor 70). 1st der Kolben ganz vorgeschoben, wird der Gasdruck durch Ventile umgekehrt, der Pumpenkopf erneut gefullt und wieder Losungsmittel ins System gefordert . Die Pumpen liefern einen immer konstanten Druck. Gasbetriebene Verstarkerpumpen werden als Fullpumpen in Saulenfullgeraten eingesetzt. Diskontinuierliche Verdrangerpumpen (syringe pumps): Diese Pumpen sind die meistgebrauchten Nichtkolbenpumpen. Prinzip: Eine uberdimensionale Spritze wird mittels Schrittmotor entleert. Vorteile : - vollig pulsationsfrei - der hohe Druck bedingt hohe Anforderung an die Dichtigkeit der Spritze - bei Spritzenpumpen ohne FluBregelung ist die Zeit bis zum Erreichen eines konstanten Volumenstromes relativ lang. - Gradientenbetrieb mit einer Pumpe nicht moglich. Spritzenpumpen werden neuerdings, aufgrund ihrer volligen Pulsationsfreiheit , auch bei sehr kleinen Fluhaten, haufig bei LC-MS-Kopplungen benutzt. Kolbenpumpen: Prinzip: Ein Kolben wird durch einen Excenter schnell bewegt und ubertragt seine Bewegung auf eine Membran, die wiederum das Losungsmittel fordert, wobei der jeweils richtige Weg durch Kugelventile freigegeben bzw. gesperrt wird. Da der Kolben nicht gleichzeitig saugen und driicken kann, entsteht eine gewisse Pulsation, die durch Dampfungssysteme, z. B. Restriktionskapillaren, geglattet werden muB. 1. Membranpumpen: Ein Kolben wird rasch bewegt, er ubertragt die Bewegung auf eine Membran, die das Losungsmittel verdrangt. Die Hubhohe des Kolbens und damit auch das verdrangte Flussigkeitsvolumen kann variiert werden. Die Druckerzeugung und die LCisungsmittelforderung erfolgen bei modernen Systemen unabhangig voneinander. Die Dosierpumpen arbeiten im Niederdruckbereich (2-4 bar), das bedeutet, daJ3 die Kolbendichtungen sanft behandelt werden

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4 Module

und dal3 die sonst kritische Abhangigkeit der Forderung von der Kompressibilitat des Losungsmittels nicht gegeben ist. Die dosierten Eluenten werden in einem Niederdruckkondensator gesammelt und in einen Pumpenkopf geleitet, in dem ein Kolben mit einer Frequenz von 10 Hz hydraulisch eine Membran bewegt. Trotz dieser relativ schnellen Frequenz ist eine Pulsationsdampfung notig. Der Hauptvorteil: Der Kolben kommt nicht mit den Eluenten in Kontakt, dadurch haben die Pumpen eine lange Lebensdauer. 2. Kurzhubkolbenpumpen: Die derzeit meistgebrauchten Pumpen sind die Kolbenpumpen, die als Ein-, Eineinhalb- und Doppelkolbenpumpen angeboten werden. Kurzhubkolbenpumpen: Hier verdrangt ein Kolben (meist aus Saphir) die Flussigkeit direkt. Die Anforderungen an die Prazision der Kolbenfuhrung sowie an das Kolben- und Dichtungsmaterial sind bei diesen Pumpen sehr hoch. Um einen moglichst gleichmal3igen Flu13 zu erhalten, mu6 die Ansaugphase des Kolbens, d. h. die Zeit, in der Losungsmittel aus der Vorratsflasche in den Kolben gefordert wird, sehr kurz sein. Dies wird erreicht durch einen nierenformigen Excenter (,,cam"); Abb. 4-2 zeigt eine Anordnung fur eine Doppelkolbenpumpe. Bei Einkolbenpumpen ist trotz dieser kurzen Unterbrechung meistens ein Pulsationsdampfer notwendig. Bei Doppelkolbenpumpen ist eine Pulsationsdampfung oft unnotig. LiisungsmittelAuslaS

Pumpenkopf

1

"cam"

rt

LiisungsmittelEinlaB

Abb. 42: Schematische Darstellung der Arbeitsweise einer Doppelkolbenpumpe . Die Ansaugphase fur Liisungsmittel aus dem VorratsgefM liegt in der GroBenordnung von 200 Millisekunden.

4.1 Pumpen

69

/ Auslasventil Kolbenhinterspulung ( Ein1a% 1

11

Kolbenhinterspulung (AuslaS)

I I

I’

1

(Prime AnschluS)

EinlaSventil

I

Pulsationsdhpfer

Eluenten

I Abfall

Abb. 4-3: Schematische Darstellung einer Einkolbenpumpe mit Hinterkolbenspiilungund Spiilventil (drain).

Wird bei Kolbenpumpen mit Puffern gearbeitet, ist eine Hinterkolbenspulung mit Wasser wichtig, um Ablagerungen, die die Dichtungen oder sogar den Kolben schadigen wurden, zu vermeiden. Haufig entstehen Beschadigungen dadurch, daB zum Spulen ein organisches Losungsmittel direkt auf die unter Puffer stehende Losung einwirkt, wobei es zum Ausfallen der Pufferbestandteile kommen kann. Abb. 4-3 zeigt eine solche Anordnung fur eine Einkolbenpumpe. Bei allen Kolbenpumpen muB der Weg vom Losungsmittelvorrat in den Pumpenkopf gesperrt sein, wenn der Kolben ins System fordert (druckt) und der Weg von der Saule in den Pumpenkopf gesperrt sein, wenn der Kolben aus dem VorratsgefaB Wsungsmittel ansaugt. Dies wird durch Doppelkugelventile (s. Abb. 4-4) gewahrleistet. Eine besondere Variante stellen Eineinhalbkolbenpumpen dar (z. B. Fa. Merck). Prinzip: Zwei phasenversetzt arbeitende Kolben sind in Reihe

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1

+

Abb. 4 4 Aufbau von Doppelkugelventilen.

geschaltet. Kolben 1 fordert Losungsmittel aus dem VorratsgefaB in Kolben 2. Der erste Kolben hat ein groBeres Volumen als der zweite. Durch diese Konstruktion wird ein weitgehend pulsationsfreier FluB gewahrleistet und es wird je ein EinlaB- und ein AuslaBventil eingespart. Kurzhubkolbenpumpen sind auch dann gradientenfahig, wenn nur eine Pumpe vorhanden ist (Niederdruckgradient). Hochdruckgradienten konnen mit zwei Pumpen, die iiber eine Mischeinheit gekoppelt sind, realisiert werden. Storungen: Instabile Fliisse beeinflussen die Analyse, wobei folgende Grenzfalle unterscheidbar sind: - kurzfrequente Schwankungen; relativ unproblematisch - niederfrequente Schwankungen; wenig EinfluB auf die Retentionszeit, vergroBert den Fehler bei quantitativen Analysen - driftender FluB: schadlich fur Retentionszeiten und quantitative Bestimmungen Die Ursachen liegen meist bei Pulsationen und Gasblasen im System.

4.2 Gradientensysteme

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Druckanderungen im System konnen eine Reihe von Ursachen haben: - Verstopfung von Fritten oder Saulenpackung; diese Verstopfungen konnen auch probenbedingt sein. - Verunreinigung von Ventilen durch Losungsmittelbestandteile oder Dichtungsabrieb; moglich ist auch eine Beschadigung eines Ventils, eine defekte Kolbendichtung oder probenbedingte Ursachen wie unterschiedliche Konzentration oder Uberladung. Die Qualitat der HPLC-Pumpe wird durch ihre FluBkonstanz determiniert. Eine nicht fluBkonstante Pumpe ist besonders fur die quantitative Analyse untragbar. Fur spezielle Zwecke sind Spritzenpumpen und gasbetriebene Verstarkerpumpen im Einsatz. Pulsationsfreie bzw. -arme Forderung der Pumpen macht bei Einkolbenpumpen den Einbau eines Pulsationsdampfers erforderlich. Die Lebensdauer einer Pumpe bzw. der zugehorigen Bauteile (Dichtungen, Ventile) hangt im wesentlichen von der Behandlung ab, was z. B. bedeutet, daB Pufferlosungen nie langere Zeit im Pumpenkopf stehen durfen, d& die Eluenten zu filtrieren und entgasen sind, Pumpen nicht trocken fordern sollten und gewechselte Dichtungen adaquat eingefahren werden mussen.

4.2 Gradientensysteme Wie bereits erwahnt konnen viele Trennprobleme nicht optimal mit einem gegebenen FlieBmittel gelost werden. Daher sind mehrere Moglichkeiten entwickelt worden, um die FlieBmittelzusammensetzung wahrend des HPLCLaufes verandern zu konnen. Grundsatzliche Voraussetzung fur eine Gradientenbildung ist die Mischbarkeit der Losungsmittel. Die technische Realisation ist unterschiedlich. Anforderungen an eine Gradientenformung sind: - exaktes Erzeugen des vorgegebenen Mischungsverhaltnisses - geringe Welligkeit - geringe Totvolumindschnelle Ansprechzeit Abb. 4-5 zeigt schematisch einige Moglichkeiten von Gradientenverlaufen, hier fur binare Gradienten. Neben den hier dargestellten, konnen manche Gerate auch andere Varianten realisieren, z. B. mehrfach lineare Gradienten mit unterschiedlichen Steilheiten oder Gradienten, die isokratische Phasen mit konkaven undoder konvexen Steigungen verbinden. In der Praxis konnen oft die komplizierteren Gradienten der Originalvorschrift durch einfache lineare Gradienten ersetzt werden (Ausnahmen bestatigen aber die Regel). Man sollte in jedem Falle die Trennung mit moglichst unkomplizierten Gradienten realisieren.

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Zeit

m

Abb. 45: Einige mogliche Gradientenverlaufe.

Stufengradienten: Stufengradienten konnen auch ohne Gradientenmischer erzeugt werden. Im einfachsten Fall wechselt man nach bestimmten Zeiten den Liisungsmittelvorrat, indem man die ,,solvent line" in ein anderes VorratsgefaB gibt. Etwas eleganter geht dies mit einem Zweiwegeventil. PC-gesteuerte Gerate konnen in einigen Fallen das angesteuerte VorratsgefaB zeitabhtingig wechseln (z. B. Beckman M 116). Neben binaren Gradienten sind auch ternare realisiert worden. Die meisten der handelsublichen Niederdruckgradientenformer bieten diese Option an. Die Literatur zeigt aber, daB Applikationen mit ternaren Gradienten in der Praxis selten sind. Die im folgenden beschriebenen Losungen erfordern in jedem Falle technischen Aufwand. Niederdruckgradienten: Die Losungsmittel werden auf der Niederdruckseite durch Dosierventile gefordert, statisch oder dynamisch gemischt und dann durch die Pumpe gefordert. Abb. 4-6 zeigt die Anordnung. Bei dieser Anordnung spart man mindestens eine Pumpe. Haufig werden Pumpe und Niederdruckgradientenformer als ein Modul geliefert . Die technischen Ausfuhrungen sind sehr unterschiedlich. Es gibt ND-Gradientensysteme mit einer einfachen Ventilsteuerung, bei denen die Mischung

4.2 Gradientensysteme L6sungsmittel

Dosierventile

n

Q

73

0

Injektionsventil

000-

und Side

I

L

d

Abb. 46: Schematischer Aufbau einer Niederdruckgradientenanlage.

nicht konstant ist. Besser und aufwendiger sind Systeme mit einer Zwangsdosierung uber zusatzliche Losungsmittelforderpumpen. Niederdruckgradienten liefern eine konstante FluBrate, da diese uber die Pumpeneinstellung geregelt wird, allerdings konnen sich die Mischungsverhaltnisse andern. Hochdruckgradienten: Hier findet, wie Abb. 4-7 zeigt, die Mischung der Eluenten auf der Hochdruckseite statt. Hochdruckgradienten liefern ein exaktes Mischungsverhaltnis, aber aufgrund moglicher Volumenkontraktionen ist eine konstante Fluhate nicht immer gewahrleistet. Mischkammern: Fur die Praxis ist zu beachten, daB eine publizierte Methode, die auf einem HD-Gradientensystem entwickelt wurde, sehr selten auf ein ND-Gradientensystem direkt ubertragbar ist. Dies liegt darin, daI3 bei einem HD-Gradienten die Anderung der FlieBmittelzusammensetzung praktisch sofort am Saulen-

0

Lnoo-

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kopf wirksam wird, wahrend bei einem ND-Mischer das Volumen der Mischkammer und das Volumen der Zuleitungen bis zur Pumpe eine Verzogerung bewirkt. Darin liegt kein prinzipielles Problem begrundet, sondern es ist lediglich eine Anpassung erforderlich. Es gibt statische und dynamische Mischkammern; erstere enthalten keine bewegten Teile, wahrend letztere mit einem Ruhrer ausgestattet sind. Auf eine graphische Darstellung wird an dieser Stelle venichtet.

4.3 Probenaufgabe 4.3.1 Manuelle Injektion Trotz der an sich einfachen apparativen Vorrichtung sind bei der Injektion eine ganze Reihe von Punkten zu beachten, um ein optimales Ergebnis zu erreichen. Bis auf wenige Ausnahmen hat sich die Probenaufgabe mit einem Dosierventil durchgesetzt (Abb. 4-8). Hierbei wird eine Dosierschleife mit einem vorgegebenen Volumen manuell durch eine Spritze (keine GC-Spritzen verwenden!) gefullt. Nach dem Umschalten des Ventils wird die Schleife vom FlieBmittel durchstromt und der gesamte Schleifeninhalt verlustfrei und reproduzierbar auf die Saule transportiert. Der Umschaltvorgang muB so schnell wie moglich durchgefuhrt werden, um die unvermeidbaren Druckschwankungen gering zu halten. Natiirlich kann auch eine teilweise Fullung der Schleife durch entsprechende Spritzenvolumina erfolgen. Bei ,,normalen" analytischen Saulen (250 X 4,6 mm i. D., 5 pm PartikelgroBe) werden in der Regel Schleifen von 10-50 pL verwendet. Um Memory- bzw. Verdunnungseffekte zu vermeiden, ist die Schleife vor der Probenschleife

m m J -

Q

Saule

P

Abb. 4-8: Aufiau eines Dosierventils.

4.3 Probenaufgabe

75

Injektion mehrmals mit der Probenlosung zu spulen. Die Spritze darf erst nach dem Umschalten des Ventils, also nach der Injektion, wieder herausgezogen werden, da sonst die Probe dabei wieder teilweise entfernt oder Luft aus dem Uberlauf in die Schleife gezogen werden kann. Die Reproduzierbarkeit bei vollstandig gefullter Schleife ist naturgemaB sehr gut, da keine Verluste auftreten konnen. Mit Vorsicht zu geniesen sind aber die Herstellerangaben uber die absoluten Schleifenvolumina, wobei es erhebliche Abweichungen vom Sollwert geben kann. Dosierschleifen lassen sich auch leicht selbst herstellen und vermessen [4-11. Beim Einbau oder beim Wechseln von Schleifen ist groBe Sorgfalt auf die Vermeidung von Totvolumina zu verwenden. Ebenfalls sol1 die Kapillare zwischen Ventil und Saulenkopf moglichst wenig zu einer zusltzlichen Bandenverbreiterung beitragen, das heiBt, Lange und Innendurchmesser (0,l-0,2 mm) mussen minimiert werden. Fur das Dosiervolumen einer Schleife gilt als Faustregel, dal3 es maximal ein Viertel des Elutionsvolumens des schmalsten Peaks betragen sollte. Weiterhin sind Uberladungseffekte im Sinne einer perfekten Peakform und Trennleistung zu vermeiden. In der Praxis mu13 bei komplexen Proben aber oft ein KompromiS gewahlt werden, z. B. wenn es gilt, Spuren- neben Hauptbestandteilen nachzuweisen, so daS die optimalen theoretischen Bedingungen nur selten realisierbar sind. Besonders stark belastet ist die Dichtungsscheibe (rotor seal), die das HauptverschleiSteil darstellt. Undichtigkeiten erkennt man an schwankenden Peakflachen bzw. durch Flussigkeitsaustritt am SpritzeneinlaB. Mit etwas praktischem Geschick ist die Auswechslung der Dichtung leicht durchzufuhren.

4.3.2 Automatische Injektion Auch bei den Probengebern wird heute meistens eine Kombination aus Dosierventil und Spritze eingesetzt , wobei diese entweder pneumatisch oder elektrisch betrieben werden. Statt der Verwendung einer Druckgasflasche lohnt sich oft schon aus praktischen Grunden auf langere Sicht der Kauf eines (leisen!) Kompressors (ca. DM 2000,-). Es gibt Probenautomaten, die ,,alles" konnen, von Standardzumischungen uber Verdunnungsreihen bis zu Derivatisierungsreaktionen,was sehr hilfreich sein kann. Es ist aber zu bedenken, daS sich hierdurch auch die Fehlermoglichkeiten und die apparativen Anfalligkeiten potenzieren. Vor einem Kauf ist deshalb sehr sorgfaltig zu priifen, ob und welche Ausbaustufe in der Praxis wirklich gebraucht wird. Es werden Gerate mit Kuhlmoglichkeiten des Probentellers angeboten. Dies kann selbst bei weniger empfindlichen Proben sinnvoll sein, da diese

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eventuell mehrere Stunden bis zur Einspritzung der Umgebungstemperatur ausgesetzt sind.

4.3.3 Microboretechnik - Praparatives Arbeiten Die Herabsetzung der Saulendimensionen erzwingt notwendigerweise die Minimierung der externen Totvolumina und damit auch des Dosiervolumens (<1 pL). Hierfiir gibt es spezielle Ventile, z. B. mit internen Schleifen oder anderen geeigneten Volumenvorgaben. Schleifen- oder Dichtungswechsel lassen sich meistens nur noch mit Spezialwerkzeugen bzw. vom Hersteller durchfuhren. Bei praparativen Arbeiten wird oft bewul3t eine Uberladung in Kauf genommen, je nach Problemfall und Saulendimension werden Schleifen bis zu 2 mL Dosiervolumen eingesetzt, die man sich leicht selbst aus einer geeigneten Kapillare herstellen kann.

4.4 Trennsaulen Trotz ihres im Vergleich zu anderen Modulen relativ geringen Preises, ist die Saule eine zentrale Komponente der HPLC-Anlage. Ihre Qualitat limitiert die Trennleistung des Systems. Normalerweise werden Trennsaulen als Fertigsiiulen bezogen, wobei einige Firmen preisgunstige Refill- oder Austauschangebote im Programm haben. Das Fullen mit Phasenmaterial im eigenen Labor erfordert ein Saulenfullgerat (ca. DM 5000,-, z. B. Shandon) und erhebliche Erfahrung bzw. Zeitaufwand. Dies lohnt sich im Regelfall nur, wenn der Saulendurchsatz sehr grol3 ist oder Spezialsaulen benotigt werden. Je kleiner der Partikeldurchmesser des Phasenmaterials (<7 pm), desto schwieriger wird es, mit Labormitteln leistungsstarke und reproduzierbare Fullungen bzw. Trennsaulen herzustellen.

Material Beim Saulenmaterial dominiert Edelstahl, aber es sind ebenfalls Glas- (z. B. Merck) und Polymerausfuhrungen (z.B. Dionex) auf dem Markt. Fur Glas spricht die Durch(Ein-)sichtigkeit und die glatte Oberflachenbeschaffenheit der Innenwandung. ,,Druckpanzer" 0.a. gehoren bei den verwendeten Glassorten der Vergangenheit an bzw. sind nur noch symbolische Sicherheitsauflagen.

4.4 Trennshulen

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Fittings Um die AnschluBprobleme bei Saulenwechsel, Gerateumriistungen etc. (vgl. Abschn. 4.7) zu umgehen, werden von einigen Herstellern Kartuschensysteme angeboten. Durch die in Abschn. 4.7 beschriebenen anpaabaren Fittings, Handverschraubungen und durch geschickt konstruierte Saulenkopfe, haben sie etwas an Bedeutung verloren. Beim Koppeln von Saulen oder Vorsaulen konnen sich beim Einsatz von Kartuschen aber Vorteile hinsichtlich einer Totvolumenminimierung ergeben (keine zusatzlichen Verbindungskapillaren notwendig). In jedem Fall sollte man sich moglichst auf einen Saulen- bzw. AnschluBtyp festlegen. Dies erleichtert die Ersatzteillagerung hinsichtlich Filter, Fritten, Verschraubungen etc. erheblich. Es ist nicht konsequent durchzufiihren, da kein Hersteller alle Variationen hinsichtlich Saulendimensionen und Phasenmaterialien anbieten kann. Es gibt sogar Firmen, die ihre Saulen nur an Kunden verkaufen, die auch ihr HPLC-Gerat dort bezogen haben! Saulenpflege Eine Moglichkeit ist es, die (teure) Hauptsaule durch eine (billigere) Vorsaule zu schutzen. Dies empfiehlt sich vor allem bei wenig aufgereinigten Extrakten und ist auch sinnvoll, da meistens wirklich nur die ersten Millimeter des Phasenmaterials oder die Filter verunreinigt sind. Nach Austausch der Vorsaule sollte die Trennung wieder gelingen, vorausgesetzt , die neue Vorsaule entspricht reproduzierbar der alten (vgl. Abschn. 4.5) und die Verbindungen wurden ordnungsgemaB hergestellt. Bei der Wahl des Saulentyps ist es sehr wichtig, darauf zu achten, daB die Filter und Fritten am Saulenkopf leicht auswechselbar sind und daB man ebenfalls an das Phasenmaterial des Saulenanfangs herankommt . Oft werden Trennsaulen, die in ihrer Effizienz nachlassen, Peaksplitting oder verzerrte Peakformen zeigen, sehr schnell ausgemustert, obwohl sie mit geringem Aufwand wiederhergestellt werden konnten. Zunachst wird man versuchen, durch Spiilen mit verschiedenen FlieBmittelkombinationen die Saule wieder zu regenerieren (unterschiedlich je nach Phasenmaterial; Hersteller-, Kataloghinweise beachten oder s. z.B. [4-21). Wenn dies nicht zum Erfolg fuhrt, sollte man zum Schraubenschlussel greifen. Aus den Anfangszeiten der Chromatographie hat sich bei vielen anscheinend das Dogma heriibergerettet ,niemals den Saulenkopf anzuriihren, was aber vollig unbegriindet ist . 1st keine Vorsaule im Einsatz, werden zunachst Filter und Fritten ausgewechselt und kontrolliert, ob das Phasenmaterial gesackt ist undoder ob es verfarbt ist. Es konnen ohne weiteres (nicht bei Microbore-Saulen!) einige wenige Millimeter mit einem Spate1 entfernt werden. Hierzu mu8 bemerkt werden, daB eine Verstopfung oder Verdichtung der oberen Schicht nicht immer optisch (z.B. durch Verfarbung) zu erkennen ist. Naturlich muB das entstandene Totvolumen wieder perfekt aufgefiillt werden, wozu man am

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besten sogenannte ,,glassbeads" mit sehr kleinen Durchmessern (z. B. 40 pm von Whatman) verwendet. Mit etwas Geschick hat man so oft in einer halben Stunde Arbeitszeit sehr vie1 Geld gespart.

Siiulenabmessungen Die gebrauchlichen analytischen Saulendimensionen beinhalten Langen von 100 bis 250 mm mit Innendurchmessern von 4 bis 4,6 mm. Ungefahr ab 2 mm Innendurchmesser (es gibt keine einheitliche Regelung) spricht man von Microboresaulen, die bis in den Bereich von 100 pm Innendurchmesser angeboten werden (z. B. LC-Packings). Ausfuhrliche Beschreibungen dieser Technik werden in [4-3, 4-41gegeben. Beim Kauf von praparativen Saulen sollte man sich vergewissern, ob die vorhandene Pumpenausstattung bei den gewahlten SaulenausmaBen und Phasenpartikeldurchmessern die benotigten hohen Fluhaten fordern kann (Druckbegrenzung). Fur die Isolierung von ublichen Mengen an Reinsubstanzen zu Zwecken der Strukturaufklarung eignen sich z. B. Saulen mit 5 pm RP-Material und MaBen von 250 X 16 mm Innendurchmesser (ca. DM 2000-3000,-).

4.5 Phasenmaterialien Allgemeines, Eigenschaften Basis fur die meisten Materialien ist immer noch Kieselgel. Dieses fungiert selbst als stationare Phase oder wird chemisch in vielerlei Weise modifiziert (einige Beispiele werden in Abb. 4-9 aus [4-51 gegeben). Die am haufigsten verwendeten Derivate stellen RP-18-Phasen dar (vgl. Abschn. 2.2.1), an ihnen werden schatzungsweise mehr als 80 % aller Trennungen durchgefuhrt . Kieselgel und modifizierte Kieselgele sollten nicht pHWerten groBer 8 oder kleiner 2 (RP-Phasen nicht <4) ausgesetzt werden. Wesentlich stabiler im alkalischen Milieu ist Aluminiumoxid (pH-Bereich 2-12). In Applikation 7.8 wird ein Beispiel mit einer beschichteten Aluminiumoxidphase gezeigt. Einsatzmoglichkeiten fur pH-Bereiche bis 13 bieten Polymerphasen. Basis sind hier oft Styrol-Divinylbenzol-Copolymere(vgl. Abschn. 2.2.2). Eine vollzahlige Aufstellung der verschiedenen Phasen kann hier nicht gegeben werden, auch eine Einteilung nach Trennmechanismen, wie in Kap. NP- und RP-Chromatographie, ist nicht konsequent durchzufuhren. Oft uberlagern sich verschiedene Effekte, dies kann vom FlieBmittelsystem, von den zu analysierenden Verbindungen und von der Phase selbst abhangen. Cyclodextrinphasen (Abb. 7-23) konnen 2.B. je nach FlieBmittel NP- oder RP-

4.5 Phasenmaterialien

Oc tadecy 1 Octyl Hexyl Dimethyl Tr imethyl

-Si (CH,)

Cyclohexyl Phenyl Biphenyl Dimethylamino Amino Aminopropyl A1 kyl amino Nitro Nitril Alkylnitril Propionitri 1 Oxyxpropionitril Diol (vic. Hydroxyl)

-CiOHH-’iH2 OH

Polycaprolactam (Polyamid , Nylon Abb. 4-9: Beispiele fiir Phasenmatenalien.

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Eigenschaften zeigen [4-61. Der Einsatz der HPLC zur Enantiomerentrennung hat eine ganze Reihe weiterer chiraler Materialien hervorgebracht, die auch fur ,,normale" analytische Zwecke gut genutzt werden konnen (vgl. Abschn. 7.10 und 7.11). Die Vielzahl der stationaren Phasen in Verbindung mit Variationen der FlieBmittel bietet dem phantasievollen Analytiker ein unendliches, manchmal auch praxisrelevantes Betatigungsfeld. Die zusatzlichen Wechselwirkungsmoglichkeiten mit der mobilen Phase ergeben einen wesentlichen Vorteil im Vergleich zur Gaschromatographie, machen Vorhersagen uber das Retentionsverhalten aber auch schwieriger. Auf die Nichtreproduzierbarkeit von chromatographischen Ergebnissen beim Einsatz verschiedener oder sogar anscheinend gleicher Phasenmaterialien sei an dieser Stelle nochmals hingewiesen (vgl. Abschn. 2.2.1). TeilchengroBe Je kleiner der Teilchendurchmesser, um so hoher sollte die erreichbare Bodenzahl sein, dies ergibt sich schon aus den in Abschn. 2.1 beschriebenen theoretischen Grundlagen. In der Praxis stehen dem allerdings einige Dinge entgegen. Die kleinsten kommerziell zur Zeit erhaltlichen Teilchen haben einen mittleren Durchmesser von 3 pm. Naturlich ergibt eine damit gefullte 250 x 4,6 mm i. D. Saule im Vergleich zu einer 5 pm Saule eine wesentlich bessere Trennung. Ihr Einsatz kann die Losung bei komplexen Problemen bedeuten. Man muB aber den erheblichen Druckanstieg bedenken, bei MethanoWWassergradienten konnen leicht Werte von uber 30 MPa erreicht werden. Die gangigen Pumpen vertragen zwar im Regelfall 40 MPa, die Frage ist nur, wie lange. Reichen kurzere Saulen aus, so spielt das Druckproblem eine geringere Rolle. Je kleiner der Partikeldurchmesser, um so gravierender machen sich auch externe Totvolumina bemerkbar. Am haufigsten verwendet werden zur Zeit fur analytische Aufgabenstellungen 5 pm-Teilchen, bei denen auch der Einsatz langer Saulen eigentlich kein HPLC-Fabrikat vor grol3e Probleme stellen sollte.

4.6 Detektoren Die wichtigsten, d. h. meistgebrauchten Detektoren sind Photometer (UV/ VIS mit fester oder variabler Wellenlange; Photodioden-Array-Detektoren), elektrochemische Detektoren, Brechungsindex (R1)-Detektoren, Leitfahigkeitsdetektoren; haufig werden auch Fluoreszenzdetektoren eingesetzt. Daneben gibt es Reaktionsdetektoren, die meistens in Kombination mit UV oder Fluoreszenz betrieben werden. Tab. 4-1 vergleicht die Eigenschaften einiger Detektoren.

4.6 Detektoren

81

Tab. 41: Einige Detektoren im Vergleich ParameterEinheit

UVNIS AU

RI RI-Einheit

ECD pamp

Fluorimeter

Gradiententauglichkeit typische Empfindlichkeit Stabilitat hearer Bereich

selektiv ja 1-10 ng hoch 5 x lo3

universe11 nein 100 ng niedrig 5 x Id

selektiv nein 0,1 g niedrig 5 x 103

selektiv ia 0,Ol ng sehr hoch

104

Einige wichtige Begriffe: Zeitkonstante (rise time): MaB fir die Registriergeschwindigkeit des Detektors. Mit kleiner Zeitkonstante konnen schnelle Peaks registriert werden, allerdings wird auch das Rauschen groBer. Meist ist die Zeitkonstante einstellbar. Rauschen: Hochfrequentes Rauschen ist oft elektronisch bedingt . Niederfrequentes Rauschen kann aufgrund von Gasblasen im System, Verunreinigungen oder auch durch Temperaturschwankungen zustandekommen. Drift: Abwandern der Nullinie. 'Ijrpische Spezifikationen fur UV-Detektoren lieAU/h bei warmer Lampe (AU = Absorption gen im Bereich von 1 X units full scale). Meist erhalt man Uberlagerungen von Rauschen und Drift. Grundsatzlich kann man konzentrationsabhangige Detektoren von stoffstromabhangigen unterscheiden. Bei konzentrationsabhangigen Detektoren (z. B. UVNIS-, Fluoreszenz-, RI-Detektoren) ist das vom Detektor ausgegebene Signal proportional zu der in der MeBzelle vorhandenen Konzentration des zu detektierenden Stoffes. Bei diesen Detektoren ist damit die Peakfllche abhangig von der FlieBgeschwindigkeit des Eluenten. Hat man z.B. in der DurchfluBzelle eines UV-Detektors eine UV-aktive Substanz und stoppt die Pumpe, wird der Integrator Peaks beliebiger GroBe aufzeichnen. Das bedeutet, daB auch unbeabsichtigte und nicht erkennbare FluBschwankungen das Ergebnis quantitativer Bestimmungen bei diesen Detektoren verfdschen konnen. Bei stoffstromabhangigen Detektoren (z. B. coulometrischen elektrochemischen Detektoren) ist das Signal der Substanzmenge proportional; bei letzteren wird die Substanz verandert bzw. zerstort.

82

4 Module

4.6.1 UVNIS-Detektoren UV-Detektor: Der UV-Detektor ist der meistverwendete Detektor in der HPLC. Die Griinde hierfur sind folgende: Gradiententauglichkeit - selektiv, wobei die Selektivitat nicht so ausgepragt ist wie z. B. beim Fluorimeter - gute Empfindlichkeit bei hoher Stabilitat und leichter Handhabbarkeit . -

Fruher dominierten Detektoren mit fester Wellenlange, da sie meist empfindlicher detektierten als solche mit variabler Wellenlange. Der Grund hierfur liegt in der intensiven Emissionbande der Hg-Dampflampen bei 254 nm. Inzwischen sind aber die Empfindlichkeitsunterschiede durch konstruktive Verbesserungen bei den Detektoren variabler Wellenlange zu vernachlassigen. MeBprinzip: Wie immer in der Photometrie wird die Intensitat der Absorption durch das Lambert-Beersche Gesetz (exakter Bouguer-LambertBeersche Gesetz) beschrieben:

mit: A E

c d

Absorbance (= Extinktion) molarer Extinktionskoeffizient Stoffmengenkonzentration in moVL Schichtdicke (Lichtweg)

Die Empfindlichkeit der Detektion hangt also zunachst von Substanzeigenschaften ( E = molarer Extinktionskoeffizient) und vom Lichtweg ab. Abb. 4-10 zeigt den Strahlengang eines UV-Detektors mit variabler Wellenlange. Die wichtigeren Bauteile werden kurz erwahnt. Lampen: Die in mit UV-Detektoren variabler Wellenlange meistgebrauchten Deuteriumlampen sind fur Messungen im Sichtbaren (VIS) nur eingeschrankt geeignet, da die Intensitat ab ca. 400 nm deutlich nachlaBt. Manche Hersteller benutzen Xenonlampen (etwas weniger intensiv im UV) oder setZen fur den sichtbaren Bereich eine zusatzliche Lampe (Wolfram) ein. Welche dieser Anordnungen vorteilhaft ist, hangt vom Einsatzgebiet ab. Die Unterschiede spielen meist auch nur im Grenzbereich eine Rolle. Charakterisiert werden Detektoren u. a. uber das typische Rauschen. Dieses liegt in der GroBenordnung von lo-’ A U (Absorption Units) bei Wellenlangen zwischen 200 und 300 nm. Der lineare Bereich liegt zwischen und ca. 1,5 AU, also etwa 5 x 103.

4.6 Detektoren

83

Strahl-4 Photodiode

I

Gitter

w

Photodiode Abb. 410 UV-Detektor mit variabler Wellenlange.

DurchfluBzellen: Die Kuvetten (FluBzellen) sind meist Z-formig aufgebaut, um einen ausreichend groBen Lichtweg sicherzustellen. Man unterscheidet FluBzellen fur analytisches und praparatives Arbeiten sowie Microbore-FluBzellen. Wichtige KenngroBen sind der Lichtweg und das Volumen der Zelle. Wahrend man fur praparatives Arbeiten, d. h. groBe Substanzmengen, relativ kurze Lichtwege bei groBem Zellvolumen hat, ist bei MicroboreZellen das Volumen klein und der Lichtweg groB; normale analytische Zellen liegen in den AusmaBen dazwischen (z. B. 5-10 pL bei 6-10 mm Lichtweg). Geringe Unterschiede in der Geometrie konnen im Betrieb groBere Unterschiede bedingen, z. B. ist bei manchen Detektoren ein Restriktor unabdingbar, wahrend andere Detektoren weniger empfindlich sind. Ein Restriktor ist eine Einrichtung, die den Eluenten unter einem gewissen Druck halt, wenn er die Saule v e r l at ; dadurch wird die Bildung groaerer Gasblasen verhindert. Zur Sicherheit ist in jedem Fall zumindest eine Restriktionskapillare (Edelstahlkapillare mit geringem Innendurchmesser) zu empfehlen. Man muB allerdings die Druckfestigkeit der FluBzelle beachten, da sonst ein nicht unerheblicher Schaden durch geplatzte Kuvettenfenster eintritt. Ubliche Zellen haben obere Druckstabilitaten von ca. 7 MPa, manche nur von 1 MPa. Fur TSP-LCMS braucht man in jedem Fall spezielle Zellen, die mindestens 15-20 MPa aushalten. EinfluB des Eluenten: Liisungsmittel, die bei der UV-Detektion eingesetzt werden, mussen selbstverstandlich bei der Detektionswellenlange durchlassig sein, d. h. mindestens 80 % UV-Durchlassigkeit haben, da ansonsten die Nachweisempfindlichkeit stark abnimmt (s. Tab. 4-2).

84

4 Module

Tab. 42: UV-Durchlassigkeit wichtiger Liisungsmittel (nach Merck-Katalog, 1993)*. Gemessen bei d = 1 cm gegen Wasser. Angaben in nm

Lijsungsmittel

20 %

80 %

Aceton Acetonitril 1-Butanol Cyclohexan 1,2-Dichlorethen Dichlormethan 1,CDioxan Ethanol Ethylacetat n-Heptan n-Hexan Isooctan Methanol 2-Propanol Tetrachlormethan Tetrahydrofuran Toluol Trichlorbenzol Trichlormethan

340 190 220 220 230 235 220 210 260 200 200 210 210 210 265 255 290 310 250 235

350 195 240 240 245 245 270 240 275 220 225 235 235 230 280 370 310 315 260

1,1,2-Trichlorfluorethan

Wasser

*

-

245 -

98 % 360

>220 310

>260 >280 >260 >300 >260 >300 >245 >260 >270 >260 >260 >290 >310

>350

>385 275 260 > 190

Die Angaben anderer Hersteller (Riedel de Haen, Baker, Roth) weichen z.T. geringfiigig von diesen ab.

Detektoren mit Umkehroptik: Ein Sonderfall bei UV-Detektoren sind solche mit Umkehroptik. Hier erfolgt wie beim nachfolgend beschriebenen Dioden-Array-Detektor die spektrale Zerlegung des Lichtes hinter der DurchfluBzelle, allerdings sind nur wenige Dioden vorhanden. Mit diesen Detektoren konnen Spektren gemessen werden (mit geringer optischer Auflosung) und Chromatogramme bei mehreren Wellenlangen aufgenommen werden . Indirekte UV-Detektion: Eine besondere Arbeitsweise ist die indirekte UV-Detektion. Hierbei wird der mobilen Phase ein Additiv zugemischt, das im UV absorbiert. Werden nicht UV-absorbierende Probenmolekule eluiert, so gelangt mehr Licht auf den Empfanger und es entsteht ein negativer Peak. Ein Problem dabei ist das Auftreten von Systempeaks.

4.6 Detektoren

85

4.6.2 Dioden-Array-Detektoren Eine spezielle Variante des UVNIS-Detektors ist der Photodiodenarraydetektor. Abb. 4-11 zeigt den typischen Strahlengang eines DAD: Das Licht einer Deuterium- oder Xenonlampe gelangt durch die Aperturblende, die DurchfluBzelle, die Linsen zur Fokussierung und deren Spalt auf ein holographisches Gitter, wo es spektral zerlegt wird. Von dort fiillt das spektral aufgespaltene Licht auf den Array. Der Array ist im Prinzip ein Siliconsubstrat, auf das durch Halbleitertechnologie eine groBere Anzahl von Dioden (meist 128 bis ca. 1000) in einer einzigen Reihe von ca. 2 cm Lange aufgebracht sind. Der prinzipielle Unterschied besteht darin, daB die spektrale Zerlegung des Lichtes beim normalen UV-Detektor vor (s.o.),beim DAD nach der Flu& zelle erfolgt. Die Dioden des Arrays sind normalerweise aufgeladen, werden sie von Licht getroffen, entladen sie sich. Der Strom, der zur Wiederaufladung benotigt wird, ist abhangig von der Intensitat des Lichtes. Da das Licht spektral zerlegt wurde, ist jede Diode auch fur eine bestimmte Wellenlange (einen bestimmten Bereich) ,,zustandig". Dadurch wird die Lichtintensitat bei jeder Wellenlange genau und gleichzeitig gemessen. Hierin liegt der wesentliche Unterschied zu schnell scannenden UV-Detektoren, bei denen z. B. das GitFlufSzelle Eluent

Holographisches

HPLC

Integrator/ Datensystem Abb. 411: Schernatischer Aufbau eines Dioden-Array-Detektors.

86

4 Module

ter gedreht wird. Diese brauchen eine gewisse Zeit, um ein komplettes Spektrum aufzunehmen. In dieser Zeit hat sich die Zusammensetzung des Gemisches in der DurchfluBzelle aber bereits geandert. Die Spektren werden elektronisch aus dem Diodenarray gewonnen. Obwohl dies normalerweise nur etwa 40-200 msec dauert, konnen viele Detektoren nur maximal ein Spektrum pro Sekunde aufnehmen. Naturlich gilt das Lambert-Beersche Gesetz, daB man hier wie folgt schreiben kann: = -log

mit: A P Po

s

D R n

Sn - Dn Rn - Dn

= Absorbance = durchgelassenes Licht = eingestrahltes Licht = Signal wahrend der Analyse = Signal wahrend des Dunkeltests = Referenzsignal = Kana1 (Wellenlange)

Die Vorteile des DAD liegen in der wesentlich groBeren Sicherheit der Detektion, insbesondere dann, wenn die gesuchte Substanz ein charakteristisches UV- oder VIS-Spektrurn aufweist. Coelutionen konnen besser erkannt werden und eine Reinheitskontrolle des eluierten Peaks ist moglich. Falls die Spektren sehr ahnlich oder sogar gleich sind, wie z.B. bei Glykosiden mit gleichem Aglykon (nur dieses ist UV-aktiv) , konnen Coelutionen naturlich nicht erkannt werden. GroSe Unterschiede gibt es bei den Programmen zur Steuerung des Gerates und bei der Auswertung. Die meisten Gerate speichern automatisch Spektren der Basislinie, der beiden Flanken und des Maximums (,,upapex-down"). Dazu muB dem Gerat ein bestimmter Wellenlangenbereich, in dem ein Peakanstieg registriert werden soll, vorgegeben werden (2.B. 200-550 nm). Man kann bei vielen Geraten fortlaufend Spektren aufnehmen und speichern. Dies ist aber nur dann sinnvoll, wenn man hinterher aus den Spektren auch wieder die Chromatogramme bei einer beliebigen Wellenlange des MeBbereichs rekonstruieren kann, z. B. um die optimale Wellenlange fur eine Quantifizierung im nachhinein festlegen zu konnen, ansonsten ist es Speicherplatzverschwendung. Die meisten Detektoren konnen Chromatogramme bei mindestens zwei (oft vier oder acht) Wellenlangen aufnehmen. Die Anzahl der Dioden spielt fur die spektrale Auflosung eine Rolle; diese liegt meist zwischen 1 und 4 nm. Viele Hersteller benutzen das Spektrum des Benzols um die Gute ihres Detektors zu demonstrieren. Ziel ist es, moglichst viele ,,Finger" des Benzols im Bereich zwischen 200 und 300 nm erkennen zu konnen (Abb. 4-12). Die Auflosung des Detektors sagt allerdings fur sich

4.6 Detektoren

I

200

220

440

ZSO

210 nm

87

Abb. 412: Spektrum von Benzol mit DiodenArray-Detektoren verschiedener Auflosung.

allein wenig uber dessen Eignung aus, da hierbei keine Aussage uber die Nachweisempfindlichkeit gemacht wird. Glattungsalgorithmen: Wie bei anderen spektroskopischen Methoden auch (FTIR, MS), kann ein verrauschtes Spektrum durch Rechneroperationen geglattet werden. Meist werden Sawitzky-Golay-Funktionenbenutzt . Das Resultatspektrum sieht optisch besser aus, allerdings geht mdglicherweise auch spektrale Information verloren, weshalb solche Prozeduren nur wohldosiert angewandt werden sollten. Wenige Detektoren konnen im Bereich von oberhalb 600 nm messen. Dieser Bereich ist z. B. fur manche Pflanzenfarbstoffe (Chlorophylle, Phaophytine und -phorbide, Carotinoide) wichtig.

88

4 Module

4.6.3 Brechungsindex-Detektoren(RI-Detektoren) Die RI-Detektoren stellten in der Anfangszeit der HPLC haufig benutzte Systeme dar. Durch das universelle Detektionsprinzip konnen auch photometrisch inaktive Substanzen ohne Derivatisierung detektiert werden (z. B. Kohlenhydrate). Wichtige Nachteile sind die Gradientenuntauglichkeit, die Empfindlichkeit gegenuber Temperaturschwankungen sowie die relativ unempfindliche Detektion. Dies hat dazu gefuhrt, daB die Nutzung dieser Detektoren abgenommen hat. Da aber in vielen offiziellen Methoden noch RI-Detektoren verwendet werden, sollen die Funktionsprinzipien hier erlautert werden. RI-Detektoren arbeiten nach verschiedenen MeBprinzipien, man unterscheidet: - Fresnel-Typ - Deflektions-Typ - Interferenz-Typ Detektoren des Fresnel- und Deflektions-Typs sind weiter verbreitet als solche vom Interferenz-Typ. Fresnel-Qp: Die reflektierte Lichtmenge an einer Phasengrenze ist nicht allein vom Einfallswinkel, sondern auch von den Brechungsindices der Medien an der Phasengrenze abhangig. Ein Teil des Lichtes wird daher reflektiert und geht an der Phasengrenzflache Prisma-Eluat verloren, der Rest wird an der zweiten Phasengrenzflache (Eluat-Metall) reflektiert und gelangt auf den Photodetektor (Abb. 4-13). Eine analog aufgebaute Referenzzelle (nicht in Abb. 4-13 dargestellt) wird vom Licht derselben Lampe bestrahlt. Durch eine Substanz im Eluat andert sich die Lichtintensitat auf dem Empfanger. Der Helligkeitsunterschied ergibt das Signal. Deflektionstyp (Abb. 4-14): Die geteilte MeBzelle wird zweimal vom Lichtstrahl passiert und durch ein Null- oder Justierglas abgeglichen. Durch ein Prisma wird der Lichtstrahl geteilt und gelangt mit gleicher Intensitat auf zwei Photodioden. Ein Teil der 0 . a. Merjzelle ist mit FlieDmittel gefullt, durch den anderen gelangt das Eluat der HPLC-Saule. Wird in letzterer durch Elution einer Probensubstanz der Brechungsindex verandert, so erfahrt der Lichtstrahl eine Ablenkung, dies hat eine Intensitatsanderung zur Folge. Dadurch wiederum wird die Intensitat des Lichts auf beiden Photodioden unterschiedlich und somit ein Signal erzeugt, daB in der ublichen Weise verstarkt und an die Aufzeichnungseinheit weitergegeben wird. Interferenz-Qp (Abb. 4-15): Monochromatisches Licht wird durch einen Strahlteiler geteilt und getrennt durch Referenz- und Probenkuvette geleitet.

4.6 Detektoren

89

Abb. 4-W: RI-Detektor,Fresnel-Typ.

Der Strahl wird anschlieBend wieder vereinigt. Falls sich in beiden Kiivetten Substanzen unterschiedlicher Brechungsindices befunden haben, kommt es durch Interferenz zu einer teilweisen Ausloschung, woraus das MeBsignal resultiert. RI-Detektoren miissen sehr gut thermostatisiertwerden, denn eine Temperaturanderung um 1 "C kann eine groBere Signalanderung hervorrufen als

Spiegel

WeSzelle qalyt

.

Abb. 4-14: RI-Detektor, Deflektions(Ab1enkungs-)typ.

90

4 Module Strahlteiler

MeSzel le Probe

Strahlteiler

.etektor

Abb. 415: RI-Detektor, Interferenz-Typ.

eine geringe Menge eluierter Substanz. Sollen aber bei Zuckern z. B. Mengen von 100 ng/mL detektiert werden, ist eine sehr genaue Thermostatisierung notig.

4.6.4 Elektrochemische Detektoren (ELCD) Der schlechte Ruf der elektrochemischen Detektoren beruht oft auf Erfahrungen alterer Analytiker mit den ersten Geraten dieser Art. Diese schienen schon vom apparativen Aufbau her, ein Studium der Elektrochemie oder Elektrotechnik nahezulegen. Dies ist aber mittlerweile nicht mehr gerechtfertigt , Systeme der neueren Generation sind anwenderfreundlich und zuverlassig. Ein Problem ist allerdings geblieben: Da es sich um die Messung von Oxidations- oder Reduktionsvorgangen handelt , mussen immer Elektroden eingesetzt werden. Elektrodenoberflachen werden aber unweigerlich durch Reaktionsprodukte oder Matrixbestandteile aus der Probe belegt, so daB es zu Anderungen in der Ansprechempfindlichkeit kommt. Da dies von der Probe, der Probenanzahl, von Fliefimittelverunreinigungen etc. abhangen kann, ist die Reproduzierbarkeit und die quantitative Auswertung in Frage gestellt. Daraus folgt, daB mehr Eicharbeit als bei anderen Systemen notwendig ist bzw. Elektrodenreinigungen durchgefuhrt werden mussen. Bei Beachtung dieser Tatsache durch geeignete Kontrollmaanahmen (z. B. ,,Schachteleichung") ist ein ELCD ein wertvolles analytisches Werkzeug. Von der Nachweisempfindlichkeit (bis in den Picogrammbereich) her, gehort er zu den besten Detektoren. Der in der HPLC nutzbare Potentialbereich liegt zwischen 1,2 V und - 1,2 V. Einsatzbereiche hinsichtlich einzelner Verbindungsklassen werden bei [4-71beschrieben.

+

4.6 Detektoren

91

MeBzellenaufbau und Arbeitsweisen DurchfluBzellen arbeiten nach dem ,,wall-jet"-Prinzip (die Arbeitselektrode wird senkrecht angestromt) oder als Dunnschichtzellen. Abb. 4-16 zeigt den Aufbau einer Dunnschichtzelle mit den drei notwendigen Elektroden. Das fur die Oxidation bzw. Reduktion benotigte Potential wird zwischen der Arbeits- und Referenzelektrode angelegt. Je geringer das Potential dabei ist, urn so selektiver arbeitet der ELCD. Die Hilfselektrode dient zur Aufrechterhaltung des Potentials bei StromfluB. In Applikation 7.8 wird mit einer solchen Dunnschichtzelle gemessen. Passiert eine elektrochemisch aktive Substanz bei angelegtem Potential die DurchfluBzelle, wird sie oxidiert bzw. reduziert und der entstehende Strom gemessen. Es gelten folgende Beziehungen [4-81: Z-d*A * C : l mit Z = Grenzstrom d = Diffusionskoeffizient A = Elektrodenoberflache c = Konzentration der elektrochemisch aktiven Substanz I = Dicke der elektr. Doppelschicht

-

Grundlegend dabei ist, daB Z C ist. Bei quantitativem Stoffumsatz spricht man von einem coulometrischen Detektor. Eine amperometische Detektion liegt vor, wenn nur 5-15 % an der Arbeitselektrode umgesetzt werden. Fur die Elektroden werden je nach Aufgabenstellung verschiedene Materialien eingesetzt (Platin, Gold, Glassy-Carbon, chemisch modifizierte Elektroden, Enzymelektroden). Als Referenzelektrode dient meistens eine Ag/AgClRef erenzElektrode

HilfsElektrode

92

4 Module

Elektrode in einer Kaliumchloridlosung. Es sind aber auch Gerate mit Trokkenreferenzelektroden im Handel (z. B. Hewlett Packard). Die in der Applikation 7.8 venvendete DurchfluSzelle besteht aus zwei Halften. Zwischen diesen befindet sich ein Spacer, der das Zellvolumen festlegt. Es liegt zwischen 4 und 6 pL, kann fur Microbore-Zwecke aber auf unter 0,8 pL reduziert werden. Gepulste Amperometrie Wegen der Polarisierung von Elektroden bei langerem StromfluS wird oft nur im Pulsmodus gearbeitet, die Spannung also nur fur kurze Zeit angelegt. Unter gepulster Amperometrie versteht man aber in der Regel die Moglichkeit, vor Einstellung des MeBpotentials ein hoheres und anschlieoend ein negativeres Potential anzuwenden. Dies geschieht im Millisekundentakt und kann zur Beseitigung von storenden elektrochemisch aktiven Reaktionsprodukten oder Verunreinigungen fiihren. Pulsen uber einen langeren Zeitraum (z. B. uber Nacht) ist eine gute Moglichkeit, die Elektrodenoberflache ohne Ausbau zu reinigen. Eine wichtige Anwendungsmoglichkeit der gepulsten Amperometrie ist die Kohlenhydratbestimmung mit Goldelektroden in stark alkalischen Flienmitteln an speziellen Ionenaustauschersaulen [4-91. Multielektroden-Detektor Eine kostspielige Variante (Gesamtsystem > DM 150.000,-) stellt eine Art Elektroden-Array-Detektor dar, der monopolistisch von ESA angeboten wird. Wegen der ungewohnlichen Moglichkeiten sei das Prinzip kurz erlautert: Es konnen bis zu 16 coulometrisch arbeitende DurchfluSzellen bei einzeln anwahlbaren Potentialen hintereinandergeschaltet werden. Dies erlaubt auch in komplexen Extrakten auSerst empfindliche und sichere qualitative und quantitative Bestimmungen [z. B. 4-10].

4.6.5 Fluoreszenz-Detektor (FLD) Der Fluoreszenz-Detektor (FLD) ist in der HPLC-Analytik ein sehr empfindlicher und selektiver Detektor, da nur wenige Substanzklassen bei Anregung Fluoreszenzstrahlung emittieren, wie z. B. die PAK, Fluorescein, Chinin, optische Aufheller oder Ce(II1). Wieder andere konnen durch Derivatisierung selektiv in fluoreszierende Verbindungen uberfiihrt werden, wie z. B. Aminosauren mit o-Phthaldialdehyd und 2-Mercaptoethanol in einen blau fluoreszierenden Komplex [4-111. Bei der Absorption von UV-Licht geeigneter Wellenlangen werden Molekule in den angeregten Zustand uberfuhrt. Das Zuruckfallen der Elektronen in die urspriinglichen Energieniveaus kann spontan (Fluoreszenz) oder verzogert (Phosphoreszenz) mit Lichtemission

93

4.6 Detektoren

verbunden sein. Es konnen auch strahlungslose Ubergange stattfinden, die fur eine Detektion nicht in Frage kommen. Die emittierte Fluoreszenzstrahem = Emission) ist lhgerwelliger als das eingestrahlte UV-Licht lung ex = Excitation = Anregung). Bei der Fluoreszenz-Detektion wird detektorseitig stets mit einem Wellenlangenpaar bestehend aus axund gearbeitet. Wahrend die UV-Einstrahlung in die Detektor-DurchfluBzelle durch die Verwendung eines Linsensystems und des Monochromators gerichtet erfolgt, ist die Fluoreszenzstrahlung nicht gerichtet und wird raumlich in alle Richtungen gleichmaBig emittiert . Die Abschwachung der eingestrahlten UVStrahlung kann daher beim Durchtritt durch die MeSzelle hinter dieser gemessen werden (s. UV-Detektor). Dagegen wird die emittierte Fluoreszenzstrahlung senkrecht hierzu abgegriffen, so daB sie somit von der UVStrahlung nicht uberlagert wird. Mit Hilfe eines nachgeschalteten Monochromators kann nach Elimination moglicher Streustrahlung die Intensitat der Fluoreszenzstrahlungin einem Photodetektor gemessen werden (Abb. 4-17). Die Fluoreszenz-Intensitat (Z = Zo * E Q K) ist proportional zur Absorption des eingestrahlten Lichtes (Lambert-Beersches Gesetz: log I/Z = E . c d, mit E = Extinktionskoeffizient, Q = Quantenausbeute und K = Geratekonstante). Die Empfindlichkeit der Fluoreszenz-Messung kann durch die Erhohung der Intensitat der Anregungsstrahlung verbessert werden. Hierfiir wer-

(a,;

(a,;

a,,,

(a,)

- -

-

Durchf l a -

Xe-Lampe

x

c

11111111111111 chromator

(I0 )

11111111111111 chromator

photodetektor

Abb. 417: Prinzipieller Aufbau des Fluoreszenz-Detektors (FLD).

94

4 Module

den zumeist Hochdruckgasentladungslampen wie Xenon-Blitzlampen eingesetzt. Oberhalb eines linearen Proportionalbereiches von ca. zwei bis drei GroSenordnungen ( mol/L) flacht die Kalibriergerade durch Verminderung der Quantenausbeuten Q aufgrund von Selbstabsorptions- und Quencheffekten ab. Die Linearitat des FLD ist daher geringer als die eines UV-Detektors. Auch andere Quencher konnen die Messung storen. Die unteren Nachweisgrenzen liegen fur viele fluoreszierende Substanzen ohne Anreicherung im Bereich 0,l-100 pg/L. Von groBer Wichtigkeit fur die Messung mittels FLD ist die Wahl des jeweils richtigen Wellenlangenpaares fur die Anregungs- und Emissionsstrahlung. Fur die meisten haufig gemessenen Analyte sind diese Wellenlangen bekannt und konnen aus der Literatur entnommen werden. Die UV- und FL-Spektren der Substanzen konnen jedoch auch in scannenden Fluorimetern selbst aufgezeichnet werden, um die geeignetsten Wellenlangenpaare (haufig die Maxima) auszuwahlen. In einem chromatographischen Lauf treten haufig Homologe einer Substanzklasse gemeinsam auf, deren empfindlichste Wellenlangenpaare deutlich voneinander abweichen konnen. In diesem Fall kann es erforderlich werden, daS die eingestellten Anregungs- und Emissionswellenlangen wahrend des chromatographischen Laufs verandert werden mussen. Die modernen Gitter/ Gitter-Gerate gestatten die zeitgesteuerte Programmierung der Monochromatoren fur die unterschiedlichen Wellenlangen, um jeweils die optimalen MeBparameter einzustellen. Es gilt jedoch zu beachten, daB sich aufgrund der wechselnden Anregungsundoder Emissionswellenlangen die Basislinie des Chromatogramms verandert . 1st diese (sprunghafte) Basislinienveranderung auf oder in unmittelbarer Nahe eines Peaks, so sind Fehlintegrationen der Peakflachen unvermeidlich. Es ist in der Regel aber nicht erforderlich, bei jeder Einzelsubstanz eine optimale Anpassung des Wellenlangenpaares durch Zeitprogrammierung des FLD vorzunehmen. Vielmehr werden mehrere dicht hintereinander eluierende Substanzen, wie z. B. zwei- und dreikernige PAH o.a., gemeinsam mit einem KompromiB-Wellenlangenpaar gemessen, bevor in einer groBeren Elutionslucke im Chromatogramm die Zeitschaltung fur das nachste Wellenlangenpaar vorgenommen wird. Dies ist in Abb. 4-18 fur die PAH-Bestimmung mit RP-18 HPLC-FLD dargestellt [4-121. Mit Hilfe des FLD konnen nicht nur, wie hier beschrieben, FluoreszenzErscheinungen detektiert werden. Viele moderne Gerate sind in der Lage, auch andere Lumineszenz-Phanomene, wie z. B. die Phosphoreszenz und Chemilumineszenz, zu messen. Die Lumineszenz tritt als Lichtemission beim Ubergang von einem angeregten Zustand in den Grundzustand unterschiedlich verzogert auf. Durch das Ausblenden der schnellen Fluoreszenz-Strahlung (Delay) und einem erweiterten Integrations-Zeitfenster (Gate) sind

4.7 Fittings, Verschraubungen, Verbindungsleitungen

95

- 1

-I I

I

f Ex.305 nm

I Em.430

Exx280mrn Em.340 nm

I

nm

- 1

Em=%O nm

I

I I

I

1

I

I

0

10

20

30

MINUTES

Abb. 4-18 Wellenlangenschaltung bei der Trennung von PAK (aus 14-12]). HC-ODs, 30 X 2,6 mm, 0,5 mumin, AcCN-/H,O-Gradient: 40% 100% AcCN in 15 min, dann 22 min 100% AcCN: 1. Naphthalin; 3. Acenaphthen; 4. Fluoren; 6. Phenanthren; 7. Fluoranthen; 8. Pyren; 9. keine Angabe; 13. Benzo[a]anthracen; 14. Chrysen; 16. Benzo[e]pyren; 17. Benzo[b]fluoranthen; 19. Benzo[k]fluoranthen; 20. Benzo[a]pyren; 21. Dibenzo[a, hlanthracen; 22. Benzo[g, h, ilperylen; 23. Indeno[1,2,3-cd]pyren.

auch die Phosphoreszenz bzw., bei ausgeschalteter Lampe, die Chemilumineszenz etwa bei Aminosauren fur die Detektion heranzuziehen.

4.7 Fittings, Verschraubungen, Verbindungsleitungen Die Nichtbeachtung von scheinbar unwichtigen, kleinen technischen Details bei Anschlussen oder Verbindungen von einzelnen HPLC-Bausteinen kann leicht zu Fehlfunktionen oder zu schlechten Trennungen fuhren. Abb. 4-19 zeigt z. B. Peaksplitting, welches durch eine fehlerhafte Verbindung entstanden war und nicht eine (gewunschte) Antrennung der hier jeweils vorliegenden cis-trans-Isomeren darstellte. Bei den Verbindungskapillaren muB zwischen den Hochdruck- und den Niederdruckanwendungsbereichen unterschieden werden. Die Verbindungsleitungen bestanden friiher fast ausschlieBlich wegen der benotigten Druck-

96

4 Module

/

Abb. 4-19: Peaksplitting durch fehlerhafte Kapillarverbindungen.

festigkeit aus Stahlkapillaren mit einem Auaendurchmesser von 1/16 Zoll. Heute kommen verstarkt auch Kapillaren aus druckfestem Material geeigneter Polymere (z. B. PEEK = Polyetheretherketon) auf den Markt. Sie zeichnen sich durch eine hohere Flexibilitat aus. Teflon oder ahnliche Polymere eignen sich nur fur den Niederdruckbereich, da sie unter Druck zu ,,flieDen" beginnen. Die teilweise Transparenz ermoglicht es, Luftblasen erkennen zu konnen. Die Eigenschaft des ,,FlieSens" kann man sich zu Nutze machen, indem man nicht mehr dichtende Verschraubungen (z. B. bei Ventilen) mit Teflonband umwickelt. Der Innendurchmesser und die Lange (Ausnahme Niederdruckgradienten) der Leitungen sind bis zum Injektionsventil relativ belanglos. Um eine storungsfreie FlieBmittelzufuhr zu gewahrleisten, wird der Innendurchmesser hier eher etwas groaer gewahlt, er liegt zwischen 0,5 und 1 mm. Von der Probenaufgabe bis hin zum Detektor kommt es dann auf eine Minimierung des Totvolumens an, um unnotige Diffusionseffekte zu vermeiden. Das bedeutet, so kurze Verbindungen, wie noch handhabbar und moglichst kleine Innendurchmesser der Kapillaren (10,2mm). Bei Microboresystemen ist dies von noch essentiellerer Bedeutung, hierfiir gibt es oft spezielle Fittings. Tab. 4-3 gibt Auskunft iiber Totvolumina bei verschiedenen Kapillardimensionen. Zum Durchtrennen der Stahlkapillaren werden preiswerte Kapillarrohrschneidezangen angeboten (z. B. Techlab), aufwendige, trennscheibeniihnli-

4.7 Fittings, Verschraubungen, Verbindungsleitungen

97

'Rb. 4-3 Rohrvolumina

Rohr ID [mm]

Volumen pro cm U n g e in pL 0,s 290 494 11 25 35 70 85 149 170 229 300 460

640 1130 2000 4Ooo

Liinge pro mL in cm 2041 500 227 90,9 40,O 28,6 14,3 11,8 6,7 599 494 3,3 292 1,6

03 0-5 03

che Gerate 0 . a. sind unnotig. Ein Entgraten der Bruchstellen sollte aber sorgfaltig mit einer Feinfeile erfolgen, wobei kein Metallabrieb in das Innenrohr gelangen darf, gegebenenfalls wird durch einseitigen AnschluB eines Kapillarendes an das System auf freien Flus uberpriift. Besonders bei 0,l mm Innendurchmesser kann die Kapillare leicht verstopft oder zugequetscht sein, ohne daB dieses mit dem bloBen Auge zu erkennen ist. Auf der Niederdruckseite erfolgt die Abdichtung einer Verbindungsstelle meistens durch gebordelte Polymerschlauche. Teure Bordelzangen sind erhaltlich, lohnen sich aber nur, wenn oft erhebliche Systemanderungen vorgenommen werden oder man uber zahlreiche Anlagen verfiigt. In der Regel wird ein Satz passender, gebordelter Ersatzschlauche bei der Anschaffung mitgeliefert . Auf der Hochdruckseite werden zur Abdichtung uberwiegend sogenannte ferrules (Schneidringe oder Klemmkegel) eingesetzt. In allen Fallen, wo es auf Totvolumenfreiheit ankommt , sollten frei verschiebbare Schneidringsysteme gewahlt werden. Hier gibt es Kombinationen aus Stahl- und Polymerkegeln (Abb. 4-20). Reine Stahlschneidringe sind nach der Verschraubung auf der Kapillare fixiert. Da aber z. B. funf verschiedene HPLC-Saulenhersteller leider auch fiinf verschiedene Verschraubungsabmessungen bedeuten konnen, sollte bei Saulenwechsel eine Anpassung der Fittings moglich sein, ohne jeweils die Kapillare kurzen zu mussen. Auch durch VerschleiB oder Verformung konnen

98

4 Module

U

1

2

3

5

6

Abb. 4-20: Frei verschiebbares Verschraubungssystem. 1 Edelstahlverschraubung,2 Kapillarrohr, 3 Zangenschneidring, 4 Polymerschneidring,

5 AnschluBteil, 6 Anschlagposition (Kapillare/AnschluBteil)

Abb. 4-21: a) Kapillarrohr

mit Schneidring; b) Verschraubung mit Totvolumen durch nicht richtig positionierten Schneidring.

4.8 FlieBmittel

99

sich Veranderungen ergeben, die bei Verwendung alter Verbindungen mit fixierten Schneidringen dann zu Totvolumina fuhren (Abb. 4-21). Druckseitige Verschraubungen durfen nur im druckfreien (kein FluB) Zustand gelost oder angezogen werden (Verformungen!) . Bei geeigneten Fittings werden heute keine Schraubenschlussel mehr benotigt. Es lohnt sich, in den entsprechenden Katalogen, die Vielzahl der angebotenen Fittings zu studieren. Oft existieren Losungen, die einem vie1 ,,Handarbeit" und muhseliges Schrauben ersparen (z. B. Schrauben mit extra langem Gewinde fur problemlose Dosierventilanschlusse oder Polymerschrauben mit integriertem Dichtkegel etc.). Es lohnt sich auch, die Preise verschiedener Anbieter zu vergleichen, hier existieren z. T. erhebliche Unterschiede bei identischen Artikeln.

4.8 FlieBmittel Allgemeine Anforderungen Fur alle HPLC-FlieBmittel gilt ein absolutes Reinheitsgebot sowohl im Inland als auch im Ausland. Dies bezieht sich nicht nur auf Partikelfreiheit, sondern je nach gewahlter Betriebs- oder Detektionsart ebenfalls auf stoffliche Verunreinigungen oder Zusatze (z. B. Stabilisatoren). Von der gleichen Bezeichnung auf einer Losungsmittelflasche kann auch beim selben Hersteller nicht auf einen identischen Inhalt geschlossen werden! Den Angaben auf den teuren, zertifizierten HPLC-Losungsmitteln ist unserer Erfahrung nach aber zu trauen, doch selbst hier miissen unterschiedliche Chargen beachtet werden. Feste Verunreinigungen Hinsichtlich der Partikelfreiheit muB man bedenken, daB groBe Liisungsmittelmengen unter hohem Druck durch sehr englumige Verbindungsleitungen gepreBt werden, wobei die Saule einen Superfilter darstellt ! Deshalb konnen Staubteilchen verhangnisvolle Wirkungen haben. Losungsmittelfritten und zusatzliche Filter (ca. DM 50,-, z. B. Knauer) hinter Abrieb produzierenden Systemteilen (z. B. Kolbendichtungen) sind Pflicht. Eine regelmaBige Sauberung bzw. ein Austausch empfiehlt sich. Abb. 4-22 zeigt den EinfluB einer stark verunreinigten Mischkammerfritte auf die Basislinie bei isokratischer Betriebsart. Bei langerem Stehenlassen konnen in Wasser, vor allem in Pufferlosungen und selbst in stark methanolhaltigen Gemischen Mikroorganismen wachsen!

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-

min

Abb. 4-22: Basislinienbeeinfluhng durch verunreinigte Mischkammerfritte, UV 254 nm.

FlieRmittel-Zusiitze, -eigenschaften Beispiele zur Ermittlung und Berechnung geeigneter Fliefimittelzusammensetzungen in Abhangigkeit vom jeweiligen Trennproblem werden z. B . bei [4-21 angegeben. Tab. 4-2 zeigt die UV-Durchlassigkeiten der wichtigsten Fliefimittel. Stabilisatorzusatze, wie z. B. Antioxidantien (BHT), konnen sowohl die Elutionskraft , als auch die UV-Durchlassigkeit verandern bzw. beeintrachtigen. Urn noch ausreichend empfindlich messen zu konnen, sollte

+

min

Abb. 4-U: ,,Geisterpeaks". a) Gradientenbasislinie bei Verwendung von p. A.-Ware; 254 nm; b)

Gradientenbasislinie bei Verwendung von HPLC grade-Ware.

4.8 FlieBmittel

101

das Eluens bei der gewahlten Wellenlange mindestens 80 % Durchlassigkeit besitzen. Tab. 4-4 zeigt die eluotrope Reihe fir A1203(vgl. Abschn. 2.2.1). In Tab. 4-5 sind die Mischbarkeiten verschiedener Komponenten dargestellt. Die Mischbarkeit der verwendeten FlieBmittel ist naturlich eine Grundvoraussetzung [4-131. Fast alle Probleme vergroBern sich beim Einsatz eines Gradienten, also bei der Anderung der FlieBmittelzusammensetzung wahrend der Analyse. WahTab. 4 4 Eluotrope Reihe von Liisungsmitteln. Sortiert nach Elutionssttirke an A1203(nach Snyder und Kirkland, vertindert) Viskositat mPas

Liisungsmittel*

Polarittit q,

n-Pentan n-Hexan Isooctan Cyclohexan 1,1,2-Xichlorfluorethan Tetrachlormethan l,l,l-Trichlorethen tert-Butylmethylether Xylol Isopropylether Toluol Chlorbenzol Benzol Diethylether Trichlormethan Dichlormethan 1,2-Dichlorethan Ethyl-methylketon Aceton 1,4-Dioxan Tetrahydrofuran Ethylacetat Dimethylamin Nitromethan Acetonitril Pyridin Dimethylsulfoxid n-Propanol Ethanol Methanol Ethylenglykol Wasser

0,Ol 0,Ol 0,Ol 0,04 0,14 0,18 0,19 0,20 0,26 0,28 0,29 0,30 0,32 0,38 0,40 0,42

0 3 0,33 0,50 1900 0,71 0,97 0,85 0,35 0,62 0,37 0,59

0944

0,79 0 4 0,32 134 0,46 0,45 0,38 0,67 0,37 0,94 2,24 2930 1,20

0,51 0,56 0,56 0,57 0,58

0,63 0964

0,65 0,71 0,75 0,82 0,88

0,95 1,11

0,80 0,65 0,24 0,57 0,44

0960

19,90 1,00

Siedepunkt "C 36 69 99 81 48 77 74 53 138 68 111 132 80 34 61 40 83

80 56 101 66 77 55 101 82 115 189 97 78 65 197 100

* es sind auch Stoffe aufgefiihrt, die man aus toxikologischen Griinden moglichst meiden sollte.

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4 Module

Tab. 45: Mischbarkeit wichtiger FlieBmittel nach [4-131.

mischbar nicht mischbar

rend man bei isokratischer Betriebsweise je nach Detektionsart auch mit normaler p. A.-Ware auskommen kann, sind hier beste (teure) FlieBmittelqualitaten notwendig. Es kann zu ,,Geisterpeaks" kommen, die den Anfanger stark verunsichern. Abb. 4-23 zeigt ein Beispiel. Es erfolgt eine Anreicherung von FlieBmittelkomponenten (z. B. Stabilisatoren) am Saulenkopf, fur deren Elution vom Phasenmaterial die gewahlte Fliel3mittelausgangszusammensetzung nicht ausreicht. Steigt dann im Laufe der Gradientenanalyse die Elutionskraft des Eluenten an (z. B. durch lineare Erhohung des Acetonitrilanteils), so konnen diese, aus dem FlieBmittel am Saulenkopf gespeicherten Verbindungen, plotzlich als scharfe Peaks im Detektor erscheinen. Unterschiedliche UV-Durchlassigkeiten der zu mischenden Eluenten fuhren im Gradientenbetrieb bei Messungen im unteren UV-Bereich zu Basis-

4.8 HieBmittel

103

linienan- und -abstieg. Es ist grundsatzlich ein Probelauf ohne Einspritzung zu empfehlen.

Reversed-Phase-FlieBmittel Die Chromatographie an Umkehrphasen hat mittlerweile die weitaus groBte Bedeutung im Bereich der HPLC erlangt. Deshalb sind die gebrauchlichsten FlieBmittel Wasser, Acetonitril, Methanol und in geringerem MaBe Tetrahydrofuran. WaBrige Anteile werden oft hinsichtlich des pH-Wertes durch Puffer (z. B. Phosphat-, Acetat-Puffer) oder Saurezusatze (Phosphorsaure, Essigsaure) modifiziert. Starke Basen konnen nur bei polymeren Phasenmaterialien eingesetzt werden, normale RP- oder Kieselgelphasen sind in diesem Bereich nicht stabil. Fur die Zusatze gilt selbstverstandlich auch das 0.a. Reinheitsgebot! Schon der Zusatz einer kleinen Menge ungeeigneter Essigsaure (z. B . hinsichtlich ihrer UV-Durchlassigkeit) kann eine Gradientenanalyse wegen zu starkem Basislinienanstieg unmoglich machen. Bei Pufferlosungen ist unbedingt darauf zu achten, daB im Laufe des Gradienten das Loslichkeitsprodukt nicht iiberschritten wird, dies fuhrt meist zum Totalausfall des Systems. Beim Wechsel von Puffern zu organischen Liisungsmitteln muB zuvor eine grundliche Wasserspulung vorgenommen werden. Grundsatzlich darf ein HPLC-System nicht unter Puffern auBer Betrieb gesetzt werden, da immer die Gefahr von Ausflockungen besteht. Beim Einsatz mehrerer HPLC-Systeme macht sich die Anschaffung einer Reinstwasseranlage (ca. DM 5000,- Regenerationskosten, z. B. Barnstedt) schnell bezahlt ,da Wasser meistens die Hauptkomponente eines FlieBmittels darstellt . Acetonitril kann oft durch Methanol (oder umgekehrt) ersetzt werden. Es hat in der Regel die wesentlich hohere Elutionskraft und auBerdem eine geringere Viskositat. Letzteres ermoglicht - z. B. an langen 3 pm Saulen - oft noch Analysen, bei denen beim Einsatz von Methanol bereits die Druckbelastungsgrenzen der Pumpen erreicht werden. Hierbei ist besonders auf den steilen Druckanstieg bei ca. 40 % bei Methanolgradienten hinzuweisen. Ebenfalls hinsichtlich der Entgasungsprobleme ist Acetonitril gunstiger, nachteilig ist seine hohe Toxizitat. Tetrahydrofuran (Peroxidbildung moglich) sollte moglichst nicht verwendet werden, seine Elutionskraft ist allerdings sehr gut. Es ist zu prufen, ob die Dichtungen des jeweiligen HPLC-Gerates f i r THF geeignet sind. Halogenhaltige FlieBmittel sollten wegen der Korrosionsgefahr (z. B. HClBildung) nicht benutzt werden. Eine Anlage darf auch nicht langere Zeit in reinem HPLC-Wasser stehen, das aufgrund seiner hohen Reinheit sehr aggressiv ist und im Laufe der Zeit selbst hochwertige Stahle korrodiert. Abends und vor dem Wochenende ist jeweils mit z. B. Methanol oder MethanoVWassergemischen zu spulen, was gleichzeitig der Saulenreinigung dienen

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kann. Falls das Gerat nicht rnit einem Probengeber uber Nacht betrieben wurde, ist der erste Gradientenlauf am nachsten Tag sowieso nicht exakt reproduzierbar und kann als Equilibrierungslauf dienen, so daB die abendliche Spiilung keinen groBen Zeitverlust bedeutet.

NormalphasenflieBmitteI(Kieselgel, Aluminiumoxid) Typische FlieBmittel sind hier Alkane, Ether, Alkohole, chlorierte Verbindungen oder entsprechende Mischungen. Da sich bei Kieselgel und bei Aluminiumoxid das Gleichgewicht zwischen stationarer und mobiler Phase nur sehr langsam einstellt, ist die Adsorptionschromatographie fur den Gradientenbetrieb ungeeignet. Dies ist mit ein wesentlicher Grund dafiir, daB die RP-Phasen eine so dominierende Rolle spielen. Wird rnit reinen Alkanen als Eluens gearbeitet, so hangt die Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten in hohem MaBe vom Wassergehalt bzw. von dessen Konstanz ab. Dies kann oft nicht mit vertretbarem Aufwand geregelt werden. Es wird deshalb der Einsatz von Desaktivatoren (gezielter Zusatz eines kleinen Anteiles eines stark polaren Stoffes, z. B. Wasser!) oder Wassersattigung empfohlen [4-51, um reproduzierbar arbeiten zu konnen. In Applikation 7.11 wird ein Beispiel rnit Acetonitril als Desaktivator gegeben. Optimierung von FlieBmittelsystemen Solange man es bei Trennproblemen rnit chemisch ahnlichen Verbindungen oder homologen Reihen zu tun hat, lassen sich gezielt Optimierungen durchfuhren und auch aus gegebenen Lasungsmittelstarken bzw. -parametern berechnen. Beispiele sind bei [4-2,4-51 gegeben. Es gibt Softwareprogramme, die durch Variation vorgegebener FlieBmittel in mehreren Analysenlaufen automatisch ,,uber Nacht" die geeignetste FlieBmittelkombination oder die beste Gradientenprogrammierung ermitteln. Bei Lebensmittel- und Umweltproben handelt es sich aber meistens um komplexe Extrakte mit unterschiedlichsten Verbindungen, so daB eine Auftrennung aller Komponenten illusorisch ist. Applikationskenntnisse, analytische Erfahrungen und analytische Vernunft erbringen hier zumindest gleichwertige (schnellere) Ergebnisse. Entgasung Grundsatzlich kann sich geloster Sauerstoff bei UV-Detektion unter 230 nm negativ hinsichtlich der UV-Durchlassigkeit auswirken (Tab. s. [4-21). Problematisch ist aber hauptsachlich die Neigung zur Entgasung im Gradientenbetrieb durch die Anderung der Liislichkeiten bei Anderung der FlieBmittelzusammensetzung. Dies fuhrt zur Blasenbildung im Niederdruckbereich, also vor der Pumpe oder am Ende der Saule. Luftblasen in der Pumpe unterbrechen die Forderung, im Detektor bewirken sie Totalreflextion, so daB keine Analyse mehr moglich ist. Diese Probleme konnen apparativ (vgl.

4.8 FlieSmittel

105

Abschn. 4.2) gelost werden oder durch geeignete EntgasungsmaBnahmen. Die oft noch empfohlene Ultraschallbadbehandlungist relativ unwirksam und kann nur als Notbehelf dienen. Das Verdrangen der Luft durch Helium ist wesentlich effektiver. Hierzu wird uber eine Fritte ein geringer Heliumstrom permanent durch das Losungsmittelreservoir geleitet . Unabhangig von Gasanschlussen oder -flaschen ist man durch die Anschaffung eines ,,Degassers" (ca. DM 2000,- bis 5000,-, je nach Anzahl der zu entgasenden Usungsmittelkanale, z. B. ERC oder Knauer). Die mobile Phase wird durch eine gasdurchlassige Polymerkapillare oder Membran gefordert an deren AuBenwandung ein Vakuum anliegt, welches durch eine Pumpe aufrecht erhalten wird. Trotz des hohen Preises rentiert sich die Anschaffung eines solchen Gerates sehr schnell.

FlieRmittelverbrauch, -entsorgung Nicht nur die Anschaffungs- sondern auch die Entsorgungskosten (vgl. Kap. Gefahrstoffverordnung und Arbeitssicherheit) f i r die FlieBmittel sind mittlerweile in der HPLC ein den Analysenpreis bestimmender Faktor. Verbrauchseinsparungen lassen sich z. B. durch Verwendung von kurzen, effizienten Saulen, die bei gleicher Trennleistung kurzere Analysenzeiten oder eine niedrigere FluBrate ergeben, realisieren. Microboresysteme sind in dieser Beziehung naturlich ideal, erfordern aber eine spezielle apparative Ausstattung. Bei isokratischer Arbeitsweise ist es moglich, die mobile Phase ,,im Kreisbetrieb" zu fahren. Das he&, FlieBmittel und darin enthaltene Probe werden wieder in das (genugend groBe) Vorrats- und nicht in ein AbfallgefaB zuruckgeleitet. Dies geht zwar nicht unendlich lange, aber die imverhaltnis geringen Probendosiervolumina (10-20 pL) bewirken erst nach erheblicher Zeit eine spurbare Veranderung der Grundlinie. Ein Ruhrer im FlieSmittelbehalter empfiehlt sich. Es gibt auch einfache Peakdetektoren (ca. DM 1700,-, z.B. Techlab), die so mit einem Schaltventil gekoppelt sind, daB erkannte Peaks automatisch in ein AbfallgefaD geleitet werden, wahrend die ,,unbelastete" mobile Phase wieder recycelt wird. Dabei ist allerdings zu bedenken, daB die Peakerkennung nur bei einer ausgewahlten Wellenlslnge erfolgt. Aus Sicherheitsgrunden sollte das AbfallgefaB immer groBer als daddie Vorratsgefaae (mehrere, bei Gradientenelution) gewahlt werden und jeweils abends geleert werden. Losungsmittelpfiitzen mit z. B. Acetonitrilanteilen, die sich unbemerkt auf dem Labortisch ausbreiten, konnen wegen der groBen Oberflache schnell verdunsten und zu todlichen Vergiftungen fuhren. Praparative Arbeiten sollten grundsatzlich unter dem Abzug oder einer Abzugshaube durchgefuhrt werden, da die FluBraten entsprechend hoch sind (bis zu 20 mW min), so daB bei Undichtigkeiten 0.a. sehr schnell groBe Mengen austreten konnen. Es ist in jedem Fall wichtig, auch das untere Drucklimit einer Pumpe einzustellen, um so bei Leckagen die Forderung automatisch zu stoppen.

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4.9 Datenauswertung Die Kurze des folgenden Beitrages darf nicht zu der Annahme fuhren, die Auswertung sei unwichtig. Ganz im Gegenteil zeigen Erfahrungen, daI3 entscheidende Fehler gerade durch die Auswertung von Chromatogrammen und nicht nur durch die HPLC-Technik verursacht werden. Die Einfuhrung von Geraten zur automatischen Peakflachen- bzw. Peakhohenauswertung bewirkte in der Chromatographie eine Art ,,Taschenrechnerglaubigkeitseffekt": Vom Integrator ausgedruckte Angaben werden oft kritiklos als absolute, richtige Werte ubernommen. Trotz aller nicht abzuleugnender Vorteile (wer will oder kann heute noch ein komplexes Chromatogramm durch manuelle Peakausmessung auswerten?) ,mussen die Integrationsparameter sorgfaltig iiberpruft werden. Eine automatische Integration speziell im Spurenbereich bei komplexer Untergrund- und Peaksituation ist ohne Kontrollmoglichkeit durch z. B. die Einzeichnung der vom PC ermittelten Basislinie in der HPLC nicht sinnvoll und fuhrt leicht zu vollig falschen Ergebnissen [4-141. Niemand - auch nicht der Computer - kennt in einem Naturstoffextrakt den chromatographischen Untergrund, so da8 schon von daher in jedem Falle gilt: Eine Methode ist keine Methode, das heiBt, zumindestens bei rechtlich relevanten Ergebnissen sollte eine zweite Absicherung erfolgen. Der Diodenarraydetektor (vgl. Abschn. 4.6.2) stellt durch die Moglichkeit der Peakreinheitskontrolle in der HPLC eine gute Hilfe dar. Bei der Vielzahl der angebotenen Integratoren und Datensysteme hat es keinen Sinn, in diesem Rahmen die verschiedenen zugrunde liegenden Algorithmen zu diskutieren. Bei Basislinientrennungen hat kein Gerat Auswertungsprobleme, aber in der Praxis geht es meistens um Antrennungen, Aufsetzerpeaks, Tailing, Spurenbestandteile neben Hauptkomponenten oder ahnliches. Hierfur gibt es kein automatisches Patentrezept, es ist der Analytikersachverstand gefragt. Um diesen einsetzen zu konnen, muB das Gerat in jedem Fall eine automatische Basislinieneinzeichnungs- und Anderungsmoglichkeit enthalten. Abb. 4-24 zeigt ein Chromatogrammbeispiel, unschwer sind garantiert falsche Integrationsvorschlage zu erkennen. Bei der HPLC kommt noch erschwerend hinzu, da8 ein ahnlich gutes SignaY Rauschverhaltnis wie in der Kapillargaschromatographie nicht erreicht wird. Das bedeutet in der Regel relativ breite Peaks. Damit ist aber gerade die Basislinienfestlegung wichtig. Irrtumer sind hier fur die Peakflachenbestimmung von gravierender Bedeutung. Manchmal ist es sinnvoller, die Peakhohe zur Auswertung heranzuziehen, eine allgemeingultige LCisung gibt es nicht. Ein Vorteil gegenuber der Gaschromatographie ist die reproduzierbarere Einspritzung mittels einer Dosierschleife (vgl. Abschn. 4.3), die einen internen Standard zur quantitativen Berechnung normalerweise unnotig macht.

Literatur

li

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I

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Abb. 4-24: HPLC-Chromatogramm, automatische Auswertung mit Basislinieneinzeichnung.

Einen interessanten Ansatz zu besseren - auch automatischen - Integrationsergebnissen bieten schnellgetaktete PC-Systeme (z. B. Gynkotek, Kontron), die ihre Datensammelrate automatisch der Peaksituation anpassen konnen. Bei konstanter Grundliniensituation werden wenig Daten gespeichert, bei Steigungsanderungen dann entsprechend wesentlich mehr. Ausfuhrliche und allgemeine Angaben zur quantitativen Analyse mit der HPLC werden in [4-151 gegeben.

Literatur [4-11 User Manual 210A Sample Injection valve, Miinchen: Beckman Instr., 1987. [4-21 Gertz, C., HPLC, Tips und Tricks, Kemmerling GmbH, 1989. [4-31 Ishii, D., Introduction to Microscale High-Performance Liquid Chromatography,Weinheim: VCH, 1987. [4-41 Steiner, E, Applications of narrow-bore columns, Hewlett Packard, Firmenschrift. [4-51 Meyer, V., Praxis der Hochleistungsflihsigchromatographie,Frankfurt am Main: Diesterweg, Salle, Sauerliinder, 1992. [4-61 Krause, M., Dissertation TU Braunschweig 1991. [4-71 Unger, K. K. (Hrsg.), Handbuch der HPLC, Darmstadt: GITVerlag, 1989. [4-81 Frischkorn, C. G. B., Schlegel, P., Vonach, B., Elektrochemische Detektion - Neuere Anwendungen, Labor Praxis Spezial, Chromatographie, 1988. [4-91 WeiB, J., Ionenchromatographie,Weinheim: VCH, 1991. [4-101 Bemwieser, I., Patzold, R., Galensa, R., Sontag, G., Z . Lebensm. Unters. Forsch. 1994, 198, 40-43. [4-111 Roth, M., Hampai, H., J . Chromatogr. 1973,83, 353. [4-l2] Bohme, W., Ogan, K., Appl. Chromatogr. 1981,36, 7 . [4-131 Godfrey, N. B., Chem. Technol. 1972,2, 359.

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[4-141 Foley, J. P., J . Chrornarogr. 1987,384, 301-313. [4-151 Engelhardt, H. (Hrsg.), Practice of High Performance Liquid Chromatography, Springer: Berlin, 1986.

5 Fehlermoglichkeiten und Fehlerbehebung (Troubleshooting) Viele HPLC-Probleme konnen, wie auch schon in anderen Kapiteln vermerkt, durch die richtige Behandlung der Anlage verhindert werden. Dieses kurze Kapitel sol1 helfen, HPLC-Probleme zu lokalisieren und schnell zu beheben, ohne daB langere Ausfallzeiten des Gerates eintreten. Hinweis: Es gibt von einigen Firmen Problemlosungshilfen (2.B. ,,Troubleshooting guide" von Fa. Supelco), in der Fehler auch bei anderen Komponenten zusammengestellt sind. Von den Modulen einer HPLC-Anlage sind nicht alle gleich anfallig; Verschleiateile in Pumpen und Detektoren sind naturgemaB die haufigsten Storungsursachen . Dokumentation: Grundsatzlich sollte sich bei jeder Anlage eine Dokumentation (z. B. in Form eines Oktavheftes) befinden, in der alle auftretenden Probleme eingetragen werden. Falls ein HPLC-System von mehreren Personen genutzt wird, ist diese Dokumentation zwingend erforderlich. Fur jede neue Saule sollte das Eingangsdatum und die tatsachliche Einsatzzeit nachvollzogen werden konnen. Der Druckabfall im System sollte fur jede Saule notiert werden (z. B. 6,l MPa bei 1 mumin Methanol), um UnregelmaBigkeiten schneller erkennen zu konnen. Es empfiehlt sich auch, bestimmte Materialien vorratig zu haben: Dichtungen aller Art, Edelstahlsiebe und Glasfaserfilter fiir die Saulen sowie Edelstahlkapillaren verschiedener Durchmesser. Insbesondere wenn mehrere Anlagen eines Herstellers benutzt werden, kann es sinnvoll sein, bestimmte Bauteile auszutauschen, z. B. Ein- und AuslaBventile, da diese oft wegen der Kosten nicht auf Vorrat gekauft werden konnen. Bevor Tests an den einzelnen Modulen durchgefuhrt werden, sollte gekliirt werden, ob der richtige Eluent angesetzt worden ist, da dieses eine der haufigsten Fehlerquellen darstellt. Diese Zusammenstellung kann nur einige Hinweise geben. Wichtig ist bei der Fehlersuche vor allem ein systematisches Vorgehen, um die defekte Komponente zu lokalisieren. Grundsatzlich sind bei Pumpenproblemen, die durch zu geringen Druck bedingt sind, zunachst die Fullung der Vorratsflaschen und die Dichtigkeit der Zuleitungen zu priifen. Bei modular aufgebauten Systemen sollten die einzelnen Komponenten fur sich getestet werden, d.h. zunachst z. B. die Pumpe ohne Saule betrieben werden, um die Fehlerquelle zu lokalisieren. Dies ist auch sinnvoll, wenn man nicht beabsichtigt, das Problem selbst zu losen, sondern einen Serviceingenieur bemuhen will, weil

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5 Fehlermoglichkeiten und Fehlerbehebung (Troubleshooting)

dadurch auch dessen Fehlersuche erleichtert und die mitzufuhrenden Austauschteile leichter erkennbar werden. Sehr viele Ausfallzeiten werden durch vermeidbare und schnell behebbare Ursachen hervorgerufen. Im folgenden einige Beispiele fiir (scheinbare) Pumpen- und Detektorprobleme, die selbst schnell behoben werden konnen: Liisungsmittel: - Alle VorratsgefaSe, in denen sich Eluenten befinden, mussen aussagekraftig beschriftet sein. Das Datum, wann das Losungsmittel zuletzt gewechselt wurde, sollte vermerkt werden. - Bei Pufferlosungen kommt es immer wieder zu Kontaminationen durch das Wachstum von Mikroorganismen, was sich durch Trubungen (,,Flocken" 0.a.) bemerkbar macht . Solche Losungen sind selbstverstandlich sofort zu verwerfen. Pufferlosungen konnen durch Zusatze organischer Losungsmittel (falls chromatographisch zulassig) oder Azid (ca. 100 mg/l) stabiler gemacht werden. - Ein beliebter Fehler beim Arbeiten mit Puffern ist die direkte Einleitung von organischen Losungsmitteln zwecks Spulung des Systems. Bei vielen Puffern kann dies zu einem Ausfallen von Salzen z.B. im Pumpenkopf kommen, was die Lebensdauer der Dichtungen und des Kolbens drastisch herabsetzt und erhebliche Kosten verursacht (ein normaler Kolben kostet ca. DM 500,-). - Bei der RP-Chromatographie ist das verwendete Wasser eine haufige Fehlerquelle. Falls eine Reinstwasseranlage vorhanden ist, mu13 diese nach Angaben des Hersteller kontrolliert bzw. gewartet werden. Normales Ionenaustauscherwasser ist fur den Gradientenbetrieb, insbesondere bei Spurenbestimmungen, fast immer ungeeignet. Saule: - Zum Schutz von HPLC-Saulen benutzen viele Anwender Vorsaulen, durch die der ,,Schmutz" von der eigentlichen analytischen Saule ferngehalten werden soll. Kontaminierte Vorsaulen konnen aber selbst eine Fehlerquelle darstellen, da auch hier Veranderungen der Peakform bis hin zum PeakSplitting eintreten konnen. - Auch die Kopplungsstucke zwischen Vorsaule und Saule konnen sich zusetZen und somit zu einem erhohten Druck beitragen. Probe im falschen Liisungsmittel gelost: Die Probe soll im Eluenten bzw. in einem Losungsmittel schwacherer Elutionskraft gelost werden. Ein haufiger Fehler liegt darin begrundet, daB diese Grundregel nicht beachtet wird. Wenn man bei einem gegebenen Phasensy-

5 Fehlerm6glichkeiten und Fehlerbehebung (Troubleshooting)

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stem (z. B. RP-Saule, Eluent MethanoVWasser; 10/90,v/v) die Probe in 100% Methanol lost, wird meist eine Peakdeformation (Buckel) oder ein PeakSplitting die Folge sein. Zusammenstellung haufig auftretender Probleme und Liisungsansatze: Bei modular aufgebauten Systemen grundsatzlich bei Druckproblemen die einzelnen Module testen. Bei der Fehlersuche niemals mehrere Dinge gleichzeitig variieren. 0 Symptom: Pumpe baut keinen oder zu geringen Druck auf, obwohl eine Saule angeschlossen ist . 1. Luft im Pumpenkopf; hierbei schwankt der Druck meistens. Aktion: Pumpe ohne Gegendruck mit hohem FluB spulen (Saule entfernen oder ,,drain valve", falls vorhanden, offnen). Falls dies nicht zum Erfolg fiihrt: mit reinem Liisungsmittel spiilen; falls auch dies keine Besserung bringt: Kapillare am AuslaBventil abschrauben und erneut fordern lassen. Notfalls AuslaBventil abschrauben und Pumpenkopf mit Eluent fiillen. 2. EinlaSventil (inlet check valve) funktionsunfahig Aktion: uberpriifen, ggf. ersetzen. Die Doppelkugelventile der einzelnen Hersteller sind unterschiedlich aufgebaut. Bei einigen kann man Einzelteile (z. B. Kugelsitz 0 . a.) ersetzen, andere mussen komplett ausgetauscht werden. 3. Leitungen der mobilen Phase verandert Aktion: VorratsgefaBe uberprufen, FrittedFilter iiberpriifen und gegebenenfalls austauschen. 4. Diverse Leckagen Aktion: Alle Leitungeflerschraubungenpriifen, um das Leck zu lokalisieren. Auch die Dichtungen im Pumpenkopf und den Kolben selbst inspizieren; dieses aber erst, wenn andere Mdnahmen nicht zum Erfolg fuhren oder das Leck eindeutig am Pumpenkopf vorhanden ist. Bei Wechsel der Kolbendichtung muB diese nach Vorschrift des Herstellers ,,eingefahren" werden. 0 Symptom: Zu hoher Druck Problem lokalisieren; zunachst Pumpe allein fordern lassen; dann Einspritzmodul anschlieBen; anschlieBend SSiule mit Vorsaule; danach Saule ohne Vorsaule. Auch Kopplungsstucke SauleNorsaule priifen. Das Bauteil, bei dem die Veranderung festgestellt wurde, austauschen oder reinigen (falls moglich). 0 Symptom: Retentionszeiten verandern sich 1. Anderungen der mobilen Phase, z.B. bei Forderung uber Gradientenformer. Bei isokratischem Dosieren iiber Gradientenformer sollte man diesen ggf. abkoppeln und das FlieBmittel vormischen.

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5 Fehlermoglichkeiten und Fehlerbehebung (Troubleshooting)

2. Temperaturprobleme; weniger bei RP-Materialien, haufiger bei Ionenaustauschern. Aktion: Thermostatisierung; oft reicht es aus, einen Kiihlmantel aus Glas einzusetzen; fur hohere Anspriiche ist ein Saulenofen notig. Wird mit erhohter Saulentemperatur gearbeitet, kann ein Vorwarmen des FlieDmittels vorteilhaft sein. 3. Luft im Pumpenkopf Aktion: siehe oben. 4. Liisungsmittel der Probe nicht mischbar mit Eluent. Aktion: Probe sollte moglichst in mobiler Phase gelost sein. 5. Saule unbrauchbadgealtert Aktion: austauschen (vgl. aber Kapitel ,,Trennsaulen") . Symptom: Auflosung verschlechtert 1. Mobile Phase verandert. Aktion: neu ansetzen 2. Saule verandert; vgl. Abschn. 4.4. Symptom: Pumpe baut Druck auf, obwohl keine Saule angeschlossen ist: 1. Ursache: Das AuslaDventil (outlet check valve) ist verstopft oder unbrauchbar. Aktion: Ausbauen, im Ultraschallbad reinigen (z. B. lauwarme Tensidlosung, dest. Wasser, Methanol), ggf. austauschen. 2. Ursache: In-line Filter verstopft. Aktion: neue Siebe und Filter. Leckagen konnen auch Symptome wie gleichmaaiges oder ungleichmaBiges Basislinienrauschen verursachen. Symptom: ,,Peak-Splitting" Zunachst verifizieren; z. B. durch frisch angesetzten Standard. 1. Kontamination auf Saulen: Aktion: Vorsaule entfernen, falls Problem fortbesteht, Sauleneingang mit neuen Fritten, Sieben versehen (vgl. Kapitel Trennsaulen) . 2. Totvolumen am Sauleneingang: Aktion: Versuchen, mit Glasmehl oder Phasenmaterial nachzufiillen, oder ein bis zwei zusatzliche Filter einbauen. 1st oft vergeblich (vgl. Kapitel Trennsaulen). Symptom: relativ regelmaBige ,,Peaks" Ursache: Kleine Luftblasen sammeln sich durch Entgasung in der Detektorzelle, und eine grol3e Luftblase verlaBt dann die Zelle. Aktion: Restriktionskapillare mit geringem Innendurchmesser (um Gegendruck zu erzeugen) am Detektorausgang anschlieBen. Wird ein Teflonschlauch verwendet, kann man einen Knoten in diesen machen. Vorsicht, da manche Zellen nur eine geringe Druckfestigkeit aufweisen.

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Symptom: kein UVNIS-Signal 1. Lampe nicht geziindet oder defekt (lafit sich meist an Kontrollleuchten oder durch ,,Error messages" am Bildschirm erkennen). Aktion: Lampe ziinden oder wechseln. Bemerkung: Es sollte immer eine Ersatzlampe vorhanden sein. 2. Das Signal wird nicht an Integrator oder Datensystem weitergeleitet. Dies ist dann schwierig zu erkennen, wenn es keine zusatzliche Anzeige der Absorption am Detektor gibt. Aktion: Kabel und Verbindungen uberpriifen. 3. Uberpriifen, ob nicht ein chromatographisches oder probenbedingtes Problem vorliegt. Es empfiehlt sich, eine Standardlosung mit einem ,,schnellen" Eluenten zu chromatographieren. Weiterhin prufen, ob sich Substanzen zersetzt haben (bei UVNIS-aktiven: an einem normalen Photometer Spektren aufnehmen). Symptom: Keine oder zu kleine Peaks - siehe ,,kein UV-Signal" - falsche Einstellung am Detektor und/oder Integrator - kein Flul3; siehe Pumpenprobleme

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6 HPLC-Applikationen

6.1 Validierung von Methoden Unter diesem Stichwort sind die Qualitatsdaten von chemischen Analysen zusammengefafit, die eine Methode charakterisieren und ihre Leistungsdaten prasentieren. Diese Daten mussen bei neu entwickelten Methoden mittels statistischer Verfahren ermittelt werden, wobei es vom Einsatzgebiet der Methode abhangt, welche Validierungsparameter bedeutend sind (s. u.). Uber die statistische AuswertungBehandlung von Analysenergebnissen und die Qualitatssicherung gibt es eine Reihe von Monographien oder Zusammenstellungen z. B. [6-1 bis 6-41. Eine ausfuhrliche Behandlung wurde den Rahmen dieses Buches sprengen, daher werden nur einige Begriffe kurz erlautert : Nachweisgrenze (detection limit): Unter der Nachweisgrenze ist die kleinste Menge eines Stoffes oder die kleinste Konzentration zu verstehen, die noch qualitativ nachgewiesen werden kann (Randbedingungen: statistische Sicherheit P; meist 95 %). Die Nachweisgrenze spielt insbesondere eine Rolle, wenn Substanzen im Spurenoder Ultraspurenbereich nachzuweisen sind. Hierfiir ist eine genaue Ermittlung der Nachweisgrenze erforderlich, wahrend in anderen Fallen oft eine Abschiitzung (z.B. Sfaches Grundrauschen) praxisgerechter ist. Fur die genaue Bestimmung eignet sich das Eichkurvenverfahren. Hier wird eine Eichkurve aus 10 Eichpunkten im Bereich der vermuteten Nachweis/Bestimmungsgrenze erstellt, wobei die x-Werte (also die Konzentrationen) aquidistant sind [6-5, 6-6, 6-71. Bestimmungsgrenze : Unter der Bestimmungsgrenze ist die kleinste Menge eines Stoffes oder die kleinste Konzentration zu verstehen, die noch quantitativ nachgewiesen werden kann (Randbedingungen: statistische Sicherheit P; meist 95 % ). Wiederfindungsrate (WFR) = Recovery: Bei der Ermittlung der Wiederfindungsrate wird im Normalfall einer untersuchten Probe mit bekanntem Gehalt an Analyten eine Aufstocklosung zugesetzt und uberpriift, wieviel hiervon wiedergefunden wird. Es ist auch moglich, die Wiederfindungsrate mit Standardlosungen zu ermitteln, wobei Ma-

116

6 HPLC-Applikationen

trixeffekte nicht erfaBt werden. Wenn synthetische Proben benutzt werden, konnen Matrixeffekte nur unvollkommen berucksichtigt werden. Die Wiederfindung kann auch mit zertifizierten Referenzstandards durchgefuhrt werden. Solche Standards sind nicht fur alle Matrices verfugbar und teuer. Genauigkeit (accuracy): Sie beschreibt die gesamten Abweichungen (systematische und Zufallsfehler) . Unterbegriffe fur Genauigkeit sind Richtigkeit und Prazision. Richtigkeit : Sie beschreibt die systematische Abweichung des Ergebnisses vom wahren Wert. Da der wahre Wert eine theoretische GroBe darstellt, definiert man einen richtigen Wert (Sollwert), der aufgrund der Untersuchung der Probe mit einer oder mehreren Referenzverfahren zustandekommt [6-51. Die Richtigkeit kann laborintern durch Blindwert-, Mittelwert- und WiederfindungsUbenvachung uberpruft werden [6-11. Bei Blindwerten sind Reagenzienblindwerte (Analysenlosung enthalt statt Probe z. B. Wasser) und Probenblindwerte (Analysenprobe enthalt Matrix, aber nicht die zu bestimmende Substanz) zu unterscheiden. Eine praktische Moglichkeit der Uberprufung ist die Bestimmung der Wiederfindungsrate. Prazision: Hierunter versteht man das Ma13 an Ubereinstimmung der Ergebnisse, die durch wiederholte Anwendung eines festgelegten Analysenverfahrens erhalten werden. Die Prazision beschreibt somit den zufalligen Fehler. Die zugehorige Angabe ist die der Standardabweichung S. Man kann noch eine laborinterne Wiederholstandardabweichung und solche zwischen Laboratorien, die mit derselben Methode und dem gleichen Material arbeiten, definieren. Selektivitat, Spezifitat: Die beiden Begriffe beschreiben, inwieweit der gemessene Wert nur von der zu bestimmenden Substanz hervorgerufen wird (und nicht durch Matrixeffekte 0.a.). Standardabweichung: Sie ist ein MaB fur die Reproduzierbarkeit einer Methode. Der Wert der Standardabweichung ist abhangig von der Dimension der MeBwerte. Variationskoeffizient : Wird aus der Standardabweichung und dem Mittelwert berechnet. Der VK steht fur die prozentuale Abweichung der Werte einer MeBreihe vom Mittelwert.

6.1 Validierung von Methoden

117

Linearitat: Grundvoraussetzung ist , daB das Analysenergebnis eine Funktion des MeBwertes ist. Ein MaB fur die Gute dieses Zusammenhangs ist der Korrelationskoeffizient . Der Korrelationskoeffizient ist dimensionslos und liegt zwischen -1 und 1. Ein Korrelationskoeffizient von 1 oder -1 kennzeichnet eine streng lineare Abhangigkeit, ein solcher von 0 besagt, daB kein Zusammenhang vorhanden ist. Wichtig ist zu ermitteln, ob die Kalibrierfunktion linear ist und in welchem Bereich (Details siehe [6-1, 6-51). Es ist relevant, d& die lineare Regressionsrechnung davon ausgeht, daS die Prazision uber den gesamten Arbeitsbereich konstant ist. Es ist aber eine Varianzeninhomogenitat moglich. Dies kann uberpruft werden, indem man je 10 Standardproben der niedrigsten und hochsten Konzentration des Arbeitsbereichs untersucht und die Datensatze vergleicht . Wird mit einem geeigneten Test (F-Test) eine Differenz festgestellt, sollte ein engerer Arbeitsbereich gewahlt werden. Arbeitsbereich: Der Arbeitsbereich stellt das durch Eichexperimente festgelegte und durch statistische Methoden abgesicherte Interval1 (der Massen- oder Stoffmengenkonzentration) dar, in dem quantitative Analysenergebnisse erhalten werden konnen. Der niedrigste Wert des Arbeitsbereichs ist die Bestimmungsgrenze. Uberpriift werden sollten die in Tab. 6-1 genannten Parameter [6-21: 'hb. 6-1: Validierungsparameter

Art der Priif'ung

Andere Priifungen

Reinheit

Reinheit

Validierungsparameter Richtigkeit Prkision Spezifitat/Selektivitat Detektionsgrenze Bestimmungsgrenze Linearitat Arbeitsbereich Robustheit

Identifizierung

quantitativ

Grenzwert

*

+

*

* *

*

* *

+

= in bestimmten Fiillen notig

** = in bestimmten Fallen nicht notig

+ + + + + + +

** -

Gehaltsbestimmung

+ +

+ +

**

-

+ + +

-

**

+

118

6 HPLC-Applikationen

6.2 Probenvorbereitung mittels Festphasenextraktion Allgemeines : Die konventionelle FlussigFlussig-Extraktion (,,Scheidetrichtermethode") hat in den letzten Jahren Konkurrenz bekommen. Zum einen ist die SorbensExtraktion zu nennen, die z. B. Kieselgur als Trager nutzt. Kieselgur adsorbiert die waBrige Phase und erhoht somit die Grenzflache. Durch Elution mit einem mit Wasser nicht mischbaren Losungsmittel konnen die Probemolekule isoliert und ggf. in einem folgenden Schritt konzentriert werden. Beispiele fur im Handel erhaltliche Materialien sind Extrelut oder ChemElut . Diese Materialien haben insbesondere in der forensischen Analytik die Scheidetrichtermethoden weitgehend verdrangt . Die Flussig-Fest-Adsorption (SPE = Solid Phase Extraktion), oft als Festphasenextraktion bezeichnet, hat gegenuber z. B. der FlussigFlussig-Extraktion eine Reihe von Vorteilen, so werden Liisungsmittel drastisch eingespart, der Zeitaufwand ist deutlich geringer und die Gefahr einer Emulsionsbildung wird herabgesetzt. Daher haben sich diese Minisaulen gegenuber der Flussigl Flussig-Verteilung auf vielen Gebieten durchgesetzt. Einige Applikationen nutzen die Festphasenextraktion, deshalb sol1 das Prinzip erlautert werden. Die in den Minisaulen eingesetzten Materialien entsprechen oft den Phasenmaterialien fur die HPLC (s. Abschn. 4 . 9 , allerdings nicht hinsichtlich der PartikelgroBe. Man unterscheidet Normal-, Umkehr- und Ionenaustauschphasen (s. Tab. 6-2). Die Vorgehensweise ist prinzipiell ahnlich (hier am Beispiel einer RP-18 Aufarbeitung gezeigt):

1. Konditionierung der Kartusche. Die Konditionierung bei RP-Phasen wird durch Waschen mit 10 mL Methanol, gefolgt von 5-10 mL Wasser erreicht (bei 500 mg Phasenmaterial). 2. Probenaufgabe; die Probe ist meist in Wasser gelost. Tab. 6-2:Charakteristika der Trennverfahren bei der Festphasenextraktion

Polaritat der Phase Polaritat der Eluenten Probenlosungsmittel Elutionsmittel Elutionsfolge Fraktionierte Elution

Normalphase

Umkehrphase

Ionenaustausch

hoch niedrig bis mittel Hexan, Toluol Ethylacetat, CHiCN unpolare zuerst steigende Pol. des Eluenten

niedrig hoch bis mittel Wasser, Puffer CH,OH/Wasser CH,CN/Wasser polare zuerst fallende Pol. des Eluenten

hoch hoch Wasser, Puffer Puffer, Salzlosungen schwach ionisierte zuerst Ionenstarke erhohen, pH-Wert andern

6.2 Probenvorbereitungmittels Festphasenextraktion

119

3. Waschen rnit Wasser; falls die interessierenden Komponenten nicht retardiert werden, ist die Probenreinigung hiermit beendet . 4. Elution rnit weniger polaren Losungsmitteln (CH,OH, CH3CN) bzw. Mischungen dieser Liisungsmittel rnit Wasser. 5. Saule mit dem am wenigsten polaren Losungsmittel von Verunreinigungen befreien und rnit 1. wieder beginnen oder Kartusche verwerfen. Kapazitat der Saulen: Die Fullmengen der Kartuschen liegen im Normalfall zwischen 100 mg und einigen Gramm. Als Faustregel kann gelten, daB Standardmaterialien 10-20 mg/g Sorbens aufnehmen konnen. Trocknung: Einige Analysenvorschriften (z. B. Triazine im Trinkwasser) erfordern eine Trocknung der Kartusche vor der Elution. FlieBgeschwindigkeit: Die FlieBgeschwindigkeit sollte 5 mUmin bei Standardkartuschen nicht uberschreiten. Methodenentwicklung: Grundsatzlich sind zwei Grenzfalle einer Reinigung der Probe denkbar: 1. Die gesuchte(n) Substanz(en) werden unter Analysenbedingungen nicht retardiert, wahrend die Storsubstanzen auf der Saule bleiben. 2. Die gesuchte(n) Substanz(en) werden unter Analysenbedingungen vollstandig retardiert, wahrend die Storsubstanzen nicht festgehalten werden oder mit einem schwacheren Elutionsmittel eluierbar sind. Meist wird letztere Technik angewandt. Die Methodenentwicklung hangt davon ab, wie die Reinigung erfolgen soll. Haufig wird auch eine Fraktionierung nach unterschiedlicher Polaritat angestrebt, d. h. man eluiert bei der RP-18 Aufarbeitung, z. B. mit 10 % Methanol, dann rnit 50 % , danach rnit 80 % . Folgende Punkte mussen ermittelt werden (experimentell oder nach Literaturangaben) :

- geeignetes Adsorbens (vollstandige oder keine Retention) - geeignetes Elutionsmittel - die Wiederfindungsrate: a) rnit Reinsubstanz b) durch rnit Standard aufgestockter Matrix Weitere EinfluBgroBedRandbedingungen: - pH-Wert: Die Probensubstanz sollte nicht geladen vorliegen, d. h. die Dissoziation ist durch den pH-Wert zuriickzudrangen (bei Sauren also im sauren Medium arbeiten).

120 -

6 HPLC-Applikationen

Bei Spurenbestimmungen ist darauf zu achten, daia sich keine Verunreinigungen aus der Laborluft auf den Saulen anreichern konnen. Dies kann z. B. durch Verwendung einer zusatzlichen Schutzsaule geschehen, die mittels Adapter auf die eigentliche Festphasenextraktionssaulegesteckt wird. Bei routinemaiaiger Anwendung ist eine Vakuumbox zur Festphasenextraktion (z.B. fur 12 Saulen) mit einer Membranpumpe dringend zu empfehlen .

Literatur [6-11 Funk, W., Dammann, V., Donnevert, G., Qualitutssicherung in der analytischen Chemie. Weinheim: VCH, 1992. [6-21 Jehle, H., Funk, W., Renger, B., Camag Bibliography Service 1993, 71, 2-7. [6-31 Montag, A., Statistische Methoden zur Bewertung analytischer Methoden; in: Taschenbuch fur Lebensmittelchemiker und -technologen, Bd. I. :Frede, W. (Hrsg.) Berlin: Springer Verlag, 1991, 107-124. [6-41 Doerffel, K. D., Die statistische Auswertung von Analysenergebnissen, in: Handbuch der Lebensrnittelchemie; Bd. IZ/2, Schormuller, J. (Hrsg.) Berlin: Springer Verlag, 1967, 1194- 1246. [6-51 Funk, W., Dammann, V.,Vonderheid, C., Oehlmann, G., Statistische Methode in der Wasseranalytik, Weinheim: VCH, 1985. (6-61 Ruckstandranalytik von Pfanzenschutzmitteln: Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hrsg.) Weinheim: Verlag Chemie, Loseblattsammlung seit 1969, XI-A, 1-22. [6-71 Gunzler, H. (Hrsg.), Akkreditierung und Qualitiitssicherung in der analytischen Chemie, Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 1994.

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich 7.1 Bestimmung von Flavonolglykosiden in Tee und Teeprodukten oder Sihnlichen Erzeugnissen Problemstellung Flavonolglykoside gelten als physiologisch aktive Komponenten. Insbesondere Rutin (Quercetin-3-0-rhamnoglucosid)ist zu nennen; dieses wurde fruher als ,,Vitamin P bezeichnet und wird auch heute noch, meist in Form von WeiBdornextrakten, bestimmten Pharmaka zugesetzt. Allgemeine Angaben bei [7-1 bis 7-31. Etliche Flavonolglykoside, wie andere Flavonoide auch, dienen als Verfalschungsindikatoren von Fruchterzeugnissen, Gewurzen und Naturstoffpharmaka. Im Tee wurden bisher 15 Flavonolglykoside identifiziert, 14 von diesen sind mit der vorgestellten Methode bestimmbar [7-4, 7-51. Formeln der Flavonolglykoside

HO

OH

0

Abb. 7-1: Formeln von Flavonol-Aglykonen: R1= R2= H Kiimpferol; R1= H; R2= OH Quercetin; R,= OH; R2= OH Myricetin.

Die Zuckerreste sind an der 3-Position 0-glykosidisch gebunden. Die Komponenten werden im folgenden abgekurzt : K-gal = Kampferol-3-0-galactosid; K-glu = Kampferol-3-0-glucosid; K-grg = Kampferol-3-0-glucorhamnogalactosid; K-rdg = Kampferol-3-0-rhamnodiglucosid; K-rut = Kampferol-30-rutinosid. Die Abkurzungen fir die Glykoside von Quercetin und Myricetin erfolgen sinngemaB.

Prinzip der Bestimmung Die Flavonolglykoside werden aus der Probe mittels heil3em Wasser (alternativ: Methanol) extrahiert. Der Methanol-Extrakt stellt die maximal extrahierbare Menge dar, der AufguB reprasentiert die Gehalte im Getrank. Nach Entfernen des ggf. vorhandenen Methanols wird die Liisung auf eine konditio-

122

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

nierte Polyamid-Saule gegeben. Die Flavonolglykoside werden rnit Methanol eluiert, die Losung eingeengt und unter isokratischen Bedingungen mittels RP-HPLC getrennt. Zur Trennung von Rutin und K-grg ist ein anderes FlieBmittelsystem notig.

Chemikalien und Hilfsmittel - Methanol, destilliert [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Acetonitril, HPLC grade [F, T; R 11-23/24/25; S 16-24-44] - Wasser, HPLC grade - Essigsaure, p.A. [C; R 10-35; S 2-23-26] - N,N-Dimethylformamid [Xn; R 20/21-36; S 26-28a-36; Besonderer Hinweis fur Frauen in gebarfahigem Alter: Teratogene Wirkung moglich) - Polyamid, eisenfrei - Glassaule (14 cm x 2,5 cm i.D.) - Glaswolle - Seesand, gegluht - Membranfilter (0,45 pm) - Papierfilter (z. B. Schleicher & Schuell, Dassel, Art. 311608) - Nutsche rnit Absaugvorrichtung Arbeitsvorschrift a) Aufarbeitung Extraktion mit Methanol/waBrigem Methanol: 2,5 g Tee rnit 200 mL Methanol 15 min im Wasserbad unter Ruhren (Wasserbadtemperatur 40 "C) extrahieren. Extrakt uber eine Nutsche mit Papierfilter filtrieren. Extraktion zweimal rnit je 75 mL Methanol (70 YO,as.) wiederholen. Vereinigte Filtrate am Rotationsverdampfer (Wasserbadtemperatur 40 "C) auf ca. 40 mL einengen. Der Extrakt mu0 weitgehend methanolfrei sein. In 100 mL-MeBkolben uberfuhren und rnit Wasser zur Marke auffullen. Alternativ kann ein waSriger AufguS (Ziehzeit 5 min) hergestellt werden; dazu 2,5 g Tee mit 100 mL kochendem Wasser ubergieBen, rnit Uhrglas bedecken und 5 min auf geheiztem Magnetriihrer (90 "C) extrahieren, filtrieren und nach Abkuhlen auf 100 mL auffullen. Vorbehandeln des Polyamids: 1. Polyamid mittels geeigneter Reaktion auf Eisenfreiheit testen. 2. 1200 g Polyamid SC6 in einem 10-L-Kunststoffkanister mit Wasser auf ca. 8 L auffullen, kraftig schutteln, mit 1,5 L Methanol (destilliert) versetzen und uber Nacht absitzen lassen. Uberstehende Flussigkeit dekantieren und verwerfen, erneut schutteln, noch zweimal wiederholen. AbschlieBend mit Methanol auffullen und mehrmals kraftig schutteln. Probleme konnen auftreten, wenn das Material groBere Mengen sehr feinkorni-

7.1 Bestimmung von Flavonolglykosiden in Tee und Teeprodukten

123

gen Materials enthalt, da dann die Polyamid-Saulenchromatographiesehr lange dauert. Polyamid-Siiulenchromatographie: Glasslule mit Glaswollepfropf, Seesand, vorgequollenem Polyamid (Fullhohe 10 cm) und Glaswollepfropf fullen; rnit 250 mL deionisiertem Wasser konditionieren und 25 mL eines Extraktes oder Teeaufgusses auf die Saule geben, rnit 100 mL Wasser waschen, Waschflussigkeit verwerfen. Mit 250 mL Methanol eluieren, Eluat am Rotationsverdampfer fast bis zur Trockne einengen (Wasserbadtemperatur 40 "C), rnit insgesamt 4 mL DMF in einen 10 mL MeBkolben uberfuhren und rnit Wasser zur Marke auffullen. Nach Membranfiltration zur HPLC einsetzen. Die Usungen sind einige Wochen stabil.

b) Gerate und chromatographische Parameter [Isokratische Anlage rnit DAD; hilfsweise UV-Detektor] Die Originalapplikation wurde auf folgender Anlage erstellt: HPLC-System: Pumpe M 116 (Beckman) mit NEC C-8300 als Pumpensteuerung; Einspritzventil 7125 (Rheodyne rnit 50 pL-Probenschleife); PYE UNICAM PU 4021 Multichannel Detector mit Datensystem. Saule: Edelstahlsaule (250 mm X 4,6 mm i. D.) mit ODs-Hypersil (5 pm; Shandon) und Nucleosil-C18 (10 mm x 4,6 mm i. D.; 5 pm; Macherey-Nagel, Duren) als Vorsaule; Eluent: Essigsaure (2 %, aq.): Acetonitril (85/15, v/v) 1 mUmin FluBrate: Detektor: DAD Wellenlangenbereich: 190-390 nm UV-Detektor: 354 nm System zur Trennung von Quercetin-3-0-rutinosid und Kampferol-3-0-glucorhamnogalactosid: Eluent: Essigsaure (2 % , aq.)/l,4-Dioxan/Methanol (77/13/10, v/v) Ubrige Bedingungen wie vorstehend.

Ergebnisse und Diskussion Es gelingt eine Trennung der FOG mittels HPLC, wenn beide HPLC-Systeme benutzt werden (Abb. 7-2). Da K-grg nicht in allen Tees vorhanden ist, muB das 2. System haufig nur zu qualitativen Zwecken eingesetzt werden. Wird die Applikation auf andere Matrices ubertragen, sollte das 2. System zur Methodenuberprufung benutzt werden. Kalibrierung Die Aufnahme der Eichkurven erfolgt durch Verdunnungsreihen je eines kommerziell erhaltlichen Glykosids von Myricetin, Quercetin und Kampferol

124

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

L

I

I

10

20

30

I

40 min

Abb. 7-2: Trennung von Flavonolglykosiden aus schwarzem Tee. a): Eluent: 2 % Essigsaure (aq.)lAcetonitril(85/15, vlv), b): Essigsaure (2 % , aq.)/l,4-Dioxan/Methanol(77/13/10; v/v), 1 = M-rut, 2 = M-gal, 3 = M-glu, 4 = Q-grg, 5 = Q-rdg, 6 = Q-rut, 7 = K-grg, 8 = Q-gal, 9 = Q-glu,

10 = K-rdg, 11 = K-gal, 12 = K-rut, 13 = K-glu (Abkurzungen siehe ,,Formeln der Flavonolglykoside").

(Myricitrin, Rutin und Kampferol-3-0-rutinosid); (1,2434 ppm, berechnet als Aglykon in der Originalvorschrift). Die Eichfunktionen werden uber die Peakflachen der Chromatogramme bei 354 nm berechnet und alle Glykoside eines Aglykons uber diese Eichkurven ausgewertet. Die Kalibrierung sollte taglich mit einer Vergleichslosung uberpruft und bei Abweichungen von mehr als 5 % neu kalibriert werden. Berechnung: x=c

VM * 1000 * 100 * M , (Glykosid) V, - E - TM - M , (Aglykon)

mit

x

= Flavonolglykosid im Tee [mg/kg i. Tr.] cp = Konzentration in der Analysenlosung [mg/lO mL] VM = Volumen des (Methano1)Extraktes Vs = auf Polyamidsaule appliziertes Volumen [mL] E = Einwaage [g] TM = Trockenmasse [%I M , = relative Molekulmasse

Validierung Nachweis- und Bestimmungsgrenze: Uber eine Verdunnungsreihe der zur Kalibrierung verwendeten Glykoside (0,3-1,2 ppm, berechnet als Aglykon) wurde ermittelt, bei welchen Konzentrationen noch auswertbare UV-Absorptions-Spektren mittels DAD erhalten wurden. Wiederfindungsraten (Methanolextrakte) liegen zwischen 88 und

7.2 Bestimmung von Catechinen und Alkaloiden in Tee oder ahnlichen Erzeugnissen

125

103% . Nachweisgrenze (hier: die Konzentration, bei der noch ein verlaBliches UV-Spektrum im DAD erhalten werden kann): Bei 0.a. DAD liegt die Nachweisgrenze bei 15 mg/kg (als Aglykon berechnet). Die Variationskoeffizienten liegen zwischen 3,8 und 6,8 % .

Besondere Hin weise Bei der Bestimmung von FOG in anderen Matrices muB die Einwaage modifiziert werden. Die so vorbereitete Probe ist fiir die LC-MS-Untersuchung geeignet [7-61. Wird die so vorbereitete Losung auf ein TSP-LC-MS-System gegeben, so ist mit einem intensiven Signal von DMF-Clustern zu rechnen. Alternativmethoden - Papierchromatographie wurde friiher zur qualitativen und halbquantitativen Bestimmung von FOG eingesetzt [7-7]’; heute praktisch nicht mehr angewandt . - Dunnschichtchromatographie (TLC) [7-81; - Capillar-Elektrophorese: Wird routinemaBig noch nicht eingesetzt , es gibt einige vielversprechende Ansatze [7-9 bis 7-11], die aber nicht fur Tee optimiert sind.

7.2 Bestimmung von Catechinen und Alkaloiden in Tee oder ahnlichen Erzeugnissen2 Problemstellung Flavanole (Catechine) sind polyphenolische Bestandteile von Pflanzen, die im griinen Tee in groSer Menge vorkommen; allgemeine Angaben vgl. [7.1-7.31. Flavanole gelten als physiologisch aktive Komponenten. Es sind eine Reihe von Arbeiten uber mogliche positive oder negative Wirkungen publiziert worden, wobei die Ergebnisse, die fur eine positive Wirkung sprechen, deutlich uberwiegen. Insbesondere die anticancerogene Wirkung des grunen Tees und seiner Inhaltsstoffe, im wesentlichen also der Flavanole, standen in jungerer Zeit im Mittelpunkt der Diskussion, z.B. [7.4 bis 7.61. Die I S 0 bemuht sich, Gehalte an Catechinen im Tee zu spezifizieren und eine Bestimmungsmethode zu erproben.

vgl. Kuhr, S. und U. H. Engelhardt (1991): Z. Lebensm. Unters. Forsch. 192, S. 526-529

126

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Formeln Catechine

Abb. 7-3: Formeln der wichtigsten Catechine im Tee; in eckigen Klammern die Gehalte in frischen Teeblattern; nach Robertson (1992) R1 = H, R2 = galloyl, R3= OH (-) Epigallocatechingallat (EGCG); [9-13%]; RI = H, R2= R3= OH (-) Epigallocatechin (EGC); [3-6%]; R1= H, R2 = galloyl, R3 = H (-) Epicatechingallat (ECG); [3-6%]; RI = OH, R2 = H, R3= OH (+) Gallocatechin (GC); [3-4%]; R, = H, R2= OH, R3= H (-) Epicatechin (EC); [l-3%]; R1= OH, R2 = H,R3 = H (+) Catechin (EC); [l-2%].

Prinzip der Bestimmung Die Catechine werden aus der Probe mittels heiBem Wasser extrahiert. Die Probenlosung wird auf eine RP-18-Kartusche zur Festphasenextraktion gegeben, anschlieBend eluiert, ggf. am Rotationsverdampfer eingeengt und mittels RP-HPLC getrennt. Chemikalien und Hilfsmittel Acetonitril, HPLC grade [F, T; R 11-23/24/25; S 16-24-44] - Methanol, destilliert [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Wasser, HPLC grade - Essigsaure, p.A. [C; R 10-35; S 2-23-26] - Papierfilter (z. B. Schleicher & Schuell, Dassel, Art. 311609) - Kartuschen zur Festphasenextraktion, R€-18rnit 0,5 g (z.B. Baker 7020-03) - Vakuumbox zur SPE mit Membranpumpe und Adaptern (z.B. Baker, Supelco 0.a.). -

Arbeitsvorschrift a) Aufarbeitung 1.5 g Tee mit 90 mL siedendem, deionisiertem Wasser iibergieBen, 5 min ruhren (auf einem geheizten Magnetruhrer) und filtrieren (uber eine Nutsche, Papierfilter Schleicher & Schuell, Dassel Art. Nr. 311609). Vor dem Erkalten (um die Ausfallung der ,,Tea-cream" zu vermeiden; kann bei anderen Matrices entfallen) in einen 100 mL MeBkolben uberfuhren und 10 mL Acetonitril zusetzen. Nach dem Abkuhlen rnit Wasser bis zur Marke auffullen. Eine rnit RP-18-Material (0,5 g) gefullte Fertig-Kartusche rnit 10 mL Methanol und

7.2 Bestimmung von Catechinenund Alkaloiden in Tee oder ilhnlichen Erzeugnissen

127

10 mL Wasser konditionieren. 1 mL TeeaufguB aufgeben (durchtropfende Anteile auffangen, mit dem Eluat vereinigen) und mit 15 mL Wasser/Acetonitril-Gemisch (85115, v/v) in 25 mL MeBkolben eluieren und auffullen. (Alternativ: Eluat am Rotationsverdampfer (Vakuum, 40 "C Wasserbad) bis fast zur Trockne einengen, mit Wasser/Acetonitril(88/12, v/v) in einen 10 mL MeBkolben uberfiihren und zur Marke auffullen) , Liisung membranfiltrieren (0,45 pm) und bald zur HPLC einsetzen oder einfrieren (- 18 "C). Im Kuhlschrank (+4 "C) sind die Losungen nur einige Tage, bei Raumtemperatur nur 1 Tag stabil. b) Geriite und chromatographische Parameter [Niederdruck-Gradientenanlagernit DAD oder UV-Detektor] Die Originalapplikation wurde auf folgender Anlage erprobt: HPLC-System: Pumpe M 116 rnit NEC C-8300 als Pumpensteuerung (Beckman Instruments, San Ramon, USA); Einspritzventil 7125 (Rheodyne, Berkeley, USA) rnit 20 pL-Probenschleife; Edelstahlsaule (250 mm X 4,6 mm i. D.) rnit ODs-Hypersil Saule: (PartikelgroBe 5 pm; z. B. Shandon, Astmoor, GroBbritannien) und Nucleosil-C18 (10 mm x 4,6 mm i.D.; PartikelgroBe 5 pm; Macherey-Nagel, Duren) als Vorsaule; Eluenten: A = Essigsaure (2 %, aq.) B = Acetonitril 88 % A, 6 min isokratisch, in 5 min auf 75 % A, 15 min isoGradient: kratisch, bei Anfangsbedingungen 15-20 min aquilibrieren Fluorate: 1 mUmin UV-Detektor rnit variabler Wellenlange (z. B. M 166 BeckDetektor: man Instruments Wellenlange: 278 nm Ergebnisse und Diskussion Die Hauptflavanole, Gallussaure, Theogallin sowie Coffein und Theobromin konnen mit der Methode in grunem und schwarzem Tee getrennt und quantifiziert werden (Abb. 7-4). Kalibrierung: Fur die Ermittlung der Eichkurven wurden Standardlosungen verschiedener Verdunnung hergestellt, die einen Konzentrationsbereich von 2 bis 200 mg Substanfi abdeckten. Als Eichsubstanzen wurden fur Theogallin, EGC, EGCG und ECG praparativ isolierte Substanzen verwendet ,fur Gallussaure, Coffein, Theobromin, EC und Catechin gekaufte Materialien. Die Berechnung der Eichfunktionen erfolgte uber die Auswertung der Peakflachen der Chromatogramme der Standardlosungen. Zur Uberpriifung der Eichung wurde regelmaBig eine Standardlasung eingespritzt .

128

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

I

I

I

0

10

20

I

30min

Abb. 7-4 HPLC-Trennung von Flavanolen in schwarzem Tee. Gradientenelution; Detektion bei 280 nm; 1 = Theogallin (TG); 2 = Gallussaure (GA); 3 = Theobromin (TB); 4 = Epigallocatechin (EGC); 5 = Catechin (Cat); 6 = Coffein (Caff); 7 = Epicatechin (EC); 8 = Epigallocatechingallat (EGCG); 9 = Epicatechingallat (ECG).

Die Konzentration der zu bestimmenden Substanzen in der Probenlosung y [mg/L] wurde mit Hilfe der Eichfunktion bestimmt und dann nach folgender Formel der Gehalt in der Teeprobe berechnet:

F ct=y*E * TM Konzentration aus der Eichlosung (mg/L) y: E: Einwaage [g] TM: Trockenmasse [“XI] Ct: Gehalt in der Teeprobe [g/lOO i. Tr.] F: 10 (Verdunnungsfaktor)

Validierung Nachweis- und Bestimmungsgrenze Zur Ermittlung der Wiederfindungsraten fur die einzelnen Substanzen bezogen auf die gesamte Methode wurde ein schwarzer Tee mit und ohne Zusatz eines Standards, der alle 9 Substanzen enthielt, aufgearbeitet. Die Wiederfindungsraten lagen zwischen 78 (EC) und 126 (Theogallin) % ; diese

7.3 Nachweis von Sulfonamiden in Heisch und Innereien

129

sollten mit jeder Charge RP-Material neu bestimmt werden. Die Variationskoeffizienten fur die Flavanole reichten von 5,3 bis 10,6 %. Als Bestimmungsgrenzen wurden diejenigen Konzentrationen der Substanzen im Tee definiert, die mit relativ grol3er Sicherheit (Signalhohe mindestens funffaches Grundrauschen) noch bestimmt werden konnten. Fur die Flavanole,Coffein und Theobromin lagen die Bestimmungsgrenzen bei ca. 1 mg/100 g, fiir Theogallin bei 7 mg/100 g und Gallussaure 0,3 mg/100 g. Die Nachweisgrenzen wurden nicht bestimmt. Besondere Hin weise Zur Methodenanpassung an das eigene HPLC-System ist ein Dioden-ArrayDetektor sinnvoll. Die Methode kann bei Anpassung auch auf einer kurzen (12 cm) Saule bei verkurzter Analysenzeit (ca. 15 min) zu guten Trennungen fuhren. Die Extrakte konnen direkt fur Thermospray LC-MS-Kopplungen eingesetzt werden. Die Catechine konnen hierbei auf der Massenspur der Quasimolekiilionen gefunden werden. So sind EC und C (Mr = 290) auf der Massenspur bei m/z 291, ECG (Mr = 442) bei m/z 443, EGC (Mr = 306) bei m/z 307 zu sehen. EGCG (Mr = 458) ist auf der Massenspur bei 459 schlechter zu sehen; hier tritt eine starkere Fragmentierung ein.

Alternativmethoden Aktuell fiir die Bestimmung dieser Verbindungen ist nur die HPLC.

7.3 Nachweis von Sulfonamiden, N4=Acetylrnetaboliten, Chloramphenicol und Nicarbazin in Fleisch und Innereien Problemstellung Die im Xtel erwahnten Chemotherapeutika werden in der Xerzucht zur Therapie und Prophylaxe eingesetzt, auch zur Verbesserung der Futterverwertung. Hochstmengen und Anwendungsverbote, soweit vorhanden ,finden sich in der VO uber pharmakologisch wirksame Stoffe sowie in den entsprechenden EG-Richtlinfen [7-151. Als Grenzwerte fur Sulfonamide sind in der EGRichtlinie 2377-90 100 & k g (Einzelsubstanz und Summe der Wirkstoffe) angegeben. Chloramphenicol ist vollstandig verboten 17-16], allerdings ohne darj Beanstandungsgrenzwerte spezifiziert wurden. Die hier vorgestellte Methode ist die Weiterentwicklung einer Multimethode [7-17 bis 7-19] und stellt die optimierte HPLC-Analytik dieser Methode dar [7-201.

130

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Formeln der Titelverbindungen

Sulfanilamid

R = H R =

R =

R

R

415

'

Sulfamerazia R =

Sulfapyridin Sulfamethoxazol f)>CH3

A

43 \N

/

Sulfadimidin (Sulfamethiazin)

Chloramghenicol Abb. 7-5: Formeln von Sulfonamiden.

Prinzip der Bestimmung Das Probenmaterial wird homogenisiert und nach Zusatz eines Citrat-Phosphat-Puffers mit Acetonitril extrahiert. Nach Filtration wird ein Aliquot des Extrakts im Scheidetrichter durch Zugabe von NaCl und Butylmethyletherl Hexan von mitextrahiertem Wasser befreit und die organische Phase unter Zusatz von Ethylenglykol eingeengt. Ethylenglykol wirkt als ,,Keeper", es verhindert das Einengen zur Trockne und damit Verluste an Analyten. Aus diesem konzentrierten Extrakt werden unpolare Stoffe extrahiert (Hexan), anschlieaend werden die Analyten mit Ethylacetat ausgeschuttelt, wobei polare Begleitstoffe abgetrennt werden. Die Ethylacetat-Phase wird unter Zugabe von Ethylenglykol eingeengt , auf ein definiertes Volumen gebracht und mittels HPLC-UV bestimmt; Chloramphenicol wird mit einem immunologischen Test (EIA) nachgewiesen [7-201.

7.3 Nachweis von Sulfonamiden in Fleisch und Innereien

131

Chemikalien und Hilfsmittel - Puffer pH 6.0 (21 g Citronensaure * HzO und 18 g Na2HPO4* 2 H 2 0 in Wasser losen, pH mit konz. NaOH [C; R 35; S 2-26-27-374391 einstellen und zu 1 Liter auffiillen) - Acetonitril, zur Ruckstandsanalyse [F, T; R 11-23/24/25; S 16-24-44] - NaCl p.a. - Hexan, dest. [F, Xn; R 11-20-48; S 9-16-24/25-29-51] - Butylmethylether p. A. [F; R 11; S 9-16-29-331 - ButylmethyletherEIexan (80/20, v/v) - Faltenfilter, ca. 15 cm; 2 Tage im Soxhlet rnit Aceton extrahiert - Natriumsulfat p. a., bei 550 "C gegluht - silanisierte Glaswolle - Ethylenglykol [R 22; S 21 - Ethylenglykol-Acetonitril-Mischung (100 mL Ethylenglykol 200 mL Acetonitril - Ethylacetat, p. a. [R 11; S 16-23a-29-33] - Wasser, HPLC grade

+

Gerate: Falls auch Nitrofurane bestimmt werden sollen, sind BraunglasgefaSe erforderlich . - Universalzerkleinerer (z. B. Kuchenmaschine, Moulinette) - Schraubenzentrifugenglaser200 und 50 mL rnit Teflondichtung - Schuttelmaschine (Extraktion kann auch rnit Ultra-Turrax, Waring-Blendor 0 . a. vorgenommen werden) - Vortex-Mischer - Scheidetrichter, 250 mL - Rotationsverdampfer rnit Vakuum-Kontroller, Rundkolben (500 mL), Spitzkolben (50 mL); alternativ: Vakuum-Konzentrierungszentrifuge mit Pumpe und Kuhlfalle - Zentrifuge fiir 50 mL Reagenzglaser (falls keine Vakuum-Konzentrierungszentrifuge benutzt wird) - Kolbenhubpipetten - Membranfilter 0,45 pm PorengroBe; fiir Microbore-Saulen essentiell.

Arbeitsvorschrift Dotierungen der Proben: Zur Kontrolle der Aufarbeitung werden Proben rnit Losungen der interessierenden Wirkstoffe dotiert. Dabei liegt die Konzentration bei 50 bzw. 100 pgkg im Lebensmittel. Innerer Standard: Lijsungen von Ethidimuron, Benzthiazuron und Oryzalin in Acetonitril (10 pg/mL)

132

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Dotierungslosung: Losung von Sulfonamiden (10 pg/mL), Nicarbazin (5 pg/ mL) und Chloramphenicol (1 pg/mL) a) Aufarbeitung

Probenvorbereitung : Tiefgefrorene Proben in der Mikrowelle oder im Kuhlschrank auftauen; Fleischproben von Fett und Sehnen befreien, homogenisieren (Kuchenmaschine). Bei Innereien nicht zu lange homogenisieren, da sonst sehr flussige Proben erhalten werden. Zu Dotierungszwecken moglichst frisches oder max. 2 Wochen tiefgefrorenes Fleisch benutzen, da es sonst, insbesondere bei homogenisiert gelagertem Fleisch zu Storungen (Storpeaks, Ausbeuteverlusten) kommen kann; dies gilt auch fur eine Lagerung bei -18 "C. Extraktion: 15 g Probenmaterial (homogenisiert) werden in ein Zentrifugenglas (200 mL mit SchraubverschluB) eingewogen, mit internem Standard (150 pL) und ggf. rnit 150 pL Dotierungslosung versetzt, 30 mL Puffer pH 6.0 zugegeben und 5 min auf der Schuttelmaschine geschiittelt (260 Hub/min). Acetonitril in zwei Portionen zu je 45 mL zugeben; nach jeder Zugabe 5 min schutteln (230 Hub/min). Den Uberstand uber ein Faltenfilter in den 250 mL Erlenmeyerkolben geben. Wasserabscheidung: 90 mL des Extraktes in 250 mL Scheidetrichter geben und 4 g NaCl zugeben; bis zur Auflosung schutteln. Dann 30 mL ButylmethyletherkIexan zugeben, schutteln, waBrige Phase (unten) ablaufen lassen, umschwenken und weiteres sich unten sammelndes Wasser ablaufen lassen. Zur Trocknung 10 g Na2S04in Scheidetrichter geben, schutteln, und nach kurzer Wartezeit durch silanisierte Glaswolle in einen 500 mL Rundkolben (alternativ im Falle der Vakuumkonzentrierungszentrifuge: in ein braunes 250 mL Zentrifugenglas) geben; jeweils Leergewicht notieren. Das Natriumsulfat rnit 10 mL Acetonitril nachwaschen. Nach Zusatz von 6 mL EthylenglykoYAcetonitrilMischung auf 2-3 g einengen. Arbeitsdruck am Rotationsverdampfer zu Beginn 200 mbar. Falls die Probe schaumt, konnen 10 mL tert. Butanol zugegeben werden. Reinigung : Ruckstande sorgfaltig von der Glaswand entfernen und die Losung in ein Reagenzglas rnit SchraubverschluB uberfuhren (z. B. mittels Pasteurpipette). Ruckstande werden mit 25 mL Hexan, 3,O mL Acetonitril, 0,4 mL Puffer pH 6 und 2 mL Wasser (alle nacheinander, nicht gemischt) in 0.a. Reagenzglas gebracht. Reagenzglas schlieBen, schutteln und zentrifugieren; dann Hexanphase (oben) absaugen und verwerfen.

7.3 Nachweis von Sulfonamiden in Fleisch und Innereien

133

3 mL Wasser und 500 mg NaCl in das Reagenzglas geben und zweimal rnit 15 mL Ethylacetat extrahieren (dabei nochmals das GefaB zur Einengung des Rohextraktes nachspulen). Ethylacetat-Phase abheben (z. B. Kolbenpipette) und in einen Spitzkolben (Rotationsverdampfer) oder 50 mL Zentrifugenglas (Vakuumkonzentrierungszentrifuge) geben; jeweils Leergewicht notieren. Den Extrakt nach Zugabe von 600 p.L EthylenglykoVAcetonitril-Mischung auf ca. 500 mg einengen, den Ruckstand mit Wasser auf 1,05 g bringen, auf der Vibromix 30 s schutteln und zentrifugieren. Extrakt durch 0,45 pm Filter geben und zur HPLC einsetzen.

Externe Standards: Zu 150 pL der Dotierungslosung2 mL EthylenglykoVAcetonitril-Mischung geben und auf ca. 0,75 g einengen (Abblasen rnit N2 im Thermoblock oder Rotationsverdampfer). Mit entsprechender Menge Wasser auf Endvolumen von 1,5 mL (entspr. 1,57 g) bringen. b) Gerate und chromatographische Parameter

[HPLC-Anlage zur Gradientenelution mit DAD; hilfsweise UV-Detektor; fur Serien Autosampler empfohlen. Zur empfindlicheren Detektion von Sulfanilid zusatzlich Fhoreszenzdetektor empfohlen.] HPLC-System Originalapplikation auf einer Hewlett-Packard-Anlage (HP 1090) rnit Niederdruckgradient. Saule: Edelstahlsaule (250 mm X 4,6 mm i. D.) rnit SpherisorbODS I (RP-18), 5 Eluent: Stufengradient aus A: 0,02 M NaCH,COO, pH 4,8; B: AcetonitriVWasser (70/30, v/v). Der optimale Verlauf muB den jeweiligen Geraten und Saulenkonfigurationen angepaBt werden. Vorschlag: Zeit (min) %B 075 0 195 5 3 15 5 20 875 25 995 30 10 35 12 50 14,5 80 16 80 17,5 90 20,5 90 22 0

134

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Flufirate:

1,0 mL/min; Druck ca. 18 MPa (FluSrate mufi ggf. angepafit werden) Detektor: DAD 315 nm : 120; 275 :4; 260 :4; 360 :4; Referenzwellenlange 550 :100 Fluoreszenzdet. : 325/365 (Ex./Em) oder 245/345 Injektionsvolumen: 100 pL

a)

20

LC A 315.120 550.100

of 098NA04A.D

KALBSCHNITZEL UNDOTIERT 100ul INJEKTION

18

16

14 12 = I (I:

€

10 8

6 4 2

0

LC A 315.120 550.100

of

098NA05A.D KALBSCHNITZEL DOTIERT 1 0 0 p p b SULFONAMIDE 100ul INJEKTION I

Abb. 7-6 Trennung von Sulfonamiden u. a. Wirkstoffen: a) Fleisch, undotiert; b) Fleisch, dotiert mit 100 pgkg Sulfonamiden und 50 pgkg Nicarbazin; c) Standard.

7.3 Nachweis von Sulfonamiden in Fleisch und Innereien LC A 3 1 5 , 1 2 0 5 5 0 , 1 0 0 STANDARD 12- SULFONRMIDE 100ppb 10’ 1 0 0 ~ 1INJEKTION~

o f 098NR06R.

135

D

86 - II 4-

2-

0-

Eqebnisse und Diskussion Durch die Methode konnen die Chemotherapeutika mittels HPLC schnell getrennt werden (Abb. 7-6). Die Aufarbeitung ist notwendig, damit nicht durch Matrixeffekte das qualitative und quantitative Ergebnis verfalscht wird. Chloramphenicol muB mittels eines EIA nachgewiesen werden. Der Zeitaufwand pro Probe betragt beim Einsatz einer Vakuumkonzentrierungszentrifuge 1,25 h, beiverwendung eines Rotationsverdampfers etwa 2 h (wenn eine Serie mit acht Proben bearbeitet wird). Die Vergleichbarkeit R lag bei 35-50 % des gespikten Wirkstoffs (Daten aus 10 Laboratorien). Kalibrierung Die Kalibrierung wird mit der Methode des externen Standards vorgenommen. Validierung Nachweis- und Bestimmungsgrenze: Wiederfindungsratenlagen zwischen 95 und 105% (Sulfadimidin, N4-Acetylsulfamidin, Sulfapyridin, Sulfamerazin, Sulfadiazin, Sulfamethoxazol, Sulfadimethoxin und Chloramphenicol) bzw. zwischen 80-95 % fur Sulfathiazol, Sulfanilamid und Nicarbazin. Bei gewachsenen Proben liegen die Extraktionsausbeuten fur Sulfadimidin und Sulfadimethoxin bei 95-100 % . Linearer Bereich: zwischen 50 und 1O.OOO pgkg. Nachweisgrenze nach dem EG-Konzept (Mittelwert von 20 Blindwert-Proben plus dreifache Standardabweichung) im Bereich von 4,6-37,6 pglkg f i r die Sulfonamide (auBer Sulfanilamid) und 1,l pgkg fur Nicarbazin. Die Ent-

136

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

scheidungsgrenze (Mittelwert von 20 Blindwert-Proben plus sechsfache Standardabweichung) zwischen 8,l und 68,3 pg/kg fur die Sulfonamide (auBer Sulfanilamid) und 1,9 pg/kg fur Nicarbazin. Variationskoeffizient unter 15 % (auBer Sulfanilamid).

Alternativmethoden Als Alternativmethoden sind in der Multimethode [7-15 bis 7-17] die Gaschromatographie nach entsprechender Derivatisierung, Hemmstofftests, RIA und ELISA beschrieben.

7.4 Bestimmung von Ruckstanden von Oxytetracyclin, Tetracyclin und Chlortetracyclin in Muskulatur und Niere Problemstellung Die im Titel erwahnten Antibiotika werden in der modernen Massentierhaltung zur Therapie verwendet. Die lebensmittelrechtliche Situation ist durch die EG-Richtlinie 2377-90 geregelt [7-151. Formeln der Tetracycline

R, = Rz = H R1 I c1 R2 = H R, = H R2 = OH

Tetracyclin Chlortetracyclin Oxytetracyclin

Abb.7-2 F~~~~~~~~ Tetracyclinen.

Prinzip der Bestimmung Das Probenmaterial wird homogenisiert, mit einem Succinatpuffer extrahiert und der Extrakt uber eine mit Cu2+-Ionen beladene Chelating-SepharoseSaule gereinigt. Die auf der Saule selektiv gebundenen Tetracycline werden nach Waschen mit Wasser und Methanol mit einem EDTA-Succinatpuffer eluiert und das Eluat durch Festphasenextraktion an RP-18-Kartuschen gerei-

7.4 Bestimmung von Ruckstanden von Oxytetracyclin in Muskulatur und Niere

137

nigt und von Cu-Ionen befreit. Die Tetracycline werden mit Methanol eluiert, unter Zugabe von Ethylenglykol eingeengt und mittels HPLC getrennt. Chemikalien und Hismittel

- Standards: Oxytetracyclin, Tetracyclin, Chlortetracyclin und Doxycyclin -

-

-

-

(alle als Hydrochloride) Methanol, zur Riickstandsanalyse [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 Acetonitril, zur Riickstandsanalyse [F, T; R 11-23/24/25;S 16-24-44] Wasser, HPLC grade Bernsteinsaureanhydrid oder Bernsteinsaure C-18-Extraktionssaulen,500 mg, geeignet zur Tetracyclinanalytik (getestet wurden Produkte von Macherey und Nagel, ICT) Chelating-Sepharose-Suspension(Pharmacia oder Sigma) Citronensaure * H 2 0 [R 41-37/38; S 26-36] Ethylenglykol [R 221 CuS04, wasserfrei [Xn; R 221 Na2HP04 2 H,O oder wasserfrei Natronlauge 1 moVL [C; R 35; S 2-26-37/39] EDTA (Ethylendiamintetraessigsaure Dinatriumsalz) Ethanol zur Ruckstandsanalyse [R 11; S 7-16]

+

Losungen: Succinatpuffer pH 4:

5,O g Bernsteinsaureanhydrid (oder 5,9 g Bernsteinsaure) in 1 L Wasser losen und rnit 1 M NaOH auf pH = 4,O einstellen. EDTA-Succinatpuffer: 37,2 gxtriplex-I11 * 2 H 2 0 werden in 1 L Succinatpuffer gelost. cuso4: 5gfl, 20 % in Wasser (v/v) Ethanol: 0,l M McIlvain-EDTA-Puffer: 52,5 g Citronensaure * H20, 44,5 g Na2HP04+ 2 H 2 0und 93 g Titriplex I11 in 2,5 L Wasser losen, pH-Wert mit NaOH auf pH 4,O einstellen. Ethylenglykol-Methanol-liisung: 22 g Ethylenglykol mit Methanol auf 100 mL bringen.

Gerate: - Adapter fur Glas-Trennsaulen aus FTFE (z. B. Baker 4528) - Glas-Saulen rnit PTFE-Fritte zu Eigenbefiillung (8 mL, z. B. Baker 7328-06) - Trichtersaulen fur Trennsaulen (z. B. Baker 7120-03,75 mL) - Ultra-Turrax - Vortex-Mischer

138

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Herstellung der Chelating-Sepharosesaule: Suspension mischen und ca. 4 mL in die Saule mit PTFE-Fritte geben, nach Absetzen des festen Materials Flussigkeit unter leichtem Vakuum absaugen; Fullhohe ca. 4 cm. AnschlieBend 20 mL CuS04-Losung durch die SHule saugen; nach 10 mL Saule zur Entfernung von Luftblasen an einem VortexSchuttler behandeln. Die Saule ist gebrauchsfertig, nachdem 15 mL Succinatpuffer durch die Saule gesaugt wurden. Regenerierung der Chelating-Sepharosesaule: Nach Gebrauch wird die Saule rnit 20 mL Wasser gespult in 20 %igem Ethanol im Kuhlschrank (+4 "C) aufbewahrt; vor erneutem Gebrauch muB das Ethanol entfernt und die Saule neu mit 20 mL CuS0,-Losung beladen werden. Die Saule kann bis zu lOmal verwendet werden. Vergleichslosungen: - Stammlosungen: Je 10,8 mg der Hydrochloride von Oxytetracyclin, Tetracyclin sowie 11,l mg Chlortetracyclin werden in 100 mL Methanol gelost. Die Stammlosungen sind monatlich frisch zu bereiten. - Dotierungslosung: je 10 mL der Standardlosung im 100 mL-MeBkolben rnit Acetonitril auffullen (c = 10 ng/pL). Die Losung ist wochentlich frisch herzustellen. Interner Standard: 11,8 mg Doxycyclin * HCl (10 mg Wirkstoff) in 100 mL Methanol losen. Monatlich frisch herstellen. 1 mL dieser Stammlosung wird im 10 mL-MeBkolben mit Acetonitril aufgefullt (c = 10 ng/pL); diese Losung muB wochentlich frisch hergestellt werden. Arbeitsvorschrift Dotierung der Proben: Zur Kontrolle der Aufarbeitung wird eine Probe aus jeder Aufarbeitungsserie dotiert; zu 10 g Muskelfleisch werden je 100 pL, zu 10 g Niere je 600 pL Dotierungslosung gegeben (je 100 pgkg im Muskelfleisch; 600 pg/kg in Nieren). a) Aufarbeitung Extraktion der Tetracycline: 10 g Probenmaterial (zerkleinert und homogenisiert) werden in ein Zentrifugenglas eingewogen, mit internem Standard (und ggf. Dotierungslosung, s.o.) versetzt, genau 93 g Succinatpuffer pH 4 zugegeben und zunachst mittels Ultra-Turrax (2 min), anschlieBend in einem Ultraschallbad (3 min) homogenisiert. Danach wird 15 min bei minimal 5000 G zentrifugiert und der Uberstand durch ein trockenes Faltenfilter in ein Becherglas filtriert. Bei jeder Serie wird eine Probe rnit der Dotierungslosung versetzt.

7.4 Bestimmung von Riickstiindenvon Oxytetracyclinin Muskulatur und Niere

139

Reinigung: Die rnit Cu-Ionen beladene Chelating-Sepharosesaule wird rnit Adapter und Trichtersaule versehen, ein Aliquot (50 mL des Extraktes) in die Trichtersaule gegeben und durch die Saule gesaugt. Die Saule wird dann sukzessive mit 10 mL Wasser, 30 mL Methanol und 2 x 10 mL Wasser gewaschen. Eine C-18-Kartusche wird rnit je einem Saulenvolumen Methanol, Wasser und EDTA-Succinatpuffer konditioniert; anschlieoend wird die Chelating-Sepharosesaule (mit Trichtersaule) uber einen Adapter auf die Kartusche aufgesetzt . Die Tetracycline werden mit 50 mL EDTA-Succinatpuffer eluiert (4 mumin). Danach werden alle Aufsatze von der Kartusche entfernt und diese rnit 2 mL Wasser (Elution von Cu-Ionen) und 1 mL Hexan (Wasserspuren entfernen) gewaschen. Die Elution der Tetracycline von der C-18-Kartusche erfolgt rnit insgesamt 7,5 mL Methanol in einen 25 mL Spitzkolben (Leergewicht mu8 notiert werden). Dem Eluat wird 1 mL EthylenglykolMethanol-Gemisch (220 mg Ethylenglykol) zugemischt und am Rotationsverdampfer bei maximal 40 "C das Methanol entfernt (Ruckstand 220-280 mg). Dieser Ruckstand wird rnit 0,l M McIlvain-EDTA-Puffer auf ein Gesamtgewicht von 430 mg (400 pL Endvolumen) gebracht. HPLC-Standardlosungen: Zu 1 mL Ethylenglykol-Methanol-Gemisch (220 mg Ethylenglykol) werden 50 bzw. 300 pL Dotierungslosung und 300 pL ISTD hinzugefugt . Die Losung wird am Rotationsverdampfer bei maximal 40 "C auf ein Gewicht von 430 mg (Endvolumen 400 pL) gebracht. Die Liisung wird unmittelbar vor Gebrauch frisch hergestellt .

b) Geriite und chromatographische Parameter [HPLC-Anlage zur Gradientenelution rnit DAD; hilfsweise UV-Detektor; fur Serien Autosampler empfohlen] HPLC-System: Originalapplikation auf einer Hewlett-Packard-Anlage (HP 1090) mit Niederdruckgradient. Saule: Edelstahlsaule (250 mm x 4,6 mm i.D.) modifiziertem Kieselgel (RP-8 oder RP-18), 5 pm Eluent: Stufengradient aus A: 0,05 M H3P04+ 0,Ol M Pentansulfonsaure-Na und B : Acetonitril; beginnend rnit 95 % A; endend rnit 90 % B. Der optimale Verlauf muB den jeweiligen Geraten und Silulenkonfigurationen angepaBt werden. Vorschlag: Zeit (min) %B Zeit (min) %B 0 5 10 60 1 5 12 90 3 10 15 90 5 30 17 5 8 60 20 5

140

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

1,5 mumin; Druck ca. 18 MPa (Fluorate mu8 ggf. angepaat werden) Detektor: DAD 320 nm : 120; 260 :4; 315 :4; 360 :4; Referenzwellenlange 550 : 100 UV-Detektor: 360 nm Injektionsvolumen: 100 pL Flufirate :

Ergebnisse und Diskussion Durch die Methode konnen die Tetracycline mittels HPLC schnell getrennt werden (Abb. 7-8). Die Aufarbeitung ist notwendig, damit nicht durch Matrixeffekte das qualitative und quantitative Ergebnis verfalscht wird. In wal3rigen Medien epimerisieren die Tetracycline sehr schnell, daher sollten Probenaufarbeitung und Messung am gleichen Tag erfolgen. Die HPLCStandards sind immer frisch anzusetzen. Kalibrierung Die Kalibrierung wird mit der Methode des externen Standards vorgenommen. Die Berechnung erfolgt uber die inneren Standards. Validierung Die Methode wird derzeit von der Arbeitsgruppe ,,Pharmakologisch wirksame Stoffe" der Lebensmittelchemischen Gesellschaft in der GDCH validiert. Endgultige Daten liegen noch nicht vor. Die Nachweisgrenze wird bei LC C 3 6 0 . 4

550.100

1 8MLR00R.

of

D

N I E R E 2786/1 CFERRINGTON)

3

a E

'1 4

07-

.

*--.---.---I--

9

.

.

.

.

.

. .

10

.

,

11

. . . -

.

.

.

Y

.

.

12

T i m e (mtn.)

Abb. 7-8 Trennung vonTetracyclinen: a) Niere, undotiert; b) mit je 600 pg/kg dotierte Probe; c) Standard mit je 600 pg/kg.

141

7.4 Bestimmung von Riickstanden von Oxytetracyclin in Muskulatur und Niere

NIERE 2786/1 DOTIERT 12ngRul CFERRINGTON) 25ul INJEKTION

9

7

6 5 4

3

2 1 -

0 +

-

1 _ .

.

10 Tim.

le? STANDARD *

TETRACYCLINE 12ng/ul

14: CFERRINGTON) : 25ul INJEKTION

.

.

Cmin.)

.

.

li

.

.

.

12

1 1 ' 1 5

k

12: 10: 8: 6:

4:

etwa 10 yg/kg liegen. Die Wiederfindung in Niere liegen bei 50 % (Chlortetracyclin und Tetracyclin) bzw. bei 60 % (Oxytetracyclin); im Muskel bei 70 % (Chlortetracyclin und Tetracyclin) bzw. bei 80 % (Oxytetracyclin). Die letzteren Angaben sind ebenfalls noch als vorlaufig zu betrachten. Alternativmethoden Als Alternativmethoden bieten sich Hemmstofftests, RIA und ELISA an.

142

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

7.5 Bestimmung von diarrhetic shellfish poisoning in marinen Lebensmitteln Problemstellung Diarrhetic shellfish poisoning (DSP) ist eine Erkrankung, die durch den Verzehr algenbelasteter Muscheln eintreten kann. Bei DSP treten Durchfallerkrankungen auf. Die Erkrankung ist nicht mit PSP (= paralytic shellfish poisoning) zu verwechseln. Der klassische Nachweis der DSP-Toxine erfolgt uber den sogenannten ,,rat feeding test", bei dem Ratten mit verdachtigem Muschelextrakt gefuttert werden und Veranderungen der Ausscheidungen registriert werden. Die fur die Vergiftungen verantwortlichen Komponenten sind Okadasaure (OA) und Dinophysistoxin-1 (DTX-1); diese konnen nach geeigneter Derivatisierung mittels HPLC bestimmt werden. Neben den genannten sind noch weitere DSP-Toxine beschrieben [7-221, aber das HPLC-Monitoring von DSP beschrankt sich auf OA und DTX-1. Die rechtlichen Regelungen fur DSP sind unterschiedlich [7-221, in einigen Landern darf im Bioassay nichts nachweisbar sein (z. B. BRD, Irland, Danemark), in anderen sind Grenzwerte festgelegt (z. B. Schweden 60 mg ON100 g Muschelgewebe). Die vorgestellte Methode ist eine Vereinfachung gegenuber Alternativprozeduren mit anderen Derivaten, bei denen HPLC-Systeme mit Saulenschaltung erforderlich sind.

7.5 Bestimmung von diarrhetic shellfish poisoning in Lebensmitteln

143

Formeln Okadasaure und Dinophysistoxin-1 P I

I

Dinophysistoxin-1

(C,5H70013)

Abb. 7-9 OkadasBure (OA) und Dinophysistoxin-1 (DTX-1).

Prinzip der Bestimmung Die DSP-Toxine werden aus Algen- oder Muschelmaterial extrahiert und durch SPE an Silicagel gereinigt. Der Extrakt wird mit 4-Brommethyl-7methoxycumarin (BrMmn) derivatisiert und die Umsetzungsprodukte direkt mittels HPLC getrennt (isokratisch) und mittels Fluoreszenzdetektion nachgewiesen. Die Methodik eignet sich auch fur HPLC-MS-Analytik (erprobt wurde API) [7-231. Chemikalien und Hilfsmittel - Methanol, destilliert [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Acetonitril, HPLC grade [F, T; R 11-23/24/25; S 16-24-44] - Wasser, HPLC grade - Isopropanol [F; R 11; S 7-16] - Essigsaure, p.a. [C; R 10-35; S 2-23-26] - Dichlormethan [Xn; R 40; S 23-24125-361371 - Ethylacetat, p. a. [R 11; S 16-23a-29-33] - Aceton [F; R 11; S 9-16-23-331 - Kieselgelsaule, 0,5 g (z. B. Waters 51900) - Kronenether: 18-Crown-6 (1,4,7,10,13,16-Hexaoxacyclooctadecan); [R 231 241251-36137138; S 44-26-28-361371391

144

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

- 4-Brommethyl-7-methoxycumarin [R 20/21/22-36/37/38; S 26-36] - Kaliumcarbonat - Vergleichssubstanzen: Okadasaure und Dinosphysistoxin sind kommerziell erhaltlich (z. B. Calbiochem und WaKo). Arbeitsvorschrift Algenmaterial oder Muschelverdauungsorgan (Hepatopankreas) homogenisieren. a) Aufarbeitung 0,5 g des homogenisierten Materials werden mit 4 mL MethanoVWasser (80/ 20) extrahiert. Nach Zentrifugation werden 2 mL des Extraktes (Uberstand) in einem geeigneten Schutteltrichter mit 5 mL Dichlormethan (zweimal) extrahiert . Die CH2C12-Extraktewerden eingeengt, in 0,5 mL Ethylacetat aufgenommen und auf eine Kieselgelsaule gegeben. Zunachst wird rnit je 10 mL Ethylacetat und EthylacetatlIsopropanol (1/1) eluiert; diese Fraktionen werden verworfen. Die Analyten werden anschlieaend rnit 5 mL IsopropanoVEssigsaure (1/1, v/v) eluiert. Vor der Derivatisierung wird diese Fraktion im Stickstoffstrom getrocknet und der Ruckstand in 170 pL Aceton aufgenommen. Derivatisierung: Zur acetonischen Losung werden 5 pL 0,1%ige Losung von 18-Crown-6 (in Aceton) gegeben, 25 pL einer O,15%ige Losung von 4-Brommethyl-7-methoxycumarin (in Aceton) sowie 1-2 mg Kaliumcarbonat. Die Mischung wird im geschlossenen GefaI3 2 h bei 55 "C gehalten (z. B. in einem Reactitherm Heizmodul; Fa. Pierce). Nach Abkuhlen kann die Losung eingespritzt werden. Diese Derivatisierungsreaktionist auch fiir andere Sauren angewandt worden.

Abb. 7-10 Reaktionsgleichung der Derivatisierung von DSP-Toxinen rnit BrMmn. Rest R vgl. Abb. 7-9.

b) Gerate und chromatographische Parameter [Isokratische Anlage mit Fluoreszenzdetektor] Die Originalapplikation wurde auf folgender Anlage erstellt: HPLC-System: Autosampler (AS-4000, Merck), Pumpe (L-6200A, MerckHitachi), Fluoreszenzdetektor (RF 551, Shimadzu) , Datensystem (D-6000, Merck-Hitachi)

7.5 Bestimmung von diarrhetic shellfish poisoning in Lebensmitteln

Saule: Eluent: Fluorate: Detektor:

145

Edelstahlsaule (250 mm X 4 mm i. D.) mit Nucleosil 5 C-18; (Macherey-Nagel, Nr. 720014) AcetonitriVWasser (70/30, v/v) 1 mUmin Fluoreszenz (ex: 325 nm; em: 390 nm)

Ergebnisse und Diskussion

Die vorgestellte Methodik hat gegenuber anderen den Vorteil, daB eine Hexanextraktion (zur Fettentfernung) unnotig ist . Durch die Reinigung an Kieselgel vor der Derivatisierung wird das Risiko einer Zersetzung der Derivate umgangen. Die Derivate sind stabiler als diejenigen mit 9-Anthryldiazomethan (ADAM). AuBerdem ist Br-Mmc deutlich preiswerter.

0

I

I

10

20

I

30 min

Abb. 7-lk Trennung von DSP-Toxinen in realen Proben.

146

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Die HPLC-Trennung erfolgt isokratisch in 25 Minuten. Wichtig ist, nach jedem Lauf die Saule 15 min mit Wasser zu spiilen, da sonst eine Anreicherung von Verunreinigungen auf der Saule eintreten kann. Nach diesem Waschschritt muB die Saule 15 min mit Acetonitril aquilibriert werden. Bei Beachtung dieser ,,Pflegevorschrift" kann die Saule 500 Einspritzungen und mehr aushalten. Validierung Die Reaktion ist zwischen 0,5 und 2,5 ng OA linear. In Zusatzversuchen wurden 5 yg/g annahernd zu 100 % wiedergefunden.

Alternativmethoden Die am weitesten verbreitete Methode nutzt selektive Extraktion von OA und DTX-1 rnit MethanoVWasser (80/20, v/v) , Derivatisierung rnit 9-Anthryldiazomethan (ADAM). Nach Reinigung iiber Kieselgel wurden die Derivate mittels HPLC unter isokratischen Bedingungen getrennt [7-231. Wenn der Extrakt ohne Kieselgelreinigung (Problem der teilweisen Zersetzung der ADAM-Derivate an Kieselgel) direkt auf eine HPLC-Anlage rnit Saulenschaltung gegeben wird, sind die Wiederfindungen gut [7-251, allerdings wird eine kompliziertere HPLCAnlage benotigt.

R-C,

//"

+

OH

Abb. 7-12: Reaktionsgleichung der Derivatisierung von DSP-Toxinen mit ADAM (Rest R vgl. Abb. 7-9).

7.6 Bestimmung von Konservierungsstoffen in Lebensmitteln und Kosmetika Problemstellung In den Verordnungen des Lebensmittel- und Bedarfsgegenstandegesetzes wird die Verwendung zahlreicher Konservierungsstoffe nach Art, Menge und Einsatzbereich seit langem genau geregelt . Die Erfassung dieser Verbindungen gehorte mit zu den ersten routinemaBig durchgefiihrten HPLC-Bestimmungen. Die folgende Vorschrift beinhaltet die simultane Analyse von pHB-

7.6 Bestimmung von Konservierungsstoffenin Lebensmitteln und Kosmetika

147

Methyl-, -Ethyl-, -Propylester, pHB-Saure, Benzoesaure und Sorbinsaure in Lebensmitteln und zusatzlich pHB-Butylester, 4-Chlor-3-MethylphenolY Dichlor-m-xylol und Salicylsaure in Kosmetika. Formeln der Konservierungsstoffe

ocooH xYcooH

-COOH

RO

Benzoesaure

R = H pHB-Saure R E CH3 pHB-Methylester

Sorbinsaure

R x CzHs pHB-Ethylester R = C3H7 pHB-Propylester R = C4H9 pHB-Butylester

qo= aooH c1

OH

Salicylsaure

4-Chlor-3-Methylphenol

Abb. 7-W: Formeln von Konservierungsstoffen.

Prinzip der Bestimmung Die homogenisierten Proben werden in methanolischen Losungen aufgeschlammt, filtriert, mit einem inneren Standard versehen (3,5-Dimethoxybenzoesaure) und mittels isokratischer RP-HPLC analysiert. Die Aufarbeitung muS fur Lebensmittel- bzw. fur Kosmetika-Proben entsprechend modifiziert werden.

Chemikdien und Hilfsmittel - Methanol, p. A. und HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Acetonitril, HPLC grade [F, T; R 11-23/24/25; S 16-24-44] - Wasser, HPLC grade - Essigsaure, p.A. [C; R 10-35; S 2-23-26] - Celite Q p 545 (Kosmetika)

148

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Losungen Cjeweils in 70 %igem Methanol): Interner Standard (ISTD): 250 mg 3,5-Dimethoxybenzoesaure/lOOmL; Stammlosung Lebensmittel: je 0,l mg/mL pHB-Methyl-, -Ethyl-, -Propylester, Benzoesaure, Sorbinsaure und 0,25 mg/ mL 3,5-Dimethoxybenzoesaureals ISTD; Stammlosung Kosmetika: je 0,l mg/mL pHB-Methyl-, -Ethyl-, -Propylester, pHB-Saure, Benzoesaure, Sorbinsaure und je 0,25 mg/mL pHB-Butylester, 4-Chlor3-methylphenol, Dichlor-m-xylol, Salicylsaure und 0,25 mg/mL 3,5-Dimethoxybenzoesaure als ISTD; Kalibrierlosung Lebensmittel: Stammlosung Lebensmittel 1:5 verdunnen (= 0,02 mg Konst. und 0,OS mg ISTD/mL); entspricht bei nachfolgender Aufarbeitung 400 mg/kg Probe Stammlosung Kosmetika 1:5 verdunnen (= Kalibrierlosung Kosmetika: 0,02 mg bzw. 0,05 mg Konst. und 0,05mg ISTD/mL); entspricht bei nachfolgender Aufarbeitung 400 bzw. 1000 mg Konst./kg Probe; Gerate und Hilfsmittel: - Ultraschallbad - Glastrichter, Glasspritze mit Luerlock-AnschluS - Membranfilter (0,02 pm Porendurchmesser)

Arbeitsvorschrift a) Aufarbeitung fur Lebensmittelproben 5,00 g homogenisiertes Probenmaterial in Becherglas (oder direkt in 100 mL MeBkolben) einwiegen. Mit 70 % igem Methanol anschlammen und in 100 mL MeSkolben uberfuhren. 2 mL ISTD zufugen. Ungefahr 5-10 min im Ultraschallbad homogenisieren, danach abkuhlen lassen. AnschlieBend zur Marke auffullen und durchmischen. Die G s u n g zum Absetzen von Fett- und Feststoffen stehenlassen. Uberstand mittels Glasspritze und Membranfilter blank filtrieren. Das klare Filtrat zur HPLC einsetzen. b) Aufarbeitung fur Kosmetikaproben 2,5 g homogenisiertes Probenmaterial in Becherglas einwiegen. Mit 3 g Ce lite verreiben und durch trockenen Trichter in 50 mL MeBkolben uberfuhren. Mit 70%igem Methanol nachspulen. 2 mL ISTD zusetzen und 10 min im Ultraschallbad homogenisieren, danach abkuhlen lassen, zur Marke auffullen

7.6 Bestimmung von Konservierungsstoffen in Lebensmitteln und Kosmetika

149

und durchmischen. Die Losung mittels Glasspritze und Membranfilter blank filtrieren. Das klare Filtrat zur HPLC einsetzen.

c) Gerate und chromatogaphische Parameter [Thermostatisierbare isokratische Anlage mit UV-Detektor] Die Originalapplikation wurde auf folgender Anlage erstellt: HPLC-System: Pumpe 655 A-12 rnit Integrator D-2000 (MercWHitachi); Einspritzventil7125 mit 20 pL Probenschleife (Rheodyne); Saule: Edelstahlsaule (125 X 4 mm i. D., Merck oder 125 X 4,6 mm i.D., Bischoff) rnit ODs-Hypersil (Shandon, 5 pm) Temperatur: 35 "C Eluent: WasserhlethanoVAcetonitrivEssigsaure (550/350/100/3; v/v) Flufirate: 1,0 mumin 655 A (MerckMitachi); UV 235 nm Detektor: Ergebnisse und Diskussion Abb. 7-14 zeigt Chromatogramme der 0 . a. Kalibrierlosung fur Lebensmittel und einer Bohnensalatprobe ohne deklarierte Konservierungsstoffe. Kalibrierung Die Identifizierung bzw. Zuordnung der Peaks erfolgt mit Hilfe der Kalibrierlosung. Die Berechnung der Konservierungsstoffgehalte kann automatisch durch einen entsprechend programmierten Integrator oder ein Datensystem erfolgen. Es liegt folgende Berechnungsformel zugrunde: Konz (SP)

=

IE (") x IE (IsTD K, x Konz (SK) IE (SK) IE (ISTD P)

Konzentration an Substanz in der Probenlosung in mgkg Probe; IE (SP): Integrationseinheit der Sub. in der Probenlosung IE (SK) : Integrationseinheit der Sub. in der Kalibrierlosung IE (ISTD P): Integrationseinheit des ISTD in der Probenlosung IE (ISTD K): Integrationseinheit des ISTD in der Kalibrierlosung Konz (SK): Konzentration der Substanz in der Kalibrierlosung in mgkg Probe (entspricht bei der beschriebenen Aufarbeitung 400 bzw. lo00 mg Konservierungsstoff) Konz(SP):

Validierung Die Aufarbeitung und Analytik ist darauf abgestellt, Mengen von ca. 10 mg bis ca. 4OOO mg Konservierungsstoff pro kg Probe zu bestimmen. Die Eichgeraden sind in diesem Bereich linear. Die Wiederfindungsraten liegen bei uber 95%.

150

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

a)

I

c

1

L

1

I

I

I

0

5

10

L

15 min

L

0

I

1

I

5

10

I

15min

Abb. 7-14 a) HPLC-Chromatogrammder Kalibrierlosung fur LM; b) HPLC-Chromatogramm einer Bohnensalatprobe.

Altemativmethoden Eine Aufzahlung der Moglichkeiten erscheint bei dem breiten Spektrum relativ sinnlos. Fast alle chromatographischen und spektroskopischen Verfahren sind in vielfaltiger Weise fur die Erfassung unterschiedlichster Konservierungsstoffe in unterschiedlichsten Matrices bereits eingesetzt worden. Fur die qualitative und quantitative Bestimmung von durch UV-Detektion erfaDbaren Verbindungen durfte die HPLC sich aber mittlerweile durchgesetzt haben.

7.7 Nachweis eines Grapefruitzusatzes zu Orangensaft

151

7.7 Nachweis eines Grapefruitzusatzeszu Orangensaft Problemstellung Orangensafte gehoren mengen- und wertmaBig zu den wichtigsten gehandelten Fruchtsiiften bzw. Konzentraten. Verfdschungen mit anderen Fruchtprodukten, unerlaubte Zuckerungen undoder Zusatze von pulp wash werden deshalb ofter aus kommerziellen Griinden vorgenommen. Je nach Weltmarktpreis wurden z. B. Grapefruitsaftprodukte zu Orangensaft oder umgekehrt zugesetzt. Da Orangensaft kein Naringin enthalt ,welches das bittere Hauptglykosid der Grapefruit darstellt, ist ein Nachweis leicht uber diese Verbindung zu fuhren. Da in Europa Orangensaft nur aus citrus sinensis-Varietiten hergestellt werden darf, kann Naringin auch nicht durch Bitterorangen in den Saft gelangen. Formeln der Flavanonglykoside

H

OH

Naringin

Hesperidin Abb. 7-15. Formeln von Naringin und Hesperidin.

152

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensrnittelbereich

Prinzip der Bestimmung (modifiziert nach [7-26]) Die Flavonoide werden aus den homogenisierten Saften durch siedende Dimethylformamidlosung extrahiert. Nach Zentrifugation (auch Filtration moglich) und Membranfiltration werden die Extrakte durch GradientenHPLC an RP-18-Phasen analysiert. Chemikalien und Hilfsmittel - Wasser, HPLC grade - Acetonitril, HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Essigsaure, p.A. [C; R 10-35; S 2-23-26] - N,N-Dimethylformamid [Xn; R 20/21-36; S 26-28a-36; Besonderer Hinweis fur Frauen im gebarfahigen Alter: Teratogene Wirkung moglich] Gerate und Hilfsmittel: - Homogenisator, z. B. Ultra Turrax T 25 (IKA) - Zentrifuge, z. B. Biofuge 28 RS (Heraeus) - Membranfilter, PTFE 0,2 pm (z. B. Amchro L6510-06)

Arbeitsvorschrift a) Aufarbeitung Die Proben 10 min mit Ultra Turrax (10 000 U/min) homogenisieren, dann mit Wasser 1:1 verdunnen (Die Homogenisation ist sehr wichtig, da die Flavonoide unterschiedlich von Fruchtbestandteilen adsorbiert werden konnen. Direkte Membranfiltration kann zu quantitativ nicht reproduzierbaren Werten fuhren). 5 mL dieser Liisung rnit 5 mL Dimethylformamid versetzen und 10 min im siedenden Wasserbad erhitzen (DMF dient als hervorragendes Losungsmittel fur die zum Teil schlecht loslichen Flavonoide (vor allem Hesperidin) und fuhrt zur Ausfallung bzw. Zusammenballung storender Makromolekule wie 2.B. Pektin). Nach dem Abkiihlen die Losung 10 min zentrifugieren (3500 rpm). Die uberstehende Losung vor der Injektion membranfiltrieren (Amchro L6510-06 PTFE 0,2 pm).

b) Gerate und chromatographische Parameter [Hochdruckseitig mischendes Gradientengerat mit UV-Detektor; vorzugsweise DAD] Die Originalapplikation wurde auf folgender Anlage erstellt: HPLC-System: System Gold, Solvent Module 126 rnit PC IBM PS2/70386 (Beckman); Dosierventil Altex 210 A mit 20 pL Schleife; Saule: Edelstahlsaule (250 x 4,6 mm i. D., Techlab) rnit ODs-Hypersil, 5 pm (Shandon);

7.7 Nachweis eines Grapefruitzusatzeszu Orangensaft

1 %ige Essigsiiure/ 90 70 70 90 Equilibrierung 90 HuBrate: 0,8 mumin Detektor: DAD, 284 nm Eluent:

Acetonitril 10 30 30 10 10

153

Zeit 0 min nach 30 min nach 35 min nach 40 min nach 60 min

Ergebnisse und Diskussion Abb. 7-16 zeigt das Chromatogramm eines reinen Orangensaftes. Bei einem mit Grapefruitsaft verfiilschten Produkt wurde zwischen Narirutin und Hesperidin (s. Abb. 7-16) ein weiterer Peak, das Naringin auftauchen. Absorbance 284

nm

'

-30-

-.>

min

Neoponcirin

Absorbance 284 nm

Abb. 7-16 HPLC-Chromatogramm eines Orangensaftes.

Hesperidin

154

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Zusatzlich zur Retentionszeit 1aBt sich die Identitat des Naringins uber das DAD-Spektrum absichern. Als Vergleich kann direkt das Spektrum des vorher eluierenden Narirutins herangezogen werden. Narirutin mu13 als natiirlicher Bestandteil des Orangensaftes (und auch des Grapefruitsaftes) immer vorhanden sein und ist chemisch ein Isomeres des Naringins. Da der strukturelle Unterschied nur den Zuckerbaustein betrifft (statt Neohesperidose liegt im Narirutin Rutinose vor), sind die UV-Spektren identisch. Identifizierungsprobleme konnen sich vor allem im unteren ppm-Bereich ergeben [7-271. Von einigen Fachleuten [7-281 wird die Ansicht vertreten, daS 5 ppm aus technologischen Grunden (unvollstandige Aussortierung von Grapefruit vor der Orangensaftherstellung) zu tolerieren seien. Je nach DAD-Fabrikat muB bei so geringen Werten eventuell eine Konzentrierung der Probe vorgenommen werden, um auswertbare DAD-Spektren zu erhalten. Sehr hohe Hesperidinwerte geben einen Hinweis auf zu hohen PreSdruck bei der Saftherstellung.

Kalibrierung Fur den Nachweis eines Grapefruitzusatzes geniigt die Absicherung der Identitat des Naringins. Eine Quantifizierung der Glykoside Narirutin, gegebenenfalls Naringin und Hesperidin kann iiber eine externe Standardisierung (Kalibriergeraden) erfolgen. Dazu werden aus einer DMF-Stammlosung mit bekannten Gehalten an Hesperidin, Narirutin undoder Naringin Verdunnungen hergestellt und eingespritzt, die Gehalte von 0,002-0,5 mg/mL enthalten. Fur die Berechnung der Kalibriergeraden werden die vom Datensystem ermittelten Peakflachen bei der Wellenlange 284 nm verwendet. Da Narirutin und Naringin den gleichen molaren Extinktionskoeffizienten besitzen, geniigt eigentlich eine der beiden Verbindungen. Alle drei Glykoside sind kommerziell erhaltlich (z. B. Roth). Naturstoffstandards sind hinsichtlich ihrer Gehaltsangaben aber immer mit Vorsicht zu betrachten. Validierung Bei der beschriebenen Aufarbeitung umfassen die Kalibriergeraden einen Bereich von 8-2000 m g L Glykosid im Orangensaft. Die Wiederfindungsraten liegen uber 95 % mit geringen Variationskoeffizienten (3-5 %). Altemativmethoden In der unter [7-261 beschriebenen Methode wird ein isokratisches System eingesetzt , dessen Trennleistung fur die meisten Falle auch ausreicht . Fruher wurde zur Bestimmung in der Regel eine Reinigung uber Polyamidsaulen durchgefuhrt [7-271. Diese fuhrt zu sehr sauberen Extrakten und die (zuckerfreien) Losungen sind bei Bedarf bei Uberpriifungen im unteren ppm-Bereich einfacher zu konzentrieren. Da die Aufarbeitung im Vergleich zur DMFExtraktion aber wesentlich aufwendiger ist, sollte sie nur noch in Zweifelsfal-

7.8 Bestimmung von schwefliger Siiure in Bier und anderen Getrhken

155

len eingesetzt werden. Die Gaschromatographie ist nicht zur Erfassung der Glykoside geeignet, sondern kann zu falschen Ergebnissen [7-28, siehe 7-26] fiihren.

7.8 Bestimmung von schwefliger Saure in Bier und anderen Getriinken mittels HPLC-Biosensorkopplung Problemstellung Fur Lebensmittel, fur die keine besonderen Regelungen uber den Sulfitgehalt getroffen wurden, sieht das deutsche Lebensmittelrecht einen allgemeinen Grenzwert von 10 mg/L vor [7-291. Dies ist auch beim Bier der Fall. Eine Kontrolle ist notwendig, da wahrend des Brauprozesses durch den Abbau schwefelhaltiger Verbindungen auf naturliche Weise bis zu ca. 15 ppm entstehen konnen. Weiterhin kann Sulfit uber entsprechend behandelte Rohstoffe eingetragen werden, einige auslandische Brauereien setzen es wegen seiner guten konservierenden und antioxidativen Eigenschaften auch direkt dem Bier zu. Bei Traubensaften konnen geringe Restgehalte auf eine vorgenommene Schwefelung hinweisen, selbst wenn die Ware als ,,ungeschwefelt" deklariert wurde. Gerade im Bereich unter 10 ppm liefern die gebrauchlichen Methoden aber keine zuverlassigen Werte.

Prinzip der Bestimmung Die Probe wird verdunnt und isokratisch an einer Aluspher-Saule (mit einer RP-18-Vorsaule) getrennt, hinter die ein Enzymreaktor geschaltet ist (vgl. Abschn. 2.2.3). Dieser ist mit immobilisierter Sulfitoxidase gefullt, durch welche Sulfit zu Sulfat und H202umgesetzt wird: SO2-,

+ H 2 0 + O2Sulfitoxidase so'-,

+

H ~ O ~

Das gebildete Wasserstoffperoxid wird dann bei einem Potential von 0,4 V mit einem elektrochemischen Detektor gemessen. Bei der Aluspher-Saule (Merck) handelt es sich um eine Trennsaule, bei der die stationare Phase aus Aluminiumoxid besteht, welches mit Polybutadien beschichtet ist. Mit ihr hat man die Moglichkeit, die Stellung des Sulfitpeaks im Chromatogramm selektiv zu verandern, ohne dal3 andere elektrochemisch aktive Storpeaks ihre Retentionszeiten wesentlich verandern. Damit kann aus: WeSels, D., v. d. Brelie, A., Gromus, J., Galensa, R., Bruuwksemchufl, 1995, 48, 96-101

156

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

b)

O

5

10 rnin

Abb. 7-17:HPLC-Chromatogramme zur Sulfitbestimmung im Bier (Verdunnung 1:lOO); a) mit 0,OS M Carbonatpuffer als FlieBmittel; b) mit 0,02 M Carbonatpuffer; pH = 9,O.

man den Sulfitpeak, je nach vorhandenen Storstoffen in verschiedenen Getranken, an eine freie Stelle im Chromatogramm plazieren (Abb. 7-17). Der Grund f i r diese Eigenschaft ist ,daB das Aluminiumoxid der Alusphersaule nicht vollstandig mit Polybutadien belegt ist. Da Aluminiumoxid eine Lewissaure (Elektronenpaarakzeptor) und das Sulfit-Ion eine Lewisbase (Elektronenpaardonator) ist, konnen sich an unbelegten Stellen Sulfit-Ionen anlagern, es kommt zu Saure-Base Wechselwirkungen. Das bedeutet, je hoher man die Konzentration des Carbonatpuffers wahlt , desto schlechter kann Sulfit vom Saulenmaterial gebunden werden und desto schneller wird es eluiert . Diesem speziellen Trennmechanismus unterliegen die Storsubstanzen in der Regel nicht, so daB auf sie die Anderung der Pufferkonzentration wenig EinfluB hat. Ein Nachteil der Alusphersaule ist ihr geringes Ruckhaltevermogen gegenuber storenden Inhaltsstoffen im Vergleich zu RP-18-Saulen. Durch den Einsatz einer RP-18-Vorsaule kann aber ein GroBteil dieser Verbindungen entfernt werden. Chemikalien und Hilfsmittel - Wasser, HPLC grade - Natriumsulfit, p. A. - Natriumcarbonat (>99,5 %) - Sulfit-Oxidase (E. C. 1.8.3.1) aus Huhnerleber, kristalline Suspension in 3,2 M (NH4)2S04-Losung,pH = 7,5 (Sigma Chemie) Arbeitsvorschrift a) Probenaufarbeitung Die Getranke werden je nach den zu erwartenden SO2-Gehalten mit Wasser verdunnt (s. Abb. 7-19) und eingespritzt. Die unproblematische und schnelle Vorbereitung ist ein weiterer Vorteil der Methode, Verluste des fluchtigen und oxidationsempfindlichen Sulfits konnen so minimiert werden.

7.8 Bestimmung von schwefliger Siiure in Bier und anderen Getranken

157

b) ImmobTsierung der Sulfitoxidase Als Tragermaterial konnen VA Epoxy (Riedel-de-Haen) oder Eupergit C3ON (Rohm) verwendet werden. Die Bindung des Enzyms erfolgt uber reaktive Oxirangruppen (vgl. Abschn. 2.2.3). Die Immobilisierung ist problemlos im Labor nach [7-301 durchzufuhren. Die erhaltene Suspension wird rnit Hilfe einer Saulenfiillanlage bei einem Druck von 150 bar in Stahlkartuschen (40 X 2,s mm i. D.) gefullt. Die Standzeiten der Reaktoren sind sehr gut, mehrere Monate sind keine Besonderheit . Genaue Angaben konnen nicht gemacht werden, da dies naturlich von der Probenart und Probenanzahl abhangt.

c) Gerate und chromatographische Parameter [Isokratische Anlagen rnit ELCD und Enzymreaktor] Die Originalapplikation wurde auf folgender Anlage erstellt : HPLC-System: System Gold M 116 (Beckman); Degasser 3512 (ERC); Dosierventil 7125 (Rheodyne mit 10 pL-Probenschleife; Auswerteeinheit System Gold (Beckman) bzw. Integrator C-R 6A (Shimadzu); Edelstahlsaule (125 x 4 mm i. D.), Aluspher 60, RP-select B Saule: (Merck) rnit Vorsaule (20 X 4,6 mm i.D.) Spherisorb S 5 PC 18 (CS-Chromatographie); 0,Ol-0,05 M Carbonat-Puffer, pH = 9 Eluent: 0,45 mumin FluBrate: ELCD EP 30 (Biometra) rnit Platin-MeBzelle; ArbeitspoDetektor: tentialO,4 V,Range 50 nA; Enzymreaktor : Stahlkartusche (40 X 2,s mm i. D.); Fullung s. 2.2.3 Ergebnisse und Diskussion Abb. 7-18 zeigt das Chromatogramm einer Bierprobe rnit und ohne Enzymreaktor. Es ist zu erkennen, daB bei der Analyse ohne Enzymreaktor an der Stelle des Sulfits kein Peak auftritt, also keine elektrochemisch aktive Storsubstanz vorliegt . Die Methode wurde ebenfalls bei Traubensaften und Weinen eingesetzt. Bei einigen als ungeschwefelt deklarierten Saften wurden hierbei noch Restmengen von Sulfit im Bereich von 1 ppm nachgewiesen.

Kalibrierung Die Aufnahme der Eichkurve (Abb. 7-19) erfolgte durch Verdunnungsreihen entsprechender Liisungen von Na2S03. Der lineare Bereich erstreckt sich von 0,08-4 mg/L SO2. Da sich die Elektrodenempfindlichkeit und die Aktivitat des Enzyms im Laufe der Zeit verandern, ist die Eichung regelmaBig zu uberpriifen (vgl. Kap. Elektrochemische Detektoren).

158

1:

7 HPLC-Gpplikationen aus dem Lebensmittelbereich

W

a)

-

0

5

10rnin

Abb. 7-18 HPLC-Chromatogramme einer Sulfit-Bestimmung in Bier (Verdunnung 1:50); a) mit Enzymreaktor; b) ohne Enzymreaktor.

"0

1

2

3

4

ms/l

so2

Abb. 7-19: Kalibrierungskurve zur Sulfitbestimmung.

Validierung Die Nachweisgrenze liegt bei funffachem Grundrauschen bei 0,02 mg/L, der Variationskoeffizient bei 2,7 % . Die Wiederfindung bei Bierproben liegt bei Sulfitzusatzen von 2-8 mg/L zwischen 95 und 103% . Zur Uberpriifung wurde ein Methodenvergleich mit einem destillativen Verfahren [7-311 bei Weinproben durchgefuhrt. Es wurde bewuBt ein Lebensmittel mit einem relativ hohen Sulfitgehalt ausgewahlt, da die destillativen Methoden im unteren Bereich keine zuverlassigen Ergebnisse liefern. Es wurden 11Weine mit S02-Gehalten zwischen 34 und 198 m g L untersucht. Die

7.9 Bestimmung von SiiBstoffen

159

Ubereinstimmung kann mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,984 als gut bezeichnet werden.

Alternativmethoden Als DIN-Vorschrift werden demnachst eine Destillationsmethode und eine enzymatische Bestimmung aufgenommen werden. In der amtlichen Sammlung nach 0 35 ist die enzymatische Bestimmung von Beutler et al. enthalten [7-321. Als offizielle AOAC-Methode ist die Destillation nach Monier-Williams [7331 ublich. Im unteren ppm-Bereich sind diese Verfahren aber sehr storungsanfallig und ungenau. Weiterhin wurden Sulfitoxidase-Enzymelektrodenentwickelt, welche entweder den verbrauchten Sauerstoff, z. B. [7-341 oder das gebildete Wasserstoffperoxid [7-351 amperometrisch bestimmen. Chromatographisch 1aBt sich auch die HPLC mit Ionenaustauschersaulen und elektrochemischer Detektion einsetzen, z. B. [7-361.

7.9 Bestimmung von SiiBstoffen Problemstellung Wie bei den Konservierungsstoffen ist auch der Einsatz von Art und Menge an SuBstoffen genau geregelt und mu13 routinemaBig uberpriifbar sein. Die folgende Vorschrift beinhaltet die simultane Analyse von Aspartam, Acesulfam und Saccharin in Lebensmitteln. Formeln der SiiBstoffe

Saccharin

Acesulfam K

Aspartam

Abb. 7-20: Strukturformeln von Aspartam, Acesulfam und Saccharin.

PMzip der Bestimmung Die homogenisierten Proben werden in methanolischer Lasung aufgeschliimmt und einer Klarung nach Carrez unterworfen. Nach Filtration und Zusatz eines inneren Standards (3-Hydroxybenzoesaure) werden sie mittels isokratischer HPLC bei 30 "C analysiert.

160

7 HPLC-Applikationen aus dern Lebensmittelbereich

Chemikalien und Hilfsmittel - Methanol, p. A. und HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-1624] - Wasser, HPLC grade - Natriumacetat, p. A. - Natriumazid, p.A. [T; R 28-32; S 281 - Tetrabutylammoniumbromid (TBA), p. A. Losungen Cjeweils in 20 %igem Methanol): 100 mg 3-Hydroxybenzoes~ure/lOOmL Interner Standard: Stammlosung SiiBstoffe: je 25 mg Aspartam, Acesulfam und Saccharin in 250 mL MeBkolben einwiegen; nach dem Auffullen eine Spatelspitze Natriumazid zur Konservierung hinzufugen; Kalibrierlosung 1: 4 mL Stammlosung SiiBstoffe und 2 mL ISTD zu 100 mL auffullen (entspricht bei der vorgeschlagenen Aufarbeitung 20 mg SiiBstoff/L (kg) und 100 mg ISTDL (kg)); 50 mL Stammlosung SuBstoffe und 2 mL ISTD zu Kalibrierlosung 2: 100 mL auffiillen (entspricht bei der vorgeschlagenen Aufarbeitung 250 mg SuBstoffn, (kg) und 100 mg ISTD/L (kg)); Losungen I und I1 nach Carrez (waBrig); Gerate und Hilfsmittel: Faltenfilter - Glastrichter, Glasspritze mit Luerlock-AnschluB - Membranfilter (0,2 pm Porendurchmesser) -

Arbeitsvorschrift a) Aufarbeitung 20 g (mL) homogenisiertes Probenmaterial in 100 mL MeBkolben einwiegen, 2 mL ISTD dazupipettieren und rnit ca. 50 mL 20%igem Methanol versetZen. Mit je 15 mL der Liisungen I und I1 nach Carrez klaren, schutteln und rnit 20 %igem Methanol zur Marke auffullen. Mit Faltenfilter und anschlieBend rnit Glasspritze und Membranfilter blank filtrieren. Das Filtrat zur HPLC einsetzen. b) Gerate und chromatographische Parameter [Thermostatisierbare isokratische Anlage rnit UV-Detektor] Die Originalapplikation wurde auf folgender Anlage erstellt: HPLC-System: Pumpe L-6200 rnit Auswerteeinheit D-6000 HPLC Manager (Mercwitachi);

7.9 Bestimmung von SiiSstoffen

Sgiule: Temperatur: Eluent: Fluorate: Detektor :

161

Edelstahlsaule (250 x 2 mm i. D., Macherey und Nagel) mit Nucleosil 120 RP-18, 5 pm; 30 "C MethanoVWasser (23/77, v/v) + 1 g Natriumacetat + 3,4 g TBA; 0,4 mumin L-4250 (Merck/Hitachi); UV 216 mm

Ergebnisse und Diskussion Abb. 7-21 zeigt Chromatogramme der Kalibrierlosung 2 und einer ZigeunersoBenprobe ohne deklarierte SiiBstoffe. Sie enthalt ca. 680 mgkg Saccharin. Die Analyse muS mit einer kleineren Einwaage wiederholt werden, die Gehalte miissen im Bereich der Kalibrierungskurve liegen.

Kalibrierung Die Identifizierung bzw. Zuordnung der Peaks erfolgt mit Hilfe der Kalibrierlosung. Die Berechnung der SiiSstoffgehalte kann automatisch durch einen entsprechend programmierten Integrator oder ein Datensystem erfolgen. Die Berechnungsformel entspricht derjenigen der vorstehenden Applikation uber Konservierungsstoffe (7.6).

I

10

1

20min

Abb. 7-Zl: a) HPLC-Chromatogrammder angegebenen Kalibrierbsung2; b) HPLC-Chromatogramm einer Zigeunersoaenprobe.

162

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Validierung Die Wiederfindungsraten liegen bei 100 % mit Variationskoeffizienten von 3%. Alternativmethoden Weitere Beispiele sind in [7-371 gegeben. Eine entsprechende Methode ist ebenfalls in der amtlichen Methodensammlung nach 8 35 LMBG beschrieben .

7.10 Nachweis von Mais und Hirse als Malzersatzstoff in Bier4 Problemstellung Das in Deutschland jahrhundertelang geltende Reinheitsgebot ist mittlerweile zwar nicht mehr gultig, die deutschen Brauer haben sich aber verpflichtet, fur den Inlandsmarkt weiterhin nur nach dem Reinheitsgebot gebrautes Bier zu produzieren. Hintergrund ist die Werbewirksamkeit dieser Aussage. Nachweismoglichkeiten von Fremdfruchtzusatzen sind deshalb notwendig, um irrefuhrende Werbungen mit dieser Qualitatsbezeichnung, die zu Wettbewerbsvorteilen fuhren, aufdecken zu konnen. Als Mais- und SorghumhirseIndikator kann das garungsstabile p-Cumaroylglycerol dienen, welches im Gerstenmalz nicht vorkommt [7-38 bis 7-40]. Weiterhin kann uber diese Verbindung ebenfalls eine Maiszumischung zu Curcuma nachgewiesen werden [7-41].1st der verwendete Mais als Referenzmaterial zuganglich, so kann auch eine quantitative Aussage uber den Maisanteil in Futtermittelmischungen getroffen werden. Dies ist fur die Uberprufung von Subventionszahlungen bei Futtermittelimporten von Interesse, die sich nach der Hohe des Maisanteiles richten. Naturlich kann Mais ebenfalls in anderen Lebensmitteln, wie z. B. Snackprodukten, nachgewiesen werden, sofern hier ein Bedarf besteht [7-411.

vgl.: Patzold R., Fenz R., Krause M., Galensa R., Dtsch. Lebensm. Rdrch. 1992,88, 390-391

7.10 Nachweis von Mais und Hirse als Malzersatzstoff in Bier

163

Formel von p-Cumaroylglycerol

CHzOH

200

250

300

350

nm

Abb. 7-22: 1-0-trans-p-Cumaroylglycerol; Strukturformel und DAD-UV-Spektrum.

Prinzip der Bestimmung Es handelt sich um eine zweistufige Festphasenextraktion, wobei RP-18- und Ionenaustauscher-Kartuschen zum Einsatz kommen. Der erhaltene Extrakt wird mit Gradienten-HPLC an einer P-Cyclodextrin-Trennsauleanalysiert. Cyclodextrinsaulen sind nicht nur fur die Analyse von Enantiomeren von Interesse, sondern zeigen vielfaltige chromatographische Besonderheiten. In Abhangigkeit vom FlieBmittel kann man z. B. Trennungen erhalten, die nach einem Normalphasen- oder Umkehrphasen-Mechanismus verlaufen. Abb. 7-23 zeigt die Struktur von P-Cyclodextrin.

HO HO’

Abb. 7-23: Strukturformel von fl-Cyclodextrin.

164

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Chemikalien und Hilfsmittel Wasser, HPLC grade - Methanol, p. A. und HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Essigsaure, p.A. [C; R 10-35; S 2-23-26] - n-Hexan, p.A. [F, Xn; R 11-20-48; S 9-16-24/25-29-51] - RP-18-Festphasenkartuschen, Bakerbond spe, 3 mL (Baker) - Ionenaustauscherkartuschen, Bakerbond spe, Quarternary Amine, 3 mL (Baker) - Ultraschallbad - Vergleichssubstanz 1-0-trans-p-Cumaroylglycerol: Diese Verbindung ist nicht kauflich erhaltlich. Sie kann relativ einfach nach [7-381 synthetisiert werden, gunstiger ist der Einsatz eines aufgearbeiteten Maisstandards nach [7-381, wo sie als Hauptkomponente leicht uber die Retentionszeit und das DAD-UV-Spektrum (Abb. 7-22) zu identifizieren ist. -

Arbeitsvorschrift a) Probenaufarbeitung Das zu untersuchende Bier im Ultraschallbad zur Vertreibung des C 0 2 bei Raumtemperatur ca. 10 min lang entgasen, 25 mL zur Festphasenextraktion einsetzen. b) Festphasenextraktion Zum Einsatz kommen RP-18- und N+-Kartuschen. RP-18-Kartuschen rnit zwei Saulenfullungen Methanol (ca. 6 mL) und anschlieaend mit zwei Saulenfiillungen H 2 0 konditionieren (vgl. Abschn. 6.2). N+-Kartuschen nacheinander rnit zwei Saulenfullungen n-Hexan, Methanol und H20 (je ca. 6 mL) konditionieren, ein Trockensaugen ist immer zu vermeiden. 25 mL entgastes Bier langsam (Tropfgeschwindigkeit ca. 8-10 Tropferdmin) durch die RP-18-Kartusche saugen. AnschlieBend rnit funf Saulenfullungen H20 (ca. 15 mL) waschen, um polare Stoffe, wie z. B. Kohlenhydrate, zu entfernen (Waschwasser verwerfen). AnschlieBend rnit 2 mL Methanol eluieren. Den Extrakt ca. 1:1 rnit Wasser verdunnen und auf die N+-Kartusche aufgeben. Hier werden so z. B. freie Phenolcarbonsauren entfernt bzw. ausgetauscht. Die durchgesaugte Flussigkeit auffangen (= Eluat), die Kartusche rnit 1 mL Wasser spulen, rnit dem Eluat vereinigen und auf 5 mL auffullen. Diese Losung fur die HPLC einsetzen, bei geringen Rohfruchtanteilen (ca. > 10 % ) kann vorher noch ein Konzentrierungsschritt erfolgen.

165

7.10 Nachweis von Mais und Hirse als Malzersatzstoff in Bier

c) Gerate und chromatographische Parameter [Gradientengerat mit UV-Detektor, vorzugsweise DAD] Die Originalapplikation wurde auf folgender Anlage erstellt: HPLC-System: Pumpe PU 4100 (Pye Unicam), es handelt sich um ein Gradientensystem, das die FlieDmittel niederdruckseitig dosiert, aber erst hochdruckseitig mischt. Die Gradientenansprechzeit entspricht einem hochdruckseitigen GeratetYP; Einspritzventil: 7125 (Rheodyne mit 20 pL Probensschleife); Edelstahlsaule (250 x 4,6 mm i.D.) mit P-Cyclodextrin Saule: (5 pm, Cyclobond I, Astec); Gradient aus A: Methanol/H20/Essigsaure (10/90/0,5; v/v) Eluent: und B: Methanol; Equilibrierung auf 90 % A und 10 % B, linear in 15 min auf 70 % B, direkt auf 0 % A und 100% B, 10 min 100% B, linear in 5 min zuriick auf 90 % A und 10 % B, 20 min equilibrieren; Ergebnisse und Diskussion Die Chromatogramme in der Abb. 7-24 zeigen ein Bier, das rnit Mais und ein Bier, welches ohne Maiszusatz gebraut wurde. Da p-Cumaroylglycerol kurioserweise gleichfalls als Sorghumhirseindikator dient [7-401, kann so eine Unterscheidung zwischen Hirse und Mais nicht getroffen werden, was bei der vorliegenden Problematik (Reinheitsgebots-

I

0

I

10

I

20 nin

1

I

0

10

I

20 min

Abb. 7-24: HPLC-Chromatogramme; a) Bier ohne Maiszusatz; b) Bier rnit Mais gebraut (70% Gerstenmalz, 30 % Mais); + = 1-0-trans-p-Cumaroylglycerol.

166

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

verifizierung) aber eigentlich ohne Bedeutung ist. Fur den Nachweis eines Reiszusatzes (nach Mais der haufigste Rohfruchtzusatz) wurde bisher noch keine phenolische Verbindung gefunden.

Kalibrierung und Validierung Bei dieser Applikation handelt es sich nur um einen qualitativen ,,entwederoder" Nachweis. Die Wiederfindungsrate fur Cumaroylglycerol liegt uber 90 YO rnit Variationskoeffizienten von 5 YO. In Maisgrits liegt der Ester in der GroBenordnung von 10 mg/kg vor [7-381.

Alternativmethoden Zu erwahnen sind die immunologischen Verfahren, wobei eine Methode bereits in die Sammlung nach $35 LMBG aufgenommen worden ist [7-421. Cumaroylglycerol kann ebenfalls rnit RP-18-Phasen analysiert werden [7-391, wobei aber eine aufwendigere Probenvorbereitung notwendig ist. Maisrohfruchtnachweise bis zu 1% lassen sich bei Einsatz der hier beschriebenen Extrakte rnit einer HPLC-Elektroden-Array-Detektor-Kopplung erbringen [7-431.

7.U Bestimmung von Kohlenhydraten durch Benzoylierung Problemstellung Die hier am Beispiel der Bestimmung von Kohlenhydraten beschriebene Vorsaulenderivatisierung ermoglicht die gleichzeitige Erfassung zahlreicher Verbindungen rnit einer Aufarbeitungsmethode und einem Analysensystem. Die Aufarbeitung ist weitgehend unabhangig von dem zu untersuchenden Probenmaterial. Es konnen flussige wie feste Stoffe fast beliebiger Art eingesetzt werden. Aufgrund der selektiven - aber nicht aufwendigen oder zeitraubenden - Derivatisierung lassen sich Spuren noch neben Hauptbestandteilen nachweisen. Fur die benzoylierten Probenextrakte wurden zur analytischen Absicherung Normal- und Umkehrphasen-HPLC-Systeme rnit isokratischer oder auch rnit Gradientenarbeitsweise entwickelt. Durch die Reaktion erhalten alle Verbindungen ein einheitliches, intensives UV-Maximum bei 230 nm. Fur einige Stoffe kann zusatzlich die Kapillargaschromatographie eingesetzt werden, so daB in fast allen Fallen eindeutige Ergebnisse erhalten werden konnen.

7.11 Bestimmung von Kohlenhydraten durch Benzoylierung

167

Derivatisierungsreaktion CZH50\ //0

o* ,c1

+8

Pyridin/Ultraschall 60 "C/ 1 h

C2H50H

-HC1

-$

Abb. 7-25: Reaktion von Ethanol mit Benzoylchlorid zu Ethylbenzoat.

Prinzip der Bestimmung Das homogenisierte Probenmaterial wird bei gleichzeitiger Extraktion in Pyridin mit Benzoylchlorid im Ultraschallbad derivatisiert. Nach Wasserfallung der gebildeten Benzoate schliel3t sich eine Reinigung des Extraktes uber eine RP-18-Festphasenkartuschean. Die Eluate konnen direkt - oder nach VerdunnungKonzentrierung - fur Normal- und Umkehrphasen-Systeme eingesetzt werden. Chemikalien und Hilfsmittel - Wasser, HPLC grade - Isooctan, HPLC grade und p. A. Ware [F; R 11; S 9-16-23-29-331 - Diethylether, p.A. Ware [F; R 12-19;S 9-16-29-331 - Acetonitril, HPLC grade, p. A. Ware [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Benzoylchlorid [C;R 34;S 261 - Pyridin, [F, Xn; R 11-20/21/22;S 26-28] - RP-18-Festphasenkartuschen,z. B. RP-181 g Polar Plus (Baker) - Festphasenextraktionsanlage,z. B. Baker - Glasspitzkolben, 50 mL - Ultraschallbad, heizbar auf 60 "C, z. B. RK 510H (Bandelin) - Dispensette - Mikrowaage - Standards: Glucosepentaacetat, z. B. Aldrich Herstellung eigener Standards durch Benzoylierung nach der folgenden Arbeitsvorschrift (Einwaage 10 mg) Arbeitsvorschrift Alle Reagenzien und Bedingungen sind auf eine maximale Einwaage von 50 mg wasserfreier Substanz oder 30 pL flussiger Probe optimiert worden. Das stellt hohe Anforderungen an die Homogenitat und Einwaagegenauigkeit .

168

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

a) Aufarbeitung und Derivatisierung Ca. 30 mg homogenisiertes Lebensmittel genau in einen 50 mL Spitzkolben einwiegen. Nach Zugabe von 4 mL Pyridin (Dispensette) und 0,5 mL Benzoylchlorid (Eppendorfpipette) (nicht schutteln) sofort fur 60 min in ein Ultraschallbad (60 "C) stellen (jeweils nach 15 min umschwenken). Nach dem Herausnehmen sofort 0,5 mL Methanol hinzugeben und schiitteln (Uberschiissiges Benzoylchlorid wird zu Methylbenzoat umgesetzt; Vorsicht, heftige Reaktion moglich). 5 min - oder beliebig langer - reagieren lassen. Mit 50 mL Wasser fallen und ca. 30 min - oder beliebig langer - stehen lassen. Die Losung langsam durch eine RP-18-Kartusche saugen, anschlieBend 4 X rnit 5 mL Wasser pyrindinfrei waschen (jeweils den Derivatisierungskolben ausspulen) und trocken saugen (die RP-18-Kartusche wirkt als ,,Fettfilter"). In einen 50 mL MeBkolben mit 3 X 10 mL und einmal 20 mL Isooctan/Diethylether/ Acetonitril(150/80/20; v/v; p. A. Qualitat) bis zur Marke eluieren (jeweils den Derivatisierungskolben ausspulen, da die meisten Benzoate als oliger Film an der Kolbenwandung haften). Den Extrakt direkt oder nach VerdiinnungKonzentrierung fur das gewahlte Analysensystem verwenden. b) Gerate und chromatographische Parameter [HPLC-Anlage zur isokratischen und/oder zur Gradientenelution rnit UVDetektor] Die Originalapplikation wurde auf folgender Anlage erstellt: HPLC-System: Pumpe LCXPD 100 rnit Niederdruckgradientenmischer (Pye Unicam); Integrator: HP 3390 A; Einspritzventil: 7125 rnit 10 pL Probenschleife (Rheodyne); Glassaule (300 X 3 mm i.D.) rnit LiChrosorb Si 60, 5 pm Saule: (Merck); Isooctan/Diethylether/Acetonitril(150/90/30; v/v) Eluent: Fluorate: 1 mL/min Detektor: LC 3 (Pye Unicam); UV230 nm Ergebnisse und Diskussion Abb. 7-26 zeigt das HPLC-Chromatogramm von 30 mg Sojamehl, welches nach der beschriebenen Aufarbeitungsvorschrift direkt benzoyliert und an einer Kieselgelsaule isokratisch analysiert wurde. Es demonstriert die durch die Derivatisierung erzeugte hohe Nachweisempfindlichkeit mittels UV-Detektion (30 mg/50 mL Eluat). Es sind deshalb aus demselben Extrakt, der sich bei Bedarf sehr leicht konzentrieren la& gleichzeitig Bestimmungen von Minorkomponenten moglich. Abb. 7-27 zeigt dies am Beispiel der Erfassung von 20 ppm Sorbit in einem Fruchtsaft. Diese Untersuchungen waren Teil eines Ringversuches, der sich rnit der Bestim-

7.11 Bestimmung von Kohlenhydraten durch Benzoylierung

I=

0

I

10

I

20

min

169

Abb. 7-26: HPLC-Chromatogrammvon benzoyliertem Sojamehl; Kieselgelsaule.

mung von Sorbit fur Gehalte unter 200 ppm durch gebriluchliche enzymatische Methoden befaate. Es zeigte sich, daB durch die Enzymatik in diesen Bereichen keine zuverlassigen Aussagen mehr getroffen werden konnen. Zur Auftrennung des komplexen Extraktes wurde eine chirale Phase mit Gradientenelution eingesetzt (Parameter s. Abb. 7-27) [7-441. Pirkle-Phasen eignen sich hervorragend fiir die Analyse von Benzoaten und ermoglichen Gradientenbetriebsweise mit normalen Equilibrierungszeiten. Kalibrierung Die Aufnahme der Eichkurven erfolgt durch Verdunnungsreihen entsprechender Liisungen von kauflichem Glucosepentaacetat oder selbst derivatisierten Verbindungen. Eine interessante Moglichkeit ist die exakte Berechnung der quantitativen UV-Parameter fur viele Verbindungen mittels nur eines Standards (z. B. Glucosepentaacetat) [7-451. Validierung Die Nachweisgrenzen liegen je nach Verbindung im Bereich von 1-10 ng, bei Wiederfindungsraten von uber 95 % mit geringen Variationskoeffizienten (fiir Raffinose in Sojamehl z. B. bei 3 %). Ausnahmen sind reduzierende Ketosen,

170

I

0

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

10

20

I

30

I

40

50 nin

Abb. 7-mHPLC-Chromatogramm eines benzoylierten Fruchtsaftes mit 20 ppm Sorbit; Chromatographische Parameter: Edelstahlsaule (250 x 4,6 mm i. D.) mit 5 pm (R)-N-3,5-DNBPG (Baker); 20 pL Dosierschleife (Rheodyne); 0,8 mumin; UV235 nm; FlieBmittel (HPLC grade): v/v); B: entspr. (40/12J48; v/v); GradienA: Isooctan/Acetonitril/tert.Butylmethylether (78/u20; tenprogramm: von 100% A in 30 min linear auf 100% B, dort 10 min belassen, in 5 rnin auf 100 % A zuriick und 20 rnin equilibrieren.

wie die Fructose, bei denen nur ca. 80 % Wiederfindung bei Entstehung einiger Nebenprodukte erzielt werden konnen. Bei reduzierenden Zuckern ist immer das Auftreten von Anomeren zu beachten, die je nach gewahltem System getrennt werden konnen (s. auch [7-45 bis 7-47]). Probleme kann es mit der Reproduzierbarkeit der Festphasenkartuschen geben (vgl. Abschn. 4.5). Zur Zeit werden von uns nur die unter Chemikalien angegebenen eingesetzt.

Alternativmethoden Zahlreiche Variationsmoglichkeiten hinsichtlich der Erfassung unterschiedlichster Verbindungen, hinsichtlich von Aufarbeitungsvarianten, FlieBmittelsystemen etc. werden in [7-45 bis 7-47] beschrieben. Eine neuere Arbeit zeigt Moglichkeiten fur eine Benzoylierung ohne Pyridin auf [7-481.

7.12 HPLC-Untersuchungeniiber Chlorogensaurelactonein Rostkaffee

171

7.l2 HPLC-Untersuchungenuber Chlorogensaurelactone in Rostkaffee5 Das folgende Applikationsbeispiel stammt aus der Forschung und weicht daher im Aufbau etwas von den vorangegangenen Beispielen ab. Es sol1 als Beispiel fur eine Methodenentwicklung mit dem Ziel einer Strukturaufklarung/Strukturzuordnung dienen. Problemstellung Chlorogensauren (QGA) sind weit verbreitete phenolische Sauren mit antioxidativer Wirkung [7-49]; in Kaffee kommen sie in sehr groBer Menge vor (7% im Rohkaffee, 2 % in Rostkaffee).

HOOC

51

OH

Abb. 7-28: Formel von 5-Chlorogensaure.

Bei der Analyse von Chlorogensauren in Kaffee (routinemaBig mit RPHPLC) finden sich neben den Peaks der Chlorogensauren noch einige Minorpeaks, die sich mit einem DAD als chlorogensaureiihnliche Verbindungen zuordnen lassen. Es ist bekannt, daS neben den CGA auch Feruloyl- und Cumaroylchinasauren vorhanden sind [7-49 bis 7-52]. Wahrend die Bestimmung der mengenmuig dominanten Chlorogensauren routinemaBig durchgefuhrt wird, ist iiber die Minorkomponenten relativ wenig bekannt . Prinzip der Bestimmung Die Komponenten werden aus Kaffee durch eine Extraktion mit Methanol bei 80 "C im geschlossenen System isoliert. Aufgrund der Selektivitat der Detektion in dieser Matrix reicht die Vorbereitung fiir quantitative Bestimmungen aus. Zur Strukturaufklarung wurden die interessierenden Verbindungen mittels Polyamid aus dem Kaffeeaufgua angereichert und mit praparativer HPLC gereinigt. Die Fraktionen wurden immer mittels HPLC-DAD und

' vgl. Bennat, C., Engelhardt, U. H., Kiehne, A., Wirries, E-M., Maier, H.-G., Z.Lebensm. Unters. Forsch. 1994,199, S. 17-21.

172

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

TSP-LC-MS auf Reinheit uberpruft und zur endgultigen Strukturaufklarung rnit NMR vorbereitet. Chemikalien und Hilfsmittel Methanol, destilliert [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Dichlormethan [Xn; R 40; S 23-24/25-36/37] oder vergleichbares Liisungsmittel - Soxhlet-Ex trak tionsvorrich tung - Extraktionshulsen - Polyamid, eisenfrei - Glassaule (14 cm x 2,5 cm i.D.) - Glaswolle - Seesand, gegluht - Membranfilter (0,45 pm) -

Arbeitsvorschrift Proben: Rohkaffee wurde in einem Laborroster behandelt, so daD eine mittlere Roststufe erhalten wurde. AuSerdem wurden Handelsmischungen untersucht. a) Aufarbeitung Extraktion und Entcoffeinierung: 5 g Kaffee rnit 200 mL 70 % Methanol bei 75-80 "C 90 min im Soxhlet extrahieren, am Rotationsverdampfer unter Vakuum einengen (80 mL) und auf 100 mL auffullen. Fur praparative Zwecke wurde eine Abtrennung mittels Polyamid-Saulenchromatographievorgenommen (vgl. Abschn. 7.1) und die Lactone mit Methanol eluiert (die Chlorogensauren werden rnit essigsaurem Methanol eluiert). 50 mL Kaffee-Extrakt werden auf die konditionierte PA-Saule (22 X 3,O cm i. D.; Fullhohe 16 cm) gegeben, mit 750 mL Wasser gewaschen und die Lactone mit 500 mL Methanol eluiert. AnschlieDend wird auf 50 mL eingeengt (Rotationsverdampfer, 40 "C Badtemperatur). Die Extrakte fur HPLCDAD und HPLC-TSP-MS wurden entcoffeiniert (2 X 25 mL CH2C12). Quantitative Bestimmung: 0,25-0,5 g mit 100 mL 70 % Methanol bei 80 "C 1 h unter Ruckflu8 extrahieren und nach Einengen auf 50 mL auffullen. b) Geriite und chromatograpbische Parameter [Isokratische Anlage rnit Dioden-Array-Detektor] Die Originalapplikation wurde rnit folgenden Geraten durchgefuhrt; die kursiv gedruckten Angaben in Klammern beziehen sich auf die praparative HPLC.

7.12 HPLC-Untersuchungen uber Chlorogensiiurelactonein Rostkaffee

173

Pumpe M 116 (Beckman Inst .), Einspritzventil: Altex 210A (Beckman) mit 50-pL (2000 pL.) Schleife, Saule: 250 mm X 4,6 mm i. D. (250 x 8 mm i. D. ) mit ODSHypersil 5 pm (Shandon); PYE UNICAM PU 4021 Detektor mit Datensystem 2 % Essigsaure (aq.)/Methanol(75/25, v/v) Eluent: 1mumin (3,3 rnllmin); Druck 15 mPa (13,5 MPa) FluBrate: Um die di-CQA von der Saule zu entfernen, sollte Wichtig: nach jedem Lauf mit Methanol gespult und anschlieBend aquilibriert werden. HPLC-MS: Anlage wie beschrieben mit folgenden Modifikationen: 1. Eluenten werden uber einen ERC-3512 Degasser gefiihrt 2. Detektor mit druckfester Zelle (Lichrograph L-4OOO/ 4200, Merck Hitachi) Wie oben, bei der Pufferionisierung wird uber eine Eluenten: zweite Pumpe 0,l M Ammoniurnacetatlosung in 10% Methanol zugemischt, Hulkate 0,5 mumin. TSP-1 Interface ( F i i g a n IWXT, Bremen); EinstellunInterface: gen: Vaporizer 80°C (Discharge) bzw. 97°C (Puffer); Quellenblock 280"C; Repeller 50 V. 850 V entsprechend 50 pA. Discharge mode: Massenspektrometer: SSQ 710 mit Thermospray-Ionenquelle und DEC-Station 5000133 (Digital); ICIS-2-software (Finnigan MAT, Bremen). m/z 150-450 bei 2 s pro Scan. Scanbereich: HPLC:

Ergebnisse und Diskussion Um die in Abb. 7-29 gezeigten Chromatogrammezu erhalten, muaten StandardHPLC-Systeme aus der Literatur [7-53,7-541 angepdt werden. Im Ausschnitt des Chromatogramms(Abb. 7-29) konnten aufgrund der Spektren Peak 4 und 9 als p-CumaMurederivate, Peak 7 und 10 als Ferulasaurederivate identikiert werden. Drei Peaks (5,6 und 8) wurden als Kaffeesaurederivate identifiziert. Diese waren besonders interessant, da sie in Rohkaffee nicht, in Rostkaffee aber fast immer auftraten. Es ist bekannt, d& Chlorogensauren wiihrend des Rostens abgebaut werden; als Zerfallsprodukte wurden u.a. Chinaslure und einige Lactone identifiziert. Weiterhin wurden insgesamt vier Chlorogensaurelactone identifiziert (durch GCMS der TMS-Derivate), allerdings ohne d& weitere Informationen uber deren Struktur gegeben wurden. Auch das Lacton einer Feruloylchinasaure wurde beschrieben [7-551. Ziel der hier vorgestellten Studie war, festzustellen, ob Chlorogensaurelactone im Kaffee vorhanden sind und wenn ja,

174

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Abb. 7-29: HPLC-Trennungvon Chlorogenshren aus Kaffee. A) Rostkaffee, B) Rohkaffee.

diese strukturell aufzuklaren. Dazu wurden TSP-LC-MS-Spektren des interessierenden Bereichs aufgenommen. Abb. 7-30 zeigt das Massenspektrum von Peak 6 und zum Vergleich das der 5-CQA mit Discharge Ionisierung. Der Unterschied der Quasi-Molekulionen betragt 18 Masseneinheiten, was fur die Eliminierung von Wasser typisch ist. Bei den Fragmenten ist das Fehlen von m/z 193 (Quasimolekulion der Chinasaure) und die Anwesenheit von m/e 175 (Quasimolekulion von Chinasaurelacton) in Abb. 7-30 interessant. Die Untersuchungen zeigten, daf3 die Massenspektren von Peak 6 und 8 identisch waren. Beide konnten somit als Caffeoylchinide (Abb. 7-31) zugeordnet werden, was durch Experimente mit Pufferionisierung bestatigt wurde (hierbei traten zusatzlich Ammoniumaddukte der Komponenten bzw. der Bruchstucke auf). Weitere Moglichkeiten bestanden unter den gegebenen apparativen Bedingungen nicht. Um eine endgultige Strukturaufklarung vornehmen zu konnen, wurden die Komponenten isoliert. Dazu wurde der Aufguf3 uber Polyamid gereinigt und anschlieBend mittels praparativer HPLC fraktioniert. Die Reinheit der jeweiligen Fraktionen wurde mit analytischer HPLC-DAD und HPLC-MS uberpruft . Vor der abschlieoenden Gefriertrocknung wurde das Methanol am Rotationsverdampfer entfernt. Wahrend dieser Konzentrierung tritt offenbar eine Isomerisierung ein, d. h. es war nicht moglich, nur eines der beiden Lactone zu erhalten; unter den Versuchsbedingungen wurden Peak 6 und Peak 8 immer im Verhaltnis 60:40 erhalten. Durch FTIRund insbesondere NMR-Spektroskopie gelang eine eindeutige Identifizierung als 3- und 4-y-Chlorogensaurelacton.

7.12 HPLC-Untersuchungen uber Chlorogensaurelactonein Rostkaffee

175

336.9

175.0 163.0 181.0

157*1 137.0

182.1 188.9 207.0 231.0

I.,

.

I

.

I

_I .

272.8

284.9

318.8

I

t i

c 354.8

181.0

320.7

163.0 137.0

213.1 224.9

252.8 272.9

298.9

336.8

i

Abb. 7-30: Thermospray Massenspektren von a) 3-Caffeoylchinid und b) 5-Chlorogensaure (Discharge Ionisierung).

'

OH

Abb. 7-31: Struktur von CCaffeoyl-y-Chinid.

176

7 HPLC-Applikationen aus dem Lebensmittelbereich

Kalibrierung Die Kalibrierung erfolgt uber n-Chlorogensaure als externen Standard bei entprechender rechnerischer Korrektur. Validierung Nachweisgrenze: etwa 50 mg/L (Sfaches Grundrauschen).

Literatur [7-11 Harborne, J. B., Flavonoids - advances in research, London: Chapman & Hall, 1988. [7-21 Harborne, J. B., Methods in Plant Biochemistry. Vol. 1: Plant phenolics, London: Academic Press, 1989. [7-31 Harborne, J. B., Mabry, T. J., Mabry, H., The flavonoids, London: Chapman & Hall, 1975. [7-41 Finger, A., Flavonol- und Ffavonglykosidedes Tees; Dissertation, Technische Universitat Braunschweig, 1991. [7-51 Engelhardt, U. H., Finger, A., Herzig, B., Kuhr, S., Deutsche Lebensrnittef-Rundschau 1992,88, 69-73. [7-61 Engelhardt, U. H., Kiehne, A., Wagner-Redeker, W., GIT 1994,8, 831-836. [7-71 Oshima, Y., Nakabayashi, T., J. Agr. Chem. Jup. 1953,26, 754-756. [7-81 Bokuchava, M. A., Ulyanova, M. S., Fenol’nye Soedin. Ikh Biol. funkts., Muter Vses. Simp. 1966, I , 224-228. [7-91 Pietta, P., Mauri, P., Bruno, A., Zini, L., J. Chromatogr. 1993,638, 357-361. [7-101 Pietta, P., Bruno, A., Mauri, P., Rava, A., J. Chromatogr. 1992,593, 165-170. [7-111 Pietta, P., Mauri, P. L., Rava, A., Sabbatini, G., J. Chromatogr. 1991,549, 367-373. [7-121 Conney, A. H., Wang, Z. Y., Ho, C. T., Yang, C. S., Huang, M. T.,in: Phenolic Compounds in Food and their effects on Health 11, ACS SymposiumSeries 507: Huang, M. T., Ho, C. T., Lee, C. Y. (Hrsg.) Washington D.C.: American Chemical Society, 1992, 284-291. [7-131 Laskin, J. D., Heck, D. E., Laskin, D. L., Mitchell, J. M., Huang, M. T., Wang, Z. Y., Yang, C. S., Ho, C. T., Conney, A. H., in: Phenolic Compounds in Food and their effects on Health 11, ACS Symposium Series 507: Hunag, M.T., Ho, C. T., Lee, C. Y. (Hrsg.) Washington D.C.: American Chemical Society, 1992,308-314. [7-141 Fujiki, H., Okuda,T., Drugs ofthe Future, 1992, 17, 462-464. [7-151 Amtsblatt (EG) Nr. L 224 vom 18. 8. 1990, S. 1. [7-161 Amtsblatt (EG) Nr. L 156 vom 23. 6. 1994. [7-171 Malisch, R., Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1986,182, 385-399. [7-181 Malisch, R . , Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1986,183, 253-266. [7-191 Malisch, R., Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1987,184, 467-477. [7-201 Malisch, R., Bourgeois, B., Lippold, R., Dtsch. Lebensm. Rundschau 1992,88, 295-216. [7-211 Farrington, W. H. H.,Tarbin, J., Bygrave, J., Shearer, G., Food Add. Contaminants 1991, 8 ( I ) , 55-64. [7-221 Luckas, B., J. Chrom. 1992,624, 439-456. [7-231 Lee, J . S., Yanagi, T., Kemna, R., Yasumoto, T., Agric. Biol. Chem. 1987,51, 877-881. [7-241 Hummert, C., Luckas, B., Kirschbaum, J., Proceedings ofthe 6th international conference on toxic marine phytoplankton, 18.-22. Oct. 1993, Nantes.

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8 Zusammenstellung einiger amtlicher Methoden Einige national oder international relevante Methodensammlungen enthalten HPLC-Methoden, die im folgenden charakterisiert sind. Ausgew< wurden die amtliche Methodensammlung nach 0 35 LMBG, das Schweizerische Lebensmittelbuch und die AOAC-Methoden (Bezug auf 15. Auflage). Diese Sammlungen werden laufend erganzt und enveitert. Viele der derzeit aufgefiihrten Methoden stellen nicht unbedingt den ,,state of the art" der HPLCAnalytik dar, weil sie notgedrungen bereits alteren Datums sind. Weiterhin werden von den Normungsinstituten (DIN, BSI, ISO) auch HPLC-Methoden bearbeitet und als Normen veroffentlicht.

8.1 Amtliche Methodensammlung nach 0 35 LMBG Die amtliche Methodensammlung nach 0 35 LMBG enthiilt Methoden, die in Ringversuchen uberpruft und fur geeignet befunden wurden. Einige dieser Methoden sind Ubernahmen von DIN bzw. I S 0 Methoden. Neuerdings werden auch vermehrt HPLC-Bestimmungen in diese Sammlung aufgenommen. In der amtlichen Methodensammlung nach 0 35 LMBG finden sich derzeit folgende HPLC-Bestimmungsmethoden (bei einigen ist das Prinzip der Bestimmung mit angegeben): 1. Acesulfam K in Lebensmitteln (00.00-28), Joghurteneugnissen (02.022), Fruchtsaftgetriinken (32.00-1) und Marzipan (43.16-2) 2. Biogene Amine in Fischen (10.00-5), Fischemeugnissen (11.00-4), Krusten-, Schalen- und Weichtieren (12.00-4) 3. Aspartam in coffeinhaltigen Brausen (32.13-1) und SuBstoff-Tabletten (57.22.99-4); s. auch Applikation 7.9 4. Benzo(a)pyren in geraucherten Fleischerzeugnissen (07.00-40) 5. Konservierungsmittel in fettarmen (00.00-9), fettreichen (00.00-10) Lebensmitteln und Limonadengrundstoff (32.16-1); s. auch Applikation 7.6 Substanzen: Benzoesaure, Sorbinsaure, p-Hydroxybenzoesauremethyl-, -ethyl- und -propylester. Fettarme Lebensmittel: Prinzip: K. werden mit Ammoniumacetat-Essigsiiure Pufferlosung (in Methanol) im Ultraschallbad extrahiert, ggf. mit Carrez-Usung geklart und filtriert.

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6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21.

8 Zusammenstellung einiger amtlicher Methoden

HPLC: Isokratisch an RP-8-Saulen rnit NH4CH3CO0 (0.01 M. aq.)Methanol (50 + 40) eingestellt auf pH 4,5-4,6. Detektion im UV bei 235 nm. Fettreiche Lebensmittel: Prinzip: Extraktion auf einer Extraktionssaule (Kieselgur, z. B. Extrelut) rnit (C2H5)20/CH2C12, einengen. HPLC: Isokratisch auf Kieselgelsaule rnit n-Heptan-DiisopropyletherEssigsaure (88/12/0.1). Detektion im UV bei 230 nm. Benzoesaure und Sorbinsaure in Limonadengrundstoff (32.16-1) Farblose organische Bestandteile in Lebensmittelfarbstoffen (57.09-5) Carazolol im Gewebe von Schweinen (06.15-4) Chlorogensauren in Kaffee (46.00-2) Flunixin im Muskelfleisch von Pferden (06.26/27-1) Konservierungsstoffe in Mayonnaise und -erzeugnissen (20.01-1) Konservierungsstoffe in Bier (36.00-9) Nicarbazin, Nitrofuran in Huhnereiern und Produkten aus Huhnereiern (05.01/02-1) Nitrat in Frischgemuse (25.00-2), Gemuseerzeugnissen (26.00-1) und Gemusebrei fur Sauglinge und Kleinkinder (48.03.05-2) Ochratoxin A in Getreide (15.00-1) und Getreideprodukten Propionsaure in Brot (17.00-14) und feinen Backwaren (18.00-11) Saccharin, Sorbinsaure in FlussigtafelsuBe (57.22.99-5) Sorbinsaure in Brot (17.00-10) Tocopherole und Tocotrienole in Speiseolen (13.03/O4-1) Vitamin A in diatetischen Lebensmitteln (49.00-3) Vitamin D in diatetischen Lebensmitteln (49.00-1)

8.2 AOAC-Methodensammlung Eine weitere gute Quelle fur validierte HPLC-Methoden im Lebensmittelbereich ist die AOAC-Methodensammlung (15. Ed., 1990). Neben Methoden fur Lebensmittel finden sich in dieser Sammlung auch solche zur Bestimmung von Stoffen in Tierfutter und Pharmaka sowie von Pestiziden in Formulierungen. Diese Methoden sind hier nicht aufgefuhrt. 1. Aflatoxine in Baumwollsamenprodukten (980.20 Aflatoxins in Cottonseed Products) Prinzip: Das Produkt wird rnit A c e t o Nasser homogenisiert, Storstoffe durch Schwermetallosungen (Pb(OAc),) entfernt und die Aflatoxine rnit CH2C12extrahiert. Weitere Reinigung durch SC an Silicagel-Minisaulen (Elution rnit CHzClz-Aceton,9 1).

+

8.2 AOAC-Methodensammlung

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HPLC: isokratisch an Normalphasen rnit CHC13(wassergesattigt)-Cyclohexan-CH3CN (25/7,5/1), rnit 1,5 % Ethanol oder Isopropanol versetzt. Detektion: Fluoreszenz: Ex. 360-365 nm; Em. 400-410 nm. Bemerkungen: diverse TLC-Methoden rnit aufgefuhrt. 2. Aflatoxine MI und M2 in fliissiger Milch (986.16 Aflatoxins MI and M2 in Fluid Milk). Prinzip: Die beiden Aflatoxine werden auf einer C-18-Kartusche aus Milch isoliert, rnit Ether auf eine Kieselgelsaule eluiert, von dieser wiederum rnit CH2C12-Alkohol.Nach Derivatisierung rnit Trifluoressigsaure erfolgt die Trennung. HPLC: Isokratisch auf einer RP-18-Phase rnit Wasser-IsopropanolCH3CN (80/12/8). Detektion: Fluoreszenz; Ex. 360-365 nm; Em. 400-410 nm. 3. Enantiomere des Amphetamins in Drogen, Sirupen und Kapseln (988.28 Enantiomers of amphetamine in bulk drugs, syrups and capsules) Methode benutzt chirale Phase (Pirkle) zur nennung von L- und DAmphetamin. 4. Antioxidantien in Fetten und Olen (983.15 Antioxidants in oils and fats). RP-Methode rnit Acetonitril-Wasser-Gradient; Probenvorbereitung durch Extraktion der Hexan-Fett-Mischung rnit Acetonitril. 5. Benzoat, Coffein und Saccharin in Erfrischungsgetranken (970.08 Benzoate, caffeine and saccharin in soda beverages). Isokratische RP-18Methode . 6. Glucose, Fructose, Saccharose und Maltose in vorgesiil3ten Getreideprodukten (982.14 Glucose, fructose, sucrose and maltose in presweetened cereals). Isokratische Trennung auf einer Aminosaule mit RI-Detektion; Reinigung durch Entfetten, extrahieren rnit 50 % Ethanol (aq.) und SPE an RP-18-Kartuschen. 7. Zucker in SiiBholz-Extrakten (984.17 Sugars in licorice extracts); ahnlich 982.14; weniger Probenvorbereitung. 8. Glycerrhicinsaure und -salze in SuBholzprodukten (982.19 Glycyrrhizic acid or Glycyrrhizic acid salts in Licorice products). Isokratisch an RP-18 mit UV-Detektion. 9. Cresidinsulfonsaure, Schaeffer's Salz, 4,4'-(Diazo-amino)bis(5-methoxy2-methyl-benzolsulfonsaure) und 6,6'-0xybis(2-naphthalinsulfonsaure) in FD & C Rot Nr. 40. (981.13 Cresidine sulfonic acid, Schaeffer's salt, 4,4'-(Diazo-amino)bis(5-methoxy-2-methyl-benzene sulfonic acid) and 6,6'-0xybis(2-naphthalinesulfonic acid) in FD & C red no. 40. Ionenaustausch HPLC mit Gradientenelution. 10. Zwischen- und Nebenprodukte in FD & C Gelb Nr. 5. (982.28 Intermediates and reaction by-products in FD & C yellow no. 5). Ionenaustausch HPLC mit Gradientenelution.

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8 Zusarnrnenstellungeiniger amtlicher Methoden

11. 4,4'-(Diamino)benzolsulfonsaure in FD & C Gelb Nr. 6. 12. Ruckstande von N-Methylcarbamat-Insektiziden und Metaboliten (985.23 N-Methylcarbamate insectizide and metabolite residues). Methode fur Kartoffeln und Trauben. Substanzen werden rnit Methanol extrahiert, durch Flussig-flussig-Verteilung und Saulenchromatographie gereinigt ,mittels HPLC getrennt und nach Hydrolyse durch Nachsaulenderivatisierung (OPA, 2-Mercaptoethanol) in fluoreszierende Derivate umgesetzt und entsprechend (Ex. 340 nm, Em. 455 nm) detektiert. 13. Hauptzucker in Maissirup (979.23Saccharides (major) in corn sirup). Die verdunnte Liisung wird auf einer Kationenaustauschersaule getrennt und refraktometrisch detektiert . 14. Minorzucker in Maiszucker (983.22Saccharides (minor) in corn sugar). Prinzipiell wie 13. 15. Trennung von Zuckern aus Honig (977.20Separation of sugars in honey). Trennung auf BondapaWCarbohydrat-Saulernit RI-Detektion. 16. Reinheit von Lactose (984.22Purity of lactose). Isokratische Trennung auf Kohlenhydratsaule rnit RI-Detektion. 17. China-, Apfel- und Citronensaure in Cranberrysaft-Cocktail und Apfelsaft (986.13Quinic, malic, and citric acid in cranberry juice cocktail and apple juice). Die Sauren werden uber Einwegkartuschen (RP-18) gereinigt, auf zwei hintereinandergeschalteten RP-Saulen rnit Phosphatpuffer als Eluent getrennt und im UV bei 214 nm detektiert. 18. Vitamin D in angereicherter Milch und Milchpulver (981.17Vitamin D in fortified milk and milkpowder). Nach Verseifung werden die Proben auf einer HPLC-,,Clean-up"-Saule vorgetrennt, die Vitamin D enthaltende Fraktion gesammelt, eingeengt und auf der analytischen Saule getrennt; Eluent jeweils n-Hexan rnit 0,35% Amylalkohol; Detektion UV 254 nm. 19. Vitamin D in Multivitaminzubereitungen (980.26Vitamin D in multivitamin preparations). Im Prinzip wie 18. 20. a-Zearalenol und Zearalenon in Mais. (985.18a-Zearalenol and Zearalenone in corn). Nach Extraktion rnit CHC13 und Reinigung durch flussigl flussig-Verteilung werden die Toxine mittels RP-Chromatographie unter isokratischen Bedingungen getrennt und fluorimetrisch (Ex: 236 nm; Em. 418 nm) detektiert.

8.3 Schweizerisches Lebensrnittelbuch

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8.3 Schweizerisches Lebensmittelbuch Im Schweizerischen Lebensmittelbuch finden sich folgende HPLC-Methoden: 1. Nitrat in Milch (U1.8.2) 2. Bestimmung von Chloramphenicol (1.7.1.1.5) und Sulfonamidriickstanden (1.7.1.2.3) in Milch; hier nur je ein Verweis auf eine Literaturstelle. 3. Coffein und Theobromin in Speiseeis (9/5.2) 4. Bestimmung von Zuckerarten in diatetischen Lebensmitteln (2Y6.2) 5. Bestimmung des Coffeins, Theobromins und Theophyllins in diatetischen Lebensmitteln (22/10.1) 6. Bestimmung des Nitrats und Nitrits in diatetischen Lebensmitteln (22l12.2) 7. Bestimmung von Chlorid, Nitrat und Sulfat (27N4.10) 8. Anthocyanmuster in Frucht- und Gemusesaften mittels HPLC (Provisorische Methode 28A) 9. Zuckerarten und Zuckeralkohole in Frucht- und Gemiisesaften (28N5.3) 10. Sorbit und Mannit in Frucht- und Gemiisesaften (28N6.2) 11. Organische Siuren in Frucht- und Gemusesaften (28M.4) 12. Ascorbinsaure in Frucht- und Gemusesaften (28AD.10.2) 13. Nitrat in Frucht- und Gemusesaften (28N9.1) 14. Freie Aminosauren in Frucht- und Gernusesiiften (28N9.3) 15. Ascorbinsaure in Bier (3U14.1) 16. Zuckerarten in Kakao und -produkten (36AD.1) 17. Bestimmung des Capsaicins in Cayennepfeffer (37AProvis. Methode) 18. Bestimmung des Vanillins in Vanille (37ANanille) 19. Bestimmung von Saccharin und Cyclamat (4U1.1.3 und 2.2) 20. Bestimmung von Acesulfam K (4U1.1.9) 21. Bestimmung von o- und p-Toluolsulfonamid in Saccharin (4U1.3.2) 22. Bestimmung von Aspartam (41/2.6) 23. Farbstoffe fur Lebensmittel (42N2.12) 24. Bestimmung von Konservierungsstoffen (44/4.2) 25. Bestimmung von Pimarizin, Benzoe- und Sorbinsaure in Kaserinde und Kase (44/8) 26. Bestimmung von Natriumazid in Wein (44/11) 27. Bestimmung von 5-Nitro-2-furylacrylsaure in Wein (44D2.1) 28. Bestimmung von Patulin (1154/1.1.3) 29. Bestimmung von biogenen Aminen (3 Varianten 54/2.3) 30. Ruckstandsbestimmung der Sulfonamide in tierischen Produkten (55/ Provisorische Methode) 31. Bestimmung von 12 Sulfonamiden in Fleisch und Nieren (55Provisorische Methode)

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8 Zusammenstellung einiger amtlicher Methoden

32. Nachweis von Benzimidazol in Leber, Niere und Muskel (55Provisorische Methode) 33. Bestimmung 17 verschiedener Sulfonamide in Eiern (55/Provisorische Methode) 34. Bestimmung der Kokzidiostatika Clopidol, Ethopabat, Zoalen und Nicarbazin in Eiern (55Provisorische Methode)

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich 9.1 Bestimmung von Nitrophenolen in Regenwasser Problemstellung Nitrophenole gehoren zu den toxikologisch bedenklichen Verbindungen. Vor allem Dinitrophenole zeigen eine hohe biologische Aktivitat und Phytotoxizitat (Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung in der Atmungskette, Storung des Zellmetabolismus). Die herbizide Wirkung von 2,4-Dinitro-6methylphenol (DNOC) und 2,4-Dinitro-6-sec.-butylphenol(Dinoseb) wird durch deren Anwendung in der Landwirtschaft kommerziell genutzt. Das Vorkommen von Nitrophenolen in Regenwasser wird daher als moglicher Strel3faktor fur Pflanzen im Zusammenhang mit dem anhaltenden Waldsterben diskutiert. Daneben zahlen einige Nitrophenole zu den von der USEPA als ,,priority pollutants" eingestuften Substanzen. Mit der hier vorgestellten Methode lassen sich 14 Nitrophenole chromatographisch erfassen. Formeln der Nitrophenole In Abb. 9-1 sind die Strukturfomeln der Nitrophenole dargestellt. Soweit nicht anders vermerkt ist, gilt: R = H. Mononitrophenole 2-Nitrophenol 3-Nitrophenol 4-Nitrophenol

Rl: NO2 R2: NO2 R3: NO2

Dinitrophenole 2,3-Dinitrophenol 2,4-Dinitrophenol 2 3 -Dinitrophenol 2,ii-Dinitrophenol 3,4-Dinitrophenol

Rl, R2: NO2 Rl, R3: NO2 Rl, R4: NO2 Rl, R.5: NO2 R2, R3: NO2

Methylnitrophenole 2-Methyl-3-nitrophenol 3-Methyl-2-nitrophenol 3-Methyl-4-nitrophenol 4-Methyl-3-nitrophenol 4-Methyl-2-nitrophenol 5-Methyl-2-nitrophenol

R2: NO2 Rl: NO2 R3: NO2 R2: NO, Rl: NO2 Rl: NO2

Rl: CH3 R2: CH3 R2: CH3 R3: CH3 R3: CH3 R4: CH3

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9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

Prinzip der Bestimmung Die Nitrophenole werden mittels flussig/fliissig-Extraktion aus den Wasserproben isoliert. Zur Abtrennung von den neutralen und basischen Verbindungen werden die Phenole danach mit Kaliumhydroxidlosung als Phenolate in die waBrige Phase iiberfiihrt und nach Ansauern durch eine erneute flussig/ flussig-Verteilung mit Dichlormethan extrahiert . Die Quantifizierung erfolgt mittels HPLC-DAD nach der Methode der externen Standardisierung [9-1,921. Chemikalien und Hilfsmittel Dichlormethan, z. A. [Xn; R 40, S 23.2-24/25-36/37] - Kaliumhydrogenphosphat, z. A. - Kaliumhydroxid, z. A. [C; R 35, S 2-26-37/39] - Methanol, HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Natriumsulfat, wasserfrei, z. A., gegliiht - ortho-Phosphorsaure, 85 % [C; R 34, S 261 - Salzsaure, rauchend (37 %) [C; R 34-37, S 2-26] - Wasser, HPLC grade oder gleichwertig - Membranfilter (0,2 pm) - silanisierte Glaswolle -

Arbeitsvorschrift a) Probenahme Die Probenahme kann mittels eines Passivsammlers (abgedeckter, quadratischer Edelstahltrichter) , der zu Beginn eines Niederschlagsereignisses manuell geoffnet wird, erfolgen. Die Proben werden in 1 L-Braunglasflaschen rnit Schliff bis zur Analyse gekuhlt bei 4 "C aufbewahrt. Eine weitere Stabilisierung ist nicht erforderlich. b) Probenvorbereitung und -aufarbeitung 0,5 L bis 1 L Probe werden in einem entsprechenden Scheidetrichter dreimal mit jeweils 50 mL Dichlormethan fur 90 Sekunden ausgeschiittelt. Die organischen Extrakte werden in einem 250 mL Scheidetrichter gesammelt und rnit

9.1 Bestimmung von Nitrophenolen in Regenwasser

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10 mL 1 N Kaliumhydroxidlosung fiir zwei Minuten geschuttelt, um die aciden Nitrophenole in die waBrige Phase zu uberfiihren. Die organische Phase kann nach erfolgter Phasentrennung zur Bestimmung polycyclischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAH) oder von Alkanen weiter aufgearbeitet und nachfolgend gaschromatographisch analysiert werden. Die in einem 100 mL Scheidetrichter aufgefangene wiiBrige Phase wird rnit 40 mL Wasser verdunnt, rnit 6 N Salzsaure (ca. 1,4mL) auf pH <2 angesauert und anschlieaend dreimal mit je 20 mL Dichlormethan extrahiert (Dauer: 90 Sekunden) . Die vereinigten organischen Extrakte werden uber Natriumsulfat getrocknet, durch mit Dichlormethan gewaschene silanisierte Glaswolle filtriert und am Rotationsverdampfer (40 "C, 800 hPa) eingeengt. Ein Eindampfen zur Trockne ist dabei unbedingt zu vermeiden. Nach erfolgtem Liisungsmitteltausch von Dichlormethan zu Methanol werden die Extrakte auf ein definiertes Volumen (0,25 mL bis 1 mL) aufgefiillt und ein Aliquot injiziert . c) Gerate und chromatographische Parameter HPLC-System : Niederdruckgradientenanlage rnit DAD, z. B. Flussigkeitschromatograph Varian 5000 (Varian Ass., Palo Alto, USA) rnit DAD Waters 990 (Waters, Milford, USA), Einspritzventil Rheodyne 7125 (Rheodyne, Berkeley, USA) rnit 20 pL Probenschleife Edelstahlsaule (250 mm x 4 mm i. D.) rnit LiChrosorb Saule: RP 18 (z. B. Merck Hibar, Fa. Merck, Darmstadt), PartikelgroSe: 5 pm MethanoVPhosphatpuffer, 40/60; isokratisch FlieSmittel: Herstellung des Phosphatpuffers: 0,05 M Kaliumdihydrogenphosphatlosung (6,81 g/L) rnit o-Phosphorsaure auf pH 3,25 einstellen Aufgrund der hohen Volumenkontraktion beim Mischen von Methanol und Puffer ist eine griindliche Entgasung des Eluenten - vorab oder on line - unabdingbar. 35 min Laufieit : FluSrate: 1,0 mumin, nach 20 Minuten innerhalb von 1,5 Minuten auf 1,2 mumin erhohen Detektor: Wellenlangenbereich: 200-450 nm Injektionsvolumen: 20 pL Ergebnisse und Diskussion Abb. 9-2 zeigt die HPLC-Chromatogramme einer realen Regenwasserprobe bei verschiedenen Wellenlangen nach einer oben beschriebenen Aufarbeitung .

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9 HPLC-Applikationen aus dern Umweltbereich

220 nm N

J

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317 nm

5 :

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2K :. .% : c

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359 nm

-

Der Einsatz des DAD ermoglicht eine optimierte quantitative Auswertung bei der fiir die entsprechende Verbindung gunstigsten Wellenlange. Die Auswahl der Wellenlange richtet sich dabei einmal nach dem Absorptionsmaximum der Verbindung, beriicksichtigt aber auch mogliche spektrale Storungen durch Eigenabsorption des LZisungsmittels oder Begleitsubstanzen, die im Verlauf der Probenaufarbeitung nicht entfernt wurden. Am geeignetsten erscheinen fur die Auswertung die folgenden Wellenlangen: 220 nm, 272 nm, 317 nm. Fur 2,6- und 2,4-Dinitrophenol sind spezifische Messungen auch bei 435 nm moglich.

9.1 Bestimmung von Nitrophenolen in Regenwasser

189

Ein weiterer Vorteil des DAD besteht darin, durch das aufgenommene UVSpektrum die Identitat der Substanz uber einen reinen Retentionszeitenvergleich hinaus auch uber einen Spektrenvergleich mit dem entsprechenden Standard absichern zu konnen. Hierbei ist jedoch zu beachten, daB die UVSpektren der aciden Nitrophenole vom pH-Wert des Liisungsmittels (hier des FlieBmittels) beeinflufit werden. So kann es je nach eingestelltem pH-Wert zu Verschiebungen der Absorptionsmaxima kommen. Ein Vergleich ist daher nur mit Spektren , die unter den festgelegten Analysenbedingungen erhalten worden sind, durchzufuhren.

Kalibrierung Die Quantifizierung erfolgt uber eine externe Standardisierung (Kalibriergerade). Dazu wird eine Verdunnungsreihe mit mindestens drei Konzentrationen ab 0,2 ng/pL mit Hilfe eines Mischstandards der Nitrophenole eingesetzt. Die Kalibriergerade wird uber die vom Integrator berechneten Peakflachen oder Peakhohen bei der fur die jeweilige Substanz gunstigsten Wellenlange ermittelt. Fur die Nitrophenole ergab sich ein h e a r e r Bereich bei Konzentrationen von 0,2 ng/pL bis 100 ng/pL. Als Detektornachweisgrenzen wurden bei einem SignaYRausch-Verhaltnisvon mindestens drei ( S / N = 3) 0,8 ng (4Nitrophenol bei 317 nm) bis 1,O ng (3-Methyl-2-nitrophenol bei 220 nm) an absoluten Substanzmengen erreicht. Validierung Die Wiederfindungsraten einer im Bereich von 10 pg/L dotierten Wasserprobe liegen zwischen 33 % (CNitrophenol) und 85 % (4-Methyl-3-nitrophenol) und erreichen fur Konzentrationen von 0,5 pg/L dieselbe GroBenordnung. Alternativmethoden

Neben der Bestimmung der Nitrophenole mittels HPLC lassen sich die Substanzen auch gaschromatographisch erfassen [9-31. Aufgrund der hohen Polaritat mu6 hierbei jedoch eine Derivatisierung vorangehen. Als Derivatisierungsreagenz bietet sich Pentafluorbenzoylchlorid an (Abb. 9-3; [9-41). Neben einer einfachen Handhabung (extraktive Derivatisierung in waBriger Losung) wird die Empfindlichkeit der Analyse mittels GC-ECD durch das

Abb. P3: Derivatisierung von Phenolen mit Pentafluorbenzoylchloridam Beispiel von 4-Nitrophenol.

190

9 HPLC-Applikationen aus dem Urnweltbereich

Einbringen von funf Fluoratomen in das Molekul signifikant erhoht. Allerdings liegen die Ausbeuten bei Nitrophenolen aufgrund ihrer hohen Polaritat unter denen anderer Phenole [9-51.

9.2 Bestimmung von Sprengstoff-Ruckstanden in Obedlachengewassern und Grundwasser Problemstellung Aufgrund des hohen Sprengstoffbedarfes wahrend des zweiten Weltkriegs wurden an vielen Stellen in Deutschland Produktionsstatten vor allem fur Trinitrotoluol (TNT) und Hexogen (RDX) errichtet. Wahrend der Herstellung und auch durch eine nicht fachgerechte Lagerung der Sprengstoffe kam es zu einer Kontamination des Bodens und Grundwassers sowie der umliegenden Oberflachengewasser. Neben Trinitrotoluol zahlen Mono- und Dinitrotoluole als Ausgangs- bzw. Nebenprodukte sowie Nitrotoluidine zu den problematischen Substanzen, die aufgrund ihrer Toxizitat Bedeutung besitzen. Dinitrotoluidine entstehen dabei wahrend des biologischen Abbaus von TNT. Zur Erkundung und Bewertung der zahlreichen Rustungsaltlasten kann unter anderem auf einen Nachweis dieser Substanzen mittels HPLC und Diodenarray-Detektion zuruckgegriffen werden. Die Sprengstoffe Hexogen und Tetryl lassen sich zudem im Gegensatz zu den Nitroaromaten gaschromatographisch nicht ohne Probleme bestimmen [9-61. Formeln der Nitroaromaten In Abb. 9-4 sind die Strukturformeln der Nitrotoluole dargestellt. Soweit es nicht anders vermerkt ist, gilt: R = H. Mononitro toluole 2-Nitrotoluol 3-Nitrotoluol 4-Nitrotoluol

R2: NO, R3: NO, R4: NO,

Dinitrotoluole 2,4-Dinitrotoluol 2,6-Dinitrotoluol 3,4-Dinitrotoluol

R2, R4: NO2 R2, R6: NO2 R3, R4: NO2

Trinitrotoluol 2,4,6-Trinitrotoluol R2, R4, R6: NO2 Die Abb. 9-5 und 9-6 zeigten die Strukturformeln von Tetryl und Hexogen (RDX) .

9.2 Bestimmung von Sprengstoff-Rilckstiden in Oberflachengewassern

191

Abb. 9 4 Strukturformel der Nitrotoluole (R: s. Text).

NO2

W02/NvN\N02

Abb. 9-5 Strukturformel von Tetryl (2,4,6-Tnnitrophenylmethylnitramin).

Abb. 9-6 Strukturformel von Hexogen (RDX) (1,3,5-Trinitro-1,3,5-triazocyclohexan).

Prinzip der Bestimmung Die zu bestimmenden Substanzen werden aus einer alkalisch gestellten Wasserprobe mit Dichlormethan extrahiert . Durch die im alkalischen Bereich durchgefuhrte Extraktion erfolgt gleichzeitig eine Abtrennung von sauren Bestandteilen (Nitrophenole), die die Detektion der Nitroaromaten storen wiirden. Nach Losungsmitteltauschkann der Extrakt direkt zur HPLC eingesetzt werden. Die Identifizierung und Quantifizierung nach der Methode der externen Standardisierung erfolgt mittels DAD [9-71.

Chemikalien und Hilfsmittel - Dichlormethan, z. A. [Xn; R 40, S 23.2-24/25-36/37] - Natriumhydroxid, z. A. [C; R 30; S 2-26-37/39] - Methanol, HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Natriumsulfat, wasserfrei, z. A., gegluht - Wasser, HPLC grade oder gleichwertig - Membranfilter (0,2 pm) - silanisierte Glaswolle - pH-Meter - Schiittelmaschine

192

9 HPLC-Applikationen am dem Umweltbereich

Arbeitsvorschrift a) Probenahme Die Probenahme erfolgt in 1 L-Braunglasflaschen rnit Schliffstopfen, die randvoll zu fiillen sind. Wird rnit der Aufarbeitung nicht unmittelbar nach der Probenahme begonnen, so miissen die Wasserproben gekuhlt (4 "C)und lichtgeschiitzt aufbewahrt werden. b) Probenvorbereitung und -aufarbeitung Bei hohen zu erwartenden Gehalten (< 100 pgL) und fur orientierende Routineanalysen laDt sich die Wasserprobe gegebenenfalls direkt ohne vorherige Anreicherung einsetzen. Hierbei ist lediglich eine Filtration der Probe erforderlich. Dazu mussen allerdings Teflonfilter verwendet werden, um Verluste durch Adsorption, wie sie beispielsweise bei Celluloseacetatmaterialien auftreten, zu minimieren. Eine Uberlagerung friihzeitig eluierender Substanzen durch nicht abgetrennte, coeluierende Phenole kann bei diesem Vorgehen zu Schwierigkeiten fiihren. In der Regel ist folgende Vorgehensweise angezeigt: 0,5 L Wasser werden in einem 1-L-Erlenmeyerkolben rnit 0,l molarer Natriumhydroxidlosung auf pH 9 eingestellt (pH-Meter), rnit 20 mL Dichlormethan versetzt und fur 30 Minuten im verschlossenen Kolben auf der Schuttelmaschine geschiittelt. Die Extraktion wird noch einmal rnit jeweils 20 mL Dichlormethan wiederholt. Die vereinigten organischen Extrakte werden iiber Natriumsulfat getrocknet, unter Nachwaschen durch silanisierte Glaswolle in einen 100-mLSpitzkolben filtriert und am Rotationsverdampfer (30 "C, 700 hPa) bis fast zur Trockne eingeengt. Losungsmittelreste werden durch Abblasen mit Stickstoff entfernt. Fur die nachfolgende HPLC wird der Ruckstand in 1 mL FlieDmittel aufgenommen. c) Gerate und chromatographische Parameter HPLC-System: Niederdruckgradientenanlage rnit DAD, z. B. Fliissigkeitschromatograph Varian 5000 (Varian Ass., Palo Alto, USA) rnit DAD Waters 990 (Waters, Milford, USA); Einspritzventil Rheodyne 7125 (Rheodyne, Berkeley, USA) mit 20-pL-Probenschleife Edelstahlsaule (200 mm x 4 mm i. D.) rnit Hypersil RP Saule: 18 (PartikelgroBe 5 pm, Fa. Shandon Scientific Ltd., GB) FlieDmittel: MethanoVWasser, 45/55; v/v Laufzeit : 25 min FluBrate: 0.8 mumin

193

9.2 Bestimmung von Sprengstoff-Ruckstandenin Oberfllchengewassern

DAD, Wellenllngenbereich: 200-450 nm; Detektionswellenllnge: 254 nm Injektionsvolumen: 20 pL Detektor:

Ergebnisse und Diskussion Abb. 9-7 zeigt das HPLC-Chromatogramm einer mit 20 pg/L (je Substanz) dotierten Oberflachenwasserprobe bei der Wellenlange 254 nm. Die Aufarbeitung erfolgte nach fliissig/flussig-Extraktion[9-71. Die Substanzen werden anhand der Retentionszeit und ihres UV-Spektrums identifiziert . Kalibrierung Die Quantifizierung erfolgt uber eine externe Standardisierung (Kalibriergerade). Dazu wird eine Verdunnungsreihe mit mindestens vier Konzentrationen im Bereich von 0,5 ng/pL bis 25 ng/pL mit Hilfe eines Mischstandards der Nitroaromaten eingesetzt. Die Kalibriergerade wird uber die vom Integrator

1

I

i , ,

k

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4

c

lo

2k

Zeit [min]

Abb. P7: HPLC-Chromatogramm einer dotierten Oberflachenwasserprobe (Vorfluter, 20 &L) bei 254 nm. 1: 2,4,6-TriNtrotoluol, 2: 3,4-Dinitrotoluol, 3: 2,6-Dinitrotoluol, 4: 2,4-Dinitrotoluol, 5: 2-Nitrotoluol, 6: 4-Nitrotoluol, 7: 3-Nitrotoluol.

194

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

berechneten Peakflachen oder Peakhohen bei der Wellenlange h = 254 nm ermittelt. Fur die Quantifizierung kann bei matrixbezogenen, spektralen Storungen auch auf andere, fur die einzelnen Substanzen charakteristischen Wellenlangen ausgewichen werden.

Validierung Der DAD besitzt fur den Konzentrationsbereich von 0,5 ng/pL bis 1 pg/pL eine gute Linearitat mit Variationskoeffizienten unter 5 % . Die Detektornachweisgrenze liegt im Bereich von 1 ng (absolute Menge) in Abhangigkeit von der Substanz und der fur die Substanz spezifischen Wellenlange. Fur die Aufarbeitungsmethode ergeben sich substanzabhangige Wiederfindungsraten, die in der Regel mehr als 85 % betragen. Da die Matrix Oberflachenwasser unterschiedlich stark mit Begleitstoffen (z. B. Huminstoffen) belastet sein kann, sollten die Wiederfindungsraten exemplarisch bei jeder Analysenserie uberpruft werden.

Alternativmethoden Mit gutem Erfolg wird zur Extraktion der Substanzen auch die Festphasenextraktion eingesetzt. Verwendet werden hierbei sowohl Amberlite XAD-Harze (als Mischung gleicher Teile von XAD 2, 4 und 8) als auch reversed phase (RP-B)-Sorbentien. Als weiteres Extraktionsmittel kann Toluol benutzt werden [9-8, 9-9, 9-10]. Die Bestimmung der Nitrotoluole kann ebenso gaschromatographisch erfolgen, wobei zur Detektion aufgrund der hoheren Sicherheit ein massenselektiver Detektor (MSD) dem ECD oder PND vorgezogen werden sollte. Durch Adsorptionseffekte im Injektor (bei nicht silanisierten Glaslinern) ergibt sich hierbei fur Trinitrotoluol eine schlechte Reproduzierbarkeit . Hexogen und Tetryl lassen sich gaschromatographisch nur unter Schwierigkeiten bestimmen.

9.3 Bestimmung von Triazin-Herbiziden in Grund- und Trinkwasser Problemstellung Unter den in der Landwirtschaft verwendeten Pflanzenbehandlungsmitteln nehmen die zur Unkrautbekampfung eingesetzten Herbizide mengenmanig den groflten Anteil ein. Als wichtige Wirkstoffgruppe wiederum besitzen die Triazin-Herbizide groBe Bedeutung. Aufgrund ihres hohen Grundwassergefahrdungspotentials sind mit Atrazin und Simazin mittlenveile zwei klassische, vorwiegend im Mais- und Hopfenanbau eingesetzte Vertreter nicht

195

9.3 Bestimmung von Triazin-Herbizidenin Grund- und Trinkwasser

mehr zugelassen. Sie konnten bereits in weiten Konzentrationsbereichen in verschiedenen Grundwasserproben nachgewiesen werden. Neben den applizierten Pestiziden selbst sind fur die Boden- und Grundwasserkontamination auch deren Hauptmetabolite von erheblichem Interesse. Mit dem ersten Metabolisierungsschritt durch die Bodenmikroorganismen werden die Ethyl- bzw. Isopropyl-Gruppen am sekundaren bzw. tertiaren Stickstoff eliminiert. Dies hat zwar einen EinfluB auf das chromatographische Verhalten der Triazine, jedoch nur in untergeordnetem MaBe auf deren Detoxifikation. Es ist daher ein Bestreben der Ruckstandsanalytik, die applizierten Ausgangsverbindungen gemeinsam mit den Hauptmetaboliten in einem chromatographischen Lauf zu bestimmen.

Formeln der aiazin-Herbide

Abb. PS: Allgemeine Strukturformel der s-Triazine. Tkiazin-Derivat

R1

R2

R3

Atrazin (2-Chlor-4-ethylamino-6-isopropylamino-s-triazin)

c1

ethyl

isopropyl

Simazin (2-Chlor-4,6-bis-ethylamino-s-triazin)

c1 c1

ethyl

ethyl

ethyl

H

Desisopropylatrazin (2-Chlor-Cethylamino-6-amino-s-triazin)

Prinzip der Bestimmung Die in dieser Applikation behandelten Triazin-Derivate Atrazin, sein Abbauprodukt Desisopropylatrazin und Simazin (Triazin-Grundgeriist: s. Abb. 9-8) werden mittels Festphasenextraktion an CI8-Umkehrphasenmaterialaus der Wasserprobe extrahiert und nach Elution mit Methanol durch HPLC mit UVDetektion bestimmt [9-111. Chemikalien und Hismittel

- Ammoniaklosung 25 % ,z. A. [Xi; R 36/37/38; S 2-26] -

Methanol, HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 Wasser, HPLC grade oder gleichwertig SPE-System (z. B. Baker SPE-10, Fa. Baker, Holland) 6 mL Bakerbond SPE Trennslule Octadecyl, 1,0 g Sorbens Membranfilter (0,45 pm)

196

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

Arbeitsvorschrift a) Probenahme Die Probenahme erfolgt unter Beachtung der in der DIN 38402 Teil 12 bis 15 festgelegten Regelungen. Eingesetzt werden Braunglasflaschen rnit Schliffstopfen, die vollstandig mit dem zu analysierenden Wasser zu fullen sind. Um Adsorptions- bzw. Abbaueffekte zu vermeiden, sollte rnit der Probenaufbereitung unverziiglich begonnen werden. Eine Lagerung darf nur bei 4 "C unter LichtausschluB erfolgen. b) Probenvorbereitung und -aufarbeitung Die Extraktion der Analyte aus der Wasserprobe erfolgt rnit einer C18-Kartusche. Vor dem Einsatz der Extraktionssaule ist eine Konditionierung erforderlich. Dazu werden 5 mL Methanol auf die Saule gegeben und nach einer kurZen Einwirkzeit langsam abgesaugt. Dieses Vorgehen wird noch zweimal rnit Wasser wiederholt, ohne daB die Saule zwischenzeitlich wieder trockenlaufen darf. AnschlieBend werden je nach zu erwartender Konzentration 250 mL bis zu 1000 mL Probenlosung durch die Saule gesaugt. Die Sauggeschwindigkeit sollte dabei ca. 5 mWmin betragen. ZweckmaBigerweise wird die Probe uber einen Teflonschlauch, der mittels Adapter an der Extraktionssaule befestigt ist, direkt aus dem ProbenahmegefaB entnommen. Nach AbschluD der Extraktion wird zum Trocknen fur 30 min Luft durch die Saule gesaugt, wobei zum Schutz vor Kontaminationen durch den Gasstrom eine zweite, zu diesem Zweck mehrfach verwendbare Extraktionssaule aufgesetzt wird. Die abschlieBende Elution erfolgt rnit 4 x 1 mL Methanol, das jeweils nach einer Einwirkzeit von ca. 10 min in einem 10 mL Spitzkolben aufgefangen wird. Das Eluat wird am Rotationsverdampfer auf ein Volumen von ca. 0,5 mL und anschlieBend im sanften Stickstoffstrom (bis 2 mumin) zur Trockne eingeengt. Aus chromatographischen Grunden wird der Ruckstand in 1 mL Methanowasser-Gemisch (1 :1) aufgenommen. Dadurch wird gewahrleistet, daB die injizierte Probenlosung keine hohere Elutionskraft als das verwendete FlieBmittel besitzt. Die so erhaltene Probenlosung kann nun zur HPLC-UVBestimmung eingesetzt werden. c) Geriite und chromatographische Parameter HPLC-System: Niederdruckgradientenanlage,z. B. Fliissigkeitschromatograph Hewlett Packard 1050 rnit UV-Detektor Hewlett Packard 1050 (Hewlett Packard, Avondale, USA), Einspritzventil Rheodyne 7125 (Rheodyne, Berkeley, USA) mit 25 pL-Probenschleife

9.3 Bestimmung von Triazin-Herbiziden in Grund- und Trinkwasser

197

Edelstahlsaule (250 mm x 4 mm i. D.) rnit ODS Hypersil (z. B. Fa. Shandon Ltd., Astmoor, GB), PartikelgroSe: 5 pm A: MethanoUWasser, 1/1, v/v FlieSmittel: B: Methanol Beide FlieBmittel werden rnit konz. Ammoniak auf einen pH-Wert von 8 eingestellt. Eine Vormischung von Methanol und Wasser ist aufgrund der hohen Liisungsmittelkontraktion beim Mischen beider Komponenten und der damit verbundenen Gefahr der Luftblasenbildung und Erwarmung unbedingt angeraten. Das in Abb. 9-9 dargestellte Chromatogramm wurde rnit isokratischer Elution (100 % A) erhalten. Alternativ dazu kann der folgende Gradient gefahren werden: 0 min: 100 % A Gradient: 2 min: 100% A 10 min: 60 % A 20 min; Aquilibrierung : 10 min bei Anfangsbedingungen Laufzeit: 1,0 mUmin FluSrate: Wellenlangeneinstellung: 233 nm Detektor: Injektionsvolumen: 25 pL uber eine entsprechende Rheodyne-Probenschleife Saule:

Ergebnisse und Diskussion Abb. 9-9 zeigt das HPLC-UV-Chromatogramm einer mit je 0,8 pg/L Triazinderivaten dotierten Trinkwasserprobe, die entsprechend der Applikation aufgearbeitet wurde. Kalibrierung Die Quantifizierung erfolgt uber eine externe Standardisierung (Kalibriergerade) . Dazu wird eine Verdunnungsreihe mit mindestens drei Konzentrationen ab 0,l ng/pL rnit Hilfe einer Mischlosung der drei kommemiell erhaltlichen Herbizide eingesetzt. Die Kalibriergerade wird uber die vom Integrator berechneten Peakflachen oder Peakhohen bei 233 nm ermittelt. Validierung Die Wiederfindungsraten einer im Bereich von 0,2 pg/L je Wirkstoff dotierten Trinkwasserprobe liegen zwischen 59% und 70%. Fur Dotierungen im Bereich von 20 pg/L werden Wiederfindungsraten uber 90 % erreicht.

Alternativmethoden Eine alternative Bestimmungsmethode fur 'Ziiazin-Herbizide stellt die Kapillargaschromatographie rnit PN-Detektor dar. Eine vergleichende Untersu-

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

2

I\

3

Zeit [min] Abb. 9-9: HPLC-Chromatograrnrn einer dotierten Trinkwasserprobe (je Substanz 0,8 kg/L). 1: Desisopropylatrazin, 2: Simazin, 3: Atrazin.

chung zur Bestimmung dieser Substanzen in Boden kommt fur eine Methode mittels Microbore HPLC-UV zwar zu einer geringfugig schlechteren Nachweisgrenze (10 ppb gegenuber 5 ppb). Dagegen gelingt aber die chromatographische Trennung von elf verschiedenen Triazin-Derivaten mit der HPLC innerhalb von zwolf Minuten. Bei der Gaschromatographie treten demgegenuber Schwierigkeiten bei der Trennung bestimmter Substanzpaare auf [9-121.

9.4 Bestimmung von Pflanzenschutzmitteln (PSM) in Trinkwasser mittels HPLC-MS Problemstellung Aufgrund der strukturellen Vielfalt der eingesetzten Pflanzenschutzmittel (PSM) und des niedrigen Grenzwertes von 100 ng/L fur den einzelnen Wirkstoff, der sowohl in der deutschen Trinkwasserverordnung (TVO)als auch in der EU-Trinkwasserrichtlinie festgelegt ist, werden an die Analysenmethoden hohe Anforderungen gestellt. Weder die GC noch die HPLC mit klassischen Detektoren bieten die Moglichkeit, unterschiedlichste Substanzklassen hin-

9.4 Bestimmung von Wanzenschutzmitteln (PSM) in Trinkwasser mittels HPLC-MS

199

reichend empfindlich und zuverlassig zu erfassen. Uncharakteristische UVSpektren oder spektrale Storungen erschweren die sichere Identifizierung der Wirkstoffe per HPLC-UVDAD. Die thermische Instabilitat vieler SubstanZen bzw. mangelnde Fliichtigkeit polarer Pestizide zeigen die Grenzen der GC auf. Hilfestellung bietet hier die Kopplung von HPLC und Massenspektrometrie (MS). Im folgenden wird eine Methode zur Bestimmung verschiedenster PSM in waBrigen Matrices per HPLC-MS vorgestellt. Als Kopplungstechnik ist fur diese Fragestellungvor allem hinsichtlich der geforderten Empfindlichkeit die Thermospray-Kopplung am besten geeignet [9-171. Thermospray-Interfaces werden mittlerweile auch im Routinebetrieb erfolgreich eingesetzt. Untersuchte Substanzen Die hier beschriebene Methode wurde bisher zum Nachweis von ca. 100 verschiedenen Einzelwirkstoffen und Hauptabbauprodukten der unterschiedlichsten Pestizidklassen eingesetzt. Das Spektrum umfaBt hierbei u. a. Carbamate, Phenylharnstoffe, Thioharnstoffe, Phenoxyalkancarbonsauren, Triazine, quaternare Ammoniumverbindungen und Organophosphorpestizide [9181. Besonderes Augenmerk gilt dabei Verbindungen mit einer geringen UVAbsorption, fur die eine herkommliche HPLC-Bestimmung somit zu unempfindlich ware.

Prinzip der Bestimmung Die Pestizide werden aus der Wasserprobe mittels Festphasenextraktion an C1,-Material angereichert und rnit Methanol eluiert. Der eingeengte Extrakt wird zur HPLC-MS eingesetzt. Die Extraktion der Pestizide ist auch on-line moglich [9-191. Chemikalien und Hilfsmittel

- Ammoniumacetat, z. A.

- Methanol, HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Wasser, HPLC grade oder gleichwertig - SPE-System (z. B. Baker SPE-10, Fa. Baker, Holland) - 15 mL Clean up C18endcapped, Fa. amchro, Sulzbach - Membranfilter (0,45 pm)

Arbeitsvorschrift a) Probenahme Die Probenahme erfolgt in 1-L-Braunglasflaschenmit Schliff. Bis zur Extraktion ist die Probe gekuhlt (4 "C) und lichtgeschutzt aufzubewahren.

200

9 HPLC-Applikationenaus dem Umweltbereich

b) Probenvorbereitung und -aufarbeitung Die Wasserprobe ist vor der Extraktion gegebenenfalls beim Vorhandensein von Schwebstoffen zu filtrieren. 1 L Probe werden uber eine zuvor gereinigte (10 mL Methanol) und konditionierte (10 mL Wasser) C,&3aule (2 g Sorbens) gegeben. Die Sauggeschwindigkeit sollte dabei 10 mumin betragen. ZweckmaBigerweise wird die Probe uber einen Teflonschlauch, der mittels Adapter an der Extraktionssaule befestigt ist, direkt aus dem Probenahmegefa0 entnommen. Nach AbschluB der Extraktion wird zum Trocknen fur 30 min Luft durch die Saule gesaugt. Als Schutz vor Kontaminationen durch die Laborluft wird eine zweite, zu diesem Zweck mehrfach verwendbare Extraktionssaule aufgesetzt. Die abschlieoende Elution der Wirkstoffe erfolgt rnit 4 X 2 mL Methanol. Das Volumen des Eluats wird durch Uberleiten von Stickstoff auf ein Volumen von ca. 100 pL eingeengt. Als interner Standard wird Coffein eingesetzt (100 pL einer methanolischen L6sung von 50 ng/pL). Aus chromatographischen Grunden wird rnit Wasser auf 500 pL aufgefullt. Der Anreicherungsfaktor betragt somit 2000. c) Geriite und chromatographischeParameter HPLC-System: Niederdruckgradientenanlage rnit Thermospray-Interface, z. B. Flussigkeitschromatograph Varian 5000 (Varian Ass., Palo Alto, USA) rnit Shimadzu LC-9APumpe fur die Nachsaulenzugabe (post column-Addition) von Reagenzien (Fa. Shimadzu, Kyoto, Japan), Vestec Thermospray-Interface (Fa. Vestec, Houston, USA), Einspritzventil Rheodyne 7125 (Rheodyne, Berkeley, USA) mit 20 pL Probenschleife. Thermospray-Interface-Parameter : Verdampferkontrolltemperatur: 135-150 "C Verdampfertemperatur : 190-220 "C Heizertemperatur : 270 "C Quellentemperatur : 250 "C Quellen-Jet-Temperatur: 230-240 "C Exit-line-Druck: 265-530 Pa Massenspektrometer: Finnigan MAT 4500 (Finnigan MAT, San Jose, USA), Betrieb im Fullscan-Modus ( d z 130 bis 450) oder zeitprogrammierten SIM-Modus Saule: narrow-bore-Edelstahlkartuschen (150 mm X 3 mm i. D.) mit LiChrospher 60 RP-select B (z. B. Merck LiChrocart, Fa. Merck, Darmstadt), Partikelgrofie: 5 CLm B. Wasser A. Methanol FlieBmittel: Die on-line Entgasung rnit Helium ist angeraten.

9.4 Bestimmung von Pflanzenschutzmitteln (PSM) in Trinkwasser mittels HPLC-MS

post column-Puffer: Gradient: Laufzeit : FluSrate: Detektor: Injektionsvolumen:

201

0.175 M Ammoniumacetat-Liisung Omin: 20% A 45 min: 95% A 60min: 95% A 60 min FlieSmittel : 0,6 mUmin post column-Puffer: 0,4 mumin Quadrupol-MS, gescanter Massenbereich von m/z 135 bis m/z 500 bzw. zeitprogrammierter SIM-Modus 20 pL

Ergebnisse und Diskussion Abb. 9-10 zeigt das HPLC-MS-Chromatogramm einer dotierten FluBwasserprobe. Die Probe wurde mit Phenylharnstoffen (100 ng/L) gespikt und im zeitprogrammierten SIM-Modus gemessen. Eine chromatographische Trennung ist bei der HPLC-MS-Kopplung keine Voraussetzung fiir die Quantifizierbarkeit der einzelnen Substanzen. Auch bei einer Peakuberlappung ermoglicht die Auswertung charakteristischer Massen eine einwandfreie Quantifizierung. Bei Messungen im Fullscan-Modus ergeben sich bei Verwendung eines Thermospray-Interfaces einfache Massenspektren, in denen hauptsachlich die Quasi-Molekulionen auftreten. Eine starke Fragmentierung und damit verbundene strukturelle Informationen sind in der Regel nicht zu beobachten. Die Ionisierung erfolgt schonend, so daB sich auch thermisch labile, stark polare Verbindungen nicht zersetzen. Entscheidend fur die Empfindlichkeit ist der Wassergehalt im Tragerstrom. Es zeigt sich ,daB ein steigender Wassergehalt mit hoheren Empfindlichkeiten einhergeht. Bei der Gradientenelution der Manzenschutzmittel wird jedoch permanent der Methanolgehalt des Eluenten gesteigert. Um dem entgegenzuwirken, erfolgt eine post column-Addition von Pufferlosung. Phosphatpuf-

2

Abb. 9-10 HPLC-MS-Chromatogramm

11, , ,

30 Zeit [min]

einer mit Phenylharnstoffen (100 ngL) gespikten FluDwassexprobe (aus [9-191). 1: Coffein (interner Standard), 2: Fenuron, 3: Monuron, 4: Monolinuron, 5: Chlortoluron, 6: Isoproturon, 8: Difenoxuron, 9: Linuron, 10: Chlorbromuron, 11: Chloroxuron.

202

9 HPLC-Applikationen aus dern Umweltbereich

fer scheidet hierbei aus, da es schnell zu Verstopfungen der Verdampferkapillare kommen kann. Bewahrt hat sich der Einsatz von Ammoniumacetatlosung. Bei der Auswahl einer geeigneten Konzentration gilt es zu beachten, daB das Untergrundrauschen mit der Salzkonzentration zunimmt . Beliebig 1aBt sich die Empfindlichkeit durch Wasser- bzw. Pufferzugabe nicht erhiihen, da eine Verdunnung des Analyten der Empfindlichkeitserhohung entgegensteht. Der optimale Flul3 fur die post-column-Zugabe ist experimentell zu ermitteln . Kalibrierung Die Quantifizierung erfolgt uber eine interne Standardisierung (Kalibriergerade). Um im Bereich der Grenzwerte der Trinkwasserverordnung messen zu konnen, erfolgt die Aufnahme des Chromatogramms im SIM-Modus. Dazu wird eine Verdunnungsreihe mit mindestens vier Konzentrationen ab 0,2 ng/ pL mit Hilfe eines Mischstandards der untersuchten Substanzen eingesetzt. Die Konzentration des internen Standards (Coffein) betragt in jeder Losung 10 ng/pL. Coffein dient daneben zusatzlich als Retentionszeit-Referenzpeak und zur Kalibrierung des Massenspektrometers. Die Kalibriergerade wird uber die von der Auswertesoftware berechneten Peakflachen oder Peakhohen bei der fur die jeweilige Substanz charakteristischen Massenspur ermittelt. Fur die Pflanzenschutzmittel ergibt sich ein linearer Bereich von vier Zehnerpotenzen ab Konzentrationen von ca. 100 pg/pL (substanzabhangig). Genaue Daten sind der Literatur zu entnehmen [9-191. Validierung Zur Aufnahme kompletter Massenspektren sind je nach untersuchter Verbindung ca. 10 bis 20 ng Substanz erforderlich. Erfolgen die Messungen im SIMModus werden Nachweisgrenzen unter 100 pg (absolut), z. B. bei Monuron oder Chloroxuron, erreicht. Damit sind die untersuchten Pflanzenschutzmittel entsprechend den Anforderungen der Trinkwasserverordnung im unteren ng/L-Bereich bestimmbar. Bei der Angabe der Nachweisgrenzen wird jeweils ein SignaYRausch-Verhaltnisvon 3 :1 zugrundegelegt . Probleme bereitet bei einem Thermospray-Interface die Reproduzierbarkeit der Peakflachen, deren Abweichung uber einen Arbeitstag hinaus oftmals 20 Prozent uberschreitet. Innerhalb eines Arbeitstages wird fur die Peakflachen der einzelnen Verbindungen eine relative Standardabweichung von 1bis 12 Prozent erreicht. Eine standige Kontrolle der Kalibrierung ist daher unbedingt erforderlich.

9.5 Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen

203

9.5 Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAH) nach 'Ikinkwasserverordnung(TVO) in Grund- und Rohwasser Problemstellung Trinkwasser gilt als das wichtigste Grundnahrungsmittel, dessen Qualitat nach Vorgaben der Europaischen Union im deutschen Recht (Trinkwasserverordnung, TVO)streng geregelt ist. Die Regelungen sehen dabei das Wasser als schutzenswertes Gut. Fur die Summe von sechs PAH gilt danach ein Grenzwert von 0,2-0,04 pg/ L (bezogen auf Kohlenstoff). Im Vorfeld der Trinkwasseraufbereitung werden bereits Grund- bzw. Rohwasserproben auf PAH untersucht, wobei im Zuge der physikalisch-chemischen Wasseraufbereitung der Gehalt an PAH herabgesetzt werden kann. PAH finden sich aufgrund ihres hohen Adsorptionskoeffizienten (aromatische Struktur, hoher Kohlenstoffanteil) sowohl gelost als auch an Schwebstoffe adsorbiert im Wasser. Bei einer dezidierten Fragestellung und einer entsprechenden Probenaufbereitung kann eine analytische Unterscheidung der gelosten und ungelosten Anteile erfolgen. Formeln der PAH Zu den in der Trinkwasserverordnung geregelten PAH gehoren: Fluoranthen, Benzo[b]fluoranthen, Benzo[klfluoranthen, Benzo[a]pyren, Benzo[ghi]perylen und Indeno[ 1,2,3-~d]pyren.Die Strukturformeln dieser Substanzen sind in Kapitel 9.9 (Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen in Bodenproben) abgebildet. Prinzip der Bestimmung Die PAH werden durch flussighlussig-Extraktion mit Cyclohexan aus dem Wasser extrahiert . Bei starker verunreinigten Proben wird gegebenenfalls ein clean-up-Schritt (Kieselgelsaule) durchgefuhrt. Der erhaltene Extrakt wird zur Trockne eingeengt und in einem geeigneten Liisungsmittel aufgenommen. Die Bestimmung erfolgt mit HPLC-FLD. Dabei wird unter isokratischen Bedingungen bei einer fur alle sechs Substanzen konstanten Wellenlangenkombination gearbeitet . Die Quantifiiierung erfolgt nach der Methode der externen Standardisierung [9-201. Chemikalien und Hilfsmittel Da mit geringen PAH-Konzentrationen zu rechnen ist , muB sichergestellt sein, daB die verwendeten Glasgerate nicht kontaminiert sind. Es wird emp-

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9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

fohlen, die Gerate mit Aceton zu spulen und nachfolgend bei 200 "C zu trocknen bzw. bei 450 "C auszuheizen. Die Abwesenheit von PAH ist durch die Untersuchung von Blindwerten zu uberprufen. Cyclohexan, z. A. [F; R 11; S 9-16-33] - Dichlormethan, z. A. [Xn; R 40, S 23.2-24/25-36/37] - n-Hexan, z. A. [Xn, F; R 11-20-48; S 9-16-24/25-29-51] - Methanol, HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Natriumchlorid, z. A., gegluht - Natriumsulfat, wasserfrei, z. A., gegluht - Tetrahydrofuran, z. A. [Xi, F; R 11-19-36/37; S 16-29-33] - Vergleichssubstanzen der sechs PAH zur Identifizierung und Kalibrierung, gegebenenfalls als im Handel erhaltliche Mischlosung - Membranfilter (0,45 pm) - silanisierte Glaswolle - Schuttelmaschine - Zentrifuge - SPE-System (z. B. Baker SPE-10, Fa. Baker, Holland) - 6 mL Bakerbond SPE Trennsaule Silicagel, 0,s g Sorbens -

Arbeitsvorschrift a) Probenahme Die Probenahme sollte in tarierten Braunglasflaschen mit Schliff erfolgen, da sonst bei Lichteinstrahlung eine Photoumwandlung der PAH stattfindet. Bei Verwendung von KunststoffgefaBen wurde eine Adsorption der Verbindungen an den GefaBwandungen eintreten. Die Flaschen werden randvoll gefiillt, um keinen Kopfraum zu haben. Da in Extrakten der Verlust an PAH geringer ist als in der Probe, sollte die Extraktion unmittelbar nach der Probenahme durchgefuhrt werden. b) Probenvorbereitungund -aufarbeitung Die Extraktion erfolgt in der Probenahmeflasche. Dazu wird aus dieser nach Homogenisation soviel Probenmenge entfernt, daB 1000 mL Wasser verbleiben (Waage). AnschlieBend wird die Probe mit 20 g Natriumchlorid und 25 mL Cyclohexan versetzt und nachfolgend durch kraftiges Schutteln grundlich gemischt. Vor der weiteren Aufarbeitung kann die Probe jetzt gegebenenfalls kuhl und lichtgeschutzt gelagert werden. Nach Uberfuhrung der Probe in einen 2 L Scheidetrichter wird fur 10 Minuten auf der Schuttelmaschine geschuttelt. Im AnschluB an die Phasentrennung (falls erforderlich kann zentrifugiert werden) wird die waBrige Phase wieder in die Probenahmeflasche abgelassen und zu einer zweiten Extraktion erneut mit 25 mL Cyclohexan

9.5 Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen

205

versetzt. Die organischen Extrakte einschlieBlich 10 mL Cyclohexan, rnit denen der Scheidetrichter abschlieBend nachgespult wird, werden in einem 250 mL Erlenmeyer-Kolben gesammelt und uber Natriumsulfat getrocknet. Der Extrakt wird unter grundlichem Nachwaschen durch silanisierte Glaswolle in einen 100 mL Spitzkolben filtriert und am Rotationsverdampfer (30 "C, 120 hPa) auf ca. 0,5 mL eingeengt. Sollte kein weiteres clean-up erforderlich sein, wird der Extrakt durch Uberleiten von Stickstoff gerade zur 'Ifockne abgeblasen und der Ruckstand in 1 mL Methanol oder Acetonitril aufgenommen. Die so erhaltene Liisung kann zur HPLC eingesetzt werden. Sofern die Farbung der Extrakte nicht durch eine hohe Konzentration an PAH hervorgerufen wird, werden die auf ca. 0,5 mL eingeengten, gefarbten Extrakte auf eine zuvor gereinigte (10 mL Dichlormethan) und konditionierte (10 mL n-Hexan) Kieselgelkartusche uberfuhrt . Der Spitzkolben wird mit ca. 0,s mL n-Hexan nachgespult, das nach Einsickern des Extraktes in das Sorbens auf die Saule gegeben wird. Die PAH werden rnit 3 mL Dichlormethanh-Hexan (1/1) eluiert. Das gesamte Eluat wird in einem 10 mL Spitzkolben aufgefangen, auf 0,5 mL eingeengt (30 "C, 200 hPa) und wie oben beschrieben weiterbehandelt.

c) Gerate und chromatographische Parameter Niederdruckanlage rnit FLD, z. B. FlussigkeitschromaHPLC-System: tograph Hewlett Packard 1050 rnit Fluoreszenzdetektor Hewlett Packard 1046 A (Hewlett Packard, Avondale, USA), Einspritzventil Rheodyne 7125 (Rheodyne, Berkeley, USA) rnit 20 pL Probenschleife Edelstahlsaule (150 mm x 4 mm i. D.) rnit ET 150/8/4 Saule: Nucleosil 5 C18 PAH-Material, PartikelgroBe 5 pm (Fa. Macherey & Nagel, Duren) FlieBmittel: Methanol/Xetrahydrofuran,90/10, v/v Das FlieBmittel sollte als Fertigmischung vorgelegt und permanent entgast werden. Im FlieBmittel geloster Sauerstoff fiihrt zu einer Abschwachung der Fluoreszenz. Variiert der Sauerstoffgehalt, kommt es zu differierenden Fluoreszenzintensitaten. 20 min Laufzeit : FluBrate: 1,5 mL/min Saulentemperatur: 24 "C Detektor: Fluoreszenzdetektion mit Anregungswellenlange: 365 nm Emissionswellenlange: 470 nm Injektionsvolumen: 20 pL

206

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

Ergebnisse und Diskussion Abb. 9-11 zeigt das HPLC-FLD Chromatogramm einer im Bereich von 50 ngl L dotierten Rohwasserprobe. Neben der hier vorgestellten Methode lassen sich PAH aus Wasser auch mit anderen Liisungsmitteln (n-Hexan) bzw. mittels Fest-Flussig-Extraktion (Kombination aus Amino- und CWPhasen) extrahieren. Untersuchungen zeigten, dal3 alle Extraktionsverfahren vergleichbar hohe Wiederfindungsraten bringen. Allerdings wird mit Cyclohexan die beste Reproduzierbarkeit der Wiederfindungsraten erreicht [9-211.

1

3

4

1

1

2

4

6

8

10

12

Zeit [min]

Abb. 9-11: HPLC-FLD-Chromatogramm einer Rohwasserprobe, dotiert mit 6 PAH nach TVO im Bereich von je 50 ng/L. 1: Fluoranthen, 2: Benzo[b]fluoranthen, 3: Benzo[k]fluoranthen, 4:

Benzo[a]pyren. 5: Benzo[ghi]perylen, 6: Indeno[l,2,3-cd]pyren.

Kalibrierung Die Quantifizierung erfolgt uber eine externe Standardisierung (Kalibriergerade) . Dazu wird eine Verdunnungsreihe mit sechs Konzentrationen (10-60 pg/pL) mit Hilfe eines Mischstandards der PAH eingesetzt. Die Kalibriergerade wird uber die vom Integrator berechneten Peakflachen oder Peakhohen ermittelt. Die Kalibnergerade ist dabei vom Betriebszustand des FLD abhangig und muB regelmaSig uberpruft bzw. neu erstellt werden.

9.6 Bestimmung von Anionen in Deponiesickerwassern

207

Validierung Die entsprechende DIN-Vorschrift sieht vor, VerfahrenskenngroBen fiir die vorgestellte Methode zu ermitteln [9-201. Dazu werden entsprechend den Konzentrationen bei der Aufstellung der Kalibriergeraden Wasserproben zu Beginn der Aufarbeitung dotiert und nach der Vorschrift aufgearbeitet . Aus den einzelnen Wiederfindungsraten, die fiir die unterschiedlichen Konzentrationen im gleichen Bereich liegen mussen, wird eine mittlere Wiederfindungsrate berechnet. Die Resultate sollten dabei nicht signifikant von folgenden Verfahrenskenndaten abweichen: Substanz Fluoranthen Benzo[b]fluoranthen Benzo[k]fluoranthen Benzo[a]pyren Benzo[ghi]perylen Indeno[1,2,3-cd]pyren

Wiederfindungsrate

Vergleichsvariationskoeffizient

[”/.I

I”/. I

95,6 966 97,3 95,7

9,51 3.76 449 3,05 5,31 4,32

9691

97,7

Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt substanzabhangig im Bereich von 5-10 ngL.

9.6 Bestimmung von Anionen in Deponiesickerwassern Problemstellung In Deponien bildet sich durch eintretende Niederschlage und durch Freisetzung von Wasser bei Abbauvorgangen Sickerwasser. Bei der Passage durch den Mullkorper reichert sich das Sickerwasser in unterschiedlichem MaJ3e mit Salzen an. Die Kenntnis dieser Salzfrachten hinsichtlich ihrer Zusammensetzung ist fur die weitere Behandlung der Sickerwhser sowie zur Charakterisierung des Deponieverhaltens von Bedeutung. Am haufigsten kommen die Anionen Chlorid und Sulfat vor. Die Anionenkonzentrationen kiinnen dabei in weiten Bereichen schwanken [9-221:

F C1NO; NO< SO:-

<0,1 36 <0,02 <0,1 18

-

50 mg/L 126300mg/L 131 mg/L - 14775mgL - 14968mgL -

208

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

Diese Konzentrationsunterschiede sind fur die analytische Bestimmung der Ionen von Bedeutung. Neben den klassischen, naochemischen Verfahren zur Anionenbestimmung (Titration, Photometrie) hat sich die Ionenchromatographie, die eine parallele Bestimmung mehrerer Anionen erlaubt, als Analysenmethode fur diese Aufgabenstellung etabliert [9-231.

Prinzip der Bestimmung Grundlage des Bestimmungsverfahrens ist die DIN 38405 Teil 20: Bestimmung der gelosten Anionen Bromid, Chlorid, Nitrat, Nitrit, ortho-Phosphat und Sulfat in Abwasser mit der Ionenchromatographie. Eine Abweichung von der Norm besteht in der hier vorgestellten Methode in der Erweiterung des Verfahrens auf Fluorid-Ionen. Mit dem verwendeten Eluenten lassen sich Phosphationen nicht nachweisen. Chemikalien und Hilfsmittel - Einzelstandardlosungen der Anionen Fluorid, Chlorid, Bromid, Nitrat, Nitrit und Sulfat in 1000-mL-PE-Flaschen (1 g/L) - Reinstwasser, bidest. oder entsprechend - Aceton, z. A. [F; R 11; S 9-16-23.2-331 - Natriumhydroxid, z. A. [C; R 35; S 2-26-27-37/39] - Phthalsaure, z. A. [Xi; R 36/37/38] - Phthalsaure-Eluent - Konzentratlosung: 3,323 g Phthalsaure, 2 mL NaOH (30%) und 10 mL Aceton werden in 950 mL Reinstwasser gelost und nach pH-Wert-Einstellung mit 1 n NaOH auf 4,5 auf 1 L aufgefullt. - gebrauchsfertiger Eluent: 100 mL Konzentrat und 100 mL Aceton werden mit Reinstwasser auf 1 L aufgefullt. AnschlieBend wird der Eluent 10 min durch schwachen Heliumgasstrom entgast (2 mMoVL Phthalsaure, 10% Aceton, pH 5,0, Lf = 180 pS/cm). - Helium - Membranfilter (0,45 pm) - Faltenfilter, z.B. Schleicher & Schull 595 1/2 - pH-Meter - Kationenaustauscher Hypersep IC-H, Fa. Metrohm Arbeitsvorschrift a) Probenahme Zur Probenahme werden gereinigte Behalter aus Polyethylen eingesetzt. Um Kontaminationen der Probe auszuschlieBen, sollten die GefaBe nicht mit starken Mineralsauren oder alkalischen Detergentien gereinigt werden. Die Analyse ist so bald wie moglich durchzufuhren, um Veranderungen der Probe

9.6 Bestimmung von Anionen in Deponiesickenvassern

209

durch mikrobielle Umsetzungen, z. B. bei nitrat- und nitrithaltigen Wassern, zu verhindern. Eine weitere Veranderung der Probe kann durch Adsorption der Anionen an Feststoffen erfolgen. 1st eine baldige Bestimmung nicht moglich, laBt sich die membranfiltrierte Probe durch Tiefgefrieren stabilisieren.

b) Probenvorbereitung und -aufarbeitung 10 mL der Sickerwasserprobe werden zur Entfernung von Feststoffen uber ein Membranfilter filtriert. AnschlieBend wird die so behandelte Probe uber einen Kationenaustauscher gegeben. Dies ist notwendig, um den Kationenpeak zu verkleinern, da dieser die Detektion des Fluoridions stort. Da die verschiedenen Anionen in einer Probe haufig sehr unterschiedlich konzentriert vorliegen, ist es notwendig, jeweils eine Verdunnungsreihe anzusetzen. Damit lassen sich die Konzentrationen der einzelnen Anionen den kalibrierten Bereichen anpassen. Zunachst werden funf Kalibrierstandards der Anionen mit Konzentrationen von 1bis 10 m g L und anschlieBend die Proben aus der Verdunnungsreihe injiziert . Um eine mogliche Kontamination der verwendeten Filter, Ionenaustauscher und Glasgerate zu erkennen, wird ein Blindwert bestimmt. c) Geriite und chromatographische Parameter HPIC-System: Ionenchromatograph 690 mit Leitfahigkeitsdetektor. Autosampler 698 Injektionsvolumen 100 pL, IC-Pumpe 697, Fa. Metrohm. Saule: IC Anionensaule PRP-X 100, StyroVDivinylbenzol-Copolymer mit quarternaren Ammoniumgruppen , Fa. Metrohm Phthalsaure-Eluent FlieBmittel: FluBrate: 2,O mUmin Saulentemperatur: 35" f 1"C Ergebnisse und Diskussion Abb. 9-12 zeigt das Ionenchromatogramm einer 1:100-Verdunnung eines Deponiesickerwassers. Im Chromatogramm sind drei Anionen und der Systempeak (Nr. 4) zu erkennen. In dieser realen Deponiesickerwasser-Probe waren keine weiteren Anionen enthalten. Der Fluoridpeak sitzt als Schulter auf dem Kationen-Peak, wodurch die Integration gestort ist. Abb. 9-13 zeigt das Ionenchromatogramm nach der Behandlung der Probe mit dem Kationenaustauscher. Die bessere Abtrennung des Fluoridpeaks vom Injektionspeak ist deutlich sichtbar. Der sogenannte Systempeak (Nr. 4) lauft in diesem Fall als negatives Signal aus dem Chromatogramm, ohne daB dadurch jedoch die Auswertung gestort ist.

210

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

4

3

, 5

1 0

.

.

.

7

20

1 5

Zeit [min]

Abb. 9-12: Ionenchromatogramm eines Deponiesickenvassers (1: 100 verdiinnt). 1: 0,5 mg/L Fluorid, 2: 255 mg/L Chlorid, 3: 98 mg/L Sulfat, 4: Systempeak.

Kalibrierung Die Quantifizierung erfolgt uber eine externe Standardisierung. Dazu wird eine Verdunnungsreihe mit funf Konzentrationen von 1bis 10 mg/L mit Hilfe eines Mischstandards der Anionen eingesetzt. Die Kalibriergeraden werden uber die vom Integrator bzw. von einer Chromatographie-Auswertesoftware berechneten Peakflachen ermittelt. Validierung Die Wiederfindungsrate einer im Bereich von 1 bis 10 mg/L dotierten Sickerwasserprobe liegt fur Fluorid bei 99 %. Fur die ubrigen Anionen werden Wiederfindungsraten von 84 % (Chlorid) bis 105% (Sulfat) ermittelt.

9.7 Bestimmung von Anionentensiden in Kliirschlammen

211

3

Zeit [min] Abb. 9-W: Ionenchromatogramm eines Deponiesickerwassers (1:100 verdunnt) nach Behandlung mit Kationenaustauscher. 1: 0,5 mg/L Fluond, 2: 255 mg/L Chlorid, 3: 98 mg/L Sulfat, 4: Systempeak (negativ).

9.7 Bestimmung von Anionentensiden in Klarschlammen Problemstellung Durch ihren Einsatz als Wirksubstanzen in Wasch- und Reinigungsmitteln belasten Tenside in erheblichem MaSe das kommunale Abwasser. Trotz guter Abbaubarkeit, die in der Regel uber 95 % liegt, fuhren die hohen Eintragsmengen zu einer Akkumulation der Stoffe im Klarschlamm. Der Begriff Tenside dient als Sammelbezeichnung fiir anionische, kationische, nichtionische und amphotere waschaktive Substanzen, wobei der Anteil an anionischen Tensiden, hier vor allem an linearen Alkylbenzylsulfonaten (LAS), mit 70 % uberwiegt. Industrielle Produkte bestehen aus einem Gemisch verschiedener Alkyl-Homologe mit einer Kettenlange von 10 bis 14 Kohlenstoffatomen (s. Abb. 9-14). Eine Uberwachung des Verbleibs dieser Verbindungen in der Umwelt ist unbedingt erforderlich. Vor allem beim Einsatz von Kliirschlamm, der LAS-Gehalte uber ein Prozent aufweisen kann,

212

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

als Dunger gelangen groRe Tensidmengen auf landwirtschaftliche Nutzflachen. Bei der Tensidanalytik mittels HPLC steht gegenuber der herkommlichen Summenparameteranalytik neben einer besseren Nachweisgrenze die Moglichkeit im Blickpunkt, Einzelstoffe nachweisen zu konnen. Dadurch wird die Bedeutung der analytischen Aussagen erhoht [9-241.

Formeln der LAS-Tenside In Abb. 9-14 ist die allgemeine Strukturformel der linearen Alkylbenzylsulfonate dargestellt, deren wichtigste Vertreter in der Seitenkette 10 bis 14 Kohlenstoffatome aufweisen.

Q NaS03

Abb. P14: Strukturformelder linearen Alkylbenzylsulfonate mit n + m = 7 bis 11.

Prinzip der Bestimmung Die gefriergetrocknete Probe wird in einer Soxhlet-Apparatur mit Methanol extrahiert. Hierbei wird fiir adsorptiv gebundene Tenside eine Ausbeute von nahezu 100 Prozent erreicht [9-251. Der methanolische Extrakt wird an einer Anionentauschersaule und anschliel3end uber eine reversed-phase-Saule (hier C,,-Material) gereinigt. Der zur Trockne eingeengte Ruckstand wird abschlieRend in einem geeigneten Liisungsmittel aufgenommen und zur HPLC eingesetzt. Die Detektion der Substanzen erfolgt mittels UV-Detektor [9-261. Chemikalien und Hilfsmittel Acetonitril, z. A. [T, F; R 11-23/24/25; S 16-27-44] - Marlon A 345, Fa. Huls, Marl - Methanol, HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Natriumhydroxid, z. A. [C; R 35; S 2-26-37/39] - Natriumperchlorat-Monohydrat, z. A. [Xn, 0; R 9-22; S 2-13-22-271 - Salzsaure, rauchend (37 %) [C; R 34-37; S 2-26] - Wasser, HPLC grade oder gleichwertig - Membranfilter (0,2 pm) - silanisierte Glaswolle - Gefriertrocknungsanlage - Soxhlet-Extraktor - Extraktionshulsen fur Soxhlet-Extraktoren - Wasser- oder Dampfbad

-

9.7 Bestimmung von Anionentensiden in Klarschlammen

213

Arbeitsvorschrift a) Probenvorbereitung und -aufarbeitung Die Probenvorbereitung fur die photometrische Bestimmung als methylenblauaktive Substanzen (MBAS) und die HPLC-Bestimmung kann nach dem gleichen Schema durchgefiihrt werden [9-271. Die Original-Schlammprobe wird durch Zentrifugieren in ihrem Feststoffgehalt angereichert. Der so erhaltene NaBschlamm wird in dunner Schicht in geeigneten Schalen eingefroren und gefriergetrocknet (in der Regel sind 24 Stunden ausreichend). 1bis 2 g der homogenisierten, gefriergetrockneten Probe werden in eine zuvor extrahierte Soxhlethulse eingewogen, mit silanisierter Glaswolle abgedeckt und in die Soxhletapparatur uberfuhrt. Als Extraktionsmittel dienen 180 mL Methanol, die in einem 250-mL-Rundkolben vorgelegt sind. Nach mindestens 10 Durchlaufen (Dauer ca. zwei Stunden) ist die Extraktion vollstandig. Der Extrakt wird auf einem siedenden Wasserbad oder Dampfbad unter Uberleiten von Stickstoff eingeengt und mit Methanol auf ein Endvolumen von genau 100 mL gebracht . Ein Aliquot (10-50 mL) wird auf eine rnit 10 mL Methanol gespulte SAX-Anionentauschersaule(0,5 g Austauscherharz, 2,8 mL Bond Elut SAX Quaternary Amine, Fa. Analytichem Int.) gegeben. Die FluBrate sollte ca. 1 TropfedMinute betragen. Die Saule wird rnit 10 mL Methanol gewaschen und nachfolgend rnit 2 mL MethanoVSalzsaure (20/5) eluiert. Durch diesen Schritt werden vor allem Nonylphenolpolyethoxylate (nichtionische Tenside), die ansonsten die chromatographische Bestimmung storen, abgetrennt. Das Eluat, das die Tensidanionen enthalt, wird rnit Wasser verdunnt, mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 gebracht und rnit Wasser auf 100 mL aufgefiillt. Von dieser LCisung werden 40 mL auf eine rnit 10 mL Methanol gereinigte und rnit 10 mL konditionierte reversed-phase-Kartusche (C,) (0,s g Sorbens, z. B. 6 mL Bakerbond SPE Trennsaule Octadecyl) gegeben. Das Waschen der Saule zur Abtrennung polarer Verbindungen erfolgt rnit 5 mL Wasser und 3 mL MethanoVWasser (20/80). Die Anionentenside werden dann rnit 5 mL Methanol eluiert und auf dem Wasser- bzw. Dampfbad zur Trockne abgedampft. Wird die HPLC-Bestimmung nicht unmittelbar im AnschluB an die Aufarbeitung durchgefiihrt ,werden die Eluate in getrocknetem Zustand aufbewahrt. Unmittelbar vor der chromatographischen Bestimmung wird der Ruckstand in 5 mL eines AcetonitriVWasser-Gemisches(70/30) gelost. b) Geriite und chromatographische Parameter HPLC-System: Niederdruck-Gradientenanlage, z. B. Fliissigkeitschromatograph Hewlett Packard 1050 rnit UV-Detektor Hewlett Packard 1050 (Hewlett Packard, Avondale, USA), Einspritzventil Rheodyne 7125 (Rheodyne, Berkeley, USA) mit 20-pL-Probenschleife.

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9 HPLC-Applikationen aus dern Umweltbereich

Saule:

Edelstahlsaule (250 mm x 4.6 mm i. D.) rnit geeignetem C1,-RP-Material (z. B. Hypersil ODs, Fa. Shandon Scientific Ltd., GB), Partikelgroae 5 pm. FlieBmittel: A. 0,l M NaC104-Losung in Wasser B. Acetonitril Gradient: Omin: 60% A 25min: 40% A 30min: 40% A Laufzeit : 30 min Um ein Auskristallisieren des Natriumperchlorats nach Analysenende zu verhindern, muB das gesamte chromatographische System vor Auaerbetriebnahme grundlich mit Wasser und anschlieaend rnit Acetonitril gespult werden. 1,0 mUmin FluBrate: Detektor: UV-Detektor, Festwellenlange: 225 nm Injektionsvolumen: 20 pL uber eine entsprechende Rheodyne-Probenschleife

Ergebnisse und Diskussion Abb. 9-15 zeigt das HPLC-Chromatogramm einer rnit Marlon A 375 dotierten Klarschlammprobe . Die LAS-Homologen eluieren entsprechend der Anzahl an Kohlenstoffatomen. Das Chromatogramm zeigt mehrere Peakgruppen. Die nicht vollstandig aufgetrennten Peaks einer Gruppe gehoren zu den Homologen rnit gleicher Anzahl an Kohlenstoffatomen in der Seitenkette (Clobis C,). Zur Detektion der LAS kann neben dem UV-Detektor auch ein Fluoreszenzdetektor (Anregungswellenlange: 225 nm, Emissionswellenlange 290 nm) eingesetzt werden. Die Vorteile des FLD liegen dabei in den durch weniger Begleitstoffpeaks gestorten Chromatogrammen [9-281. Ka librierung Die Quantifizierung erfolgt uber eine externe Standardisierung (Kalibriergerade). Dazu werden 2,O mg/mL Marlon A bekannten Gehaltes (Huls AG) in Methanol gelost. Diese Losung wird mit AcetonitriVWasser (70/30) im Verhaltnis 1/10, 1/50, 11100, 1/200 verdunnt und dient zu Vergleichsmessungen bzw. zur Erstellung der Kalibriergeraden. Fur die Berechnung der Kalibriergeraden werden die vom Integrator ermittelten Peakflachen bei der Wellenlange h = 225 nm verwendet. Einzelne Isomere mit gleicher Anzahl an Kohlenstoffatomen werden nicht unterschieden, sondern zu einer Flachensumme zusammengefaBt.

9.7 Bestimmung von Anionentensiden in Klarschlammen

215

c 11

c 12

I c 10 -

5

10

15

20

25

Zeit [min]

Abb. 9-15: HPLC-Chromatogramm einer mit 1 mg/g Marlon A 375 dotierten Klarschlammprobe.

Validierung Die Detektornachweisgrenze liegt bei ca. 1 pg pro Homologem. Mit der beschriebenen Methode lassen sich Gehalte ab 100 ppb nachweisen. In Klarschlammen ist hierbei ublicherweise mit LAS-Gehalten uber 100 ppm zu rechnen. Fur im Bereich von 1 mg/g Trockenmasse dotierte Klarschlamme werden fur die Summe an LAS Wiederfindungsratenvon uber 85 Prozent bei einer relativen Standardabweichung von 6,s Prozent erhalten. Dabei verhalt sich die Wiederfindungsrate umgekehrt proportional zur Lange der Seitenkette.

Alternativmethoden In der Routineanalytik werden Anionentenside nach geeigneter Probenvorbereitung nach einer standardisierten DIN-Methode (DIN 38409 Teil23) als Gruppenparameter ,,MethylenblauaktiveSubstanzen (MBAS)" erfaBt [9-291. Hierbei werden die Substanzen mit Methylenblau zu einem blauen Farbkomplex umgesetzt, der mit Chloroform aus einer warigen Matrix extrahierbar ist . Diese MeBgroBe verzichtet auf eine spezifische Bestimmung einzelner Tenside und stellt einen analytischen Hochstwert dar, da zahlreiche, nicht

216

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

naher charakterisierte biogene methylenblauaktive Substanzen (Pseudotenside) miterfafit werden. Ebenso ist es moglich, daB in der Liisung enthaltene Anionen Farbkomplexe bilden. Vor allem bei Proben mit geringen Tensidgehalten kommt es so zu unrichtigen Ergebnissen. Gegenuber der Gaschromatographie besitzt die HPLC-Methode den Vorteil, daB die wichtigsten LAS-Homologen ohne Derivatisierung bestimmbar sind. Fur die Gaschromatographie werden die Alkylbenzylsulfonate zunachst in die entsprechenden fluchtigen Alkylbenzole uberfuhrt.

9.8 Bestimmung von Phenylharnstoff-Herbiziden in Eluaten aus Bodenproben Problemstellung Substituierte Harnstoffderivate und ihre herbizide Wirkung sind bereits seit den 50er Jahren bekannt. Sie besitzen noch heute groDe Bedeutung als Totalherbizide bzw. zur selektiven Unkrautbekampfung in der Landwirtschaft . Die Applikation der Wirkstoffe erfolgt zumeist uber den Boden. Bei der Beurteilung der Ruckstande von Pflanzenschutzmitteln (PSM) in Boden gibt es neben dem Ansatz, den Gehalt durch direkte Extraktion mit geeigneten organischen Losungsmitteln zu ermitteln (z. B. [9-30]), die Moglichkeit der Bestimmung der Substanzen im wal3rigen Eluat. Die Erfassung dieses Anteils sol1Aufschliisse daruber ermoglichen, inwieweit eine Gefahrdung des Grundwassers oder von Oberflachengewassern durch Auswaschung von PSM gegeben ist. Die Bestimmung der Substanzen im Eluat wird auch dann zur Gefahrdungsabschatzung herangezogen, wenn bei direkter und somit wirkungsvollerer Extraktion der Boden Grenz- bzw. Schwellenwerte uberschritten werden. Da Phenylharnstoffe zu den thermisch labilen, schwerfluchtigen Verbindungen gehoren, lassen sie sich gaschromatographisch nur nach vorheriger Umsetzung, z. B. durch Abspaltung und Bestimmung des entsprechenden Anilins nach Derivatisierung, erfassen. Im folgenden wird eine Methode zur Bestimmung von Phenylharnstoffen in Bodeneluaten nach der DEV S4Methode per HPLC-UV beschrieben. Formeln der Phenylharnstoff-Herbizide Abb. 9-16 zeigt das Grundgerust der betrachteten Phenylharnstoff-Herbizide, die hinsichtlich der Substituenten R1 bis R4 in Tab. 9-1 naher charakterisiert sind. In Abb. 9-17 sind zwei weitere Vertreter der Harnstoff-Herbizide, Benzthiuzuron und Methubenzthiuzuron, dargestellt. SchlieBlich zeigt Abb. 9-18 den Wirkstoff Ethidimuron.

217

9.8 Bestimmung von Phenylharnstoff-Herbiziden in Eluaten aus Bodenproben

Abb. P 1 6 Grundgeriist der Phenylharnstoff-Herbizide.

fi @ ! - I / - SC - NR,

lH

CH3

J-A fi

N-C-N,

CzHs-

SO2

AH3

Abb. $17: Benzthiazuron (l-Benzothiazol-2-yl-lmethylhamstoff, R = H), Methabenzthiazuron (l-Benzothiazol-2-yl-l,3,-dimethylharnstoff, R = CH,).

B CH3

Abb. 9-18: Ethidimuron [1-(5-EthylsuIfonyl1,3,4-thiadiaz~l-2-yI)-1,3-dimethylharnstoffl.

'Rb. 9-1: Substitutionsmuster der Phenylharnstoff-Herbizide (Rl-R4: s. Abb. 9-16; *: siehe FuRnote). Substanz

R1

Chloroxuron: 3-[4-(4-Chlorphenoxy)-phenyl]- 4-Chlorphenyl 1,l-dimethylhamstoff Chlortoluron: 3-(3-Chlor-4-methylphenyl)CH3 1,l-dimethylhamstoff Dimefuron: 3-[4-(5-tert.-Butyl-2,3-dihydro- * 2-0~0-1,3,4-oxadiazol-3-yl-3-chlorphenyl]-l, 1dimethylhamstoff Diuron: 3-(3,CDichlorphenyl)c1 1,l-dimethylhamstoff Isoproturon: 3-(4-Isopropylphenyl)isopropyl 1,l-dimethylhamstoff Linuron: 3-(3,4-Dichlorphenyl)-l-methoxy- c1 1-methylhamstoff Metobromuron: 3-(4-Bromphenyl)-l-methoxy- Br 1-methylhamstoff Metoxuron: 3-(3-Chlor-4-methoxyphenyl)OCH3 1,l-dimethylharnstoff Monolinuron: 3-(4-Chlorphenyl)-l-methoxy- c1 1-methylhamstoff Monuron: 3-(CChlorphenyl)c1 1,l-dimethylharnstoff)

R2

R3

R4

H CI

c1 c1

CH3

H

CH3

a

OCH3

H

OCH3

CI

CH3

H

OCH3

H

CH3

Prinzip der Bestimmung Der zu untersuchende Boden wird unter definierten Bedingungen mit Wasser eluiert. Nach Abtrennung der ungelosten Bestandteile werden die Phenyl-

218

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

harnstoffe uber eine CI8-Kartuscheangereichert [9-31,9-321 und anschlieBend mit Acetonitril eluiert . Gegebenenfalls erfolgt eine Nachreinigung des Eluats uber eine Kieselgel-Kartusche. Das gereinigte Eluat wird zur Trockne eingeengt und nach Aufnahme im FlieBmittel per HPLC-UV (Mehrwellenlangendetektor) oder HPLC-DAD untersucht. Die hier vorgestellte Methode eignet sich fur die Routineanalytik. Die Quantifizierung erfolgt uber die Methode der externen Standardisierung.

Chemikalien und Hilfsmittel - Acetonitril, HPLC grade [T, F; R 11-23/24/25; S 16-27-44] - Dichlormethan, z. A. [Xn; R 40; S 23.2-24/25-36/37] - Dikaliumhydrogenphosphat, wasserfrei, z. A. - Dodecan, z. A. [Xi; R 36/37/38-40; S 25-37] - Natriumchlorid, z. A., gegluht - ortho-Phosphorsaure, 85 % zur Analyse [C; R 24; S 261 - Salzsaure, rauchend (37 %) [C; R 34-37; S 2-26] - Wasser, HPLC grade oder gleichwertig - Methanol, HPLC grade [F, T; R 11-23/25; S 2-7-16-241 - Stammlosungen der Phenylharnstoffe (1 pg/pL Methanol). Die Aufbewahrung erfolgt bei - 18 "C lichtgeschutzt. Die Haltbarkeit der Losungen ist begrenzt . - Schuttelmaschine (Horizontalschuttler) - Zentrifuge - Glasfritte D2 - SPE-System (z. B. Baker SPE-10, Fa. Baker, Holland) - 6 mL Bakerbond SPE Trennsaule Silicagel, 0,s g Sorbens - 6 mL Bakerbond SPE Trennsaule Octadecyl, 0,s g Sorbens - Membranfilter (0,45 pm) - Trockenschrank Arbeitsvorschrift a) Probenahme Bei der Probenahme ist darauf zu achten, daB von dem zu untersuchenden Material eine reprasentative Teilprobe erhalten wird. Die Lagerung erfolgt in geeigneten luftdicht schlieBenden BraunglasgefaBen unter Kuhlung (4 "C). b) Probenvorbereitung und -aufarbeitung Herstellung des Eluates [9-331: Bei der Herstellung des Eluates wird in der Regel auf die Zerkleinerung des Materials verzichtet. Vor Beginn der Elution ist von einer Teilprobe die Trockenmasse (Trocknungsverlust bei 105 "C) zu bestimmen. 50 g Trocken-

9.8 Bestimmung von Phenylharnstoff-Herbiziden in Eluaten aus Bodenproben

219

masse enthaltende Originalprobe wird in eine verschlieBbare Weithalsflasche oder einen Erlenmeyer-Kolben rnit Schliff (lo00 mL) eingewogen und rnit destilliertem Wasser versetzt, so d& die Gesamteinwaage 500 g betragt. Die Elution erfolgt bei Raumtemperatur fur 24 Stunden durch permanentes Schutteln auf der Schuttelmaschine. Danach wird der ungeloste Ruckstand durch Zentrifugieren oder Abfiltrieren (uber eine rnit Methanol gereinigte Glasfritte D 2) abgetrennt. Ein Nachwaschen des Filterkuchens ist nicht moglich. Das erhaltene Eluat sollte vollig klar sein und muB gegebenenfalls zusatzlich durch ein vorgewaschenes Membranfilter filtriert werden. Das Volumen des erhaltenen Eluats wird auf 10 mL genau bestimmt. Anreicherung und Reinigung des Eluats: 100 mL des Eluates werden rnit 0,2 mL konzentrierter Salzsaure, 0,l mL Methanol (zur Solvatisierung der Probe) sowie 30 g Natriumchlorid versetzt und anschlieflend homogenisiert. Zur Uberpriifung der matrixabhangigen Wiederfindungsrate konnen zudem 250 pL einer Losung eines Standards (z. B. Benzthiazuron, 2 pg/mL Methanol) dem Eluat zugesetzt werden. Die C18-Kartusche wird rnit 10 mL Methanol aktiviert und rnit 10 mL Wasser gewaschen. Im AnschluB daran wird die Probe uber die Kartusche gegeben (Durchfluflgeschwindigkeit: max. 2 mumin), die erneut rnit 10 mL Wasser nachgewaschen wird. Die Kartusche darf dabei zu keinem Zeitpunkt trockenlaufen. Nach AbschluB der Extraktion wird das Sorbens durch Durchsaugen von Luft (zur Vermeidung von Kontamination eine zweite Kartusche aufsetZen) oder im Stickstoffstrom getrocknet. Die Elution der Wirkstoffe erfolgt mit 20 mL Acetonitril in einem 25 mL Spitzkolben, in dem 100 pL Dodecan (1g in 50 mL Hexan) als Keeper vorgelegt sind. Eine Einwirkzeit des Acetonitrils von mindestens 15 Minuten sollte eingehalten werden. Das Eluat wird vorsichtig bis auf ca. 0,5 mL am Rotationsverdampfer eingeengt und danach mit Stickstoff zur Trockne abgeblasen. Der Ruckstand wird in 250 pL AcetonitriVWasser (25:75) aufgenommen. Die so erhaltene Liisung kann in der Regel zur HPLC-UV Bestimmung eingesetzt werden. 1st eine weitere Reinigung des Eluates (z. B. wegen starker Farbung) erforderlich, wird das Eluat statt im FlieSmittel in 500 pL Dichlormethan aufgenommen und auf eine zuvor konditionierte Kieselgel-Kartusche gegeben. Die Konditionierung erfolgt rnit 10 mL Ethylacetat und 10 mL Dichlormethan. Nach der Probenaufgabe wird mit 500 1 L Dichlormethan nachgewaschen. Folgende Fraktionen werden in einem 25 mL-Spitzkolben aufgefangen: Fraktion I: 4 mL Dichlormethan/Ethylacetat, 95 :5 Fraktion 11: 4 mL Ethylacetat. Die Fraktion I enthalt Linuron, Monolinuron sowie Metobromuron und kann bei speziellen Fragestellungen gesondert untersucht werden. In der Regel werden beide Fraktionen vereinigt, erneut zur Trockne eingeengt und, wie oben beschrieben, in 250 pl Flieflmittelgemisch aufgenommen.

220

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

c) Gerate und chromatographische Parameter HPLC-System: Niederdruck-Gradientenanlage, z. B. Flussigkeitschromatograph Hewlett Packard 1050 mit UV-Detektor Hewlett Packard 1050 (Hewlett Packard, Avondale, USA), Einspritzventil Rheodyne 7125 (Rheodyne, Berkeley, USA) mit 20-pL-Probenschleife. Saule: Edelstahlsaule (125 mm x 4 mm i. D.) mit geeignetem RP-Material (z. B. LiChrospher GORP-select-B, Fa. Merck, Darmstadt), PartikelgroBe 5 pm. Der Einsatz einer Vorsaule (4 mm x 4 mm i. D.) ist unbedingt angezeigt. FlieSmit tel : A. Acetonitril. Acetonitril ist trotz seiner Toxizitat aufgrund der hoheren optischen Durchlassigkeit und der geringeren Viskositat Methanol vonuziehen. B. Dikaliumhydrogenphosphat-Puffer (0,005 M) rnit konzentrierter Phosphorsaure auf pH 4,5 eingestellt Gradient: Omin: 10% A 2min: 10% A 30min: 65% A Laufzeit: 30 min Flufirate : 1,0 mUmin Wellenlangeneinstellung:220 nm, 245 nm, 280 nm Detektor: Injektionsvolumen: 20 pL uber eine entsprechende Rheodyne-Probenschleife Ergebnisse und Diskussion Abb. 9-19 zeigt das HPLC-UV Chromatogramm einer dotierten Bodenprobe bei der Wellenlange 245 nm. Monolinuron und Isoproturon werden unter den gewahlten Bedingungen chromatographisch nur angetrennt. Eine sichere Zuordnung ist nur mittels DAD uber einen Spektrenvergleich moglich. Kalibrierung Die Quantifizierung erfolgt uber eine externe Standardisierung (Kalibriergerade). Dazu wird eine Verdunnungsreihe mit mindestens drei Konzentrationen ab 500 ng/pL eingesetzt. Als Losungsmittel wird AcetodWasser (25/75) verwendet. Die Kalibriergerade wird uber die vom Integrator ermittelten Peakflachen oder Peakhohen bei allen drei Wellenlangen berechnet. Zu jeder Analysenserie sind Blindwerte anzufertigen und gegebenenfalls von den MeBwerten abzuziehen. Daneben ist die Wiederfindungsrate durch das Standardadditionsverfahren matrixbezogen zu uberprufen (z. B. durch Zugabe von Benzthiazuron) . Die Absicherung positiver Ergebnisse erfolgt durch Auswertung bei verschiedenen Wellenlangen und nachfolgender Plausibilitatspru-

9.8 Bestimmung von Phenylharnstoff-Herbizidenin Eluaten aus Bodenproben

ir

2

1

a

il 4u

10

221

415

3

1 7

1 20

30 Zeit [min]

Abb. 9-19:HPLC-UV-Chromatogramm einer dotierten Bodenprobe (40 p@kgje Substanz) bei der Wellenlgnge 245 nm. 1: Metoxuron, 2: Monuron, 3: Chlortoluron, 415: MonolinuronIIsoproturon, 6: Diuron, 7: Metobromuron, 8: Dimefuron, 9: Lmuron, 10: Chloroxuron.

fung. Bei Verwendung eines DAD wird neben der Retentionszeit auch das UV-Spektrum zur Identifiiierung herangezogen. Im Zweifel kann eine Aufstockung des Extraktes mit der betreffenden Substanz im ermittelten Konzentrationsbereich durchgefuhrt werden.

Validierung Die Aufarbeitungsmethode wurde im Rahmen eines orientierenden Ringversuchs zur Bestimmung von Pflanzenschutzmitteln in Wasser anhand von Isoproturon und Diuron erprobt. Die Wiederfindungsraten lagen bei einer Dotierung im Bereich von 1 pg/L f i r Diuron bei 97 %, fur Isoproturon bei 77 % Der Variationskoeffizient einer Funffachbestimmung lag fur Diuron bei 6,s% .

.

Alternativmethoden Aufgrund des schwerfliichtigen, thermolabilen Charakters der Phenylharnstoff-Herbizide setzt eine gaschromatographische Bestimmung eine Derivatisierung voraus. Geeignet ist der Einsatz von Heptafluorbuttersaureanhydrid als Acylierungsreagenz [9-341. Dabei werden die Substanzen in stabile, gaschromatographierbare Derivate iiberfiihrt, die durch die Einfiihrung der

222

9 HPLC-Applikationenaus dem Umweltbereich

Fluorsubstituenten per Elektroneneinfangdetektor sensitiv und selektiv nachweisbar sind. Neben der direkten Derivatisierung der Harnstoffe gibt es die Moglichkeit , die entsprechenden Aniline nach Abspaltung (Kochen mit Natronlauge) umzusetzen. Da jedoch verschiedene Phenylharnstoffe das gleiche Anilin abspalten konnen (z. B. Diuron und Linuron), lassen sie sich nach dieser Methode nicht unterscheiden.

9.9 Bestimmung von 16 polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAH) nach USEPA in Bodenproben Problemstellung Als ubiquitaren Umweltschadstoffen kommt den PAH aufgrund ihres kanzerogenen bzw. mutagenen Potentials besondere Aufmerksamkeit zu. Um die Belastung einer Probe mit dieser Substanzklasse weitreichend zu beschreiben, werden zumeist 16 von der US Umweltbehorde EPA (USEPA) festgelegte Einzelverbindungen in der Matrix bestimmt. Besonders hohe Gehalte dieser Verbindungen, die Produkte eines unvollstandigen Verbrennungsvorgangs sind, lassen sich in Boden ehemaliger Industriestandorte (z. B. Kokereien, Gaswerke, Teerverarbeitung) finden. Verbindliche Beurteilungsgrundlagen oder gar Grenzwerte fehlen bisher fast vollig. Lediglich in den Niederlanden gibt es in der sogenannten HollandListe orientierende Werte [9-351. Mittlerweile hat auch das baden-wurttembergische Umweltministerium per ErlaB PAH-Grenzwerte fur Boden festgelegt [9-361. Fur die Bestimmung der PAH in Boden bietet sich aufgrund einer hohen Spezifitat und Empfindlichkeit die HPLC-FLD an [9-37,9-381. Bei der Analyse von Bodenproben besitzt gerade die Spezifitat eine grol3e Bedeutung, da eine Vielzahl storender Begleitstoffe im Extraktionsschritt miterfafit und im Verlauf des clean-ups nur teilweise abgetrennt werden. Formeln der PAH Abb. 9-20 zeigt die Strukturfomeln der 16 PAH nach USEPA. Prinzip der Bestimmung Die Bestimmung der PAH erfolgt in Anlehnung an die von der Landesanstalt fur Umweltschutz (Baden-Wurttemberg) veroffentlichte Richtlinie [9-391. Dazu werden die PAH aus der feldfrischen Bodenprobe durch flussig/flussigExtraktion mit einem AcetodCyclohexan-Gemisch extrahiert. Das Aceton wird durch Ausschutteln mit Wasser entfernt, wobei die PAH in der organi-

9.9 Bestimmung von 16 polycyclischenaromatischen Kohlenwasserstoffen

5

4

Naphthalin

6

5

5

6

Acenaphtylen

Phenanthren

223

4

5

Acenaphten

Anthracen

000

9H-Fluoren

Fluoranthen*

00 .. 6

Benz [a1anthracen (1,l-Benzanthracen)

Benzo [blfluoranthen*

Indemo [l,2,3 -cdlpyren*

Benzo [kl fluoranthen*

Dibanzo [ah1anthracen

&Sei

B-ZO

tal pyren*

B-20

tghil perylen'

Abb. 9-20: 16 PAH nach EPA-Standard 610 (* 6 PAH nach der deutschen Trinkwasserverordnung TVO von 1986).

schen Phase verbleiben. Bei starker verunreinigten Proben wird gegebenenfalls ein clean-up-Schritt (Kieselgelsaule) durchgefiihrt. Der erhaltene Extrakt wird zur Trockne eingeengt und in einem geeigneten Losungsmittel aufgenommen. Die Bestimmung erfolgt per HPLC-FLD nach der Methode

224

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

der externen Standardisierung. Sol1 der Gehalt an Acenaphthylen ermittelt werden, so ist zusatzlich ein UV-Detektor notwendig, da Acenaphthylen nicht fluoreszenzaktiv ist. Chemikalien und Hilfsmittel Aceton, z. A. [F; R 11; S 9-16-29.9-331 - Acetonitril, HPLC grade [T, F; F 11-23/24/25; S 16-27-44] - Cyclohexan, z. A. [F; R 11; S 9-16-33] - Dichlormethan, z. A. [Xn; R 40; S 29.9-24/25-36/37] - n-Hexan, z. A. [Xn, F; R 11-20-48; S 9-16-24/25-29-51] - Natriumchlorid, z. A., gegluht - Natriumsulfat, wasserfrei, z. A., gegluht - Wasser, HPLC grade oder gleichwertig - Vergleichssubstanzen der 16 EPA-PAH zur Identifizierung und Kalibrierung, gegebenenfalls als im Handel erhaltliche Mischlosung - Membranfilter (0,45pm) - silanisierte Glaswolle - Schuttelmaschine - SPE-System (z. B. Baker SPE-10, Fa. Baker, Holland) - 6 mL Bakerbond SPE Trennsaule Kieselgel, 0,5 g Sorbens -

Arbeitsvorschrift a) Probenahme Die Probenahme sollte in BraunglasgefaSen erfolgen, da bei Lichteinstrahlung sonst eine Photoumwandlung der PAH stattfindet. Bei Verwendung von KunststoffgefaSen wurde eine Adsorption der Verbindungen an den GefaSwandungen eintreten. Bei der Beprobung ist auf eine reprasentative Probenahme zu achten. b) Probenvorbereitung und -aufarbeitung

Da die Gehalte auf die Trockenmasse (TS) bezogen werden mussen, werden vor Beginn der eigentlichen Analyse 10 g Probe zur Bestimmung des TSGehaltes in einer Porzellanschale bei 105 "C im Trockenschrank bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. 5 g der ungetrockneten, homogenisierten Probe werden in einem 250 mL Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 50 mL Aceton und Cyclohexan versetzt und bei Raumtemperatur fur 30 Minuten auf der Schuttelmaschine geschuttelt. Nach Filtration der Aufschlammung in einen 250 mL Scheidetrichter und Nachwaschen des Riickstandes mit Cyclohexan wird die organische Phase mit 100 mL Wasser gewaschen. Dabei gehen polare Begleitstoffe und Aceton in die wal3rige Phase uber. Eventuell auftretende Emulsionen lassen sich durch Aussalzen (NaCl, fest oder als gesattigte

9.9 Bestimmung von 16 polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen

225

Losung) beseitigen. Die organische Phase wird abgetrennt, uber 10 g Natriumsulfat getrocknet, uber silanisierte Glaswolle in einen 100 mL Spitzkolben filtriert und am Rotationsverdampfer (40"C, 190 hPa) auf 1 mL eingeengt. Da auch die leichtfluchtigen PAH mitbestimmt werden sollen, ist unbedingt darauf zu achten, daS der Extrakt keinesfalls zur Trockne eingeengt wird. Je nach PAH-Gehalt und matrixspezifischen Begleitstoffen kann eine weitere Aufreinigung des Extraktes erforderlich sein. Hierzu wird eine Kieselgel-Kartusche mit jeweils 4 mL n-HexadDichlormethan (1/1) und n-Hexan konditioniert. Nach Aufgabe des eingeengten Extraktes erfolgt eine Elution rnit 6 mL n-HexanDichlormethan (1/1) in einen 10 mL Spitzkolben. Das Eluat wird am Rotationsverdampfer (40"C, 270 hPa) auf 1 mL eingeengt. Durch Zugabe von Acetonitril und Abblasen des Lijsungsmittels (keinesfalls zur Trockne) wird ein Losungsmitteltausch, der fur die HPLC-Bestimmung notwendig ist, durchgefuhrt. Das Extraktvolumen wird mit Acetonitril auf 1 mL aufgefullt. Gegebenenfalls wird der Extrakt vor der Injektion noch durch ein Membranfilter (0,45 pm) filtriert.

c) Geriite und chromatographische Parameter HPLC-System: Niederdruckgradientenanlage rnit FLD, z. B . Flussigkeitschromatograph Hewlett Packard 1050 rnit Fluoreszenzdetektor Hewlett Packard 1046 A (Hewlett Packard, Avondale, USA), Einspritzventil Rheodyne 7125 (Rheodyne, Berkeley, USA) mit 20-pL-Probenschleife. Saule: Edelstahlsaule (250 mm x 4,6 mm i. D.) rnit RP-Material, Partikelgroae 5 p m (z. B. Bakerbond OctadecylPAH, Fa. Baker, Deventer, Holland). Der Einsatz einer Vorsaule ist angezeigt. Flieamittel : A. Acetonitril B. Wasser Gradient: Omin: 55% A 5min: 55% A 35 min: 100% A 42min: 100% A Aquilibrierung: 10 min bei Anfangsbedingungen 42 min Laufieit : Fluhate: 1,2 mUmin Saulentemperatur: 23 "C Da die Zeitintervalle zur Ausfiihrung der Wellenlangenschaltung stark von der temperaturabhangigen chromatographischen Trennung beeinfluat werden, sollte die Saule unbedingt thermostatisiert werden. Detektor : FLD .

226

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

In einem in der Routineanalytik praktikablen Programm zur Schaltung der Anregungs- und Emissionswellenlangen sollten moglichst wenige Schaltschritte enthalten sein. Daher werden die Verbindungen in Gruppen zusammengefaSt und nicht immer bei der idealen Kombination bestimmt. Dadurch werden die Einflusse von auftretenden Retentionszeitverschiebungen oder Matrixeinflussen minimiert. Folgende Gruppen werden gebildet :

1. Naphthalin, Acenaphthen, Fluoren Anregungswellenlange: 270 nm Emissionswellenlange: 330 nm Verstarkungsfaktor: 10 (Naphthalin: 11) 2. Phenanthren, Anthracen, Fluoranthen, Pyren Anregungswellenlange: 260 nm Emissionswellenlange: 420 nm Verstarkungsfaktor: 11 (Phenanthren: 13) 3. Benzo[a]anthracen, Chrysen Anregungswellenlange: 270 nm Emissionswellenlange: 420 nm Verstarkungsfaktor: 10 4. Benzo[b]fluoranthen, Benzo[k]fluoranthen, Benzo[a]pyren Anregungswellenlange: 284 nm Emissionswellenlange: 410 nm Verstarkungsfaktor: 8 (Benzo[b]fluoranthen: 10) 5. Dibenzo[ah]anthracen, Benzo[ghi]perylen, Indeno[ 1,2,3-cd]pyren Anregungswellenlange: 300 nm Emissionswellenlange: 500 nm Verstarkungsfaktor: 14 (Indeno[ 1,2,3-cd]pyren: 12) Die Detektion von Acenaphthylen als nicht fluoreszenzaktiver Substanz mu0 mittels UV-Detektor bei 254 nm erfolgen. Injektionsvolumen: 20 pL

Ergebnisse und Diskussion Abb. 9-21 zeigt das HPLC-FLD Chromatogramm einer im Bereich von 0,l mg/kg mit 15 PAH dotierten Bodenprobe. Die fur die leichtfluchtigen PAH Naphthalin, Acenaphthylen und Acenaphthen gefundenen Analysenwerte mussen genauestens gepruft und bewertet werden, da aufgrund der hohen Fluchtigkeit dieser Verbindungen in Verbindung mit einer aufwendigen Extraktreinigung hohere Ergebnisschwankungen auftreten konnen. Geringe Anderungen des chromatographischen Systems, u. a. des eingesetzten Saulenmaterials, beeinflussen die Trennung, so daS es erforderlich ist,

9.9 Bestimmung von 16 polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen

227

8

3

11 12

'0

15

II 14

9

13

L

I

10

20

n

40

30

Zeit [min]

Abb. 9-21: HPLC-FLD-Chromatogrammeiner im Bereich von 0,l mgkg mit 15 PAH dotierten Bodenprobe. 1: Naphthalin, 2: Acenaphthen, 3: Fluoren, 4: Phenanthren, 5: Anthracen, 6: Fluoranthen, 7: Pyren, 8: Benzo[a]anthracen, 9: Chrysen, 10: Benzo[b]fluoranthen, 11: Benzo[k]fluoranthen, 12: Benzo[a]pyren, 13: Dibenzo[ah]anthracen, 1 4 Benzo[ghi]perylen, 15: Indeno[l,2,3cdlpyren.

den Gradienten und die Zeiten fiir die Wellenlhgenschaltung den eigenen Bedingungen anzupassen.

Kalibrierung Die Quantifizierung erfolgt uber eine externe Standardisierung (Kalibriergerade) . Dazu wird eine Verdunnungsreihe mit fiinf Konzentrationen (10-100 pg/pL) mit Hilfe eines Mischstandards der PAH eingesetzt. Die Kalibriergerade wird iiber die vom Integrator berechneten Peakflachen oder Peakhohen ermittelt. Die Wellenlangenschaltung bei der Detektion fiihrt zu Spriingen in der Detektorgrundlinie, so daS die vom Integrator gelieferten Hohen- und Flachenwerte stets auf korrekte Integrationsparameter (Basislinie, Peakanfang, Peakende) uberpriift werden mussen. Im Routinebetrieb ist es ausreichend, die Kalibrierung in regelmaaigen Abstanden anhand einzelner Standardlosungen zu uberpriifen und nur bei Bedarf neu durchzufiihren. Probenextrakte und Standardlosungen mussen unbedingt im gleichen Liisungsmittel gelost sein, da sonst eine Beeinflussung der Retentionszeiten

228

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

auftritt. Den groaten EinfluB haben die Reste an unpolaren Losungsmitteln (n-Hexan, Cyclohexan) aus der Probenvorbereitung. Bereits ein Volumenprozent beeinflufit die Chromatographie (Retentionszeiten) in dem MaBe, daB die Wellenlangenschaltung angepal3t werden muB. Hohere Anteile fuhren schlieBlich zu Peaksplitting. Da es bei bestimmten Probenmatrices vorkommen kann, daB das Signal eines verwendeten internen Standards stark durch Matrixkomponenten gestort wird, ist es sinnvoll, die Quantifizierung rnit einem externen Standard vorzunehmen.

Validierung Die Detektornachweisgrenze dieser Methode liegt substanzabhangig im Bereich von 5-10 pg/pL. Die Wiederfindungsraten liegen fur die 16 PAH im Bereich von 80-100 % . Sie sind bei den leichtfluchtigen Vertretern jedoch in groBem MaBe von der Art der Aufreinigung abhangig. Alternativmethoden Neben verschiedenen Variationen des Extraktionsschrittes hinsichtlich Methodik (z. B. Soxhletextraktion) und eingesetztem Losungmittel (z. B. nHexan) kann die Bestimmung der PAH im Extrakt auch gaschromatographisch erfolgen. Fur hohere Konzentrationen findet vielfach der Flammenionisationsdetektor Anwendung [9-401. Wesentlich eleganter und sicherer lassen sich die PAH jedoch mittels massenselektivem Detektor (MSD) bestimmen [9-411. Die erreichbaren Nachweisgrenzen liegen hier im pg/kg-Bereich, wenn die Quantifizierung auf den fur die einzelnen Substanzen charakteristischen Massen erfolgt. Fur die Extraktion wird seit kurzem auch die Extraktion mit uberkritischem Kohlendioxid eingesetzt (SFE). Das Kohlendioxid wird dazu mit 3 % Methanol modifiziert. Die Extraktionsausbeuten sind dabei durchaus mit denen der oben beschriebenen Methode vergleichbar, lediglich die hoherkondensierten PAH ergeben geringfiigig schlechtere Wiederfindungsraten [9-351.

9.10 Bestimmung von Aldehyden und Ketonen in Dieselmotoremissionen Problemstellung Aldehyde und Ketone entstehen als Zwischenprodukte bei der unvollstandigen Verbrennung von Kraftstoffen auf dem Weg zur vollstandigen Oxidation zu Wasser und Kohlendioxid. Die Verbindungen haben groDtenteils schleimhautreizende Eigenschaften und sind uberdies in Gegenwart von Stickoxiden

9.10 Bestimmung von Aldehyden und Ketonen in Dieselmotoremissionen

229

durch Bildung von Photooxidantien am sogenannten durch Ozon bestimmten photochemischen Smog beteiligt. Die Aldehydkomponenten im Abgas eines Dieselmotors sollen nach jiingeren Untersuchungen fiir mehr als 40% des Ozonbildungspotentials der gesamten Dieselemission verantwortlich sein. Die Bestimmung des Gehalts an Carbonylverbindungen steht daher unter dem Aspekt der Luftreinhaltung verstarkt im Blickpunkt.

Reaktionsgleichung zur Bildung der DNPH-Derivate In Abb. 9-22ist der Reaktionsweg von Acetaldehyd zum entsprechenden Dinitrophenylhydrazon schematisch dargestellt.

Abb. 9-22: Reaktionsschema der Derivatisierung von Acetaldehyd mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin zum 2,4-Dinitrophenylhydrazon.

Prinzip der Bestimmung Beschrieben wird eine Applikation zur Bestimmung der folgenden Carbonylverbindungen: Formaldehyd, Acetaldehyd, Aceton, Acrolein, Propionaldehyd, Crotonaldehyd, Butanon, Isobutyraldehyd, Benzaldehyd, Hexanaldehyd. Die Substanzen, die alle gasformig im Abgas vorliegen, werden durch Einleiten eines Abgasteilstroms in eine Absorptionslosung fixiert und gleichzeitig derivatisiert. Die Bestimmung kann ohne grol3en Aufwand direkt aus der Absorptionslosung per HPLC-UV erfolgen [9-42,9-43]. Cbemikalien und Hilfsmittel Acetonitril, HPLC grade [F, T; R 11-23124125;S 16-27-44] 2,4-Dinitrophenylhydrazin[T; R 23/24/25;S 441 Ethanol, z. A. [F; R 11; S 7-16] Methanol, z. A. [F, T; R 11-23/25;S 2-7-16-241 Salzsaure, 1 N [Xi; R 36/38;S 2-28] Schwefelsaure, konz. [C; R 35;S 2-26-30] Tetrahydrofuran [F,Xi;R 11-19-36-37; S 16-29-33] Gaswaschflaschen Membranfilter (0,45pm) Arbeitsvorschrift a) Probenahme Ein Abgasteilstrom (siehe Kapitel 9.11,Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen in Dieselmotoremissionen) wird uber eine

230

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

beheizte Leitung durch zwei hintereinander geschaltete Gaswaschflaschen mit Absorptionslosung geleitet. Als Absorptionslosung dient eine schwach saure Losung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) in Acetonitril. Zur Herstellung dieser Liisung werden pro Waschflasche 60 mg DNPH (zur Reinigung aus Methanol umkristallisiert) in 40 mL Acetonitril gelost und rnit 0,5 mL 1 N Salzsaure versetzt. Da die Bestimmung der Carbonylverbindungen nach Derivatisierung sehr empfindlich verlauft (Nachweisgrenze < 1 g/ m3), sind unbedingt Mafinahmen zu treffen, die einer Kontamination der Absorptionslosung aus der Umgebungsluft entgegenwirken. Vor allem in Laboratorien besteht die Gefahr einer Verunreinigung durch als Losungsmittel verwendetes Aceton. b) Probenvorbereitung und -aufarbeitung Eine Probenaufbereitung ist aufgrund der selektiven Derivatisierung nicht erforderlich. Die gebildeten 2,4-Dinitrophenylhydrazone absorbieren bei einer charakteristischen Wellenlange von 365 nm, bei der keine nennenswerten Storungen durch ebenfalls in der Absorptionslosung aufgefangene Begleitsubstanzen beobachtet werden. Vor der Messung ist lediglich die Zugabe eines internen Standards erforderlich. Hierzu eignet sich das DNPHDerivat des nicht als Verbrennungsprodukt entstehenden Cyclohexanons. Die Absorptionslosung wird dann direkt mittels HPLC-UV analysiert. Zur Kalibrierung ist die Darstellung von derivatisierten Standardverbindungen notwendig, die nach folgender Vorschrift erfolgen kann [9-441: Fur die frisch herzustellende Derivatisierungslosung werden 0,4g DNPH in 2 mL konzentrierter Schwefelsaure und 3 mL Wasser (Ruhren!) gelost. Die warme Losung wird mit 10 mL Ethanol (95 %) versetzt. Unter starkem Ruhren erfolgt die Zugabe von 1 mL der entsprechenden Carbonylverbindung als 20% ige ethanolische k s u n g . Die ausgefallenen 2,4-Diphenylhydrazone werden abgesaugt, mit Wasser gewaschen, abschliefiend aus einem geeigneten Losungsmittel (z. B. Ethanol) umkristallisiert und getrocknet. Gegebenenfalls kann die Reinheit mittels HPLC-DAD uberpruft werden. Daneben sind zudem fertige Mischungen von Carbonylderivaten definierter Konzentration in Losung kommerziell erhaltlich. Unsymmetrische Carbonylverbindungen ergeben nach der Derivatisierung zwei Stereoisomere in syn- bzw. anti-Stellung (z. B. Butanon: CH3-COCH, -CH3). Gaschromatographisch kann aufgrund der hoheren Trennstufenzahl eine Auftrennung der Isomere erreicht werden. Bei Emissionsmessungen, bei denen lediglich der Gehalt der Ausgangscarbonylverbindung im Abgas interessiert, reicht dagegen die Trennscharfe des HPLC-Systems aus. In der Regel wird hier keine Aufspaltung in zwei Signale beobachtet. Unter den in der Applikation beschriebenen chromatographischen Bedingungen erscheinen nur die Butanon-Derivate mit zwei isolierten Peaks, von denen

9.10 Bestimmung von Aldehyden und Ketonen in Dieselmotoremissionen

231

einer als Schulter des Crotonaldehyd-DNPH-Peaks auftritt. Bei der Quantifizierung mussen diese Effekte, die sich bei Verwendung eines anderen HPLCSystems in unterschiedlicher Weise bemerkbar machen konnen, unbedingt beriicksichtigt werden.

c) Geriite und chromatographische Parameter Niederdruckgradientenanlage, z. B. FliissigkeitschromaHPLC-System: tograph Hewlett Packard 1084 mit UV-Detektor Hewlett Packard 1050 (Hewlett Packard, Avondale, USA), Einspritzventil Rheodyne 7125 (Rheodyne, Berkeley, US) mit 20-pL-Probenschleife. Edelstahlsaule (150 mm x 3,9 mm i. D.) mit Resolve 5 Saule: Spherical CI8(Fa. Waters), PartikelgroSe: 5 pm Saulentemperatur: 28 "C FlieBmittel: A. Wasser mit 15% THF B. Acetonitril Gradient: 0 min: 68% A 10 min: 68% A 18 min: 40% A 24 min: 20% A 68% A 27 min: 30 min Laufzeit : FluBrate: 1,2 mUmin Detektor: Wellenlangeneinstellung: 365 nm Injektionsvolumen: 20 pL Ergebnisse und Diskussion Abb. 9-23 zeigt das HPLC-UV Chromatogramm einer entsprechend der Applikation aufgearbeiteten Abgasprobe (Kraftstoff Rapsolmethylester). Kalibrierung Die Quantifizierung erfolgt nach der Methode der internen Standardisierung, wobei Cyclohexanon als interner Standard bereits als DNPH-Derivat der Absorptionslosung zugesetzt wird. Die Kalibriergerade sollte mindestens funf Kalibrierpunkte umfassen. Die Auswertung erfolgt uber die bei 365 nm erhaltenen Peakflachen. Validierung Als MaB fur die Wiederholgenauigkeit des HPLC-Schritts wird eine substanzspezifische relative Standardabweichung von 3,0-11,3 % erreicht . Die Erfassung der Aldehyde aus der Luft kann als quantitativ angesehen weden, wenn bei der Untersuchung von Kontrollabsorptionslosungen, die hinter die eigentlichen Absorptionslosungen geschaltet werden, keine meBbaren Mengen an

232

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

10

2

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Zeit [min]

Abb. 9-23: HPLC-UV-Chromatogramm eines realen Rapsolmethylester-Abgases nach Umsetzung zu Carbonyl-DNPH-Derivaten. 1: Formaldehyd, 2: Acetaldehyd, 3: Aceton, 4: Acrolein, 5: Propionaldehyd, 6: Crotonaldehyd, 7: Butanon, 8: Isobutyraldehyd,9: Benzaldehyd, 11: Hexanaldehyd, (10: Cyclohexanon - interner Standard).

DNPH-Derivaten feststellbar sind. Blindwerte stellen bei Verwendung von hochreinen HPLC-Liisungsmitteln kein Problem dar. Im Labor sollte allerdings unbedingt auf die Abwesenheit von Aldehyden geachtet werden. Schon die Anwesenheit von Acetonflaschen in der Nahe fuhrt zu merkbaren Kontaminationen.

Alternativmethoden Zur Bestimmung der Aldehyde ist eine weitere Derivatisierungsreaktion moglich, die mit der Absorption der Aldehyde in einer Liisung von 3-Methyl2-benzothiazolon (MBTH) arbeitet [9-451. Gegenuber dieser, in der VDIRichtlinie 2449, Blatt 1, festgelegten Bestimmungsmethode bietet das hier vorgestellte Verfahren erhebliche Vorteile. Zum einen werden durch MBTH lediglich C1-C3-Aldehydeund keine Ketone erfaBt. Zum anderen besteht eine

9.11 Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen

233

ausgepragte Querempfindlichkeitvon MBTH gegenuber dem S02-Gehaltdes Abgases. Die hier vorgestellte Methode gilt somit als Methode der Wahl. Beschrieben wird weiterhin eine Methode, die mit der Derivatisierung zu 2,4Dinitrophenylhydrazonen auf einem Sorbens (Vorsaulenderivatisierung) und nachfolgender Elution arbeitet [9-461.

9.ll Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAH) in Dieselmotoremissionen Problemstellung Als Produkte einer unvollstandigen Verbrennung kommen polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAH) in Dieselmotoremissionen vor. Sie breiten sich uber den Luftpfad in der Okosphare aus, wobei sie groBtenteils an DieselruBpartikel adsorbiert sind. Wie der DieselruB an sich, werden auch einzelne PAH als kanzerogen angesehen. Die Bestimmung dieser Verbindungsklasse in Abgasen von Verbrennungsmotoren ist daher zur Gefahrdungsabschatzung von groBem Interesse. Formeln der PAH In der folgenden Applikation wurden die folgenden 10 Substanzen berucksichtigt: Fluoranthen, Pyren, Benzo[a]anthracen, Chrysen, Benzo[b]fluoranthen, Benzo[k]fluoranthen, Benzo[a]pyren, Dibenz[ah]anthracen, Benzo[ghi]perylen, Indeno[1,2,3-cd]pyren. Die Strukturformeln dieser Verbindungen sind dem Kapitel 9.9 (Bestimmung von 16 polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen nach USEPA in Bodenproben) zu entnehmen.

Prinzip der Bestimmung Bestimmt werden PAH mit mehr als drei kondensierten Ringen, da leichtere Homologe als nicht kanzerogen angesehen werden konnen. Die hoher kondensierten PAH liegen uberwiegend an RuBpartikel adsorbiert vor und lassen sich somit durch einen Filter aus dem Abgasstrom isolieren. Nach dem Ablosen vom Filter werden polare Begleitsubstanzen durch eine Kieselgel-Kartusche, aliphatische Kohlenwasserstoffe dunnschichtchromatographisch an einer Umkehrphase aus dem Extrakt abgetrennt. Die Quantifizierung erfolgt mittels HPLC-FLD nach der Methode der internen Standardisierung. Je nach erwarteter Konzentration sind auch ein UV- oder ein PhotodiodenarrayDetektor einsetzbar. Letzterer ermoglicht zusatzlich eine sichere Identifizierung der Substanzen uber ihr UV-Spektrum [9-421.

234

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

Chemikalien und Hilfsmittel - Acetonitril, HPLC grade [F, T; R 11-23/24/25; S 16-27-44] - Cyclohexan, z. A. [F; R 11; S 9-16-33] - Dichlormethan, z. A. [Xn; R 20; S 241 - Hexan, z. A. [F, Xn; R 11-20-48; S 9-16-24/25-29-51] - Natriumsulfat wasserfrei, z. A., gegluht - Toluol, z. A. [F, Xn; R 11-20; S 16-25-29-331 - EPA-PAH Standard - SPE-System (z. B. Baker SPE-10, Fa. Baker, Holland) - 6 mL Bakerbond SPE Trennsaule Silicagel, 0,5 g Sorbens - Glasfaserfilter - Kieselgel-Kartusche - DC-Fertigplatte (RP- 18-Material auf Glasplatte) - DC-Entwicklungskammer - UV-Lampe (Wellenlangen 254 nm und 366 nm) - Membranfilter (0,45 pm) Arbeitsvorschrit't

a) Probenahme Durch geeignete Probenahmevorrichtungen (Abb. 9-24) wird ein reprasentativer Teilvolumenstrom des Abgases entnommen und nach Abkuhlung auf ca. 35 "C durch einen teflonbeschichteten Glasfaserfilter (70 mm Durchmesser) geleitet. Da vor der drastischen Abkiihlung PAH nicht nur an RuBpartikel adsorbiert sind, sondern sich auch in der Gasphase befinden, schlagen sich bis zu 30 % der PAH auch an der Kuhlerinnenwand nieder bzw. sind im gebildeten Kondensat enthalten. Daher ist eine Kuhlerspulung erforderlich, die am besten mit Acetonitril erfolgen sollte. Die Losung der Kuhlerspulung und das Kondensat werden ebenso wie der Glasfaserfilter aufgearbeitet .

b) Probenvorbereitung und -aufarbeitung Da PAH zu den lichtempfindlichen Verbindungen gehoren, ist wtihrend des gesamten Clean-up-Verfahrens auf maximal moglichen LichtausschluD zu achten. Die Verwendung von Braunglasgeraten ist angezeigt. Zur Extraktion der PAH wird der Glasfaserfilter in einem 250 mL Rundkolben mit 160 mL Toluol versetzt. Das PAH enthaltende Gemisch aus Kuhlerspulung und Kondensat wird am Rotationsverdampfer (35 "C, verminderter Druck) auf 10 mL eingeengt und anschlieBend ebenfalls in den 250 mL Rundkolben uberfuhrt. Der Zusatz von 5 g Natriumsulfat sol1 eventuell vorhandenes Restwasser binden. Die Losung wird 90 min unter RiickfluB gekocht, anschlieBend der Filter aus der noch heiBen Losung entfernt. Um eine Quantifizierung nach der Methode der internen Standardisierung durch-

9.11 Bestimmung von polycyclischenaromatischen Kohlenwasserstoffen

235

Absaugung

7

-

Kiihlwasser

Glaskuhler Kiihlwasser : -

Kondensat

Probennahme (konstanteFlufirate)

Abb. 9-24: Schematische Darstellung der Abgasprobenahmesysteme bei Ackerschleppern: oben: Vollstrom-Methode; unten: Verdiinnungstunnel-Methode.

fuhren zu konnen, erfolgt der Zusatz einer entsprechenden Liisung von pQuaterphenyl. Der Extrakt wird am Rotationsverdampfer auf 100 pL, nach Zugabe von ca. 2 mL Cyclohexan erneut auf 100 pL eingeengt. Das Konzentrat wird auf eine mit 15 mL Elutionsgemisch (n-Hexan/Dichlormethan, 751 25) konditionierte Kieselgel-Kartusche uberfiihrt. Durch Elution mit 13 mL Losungsmittelgemisch werden aliphatische Kohlenwasserstoffe und PAH von polaren Substanzen abgetrennt. Trotz Retardation des uberwiegenden Anteils farbiger Komponenten auf dem Kieselgel enthalt das Eluat weitere bei der

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9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

Detektion storende Verbindungen (u. a. langkettige n- und iso-Alkane), so daB weitere Clean-up-Schritte notwendig sind. Das auf ca. 20 pL eingeengte Eluat der Festphasenextraktion wird daher dunnschichtchromatographisch weiter aufgereinigt, wobei die Trennung an RP-18-Material erfolgt (Laufstrecke: 20 cm, Laufmittel: n-HexadDichlormethan, 90/5). Zu beachten ist dabei, daB auf der stationaren Phase adsorbierte PAH in Gegenwart von Licht und Sauerstoff relativ rasch oxidieren. Somit mul3 unbedingt zugig und unter moglichst weitgehendem LichtausschluB gearbeitet werden. Unter langwelligem UV-Licht (366 nm) ist nach der Entwicklung im mittleren Retentionsbereich eine PAH-Bande sichtbar, die sich von zwei Banden UV-aktiver Verbindungen (254 nm) mit hohen bzw. geringen RrWerten deutlich abgrenzt. Die PAH-Bande wird von der Glasplatte abgekratzt, in Acetonitril 30 min unter RuckfluS gekocht und nach Filtration und Konzentration auf ca. 1 mL (Rotationsverdampfer) zur HPLC-Trennung eingesetzt. Gegenuber den nach der VDI-Richtlinie 3872 (Blatt 1 und 2) vorgeschriebenen Clean-up-Verfahren mittels Saulenchromatographie an selbst herzustellenden Kieselgel- und Sephadexsaulen [9-471 stellt die beschriebene Methode ein weniger aufwendiges und Losungsmittel sparendes Verfahren dar. c) Gerate und chromatographische Parameter HPLC-System : Flussigkeitschromatograph Hewlett Packard 1090 mit Fluoreszenzdetektor Hewlett Packard 1046 A (Hewlett Packard, Avondale, USA), Einspritzventil Rheodyne 7125 (Rheodyne, Berkeley, USA) mit 5-pL-Probenschleife . Saule: Edelstahlsaule mit Chromspher PAH-Material (200 mm x 3 mm i. D.), PartikelgroSe: 5 pm Saulentemperatur: 26,5 "C A. Wasser Eluent: B. Acetonitril Gradient: Omin: 40% A 6min: 40% A 5% A 21min: 22min: 0% A 38min: 0% A 42min: 40% A Laufzeit : 42 min FluBrate: 0,55 mWmin Injektionsvolumen: 5 pL

9.11 Bestimmung von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen

Detektor:

Retentionszeitabhangige Fluoreszenzdetektors:

1: Fluoranthen 2: Pyren 3: BenzCaIanthracen 4: Chrysen 5: Benzo[b]fluoranthen 6: Benzo[k]fluoranthen 7: Benzo[a]pyren 8: Dibenz[ah]anthracen 9: Benzo[ghi]perylen 10: Indeno[l,2,3-cd]pyren 11:p-Quaterphenyl

Wellenlangenschaltung Anregung [nml 237 237 290 290 297 290 290 290 290 247 220

237 des

Emission [nml 440 440 450 450 460 425 425 410 410 504 335

Die hochste Empfindlichkeit ware durch die Auswahl der Wellenlangen entsprechend der Absorptions- und Emissionsmaxima der Analyte erreichbar. In Dieselmotoremissionen ist jedoch mit der Anwesenheit groBerer Mengen coeluierender, alkylierter PAH zu rechnen, die bei der Flussigchromatographie zu einem starkeren Untergrund bzw. einer verminderten Signalauflosung fuhren. Die gewahlten Anregungs- und Emissionswellenlangen entsprechen daher nicht immer den Maxima, sondern tragen den moglichen Interferenzen Rechnung. Vor allem bei dem als internem Standard eingesetzten p-Quaterphenyl schlieaen die gewahlten Bedingungen eine Beeinflussung durch zeitgleich eluierendes, in Realproben vorhandenes Coronen aus.

Ergebnisse und Diskussion Abb. 9-25 zeigt das HPLC-FLD-Chromatogramm einer entsprechend der Applikation aufgearbeiteten Abgasprobe (Dieselkraftstoff). Kalibrierung Die Quantifizierung erfolgt uber die Methode der internen Standardisierung. Als interner Standard wird p-Quaterphenyl verwendet . Aus dem Verhaltnis der Massen Analyt zu internem Standard und dem entsprechenden Peakflachenverhaltnis werden f i r die einzelnen Analyte Responsefaktoren ermittelt, mit deren Hilfe in Realproben die Quantifizierung moglich ist. Die aufzustellende Kalibriergerade sollte mindestens fiinf Kalibrierpunkte umfassen.

Validierung Fur einen auf einen Glasfaserfilter direkt aufgebrachten Standard liegen die Wiederfindungsraten fur alle PAH uber 90 % . Die relative Standardabwei-

238

9 HPLC-Applikationen aus dem Umweltbereich

2

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35

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Zeit [rnin] Abb. 9-25: HPLC-FLD-Chromatogramm eines realen Dieselkraftstoff-Abgases nach Reinigung

durch Dunnschichtchromatographie. 1: Fluoranthen, 2: Pyren, 3: Benzo[a]anthracen, 4: Chrysen, 5: Benzo[b]fluoranthen, 6: Benzo[k]fluoranthen, 7: Benzo[a]pyren, 8: Dibenzo[ah]anthracen, 9: Benzo[ghi]perylen, 10: Indeno[ 1,2,3-cd]pyren, 11: p-Quarterphenyl (interner Standard).

chung, als MaB fur die Wiederholgenauigkeit der HPLC-Bestimmung, liegt zwischen 0,s und 3,3 %. Lediglich bei Chrysen (9,3 %) und Dibenz[ah]anthracen (25,8 % ) liegen die Standardabweichungen hoher. Fur Dibenz[ah]anthracen liegt der Grund in dem geringeren Gehalt in Realproben im Vergleich zu anderen PAH und dem damit verbundenen schwachen Signal. Alternativmethoden Neben der HPLC eignet sich auch die GC mit FID oder als MS-Kopplung (MSD) als Detektionsmoglichkeit . Eine umfassende Ubersicht der analytischen Methoden zur PAH-Bestimmung in Abgasen liefert [9-481.

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Sachregister

Acenaphthen

Anthracen

- Bestimmung nach USEPA in Bodenpro-

- Bestimmung nach USEPA in Bodenpro-

ben

222ff

ben

222ff

- Formel 223

- Formel 223

Acenaphthylen

Antioxidantien, Bestimmung 180 AOAC-Methodensammlung 180f APCI s. atmospheric pressure chemical ionisation 42,47 Arbeitsbereich 117 Arbeitssicherheit 1ff Aspartam 179, 183 - Bestimmung in Lebensmitteln 159f atmospheric pressure chemical ionisation (APCI) 42,47 Atrazin, Bestimmung in Grund- und Trinkwasser 194ff Auflosung - chromatographische 25f - D A D 86ff - Detektor 84 - SFC 60 AuslaBventil 65, 70, l l l f Ausloseschwellen 12, 14 Automated multiple development (AMD) 51f Automatische Injektion 75 Automatische Mehrfachentwicklung s. Automated multiple development Azeotrope 20f

- Bestimmung nach USEPA in Bodenproben

222ff

- Formel 223 Acesulfam, Bestimmung in Lebensmitteln 159ff, 179 Acetaldehyd, Bestimmung in Dieselmotoremissionen 228ff Aceton, Bestimmung in Dieselmotoremissionen 228ff Acetylmetaboliten, Bestimmung in Lebensmitteln 129ff N4-Acetylsulfamidir1,Bestimmung in Lebensmitteln 129ff Acrolein, Bestimmung in Dieselmotoremissionen 228ff Aflatoxin, Bestimmung 180 Aldehyde - Bestimmung in Dieselmotoremissionen 228f - Derivatisierung mit 2,4-Diphenylhydrazin 229ff Alkaloide, Bestimmung in Tee 125ff Alkylbenzylsulfonate, Bestimmung in Kllrschlamm 211ff Allgemeine Laboranweisungen 9 AMD s. Automated multiple development Amperometrie 60,92 - gepulste 92 ampemmetrische Detektion 36,91f amperometrischer Detektor 36 amtliche Methoden 179ff - nach 5 35 LMBG 179ff Anionen 31,33ff, - Bestimmung in Deponiesickerwassern 207ff - CE 55 Anionentenside, Bestimmung in Klarschlammen 211ff

Bandenverbreiterung

- LC-GC 41

28f, 56

75 BAT S. Biologischer Arbeitsplatztoleranzwert 11 Benzaldehyd, Bestimmung in Dieselmotoremissionen 228ff Benz[a]anthracen - Bestimmung in Dieselmotoremissionen 233ff - Bestimmung nach USEPA in Bodenproben 222ff - Formel 223 - Probenaufgabe

244

Sachregister

Benzo[a]pyren

95

- Bestimmung in Dieselmotoremissionen

Butanon, Bestimmung in Dieselmotoremissionen 228ff

233ff - Bestimmung nach TVO in Grund- und

Rohwasser 203ff - Bestimmung nach USEPA in Bodenproben 222ff - Formel 223 Benzo[b]fluoranthen - Bestimmung in Dieselmotoremissionen 233ff - Bestimmung nach TVO in Grund- und Rohwasser 203ff - Bestimmung nach USEPA in Bodenproben 222ff - Formel 223 Benzoesaure, Bestimmung 146ff, 179f Benzo[ghi]perylen - Bestimmung in Dieselmotoremissionen 233ff - Bestimmung nach TVO in Grund- und Rohwasser 203ff - Bestimmung nach USEPA in Bodenproben 222ff - Formel 223 Benzo[ klfluoranthen - Bestimmung in Dieselmotoremissionen 233ff - Bestimmung nach TVO in Grund- und Rohwasser 203ff - Bestimmung nach USEPA in Bodenproben 222ff - Formel 223 Benzoylierung - Bestimmung von Kohlenhydraten 166f - Reaktionsgleichung 167 Bestimmungsgrenze 115f Bier - Bestimmung von Sulfit 155f - Nachweis von Mais und Hirse 162f Biogene Amine, Bestimmung 180 Biologischer Arbeitsplatztoleranzwert (BAT) 11 Biosensoren 37f - Bestimmung von Sulfit mit HPLC-Biosensor 155f Bodenhohe 26 Bodenproben 210,223,229,240 Brechungsindex-Detektor s. RI-Detektor Bruttoretentionszeit 23ff

Capillar-Elektrophorese (CE) 53ff, 59 Capillar-Zonen-Elektrophorese(CZE) 54ff Carazolol, Bestimmung 180 Catechine, Bestimmung in Tee 125ff CE s. Capillar-Elektrophorese CFFAB s. Continuous flow fast atom bombardement Chemikalienkataster 4f Chemilumineszenz 94, 102 Chloramphenicol, Bestimmung in Lebensmitteln 129f, 179 Chlorbromuron, Bestimmung in Trinkwasser 198ff Chlorid, Bestimmung in Deponiesickerwassern 207ff 4-Chlor-3-Methylphenol - Bestimmung in Lebensmitteln 146ff - Formel 147 Chlorogensaure, Bestimmung 180 Chlorogenshrelactone, Bestimmung in Kaffee 171ff Chloroxuron - Bestimmung in Bodenproben 216ff - Bestimmung in Trinkwasser 198ff Chlortetracyclin, Bestimmung in tierischen Lebensmitteln 136ff Chlortoluron - Bestimmung in Bodenproben 216ff - Bestimmung in Trinkwasser 198ff chromatographische KenngroRen 23ff Chrysen - Bestimmung in Dieselmotoremissionen 233ff - Bestimmung nach USEPA in Bodenproben 222ff - Formel 223 Continuous flow fast atom bombardement (CFFAB) 48 Crotonaldehyd, Bestimmung in Dieselmotoremissionen 228ff 1-0-trans-p-Cumaroylglycerol - Formel 163 - Maisnachweis in Bier 162f - UV-Spektrum 163 Cyclodextrinsaulen 163 CZE s. Capillar-Zonen-Elektrophorese

Sachregister DAD s. Dioden-Array-Detektor Datenauswertung 32, 106ff Deflektions-vp s. RI-Detektor Deponiesickerwasser, Bestimmung von Anionen 207ff Desisopropylatrazin, Bestimmung in Grund- und Trinkwasser 194ff Detektoren 80ff - fur die Ionenchromatographie 36f Deuteriumlampen 82 Diarrhetic shellfish poisoning, Bestimmung in marinen Lebensmitteln 142f Dibenzo[ah]anthracen - Bestimmung in Dieselmotoremissionen

233ff - Bestimmung nach USEPA in Bodenpro-

ben 222ff - Formel 223 Difenoxuron, Bestimmung in Trinkwasser

245

Electrospray ionisation(ES1) 46ff elektrochemischer Detektor 36,38,9Of,

157 Elektrochromatographie 59 elektroendoosmotischer HUB(EOF) 55 Eluotrope Reihe (Tab) 101 Elutionssttirke 101 Endcapping 30 Entgasung W f , 112,187,207 Enzymreaktor 37ff,155 EOF s. elektroendoosmotischer FluB Epicatechin, Bestimmung in Tee 125ff Epicatechingallat, Bestimmung in Tee

125ff Epigallocatechin, Bestimmung in Tee

125ff Epigallocatechingallat, Bestimmung in Tee 125ff ESI s. Electrospray ionisation

198ff Dimefuron, Bestimmung in Bodenproben

216ff Dinitrophenole, Bestimmung in Regenwasser 185ff

2,4-Dinitrophenylhydrazin 228ff Dinitrophenylhydrazone 228ff Dinophysistoxin-1, Bestimmung in marinen Lebensmitteln 142ff Dioden-Array-Detektor (DAD) 21,52,

80,85ff - Applikationen

123, 127, 133, 139,152, 165,172,185ff,191, 199,218,220,230 - Aufbau, Abbildung 85 - C E 60 - Peakreinheitskontrolle 106 - SFC 62 Direct liquid introduction (DLI) 49,51,55 Diskontinuierliche Verdrangerpumpen 67 Diuron, Bestimmung in Bodenproben

216ff DLI s. Direct liquid introduction Dosierschleife 28,74f,106 Dosierventil 28,74f Drift 81 Diinnschichtchromatographie 51, 125,236 Durchbruchszeit 25 Eddy-Diffusion 27 EinlaBventil 65,69,111 ELCD s. elektrochemischer Detektor

Fehlerbehebung 109ff Fehlermoglichkeiten 109ff Fenuron, Bestimmung in Trinkwasser

198ff Festphasenextraktion 6 - Applikationen, Lebensmittel 126, 136, 164, 170 - Applikationen, Umwelt 194,202,206 - Probenvorbereitung mit 118ff, Fittings 77,96,102ff Flavanole, Bestimmung in Tee 125ff Flavanonglykoside, Verfalschungsnachweis Fruchtsaft 151ff Flavonolglykoside, Bestimmung in Tee

121ff FlieBmittel 28ff,99ff - allgemeine Anforderungen 99f - Eigenschaften 100 - Entsorgung 105 - Enzymreaktor 46 - feste Verunreinigungen 99 - NP-FlieBmittel 104 - RP-FlieBmittel 103 - Z~satze, 105 Flunixin, Bestimmung 180 Fluoranthen - Bestimmung in Dieselmotoremissionen

233ff

- Bestimmung nach TVO in Grund- und Rohwasser 203ff

246

Sachregister

- Bestimmung nach USEPA in Bodenpro-

ben 222ff - Formel 223 Fluoren - Bestimmung nach USEPA in Bodenproben 222ff - Formel 223 Fluoreszenz-Detektor 92ff - Ionenchromatographie 37 Fluorid, Bestimmung in Deponiesickerwassern 207ff Fliissigkeitchromatographie-Gaschromatographie (LC-GC) 39ff Formaldehyd, Bestimmung in Dieselmotoremissionen 228ff Fresnel-Typ s. RI-Detektor Gefahrensymbole 13ff Gefahrstoffverordnung (GefStoffVO) Itr, 23,98 Geisterpeaks 93, 102 Genauigkeit 116 Glattungsalgorithmen 80 Gradienten 21, riff, 81f, 96 - A M D 51 - CZE(Fe1dstarkegradient) 55 - moving belt 42 - RP-Phasen 30 - SFC 62 Gradientensysteme 71ff Grundwasser, Bestimmung von Triazinen 194ff Hesperidin, Bestimmung in Fruchtsaft 151ff HETP-Kurve 27 Hexanaldehyd, Bestimmung in Dieselmotoremissionen 228ff Hexogen (RDX), Bestimmung 190ff High performance ion chromatography (HPIC) s. Ionenaustausch-Chromatographie High performance ion chromatography exclusion (HPICE) s. IonenausschluRChromatographie High performance thin layer chromatography (HFTLC) 51ff Hinterkolbenspiilung 69 Hochdruckgradienten 70,73 HPLC-Biosensorkopplung 37ff

HPLC-IMER 38 HPLC-MS-Kopplungen 41ff - Bestimmung von Flavonolglykosiden 125 - Chlorogensaurelacton, Kaffee 171 - Bestimmung von Pflanzenschutzmitteln in Trinkwasser 198ff HPTLC s. High performance thin layer chromatography HygienemaBnahmen 10 Immobilisierung von Enzymen 39 Indeno[ 1,2,3-cd]pyren - Bestimmung in Dieselmotoremissionen 233ff - Bestimmung nach TVO in Grund- und Rohwasser 203ff - Bestimmung nach USEPA in Bodenproben 222ff - Formel 223 Indirekte UV-Detektion 37, 84 - C E 60 Injektoren, s.a. Probenaufgabe 74ff, 96 - Capillar-Elektrophorese 54, 59 - Festphasenextraktion 118 - SFC 60 Integration 106f Interferenz-Typ s. RI-Detektor IonenausschluR-Chromatographie (HPICE) 31,34f Ionenaustausch-Chromatographie(HPIC) 31ff - Bestimmung von Anionen in Deponiesickerwlsssern 208ff Ionenaustauscher 33ff, 92, 112, 159, 163, 208 Ionenchromatograph 31ff - Aufbau 32 Ionenpaar-Chromatographie (MPIC/ RPIC) 31, 35f Ionenpaar-Reagenz 35 Isobutyraldehyd, Bestimmung in Dieselmotoremissionen 228ff isokratisch 24,65,99 Isoproturon - Bestimmung in Bodenproben 198ff - Bestimmung in Trinkwasser 216ff Isotachophorese (ITP) 56f ITP s. Isotachophorese

Sachregister Gmpferolglykoside, Bestimmung in Tee 121ff Kapazitat - Festphasenextraktionssaulen 119 - Ionenaustauscher 33,35 Kapazitatsfaktor (k’-Wert) 24, 31,59 Ketone, Bestimmung in Dieselmotoremissionen 228ff Kieselgel 29f, 104 - A M D 51 - Elektrochromatographie 59 - modifiziertes 78f - SFC 62 Kohlenhydrate 39,88,92, 164 - Bestimmung durch Benzoylierung 166ff Kolbenhinterspiilung 69 Kolbenpumpen 65ff - Membranpumpen 67f - SFC 60 Konservierungsstoffe, Bestimmung 146ff k’-Wert s. Kapazitatsfaktor Laboranweisungen, allgemeine 9ff Laborrichtlinien 9ff Lambert-Beersches Gesetz 82,86,93 Lingsdiffusion, s.a. van DeemterGleichung 27 LAS s. Alkylbenzolsulfonate LC-GC s. FliissigkeitschromatographieGaschromatographie Leitfiihigkeitsdetektor 31, 33,36, 80 Linearitat -FTD 94 - Kalibrierfunktion 117 Linuron - Bestimmung in Bodenproben 216ff - Bestimmung in Trinkwasser 198ff loop-type-interface 41 Lbsungsmittelriickgewinnung 19ff MAK s. Maximale Arbeitsplatzkonzentration Maximale Arbeitsplatzkonzentrtion (MAK) 11 MBAS s. Methylenblauaktive Substanzen MBI s. moving belt interface 42f MEKC s. Micellare eletrokinetische Capillar-Chromatographie Methylenblauaktive Substanzen (MBAS) 215ff

247

Methylnitrophenole, Bestimmung in Regenwasser 185ff Metobromuron, Bestimmung in Bodenproben 216ff Metoxuron, Bestimmung in Bodenproben 216ff Micellare eletrokinetische Capillar-Chromatographie (MEKC) 54,58ff microbore HPLC 6,76ff - FluRzellen 83,92,%, 198 - LC-MS 42,44,46,48 Mischbarkeit 71, 101 - von FlieBmitteln (Tabelle) 102 Mischkammern 73f Modifier 60 Monolinuron - Bestimmung in Bodenproben 216ff - Bestimmung in Trinkwasser 198ff Mononitrophenole, Bestimmung in Regenwasser 185 Monuron - Bestimmung in Bodenproben 216ff - Bestimmung in Trinkwasser 198ff moving belt interface (MBI) 43f MPIC s. Ionenpaar-Chromatographie MSlMS 48f Myricetinglykoside, Bestimmung in Tee 121ff Nachweisgrenze 40,U

- Biosensoren 39 - F L D 94 Naphthalin - Bestimmung nach USEPA in Bodenproben 222ff - Forrnel 223 Naringin, Bestimmung zum Authentizitiitsnachweis von Fruchtsaft 151f Nettoretentionszeit 23ff Nicarbazin - amtliche Methoden 180,184 - Bestimmung in tierischen Lebenmitteln 129ff Niederdruckgradienten 70,72f, % Nitrat, Bestimmung 180 Nitrofuran, Bestimmung 180 Nitrophenole, Bestimmung in Regenwasser 185ff Nitrotoluole, Bestimmung in Obeflachengewiissern und Grundwasser 190ff

248

Sachregister

NormalphasenflieRmittel 104 Normalphasen-HPLC 23,29f, 163

- Kolbenfuhrung 68 - TLC-Scanner 52

Oberflachengewasser, Bestimmung von Sprengstoff-Ruckstanden 19Off Ochratoxin A, Bestimmung 180 Okadasaure, Bestimmung in marinen Lebensmitteln 142ff Optimierung von FlieBmittelsystemen 104 Oxytetracyclin, Bestimmung in tierischen Lebensmitteln 136ff

- CE 54,59 - Festphasenextraktion

Probenaufgabe

PAH s. polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe Particle beam 47ff Peaksplitting 77,95f, 228 PEEK (Polyetheretherketon) 96 Pflanzenschutzmittel 6 - Bestimmung in Bodenproben 216ff - Bestimmung in Trinkwasser mittels HPLC-MS 198ff Phasenmaterial 27ff, 76,78ff, 102, 112 - Festphasenextraktion 118 pHB-Ester, Bestimmung in Lebensmitteln 146ff pHB-Saure, Bestimmung in Lebensmitteln 146ff Phenanthren - Bestimmung nach USEPA in Bodenproben 222ff - Formel 223 Phenylharnstoff-Herbizide - Bestimmung in Bodenproben 216ff - Bestimmung in Trinkwasser 198ff Phosphoreszenz 92,94f Photodioden-Array-Detektorens. DiodenArray-Detektor Polyamid-Saulenchromatographie 122f, 154 Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAH) 95 - Bestimmung in Dieselmotoremissionen 233ff - Bestimmung nach TVO in Grund- und Rohwasser 203ff - Bestimmung nach USEPA in Bodenproben 222ff - Formeln 223 Prazision - von Analysenergebnissen 116f

74ff, 96

118 Probenvorbereitung mittels Festphasenextraktion 118ff Propionaldehyd, Bestimmung in Dieselmotoremissionen 228ff Propionsaure, Bestimmung 180 Puffer 103, 110, 118 - CE 56 - HPLC-Biosensor 39 - Kolbenpumpen 69,71,99 - Pufferionisierung, TSP-LC-MS 44f Pulsation 67f Pulsationsdampfung 31, 60 Pulsationsfreiheit - LC-MS 42 - SFC 60 Pumpen 65ff - LC-MS 42ff - SFC 60 - Wasserstrahl 19 Pumpenkopf 68f Pyren - Bestimmung nach USEPA in Bodenproben 222ff - Formel 223 Quercetinglykoside, Bestimmung in Tee 121ff Rauschen 81f Regenwasser, Bestimmung von Nitrophenolen 185ff Reinheitsgebot - Bier, Nachweis 162 - HPLC-FlieRmittel 99, 103 retention gap 40 Retentionszeit 23ff, 54, 70 reversed-phase-FlieBmittel 103 reversed-phase-HPLC (RP-HPLC) 23, 29ff Richtigkeit 116f RI-Detektor 80,88ff - Deflektionstyp 88 - Fresnel-Tp 88f - Interferenz-’Qp 88ff rotorseal 75

Sachregister RPIC s. Ionenpaar-Chromatographie RP-Phasen 35,78f, 103f, 118f - Reproduzierbarkeit 30 R-Satze 14ff Saccharin

- amtliche Methoden 179ff - Bestimmung in Lebensmitteln

159ff Salicylsaure, Bestimmung in Lebensmitteln 146ff Saulenabmessungen 78 Saulenmaterial 76 Saulenpflege nf Schadstoffbelastung, Reduzierung im Labor 18f Schutzeinrichtungen 10 schwefelige Saure, Bestimmung in Getranken 155ff SchweizerischesLebensmittelbuch 183ff Selektivitat 31f, 59, 89, 116f, 171 SFC s. Supercritical fluid chromatography SFE s. Supercritical fluid extraction Simazin, Bestimmung in Grund- und Trinkwasser 194ff Sprengstoff-Riickstande,Bestimmung in Oberflachengewassern und Grundwasser 190 Sorbinsaure, Bestimmung in Lebensmitteln 146ff Spritzenpumpen 42,60,65,67,71 S-Sltze 13, 16ff Standardabweichung 116f Stoffaustausch 28 Sulfadiazin s. Sulfonamide Sulfadimethoxin s. Sulfonamide Sulfadimidin s. Sulfonamide Sulfamerazin s. Sulfonamide Sulfamethoxazol s. Sulfonamide Sulfanilamid s. Sulfonamide Sulfapyridin s. Sulfonamide Sulfat, Bestimmung in Deponiesickerwassern 207ff Sulfathiazol s. Sulfonamide Sulfit - Bestimmung in Getriinken 155ff - Bestimmung mit Ionenchromatographie 34f Sulfitoxidase 155 Sulfonamide - amtliche Methoden 184

249

- Bestimmung in tierischen

Lebensmitteln 129ff Supercritical fluid chromatography (SFC) 6off Supercritical fluid extraction (SFE) 6, 63, 228 Suppressor-Saule 31,33f, 36 SiiBstoffe, Bestimmung in Lebensmitteln 159ff Technische Regeln fur Gefahrstoffe 4 Technische Richtkonzentration (TRK) 11 TeilchengroBe von Phasenmaterial 80 Tetracycline, Bestimmung in Lebensmitteln 136ff Tetrahydrofuran 103 Tetryl, Bestimmung in Oberflachengewassern und Grundwasser 190ff Theogallin, Bestimmung in Tee 125ff Thermospray (TSP) 44ff, 125, 171, 198 - Bestimmung von Chlorogensaurelacton 171ff - Bestimmung von Pflanzenschutzmitteln 198ff - Massenspuren Catechine 129 TLC-Scanner 52 Tocopherole, Bestimmung 180 Totzeit 23f - HPICE 34 Trennsaulen 23,31, 33,76ff Trennstufenzahl - effektive 25 - theoretische 25 Triazin-Herbizide - AMD 52, 119 - Bestimmung in Grund- und Trinkwasser 194ff, 198ff Trinitrotoluol (TNT),Bestimmung in Oberflachen- und Grundwhsern 19Off Trinkwasserverordnung 198,203 TRK s. Technische Richtkonzentration Troubleshooting 109ff TSP s. Thermospray Umgang mit Chemikalien 11 Untersuchung von Proben, Gefahren 7 UV-Detektor 80ff UV-Durchlhigkeit von Liisungsmitteln 83, l O l f - Tabelle 84

250

Sachregister

Vakuumkonzentrierungszentrifuge 132f Validierung 115ff Validierungsparameter 117 Van Deemter-Gleichung 25ff Van Deemter-Kurve 27 Verbindungsleitungen 28, 95ff, Verdrlngerpumpen, gasbetriebene 66 Verschraubungen 77,95ff, 111 Verstlrkerpumpen, gasbetriebene 67 Vitamin A, Bestimmung 180 Vitamin D, Bestimmung 180

VVV (Vermeiden, Vermindern, Verwerten) 19ff Wellenliingenschaltung, Bestimmung von PAH 95, 225f, 237 Wiederfindungsrate 115ff Xenonlampen

82,85

Zeitkonstante, Detektor 81 Zeotrope binlrer Mischungen (Tabelle) 20